DD287956A5 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen das mannan-antigen des candida albicans - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen das Candida-albicans-Mannan-Antigen (CAM). Durch Immunisierung von Maeusen und Immortalisierung ihrer Milzlymphozyten mit einer murinen Myelomzellinie werden die Hybridomzellen H-CB-CAM-G1 und -M1 (ZIM-0484 und -0483) und daraus die entsprechenden monoklonalen Antikoerper CB-CAM-G1 und -M1 erhalten. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnostik.{Antikoerper; monoklonale Antikoerper; Antigen; Candida albicans; Mannan-Antigen; Immunisierung; Maeuse; Hybridzellen; Medizin; Veterinaermedizin; Lebensmittelhygiene; Diagnostik}

Description

aufgeteilt. In einem Hypoxanthln, Aminopterin und Thymidin enthaltendem Zellkulturmedium (HAT) nach UTTLEFIeLD (Science1964,145,709) werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelom- und Milzzellen abgetrennt underfindungsgemfiß Klone selektionlert, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren.

Die Detektion dieser Klone erfolgt dadurch, daß im zellfreien Überstand der angelegten Zellkulturen durch ein geeignetes Verfahren (z.B. einem spezifischen Enzymimmunoassay [EIA]) sezernierte Antikörper gegen das Mannan-Antigen von Candida

alblcans nachgewiesen werden. Die Primärzellkulturen mit Anti-Candida albicans-Mannan-Antigen-Antikörperproduktionworden kloniert und mehrmals rekloniert, bis monoklonale Subklono erhalten werden, die stabil und in hohen Konzentrationendie gewünschten spezifischen Antikörper sezernieren.

Die so isolierten Hybridome werden mit H-CB-CAM bezeichnet. Besonders geeignet sind die Zelllnlen H-CB-CAM-G1 und H-CB-CAM-M1. Diese zwei Hybridome sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Molekularbiologie der AdW der DDR, Berlin-Buch, unter folgenden Nummern registriert:

H-CB-CAM-G1 alsZIM-0484 H-CB-CAM-M1 alsZIM-0483.

Die hinterlegten Hybridomzellkulturen eignen sich für eine Massenproduktion von monoklonalen Antikörpern in vitro und in

vivo.

Zur Charakterisierung des Wachstumsverhaltens der genannten Zellinien unter In-vivo-Bedingungen wurden die Zellen in

6-well-Zellkulturplatten bis zu einer maximalen Zelldichte von 8 χ 10⁶ Zellen/ml kultiviert, wobei Antikörperkonzentrationen im

Zellkulturüberstand bis zu 26 Mg/mI Ig erreicht werden. Im zweiten Fall werden die Zellen auf eine Konzentration von

1-5 x 10^ü Zellen/ml eingestellt und in Pristan vorbehandelte Mäuse intraperitoneal nach bekanntem Verfahren appliziert. Nachca. 8-24 Tagen lassen sich durch Punktion bis zu 13ml Ascitesflüssigkeit gewinnen.

Auf diese Weise werden aus den genannten Hybridomen die monoklonalen Antikörper CB-CAM-G1 und CB-CAM-M1

gewonnen. Durch Anwendung verschiedener biochemischer und immunchemischer Verfahren lassen sich die genannten

Antikörper bis zu einem hohen Reinheitsgrad anreichern. Für die Entwicklung bestimmter Testverfahren können die Antikörper mit Enzymen oder partikulären Trägern kovalent bzw.

adsorptiv koppeln (Peroxidase-Marklerung bzw. Latex-Kopplung z. B.). Sie lassen sich jedoch auch biotinilieren oder für spezielle

Reinigungsverfahren an verschiedene Trägermaterialien koppeln.

Anwendungsbeispiele Beispiel 1

Über einen Zeitraum von 8 Wochen werden drei weibliche Balb/c-Mäuse 2x wöchentlich mit 100 μΙ einer Formalin-inaktivierten-Candida-albicans-Vollkeimsuspension (OD = 1,0 in der 1-cm-Küvette bei 650nm) je Versuchstier intravenös immunisiert. 4 Tage nach der letzten Antigengabe werden die Milzen der Versuchstiere entnommen und mittels Glashomogenisator Einzelzellsuspensionen hergestellt. Je Versuchstier lassen sich 1-2 χ 10⁸ Milzzellen isolieren. Diese werden mit Myelomzollen der Linie P3X63 Ag 8/653 im Verhältnis von 1:3 bis 1:8 (Myelomzellen zu Milzzellen) gemischt und mittels Polyethylenglykol 1500 fusioniert. Nach entsprechenden Waschschritten werden die Zellen in 96-well-Zellkulturplatten mit 10^s Zellen/well in 100μΙ ausplattiert.

