DD294633A5 - Adjuvans-formulierung, enthaltend eine oeltroepfchenemulsion - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Adjuvans-Formulierung, enthaltend eine OEltroepfchenemulsion. In der Adjuvans-Zusammensetzung, die ein metabolisierbares OEl und einen Emulgator enthaelt, liegen das OEl und das Detergens in Form einer OEl-in-Wasser-Emulsion mit OEltroepfchen, von denen im wesentlichen alle einen Durchmesser kleiner als ein Mikron haben, vor. In bevorzugten Ausfuehrungsformen stellt der Emulgator ein Immunostimulans, z. B. ein lipophiles Muramylpeptid, dar. Alternativ kann ein Immunostimulans getrennt von dem Emulgator verwendet werden.{Adjuvans-Formulierung; Adjuvans-Zusammensetzung; metabolisierbares OEl; Emulgator; Detergens; OEl-in-Wasser-Emulsion; Immunostimulans; lipophiles Muramylpeptid}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf Adjuvans-Formulierungen zur Verwendung bei der Steigerung der Wirksamkeit von Impfstoffen, insbesondere auf Adjuvantien, die Öl-in-Wasser-Emulsionen enthalten.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Das Erscheinen neuer, mit der Technologie der rekombinanten DNA hergestellter Untereinheit-Impfstoffe hat den Bedarf an sicheren und wirksamen Adjuvantien gesteigert. Herkömmliche antivirale Lebend-Impfstoffe erfordern keine Adjuvantien. Virus-Totimpfstoffe sind im allgemeinen viel immunogener als Untereinheit-Impfstoffe und können ohne Adjuvans oder mit

Adjuvantien, die eine begrenzte Fähigkeit zur Stimulierung von Immunreaktionen besitzen, wirksam sein. Die neuen, von rekombinanter DNA abgeleiteten Untereinheit-Impfstoffe stellen im allgemeinen isolierte Proteine oder Protein-Gemische dar, die, verglichen mit ganzen Viren, eine begrenzte Immunogenität besitzen, wenn sie auch in bezug auf Sicherheit und Herstellungskosten wesentliche Vorteile gegenüber den herkömmlichen Impfstoffen bieten. Diese Stoffe werden in dieser Beschreibung zur Unterscheidung von ganzen Organismen (und Teilen davon), die früher in Impfstoffen verwendet wurden, als molekulare Antigene bezeichnet. Diese Impfstoffe erfordern zum Erreichen ihres vollen Potentials bei der Verhütung von Krankheiten Adjuvantien mit signifikanten immunostimulatorischen Eigenschaften.

Zur Zeit sind in den Vereinigten Staaten die einzigen für die Anwendung beim Menschen zugelassenen Adjuvantien pharmazeutisch verträgliche Aluminiumsalze (Alum; im folgenden so bezeichnet). Die Adjuvantien sind für einige Impfstoffe, wie Hepatitis B, Diphtherie, Polio, Tollwut und Grippe, eingesetzt worden, können aber für andere nicht verwendbar sein, insbesondere wenn für den Schutz die Anregung der zell-vermittelten Immunität erforderlich ist. Berichte zeigen, daß Alum bei der Steigerung der Wirksamkeit von Keuchhusten- und Typhus-Impfstoffen versagt und bei Adenovirus-Impfstoffen nur eine kleine Wirkung ergibt. Probleme mit Aiuminiumsalz umfassen die Entstehung von Granulomen am Injektionsort und partienweise Schwankungen der Alum-Präparate.

Das vollständige Freund-Adjuvans (CFA) ist ein starkes Immunostimulans, das mit vielen Antigenen auf experimenteller Basis erfolgreich verwendet worden ist. CFA enthält drei Bestandteile: ein Mineralöl, einen Emulgator wie Arlacel A und abgetötete Mykobakterien wie Mycobacterium tuberculosis. Zur Herstellung einer Wasser-in-ÖI-Emulsion werden wäßrige Antigenlösungen mit diesen Bestandteilen gemischt. CFA verursacht jedoch starke Nebenwirkungen wie Schmerzen, Abszeßbildungen und Fieber, was seine Verwendung sowohl in menschlichen als auch in tierarzneilichen Impfstoffen verhindert. Die Nebeneffekte werden im wesentlichen von den Reaktionen des Wirts auf die mykobakteriellen Bestandteile von CFA verursacht. Das unvollständige Freund-Adjuvans (IFA) ist ähnlich dem CFA, jedoch ohne den bakteriellen Bestandteil. Während es für die Verwendung in den Vereinigten Staaten nicht zugelassen ist, ist IFA in anderen Ländern bei verschiedenen Arten von Impfstoffen eingesetzt worden. IFA ist erfolgreich bei Menschen mit Grippe- und Polio-Impfstoffen und mit verschiedenen Tierimpfstoffen, wie Tollwut, Hundestaupe und Maul- und Klauenseuche, eingesetzt worden. Versuche haben gezeigt, daß sowohl das in IFA verwendete Öl als auch der Emulgator bei Mäusen Tumore verursachen; dies zeigt, daß ein anderes Adjuvans für die Verwendung beim Menschen besser wäre.

Muramyldipeptid (MDP) stellt die kleinste Einheit des mykobakteriellen Zellwandkomplexes dar, die die mit CFA beobachtete Adjuvans-Wirksamkeit erzeugt; siehe Ellouz et al. (1974) Biochem.Biophys. Res. Comm., 59:1317. Es wurden viele synthetische Analoga von MDP entwickelt, die eine weite Spanne der Adjuvans-Wirksamkeit und der Nebeneffekte zeigen (einen Überblick gibt Chedid et al. [1978] Prog. Allergy, 25:63). Drei Analoga, die besonders nützlich als Impfstoff-Adjuvantien sein können, sind Threonyl-Derivatevon MDP, siehe Byarsetal. (1987) Vaccine, 5:223; N-Butyl-Derivate von MDP, siehe Chedid et al. (1982) Infect, and immun, 35:417; und lipophile Derivate von Muramyltripeptid, siehe Gisler et al. (1981) in Immunomodulations of Microbial Products and Related Synthetic Compounds, Herausgeber Y. Yamamura und S. Kotani, Excerpta Medica, Amsterdam, S. 167. Diese Verbindungen stimulieren wirksam die humorale und zell-vermittelte Immunität und zeigen niedrige Toxizitäten. Ein vielversprechendes lipophiles Derivat von MDP ist N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-di-palmitoylsn-glycero-3-3(hydroxyphosphoryloxy)]ethylamid (MTP-PE). Dieses Muramyltripeptid hat Phospholipidenden, die die Assoziation des hydrophoben Teils des Moleküls mit einer Lipid-Umgebung ermöglichen, während der Muramylpeptid-Teil mit der wäßrigen Umgebung assoziiert. Daher kann das MTP-PE selbst als Emulgator zur Bildung stabiler Öl-in-Wasser-Emulsionen wirken.

Ursprüngliche Versuche mit Mäusen in den Laboratorien der in der vorliegenden Erfindung genannten Erfinder mit MTP-PE zeigten, daß dieses Adjuvans bei der Stimulierung von Anti-HSV-gD-Antikörpertitern gegen Herpes Simplex-Virus-gD-Antigene wirksam ist und daß die Wirksamkeit erheblich gesteigert wurde, wenn das MTP-PE und das gD in Öl verabreicht wurden (IFA) und nicht in wäßriger Lösung. Weil IFA für die Verwendung beim Menschen nicht zugelassen ist, wurden für MTP-PE und das Antigen andere Öl-Verabreichungssysteme untersucht. Eine Emulsion von 4% Squalen mit 0,008% Tween 80 und HSV-gD ergab bei Meerschweinchen eine sehr gute Immunität. Diese Formulierung, MTP-PE-LO (wenig Öl), wurde durch Passieren durch eine subkutane Nadel emulgiert, und war ziemlich instabil. Dennoch ergab diese Formulierung hohe Antikörpertiter beim Meerschweinchen und guten Schutz bei einer HSV-Exposition von immunisierten Meerschweinchen. Die Formulierung war am wirksamsten, wenn sie in die Pfote verabreicht wurde, ergab aber ebenfalls annehmbare Antikörpertiter und Schutz, wenn sie intramuskulär verabreicht wurde. Diese Daten erschienen in zwei Veröffentlichungen (Sanchez-Pescador et al., J. Immunology, 141,1720-1727,1988, und Technological Advances in Vaccine Development, Lasky et al., Herausgeber, Alan R.Liss, Inc., S. 445 bis 469,1988). Die MTP-PE-LO-Formulierung war ebenso bei der Stimulierung der Immunreaktion von Meerschweinchen auf das in Hefe hergestellte HIV-Hüllprotein wirksam. Sowohl ELISA-Antikörpertiter als auch virusneutralisierende Antikörpertiter wurden mit der MTP-PE-Formulierung auf einen hohen Gehalt stimuliert. Wenn jedoch die gleiche Formulierung bei großen Tieren wie Ziegen und Pavianen getestet wurde, waren die Zusammensetzungen nicht so wirksam.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, die Wirksamkeit von Impfstoffen beim Menschen und bei großen Tieren zu erhöhen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Adjuvans-Formulierung bereitzustellen, die geeignet ist, Immunreaktionen auf molekulare Antigene beim Menschen und bei großen Säugetieren zu stimulieren.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß eine Adjuvans-Formulierung durch eine Zusammensetzung bereitgestellt wird, die ein metabolisierbares Öl und einen Emulgator enthält, wobei das Öl und der Emulgator in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion mit Öltröpfchen, von denen im wesentlichen alle einen Durchmesser von < 1 Mikron aufweisen, vorliegt

und die Zusammensetzung keine Polyoxypropylen-polyoxyethylen-blockcopolymeren enthält, die früher als für Herstellung von Submikron-ÖI-in-Wasser-Emulsionen erforderlich angesehen wurden. Die Zusammensetzung kann weiterhin ein Immunostimulans (das mit dem Emulgator übereinstimmen kann, wenn ein amphipathisches Immunostimulans ausgewählt wurde) enthalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Adjuvans-Zusammensetzung, die ein metabolisierbares Öl und einen Emulgator enthält, wobei das Öl und der Emulgator in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion mit Öltröpfchen, von denen im wesentlichen alle einen Durchmesser von <1 Mikron aufweisen, vorliegt. Untersuchungen in den Laboratorien der in der vorliegenden Erfindung genannten Erfinder, die detailliert in den folgenden Beispielen dargestellt werden, zeigen eine überraschende Überlegenheit gegenüber Adjuvanszusammensetzungen, die Öl und Emulgatoren enthalten, in denen die Öltröpfchen wesentlich größer als die bei der vorliegenden Erfindung erhaltenen sind.

