DD290217A5

DD290217A5 - Verfahren zur herstellung von prednisolon-17-acetat

Info

Publication number: DD290217A5
Application number: DD28160885A
Authority: DD
Inventors: Georg Truckenbrodt; Karin Porwol; Horst Steppan; Lilian Hess; Bernd Roeder; Heinz Stopsack; Joerg Auweiler; Gerhard Langbein; Harry Henkel
Original assignee: Veb Jenaphrarm,De
Priority date: 1985-10-10
Filing date: 1985-10-10
Publication date: 1991-05-23

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Transformation von * zu Prednisolon-17-acetat. Es ist dadurch charakterisiert, dasz die Ausgangsstoffe, die in 17a-Stellung verestert sind und die in anderen Positionen acylierte Hydroxylgruppen enthalten koennen, mit Pilzen, insbesondere mit Cochliobulus lunatus 148, Absidia orchidis 409 bzw. Absidia coerula 468 hydroxyliert werden und durch Inhibierung der Esterasen der Pilze bei einer Fermentationsfuehrung im Wasserstoffionenkonzentrationsbereich von 5 bis 7 die Verseifungsreaktion unterbunden wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist die mikrobialle Transformation von 11 -Desoxy-1,4-dien-3-oxo-steroiden der Pregnanreihe, die in 17a-Stellung verestert sind, zu Prednlsolon-17-acetat. Prednisolonacetat wird als Arzneimittel zur Behandlung der rheumatischen Arthritis, des Asthmas, von Dermatosen und anderen Krankheiten eingesetzt.

Die mikrobielle Hydroxylierung von 11 -Desoxy-1 ,«l-dien-S-oxo-steroiden dor Pregnanreihe, die in 17a-Stellung verestert sind, zu Prednisolon-17-acetat ist eine wirtschaftlich und technisch vorteilhafte Variante zur Gewinnung dieses hochwirksamen Glukokortikoids.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Von den zahlreichen bekannten mikrobiellen Hydrolxylierungen am Steroidgerüst kommt der 11 ß-Hydroxylierung die größte Bedeutung zu. Zur Gewinnung von Prednisolon bzw. seiner Ester werden industriell die nachfolgenden Reaktionsschritte durchgeführt:

- 11 ß-Hydroxylierung von Reichsteins Substanz S (RSS) zu Hydrocortison

- Isolierung des Hydrocortisons

- Mikrobielle Dehydrierung des Hydrocortisons zu Prednisolon

- Isolierung des Prednisolons.

Die zwei biologischen Stufen mit ihrer separaten Isolierung dar Fermentationsprodukte haben signifikanten Einfluß auf die Kosten der Endprodukte. Es ist bekannt, daß bei Einsatz von Acetaten als Ausgangssteroide der Durchsatz erschwert und die Effektivität des Gesamtprozeses verschlechtert wird. Die benutzten Mikroorganismen, bevorzugt Arten von Curvularia, Cunninghamella und Trichothecium, besitzen Esterasen, und es entsteht als Endprodukt ein Gemisch von Steroidalkoholen und Estern. Ein weiterer chemischer Reaktionsschritt zur Erzielung einej einheitlichen Endproduktes schließt sich an. 11 ß-Hydroxylierungen von 1,4-Dien-steroiden der Pregnanreihe sind im industriellen Maßstab nicht bekannt. Derartige Verfahren besitzen zum gegenwärtigen Zeitpunkt nur akademisches Interesse. Das aus der DE-OS 2901 561 bekannte Verfahren mit dem Pilz Curvularia lunata läßt nur einen Durchsatz von 0,5g Stero'd/I Kulturlösung zu.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, mit geeigneten Mikroorganismen, bevorzugt Pilzen bzw. deren Enzymsystemen in konventioneller Fermentationsweise der Batch-Kultur oder der semikontinuierlichen bzw. kontinuierlichen Fermentationsführung und/oder mit immobilisierten Zellen der Mikroorganismen im trägerfixierten Zustand 17-acylierte 11 -Desoxy-1,4-dien-steroide der Pregnanreihe zu dem entsprechenden 17a-Prednisolonacetat zu transformieren. Bei den eingesetzten Mikroorganismen, bevorzugt Phycomyceten und Ascomyceten, muß gesichert sein, daß die in ihrem Enzymbesteck neben Hydroxylasen enthaltenen Cäterasen, die normalerweise ein Gemisch von Prednisolon und 17 μ-Prednisolonacetat liefern, durch die Fermentationsführung, speziell bei Nutzung des physiologischen Zustandes der logarithmischen Wachstumsphase, inhibiert werden. Dadurch wird erreicht, daß am Ende der Fermentation nur 17a-Prednisolonacetat vorliegt, das dann besonders günstig aus der Kulturlösung zu gewinnen ist. Das Verfahren muß einen hohen Steroiduurchsatz (1 bis 2g Steroid/I Kulturlösung) garantieren, wobei in 17-Stellung acylierte 11 -Desoxy-1,4-dien-3-oxo-steroide der Pregnanreihe als Ausgangssubstanzen dienen, die Zahl der Nebenprodukte gering ist und ihr mengenmäßiger Anteil nicht stört.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße erfahren zur Herstellung von ^a-Prednisolonacetat ist dadurch charakterisiert, daß 17-acylierte 11-Desoxy-1,4-dien-3-oxo-steroide der Pregnanreihe, die in 17a-Stellung verestert sind und die auch in anderen Positionen acylierte Hydroxylgruppen enthalten können, mit Pilzen der Gattungen Cochliobulus und Absidia transformiert werden. Besondere Eignung besitzen

