DD294500A5 - Verfahren zur herstellung einer grossen anzahl von peptid-analogen - Google Patents
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Abstract
Es wird ein Verfahren zur Erzeugung einer groszen Anzahl von Analoga eines gewaehlten Peptids beschrieben. Das Verfahren umfaszt die folgenden Schritte: Synthetisierung von zwei unterschiedlichen Gemischen von gleichlangen Oligonucleotiden, die an einigen bestimmten Positionen unterschiedliche Basen und am 3-Ende einige identische Basen besitzen, Mischen der beiden Gemische zur Bildung eines Gemischs von partiell doppelstraengigen, gleichlangen DNA-Sequenzen, die danach enzymatisch in vollstaendig doppelstraengige DNA-Sequenzen umgewandelt werden, Schneiden des zuletzt genannten Gemischs mit zwei verschiedenen Enzymen zur Erzeugung von DNA-Sequenzen, die an einen in aehnlicher Weise geschnittenen Vektor ligiert werden koennen, Inserieren der DNA-Sequenzen in den Vektor durch Ligation, um ein Gemisch von Vektoren zu erzeugen, die dann in einer an sich bekannten Art und Weise in einen Wirt transformiert werden, Vermehrung des Wirts zur Bildung von Kolonien, die nacheinander analysiert werden, um die DNA-Sequenzen festzustellen, die fuer ein einzelnes Protein codieren, unter Expressionsbedingungen separate Vermehrung der groszen Anzahl von Wirten zur Erzeugung einer groszen Anzahl von Analoga des gewaehlten Peptids. Auszerdem werden neue Analoga von VIP und ein Plasmid, das ein Gen enthaelt, das fuer eines der neuen Analoga von VIP codiert, offenbart.{Verfahren; Herstellung; Peptid; Oligonucleotide; Basen; 3-Ende; DNA-Sequenzen; Enzyme; Vektor}
Description
Charakteristik dos bekannton Standes der Technik
Die pharmazeutische Industrie und unabhängige Wissenschaftler in der Forschung suchen ständig nach neuen Verbindungen, die «ich von nützlichen bekannten Verbindungen etwas unterscheiden, mit dem Ziel, noch wirksamere, noch spezifischere usw. Derivate zu finden. Gesetzt den Fall, die in Frage kommende bekannte Verbindung ist ein Peptid oder Polypeptid, so weiden ein oder mehrere Aminosäurereste von dessen Aminosäuresequenz durch andere natürliche oder nicht natürliche Aminosäurereste substituiert.
Für Screeningzwecke wäre es wünschenswert, wenn man gleichzeitig eine große Anzahl von Analoga eines gewählten Peptids herstellen könnte, um sowohl Zeit als auch Geld zu sparen.
Die vorliegende Erf'idung stellt ein Verfahren zur gleichzeitigen Erzeugung einer großen Anzahl von Analoga eines gewählten Peptids, worin alle Aminosäurereste die L-Konfiguration aufweisen, zur Verfügung, und die durch das Verfahren erzeugten Analoga sind Analoga von VIP.
Vasoaktives Intestinalpolypeptid (VIP) ist ein stark basisches Peptid mit einer Länge von 28 Aminosäuren mit einem C-terminalen Amid, das zur Glucagon-Secretin-Familie gehört. VIP wurde erstmals von S. Said und V. Mutt im Jahre 1970 (Said, S. I., und Mutt, V. (1970) Science 169,1217-1218) aus oberem Intestinalgewebe des Schweins isoliert und wurde später sowohl in Nervengewebe als auch in endokrinen Zellen (Said, S.l. [1982]) Vasoactive Intestinal Peptide (Raven Press, N.Y.) und (Said, S.l. [1984] Peptides 5,143-150) gefunden. Die biologischen Wirkungen von VIP umfassen die Gefäßerweiterung von Gehirnblutgefäßen, die Stimulierung der Prolaktinfreisetzung, die Stimulierung der Pankreasexokrinsekretion, die Wirkung auf die Peniserektion (Said, S. I. [1982]) Vasoactive Intestinal Peptide (Raven Press, N. Y.) und (Roslöne, W. H. [1984] Progress in Neurobiology 22,103-129) und (Mutt, V. [1083) in Brain Peptides, Herausgeber Krieger, D.T., und Autorenkollektiv), die Verstärkung des cholinergisch stimulierten Speichelflusses (Lundberg, J. M., und Autorenkollektiv [1982) Acta Physiol. Scan. 114,329-337) und die Wirkung als oberflächenaktive Substanz in der Lunge (Barnes, P. J. [1987] TIPS, 8,24-27). In jüngster Zeit wurde das für Human-VIP codierende Präkursor-Gen isoliert und sequenziert (Bodner, M., und Autorenkollektiv [1985] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82,3548-3551) und (Linder, S., und Autorenkollektiv [1987] Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 84, 605-609). Die Sequenzdaten zeigen, daß am 3'-Ende des für VIP codierenden Gens drei zusätzliche Tripletts vorhanden sind, die für die Aminosäuresequenz Gly-Lys-Arg codieren. Es wurde gezeigt, daß C-terminale Gly-Lys-Arg oder GIy allein als Substratstellen für C-terminale Amidierung durch Peptidylglycin-a-amidierende Monooxygenase (PAMase) wirken können, was in verschiedenen Geweben nachgewiesen wurde (Bradbury, A. F., und Autorenkollektiv [1982] Nature 298,686-688) und (Eipper, B. A., und Autorenkollektiv [1983] Peptides 4,921-928) und (Glembotski, C. Cry, und Autorenkollektiv [1984] J. Biol. Chem. 259, 6385-6392) und (Gomez, S., und Autorenkollektiv [1984] FEBS Lett. 167,160-164) und (Eipper, B. A., und Autorenkollektiv [1985] Endocrinology, 116,2497-2504) und (Quafik, H., und Autorenkollektiv [1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84,261-264). Es ist offensichtlich, daß die Massenproduktion von VIP, einem Peptidhormon von breiter biologischer Wirksamkeit, mittels gentechnischer Verfahren wünschenswert ist. Obwohl das Human-Präkursor-Gen für VIP isoliert und charakterisiert wurde (Bodner, M., und Autorenkollektiv [1985] Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82,3548-3551) und (Linder, S., und Autorenkollektiv [1987] Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84,605-609), wurde über seine Expression in einem anderen Organismus bisher noch nicht berichtet. Die erfindungsgemäßen VIP-Analoga wurden in E.coli produziert.