Die einzelnen Bestandteile der Adjuvans-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung sind bekannt. Wenn auch solche Zusammensetzungen noch nicht auf dieselbe Weise kombiniert und keine Öltröpfchen mit so kleinem Durchmesser erhalten wurden. Demgemäß sind die einzelnen Bestandteile, obwohl unten sowohl im allgemeinen als auch in einigen Einzelheiten für bevorzugte Ausführungsformen beschrieben, im Fachgebiet allgemein bekannt, und die hierin verwendeten Begriffe, wie metabolisierbares Öl, Emulgator, Immunostimulans, Muramylpeptid und lipophiles Muramylpeptid, sind ausreichend bekannt, um diese Verbindungen dem Fachmann ohne weitere Beschreibung zu bezeichnen.

Eine Komponente dieser Formulierungen ist ein metabolisierbares nicht-toxisches Öl, vorzugsweise eines, das 6 bis 30 Kohlenstoffatome enthält, umfassend, aber nicht beschränkt auf Alkane, Alkene, Alkine und ihre entsprechenden Säuren und Alkohole, die Ether und Ester derselben, und Gemische derselben. Das Öl kann ein beliebiges Öl pflanzlicher Herkunft, ein Öl von Fischen, ein Öl tierischer Herkunft oder ein synthetisch hergestelltes Öl sein, das von dem Körper des Empfängers, dem das Adjuvans verabreicht wird, metabolisiert werden kann, und das für den Empfänger nicht toxisch ist. Der Empfänger ist ein Tier, typischerweise ein Säugetier, und vorzugsweise ein Mensch. Mineralöle und ähnliche toxische Petroleumdestillatöle sind ausdrücklich bei der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen.

Die Ölkomponente dieser Erfindung kann jedes langkettige Alkan, Alken oder Alkin oder eine Säure oder ein Alkoholderivat derselben sein, und zwar sowohl die freien Säuren oder Salze derselben oder Ester wie Mono-, Di- oder Triester, z. B. Triglyceride und Ester mit 1,2-Propandiol oder ähnlichen Polyhydroxyalkoholen. Alkohole können unter Verwendung einer mono- oder polyfunktionellen Säure, z. B. Essigsäure, Propionsäure, Zitronensäure oder ähnlichem, acyliert sein. Von langkettigen Alkoholen abgeleitete Ether, die Öle sind und die anderen hierin festgelegten Kriterien erfüllen, können ebenfalls verwendet werden. Der jeweilige Alkan-, Alken- oder Alkinrest und seine Säure- oder Al ко ho I derivate weisen 6 bis 30 Kohlenstoffatome auf. Der Rest kann eine geradkettige oder verzweigte Struktur haben. Er kann vollständig gesättigt sein oder eine Doppel- oder Dreifachbindung oder mehrere enthalten. Wenn Öle auf Basis von Mono- oder Polyestern oder Öle auf Basis von Ethern eingesetzt werden, bezieht sich die Beschränkung auf 6 bis 30 Kohlenstoffatome auf die jeweiligen Fettsäure- oder Fettalkoholreste, und nicht auf die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome.

Es kann jedes metabolisierbare Öl, insbesondere aus einer tierischen oder pflanzlichen Quelle, oder vom Fisch stammend, verwendet werden. Es ist wichtig, daß das Öl von dem Wirt, dem es verabreicht wurde, metabolisiert wird; anderenfalls kann der Ölbestandteil Abszesse, Granulome oder sogar Carcinome verursachen oder kann (bei Gebrauch in der tierärztlichen Praxis) das Fleisch von geimpften Vögeln oder Tieren gemäß der schädlichen Wirkung, die das unmetabolisierte Öl auf den Verbraucher haben kann, für den menschlichen Verzehr ungeeignet machen.

Quellen für Öle pflanzlicher Herkunft umfassen Nüsse bzw. Früchte, Samen und Getreide. Erdnußöl, Sojaöl, Kokosnußöl und das überall erhältliche Olivenöl sind Beispiele für Nuß- bzw. Fruchtfleischöle. Samenöle umfassen Safloröl, Baumwollsaatöl, Sonnenblumenöl, Sesamöl oder dergleichen. In der Getreideölgruppe ist das Maisöl das häufigste; das Öl von anderen Getreidearten wie Weizen, Hafer, Roggen, Reis, abessinisches Liebesgras (Eragrostis abessinica), Triticale oder dergleichen, kann ebenso verwendet werden.

Die Technologie zum Erhalt von Ölen pflanzlicher Herkunft ist weit entwickelt und wohlbekannt. Die Zusammensetzungen dieser und ähnlicher Öle können z.B. im Merck-Index und in der Literatur über Nahrungsmittel, Ernährung und die Lebensmitteltechnologie gefunden werden.

Die Fettsäureester des Glycerins und 1,2-Propandiols mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, die nicht in natürlichem Samenöl vorkommen, können ausgehend von den Nuß-und Samenölen durch Hydrolyse, Trennung und Veresterung der geeigneten Materialien hergestellt werden. Diese Produkte sind unter dem Namenl NEOBEE® der PVO International Inc., Chemical Specialties Division, 416 Division Street, Boongon, NJ und von anderen Firmen im Handel erhätlich.

Bei den Adjuvantien und Impfstoffen dieser Erfindung können Öle aus beliebiger tierischen Quelle eingesetzt werden. Tierische Öle und Fette sind üblicherweise bei physiologischen Temperaturen Feststoffe, da sie als Triglyceride vorkommen und einen höheren Sättigungsgrad als Öle von Fischen oder Pflanzen aufweisen. Dennoch sind Fettsäuren aus tierischen Fetten durch teilweise oder vollständige Triglyceridverseifung, die die freien Fettsäuren ergibt, gewinnbar. Fette und Öle aus der Milch von Säugetieren sind metabolisierbar und können deshalb im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Die Verfahren zur Trennung, Reinigung und Verseifung u. a. zum Erhalt reiner Öle aus tierischen Quellen benötigten Methoden sind im Fachgebiet allgemein bekannt.

Die meisten Fische enthalten metabolisierbare Öle, die auf leichte Weise erhalten werden können. Typische Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbare Öle sind Lebertran, Haileberöl und Walöl wie Walrat. Eine Anzahl von Ölen mit verzweigter Kette wird biochemisch in 5 Kohlenstoff-Isopreneinheiten hergestellt und wird im allgemeinen als Terpenoide bezeichnet. Haileberöl enthält ein verzweigtes, ungesättigtes Terpenoid, das als Squalen, 2,6,10,15,19,23-Hexamethyl-2,6-10,14,18,22-tetracosahexaen bezeichnet wird und hier besonders bevorzugt ist. Squalan, das gesättigte Analogon zu Squalen, ist ebenso ein besonders bevorzugtes Öl. Fischöle, einschließlich Squalen und Squalen, sind im Handel erhältlich oder können durch bekannte Methoden erhalten werden.

Der Ölbestandteil der Adjuvantien und Impfstoff-Formulierungen liegt in einer Menge von 0,5 bis 20 Vol.-%, vorzugsweise nicht mehr als 15%, insbesondere in einer Menge von 1 bis 12%, vor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von 1 bis4%ÖI. Der wäßrige Anteil der Adjuvans-Zusammensetzungen ist gepufferte Kochsalzlösung oder, in bevorzugten Ausführungsformen, pharmazeutisch reines Wasser. Weil die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung vorgesehen sind, ist es bevorzugt, am Ende gepufferte Lösungen, die als Impfstoffe verwendet werden, herzustellen, so daß die Tonizität, d. h. Osmolalität, zur Vermeidung von Schwellungen nach der Verabreichung oder schneller Absorption der Zusammensetzung wegen differentieller lonenkonzentrationen zwischen der Zusammensetzung und den physiologischen Flüssigkeiten, im wesentlichen dieselbe wie bei normalen physiologischen Flüssigkeiten ist. Ebenso ist es bevorzugt, zur Aufrechterhaltung eines mit normalen physiologischen Gegebenheiten verträglichen pH die Kochsalzlösung zu puffern. Ebenso kann es in bestimmten Fällen zur Sicherung der Stabilität bestimmter Bestandteile der Zusammensetzung, wie Glycopeptide, erforderlich sein, den pH auf einem bestimmten Wert zu halten.

