DD287954A5 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen tetanustoxin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen das Tetanus-Toxin. Durch Immunisierung von Maeusen und Immortalisierung ihrer Milzlymphozyten mit einer murinen Myelomzellinie werden die Hybridomzellen H-CB-TT-G1, -M1 und -G2 (ZIM 0489 bis 0491) und daraus die entsprechenden monoklonalen Antikoerper CB-TT-G1, -M1 und G2 erhalten. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik und die Impfstoffherstellung.{Antikoerper; monoklonale Antikoerper; Antigen; Tetanus-Toxin; Immunisierung; Maeuse; Hybridzellen; Medizin; Diagnostik; Impfstoffherstellung}

Description

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und anschließender Sedimentation wurde durch Zugabe von Polyethylenglyko! die Zellfusion induziert. Darauffolgend wurden din Zellen in eine Vielzahl von separaten 200μΙ Kulturen aufgeteilt. In einem Hypoxanthin, Aminopterln und Thymidin enthaltenden Zellkulturmedium (HAT) nach LITTLEFIELD (Science 1964,145709) werden die gebildeten Hybride von den nicM fusionierten Myelom- und Milzzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Klone selektioniert, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren.

Die Detektion dieser Klone erfolgte dadurch, daß im zollfreien Überstand der angelegten Zellkulturen durch ein geeignetes Verfahren (z.B. einem spezifischen Enzymimmunoassay, EIA) sezernierte Antikörper gegen das Tetanus-Toxin nachgewiesen werden. Die Primärzellkulturen mit Anti-Tetanus-Toxin-Antigen-Antikörperproduktion werden kloniert und mehrmals rekloniert, bis monoklonale Subklono erhalten werden, die stabil und in hohen Konzentrationen die gewünschten spezifischen Antikörper sezornie'ren.

Die so isolierten Hybridoma werden mit H-CB-TT bezeichnet. Besonders geeignet sind die Zellinien der H-CB-TT-GI.H-CB-TT-MI und H-CB-TT-G2. Diese drei Hybridoma sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie der AdW der DDR, Berlin-Ruch, unter folgenden Nummern registriert:

H-CB-TT-GialsZIM-0489 H-CB-TT-M1 als ZIM-0491 H-CB-TT-G2alsZIM-0490

Die hinterlegten Hybridomzellkulturen eignen sich für eine Massenproduktion von monoklonalen Antikörpern in vitro und In Zur Charakterisierung des Wachstumsverhaltens der genannten Zellinien unter In-vitro-Bedingungen wurden die Zellen in

6-v/ell-ZellkulturplaUen bis zu maximalen Zelldichten von 9 χ 10⁶ Zellen/ml Zellkulturflüssigkeit kultiviert, wobei

Antikörperkonzentrationen von 23 pg Ig 5 χ 10⁵ Zellen/ml Zellkulturflüssigkeit nachgewiesen werden konnten. Im zweiten Fall wurden die Zellen auf eine Konzentration von 1 χ 10^e Zellen/ml PBS eingestellt und in pristanvorbehandelte Mäuse intraperitoneal nach bekanntem Verfahren appliziert. Nach ca. 1-3 Wochen läßt sich durch Punktion die antikörperhaltige Ascitesflüssigkeit gewinnen. Auf diese Art und Weise lassen sich durch Kultivierung der genannten Hybridoma in vitro und in vivo die monoklonalen Antikörper CB-TT-G1, CB-TT-M1 und CB-TT-G2 gewinnen. Unter Anwendung verschiedener biochemischer und immunochemischer Verfahren lassen sich die gewonnenen Antikörper bis

zu einem hohen Reinheitsgrad anreichern.

Für die Entwicklung bestimmter Testverfahren können die Antikörper mit Enzymen oder partikulären Trägern kovalent bzw.

adsorbtiv koppeln (Peroxidase-Markierung bzw. Latex-Kopplung z. B.). Sie lassen sich jedoch auch biotinylieren oder für speziell«

Reinigungsverfahren an verschiedene Trägermaterialien koppeln. Die positiven Primärkulturen werden auf Peritonealmakrophagen der Balb/c-Mäuse (luVwell) nach dem Grenzverdünnungsverfahren kloniert und bis zum Erreichen der Monoklqnalität rekloniert. Auf diese Weise werden Zellinien mit

spezifischer Anti-Tetanus-Toxin-Antigen-Antikörperproduktion erhalten.