Das dabei zur Kultivierung genutzte Standardzellkulturmedium besteht aus RPM11640 mit 10%igem FKS-Zusatz. Am folgenden Tag werden 100μΙ eines doppelt konzentrierten HAT-Selektionsmediums zugesetzt. Eine weitere Zugabe von 50μΙ des HAT-Mediums pro well der Zellkulturplatte erfolgt nach einer Woche. Nach 14tägiger Zellkultur werden die Primärzellkulturüberstände mit einem hochspezifischen EIA hinsichtlich ihres Gehaltes an spezifischen Antikörpern geprüft. Der angewandte EIA basierte auf der Festphasenbindung von Phenol/Wasser-extrahiertem Candida albicans Mannan-Antigen bei einem Beladungsoptimum von 10pg CAM/ml PBS. Das zum Antikörpernachweis in der Festphasenbindung an Polysteron eingesetzte CAM (Candida albicans-Mannan-Antigen) wurde sowohl chemisch als auch immunochemisch charakterisiert. Die Testergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt. Die positiven Primärkulturen werden auf Peritonealmakrophagen der Balb/c-Maus dOVwell) nach dem Grenzverdünnungsverfahren kloniert und bis zum Erreichen der Monoklonalität rekloniert. Auf diese Weise werden Zellinien mit spezifischer Anti-Candida albicans-Mannan-Antigen-Antikörperproduktion erhalten.

Tabelle 1 Anzahl immunglobulinproduzierender Primärkulturen nach intravenöser Antigenapplikation

Fusions nummer	wells total	wells mit Primärkul turen	wells mit Ig-Produktion IgM IgG	130 128 135	Anti-CAM-lgG	IgM
1 2 3	288 288 288	276 288 288	100 109 128	8 14 38	8 12 17

Prozent

98,6

39,5

46,1

5,0

3,6

Tabelle 2

Charakterisierung der Hybridomzellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen das Candida albicans-Mannan-Antigen

Klon Verdoppelungs· Ig-Klasse Ig-Produktion

zeit(h) (Mg/24h/O,5xiO^e Zellen/ml

H-CB-CAM-G1 31 G 26,0

H-CB-CAM-M1 25 M 18,3

Beispiel 2

Nach dem beschriebenen Verfahren sind Hybridomzellinien mit monoklonaler Antikörperproduktion gegen das Candida albicans-Mannan-Antigen hergestellt worden, die mit CB-CAM-G1 und CB-CAM-M1 bezeichnet wurden. Diese Zellinien wurden für die Optimierung des Verfahrens zur Herstellung der entsprechenden Antikörper charakterisiert (Tabelle 2).

Die Spezifitätscharakterisi 'rung der durch die genannten Zellinien produzierten Antikörper ist in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3

Charakterisierung der Spezifität monoklonüler CB-CAM im EIA gegenüber verschiedenen bakteriellen Antigener, (Festphasenbindung von Vollkeimsuspensionen (VK] bzw. immur.ochemisch charakterisierten Teilantigenen (PA], Entwicklung mit Anti-Specle8-AntikörpernPOD-markiert, Testung Zellkulturüberständenativ)

Antikörper	CB-CAM-G1	CB-CAM-M1
Ext. 460 nm
Antigen
Streptococcus
agalactiae(VK)	0,080	0,050
Gruppenpolysaccharid
aus Str. agalact. (PA)	0,044	0,046
Α-Streptokokken (PA)
(Gruppenpolysaccharid)	0,081	0,122
C-Streptokokken (PA)
(Gruppenpolysaccharid)	0,076	0,046
G-Streptokokken (PA)
(Gruppenpolysaccharid)	0,120	0,082
Candida albicans (VK)	0,247	0,152
Candida-Mannan-Antigen (PA)	1,823	1,418
A-Meningokokken(VK)	0,067	0,035
Hämophilus influence
Typ b (VK)	0,043	0,026