Jeder physiologisch verträgliche Puffer kann hier verwendet werden, wobei Phosphatpuffer bevorzugt sind. Andere verträgliche Puffer wie Acetat, Tris, Bicarbonat, Carbonat oder dergleichen können anstelle von Phosphatpuffern verwendet werden. Der pH des wäßrigen Bestandteils liegt vorzugsweise zwischen 6,0 und 8,0.

Wenn jedoch zunächst das Adjuvans hergestellt wird, wird reines Wasser als wäßriger Bestandteil der Emulsion bevorzugt. Die Steigerung der Salzkonzentration erschwert den Erhalt der gewünschten kleinen Tröpfchengröße. Wenn die endgültige Impfstoff-Formulierung aus dem Adjuvans hergestellt wird, kann zum Erhalt der gewünschten Impfstoffzusammensetzung das antigene Material in einem Puffer mit einer geeigneten Osmolalität zugegeben werden.

Die Menge des in der Zusammensetzung eingesetzten wäßrigen Bestandteils ist diejenige Menge, die zum Erhalt einer Einheits-Zusammensetzung erforderlich ist. Das bedeutet, daß eine Menge des wäßrigen Bestandteils zugemischt wird, der dazu ausreicht, mit den anderen o.g. Bestandteilen 100%zu ergeben, um die Zusammensetzungen auf Standard-Volumen zu bringen. In der pharmazeutischen Wissenschaft wird im allgemeinen eine beträchtliche Anzahl von Emulgatoren und Suspendiermitteln verwendet. Diese umfassen aus der Natur gewonnene Materialien wie Gummen von Bäumen, pflanzliche Proteine, Polymere auf Zuckerbasis, wie Alginate und Cellulose, oder dergleichen.

Bestimmte Oxypolymere oder Polymere, die eine Hydroxylgruppe oder einen anderen hydrophilen Substituenten an der Kohlenstoff-Hauptkette tragen, besitzen Oberflächenaktivität, z.B. Povidon, Polyvinylalkohol, und mono- und polyfunktionelle Verbindungen auf Glykoletherbasis. Verbindungen, die von langkettigen Fettsäuren abgeleitet sind, bilden eine dritte wichtige Gruppe von Emulgatoren in Suspendiermitteln, die in der Erfindung verwendet werden können. Jedes der vorgenannten Tenside sind verwendbar, soweit sie nicht-toxisch sind.

Spezielle Beispiele für geeignete Emulgatoren (auch als Detergentien oder Tenside bezeichnet), die gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind:

1. wasserlösliche Seifen, z. B. Natrium-, Kalium-, Ammonium- und Alkanolammoniumsalze der höheren Fettsäuren (C₁(T-C₂₂), insbesondere Natrium- und Kalium-Talg- und Kokosnußseifen.

2. anionische, synthetische Detergentien, die keine Seifen sind, z. B. wasserlöslichen Salze von organischen Schwefelsäure-Reaktionsprodukten, die in ihrer molekularen Struktur einen Alkyl rest mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen und einen Rest aus der von Sulfonsäure- und Schwefelsäureesterresten gebildeten Gruppe aufweisen. Beispiele hierfür sind die Natrium- oder Kaliumalkylsulfate aus Talg oder Kokosnußöl, Natrium- oder Kaliumalkylbenzolsufonate; Natriumalkylglycerylethersulfonate; Natriumkokosölfettsäure-monoglycerid-sulfonate und -sulfate; Natrium-oder Kaliumsalze von Schwefelsäureestern der Umsetzungsprodukte von einem Mol eines höheren Fettalkohols mit etwa 1 bis 6mol Ethylenoxid, Natrium- oder Kaliumalkylphenol-ethylenoxidether-sulfonate mit 1 bis 10 Ethylenoxid-Einheiten pro Molekül, in denen die Alkylreste 8 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten. Reaktionsprodukte von Fettsäuren, die mit Isethiosäure verestert und mit Natriumhydroxid neutralisiert sind, Natrium- oder Kaliumsalze von Fettsäureamiden eines Methyltaurids und Natrium- und Kaliumsalze von SO₃-sulfonierten C₁₀-C₂4 a-Olefinen.

3. nichtionische synthetische Detergentien, hergestellt durch die Kondensation von Alkylenoxidgruppen mit einer organischen, hydrophoben Verbindung. Typische hydrophobe Gruppen umfassen Kondensationsprodukte von Propylenoxid, Propylenglykol, Alkylphenole, Kondensationsprodukte von Propylenoxid und Ethylendiamin, aliphatische Alkohole mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen und Fettsäureamide.

4. nichtionische Detergentien wie Aminoxide, Phosphinoxide und Sulfoxide, die semipolare Eigenschaften aufweisen. Besondere Beispiele für langkettige tertiäre Aminoxide umfassen Dimethyldodecylaminoxid und bis-(2-HydroxyethyOdodecylamin. Besondere Beispiele für Phosphinoxide sind in der US-PS 3,304,263, veröffentlicht am

14. Februar 1967, beschrieben und umfassen Dimethyldodecylphosphinoxid und Dimethyl-(2-hydroxydodecyl)phosphinoxid.

5. langkettige Sulfoxide, z. B. diejenigen, die der Formel

R₁-SO-R₂

entsprechen, wobei R, und R₂ substituierte oder unsubstituierte Alkylreste darstellen, wobei der erste ca. 10 bis 28 Kohlenstoffatome enthält, wogegen R₂1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält. Spezielle Beispiele für diese Sulfoxide umfassen Dodecyl-methyl-sulfoxid und 3-Hydroxytridecyl-methyl-sulfoxid.

6. ampholytische synthetische Detergentien

wie Natrium-3-dodecylaminopropionat und Natrium-3-docecylaminopropansulfonat.

7. zwitterionische synthetische Detergentien wie 3-(N,N-Dimethyl-N-hexadecylammonio)propan-1-sulfonat und 3-(N,N-Dimethyl-N-hexadecylarnmoniol^-hydroxypropan-i-sulfonat.

Zusätzlich können sämtliche der folgenden Typen von Emulgatoren in einer Zusammensetzung der Erfindung verwendet werden:

(a) Seifen (d.h. Alkalisalze) von Fettsäuren, Harzsäuren und Tallöl; (b) Alkylarylsulfonate; (c) Alkylsulfate, einschließlich Tenside mit verzweigtkettigen oder geradkettigen hydrophoben Gruppen als auch primären und sekundären Sulfatgruppen; (d) Sulfate und Sulfonate, die eine Brücke zwischen den hydrophoben und den hydrophilen Gruppen enthalten, wie die fettsäureacylierten

Methyltauride und die sulfierten Fettsäuremonoglyceride; (e) langkettige Säurerester des Polyethylenglykols, insbesondere die Tallölester; (f) Polyethylenglykolethervon Alkylphenolen; (g) Polyethylenglykolethervon langkettigen Alkoholen und Mercaptanen; (h) Fettsäure-diethanolamide; und (i) Blockcopolymere des Ethylenoxids und Propylenoxids. Weil Tenside auf mehr als eine Weise eingeteilt werden können, überlappen eine Anzahl von Klassen der Tenside, die in diesem Absatz aufgeführt sind, mit vorher beschriebenen Tensidklassen.

Es gibt eine Anzahl von Emulgatoren, die speziell für biologische Systeme entwickelt und häufig in diesen verwendet werden.

Eine Anzahl von biologischen Detergentien (Tenside) ist z.B. derauf den Seiten 310-316des 1987er Catalog of Biochemical and Organic Compounds der Sigma Chemical Company aufgeführt. Derartige Tenside sind in vier grundlegende Arten unterteilt:

anionische, kationische, zwitterionische und nichtonische.

Beispiele für anionische Detergentien sind Alginsäure, Caprylsäure, Cholsäure, 1-Decansulfonsäure, Desoxycholsäure, 1-Dodecansulfonsäure, N-Lauroylsarcosin undTaurocholsäure.

Kationische Detergentien umfassen Dodecyltrimethylammoniumbromid, Benzalkoniumchlorid, Benzyldimethylhexadecylammoniumchloird, Cetylpyridiniumchlorid, Methylbenzethoniumchlorid und 4-Picolindodecylsulfat.

Beispiele für zwitterionische Detergentien schließen ein 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (im allgemeinen mit CHAPS abgekürzt),S-KCholamidopropyO-dimethylammoniol^-hydroxy-i-propansulfonat (häufig mit CHAPSO abgekürzt), N-Dodecyl-^N-dimethyl-S-ammonio-i-propansulfonat und Lyso-a-phosphatidylcholin. Beispiele für nichtionische Detergentien umfassen Decanoyl-N-methylglucamid, Diethylenglykolmonopentylether, n-Dodecyl-ß-D-glucopyranosid, Ethylenoxid-Kondensate von Fettalkoholen (z.B. unter dem Handelsnamen Lubrol erhältlich), Polyoxyethylenether von Fettsäuren (insbesondere Ci2-C₂2-Fettsäuren), Polyoxyethylensorbitanfettsäureether (z. B. unter dem Namen Tween im Handel erhältlich) und Sorbitanfettsäureether (z.B. unter dem Namen Span im Handel erhältlich).

