DD280785A1

DD280785A1 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen dasGruppenpolysaccharid der B-Streptokokken

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Publication number: DD280785A1
Authority: DD
Publication date: 1990-07-18

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid des Streptococcus agalactiae. Durch Immunisierung von Mäusen und Immortalisierung ihrer Milzlymphozyten mit einer murinen Myelomzellinie werden die Hybridomzellen H - CB - GBS, -M1, -M2, -M3, -M4, -M5, -M6, -M7 und -M8 erhalten. Das Anwendungsgebiet ist die human- und veterinärmedizinische Diagnostik.{Antikörper; monoklonale Antikörper; Antigen; Streptococcus agalactiae; B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid; Immunisierung; Mäuse; Hybridzellen; Humanmedizin; Veterinärmedizin; Diagnostik}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung muriner monoklonaler Antikörper gegen das in der Zellwand des Streptococcus agalactiae lokalisierte B-Streptokokken-spezifisches Antigen Ausgangspunkt der Typisierung des Streptococcus agalactiae nach dem LANCEFIELD-Schema isi

Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die human- und veterinärmedizinische Diagnostik.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Herstellung monokloruiiar Antikörper wurde erstmals von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 1975, 2-36,495) Mitte der 70er Jahre beschrieben. Die genannten Autoren beschrieben ein Verfahren zur somatischen Fusion von murinen antikörperbildenden Zellen mit permanent wachsendo-i Flasmo*ytomzellinien für die Herstellung von Hybridomen, die nach entsprechenden Klonierungsschritten monoklonale Antikörper der Maus gegen gewünschte Antigenspezifitäten produzieren. Mit dieser prinzipiellen biotechnologischen Lösung sind bereits Antikörper gegen ß-Streptokokken hergestellt worden (WANGER, A.R. u. G.M.DUNNY, Infection and Immunity 1987, 55,1170; POLIN, R.A. u. R.KENNETT, J. Clin. Microbiology 1380,11, 332; RENCH, M.Α., T.G. METZGER u. CJ. BAKER, J. Clin. Microbiology 1984,20,852; RUCH, F.E. u. L.SMITH, J. Clin. Microbiology 1982, 16,145).

Bisher sind allerdings keine Hybridomlinien bekannt, deren Charakterisierungsgrad hoho Antikörperausbeuten, überprüfter Spezifität des Typs H-CB-GBS-M1, -M 2, -M3, -M4, -M 6, -M7 und -M 8 garantiert.

Ziol der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung muriner Hybridome. die monoklonale Antikörper sezernieren, die zum Aufbau von Testsystemen für den Nachweis von Β-Strepto'..okken-Gruppenpolysaccharid des Streptococcus agalactiae innerhalb der humanmedizinischen und veterinärmedizinischen Diagnostik dienen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwicke'n, mit dem zunächst effektiv Hybridomzellinien erzeugt werden können, von denen in darauf folgenden Verfahrensschritton Zeilklone isoliert werden, die Antikörper gegen das Gruppenpolysaccharid der B-Streptokokken (Streptococcus agalactiae) sezernieren. Die Hybridomzellen sollen ökonomisch günstig in vitro und in vivo kultivierbar sein und für darauffolgende Reinig· ingsschritte ausreichenden Mengen an monoklonalen Antikörpern sezernieren. Die monoklonalen Antikörper sollen bezüglich ihrer Spezifität im ELISA gegenüber verschiedenen anderen bakteriellen Antigenen charakterisiert sein.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß zunächst Mäuse vom Stamm Balb/c mit formalinabgetöteten Bakteriensusponsionen eines B-Streptokokkenstammes (09OR) der Optischen Dichte 1,0 mit 100 μΐ je Immunisierungsdosis nach einem bestimmten erfinderischen Schema immunisiert wurden. Die Immunisierung erfolgte über einen Zeitraum von 8 Wochen bei zweimaliger intravenöser Applikation der genannten Immunisierungsdosis pro Woche. Als vorteilhafi erwies sich die Immunisierung bei 8-10 Wochen alten weiblichen Mäusen.