Darlegung des Wesens der Erfindung
In einem erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung einer großen Anzahl von Analoga eines gewählten
Peptids zur Verfugung gestellt, das folgende Stufen umfaßt:
Synthetisierung eines ersten Gemische von gleichlangen Oligonucleotiden, die an einigen definierten Positionen
unterschiedliche Basen und am 3'-Ende einige identische Basen besitzen,
Mischen des ersten Gemische mit einem in gleicherweise synthetisierten zweiten Gemisch von Oligonucleotiden, wobei die Basen r.m 3'-Ende der Oligonucleotido des ersten Gemischs an die Basen des 3'-Endes der Oligonucleotide des zweiten Gemische hybridisieren („annealing"), was zu einem Gemisch von partiell doppelsträngigen, gleichlangen DNA-Sequenzen führt, die danach enzymatisch in vollständig doppelstiängige DNA-Sequenzen umgewandelt werden, gleichzeitiges oder nacheinander ' erfolgendes Schneiden des Gemischs, das aus doppelsträngigen DNA-Sequenzen besteht, die am 3'-Ende eine Stelle zum Schneiden mit einem ersten Enzym und am 5'-Ende eine Stelle zum Schneiden mit einem zweiten Enzym besitzen, mit dem ersten und dem zweiten Enzym, um DNA-Sequonzen mit 3'- und 5'-Enden zu erzeugen, die an die 5'- und 3'-Enden eines in
ähnlicher Weise geschnittenen Vektors ligiert werden können,
Inserieren der so geschnittenen DNA-Sequenzen in den so geschnittenen-Vektor durch Ligation, um ein Gemisch von Vektoren zu erzeugen, die anschließend in einer an sich bekannten Art und Weise in einen Wirt transformiert werden,
Vermehrung des Wirts zur Bildung von Kolonien, die nacheinander analysiert werden, um die DNA-Sequenzen festzustellen, die
für ein einzelnes Protein codieren,
unter Expressionsbedingungen separate Vermehrung der großen Anzahl von Wirten, die Vektoren enthalten, die die identifizierten, für ein Protein codierenden Sequenzen aufweisen, um eine große Anzahl von Analoga des gewählten Peptids
herzustellen.
Beispiele für beim obengenannten Verfahren zu verwendende Wirte sind Bakterien, z. B. von Genus Bacillus oder Escherichia
coli, sowie Hefen, z.B. Saccharomyces cerevisiae.
Beispiele für beim obengenannten Verfahren zu veivvendende Vektoren sind Bakteriophagen und Plasmide.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Aspekts ist das gewählte Peptid ein Analog des vasoaktiven
Intestinalpolypeptids (VIP), der Vektor ist ein Plasmid und der Wirt ist E. coli.
Im Ergebnis der Durchführung der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde eine große Anzahl
von VIP-Analoga hergestellt, die einen zusätzlichen erfindungsgemäßen Aspekt darstellen.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird somit ein VIP-Analog zur Verfugung gestellt, das ausgewählt wird aus der
aus folgendem bestehenden Gruppe:
Analoga von VIP, die die folgende Aminosäuresequenz aufweisen
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-X-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Y-1 2 3 4 5 6 7 0 9 10 11 12 13 14
-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Z-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-W 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 (
worin X Thr, Ser, Pro oder AIa darstellt,
Y Thr, Lys, He oder AIa darstellt,
Z Thr, Lys, He oder Arg darstellt, und
W -NH2, -COOH, GIy oder Gly-Lys-Arg darstellt,
(die aus dem Verfahren resultieren und die ursprünglich hergestellt werden sollten);
Analoga von VIP, die die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen, worin W -NH2, -COOH oder GIy darstellt,
mit Ausnahme von His in Position 1, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = He und Z = Thr, mit Ausnahme von His in Position 1, das durch Tyr ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = Lys,
mit Ausnahme von Ser in Position 2, das durch Tyr ersetzt wird, und Asp in Position 8, die durch Tyr ersetzt wird, wenn X = Thr,
Y = Thr und Z = Thr,
mit Ausnahme von Asp in Position 3, die durch GIy ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und Z = Arg, mit Ausnahme von AIa in Position 4, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Arg und Z = Thr, mit Ausnahme von VaI in Position 5, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und Z = Lys, mit Ausnahme von Asp in Position 8, die durch Asn ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Arg und Z = Arg, mit Ausnahme von Asp in Position 8, die durch GIy ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und X = Lys,
mit Ausnahme von Asp in Position 8, die durch GIn ersetzt wird, und VaI in Position 19, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Pro,
Y = He und Z = Arg,
mit Ausnahme von Asp in Position 8, die durch Pro ersetzt wird, wenn X = Ser, V = He und Z = Arg, mit Ausnahme von Thr in Position 11, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = AIa, ' = Lys und Z = Lys, mit Ausnahme von Arg in Position 12, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = Thr, mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch Asn ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und Z = lie, mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch Arg ersetzt wird, wenn/' = Pro, Y = He und Z = Lys, mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch GIn ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = Lys und Z = Arg, mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch Thr ersetzt wird, wenn X = AIa1Y = lleundZ = Lys, mit Ausnahme von GIn in Position 16, das durch His ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und Z = Lys, mit Ausnahme von GIn in Position 16, das durch His ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = He und Z = Thr, mit Ausnahme von VaI in Position 19, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = He und Z = He, mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch Lys ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = Thr, mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch He ersetzt wird, wenn X = Ser, Y = Lys und Z = Thr, mit Ausnahme von Asn in Position 28, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Arg und Z = Lys, und X = GIy, wenn Y = Lys und Z = Lys, und
X = AIa, wenn Y = Asn und Z = Arg,
(die als Mutanten aus einem Durchgang der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens entstanden) und Analoga von VIP, die die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen, worin W -NH2, -COOH oder -Gly-Lys-Arg darstellt,
mit Ausnahme von Ser in Position 2, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und X = Arg, mit Ausnahme von Asp in Position 3, die durch VaI ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und Z = Me, mit Ausnahme von AIa in Position 4, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und Z = Lys, mit Ausnahme von VaI in Position 5, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = He, mit Ausnahme von Phe in Position 6, das durch Thr ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = Thr und Z = Thr, mit Ausnahme von Asp in Position 8, die durch VaI ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und Z = Thr, mit Ausnahme von Thr in Position 11, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = Lys, mit Ausnahme von Thr in Position 11, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = He und Z = Arg, mit Ausnahme von Leu in Position 13, das durch Arg ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und Z = Arg, mit Ausnahme von Leu in Position 13, das durch GIn ersetzt wird, wenn X.= Pro, Y = Lys und Z = Lys, mit Ausnahme von Leu in Position 13, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = Thr,
mit Ausnahme von Leu in Position 13, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = ThrundZ = Arg,
mit Ausnahme von Leu in Position 13, das durch Arg ersetzt wird und Lys in Position 15, das durch GIn ersetzt wird, wenn X = Ser, Y = Thr und Z = Thr,
mitAusnahmevon Lys in Position 15, das durch GIn ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Lys und Z = Arg, mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch Asn ersetzt wird, wenn X = Ser, Y = Lys und Z = Arg, mit Ausnahme von VaI in Position 19, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und Z = Lys, mitAusnahmevon VaI in Position 19, das durch GIy ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und Z = Thr, mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und Z = IIe, mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = He und Z = Arg, mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch Lys ersetzt wird, wenn X = Ser, Y = Me und Z = Thr, mit Ausnahme von Ser in Position 25, das durch Tyr ersetzt wird, wenn X = Pro, Y= Me und Z = Thr und mit Ausnahme von He in Position 26, das durch VaI ersetzt wird, wenn X = Ser, Y = ThrundZ = He, (die als Mutanten aus einem zweiten Durchgang der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens entstanden).