Eine besonders geeignete Gruppe von Tensiden sind die nichtionischen Tenside auf Sorbitanbasis. Diese Tenside wreden durch Dehydratisierung von Sorbit zum 1,4-Sorbitan, das man dann mit einem oder mehr Äquivalenten einer Fettsäure reagieren läßt, hergestellt. Den Fettsäure-substituierten Rest kann man dann zum Erhalt einer zweiten Gruppe von Tensiden mit Ethylenoxid reagieren lassen.

Die Fettsäure-substituierten Tenside auf Sorbitanbasis werden durch Reaktion von 1,4-Sorbitan mit einer Fettsäure wie Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure oder einer ähnlichen langkettigen Fettsäure hergestellt; man erhält die 1,4-Sorbitanmonoester, 1,4-Sorbitansesquiester oder 1,4-Sorbitantriester. Die üblichen Bezeichnungen für diese Tenside sind z.B. Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonopalmitat, Sorbitanmonostearat, Sorbitanmonooleat, Sorbitansesquioleat und Sorbitantrioleat. Diese Tenside sind im Handel erhältlich unter dem Namen SPAN® oder ARLACEL®, üblicherweise mit einer Buchstaben- oder Zahlenkennzeichnung, die zwischen den verschiedenen Mono-, Di- und Triester-substituierten Sorbitanen unterscheiden.

Die Tenside SPAN® und ARLACEL® sind hydrophil und sind im allgemeinen in Öl löslich oder dispergierbar. Sie sind ebenso in den meisten organischen Lösemitteln löslich. In Wasser sind sie im allgemeinen unlöslich, aber dispergierbar. Im allgemeinen weisen diese Tenside einen HLB-Wert zwischen 1,8 und 8,6 auf. Derartige Tenside können leicht mit bekannten Methoden hergestellt werden oder sind im Handel erhältlich, z. B. von ICI America's Inc., Wilmington, DE, unter dem Warenzeichen ATLAS®.

Eine verwandte Gruppe von Tensiden umfaßt Polyoxyethylensorbitanmonoester und Polyoxyethylensorbitantriester. Diese Substanzen werden durch Addition von Ethylenoxid an einen 1,4-Sorbitanmonoester oder-triester hergestellt. Die Addition von Polyoxyethylen verwandelt das lipophile Sorbitan-Mono- oder Triester-Tensid in ein hydrophiles Tensid, das im allgemeinen in Wasser löslich oder dispergierbar und in verschiedenem Maße in organischen Flüssigkeiten löslich ist.

Diese Substanzen, im Handel erhältlich unter dem Namen TWEEN®, sind zur Herstellung von Öl-in-Wasser-Emulsionen und -Dispersionen oder für die Solubilisierung von Ölen verwendbar, weiterhin auch, um wasserfreie Salben wasserlöslich oder abwaschbar zu machen. Die TWEEN®-Tenside können zur Verbesserung der Emulsionsstabilität mit einem verwandten Sorbitanmonoester- oder -triester-Tensid kombiniert werden.

TWEEN®-Tenside haben im allgemeinen einen HLB-Wert zwischen 9,6 und 16,7. TWEEN®-Tenside sind im Handel erhältlich von einer Anzahl von Herstellern, z. B. ICI America's Inc., Wilmington, DE, unter dem Warenzeichen ATLAS®.

Eine dritte Gruppe nichtionischer Tenside, die allein oder in Verbindung mit SPAN®-, ARLACEL®- und TWEEN®-Tensiden verwendet werden kann, sind die Polyoxyethylenfettsäuren, die durch die Umsetzung von Ethylenoxid mit einer langkettigen Fettsäure hergestellt werden. Das am häufigsten im Handel erhältliche Tensid dieser Art wird unter dem Namen MYRJ® vertrieben und ist ein Polyoxyethylen-Derivat der Stearinsäure. MYRJ®-Tenside sind hydrophil und wie TWEEN®-Tenside in Wasser löslich oder dispergierbar. Die MYRJ®-Tenside können zur Verwendung bei der Bildung von Emulsionen mit TWEEN®- Tensiden oder mit TWEEN®/SPAN® oder ARLACEL®-Tensidgemischen vermischt werden.

MYRJ®-Tenside können mit bekannten Methoden hergestellt werden oder sind im Handel von der ICI America's Inc. erhältlich.

Eine vierte Gruppe von nichtionischen Detergentien auf Polyoxyethylen-Basis sind die Polyoxyethylenfettsäureether, die von Lauryl-, Acetyl-, Stearyl- und Oleylalkohol abgeleitet sind. Diese Substanzen werden wie oben beschrieben durch die Addition von Ethylenoxid an einen Fettalkohol hergestellt. Der Handelsname für diese Tenside ist BRIJ®. BRIJ®-Tenside können abhängig von der Größe des Polyoxyethylenrests in dem Tensid hydrophil oder lipophil sein. Wenngleich die Herstellung dieser Verbindungen bekannt ist, sind sie ebenso im Handel erhältlich, z.B. von ICI America's Inc.

Andere nichtionische Tenside, die gegebenenfalls im Rahmen der Erfindung verwendet werden können, sind z. B.:

Polyoxyethylen, Polyolfettsäureester, Polyoxyethylenether, Polyoxypropylenfettether, Bienenwachs-Derivate, enthaltend Polyoxyethylen, Polyoxyethylen-Lanolinderivate, Polyoxyethylenfettglyceride, Glycerinfettsäureester oder andere Polyoxyethylen-Säure-Alkohol-oder-etherderivate von langkettigen Fettsäuren mit 12-22 Kohlenstoffatomen.

Daß die Adjuvans- und die Impfstoff-Formulierungen der Erfindung Mehrphasensysteme sind, wird bevorzugt, ein emulsionsbildendes nichtionisches Tensid auszuwählen, das einen HLB-Wert im Bereich von ca. 7-16 aufweist. Dieser Wert kann erhalten werden durch die Verwendung eines einzelnen nichtionischen Tensids, z.B. ein TWEEN®-Tensid, oder kann erreicht werden durch die Verwendung eines Gemisches von Tensiden, z. B. solchen mit einem Tensid auf der Basis von Sorbitanmono-, -di- oder -triester; Sorbitanester-Polyoxyethylen-Fettsäure, Sorbitanestern in Verbindung mit einem von Polyoxyethylenlanolin

abgeleiteten Tensid; ein Sorbitanester-Tensid in Verbindung mit einem Polyoxyethylenfettether-Tensid mit hohem HLB oder ein Polyoxyethylenfettether-Tensid oder eine Polyoxyethylensorbitanfettsäure.

Im Rahmen der Erfindung ist die Verwendung eines einzelnen nichtionischen Tenside als emulsionsstabilisierendes nichtionisches Tensid besonders bevorzugt, insbesondere die Verwendung eines TWEEN®-Tensids. Das Tensid mit der Bezeichnung TWEEN® 80, auch bekannt als Polysorbat 80 für Polyoxyethylen 20-Sorbitanmonooleat, ist das vorteilhafteste der o.g. Tenside.

Eine ausreichende Verkleinerung der Tröpfchengröße kann üblicherweise bewirkt werden, wenn das Tensid in einer Menge von 0,02 bis 2,5Gew.-% vorliegt, vorzugsweise in einer Menge von 0,05 bis 1 %, und besonders bevorzugt in einer Menge von 0,01 bis 0,5%.

Die Art und Weise, wie die Tröpfchengröße der Erfindung erreicht wird, ist für die Praxis der vorliegenden Erfindung nicht wichtig. Eine Art, auf die Submikron-Öltröpfchen erhalten werden können, ist die Verwendung eines handelsüblichen Emulgierers,z.B. das Modell Nr Л10Y, erhältlich bei Microfluidics, Newton, MA. Beispiele für andere handelsübliche Emulgierer umfassen das Gaulin-Modell 30 CD (Gaulin, Inc., Everett, MA) und den Rainnie Minlab-Typ 8.30 H (Niro Atomizer Food und Dairy, Inc., Hudson, Wl). Diese Emulgierer arbeiten mit dem Prinzip der großen Scherkräfte, erzeugt durch Pressen der Flüssigkeiten durch kleine Öffnungen unter hohem Druck.

Wenn das Modell 110Y bei 34,5-270MPa (5000-30000psi) arbeitet, werden Öltröpfchen mit Durchmessern von 100-750nm erhalten.

Die Größe der Öltröpfchen kann durch Wechseln des Verhältnisses zwischen Detergens und Öl (Steigern des Verhältnisses verkleinert die Tröpfchengröße), des Arbeitsdrucks (steigender Arbeitsdruck verringert die Tröpfchengröße), der Temperatur (steigende Temperatur verringert die Tröpfchengröße) und Zugabe eines amphipatischen Immunostimulans (Zugabe derartiger Agentien verringert die Tröpfchengröße) verändert werden. Die tatsächliche Tröpfchengröße ändert sich mit dem einzelnen Detergens, dem Öl und dem Immunostimulans (wenn vorhanden) sowie mit den im einzelnen ausgewählten Arbeitsbedingungen. Die Tröpfchengröße kann durch Verwendung von Größenbestimmungsinstrumenten, wie der im Handel erhältliche, von der Coulter Corporation hergestellte Sub-Mikron-Teilchen-Analysator (Modell N 4 MD), überprüft werden, und die Parameter können unter Verwendung der oben offenbarten Richtlinien verändert werden, bis im wesentlichen alle Tröpfchen einen Durchmesser <1 Mikron, vorzugsweise <0,8 Mikron, und insbesondere <0,5 Mikron haben. Im wesentlichen alle bedeutet mindestens 80% (gemessen an der Zahl), vorzugsweise mindestens 90%, insbesondere mindestens 95% und am meisten bevorzugt mindestens 98%. Die Teilchengrößenverteilung ist typischerweise eine Gaussche Verteilung, so daß der mittlere Durchmesser kleiner als die angegebenen Grenzwerte ist.

