DD280786A1

DD280786A1 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen das Gruppenpolysaccharid des Streptococcus agalactiae

Info

Publication number: DD280786A1
Application number: DD32695289A
Authority: DD
Inventors: Michael Mehl; Roland Starke; Roland Grunow; Sigbert Jahn; Stephan Kiessig; Baehr Ruediger Von
Priority date: 1989-03-28
Filing date: 1989-03-28
Publication date: 1990-07-18
Also published as: DD280786B5

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid des Streptococcus agalactiae. Durch Immunisierung von Mäusen und Immortalisierung ihrer Milzlymphozyten mit einer murinen Myelomzelllinie werden die Hybridomzellen H-CB-GBS-G1, -G2, -G3, -G4 erhalten. Das Anwendungsgebiet ist die human- und veterinärmedizinische Diagnostik.{Antikörper; monoklonale Antikörper; Antigen; Streptococcus agalactiae; B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid; Immunisierung; Mäuse; Hybridzellen; Humanmedizin; Veterinärmedizin; Diagnostik}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung muriner monoklonaler Antikörper gegen das in der Zellwand des Streptococcus agalactiae lokalisierte B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid, das als B-Streptokokken-spezifisches Antigen Ausgangspunkt der Typisierung des Streptococcus agalactiae nach dem LANCEFIELD-Schema ist. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die human- und veterinärmedizinische Diagnostik.

Chaiakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Herstellung monoklonaler Antikörper wurde erstmals von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 1975,256,495) Mitte der 70er Jahre beschrieben. Die genannten Autoren beschrieben ein Verfahren zur somatischen Fusion von murir.en antikörperbildenden Zellen mit permanent wachsenden Plasmozytomzellinien für die Herstellung von Hybridomen, die nach entsprechenden Klonierung^schritten monoklonale Antikörper der Maus gegen gewünschte Antigenspezifitn'en produzieren. Mit dieser prinzipiellen bio'echnologischen Lösung sind bereits Antikörper gegen B-Streptokokken hergestellt worden (WANGER, A. R. u. G.M.DUNNY, Infection and Immunity 1987, 55,1170; POLIN, R.A. u. R.KENNETT, J. din. Microbiology 1980,11,332; RENCH, M. Α., T.G.METZGER u. CJ. BAKER, J. Clin. Microbiology 1984, 20, t^%52; RUCH, F.E. u. L.SMITH, J. din. Microbiology 1982,16,145).

Bisher sind allerdings keine Hygridomlinien bekannt, deren Charakterisierungsgrad hohe Antikörperausbeuten, überprüfter Spezifität des Typs H-CB-GBS-G1, -G 2, -G 3 und -G4 garantiert.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung muriner Hybridome, die monoklonale Antikörper sezernieren, die zum Aufbau von Testsystemen für den Nachweis von B-Streptokokken-Gruppenpoly-accharid des Streptococcus agalactiae innerhalb der humanmedizinischen und veterinärmedizinischen Diagnostik dienen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem zunächst effektiv Hybridomzellinien erzeugt werden können, von denen in darauf folgenden Verfahrensschritten Zeilklone isoliert werden, die Antikörper gegen das Gruppenpolysaccharid der B-Streptokokken (Streptococcus agalactiae) sezernieren. Die Hybridomzelien sollen ökonomisch günstig in vitro und in vivo kultivierbar sein und für darauffolgende Reinigungsschritte ausreichende Mengen an monoklonalen Antikörpern sezernieren. Die monoklonalen Antikörper sollen bezüglich ihrer Spezifität im ELISA gegenüber verschiedenen anderen bakteriellen Antigenen charakterisiert sein.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß zunächst Mäuse vom Stamm Balb/c mit formalinabgetöteten Bakteriensuspensionen eines B-Streptokokkenstammes (090R) der Optischen Dichte 1,0 mit ΊΟΟμΙ je Immunisierungsdosis nach einem bestimmten erfinderischen Schema immunisiort wurden. Die Immunisierung erfolgte über einen Zeitraum von 8 Wochen bei zweimaliger intravenöser Applikation der genannten Immunisierungsdosis pro Woche. Als vorteilhaft erwies sich die Immunisierung bei 8-10 Wochen alten weiblichen Mäusen.

Aus den Milzen derart hyperimmunislerer Mäuse wurden 4 Tage nach der letzten Immunisierung nach einem beschriebenen Verfahren Zellsuspensionen hergestellt.

Als Fusionspartner für diese Zellen wurden Mausmyelomzellen der Linie P3 χ 63 Ag8/653 (Kearney et al., J. Immunol., 1979,123, 1548) verwendet. Die Kultivierung dieser Zellen erfolgte in einem Zellzuchtmedium RPM11640, das mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) supplementiert wurde.