Aus den Milzen derart hyperimrnuriisierter Mäuse wurden 4 Tage nach der letzten Immunisierung nach einem beschriebenen Verfahren Zellsuspensionen hergestellt.

Als Fusionspartner für diese Zellen wurden Mausmyelomzellen der Linie P 3X63 Ag 8/653 (Kearney et ai., J. Immunol., 1979,123, 1548) verwendet. Die Kultivierung dieser Zellen erfolgte in einem Zellzuchtmedium RPM11640, das mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) supplementiert wurde.

Die Zellfusion wurde nach Vermischen beider Fusionspartner im Verhältnis 1:5 (Myelomzellinie zu Milzzellen) und ihrer Sedimentation unter Verwendung von Polyethylenglykol durchgeführt. Anschließend erfolgte die Verteilung der fusionierten Zellen in eine Vielzahl von separaten 200μΙ Kulturen. Zur Selektion der fusionierten von den nichtfusionierten Myelomzellen wurde ein Zelikulturmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin undThymidin (HAT) enthielt (LITTLEFIELD, Science 1964,145,709), verwandt. Damit erfolgte erfindungsgemäß die Abtrennung jener Klone, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren. Die Detektion dieser Klone erfolgte durch den Nachweis sezernierter Antikörper in den Zoilkulturüberständen wachsender Hybridome mittels eines spezifischen Enzymimmunoassay, der auf der Festphasenbindung von Phenol/Wasser-extrahiertem B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid beruht.

Die so detektierten Antikörper sind spezifisch für das B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid des Strepticoccus agalactiae. Ermittelte Primärzellkulturen wurden bis zur Monoklonalität Moniert und rekloniert, bis gesichert monoklonale Subklone mit stabiler Antikörperproduktion in hoher Qualität und Quantität etaoliert waren. Diese Hybridome bezeichneten wir als H-CB-GBS. Besonders geeignet sind die Zellkulturen HCB-GBS-M1, -M 2, -M 3, -M4, -M 5, -M6, -M7 und -M8.

Die aufgeführten Hybridome sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie der AdW, Berlin-Buch, unter folgenden Nummern registriert:

H-CB-GBS-M 8 als ZIM-0290 H-CB-GBS-M7alsZIM-0291 H-CB-GBS-M 6 als ZIM-0292 H-CB-GBS-M 5 als ZIM-0293 H-CB-GBS-M4 als ZIM-0294 H-CB-GBS-M3alsZIM-0295 H-CB-GBS-M 2 als ZIM-0296 H-CB-GBS-M1 als ZIM-0297

Die aufgeführten Hybridomzellkulturen eignen sich für eine Massenproduktion von monoklonalen Antikörpern in vivo und in vitro.

Bei der in vitro-Kultivierung der genannten Hybridome lassen sich bei Aussaat von 5.1O⁶ Zellen in hei kömmliche 6-well-Zellkulturplatten bis zu 25Mg/lgG pro ml Zellkulturüberstand und 30pg IgM pro mi Zellkulturüberstand nachweisen. Die in vivo-Produktion monokloncler Antikörper erfolgte durch intra-peritoneale Applikation von 2-10 χ 10° Zellen/ml in mit Pristan vorbehandelter Mäuse nach bekanntem Verfahren. Nach etwa 8-24 Tagen lassen sich durch Punktion bis zu 10 ml Ascitesflüssigkeit konnten bis zu 20 mg spezifischer Antikörper nachgewiesen werden. Auf diese Weise konnten aus den genannten Hybridomen die monoklonalen Antikörper CB-GBS-M1, -M 2, -M 3, -M 4, -M 5, -M 6, -M 7 und -M 8 gewonnen worden. Durch verschiedene biochemische und immunochemische Verfahren lassen sich die Antikörper bis zu einem hohen Reinheitsgrad anreichern. Für die Entwicklung bestimmter Testverfahren lassen sich die Antikörper mit Partikeln bzw. mit Enzymen koppeln. Sie können außerdem biotiniliert bzw. für Reinigungsverfahren an Trägermaterialien gekoppelt werden. Die erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper (mAK) weisen einen hohen Grad an Spezifitätscharakterisierung gegenüber verschiedenen bakteriellen Antigenen auf, die als kreuzreagierende Komponenten einen Einsatz der bisher beschriebenen mAK einschränken würden. Die neuen mAK zeichnen sich ferner durch eine nach Produktions- und Wachstumscharakteristik ausgewiesene hohe Produktion an spezifischen Antikörpern unter in vitro- und in vivo-Bedingungen aus.