Die vorliegende Erfindung wird ausgeführt, indem eine Ölemulsion in Abwesenheit anderer Komponenten, deren Verwendung in Submikronemulsionen für eine befriedigende Immunogenizität bereits im Stand der Technik gelehrt wird, nämlich Polyoxypropylen-Polyoxyethylen-Blockcopolymere, wie die zur Verwendung in Adjuvantien in den US-PS 4772466 und 4770874 und in EP 0315153 A2 beschriebenen, hergestellt wird.

Eine Adjuvans-Zusammensetzung der Erfindung besteht im wesentlichen aus einem metabolisierbaren Öl in Wasser und einem von Polyoxypropylen-Polyoxyethylen-Copolymeren (POP-POE-Copolymeren) verschiedenen Emulgator. Der Emulgator braucht keine besondere immunostimulierende Aktivität zu besitzen, weil die Ölzusammensetzung selbst als Adjuvans dienen kann, wenn die Öltröpfchen im Submikronbereich liegen. Indes kann eine gesteigerte immunostimulierende Aktivität durch Einschluß jeder der bekannten Immunostimulantien in die Zusammensetzung erreicht werden. Die Immunostimulantien können entweder getrennt von dem Emulgator und dem Öl sein, oder das Immunostimulans und der Emulgator können ein und dasselbe Molekül sein. Beispiele für die erstgenannte Situation umfassen mit getöteten Mykobakterien wie Mycobacterius tuberculosis und subzellulären Bestandteilen davon gemischte metabolisterbare Öle. Zusätzliche immunostimulierende Verbindungen umfassen die Muramylpeptide, die Bestandteile der Zellwände dieser Bakterien sind. Eine Anzahl von bevorzugten Muramylpeptiden wird unten aufgeführt. Beispiele für vereinte Emulgatoren/Immunostimulantien sind die lipophilen Muramylpeptide, die in den zwei oben zitierten Veröffentlichungen von Sanchez-Pescador et al.beschrieben wurden. Diese Verbindungen enthalten das basische N-Acetylmuramyfpeptid (ein hydrophiler Rest), das als immunostimulierende Gruppe wirkt, enthalten jedoch ebenso einen lipophilen Rest, der der resultierenden Verbindung oberflächenaktive Eigenschaften verleiht. Derartige Verbindungen, ebenso andere Arten von amphipatischen immunostimulierenden Substanzen, wirken sowohl als Immunostimulantien als auch als Emulgatoren und werden in der Praxis der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Zusätzlich ist es ebenso möglich, die vorliegende Erfindung unter Verwendung einer amphipatischen immunostimulierenden Substanz in Verbindung mit einer zweiten immunostimulierenden Substanz, die nicht amphipatisch ist, auszuführen. Ein Beispiel ist die Verwendung eines lipophilen Muramylpeptide in Verbindung mit einem im wesentlichen unsubstituierten (d.h. im wesentlichen hydrophilen) Muramyldipeptid.

Die bevorzugten, die Immunreaktion stimulierenden Muramylpeptide (oder genauer: Glycopeptide) der Erfindung sind eine Gruppe von Verbindungen, die verwandt sind mit und im allgemeinen abgeleitet sind von N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, das von Ellouz et al. (1974) Biochem. & Biophys. Res. Comm., 59 (4): 1317 als die kleinste wirksame Einheit, die eine immunologische Adjuvans-Wirksamkeit in M. tubercolosis, dem mykobakteriellen Bestandteil von Freunds vollständigem Adjuvans, aufweist, bestimmt wurde. Eine Anzahl von Dipeptid- und Polypeptid-substituierten Muraminsäurederivaten wurde nachfolgend ermittelt, und es wurde gefunden, daß sie immunostimulierende Aktivität besitzen.

Obwohl diese Glycopeptide eine Gruppe verschiedener Verbindungen darstellen, können sie im allgemeinen durch die folgende Formel I wiedergegeben werden:

(I)

wobei die Sauerstoffatome des Pyranringes mit Wasserstoff, Alkyl, Acyl oder dergleichen substituiert sind oder durch Stickstoff enthaltende Substituenten ersetzt werden können, insbesondere der Sauerstoff in 6-Stellung; die 2-Aminogruppe eine Acylgruppe oder ein anderes Amid ist; die Lactylseitenkette modifiziert ist, d. h. ein Ethylrest oder ein anderer 2-Alkylrest ist, und die Peptidfunktion ein Dipeptid oder Polypeptid, das weiter derivatisiert sein kann, ist. Furanosylanloge der Pyranosylverbindungen haben ebenso immunopotenzierende Aktivität und können bei der Erfindung verwendet werden.

Unter den Glycopeptiden der Erfindung sind die mit Mesoalpha, epsilon-diaminopimelinsäure verbundenen Disaccharide und Tetrasaccharide, die in US-PS 4,235,771 und 4,186,194 beschrieben sind.

Die die Immunreaktion anregenden Glycopeptide, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden können, sind in US-PS 4,094,971,4,101,536,4,152,684,4,235,771,4,323,559,4,327,085,4,185,089,4,082,736,4,369,178,4,314,998,4,082,735 und 4,186,194 offenbart. Auf die in diesen Patentschriften beschriebenen Glycopeptide wird hier Bezug genommen. Sie stellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung dar. Die Verbindungen der japanischen Patentanmeldungen J 54079-2227, J 54079-228 und J 541206-696 sind ebenso im Rahmen der Erfindung verwendbar.

Methoden zur Herstellung dieser Verbindungen sind bekannt.

Beispielhafte Darstellungen des Herstellungsverfahrens sind in den US-PS 4,082,736 und 4,082,735 enthalten. Zusätzlich sind ähnliche Herstellungsverfahren in den im vorhergehenden Absatz zitierten US-Patentschriften offenbart.

Bevorzugte Glycopeptide haben die Formel Il

(II)

in der

R einen unsubstituierten oder substituierten Alkylrest, der 1 bis 22 Kohlenstoffatome enthält, oder einen unsubstituierten oder substituierten Arylrest, der 6 bis 10 Kohlenstoffatome enthält; R' und R², die gleich oder verschieden sind, Wasserstoff oder einen Acylrest, der 1 bis 22 Kohlenstoffatome enthält; R³ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen oder Aryl mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen; R⁴ Wasserstoff oder Alkyl; η 0 oder 1; X und Z unabhängig voneinander Alanyl, VaIyI, Leucyl, Isoleucyl, a-Aminobutyryl, Threonyl, Methionyl, Cysteinyl, Glutamyl, Glutaminyl, Isoglutamyl, Isoglutaminyl, Aspartyl, Phenylalanyl, Tyrosyl, Lysyl, Ornithinyl, Arginyl, Histidyl, Asparaginyl, Prolyl, Hydroxyprolyl, Seryl oder Glycyl; R⁵ eine gegebenenfalls veresterte oder amidierte Carboxylgruppe der terminalen Aminosäure und Y-NHCHr⁶CH₂CH₂CO-, wobei R⁶ eine gegebenenfalls veresterte oder amidierte Carboxylgruppe ist, bedeuten.

Alkyl bedeutet einen geradkettigen oder verzweigten Rest, der, wenn nicht anders vermerkt, 1 bis 7 Kohlenstoffatome aufweist,

z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl oder Heptyl oder ein Isomeres derselben. Niedrigalkyl bedeutet einen Rest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

Eine gegebenenfalls veresterte oder amidierte Carboxylgruppe ist die Carboxylgruppe selbst oder eine Carboxylgruppe, die mit einem niederen Alkanol, wie Methanol, Ethanol, Propanol oder Butanol verestert ist, oder die Carbamoylgruppe, die an dem Stickstoffatom unsubstituiert oder mit Alkyl, insbesondere Niedrigalkyl, Aryl, vorzugsweise Phenyl, oder Arylalkyl, vorzugsweise Benzyl, mono-substituiert oder di-substituiert ist. Die Carbamoylgruppe kann ebenso mit einem Alkylidenrest wie dem Butylidenrest oder dem Pentylidenrest substituiert sein. Zusätzlich kann die Carbamoylgruppe R⁵ mit einer Carbamoylmethylgruppe an dem Stickstoffatom substituiert sein.

Besonders bevorzugte Verbindungen sind solche gemäß Formel II, wobei R und R¹ gleich oder verschieden sein können und Wasserstoff oder ein Acylrest, der 1 bis 22 Kohlenstoffatome enthält, R² Methyl, R³ Wasserstoff, X L-alanyl, Y D-Isoglutaminyl und η = 0 bedeuten.

Eine andere bevorzugte Gruppe von Glycopeptiden sind Verbindungen gemäß der Formel II, wobei R und R¹ Wasserstoff oder Acyl mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen, R² Methyl, R³ Wasserstoff, R⁴ Methyl oder Butyl und X L-VaIyI, L-Seryl, L-Alanyl, L-Threonyl oder L-a-Aminobutyryl bedeuten.