Alle Aminosäurereste im erfindungsgemäßen VIP-Analog weisen die L-Konfiguration auf.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Plasmid zur Verfügung gestellt, das ein Gen enthält, das eine DNA-Sequenz besitzt, die für ein erfindungsgemäßes VIP-Analog codiert.
Alle erfindungsgemäßen VIP-Analoga besitzen ähnliche Eigenschaften wie natürliches Human-VIP. Somit sind die erfindungsgemäßen VIP-Analoga als potentielle wirksame Bestandteile in neuen Pharmazeutika wie duch in Kosmetika (zur Wasseranlagerung der Haut) nützlich
Die neuen Pharmazeutika sind dazu gedacht
1) bei der Behandlung von Asthma und bei der Konstriktion der oberen Luftwege im allgemeinen und bei der Vasodilation in den Lungen im besonderen,
2) als lokal angewandte äußere Vasodilatoren, z. B. bei der Peniserektion,
3) bei der Behandlung von VIPOMA (ein VIP, das Intestinaltumor hervorbringt, der durch einen Wasserverlust von 5-15 Litern pro Tag zum Tode führt),
4) bei der Behandlung von Störungen des Blutflusses, Blutdruckes, der Intestinalmotilität und der Harnblase,
5) für die Verstärkung der Salivation, ζ. B. bei der Behandlung von blockierter oder reduzierter Salivation (ζ. Β. infolge der Verabreichung von Antipsychosemedikamenten oder Antidepressiva), und
6) für die Stimulierung der Pankreassaftsekretion verabreicht zu werden.
Das pharmazeutische Präparat einschließlich der Wirkstoffe hängt von der Verabreichungsart und der zu behandelnden speziellen Störung ab. Ein nasales oder orales Spray ist geeignet, wenn Asthma behandelt werden soll. Wäßrige Lösungen oder Tabletten zur oralen Verabreichung werden bei anderen Indikationen geeignet sein. Bei allen Arten von pharmazeutischen Präparaten befindet sich der Wirkstoff in einer Beimischung mit pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffen und/oder Streckmitteln, die normalerweise in der Pharmazie verwendet werden.
Allgemeine Strategie zur Erhaltung von for VIP-Analoga codierenden DNA-Sequenzen, die In einem E.-coli-Expressionsvektor clonlert werden
Es war geplant, eine große Anzahl von künstlichen Genen, die für VIP-Analoga codieren, direkt in nur einer Cionierstufe als Teile eines E.-coli-Plasmidexpressionsvektors zu erhalten. Die Synthesestrategie nutzte das Prinzip eines Verfahrens, das erstmals von Simonesits A., Kalman, M., Cserpän, J., und Kari, C. (1984) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 14,321) zur Gewinnung einer großen Anzahl künstlicher E.-coli-Promoterderiv?te beschrieben worden war. Kurz gesagt wurden zwei einzelsträngige Oligodesoxyribonucleotide chemisch synthetisiert und durch ihro 3'-terminalen Komplementärsequenzen hybridisiert („annealed") (Itakura, K. [1982] TIBS, 7,443). Der so gewonnene Pbrtialduplex umfaßte die gesamte VIP codierende Region und enthielt zusätzliche terminale Sequenzen, die zum Cionieren eingesetzt werden. Die beiden Oligodesoxyribonucleotide wurden durch nicht eindeutige chemische Synthesen gewonnen, so daß das Gemisch aller vier aktivierten Nucleotidmonomere an bestimmten vorbestimmten Positionen, die sich außerhalb der „annealing"-Region befanden, verwendet wurde. Der hybridisierte („annealed") Partialduplex wurde durch eine beiderseitig gestartete („primed") Synthese, die durch DNA-Polymerase (Klenow-F'-jment) bewirkt wurde, in ein doppelsträngiges DNA-Gemisch umgewandelt, das alle möglichen Homoduplexe enthielt. Diese wurden dann mit zwei verschiedenen Restriktionsendonucleasen geschnitten, deren Schnittstellen „upstream" und „downstream" von der für VIP codierenden Region lagen, und das Schnittgemisch wurde mit dem in geeigneter Weise geschnittenen Expressionsvektor pPEX ligiert. Das HgierteGemisch wurde in die kompetenten E. coli Zellen transformiert und die VIP-verwandte Codiersequenzen enthaltenden Rekombinanten wurden durch Koloniehybridisierung selektioniert. Die positiven Rekombinanten wurden weiter durch Nucleotidsequenzierung analysiert, um die in der clonierten VIP-Codierregion erhaltenen besonderen Mutationen zu identifizieren. Während des Entwurfs der synthetischen Oligodesoxyribonucleotide wurde berücksichtigt, daß sie für eine Methioninextension, die der VIP-codierenden Region vorangeht, und für eine GIy-(VIPa-Analoga) oder eine Gly-Lys-Arg-(VIPb-Analoga)-Extension am Carboxy-Terminus codieren müssen. Methionin wurde mit eingeschlossen, damit die VIP-Analoga aus dem Fusionsprotein durch CNBr-Schneiden freigesetzt werden können, während die Carboxy-Terminus-Extensionen als Substratstellen für durch Peptidylglycin-a-amidierende Monooxygenase (PAMase) katalyiserteAmidierung dienen können (Bradburg, A.F., Finnie, M. D. A., und Smyth, D.C. (19821 Nature 298,686). Die Positionen der gemischten chemischen Kopplungen (.couplings") innerhalb der Nucleotidsequenzen wurden so gewählt, daß sie in den vorbestimmten Codonen X, Y und Z lagen, so daß nach Durchführung der in Schema 1 gezeigten Stufen die maximale Anzahl , von Aminosäurevariationen für X, Y und Z erhalten wurden. Durch Wählen der ersten (für Codon X) oder der zweiten (für die Codone Y und Z) Base der Zielcodone als ge.nischte Positionen, können 4 Aminosäuren von je «irei Codonvariationen erhalten werden, was nach der Expression zusammen 64 mögliche VIP-Analoga ergibt.