Ausführungsbeispiele

Beispiel I

Über einen Zeitraum von 8 Wochen werden 3 weibliche Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen (Balb/c-Mäuse) 2x wöchentlich mit 100μΙ einer formalinabgetöteten B-Streptokokken-Vollkeimsuspension (optische Dichte 1,0 in der 1 cm-Küvette bei 650nm) intravenös immunisiert. 4 Tage nach der letzten Immunisierung werden 2 x 10⁸ Milzzellen isoliert. Diese werden durch Polyethylenglykol 1500 mit 2 χ 10⁷ Myelomzellen der Linie P3 X63 Ag8/653 fusioniert. Nach entsprechenden Waschschritten werden die Zellen in 96-well-Zellkulturplatten mit 10⁵ Zellen/well in ΙΟΟμΙ ausplattiert. Das Standardzellkulturmedium besteht aus RPM11640 mit 10% FKS. Am folgenden Tag werden 100 μΙ eines doppelt konzentrierten HAT-Mediums zugesetzt. Nach einer Woche werden 50μΙ HAT-Medium pro wel! zugegeben. Nach etwa 14 Tagen erfolgt die Prüfung der Primärkulturen mitteis eines hochspezifischen EIA auf die Produktion B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid-spezifischer Antikörper der Maus-Immunglobülinklasse M. Nach dem genannten Verfahren können bis zu 10%-spez. IgM-Antikörper-produzierende Primärkulturen erzeugt werden.

Die positiven Primärkulturen werden auf Peritonealmdkrophagen der Maus (10⁴/well) nach dem Grenzverdünnungsverfahren klonicrt und rekloniert. Auf diese Weise kann eine hohe Zahl monoklonaler Zellinien mit spezifischer Anti-Gruppe-B-Streptokokken-Gruppen-Polysaccharid-Antikörperproduktion gev onnen werden.

Beispiel Il

Die bis zur Monoklonalität gezüchteten Zellinifin mit spez. Antikörperproduktion gegen B-Streptokokken-Gruppen-Polysaccharid werden in feuchter Atmosphäre mit einem 5-%igen CO_rAnteil in einem Standardkulturmedium gezüchtet. Schrittweise Adaptierung erlaubt die Verringerung des FKS-Anteils auf 2-5%. Durch Verdünnung im Verhältnis 1:10 wird das Zellkulturvolumen schrittweise vergrößert. Nach Erreichen der Massenkultur in Rollerflaschen von 500ml Fassungsvermögen ist die Passage in den 5Ol Bioreaktor möglich.

Beispiel III

In 6-well-Kulturplatten werden die monoRlonslen Hybridome bis auf Zellzahlen von 1 x 10^eml gezüchtet. Die Zellor, werden 2x in isotonischer Phos^hatpufferlösung gewaschen und in einer Konzentration von 5 χ 10^β Hybridomzellen/ml in dar gleichen Lösung aufgenommen. JeImI dieser Zellsuspension wird in Balb/c-Mäuse, die 8 Tage vorher mit 1 ml Pristan i. p. behandelt wurden, i.p. appliziert. Die Ascitesproduktion läßt sich nach 8-14 Tagen an der Bauchschwellung der Mäuse feststellen. 2-15ml Ascites mit einem Antikörpergehalt von bis zu 20mg spezifischem Antikörper konnten pro Maus gewonnen werden. Die Reinigung der Antikörper erfolgte nach bekannten Verfahren.