Anwendungsbelsplele Beispiel 1

Über einen Zeitraum von 53 Versuchstagen werden drei weibliche Balb/c-Mäuse jeweils am 1., 21., 35., 49., 51., 52. und 53. Tag intraperitoneal mit lOOpg einerTetanustoxin-Escherichia coli KI-Kapselpolysaccharld-Konjugatvakzine + 100μ! KFA immunisiert. 4 Tage nach der letzten intraperitonealen Antigengabe und 4 Tage vor der Milzentnahme erfolgte eine einmalige intravenöse Applikation von ^00\lg der Konjugatvakzine. 4 Tage nach der letzten Antigengabe wurden die Milzen entnommen und mittels Glashomogenisator Einzelzellsuspensionen hergestellt.

Je Versuchstier lassen sich 1-2 χ 10^s Milzzellen isolieren. Diese werden mit Myelomzellen der Linie P3X63 Ag8/653 im Verhältnis von 1:3 bis 1:8 (Myelomzellen zu Milzzellen) gemischt und mittels Polyethylenglykol 1500 fusioniert. Nach entsprechenden Waschschritten werden die Zellen in 96-we!l-Zellkulturplatten mit 10^B Zellen/well in 100 μΙ ausplattiert. Dasdabei zur Kultivierung genutzte Standardzellkulturrredium besteht aus RPM11640 mit 10%igem FKS-Zusatz. Am folgenden Tag werden 100μΙ eines doppelt konzentrierten HAT-Selektionsmediums zugesetzt. Eine weitere Zugabe von 50 μΙ des HAT-Mediums pro well der Zellkulturplatte erfolgt nach einer Woche. Nach 14tägiger Zellkultur werden die Primärzellkulturüberstände mit einem hochspezifischen EIA hinsichtlich ihres Gehaltes an spezifischen Antikörpern geprüft. Die Testergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt.

Beispiel 2 Nach dem beschriebenen Verfahren sind Hybridomzellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen das Tetanus-Toxin

hergestellt worden, die mit H-CB-TT-G1, H-CB-TT-M1 und H-CB-TT-G2 bezeichnet wurden. Diese Zellinien wurden für die

Optimierung des Verfahrens zur Herstellung der entsprechenden Antikörper charakterisiert (Tabelle 2). Die Spezifitätscharakterisierung der durch die genannten Zellinien produzierten Antikörper ist in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 1 Anzahl immunglobulinproduzierendsr Primärkulturen nach intraperitonealer Immunisierung mit TT-Konjugatvakzine

Fusions nummer	wells total	wells mit Wachstum	wells mit IgG	Immunglobulinprodiiktion Anti-TT-lgG
1 2 3	288 288 288	288 288 288	282 288 187	282 288 31

Prozente 100% 87,5% 69,4%

Tabc.le2

Charakterisierung der Zellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion geyon Tetanus-Toxin Klon . Verdopplungs- Ig-Klasse Ig-Produktion

zeit (Mg/24h,0,5x10^a

Zellen/ml)

H-CB-TT-G1 27 G 23~i

H-CB-TT-M1 18 M 14,3

H-CB-TT-G222G

Tabelle 3

Charakterisierung der Spezifitat monoklonaler CB-TT im EIA gegenüber verschiedenen bakteriellen Antigenen (Fe&tphasenblndung von Vollkeimsuspensionen (VK) bzw. immunochemisch charakterisierten Teilantigenen (PA), Entwicklung mit Anti-Species-Antikörpern POD-markiert, Testung Zellkulturüberstände nativ)

Antikörper	CB-TT-G1	CB-TT-M1	CB-TT-G2
Ext. 460 nm
Antigen
Streptococcus agalactiae VK	0,008	0,003	0,005
Candida albicans VK	0,085	0,079	0,078
E. coli 075 K100 VK	0,005	0,009	0,004
B-MeningokokkenVK	0,020	0,012	0,018
E.COÜ016K1VK	0,022	0,047	0,036
Kapselpolysaccharid	0,034	0,042	0,054
LPS aueE.coli 083	0,099	0,053	0,107

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die das Tetanus-Toxin Antigen (TT) erkennen, durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mitTetanus-Toxin-Escherichia coli KI-Kapselpolysaccharid-Konjugat-Vakzine und Immortalisierung Ihrer Milzlymphozyten mit einer murinen Myelomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß daraus die Hybridmonozellen H-CB-TT-G1 (ZIM-0489, H-CB-TT-M1 ZIM-0491) und H-CB-TT-G2 (ZIM-0490) selektiert zur Züchtung eingesetzt und aus dem Überstand die monoklonalen Antikörper CB-TT-G1, CB-TT-M1 und CB-TT-G2 isoliert werden.