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Dis Zeilfusion wurde ..ach Vermischen beider Fusionspartner im Verhältnis 1:5 (Myolomzellinie zu Milzzellen) und ihrer Sedimentation unter Verwendung von Polyethylenglykol durchgeführt. Anschließend erfolgte die Verteilung der fusionierten Zellen in eine Vielzahl von separaten 200 μΙ Kulturen. Zur Selektion der fusionierten von den nichtfusionierten Myelomzellen wurde ein Zellkulturmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthielt (ÜTTLEFIELD, Science 1964,145,709), verwandt. Damit erfolgte erfindungsgemäß die Abtrennung jener Klone, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren. Die Detektion dieser Klone erfolgte durch den Nachweis sezernierter Antikörper in den Zellkulturüberständen wachsender Hybridome mittels eines spezifischen Enzymimmunoassay, der auf der Festphasenbindung von Phenol/Wasser-extrahiertem B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid beruht.

Die so detektieren Antikörper sind spezifisch für das B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid des Streptococcus agalactiae. Ermittelte PrimärzellkulU'ren wurden bis zur Monoklonalität klonie.1 und rekloniort, bis gesichert monoklonal Subklone mit stabil ar Antikörperproduktion in hoher Qualität und Quantität etabliert waren. Diese Hybridome bezeichneten wir als H-CB-GBS. Besonders geeignet sind die Zellkulturen H-CB-GSS-G1, -G 2, -G3 und -G4.

Die aufgeführten Hybridome sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie der AdW, Berlin-Buch, unter folgenden Nummern registriert:

H-CB-GBS-G4 als ZIM-0298 •H-CB-GBS-G3alsZIM-0299 H-CB-GBS-G 2 als ZIM-0300 H CB-GBS-G1 als ZIM-0301

Die aufgeführten Hybridomzollkulturen eignen sich für eine Massenproduktion von monoklonalen Antikörpern In-vivo und in vitro.

Bei der In-vitro-Kultivierung der genannten Hybridome lassen sich bei Aussaat von 5 · 10⁵ Zellen in herkömmliche 6-well-Zellkulturplatten bis zu 25pg/lgG pro ml Zellkulturüberstand und 30Mg IgM ml Zellkulturüberstand nachweisen.

Die In-vivo-Produkten monoklonaler Antikörper erfolgte durch intra-peritoneale Applikation von 2-10 χ 10⁶ Zellen/ml in mit Pristan vorbehandelter Mäuse nach bekanntem Verfahren. Nach etwa 8-24 Tagen lassen sich durch Punktion bis zu 10ml Ascitestlüssigkeit konnten bis zu 20 mg spezifischer Antikörper nachgewiesen werden. Auf diese Weise konnten aus den genannten Hybridomen die monoklonalen Antikörper GB-GBS-G 1,-G2, -G3 und -G4 gewonnen werden. Durch verschiedene biochemische und immunochemische Verfahren lassen sich die Antikörper bis zu einem hohen Reinheitsgrad anreichern. Für die Entwicklung bestimmter Testverfahren lassen sich die Antikörper mit Partikeln bzw. mit Enzymen koppeln. Sie können außerdem biotiniliert bzw. für Reinigungsverfahren an Trägermaterialien gekoppelt werden.

Die erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper (mAK) weisen einen hohen Grad an Spezifitätscharakterisierung gegenüber verschiedenen bakteriellen Antigenen auf, die als kreuzreagierende Komponenten einen Einsatz der bisher beschriebenen mAK einschränken würden. Die neuen mAK zeichnen sich ferner durch eine nach Produktions- und Wachstumscharakteristik ausgewiesene hohe Produktion an spezifischen Antikörpern unter In-vitro- und In-vivo-Bedingungen

Anwendungsbeispiele

Beispiel I

Über einen Zeitraum von 8 Wochen werden 3 weibliche Mäuse im Alter von 8 bis 10 Wochen (Balb/c-Mäuse) 2x wöchentlich mit 100μΙ einer formalinabgetöteten B-Streptokokken-Vollkeimsuspension (optische Dichte 1,0 in d3r 1-cm-Küvette bei 650nm) intravenös immunisiert. 4 Tage nach der letzten Immunisierung werden 2 χ 10^s Milzzellen isoliert. Diese werden durch Polyethylenglykol 1500 mit 2 χ 10⁷ Myelomzellen der Linie P3 X63Ag8/653 fusioniert. Nach entsprechenden Waschschritten werden die Zellen in 96-well-Zellkulturplatten mit 10^s Zellen/well in 100 μΙ ausplattiert. Das Standardzellkulturmedium besteht aus RPMI 1640 mit 10 % FKS. Am folgenden Tag werden 100μΙ eines doppelt konzentrierten HAT-Mediums zugesetzt. Nach einer Woche werden 50μΙ HAT-Medium pro well zugegeben. Nach etwa 14 Tagen erfolgt die Prüfung der Primärkulturen mittels eines hochspezifischen EIA auf die Produktion B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid-spezifischer Antikörper der Maus-Immunglobulinklasse G. Nach dem genannten Verfahren können bis zu 15 %-spez. IgG-Antikörper-produzierende Primärkulturen erzeugt werden.