Beispiel IV

Nach dem beschriebenen Schema wurden Hybridomzellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen B-Streptokokkengruppenpolysaccharid gewonnen, die mit H-CB-GBS-M1, -M 2, -M3, -M4, -M5, -M6, -M7 und -M8 bezeichnet wurden. Diese Zellinien wurden bezüglich ihrer Spezifität getestet (Tabelle 1) und für die Optimierung des Verfahrens der Herstellung entsprechende! Antikörper charakterisiert (Tabelle 2).

Tabelle 1: Spezifitätstestung monoklonaler Antikörper gegen das B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid des Sc. agalactiae Extinktion 46onm (Entwicklung, Peroxidase markierter Antie-Species-Antikörper, Substrat OPD) Testung ZKÜ, Festphasenbeladung mit LANCEFIELD-Antigenen aus

Antikörper ScA ScC ScG ScB

CB-GBS-M1	0,130	0,185	0,095	1,941
CB-GBS-M 2	0,098	0,115	0,104	2,000
CB-GBS-M3	0,074	0,221	0,042	2,000
C8-GBS-M4	0,023	0,056	0,051	2,000
CB-GBS-M 5	0.049	0,088	0,102	2,000
CB-GBS-M 6	0,062	0,033	0,057	2,000
CB-GBS-M 7	0,088	0,102	0,100	2,000
CB-GBS-M8	0,033	0,067	0,042	2,000

Tabelle 2: Charakterisierung der Hybridomzellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen Gruppe B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid

Klon	Verdoppelungs	IgM-Produktion	Ig-Klasse	Isoelektr.
	zeit (h)	(Mg 5 χ 10⁶		Punkt
		Zel!en/ml)
H-CB-GBS-M1	18	14,5	M	>8,0
H-CB-GBS-M 2	31	28,3	M	>8,0
H-CBGBS-M3	22	19,5	M	>8,0
H-CB-GBS-M4	24	16,2	M	>8,0
H-CB-GBS-M5	37	3Ί,4	M	>8,0
H-CB-GBS-M6	22	15,3	M	>8,0
H-CB-GBS-M7	28	19,2	M	>8,0
H-CB-GBS-M8	20	10,5	M	>8,0

Claims

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die Strukturen des B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharides des Streptococcus agalactiae erkennen, durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit B-Streptokokken und Immortalisierung ihrer Milziymphozyten mit einer murinen Myelomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß daraus die Hybridomzellen H-CB-GBS-M 1 (ZIM-0297), H-C3-GBS-M2 (ZIM-0296),

H-CB-GBS-M3 (ZIM-0295), H-CB-GBS-M4 (ZIM-0294),

H-CB-GBS-M 5 (ZIM-0293), H-CB-GBS-M 6 (ZIM-0292),

H-CB-GBS-M7 (ZIM-0291) und H-CB-GBS-M8 (ZIM-0290)

selektiert zur Züchtung eingesetzt und aus dem zellfreien Überstand die monoklonalen Antikörper CB-GBS-M1, CB-GBS-M2, CB-GBS-M3, CB-GBS-M4, CB-GBS-M5, CB-GBS-M6, CB-GBS-M7 und CB-GBS-M 8 isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Milziymphozyten erfolgt, nachdem das Antigen 8 bis 10 Wochen alten weiblichen Mäusen über einen Zeitraum vcn 8 Wochen zweimal wöchentlich intravenös appliziert wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper biotiniliert oder an Partikel, Enzyme bzw. an Trägermaterialien gekoppelt werden.