-1- 207 954 Patentansprüche:

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Milzlymphozyten erfolgt, nachdem das Antigen 8 bis 10 Wochen alten weiblichen Mäusen über einen Zeitraum von 57 Tagen am 1., 21., 35., 49., 51., 52. und 53. Tag in Form einer i. p. Gabe von 100 μΙ Konjugatvakzine und ΙΟΟμΙ KFA verabreicht wird und die letzte Gabe des Antigens 4 Tage vor der Milzentnahme erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper biotiniliert oder an Enzyme, z. B. zur Peroxidase-Markierung, an partikuläre Träger, z. B. Latex bzw. an Trägermaterialien gekoppelt w den.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung muriner monoklonaler Antikörper gegen Tetanustoxin. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Impfstoffherstellung und die medizinische Diagnostik.

Charakteristik de* bekannten Standes der Technik

Die Herstellung monoklonaler Antikörper ist ein bereits beschriebenes Verfahren. Erstmalig haben KÖHLER und MILSTEIN (Nature 1975,256,495) durch somatische Fusion von murinen antikörperbildenden Zellen und Zellen einer permanent wachsenden Plasmocytomzellinie Hybridoma erzeugt, die nach entsprechenden Klonierungsschritten monoklonal Antikörper von der Maus gegen eine gewünschte Antigenspezifität produzierten. Mit dieser biotechnologischen Prinziplösung sind bereits monoklonale Antikörper gegen Tetanustoxin erzeugt worden (AHNER WILGER, G., B. BIZZINI, K. GORETZKI, H. MÜLLER, C.VOLKERS, und E.HABERMANN, Med. Microbiol. Immunol. 1983,172,123; KENIMER, J.G., W.HABIG, M.C. HARDEGREE, Infect. Immun. 1983,42,942; SHEPPARD, A. J., D.CUSSEL und M.HUGHES, Infect. Immun. 1984,43,710; ZURAWSKI, V.R., E.HABER und P.H. BLACK, Science 1978,199,1439; GIGLOTTI, F. und R.A. INSEL, J. Clin. Invest. 1982,70,1306; Essindjedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute murine monoklonale Antikörper vom Typ CB-TTG1, CB-TT M1 und CB-TT G2 sezernleren.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht d_rin, für die Reinigung von Tetanustoxinpräparaten innerhalb der Tetanus-Impfstoffproduktion sowie für die medizinische Diagnostik monoklonale Antikörper zur Verfügung zu stellen, die zum Reinigen sowie für den Nachweis von Tetanustoxin im Rahmen immunochemischer Reinigungs- und Nachweisverfahren geeignet sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein effektives Verfahren zur Erzeugung von Hybridomzellon, aus deren Zellkulturüberständen in weiterführenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper gegen das Tetanustoxin gewonnen werden können, zu entwickeln.

Die nach dem beschriebenen Verfahren erzeugten Hybridomzellinien sollen mit ökonomisch günstigstem Aufwand in vitro und in vivo kultivierbar sein und die für eine wirtschaftliche Reinigung erforderlichen Mengen an stabilen Antikörpern sezernieren. Die Aufgabenlösung erfolgte durch iTimunisierung von Mausendes Inzuchtstammes Balb/c mit einer Tetanustoxin-Escherichia coli KI-Kapselpolysaccharid-KonjUjjat-Vakzine (ΙΟΟμςι Vakzine je Applikation) nach einem bestimmten erfinderischen Schema. Als vorteilhaft erwies sich die Verwendung von 8 bis 10 Wochen alten weiblichen Mäusen des genannten Inzuchtstammes. Die Immunisierung erfolgte durch mehrmalige Antigenapplikation, wobei komplettes Freundsches Adjuvans zur Immunogenitätssteigerung zur Anwendung kam. Als ökonomisch günstigste Variante erwies sich die intraperitonale Applikation von 100pg Konjugatvakzine in 100μΙ PBS mit gleichem Volumenanteil komplettem Freundschem Adjuvans am 1., 21., 35., 49., 50., 51., 52. und 53. Versuchstag,

4 Tage vor der Milzentnahme (4 Tage nach der letzten intraperitonealen Immunisierung) erfolgte eine intravenöse Immunisierung mit 100pg Konjugatvakzine. Nach erfolgter Milzentnahme wurde mittels Glashomogenisator eine Einzelzellsuspension hergestellt. Zur Durchführung der somatischen Fusion der gewonnenen antikörperproduzierenden Zellen wurden Mausmyelomzellen der Linie P3X63 Ag 8/653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 1979,123, 1548) als Fusionspartner verwendet. Die Kultivierung der Mausmyelomzellen erfolgte im Zellzuchtmedium RPM11640 mit einem 10%igen Anteil an fetalem Kälberserum (FKS). Nach dem Durchmischen beider Fusionspartner in FKS-freiem Zellzuchtmedium