Das VIP 1-Oligonucleotid, das in Schema 1 als der Oberstrang des hybridisierten Partialduplexes gezeigt ist, enthält zwei gemischte Positionen (N), während der untere Strang, VIP2-Oligonucleotjd, nur eine enthält. Das VIP2-Oligonucleotid wurde in
zwei Varianten hergestellt, die die oben angeführten Informationen für C-terminale Extensionen tragen (VIP2a und VIP2 b-Oligonucleotide in Schema 1). Um sowoh' VIPa- als auch VIPb-Analoga zu erhalten, wurden zwei getrennte Experimente mit den OligonucleotidenVIPI + VIP2abzw. VIP1 +VIP2b durchgeführt.
Das durch Klenow-Polymerasereaktion gewonnene doppelsträngigeDNA-Gemisch enthielt Homoduplexmoleküle, die durch Cionieren in einen Expressionsvektor getrennt wurden. Im Prinzip sollten alle Rekombinanten nur einen Typ von Mutantengen, das für ein bestimmtes VIP-Analog codiert, enthalten.
pPEX Vektor
pPEX ist ein hochwirksamer E.coli Expressionsvektor, der aus einem rac-Fusionspromotor-Vektor Laint23, von uns als pPEX bezeichnet, konstruiert wurde (Borus, J., Lukacsovich/T., Baliko, G., und Venetianer, P. [1986] Gene 42,97). Der Laint23-Vektor, der unter rac-Promoterkontrolle ein Fusionsprotein exprimiert, das aus 280 Aminosäuren von E.-coli ß-Galactosidase und einem Teil dör bakteriellen CAT (Chloramphenicolacetyltransferase) zusammengesetzt war, wurde durch Eliminieren einer einzigartigen Barn HI-Stelle und durch Austausch einerzwischen den CIaI- und Eco Rl-Stellen gelegenen CAT-Codierregion Jurch eine synthetische Polyclonierregion modifiziert. Die so gewonnene relevante Region des pPEX-Vektors wird in Schema 2 gezeigt. Der Vektor enthält die einzigartigen Bam Hl-, Kpn I, Sacl-, Apa I- und Eco Rl-Stellen in der Polyclonierregion und mit Hilfe der Barn HI-Stellen und beliebiger anderer der einzigartigen Stellen können ß-Galactosidasegenfusionen erfolgen. Wenn die VIP-codierenden Gene in die Bam Hl- und Eco Rl-Stellen des pPEX-Vektors cloniert werden, codieren die erhaltenen Genfusionen für 314 bzw. 316 Aminosäuren lange ß-Galactosidase-VIPa- bzw. ß-Galactosidase-VIPb-Fusionsproteine, von denen 284 Aminosäuren aus dem Fusionspartner abgeleitet werden (Schema 1).
Ausführungsbeispiel
Herstellung des Gemlschs von DNA-Regionen, die für VIP-Analoga codleren Materialien
Restriktionsenzyme und T4-DNA-Ligase wurde von New England Biolabs bezogen. T4-Polynuc!eotidkinase und Klenow-Polymerase wurden von Boehringer, (y-32P) ATP (> 5000Ci/Mmol) und (a-32P) dATP (800Ci/Mmol) wurden von Amersham, gegen BSA-VIP-Konjugate gerichtete Kaninchen-Antiseren wurden von Dr. Per Askelöf (SBL, Stockholm, Schweden) bereitgestellt. Immunoblot-Testkits, die Anti-Kaninchen-lgG-alkalisches-Phosphatase-Konjugat und Farbentwicklungsreagenzien BCIP/NBT enthielten, wurden von Bio-Rad gekauft. T,RNase wurde von Calbiochem gekauft.
Ollgodesoxyribonucleotlde
CCGGATCCATATGCACTCTGACGCTGTTTTCNCTGACAACTACACT-CGTCTGANAAAACAGCTGGCT (VIP 1-Oligonucleotid),
AAGAATTCAGCCGTTCAGGATAGAGTTCAGGTACTTTNTAACAGCC-AGCTGT (VIP 2 a-Oligonucleotid),
AAGAATTCAACGTTTGCCGTTCAGGATAGAGTTCAGGTACTTTNTA-ACAGCCAGCTGT (VIP 2 b-Oligonucleotid) und
CAGGGTGAAACGCAGGTCCCCAGCGGC (Iac Z27-mer Primer) Oligonucleotide wurden durch die Phosphoramiditchemie (Pharmacia Gene Assembler) auf einem DNA-Syntheseautomaten hergestellt und durch Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen, die 8 M Harnstoff enthielten, gereinigt. Die Oligonucleotide wurden mit (γ-32Ρ) ATP mit Hilfe von T4-Polynucleotidkinase (Maniatis, T., Fritsch, E. F., und Sambrook, J. [1982] Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N. Y.) 5'-phosphoryliert, wenn sie entweder als Hybridisiersonde oder als Sequenzierprimer verwendet werden sollten.
lOOpmol VIP1-Oligonucleotid wurden mit lOOpmol VIP2a- oder mit VIP2b-Oligonucleotiden in 50 μΙ Wasser vermischt, das Gemisch wurde3 Minuten bei 90°Cgehalten und dann in etwa einer Stunde auf Zimmertemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde auf 100μΙ aufgefüllt und enthielt 1OmM Tris-HCI, pH8,2, 5mM MgCI2, je 50μΜ dCTP, dGTP und TTP, 5μΙ (α-32Ρ) dATP (etwa 62,5pmol) und 1 μΙ 5 Einheiten/μΙ Klenow-Polymerase. Nach 15Min. wurden 10μΙ des 1 niM dDNTP-Gemischs (das alle 4 Desoxynucleosid-5'-Triphosphate enthielt) zugegeben, und die Lösung wurde 15Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA wurde mit Hilfe von 1 μΙ 10pg/pl Hefeträger-tRNA (ctRNA) durch Ethanolpräzipitation präzipitiert und durch Gelelektrophorese mit 10%igem Acrylamid und 8 M Harnstoff bei 400V in 2 Stunden gereinigt (Geldicke 0,4mm). Das Gel wurde durch Radioautographie untersucht, die radioaktive Hauptbande wurde ausgeschnitten und 12 Stunden bei 370C in 300μΙ einer S0-mM-Lösung aus NaCI und 0,1 % SDS eingeweicht. Das Überstehende wurde mit Phenol extrahiert und die Präzipitation erfolgte durch Zugabe von 1 μΙ von 10μg/μl ctRNA, 30μΙ von 3 M NaOAc, pH 5,2 und 900 μΙ Ethanol in einem Flüssigstickstoffbad. Die Zentrifugierung (14000U/min"', 3min) ergab ein radioaktives Pellet, das mit Ethanol gewaschen, getrocknet und in sterilem Wasser aufgelöst wurde.