Spezielle Beispiele umfassen die folgenden Verbindungen:

N-Acetylmuramyl-L-a-aminobutyryl-D-isoglutamin;

e-O-Stearoyl-N-acetylmuramyl-L-a-aminobutyryl-D-isoglutamin;

N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin;

N-Acetylmuramyl-L-valyl-D-isoglutamin;

N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamin-n-butylester;

N-Acetyl-desmethyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin;

N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamin;

N-Acetylmuramyl-L-seryl-D-isoglutamin;

N-Acetyl(butylmuramyl)-L-a-aminobutyl-D-isoglutamin; und

N-AcetyKbutylmuramyO-L-alanyl-D-isoglutamin.

Eine wirksame Menge eines immunostimulierenden Glycopeptids ist die Menge, die bei Verabreichung in Verbindung mit einem Antigen eine Steigerung des Antikörpertiter-Spiegels über den Titer-Spiegel, der beobachtet wird, wenn das Glycopeptid nicht mit verabreicht worden ist (typischerweise im Bereich von 0,0001 bis 10% der Gesamtzusammensetzung), bewirkt. Man kann feststellen, daß jedes Glycopeptid einen Bereich der wirksamen Dosis haben kann, der von den anderen Glycopeptiden verschieden sein kann. Daher kann kein einheitlicher Dosis-Bereich angegeben werden, der genau für jedes mögliche Glycopeptid im Rahmen der Erfindung paßt. Dennoch liegt im allgemeinen das Glycopeptid in dem Impfstoff vorzugsweise in einer Menge zwischen 0,001 und 5% (w/v), insbesondere 0,01 bis 3% (w/v), vor.

Die meisten der oben diskutierten immunostimulierenden Glycopeptide sind im wesentlichen hydrophile Verbindungen.

Demgemäß sind sie für den Einsatz mit einem getrennten Emulgator (der wie oben beschrieben ebenso ein Immunostimulans sein kann) vorgesehen. In einigen Fällen haben die oben beschriebenen Verbindungen einen lipophilen Charakter, z. B. die Verbindungen, die Fettsäuresubstituenten und/oder Arylsubstituenten an dem Zuckerrest enthalten, insbesondere diejenigen, die einen oder mehr Acylreste mit 14 bis 22 Kohlenstoffatomen enthalten, sind insbesondere die, die mehr als einen dieser Acylsubstituenten enthalten. Dennoch ist es durch Verbinden eines Lipidrestes mit der Carboxylgruppe oder Seitenketten des Peptidrestes auch möglich, bei einem Muramyl peptid lipophilen Charakter zu erreichen. Insbesondere stellen mit der terminalen Carboxylgruppe des Peptidrests verbundene Lipidgruppen eine bevorzugte Gruppierung in den Verbindungen dar. Diese Verknüpfung kann leicht entweder direkt, wie durch Bildung einer Esterbindung zwischen dem terminalen Carboxylat und einem Fettalkohol mit 14 bis 22 Kohlenstoffatomen, oder durch Verwendung einer bifunktionellen brückenbildenden Gruppe, wie Ethanolamin, zur Verknüpfung des Carboxylate mit einem Lipid über entweder eine Ester- oder eine Amidbrücke erhalten werden. Insbesondere werden bei dieser Ausführungsform der Erfindung Phospholipide bevorzugt, weil die Phosphatgruppen leicht verknüpfbare funktionell Gruppen sind. Phosphatidylethanolamin, eine leicht erhältliche, in der Natur vorkommende Verbindung, kann über eine Amidbindung leicht mit dem terminalen Carboxylat des Peptidrests verbunden werden. Andere Lipide an der terminalen Carboxylgruppe umfassen Acylglycerine, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinosit, Phosphatidylglycerin, Cardiolipin und Sphingomyelin.

Eine Anzahl von bevorzugten amphipatischen immunostimulierenden Peptiden haben die folgende Formel III;

(III)

in der R, R¹-R⁴, X, Y, Z und η die oben genannte Bedeutung haben. L stellt einen Lipidrest dar, z. B. einen der oben beschriebenen.

Zusammenfassend gesagt, ergeben der Muraminsäurerest und der Peptidrest des Moleküls zusammen einen hydrophilen Rest. In dem Molekül ist auch ein lipophiler Rest vorhanden, wobei die Lipophilie im allgemeinen durch eine langkettige Kohlenwasserstoffgruppe, die typischerweise in Form einer Fettsäure vorliegt, erhalten wird. Die Fettsäure oder ein anderer kohlenwasserstoffhaltiger Rest kann an eine Hydroxylgruppe des Zuckers gebunden werden oder kann direkt, z.B. durch die Reaktion einer Fettsäure mit einer in dem Peptidrest vorhandenen freien Aminogruppe, oder über eine brückenbildende Gruppe, z. B. Hydroxyalkylamin, das über die Bildung einer Amidbindung zwischen einer Carboxylgruppe des Peptids und einer funktionellen Gruppe in einem Lipid, z. B. einer Phosphatgruppe, eine Brücke bildet, mit dem Peptidteil des Moleküls verbunden werden. Phospholipidreste sind für die Verwendung bei der Bildung lipophiler Muramylpeptide besonders bevorzugt. Eine Gruppe von bevorzugten Verbindungen umfaßt Muramylpeptide und -tripeptide, die über einen Hydroxyalkylaminrest mit einem Phospholipidrest verbunden sind. Ein Beispiel und eine besonders bevorzugte Verbindung ist N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin^-II^-dipalmitoyl-sn-glycero-S-fhydroxyphosphoryloxyiJethylamid (abgekürzt MTP-PE). Die Adjuvans-Formulierungen werden im allgemeinen aus den oben beschriebenen Bestandteilen hergestellt, bevor das Adjuvans mit dem Antigen, das in dem Impfstoff verwendet werden soll, vereinigt wird. Das Wort „Antigen" bezieht sich auf jede Substanz, einschließlich ein Protein oder Protein-Polysaccharid, ein Protein-Lipopolysaccharid, ein Polysaccharid, ein Lipopolysaccharid, Virus-Untereinheiten, vollständige Viren oder vollständige Bakterien, die, wenn sie dem Blutstrom eines Tieres fremd ist und in das Gewebe des Tieres Zugang findet, die Bildung spezifischer Antikörper stimuliert und in-vivo oder in-vitro spezifisch mit einem homologen Antikörper reagiert. Außerdem stimuliert es die Proliferation von T-Lymphocyten mit Rezeptoren für das Antigen und kann mit den Lymphocyten unter Einleitung der Reihe von Reaktionen reagieren, die als zeilvermittelte Immunität bezeichnet wird.

Ein Hapten liegt im Bereich dieser Definition. Ein Hapten ist der Teil eines Antigenmoleküls oder Antigenkomplexes, der dessen immunologische Spezifizität bestimmt. Üblicherweise ist ein Hapten ein Peptid oder Polysaccharid in natürlich vorkommenden Antigenen. In künstlichen Antigenen kann es eine niedermolekulare Substanz, z. B. ein Arsanilsäurederivat, sein. Ein Hapten reagiert in-vivo oder in-vitro spezifisch mit homologen Antikörpern oder T-Lymphocyten. Andere Bezeichnungen sind antigene Determinante, antigene strukturelle Gruppierung und Hapten-Gruppierung.

Die Formulierung eines Impfstoffs der Erfindung erfordert eine wirksame Menge eines Antigens. Das heißt, es wird eine Menge eines Antigens zugegeben, die in Kombination mit dem Adjuvans bewirkt, daß der Empfänger eine spezifische und ausreichende Immunreaktion entwickelt, die ihm Schutz vor der folgenden Exposition mit einem Virus, einem Bakterium, einem Pilz, einem Mycoplasma oder einem Parasiten, gegen den oder das immunisiert wurde, verleiht.

Antigene können mit im Fachgebiet bekannten Methoden hergestellt oder im Handel bezogen werden. Zum Beispiel beschreiben die US-PS 4,434,157,4,406,885,4,264,587,4,117,112,4,034,081 und 3,996,907, auf die hier Bezug genommen wird. Verfahren zur Herstellung von Antigenen für Katzenleukämievirus-Impfstoffe. Andere Antigene können ähnlich hergestellt werden. Antigene im Rahmen der Erfindung umfassen ganze inaktivierte Virusteilchen, isolierte Virusproteine und Proteinuntereinheiten, ganze Zellen und Bakterien, Zellmembran- und Zellwandproteine, und dergleichen. Die Impfstoffe der Erfindung können zur Immunisierung von Vögeln und Säugetieren gegen Krankheiten und Infektionen, einschließlich, aber ohne Beschränkung auf, Cholera, Diphtherie, Wundstarrkrampf (Tetanus), Keuchhusten (Pertussis), Grippe (Influenza), Masern, Hirnhautentzündung (Meningitis), Mumps, Pest, spinale Kinderlähmung (Polymyelitis), Tollwut, amerikanisches Fleckfieber, Röteln, Blattern, Typhus, Fleckfieber (Flecktyphus), Katzenleukämievirus und Gelbfieber verwendet werden.