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die das Candida albicans-Mannan-Antigen (CAM) erkennen, durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit Candida albicans-Vollkeimsuspensioi.an und Immortalisierung ihrer Milzlymphocyten mit einer murinen Myelomzellinie, dadurch gekennzeichnet, daß daraus die Hybridomzellen H-CB-CAM-G1 (ZIM-0484) und H-CB-CAM-M1 (ZIM-0483) selektiert zur Züchtung eingesetzt und aus dem Überstand die monoklonalen Antikörper CB-CAM-G1 und CB-CAM-M1 isoliert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung der Milzlymphozyten erfolgt, nachdem das Antigen 8 bis 10 Wochen alten weiblichen Mäusen über einen Zeitraum von 8 Wochen zweimal wöchentlich intravenös appliziert wird und die letzte Gabe des Antigens 4 Tage vor der Milzentnahme erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper biotiniliert oder an Enzyme, z. B. zur Peroxidase-Markierung, an partikuläre Träger, z. B. Latex bzw. an Trägermaterialien gekoppelt werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das Mannan-Antigen des Candida albicans. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die veterinärmediznische Diagnostik, die humanmedizinische Diagnc stik und die Lebensmittelchemie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Herstellung monoklonaler Antikörper wurde bereits von KÖHLER und MILSTEIN im Jahre 1975 beschrieben (Nature 1975, 256,495). Sie erfolgte durch somatlsche Fusion von murinen antikörpersezernierenden Zellen und Zellen einer permanent wachsenden Plasmocytomzellinie, in deren Ergebnis Hybridoma erzeugt werden konnten, die nach verschiedenen Klonierungsschritten monoklonale Antikörper murinen Ursprungs gegen eine gewünschte Antigenspezifität produzierten. Die Herstellung muriner monoklonaler Antikörper gegen Candida albicans mittels der von KÖHLER und MILSTEIN referierten Prinziplösung wird ebenfalls im Schriftum beschrieben (HOPWOOD, V., D. POULAIN, B. FORTIER, G. EVANS und A. VERNES, 1986, Infect. Immun. 54,222; MIYAKAWA, Y., K. KAGAYA, Y. FUKAZAWA und G. SOE, 1986, J. Clin. Microbiol. 23,881; POLONELLI, L., und G.MORACE, 1986, J. Clin. Microbiol. 23,366; STROCKBINE, A., M.T.URGEN und H.R.BUCKLEY, 1984, Infect. Immun. 43,1012; BORG, M., D.WATTERS, B.REICH und R.RÜCHEL, 1988, ZbI. Bakt. Hyg. A, 268,62; LINEHAN, L., E.WADSWORTH und R. CALDERONE, 1988, Infect. Immun. 56,1981).

Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monoklonale Antikörper vom Typ CB-CAM-G1 und CB-CAM-M1 sezernieren.

Ziei der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht in der Herstellung muriner monoklonaler Antikörper, die für den Aufbau von Testsystemen zum Nachweis von Candida albicans innerhalb der medizinischen, veterinärmedizinischen und lebensmittelhygienischen Diagnostik geeignet sind.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein effektives Verfahren zur Erzeugung von Hybridomzellinien aus deren Zellkulturüberständen in weiterführenden Verfahrensschritten monoki male Antikörpergegen das Mannan-Antigen des Candida albicans gewonnen werden können, zu entwickeln.

Die nach beseht !ebenem Verfahren erzeugten Hybridomzellinien sollen mit ökonomisch günstigstem Aufwand in vitro und in vivo kultivierbar i'ein, und die für eine wirtschaftliche Reinigung erforderlichen Mengen an stabilen Antikörpern sezernieren. Die Aufgabenlösung erfolgte durch die Immunisierung von Mäusen des Inzuchtstammes Balb/c mit einer Vollkeimsuspension des Candida albicans (Formalin-inaktiviert, OD 1,0 in der 1-cm-Küvette bei 650nm) nach einem bestimmten erfinderischen Schema. Als vorteilhaft erwies sich die Verwendung von 8-10 Wochen alten weiblichen Mäusen des genannten Inzuchtstammes. Die Immunisierung erfolgte durch mehrmalige Antigenapplikation, wobei keinerlei Adjuvantien zur Anwendung kamen. Als ökonomisch günstige Variante erwies sich die intravenöse Applikation von 100μΙ Vollkeimsuspension 2x wöchentlich je Versuchstier über einen Zeitraum von 8 Wochen. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse wurde

4 Tage nach der letzten Antigenapplikation in an sich bekannter Weise eine Einzelzellsuspension mittels Glashomogenisator hergestellt. Zur Durchführung der somatischen Fusion der gewonnenen Antikörperproduzierenden Zellen wurden Mausmyelomzellen der Linie P3X63 Ag 8/653 (KEARNEY etal.,J.lmmunol.1979,123,1548) als Fusionspartner verwendet. Die Kultivierung der Mausmyelomzellen erfolgte in Zellzuchtmedium RPM11640 mit einem 10%igem Anteil an fetalem Kälberserum (FKS). Nach dem Durchmischen beider Fusionspartner in FKS-freiem Zellzuchtmedium Und anschließender Sedimentation, wurde durch Zugabe von Polyethylenglykol die Zellfusion induziert. Darauffolgend wurden die Zellen in eine Vielzahl von separaten 200μΙ Kulturen