20pmol der wie oben beschrieben gewonnenen radioaktiven VIP-DNA wurden 20 Stunden bei 37 0C mit je 200 Einheiten Bam Hl und EcoRI in 200μΙ 10OmM NaCI, 5OmM Tris-HCI, pH7,5,1OmM MgCI2,1 mM DTT (salzreicher Puffer) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang auf 6O0C erhitzt, (zweimal) mit Phenol extrahiert, und die DNA wurde wie oben beschrieben durch Ethanolpräzipitation (zweimal) aus der Wasserphase zurückgewonnen, anschließend mit Ethanol gewaschen, getrocknet und in sterilem Wasser erneut aufgelölst. Die Analyse des Gemische durch Elektrophorese mit 10%igem Acrylamid und 8 M Harnstoff zeigte, daß nur etwa 50% des Duplexes geschnitten worden waren und die DNA-Fraktion, die durch beide Enzyme geschnitten worden war, betrug nur etwa 30%. Trotzdem wurde dieses Gemisch zur Clonierung in Barn Hl-Eco HI-geschnittenem pPEX-Vektor verwendet.
Schneiden des pPEX-Vektors mit Bam Hl und Eco Rl
2\ig pPEX 13 wurden mit 10-10 Einheiten von Bam Hl und EcoRl 4 Stunden bei 370C in 20μΙ salzreichem Puffer behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde auf ein Agarosegel (0,5%) gegeben und die Elektrophorese erfolgte 1 Stunde in TAE-Puffer (4OmM Tris-Acetat, 2mM EDTA, pH7,5) bei 60 V in Gegenwart von Ethidiumbromid. Die lineare Vektorbande wurde ausgeschnitten, elektroeluiert, zweimal mit Phenol extrahiert, mit Ethanol präzipitiert, mit Ethanol gewaschen und getrocknet. Das Pellet wurde in sterilem Wasser aufgelöst.
0,2 μg mit Barn Hl-Eco Ri-geschnittener pPEX-Vektor und etwa 5 pmol Barn Hl-Eco RI-VIP-DNA, die wie oben beschrieben gewonnen worden waren, wurden in einem Reaktionsgemisch von 20μΙ, das 5OmMTHs-HCI, pH 7,5,1OmM MgCI2,1OmM DTT, 1 mM ATP und 80 Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt, 12 Stunden bei 15°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in JM101 E.coliZellen (Genotyp (A(lac-proAb), |F', traD36,proAB), laclqZAM 15) Messing, J„Crea, R., und Seeburg, P.H. (1981] Nucleic Acids Res. 9,309-321) mittels einer gefrorenen Kultur (Hanahan, D. in DNA-cloning, Vol. I, Hrsg. Glover, D. M. IRC Press Limited [1985], S. 109-135. Protokoll 3) transformiert. Arr.picillinresistente Kolonien wurden mittels 32P-markierter VIP1-Oligonucleotidsonde zur Koloniehyridisierung ausgesucht (Grunstein, M., und Hogness, D. S. [1085] Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72,3961-3965). Etwa 80-90% der Kolonien waren bei diesem Test nach VIPa- und VIPb-Mutanten positiv. 120 Kolonien aus beiden Serien wurden zur Plasmidherstellung und Sequenzierung verwendet.
Plasmidherstellung und Sequenzierung
Eine einzelne Kolonie wurde in 3 ml LB-Medium, das 100 Mg/mI Ampicillin enthielt, inokuliert und die Kultur wurde bei 37"C 12-16 Stunden lang geschüttelt. Die Plasmid-DNA wurde durch ein schnelles alkalisches Extraktionsverfahren (Birnboim, H. C. und DoIy, J. [1979] Nucleic Acids Res., 7,1513-1523) hergestellt. Die Plasmid-DNA wurde weiter mit 5 Einheiten Τ,-RNase in ΙΟΟμΙ Lösung, die 1OmM Tris-HCI, pH8,0,1 mM EDTA enthielt, 30 Minuten lang bei 370C behandelt, anschließend erfolgte eine Extraktion mit Phenol und eine Präzipitation mit Ethanol. Das Pellet wurde in 30μΙ sterilem Wasser aufgenommen. Die Didesoxynucleotidsequenzierung wurde an einer Hind lll-linearisierten Plasmidmatrize (0,2-0,4 μg) mittels 5'-32P-phosphoryliertem Iac 27-mer Sequenzierprimer (0,25pmol) und mit Wärmedenaturierung wie bei Hong, G.F., (1982) Bioscience Reports 2,907 beschrieben, durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen für 24 Clone wurden gleichzeitig durchgeführt.
Expression von VIP-Analoga
Mit pPEX-VIP-Analog-Plasmiden transformierte E.coli Zollen JM101 wurden bei 37°C unter Schütteln mit 250U min"1 in 1 ml LB-Medium, das 0,1 mg/ml Ampicillin enthielt, gezüchtet. Als die Zelldichte bei A = 600nm 0,5 erreichte, wurden die Zellen entweder durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 2,5mM) und vierstündigem Schütteln mit 250U min"1 bei 370C oder durch Zugabe von Lactose (Endkonzentration 1 %) und zwanzigstündigem Schütteln bei 250U min"1 induziert. Nach der Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 12000U min"' 1 Minute lang in einer Eppendorf-Zentrifuge gesammelt, 3 Minuten lang bei 1000C in 300μΙ Lysepuffer (0,125M Tris-HCI, pH6,8,30% Glycerol, 2% SDS, 6M Harnstoff und 1M 2-Mercaptoethanol) lysiert, und anschließend ließ man 30μΙ nicht induzierte Extrakte und 30μΙ induzierte Extrakte nach Laemmli, Großbritannien (1970) Nature, 227,680-685, zur Überwachung des Grades der Proteinexpression, wie durch Coomassiebrilliantblau-Färbung der Gele angezeigt wird, über SDS-10%ige Polyacrylamidgelo laufen. Wie aus den Gelen geschätzt wurde, betrug die Menge des exprimierten Fusionsproteins mehr als 60% der gesamten Zellproteine.
Immunologische Erkennung/immunologischer Nachweis von ß-Galactosldase-VIP-Analoga
Man ließ 6^I-Aliquoten von nicht induzierten und 6μΙ von 50fach verdünnten induzierten Proben parallel auf SDS-10%igen Polyacrylamidgelen laufen und die Hälfe der Gele wurde mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt, und die andere Hälfte der Gele wurde auf Nitrocelluloscpapiere elektrophoretisch übertragen. Diese Nitrocellulosepapiere wurden mit einem polyclonalen Kaninchenserum, das gegen BSA-VIP gerichtete Antikörper enthielt, inkubiert, und das Immunoblot wurde durch Behandlungen mit Ziegen-Anti-Kaninchen-1 gG-konjugierter alkalischer Phosphatase und BCIP/NBT-Farbentwicklerlösung (Bio-Rad-Immunoblot-Testkit) nach den Anweisungen des Herstellers entwickelt. Bei den VIP-Analoga enthaltenden Fusionsproteinen wurde eine sehr kräftige Immunofärbung erhalten.