Cochliobuluslunatur 148 Absidiaorchidis 409 Absidiacoerula 468. Die im Enzymbesteck der angeführten Pilze enthaltenen Esterasen werden durch die Fermentationsführung bei Nutzung der

optimalen physiologischen Zustandsform des Mycels für die 11 ß-Hydrioylierung inhibiert, so daß nur Prednisolonacetat am

Ende der Transformation aus der Kulturlösung isoliert wird. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Transformationen zur Einführung einer 11 ß-Hydroxylgruppe in 17-acylierte

11 -Desoxy-1,4-dien-3-oxo-steroide der Pregnanreihe am Ende der logarithmischen Wachstumsphase, kurz vor Beginn der

Kohlenhydratlimitation, besonders vorteilhaft vorgenommen werden können. Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, das Mycel in Form der Pellets wachsen zu lassen, um bei optimaler Sauerstoffversorgung

kurze Transformationszeiten und hohe Substratdurchsätze zu erhalten. Das Mycel kann zu wiederholten Hydroxylierungen unter

aseptischen Bedingungen genutzt werden. φ

Die Phase der optimalen Hydroxylierung ist erreicht, wenn mit den bekannten analytischen Methoden eine Glucosekonzehtration

von 0,02 g/l Kulturlösung ermittelt wird, die Wasserstoffionenkonzentration einen Wert von 5 bis 7 erreicht und die Biomasse ein

Trockengewicht von 10g/l Kulturlösung aufweist. Die Hydroxylierung wird über längere Zeiten gefühlt, indem der pH-Wert durch Titration mit Kohlenhydratlösungen,

vorzugsweise Glucose bzw. Saccharose, bei 0,02 bis 0,04g Glucose bzw. Saccharose je I Kulturlösung gehalten undgegebenenfalls mit Mineralsäuren, wie Schwefelsäure oder Salzsäure, auf den für die Hydroxylierungsreaktion geeignetenpH-Bereich von 5 bis 7 eingestellt und die Sauerstoffversorgung mittels Belüftens und Rührens auf einen Sättigungsgrad von40% bis 50% gebracht wird. Der Durchsatz an Ausgangssteroid wird durch das Sauerstoffangebot limitiert.

Die für die Fortführung der Hydroxylierungsreaktion angegebenen Bedingungen hemmen gleichzeitig die Esterasen, deren

pH-Optimum bei 7,5 bis 8,5 liegt.

Die Ausgangssubstanzen werden mikronisiert odor in einem Lösungsmittel, wie Aceton, Dimethylformamid-Wassergemisch

oder niederen Alkoholen, gelöst zugegeben. Besondere Eignung zur kontinuierlichen Zugabe haben methanolische CaCI₂-

Lösungen, bei denen die Ausgangssteroide bereits bei Zimmertemperatur gelöst werden. Die Zugabe erfolgt während des logarithmischen Wachstums. Sie beginnt kurz vor Eintritt der Kohlenhydratlimitation, in der Re(> ' 6 bis 8 Stunden nach dem Beimpfen. Fü » Erfindung sind durch die Wahl der Mikroorganismen, durch den Nährboden und durch die Fermentationsführung Bedingungen gegeben, die hohe Ausbeuten an Prednisolon-17-acetat ergeben. Das erfindungsgemäße Verfahren wird an folgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert: Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Herstellung von 17-Prednisolonacetat aus 17-Acetoxy-21 -hydroxy-pregna-1,4-dien-3,20-dion (1 -Dehydro-RSS-17-acetat) mit Cochliobulus lunatus