Es kann keine Einzeldosisbestimmung angeführt werden, die für jedes Antigen und alle Antigene eine bestimmte Anleitung ermöglicht, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden kann. Die wirksame Menge des Antigens hängt von seiner zugehörigen Wirksamkeit und Reinheit ab. Es kommt in Betracht, daß die Adjuvans-Zusammensetzungen der Erfindung zusammen mit Ganzzell- oder Virusimpfstoffen oder mit gereinigten Antigenen oder Proteinuntereinheiten oder Peptidimpfstoffen, die mit Techniken oder Synthesen mit rekombinanter DNA hergestellt wurden, verwendet werden. Weil die Adjuvans-Zusammensetzungen der Erfindung stabil sind, können das Antigen und die Emulsion durch einfaches Schütteln gemischt werden. Andere Techniken, wie das schnelle Pressen einer Mischung des Adjuvans und der Lösung oder Suspension des Antigens durch eine kleine Öffnung (z. B. eine Injektionsnadel), ergeben auf leichte Weise eine brauchbare Impfstoff-Zusammensetzung.

Ausführungsbeispiele

Nachdem die Erfindung jetzt allgemein beschrieben worden ist, wird sie im Zusammenhang mit den folgenden ausführlichen Beispielen, die der Erläuterung dienen und die, wenn nicht im einzelnen angegeben, die Erfindung nicht beschränken sollen, näher erläutert.

Beispiel 1

Allgemeine Methoden

Wenn nicht anders vermerkt, wurden die folgenden allgemeinen Methoden überall in den folgenden Beispielen verwendet.

Materialien

MTP-PE wurde von CIBA-GEIGY (Basel, Schweiz) bezogen. Squalen und Tween 80 wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. CFA und IFA wurden von Gibco (Grand Island, NY) erhalten. Aluminiumhydroxid (Rehsorptar) wurde von Reheis Chemical Co. (Berkeley Heights, NJ) bezogen.

Herstellung der Emulsionen

Verfahren 1 -Spritze und Nadel. Ein Gemisch von 4% Squalen, 0,008%Tween 80,250цд/ті MTP-PE und Antigen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurde sechsmal durch eine 23 Gauge-Nadel gedrückt. Diese Emulsion besaß Tröpfchengrößen im Bereich von 10 Mikron und wird MTP-PE-LO genannt.

Verfahren 2 - Kirkland-Emulgierer. Das obige Gemisch wurde fünfmal durch einen Kirkland-Emulgierer gedrückt. Die Emulsion besteht im wesentlichen aus Öltröpfchen mit 1-2 Mikron und wird MTP-PE-LO-KE genannt. Der Kirkland-Emulgierer (Kirkland Products, Walnut Creek, CA) ist eine verkleinerte Version der handelsüblichen Messerschneide-Emulsionsmaschine (z. B. Gaulin Modell 30CD und Rainnie Minilab Typ 8,30H), die in der Arbeitskammer ungefähr 6,9MPa (1000 Psi) erzeugt.

Verfahren 3- Mikrofluidierer. Gemische, die 0,3-18% Squalen und 0,2-1,0 mg/ml MTP-PE mit oder ohne Tween 80 enthielten, wurden bei 34,5-207MPa (5000-30000psi) durch den Mikrofluidierer (Modell Nr. 110Y, Microfluidics Newton, MA) gedruckt.

Typischerweise wurden 50ml Emulsion 5min oder 100ml 10min in dem Mikrofluidierer gemischt. Die erhaltenen Emulsionen bestanden, abhängig von der Squalen-, MTP-PE- und Detergenskonzentration, dem Arbeitsdruck des Mikrofluidierers und der Temperatur, aus Öltröpfchen mit 100-755nm. Diese Formulierung wurde MTP-PE-LO-MF genannt.

Das Antigen wurde den o. g.Adjuvans-Formulierungen nach der Herstellung zugegeben. Das Antigen und die Emulsion wurden durch Schütteln gemischt. Bei Verwendung von CFA und IFA wurde das Antigen in PBS mit einem gleichen Volumen von entweder CFA oder IFA gemischt. Das Gemisch wurde emulgiert, indem es durch eine Injektionsnadel gedrückt wurde, bis eine dicke Emulsion erhalten wurde.

Antigene

Das Herpes Simplex-Virus (HSV) rgD2 stellt ein gentechnologisch mit Ovarialzellen des chinesischen Hamsters hergestelltes rekombinantes Protein dar. Bei diesem Protein ist die normale Ankerregion abgetrennt, was ein in ein Gewebekulturmedium ausgeschiedenes glycosyliertes Protein ergibt. Das gD2 wurde in dem CHO-Medium bis zu einer Reinheit von mehr als 90% gereinigt. Das menschliche Immundefekt-Virus (HIV)-env-2-3 ist eine rekombinante Form des HIV-Hüllproteins, die

gentechnologisch in Saccharomyces cerevisae hergestellt wird. Dieses Protein stellt die vollständige Proteinregion von HIV gp 120 dar, ist aber nicht glycosyliert und denaturiert, wenn es von der Hefe gereinigt wird. HIV gp 120 stellt eine voll glycosilierte, ausgeschiedene Form von gp 120 dar, die in CHO-Zellen auf eine ähnliche Weise wie das o. g. gD2 gebildet wird.

Immunisierung von Tieren

Mäusen wurden die verschiedenen Adjuvans-Antigen-Formulierungen inm peritoneal, intramuskulär oder subkutan injiziert. Meerschweinchen wurden über die Pfote oder intramuskulär immunisiert. Kaninchen, Ziegen und Paviane wurden intramuskulär immunisiert.

Analyse der Immunreaktion

Antikörpertiter gegen das immunisierende Antigen wurden durch Enzym-Immunassay (EUSA) bestimmt.

Beispiel 2

MTP-PE-LO-Formulierung bei großen Tieren (Vergleichsbeispiel)

Es wurden zuerst mit dem HIV-env-2-3-Antigen und danach mit dem HSV-gD-Protein eine Anzahl von Experimenten durchgeführt, in denen die MTP-PE-LO-Formulierung zur Stimulierung der Immunität in großen Tieren verwendet wurde. Diese Versuche werden unten dargestellt.

1. HIVenv2-3 a. Meerschweinchen

Meerschweinchen wurden monatlich entweder über die Pfote oder intramuskulär mit einer 50 ug/Dosis MTP-PE env 2-3 immunisiert. Der Impfstoff wurde entweder mit der MTP-PE-LO-Formulierung (4% Squalen, 0,008% Tween 80,50^g/Dosis MTP-PE) oder an Alum (0,7% Aluminiumhydroxid) absorbiert verabreicht. Eine Woche nach jeder Immunisierung wurde Serum entnommen und mit ELISA auf Anti-env-2-3-Antikörper untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Die MTP-PE-LO-Formulierung ergibt sowohl bei intramuskulärer Verabreichung als auch bei Verabreichung in die Pfote hohe Anti-env-2-3-Titer. Im Gegensatz dazu ergibt Alum auf beiden Wegen viel niedrigere Antikörper-Titer. Dieser Versuch veranschaulicht die Wirksamkeit der MTP-PE-LO-Formulierung bei Meerschweinchen.

Tabelle 1

Vergleich verschiedener Adjuvantien beim Erzeugen env 2-3-spezifscher Antikörper in Abhängigkeit vom Injektionsweg⁰)

Adjuvans-	Tier	Weg	Null	Zwei	Env2-3ELISA-Titer	Vier	Fünf	Sechs	Sieben
gruppe	#	FP	«100c	135500	Drei	343100	401 800	338000	282700
MTP-PE	839	FP	«100	331 700	382100	542300	392900	359000	292100
4%Squalen	840	FP	«100	247800	588700	301100	285800	334400	383 700
0,008%	841	FP	«100	108100	330900	694300	344400	289800	220300
Tween	842	FP	«100	65000	570300	—	—	—	-
	843	FP	«100	25000	_b	-	-	-	-
	844	(FP)	(«100)	(152000)	-	(470000)	(356000)	(330000)	(295000)
	(Mittelwert)	IM	«100	12300	(468000)	23800	15100	20000	27300
MTP-PE	845	IM	«100	10400	19600	43600	44600	121100	42 000
4% Squalen	846	IM	«100	29700	20 500	136800	156000	144500	164600
0,008%	847	IM	«100	447 000	80000	400000	71000	674000	533000
Tween	848	IM	350	10600	640000	311000	533000	nt	200000
	849	IM	«100	340000	78700	—	—	—	—
	850	(IM)	(«100)	(142000)	—	(183000)	(164000)	(240000)	(193000)
	(Mittelwert)	FP	«100	«100	(168000)	nt	nt	nt	nt
Alum	863	FP	«100	2500	nt	86000	47 700	21000	16000
	864	FP	«100	2400	4100	80400	83 500	39 200	4500
	865	FP	«100	15100	26400	124100	107100	56700	16800
	866	FP	«100	2200	103 900	14500	11900	11400	12 300
	867	FP	«100	6500	8 800	34000	18 800	12800	—
	868	(EP)	(«100)	(5700)	44500	(68000)	(54000)	(28000)	(12 000)
	(Mittelwert)	IM	«100	«100	(38000)	2600	2 000	1600	2 300
Alum	869	IM	«100	«100	300	220	330	270	300
	870	IM	«100	«100	130	4300	4900	3000	1600
	871	IM	«100	«100	1200	900	920	770	1700
	872	IM	«100	«100	300	41100	79 800	27900	15500
	873	IM	«100	«100	990	17 300	13 200	10600	8600
	874	(IM)	(«100)	(«100)	940	(11000)	(17 000)	(7000)	(5000)
	(Mittelwert)			(640)

a. Meerschweinchen wurden entweder über den Weg durch die Pfote (FP) oder über den intramuskulären (IM) Weg monatlich mitS^g/Dosis env 2-3 plus den verschiedenen Adjuvantien immunisiert. Seren wurden eine Woche nach jeder Immunisierung entnommen.

b. „-"; wegen des Tods des Tiers keine Daten erhalten.