Reinigung von exprimierten ß-Galactosidase-VIP-Analog-Fuslonsproteinen In der Größenordnung von 1 Liter E.coli JM101 Zollen, die die pPEX-VIP-Analog-Plasmide trugen, wurden in 1 Liter LB-Medium, das 0,1 mg/ml Ampicillin enthielt, bei 370C mit 250U min"' geschüttelt. Wenn die optische Dichte (OD) bei 600nm 0,5 erreicht hatte, wurden die Zellen mit Lactose (Endkonzentration 1 %) induziert und 20 Stunden lang bei 37°C mit 250 U min"1 geschüttelt. Nach der Induktion wurden die Zellen durch zehnminütiges Zentrifugieren bei 2 000 χ g und 4°C geerntet, mit 40ml TBS, pH 7,6, gewaschen und in 30 ml TBS, die 10μΜ PMSF und 0,5mM EDTA enthielt, erneut suspendiert. Die Zellsuspension wurde anschließend gefroren und getaut und in einem Branson-Beschallungsgerätmit5 Impulsen von je einer Minute beschallt, anschließend bei 17000 x gund4°C30Minuten lang zentrifugiert. Das das Fusionsprotein enthaltende Pellet wurde in 50ml 6M Guanidiumchlorid enthaltendem 1%igem 2-Mercaptoethanol nach Goeddel, D. V., und Autorenkollektiv (1979) PNAS (USA), 76,106-110, homogenisiert und 60 Minuten lang bei 60000 χ g zentrifugiert. Die klare, bernsteinfarbene überstehende Flüssigkeit, die das Fusionsprotein enthielt, wurde mit 6M Guanidiumchlorid 1 %-2-Mercaptoethanol auf 100ml verdünnt und 172 ml TBS wurden tropfenweise unter starkem Rühren zugefügt, was dazu führte, daß der größte Teil des Fusionsproteins präzipitierte und der größte Teil der Wirtsproteine in Lösung blieb. Die Aufschlämmung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt, bevor 30 Minuten lang bei 10°C mit , 10000 χ g zentrifugiert wurde. Das so gewonnene Pellet enthält den größten Teil des ß-Galactosidase-VIP-Analog-Fusionsproteins.
Schneiden des Fusionsproteins mit CNBr
Das teilweise gereinigte ß-Galactosidase-VIP-Analog-Fusionsprotein wurde durch Homogenisierung in 25 ml 70%iger HCOOH gelöst und 1,5g CNBr wurden pro Gramm Präzipitat zugegeben. Die Lösung wurde 70 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und
anschließend bei Raumtemperatur mittels eines Rotationsverdampfers unter reduziertem Druck eingedampft. 20ml 5OmM HCI in Methanol wurden pro Gramm Fusionsprotein zu dem Rückstand gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Aufschlämmung 10 Minuten lang bei 4°C mit 2000 x g zentrifugiert und das Überstehende wurde gesammelt.
Reinigung der VIP-Analoga Das die VIP-Analoga enthaltende Überstehende wurde erstens entweder
- gefriergetrocknet und der das VIP-Analog enthaltende Rückstand wurde in 1%iger TFA gelöst und auf HPLC (Cig-Bondapack, Umkehrphase) gereinigt,
oder zweitens _
- vor der HPLC-Stufe einer wie im folgenden beschriebenen Reinigung unterzogen.
- Zur-der das VIP-Analog enthaltenden sauren Methanolphase wurde festes NaCI (0,2g/ml) und 4 Volumeneinheiten eiskalter Diethylether zugefügt.
Das Präzipitat (das das VIP-Analog enthielt) wurde auf einem Glassintertrichter (Porengröße Nr,3) gesammelt und durch Waschen mit 5ml 1M Essigsäure gelöst. Das gelöste VIP-Analog wurde auf einer Sephadex-C25-Säule (7 cm lang, Durchmesser 2 cm) entsalzt, und gefriergetrocknet, bevor eü in 1%iger TFA gelöst und durch HPLC auf einem 20-40%igen linearen Acetonitrilgradienten in 1 %iger TFA gereinigt wurde. Das VIP-Analog wurde bei 33%igem Acetonitril eluiert. Das gereinigte VIP-Analog wurde dann in biochemischen und biologischen Testsystemen getestet.
Beispiel. VIPa (X= Thr, Y = Arg, Z = Lys, W = GIy)
Das Fusionsprotein ß-Galactosidase- VIPa wurde wie oben beschrieben in einem Liter Ld-Medium, das 0,1 mg/ml Ampicillin enthielt, exprimiert und gereinigt. Das Fusionsprotein wurde mit CNBr geschnitten und das so gewonnene VIPa wurde weiter wie oben beschrieben gereinigt und in den folgenden Testsystemen getestet:
1) Radioimmuntest (RIA)
2) Radiorezeptortest
3) Stimulation der Produktion von cyciischem Adenosin-3':5'-Phosphat
4) Hydrogencarbonatsekretion in Katzen in vivo
1) Radioimmuntest (RIA)
Im VIP-RIA-Kit, das von den Penninsula Laboratories (USA) bezogen worden war, wird rekombinantes VIPa als VIP erkannt, wenn nach den Empfehlungen des Herstellers auf der Grundlage des Verfahrens von Fahrenkrug, J., und Schaffalitzky De Muckadell, O. (1977) J. Lab. Clin. Med. 89,1379-1388 gemessen wird.
2) Radiorezeptortest
Der Radiorezeptortest wurde an Membranen von Rattenhirnrinde durchgeführt, und zwar mil Chloramin-T-iodiertem '26I-VIP (Halldon, G., und Autorenkollektiv [1986] Reg. Pep-16,183-188) bei einer Konzentration von 0,5mM, wobei die Verdrängung des markierten VIP durch gereinigtes VIP aus Schweinedarm und durch rekombinantes VIPa aus E.coli, wie von Abens, J., und Autorenkollektiv (1984) Peptides 5,375-377, beschrieben, untersucht wurde. Die Äff inität des rekombinanten VIPa war innerhalb des Versuchsfehlers mit dem aus Schweinedarm gereinigtem VIP mit einem Kd-Wert von 1,5-1,8 nm bei Gleichgewicht identisch, was beweist, Jaß rekombinantes VIPa ein Ligand mit hoher Affinität von VIP-Rezeptoren ist und in einer Art und Weise bindet, die von derjenigen von VIP, das aus anderen Quellen gewonnen wurde, nicht zu unterscheiden ist.