Die positiven Primärkulturen werden auf Peritonealmakrophagen der Maus (10Vwell) nach dem Grenzverdünnungsverfahren Moniert und rekloniert. Auf diese Weise kann eine hohe Zahl monoklonaler Zellinien mit spezifischer Anti-Gruppe-B-Streptokokken-Gruppen-Polysaccharid-Antikörperproduktion gewonnen werden.

Beispiel Il

Die bis zur Monoklonalität gezüchteten Zellinien mit spez. Antikörperproduktion gegen B-Streptokokken-Gruppen-Polysaccharid werden in feuchter Atmosphäre mit einem 5%igen CGyAntiil in einem Standardkulturmedium gezüchtet. Schrittweise Adaptierung erlaubt die Verringerung des FKS-Anteils auf 2-5%.Durch Verdünnung im Verhältnis 1:10 wird das Zellkulturvolumen schrittweise vergrößert. Nach Erreichen der Massenkultur in Rollerflaschen von 500ml Fassungsvermögen ist die Passage in den 5Ol Bioreaktor möglich.

Beispiel III

In 6-well-Kulturplatten werden die monoklonalen Hybridome bis auf Zellzahlen von 1 χ 10⁶rnl gezüchtet. Die Zellen werden 2x in isotonischer Phosphatpufferlösung gewaschen und in einer Konzentration von 5 x 10⁶ Hybridomzellen/ml in der gleichen Lösung aufgenommen. Je 1 ml dieser Zellsuspension wird in Balb/c-Mäuse, die 8 Tage vorher mit 1 ml Pristan i. p. behandelt wurden, i. p. appliziert. Die Ascitesproduktion läßt sich nach 8-14 Tagen an der Bauchschwellung der Mäuse feststellen. 2-15ml Ascites mit einem Antikörpergehalt von bis zu 20mg spezifischem Antikörper konnten pro Maus gewonnen werden. Die Reinigung der Antikörper erfolgte nach bekannten Verfahren.

Beispiel IV

Nach dem beschriebenen Schema wurden Hybridomzellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen B-Streptokokkongruppenpolysaccharid gewonnen, die mit H-CB-GBS-G1, -G 2, -G 3, und -G 4 bezeichnet wurden. Diese Zellinion wurden bezüglich ihrer Spezifität getestet (Tabelle 1) und für die Optimierung des Verfahrens der Herstellung entsprechender Antikörper charakterisiert (Tabelle 2).

Tabelle 1: Spozifitätstestung monoklonaler Antikörper gegen das B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid des Sc. agalactiac

Extinktion 460nm (Entwicklung, Peroxidase markierter Anti-Species-Antikörper, Substrat OPD) Testung ZKÜ, Festphasenbeladung mit LANCEFIELD-Antigenen aus

Antikörper

ScA

ScG

CB-GBS-GI	0,096	0,122	0,103	2,0
CB-GBS-G 2	0,085	0,112	0,076	2,000
CB-GBS-G 3	0,180	0,180	0,168	2,000
CB-GBSG 4	0,094	0,096	0,102	2,000

Tabelle 2: Charakterisierung der Hybridomzellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen Gruppe B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharid

Klon	Verdoppe	IgG-	Ig-Klasse	Isoelektr
	lungszeit	Produktion		Punkt
	(h)	(pg5x10⁵
		Zellen/ml)
H-CB-GBS-G 1	19	10,1	G	>8,0
H-CB-GBS-G 2	21	12,0	G	>8,0
H-CB-GBS-G 3	27	24,0	G	>8,0
H-CB-GBS-G 4	21	14,0	G	>8,0

Claims

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die Strukturen des B-Streptokokken-Gruppenpolysaccharides des Streptococcus agalactiae erkennen, durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit B-Streptokokken und Immortalisierung ihrer Milzlymphozyten mit einer murinen Myelomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß daraus die Hybridomzelien H-CB-GBS-G1 (ZIM-0301), H-CB-GBS-G2 (ZIM-0300), H-CB-GBS-G3 (ZIM-0299), H-CB-GBS-G4 (ZIM-0298), selektiert zur Züchtung eingesetzt und aus dem zellfreien Überstand die monoklonalen Antikörper CB-GBS-G 1, CB-GBS-G 2, CB-GBS-G 3, CB-GBS-G 4 isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Milzlymphozyten erfolgt, nachdem das Antigen 8 bis 10 Wochen alten weiblichen Mäusen über einen Zeitraum von 8 Wochen zweimal wöchentlich intravenös appliziert wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper biotiniliert oder an Partikel, Enzyme bzw. an Trägermaterialien gekoppelt werden.