1.1. Inkubation von i-DehydiO-RSS-17-acetat mit Cochliobulus lunatus 148

Laborfermentation:

2,5-l-Steilbrustflaschen mit 500ml Nährlösung, die einen pH-Wert von 6,5 bis 6,7 besitzt und folgende Zusammensetzungaufweist

Maisquellwasser (100%Trockengewicht)	ad	1,0%
Glucose	2,5%
NaNO₃	0,2%
KH₂PO₄	0,1 %
MgSO₄	0,05%
Aquadest.	1,01

werden mit 10% einer 22h alten Kulturlösung von Cochliobulus lunatus beimpft. Die submerse Vorzuchtstufe wird 22 Stunden bei 26⁰C ± 0,5⁰C auf einer Rotationsschüttelmaschine kultiviert (240U/min; Amplitude 4cm). 50ml der Kultur genügen zur Beimpfung von 500ml Nährlösung der Transformationsstufe in 2,5-l-Steilbrustflaschen Die Nährlösung hat folgende Zusammensetzung:

Hefeextrakt 1,0%

Glucose 1,5%

KH₂PO₄ 0,025%

MgSO₄ 0,03%

Aquadest. ad 1,01

und muß einen pH-Wert von 5,0 aufweisen.

Die Kulturbedingungen sind: Temperatur 29⁰C ± 0,5⁰C, Belüftung 240U/min, Amplitude 4cm. Nach 6stündigem Wachstum ist die Nährlösung bewachsen, der Feuchtmycelgehalt beträgt 7,5 bis 10,5% (3000 U/min über

3 min). Zu diesem Zeitpunkt erfolgt die erste Zugabe von 125 mg 1 -Dehydro-RSS-17-acetat, gelöst in 1 ml Dimetnylformamid.

Dieser Prozeß wird nach 6 Stunden wiederholt, so daß in einem Ansatz von 500ml dann 250mg 1-Dehydro-RSS-17-acetat

enthalten sind.

Der Transformationsverlaut wird mit dünnschichtchromatographischen Methoden verfolgt. Er wird beendet, weil keine Ausgangssubstanz mehr nachweisbar Ist. 18 Stunden nach der letzten Zugabe ist die Transformation beendet. In der Kulturlösung sind 58% Prednisolon und 26% Prednisolon-17-acetat gebildet.

1.2. Inkubation von : Dehydro-RSS-17-acetat mit Cochliobulus lunatus 148 im 30-l-Fermanter 20I Nährlösung folgender Zusammensetzung:

Maisquellwasser (bezogen auf Trockengewicht)	3%
Saccharose	1%
MgSO₄	0,15%
KH₂PO₄	0,075%
ZnSO₄	0,005%
CaCI₂	0,1 %
Polypropylenglykol	0,005%
Leitungswasser

die einen pH-Wert von 5,2 besitzt, werden in einem 30-l-Fermenter 35min bei 123⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen auf 29⁰C wird mit 21 Impfmedium aus Steilbrustflaschen beimpft, dessen Nährlösung die Zusammensetzung, wie bei 1.1. beschrieben, hat, beimpft. Nach einer Wachstumsphase von 6 Stunden (Rührung 540 U/min; Belüftung: 11 Luft/l Kulturlösung -min; Temperatur:

29°C ± 0,5°C; Sauerstoffsättigung: 50%) ist ein pH-Wert von 4,8 bis 5,2 erreicht, die Glucosekonzentration beträgt 1,2g pro I Kulturlösung.

Die Zugabe von 30g 1-Dehydro-RSS-17-acetat, gelöst in 11 methanolischer CaCI₂-Lösung, erfolgt kontinuierlich über einen Zeitraum von 10 Stunden. Die Transformation wird, wie bei 1.1. beschrieben, kontrolliert, der pH-Wert wird mit 1 η H₂SO₄ bei pH 5,0 bis 5,5 gehalten und die Glucosekonzentration mittels 50%iger steriler Glucoselösung bei 0,2g Glucose/I Kulturlösung eingestellt. In der Regel ist bei Einhaltung des Fermentationsregimes das Ausgangsmatcrial 36 bis 40 Stunden nach Ende der Zugabe umgewandelt.

Nach vollständigem Umsatz wird der Versuch aufgearbeitet, das Mycel abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Kulturfiltrat wird mit Methylenchlorid erschöpfend extrahiert, der Extrakt im Vakuum möglichst weit eingeengt und das Konzentrat über Nacht in den Kühlschrank gestellt.