3) Stimulation der Synthese von cyciischem Adenosln-3':5'-Phosphat
Die Stimulierung der Synthese von cyciischem Adenosin-3':5'-Phosphat (cAMP) in Gewebescheiben von Rattenhirnrinde durch VIP, das gereinigt vom Schwein gewonnen wurde, und durch rekombinantes VIPa wurde untersu ht, um festzustellen, ob sich rekombinantes VIPa, nach dem Ergebnis aus Punkt 2 ein Ligand des VIP-Rezeptors, wie ein Agonis. oder wie ein Antagonist vorhalt. Die Experimente wurden folgendermaßen durchgeführt:
Rattenhirnrindenscheiben (0,4mm x 0,4 mm) wurden in Krebs-Ringers-Hydrogencarbonatpufferpräinkubiert, in Gegenwart von 1OmM Theophyllin (ein Phosphodiesteraseinhibitor) 60 Minuten lang bei 360C mit O2/CO2 (95%/5%) (V/V) durchgeblasen. Anschließend wurden die Gewebescheiben in einem Gesamtvolumen von 600μΙ mit Schweine-VIP bei Konzentrationen von 10, 50,10OnM, 1 und 10μΜ und mit rekombinantem VIPa bei Konzentrationen von 10,50,100 und 30OnM (geschätzt von 1) 10 Minuten inkubiert. Die Inkubationen wurden durch Zugabe von 150μΙ EGTA-Lösung (10OmM) beendet und anschließend wurden die Reagenzgläser 3 Minuten lang in ein kochendes Wasserbad gehalten. Der cAMP-Gehalt wurde nach Brown, B. L., und Autorenkollektiv (1972) Adv. Cycl. Nucl. Res. 2,25-40, gemessen. Die Ergebnisse zeigen, daß das rekombinante VIPa bei einer Inkubationszeit von 10 Minuten eine Erhöhung der c AM P-Wert θ bewirkte und somit als Agonist bei der VIP-Rezeptorgekoppelten Adenylatcyclase wirkt, von der man glaubt, daß sie die physiologischen Wirkungen von VIP trägt (siehe Rostene, W.H.(1984)Progr.Neurobiol.22,103-129).
4> Biologische Wirksamkeit von VIPa
Die> biologische Wirksamkeit von rekombinantem VIPa wurde ebenfalls in einem in vivo Test zur Stimulierung der Hydrogencarbonatsekretion aus Katzenpankreas nach Jorpes, J.E. und Mutt, V. (1966) Acta Physiol. Scand. 66,316-325,
untersucht.
Rekombinantes VIPa war in diesem Test mit 30-35% genauso wirksam wie Schweine-VIP.
Schema 1
VlP 1 Oligonucleotid
CCGGATCCATATGCACTCTGACGCTGTTTTCNCTGACAACTACACTCGTCTGANAAAACAGCTGGCT I
TGTCGACCGACAATNTTTCATG GACTTGAGATAG GACTTG ι
VIP2 0ligonucleotide '
N:A,C,GorT
Klenow Polymerase + dNTP
Bam HI
CCGGATCCATATGCACTCTGACGCTGTTTTCNCTGACAACTACACTCGTCTGANAAAACAGCTGGCTGTTANAAAGTACCTGAACTCTATCCTGAAC GGCCTAGGTATACGTGAGACTGCGACAAAAGNGACTGTTGATGTGAGCAGACTNTTTTGTCGACCGACAATNTTTCATGGACTTGAGATAGGACTTG,
VIPa and VIPb Duplexe
EcoRI
GGCTGAATTCTT CCGACTTAAGAA
EcoRI
GGC 'VAACGTTG AATTCTT CCGTTTGCAACTTAAGAA
1. BamHI-undEcoRI-Spaltung
2. Clonierung in mit Bam HI und EcoRI gespaltenem pPEX-Vektor
3. Selektion der individuellen Mutanten durch Nucleotidsequenzierung
ISJ CO *k
Schema 1 (Fortsetzung)
ß-Galacto- neAspSerTrplleHisMetHisSerAspAlaValPhe XAspAsnTyrThrArgLeu Y LysGlnLeuAlaVal Z LysTyrLeuAsnSerlleLeuAsn —atcgattcttggatccatatgcactctgacgctgttttcnctgacaactacactcgtctganaaaacagctggctgttanaaagtacctgaactctatcctgaac —tagctaagaacctaggtatacgtgagactgcgac^aaagngactgttgatgtgagcagactnttttgtcgaccgacaatntttcatggacttgagataggacttg! w
CIaI Bam Hl GlyLysArg...
GGCAAACGTTGAATTC
1CCGTTTGCAACTTAAG
1 EcoRI
X= V= 7 = I
Thr
-ACT-
-TGA-
Pro
-CCT- -GGA-
AIa
-GCT- -CGA-
Ser He Ue Bei allen 64 Varianten:
-TCT- -ATA- -ATA- VIPa-Analoga, wenn W = GIy
-AGA- -TAT- -TAT- VIPb-Analoga, wenn W = Gly-Lys-Arg
| Y = Arg -AGA- -TCT- | 2 = Lys -AAA- -TTT- |
| Thr -ACA- -TGT | Thr -ACA- -TGT- |
| Lys -AAA- -TTT- | Arg -AGA- -TCT- |
| He -ATA- -TAT- | Ue -ATA- -TAT- |
Schema Sequenzierung der polyclonierenden Region des pPEX-Vektors
284
ß-Galacto- lleAspSerTrplleLeu...
sidase ATCG ATTCTTGG ATCCTCTG ATG GTACCTCCTCTG AG CTCTCTG ATG G GCCCGAGTATGCGACAG CTG GAATTC
CIaI BamHI Kpnl Sacl Apal EooRI
Claims (4)
1. Verfahren zur Herstellung einer großen Anzahl von Analoga eines gewählten Peptids, gekennzeichnet durch die Stufen
Synthetisierung eines ersten Gemisches von gleichlangen Oligonucleotiden, die an einigen definierten Positionen unterschiedliche Basen und am 3'-Ende einige identische Blasen besitzen, Mischen des ersten Gemischs mit einem in gleicher Weise synthetisierten zweiten Gemisch von Oligonucleotiden, wobei die Blasen am 3'-Ende der Oligonucleotide des eisten Gemischs an die Basen des 3'-Endes der Oligonucleotide des zweiten Gemischs hybridisieren („annealing"), was zu einem Gemisch von partiell doppelsträngigen, gleichlangen DNA-Sequenzen führt, die danach enzymatisch in vollständig doppelsträngige DNA-Sequenzen umgewandelt werden, gleichzeitiges oder nacheinander erfolgendes Schneiden des Gemischs, das aus doppelsträngigen DNA-Sequenzen besteht, die am 3'-Ende eine Stelle zum Schneiden mit einem ersten Enzym und am 5'-Ende eine Stelle zum Schneiden mit einem zweiten Enzym besitzen, mit dem ersten und dem zweiten Enzym, um DNA-Sequenzen mit 3'- und 5'-Enden zu erzeugen, die an die 5'- und 3'-Enden eines in ähnlicher Weise geschnittenen Vektors ligiert werden können, Inserieren der so geschnittenen DNA-Sequenzen in den so geschnittenen Vektor durch Ligation, um ein Gemisch von Vektoren zu erzeugen, die anschließend in einer an sich bekannten Art und Weise in einen Wirt transformiert werden,
Vermehrung des Wirts zur Bildung von Kolonien, die nacheinander analysiert werden, um die DNA-Sequenzen festzustellen, die für ein einzelnes Protein codieren, unter Expressionsbedingungen separate Vermehrung der großen Anzahl von Wirten, die Vektoren enthalten, die die identifizierten, für ein Protein codierenden Sequenzen aufweisen, um eine große Anzahl von Analoga des gewählten Peptids herzustellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch geke eichnet, daß das gewählte Peptid ein VIP-Analog ist, der Vektor ein Plasmid ist und der Wirt E.coli ist.