Das ausgefallene Kristallisat wird abgesaugt, gewaschen und im Vakuum getrocknet, anschließend analysiert. Der Gehalt an reinem Prednisolon-17-acetat beträgt 81 %, wovon 56% als Erstkristallisat gewonnen werden. Die weiteren 34 % Prednisolon-17-acetat sind aus der Säulenchromatographie der Mutterlauge zu gewinnen. Insgesamt können 71 % der theoretisch möglichen Ausbeute gewonnen werden.

Beispiel 2

Herstellung von 17-Predniso!onacetat aus 17,21-(1'Ethoxyethyliden-dioxy)-pregna-1,4-dien-3,20-dion (1-Dehydro-RSS-orthoester) mit Cochliobulus lunatus 148

Die Bedingungen des Wachstums und der Transformation entsprechen denen im Beispiel 1 unter 1.2.

Nach einer Wachstumsphase von 6 Stunden werden zu der Kulturlösung (31) 3g 1 -Dehydro-RSS-orthoester kontinuierlich über einen Zeitraum von 12 Stunden zutitriert. Der pH-Wert wird nach dem pH-Wert-Abfall zu Beginn des Wachstums auf pH 5,0 bis 5,5 eingestellt.

Aus dem 1-Dehydro-RSS-orthoester wird unter den gewählten Kulturbedingungen 1-Dehydro-RSS-17-acetat gebildet, das von den Hydroxylasen des Pilzes zu Prednisolon-17-acetat umgewandelt wird.

Aus 3g 1-Dehydro-RSS-orthoester werden 69% Prednisolon-17-acetat gewonnen.

Beispiel 3

Herstellung von 17-Prednisolonacetat aus 1 -Dehydro-RSS-17-acetat mit Absidia orchidis 409 bzw. Absidia coerula 468 21 Nährlösung folgender Zusammensetzung

Maisquellwasser (100 %TG)	0,5%
Glucose	1,5%
Pepton	0,4%
KH₂PO₄	0,05%
MgSO₄	0,025%
ZnSO₄	0,012%
Antaphron (Silikonöl)	0,005%,
Aqua dest.

die auf einen pH-Wert von 5,8 bis 6,2 eingestellt ist, werden mit 200 ml Kulturlösung des Pilzes Absidia orchidis 409 (bzw. Absidia coerula 468 bei gleicher Nährlösung) beimpft. Nach einer Wachstumsphase von 30 Stunden (Rührung: 630U/min; Belüftung: 11 Luft/l Kulturlösung · min; 40% Sauerstoffsättigung,Temperatur: 26⁰C ± 0,5"C)isteineMycelbildung von 10 bis 12,5% Biomasse (3000 U/min, 3 min lang) in Form von Pellets erreicht, der pH-Wert von 4,5 bis 5.0 und eine Glucosekonzentration von 0,3 bis 0,4g Glucose je I Kulturlösung gegeben.

Die Zugabe von 3g 1-Dehydrc-RSS-i7-acetat in 30ml Methanol erfolgt kontinuierlich über einen Zeitraum von 20 Stunden. Die Transformation wird, wie im Beispiel 1 unter 1.1. beschreiben, kontrolliert. In der Regel ist bei Einhaltung des Fermentationsregimes das Ausgangsmaterial 48 bis 60 Stunden nach Ende der Zugabe umgewandelt.

Die Aufarbeitung erfolgt, wie im Beispiel 1 unter 1.2. beschrieben. Man erhält nach Vakuumdestillation 65% Prednisolon-17-acetat.

Beispiel 4

Herstellung von 17-Prednisolonacetat aus 1 -Dehydro-RSS-orthoester mit Absidia orchidis 409 und/oder Absidia coerula 468 Werden 2g 1-Dehydro-RSS-orthoester den Kulturen der Pilze Absidia orchidis 409 und/oder Absidia coerula 468zugegeben und wird, wie im Beispiel 3 beschrieben, verfahren, so werden 63% Prednisolon-17-acetat erhalten.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Prednisolon-17-acetat aus 1 1-Desoxy-1,4-dien-3-oxo-steroiden, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangsstoffe, die in 17-Stellung verestert sind und die in anderen Positionen acylierte Hydroxylgruppen enthalten können, mit Pilzen hydroxyliert werden und durch Inhibierung der Esterasen der Pilze bei einer Fermentationsführung im Wasserstoffionenkonzentrationsbereich von 5 bis 7 die Verseifungsreaktion unterbunden wird.

2. Verfahren zur Herstellung von Prednisolon-17-acetat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur mikrobiellen Transfomation die Pilze

Cochliobuluslunatus 148
Absidiaorchidis 409

Absidiacoerula 468

verwendet werden.