3. Analog von VIP, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt wird aus der aus folgendem bestehenden Gruppe:
Analoga von VIP, die die folgende Aminosäuresequenz aufweisen
His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-X-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Y-1 2 3 4 5 6 7 0 9 10 11 12 13 14
-Lys-Gln-Leu-Ala-Val-Z-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-W 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 23 29 ,
worin X Thr, Ser, Pro oder AIa darstellt, Y Thr, Lys, lie oder AIa darstellt, Z Thr, Lys, He oder Arg darstellt, und W -NH2,-COOH, GIy oder Gly-Lys-Arg darstellt
Analoga von VIP, die die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen, worin W -NH2, -COOH oder GIy
darstellt,
mit Ausnahme von His in Position 1, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = He und Z = Thr, mit Ausnahme von His in Position 1, das durch Tyr ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und Z = Lys,
mit Ausnahme von Ser in Position 2, das durch Tyr ersetzt wird,
und Asp in Position 8, die durch Tyr ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und Z = Thr, mitAusnahmevon AspinPosition3,diedurchGlyersetztwird,wennX = Thr,Y = ThrundZ = Arg, mit Ausnahme von AIa in Position 4, das durch Pro ersetztwird, wenn X = Thr, Y = Arg und Z = Thr, mitAusnahmevon VaI in Position 5, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = ThrundZ = Lys, mit Ausnahme von Aep in Position 8, die durch Asn ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Arg und
Z = Arg,
mitAusnahmevon Asp in Position 8, die durch GIy ersetztwird, wennX = Pro, Y = ThrundX = Lys,
mit Ausnahme von Asp in Position 8, die durch GIn ersetzt wird,
und VaI in Position 19, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = He und Z = Arg, mitAusnahmevonAsp in Position 8, die durch Pro ersetztwird, wennX = Ser,Y = MeundZ = Arg,
mit Ausnahme von Thr in Position 11, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = Lys und
Z = Lys,
mit Ausnahme von Arg in Position 12, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und
Z = Thr,
mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch Asn ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und
Z = Ne,
mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch Arg ersetzt wird, wenn X = Pro, Y= He und Z = Lys, mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch GIn ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = Lys und
Z = Arg,
mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch Thr ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = Me und Z = Lys, mit Ausnahme von GIn in Position 16, das durch His ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und
Z = Lys,
mitAusnahmevon Ginin Position 16, dasdurchHisersetztwird,wennX = Pro,Y = HeundZ = Thr, mit Ausnahme von VaI in Position 19, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = He und Z = Ne, mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch Lys ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und
Z = Thr,
mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch lleersetztwird,wennX = Ser, Y = Lys und Z = Thr, mit Ausnahme von Asn in Position 28, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und
Z = Lys,
und X = GIy, wenn Y = Lys und Z = Lys, und X = AIa, wenn Y = Asn und Z = Arg,
und Analoga von VIP, die die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen, worin W -NH2, -COOH oder-Gly-Lys-Arg darstellt,
mit Ausnahme von Ser in Position 2, das durch Phe ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und
X = Arg,
mitAusnahmevon Asp in Position 3, die durch VaI ersetzt wird, wenn X = Thr,Y = LysundZ = He, mit Ausnahme von AIa in Position 4, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und Z = Lys, mitAusnahmevon VaI in Position 5, das durch Pheersetztwird,wennX = Pro, Y -- Thr und Z = He, mitAusnahmevon Phe in Position 6, das durch Thr ersetzt wird, wenn X = AIa1Y - ThrundZ = Thr, mitAusnahmevon Asp in Position 8, die durch VaI ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = ThrundZ = Thr, mit Ausnahme von Thr in Position 11, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und
Z = Lys,
mitAusnahmevon Thr in Position 11, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = He und Z = Arg, mit Ausnahme von Leu in Position 13, das durch Arg ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und
Z = Arg,
mitAusnahmevon Leu in Position 13, das durch GIn ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Lys und
Z = Lys,
mitAusnahmevon Leu in Position 13, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und
Z = Thr,
mit Ausnahme von Leu in Position 13, das durch Pro ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Thr und
Z = Arg,
mitAusnahmevon Leu in Position 13, das durch Arg ersetzt wird und Lysin Position 15,
das durch GIn ersetzt wird wenn X = Ser, Y = Thr und Z = Thr,
mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch GIn ersetzt wird, wenn X = Pro, Y = Lys und
Z = Arg,
mit Ausnahme von Lys in Position 15, das durch Asn ersetzt wird, wenn X = Ser, Y = Lys und
Z = Arg,
mitAusnahmevon VaI in Position 19, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und
Z = Lys,
mit Ausnahme von VaI in Position 19, das durch GIy ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Lys und
Z = Thr,
mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Thr, Y = Thr und
Z = He,
mit Ausnahme von Asn in Position 24, das durch Asp ersetzt wird, wenn X = Ala, Y = He und
Z = Arg,
mitAusnahmevonAsninPosition24,dasdurchLysersetztwird,wennX = Ser,Y = lleundZ = Thr, mitAusnahmevon Serin Position 25, dasdurchTyrersetztwird.wennX = Pro,Y = lleundZ = Thr
mitAusnahmevon Ne in Position 26, das durch VaI ersetzt wird, wenn X = Ser,Y = ThrundZ = He, und worin alle Aminosäurereste die L-Konfiguration besitzen.
4. Plasmid, das ein Gen enthält, das für ein Analog von VIP codiert, gekennzeichnet durch eine DNA-Sequenz, die für ein VIP-Analog nach Anspruch 3 codiert.
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer großen Anzahl von Peptidanaloga, sowie nouo Peptidanaloga. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer großen Anzahl von Analoga von vasoaktivem Intestinalpolypeptid (VIP), neue Analoga von VIP sowie Plasmide, dio Gene mit DNA-Sequenzen enthalten, die für erfindungsgemäße VIP-Analoga codieren.
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