с << 100; kein nachweisbares EUSA-Signal bei Serum-Verdünnung 1:100

d. nt = nicht getestet.

b. Ziegen Ziegenpaare erhielten mit der MTP-PE-LO-Formulierung, die verschiedene Mengen MTP-PE zwischen 0 und 500 цд enthielten, bei den ersten Immunisierungen 1 mg env 2-3 und bei den zweiten Immunisierungen 500 цд. Positive Kontrolltiere erhielten die erste Immunisierung mit CFA und die zweite Immunisierung mit IFA. Eine Gruppe erhielt auch mit der 100μg MTP-PE enthaltenden MTP-PE-LO-Formulierung bei der ersten Immunisierung 100цд env 2-3, gefolgt von 50 цд bei der zweiten Immunisierung. Beide Ziegen, die Freund's Adjuvans erhielten, ergaben, wie in Tabelle 2 gezeigt, hohe Antikörpertiter von 2 bis 62 800. Im Gegensatz dazu waren die meisten der Ziegen, die die MTP-PE-LO-Formulierung erhielten, negativ für Anti-env-2-3-Antikörper. Die Tiere, die reagierten, ergaben nur Titer im Bereich 100-600. Diese Ergebnisse stehen in starkem Gegensatz zu den obigen Daten für Meerschweinchen.

Tabelle 2

Antikörperreaktionen von mit env 2-3 und verschiedenen Dosen MTP-PE immunisierten Ziegen

Adjuvans Formulierung

	Keine	Env2-3ELISA-Titer	Zwei
Nummer	«100b	Immunisierung	62800
des Tiers	«100	Eine	7500
2295	«100	43200	<100
2 296	«100	2700	300
2297	«100	<100c	<100
2298	«100	100	200
2290	«100	<100	<100
2300	«100	100	<100
2301	«100	«100	100
2302	«100	«100	<100
2303	«100	«100	600
2304	«100	«100	<100
2305	«100	<100	<100
2306	«100	«100	«100
2 307	200	<100	200
2308	«100	«100	«100
2309	500
2310	<100

Freund's

ST⁸ + Oug MTP-PE ST + 20 μg MTP-PE ST + 50 цд MTP-PE ST+ЮОцд MTP-PE ST + 250 цд MTP-PE St + 500 цд MTP-PE ST+ЮОцд MTP-PE

a. ST ist die Formulierung mit wenig Öl; 4% Squalen, 0,008% Tween

b. «100 zeigt einen Env 2-3 ELISA-Titer an, der sich bei einer Serum-Verdünnung Vioo nicht aus dem Rauschen abhebt.

с < 100 zeigt einen Env 2-3 ELISA-Titer an, der sich bei einer Serum-Verdünnung Vioo aus dem Rauschen abhebt, aber kleiner als das halbe maximale Signal der Analyse ist.

с Hunde Beagle-Hund wurden in Abständen von drei Wochen entweder mit 250 цд env-2-3 in MTP-PE-LO (100 цд MTP-PE) oder mit der MTP-PE-LO-Formulierung allein immunisiert. Zehn Tage nach jeder Immunisierung wurden den Tieren Blutproben entnommen und mit ELISA Anti-env-2-3-Antikörpertiter bestimmt. Tabelle 3 zeigt, daß die zwei Hunde, die env 2-3 und Adjuvans erhielten, Anti-env-2-3-Titer zeigten, aber diese Titer erreichten nicht die bei den Meerschweinchen beobachteten Höhen (maximale Titer 1700 und 6300 für die zwei immunisierten Tiere). Zusätzlich bildeten diese Tiere keine Virusneutralisierenden Antikörper gegen entweder die homologen (SF2)oderheterologen (BRU oder Zr6) HIV-Stämme.

Tabelle 3

ELISA-und neutralisierende Antikörper-Titer für Seren von mit env 2-3 in MTP-PE-LO-Adjuvans immunisierten Beagle-Hunden³

	immunisiert	Immunisier-	#	Titer	Env 2-3	Neutralisier-Titer	HIV-
Tier	mit	Vorprobe	«100b	ELISA	HIV-	Zr6
#	env2-3	2	1300	HIV-SF 2	BRU	<20
1375	MTP-PE-LO			<20c	<20	<20
	100 мд	3	1700	<20	<20
	MTP-PE	4	900			<20
		5	400	<20	<20	<20
		6	300	<20	<20	<20
		7	300	<20	<20	<20
		Vorprobe	«100	<20	<20	<20
	env 2-3	2	3500	<20	<20	<20
1376	MTP-PE-LO			<20	<20	<20
	100 ид	3	6300	<20	<20
	MTP-PE	4	5100			<20
		5	2100	<20	<20	<20
		6	2200	<20	<20	<20
		7	2000	<20	<20	<20
			<20	<20	<20
			<20	<20

Fortsetzung zu Tabelle 3

	immunisiert	Immunisier-	#	Titer	Env2-3	Neutralisier-Titer	HIV-
Tier	mit	Vorprobe	«100	ELlSA	HIV-	Zr 6
#	MTP-LO	2	«100	HIV-SF 2	BRU	<20
1377	0-MTP-PE	3	«100	<20	<20	<20
	Kontrolle	4	«100	<20	<20	<20
		5	«100	<20	<20	<20
		6	«100	<20	<20	<20
		7	«100	<20	<20	<20
		Vorprobe	«100	<20	<20	<20
	MTP-PE-LO	2	«100	<20	<20	<20
1378	O-MTP-PE	3	«100	<20	<20	<20
	Kontrolle	4	«100	<20	<20	<20
		5	«100	<20	<20	<20
		6	«100	<20	<20	<20
		7	«100	<20	<20	<20
			<20	<20	<20
			<20	<20

a. Die Hunde erhielten alle 21 Tage intramuskulär 250цд env 2-3 in Biocin-Adjuvane (ЮОцд MTP-PE). 10 Tage nach jeder Injektion wurden Blutproben entnommen.

b. Es wurden ELISA-Titer «100 angegeben, wenn bei Serum-Verdünnung Vtoo kein Signal nachgewiesen wurde.

с Neutralisier-Titer < 20 zeigen an, daß bei der Serum-Verdünnung mit der höchsten getesteten Konzentration (V20) keine Neutralisierung beobachtet wurde.

d. Schweine

Schweine wurden alle 21 Tage mit 1 mg env 2-3 plus MTP-PE-LO (100цд MTP-PE) immunisiert. Kontrolltiere erhielten das Adjuvans allein. Zehn Tage nach jeder Immunisierung wurden den Tieren Blutproben entnommen und mit ELISA Anti-env-2-3-Antikörpertiter bestimmt. Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, daß die zwei immunisierten Tiere nur geringe Anti-env-2 Titer (140 bzw. 100) entwickelten und keine nachweisbaren Virus-neutralisierenden Titer gegen entweder den homologen Stamm (SF 2) oder die heterologen Stämme (BRU oder Zr6) entwickelten.

Tabelle 4 ELISA- und neutralisierende Antikörper-Titer von mit env 2-3 in MTP-PE-LO-Adjuvans immunisierten Schweinen"

Nummer	Imunisie-	env2-3	Neutralisier-Titer bei:	HIV-BRU	HIV-Zr 6
des	rungs-	ELISA-	HIV-SF 2	<20	<20
Tieres Antigen	nummer	Titer	<20d	<20	<20
1371 env2-3	Vorprobe	«50b	<20	<20	<20
	2	<50c	<20	<20	<20
	3	70	<20	<20	<20
	4	70	<20	<20	<20
	5	80	<20	<20	<20
	6	70	<20	<20	<20
	7	140	<20	<20	<20
1372 env 2-3	Vorprobe	«50	<20	<20	<20
	2	100	<20	<20	<20
	3	70	<20	<20	<20
	4	70	<20	<20	<20
	5	60	<20	<20	<20
	6	90	<20	<20	<20
	7	90	<20	<20	<20
1373 Adjuvans-	Vorprobe	«50	<20	<20	<20
Kontrolle	2	«50	<20	<20	<20
	3	«50	<20	<20	<20
	4	«50	<20	<20	<20
	5	«50	<20	<20	<20
	6	«50	<20	<20	<20
	7	«50	<20	<20	<20
1374 Adjuvans-	Vorprobe	«50	<20	<20	<20
Kontrolle	2	«50	<20	<20	<20
	3	«50	<20	<20	<20
	4	«50	<20	<20	<20
	5	«50	<20	<20	<20
	6	«50	<20		lOTage nach jederlmmunisierung
	7	«50	a. Die Schweine erhielten alle 21 Tage intramuskulär 1 mg env 2-3 in Biocin-Adjuvans (100 pg MTP-PE).
	wurden Seren entnommen.
	d. Keine Neutralisierung bei Serum-Verdünnung V20, der höchsten getesteten Konzentration, gesehen.
b. Lag bei Serum-Verdünnung V50 kein Signal vor, wurden Titer «50 angegeben.
с Kleines, aber nachweisbares Signal bei Serum-Verdünnung Vso.

e. Affen

Rhesussaffen wurden alle 20 Tage mit 250pg env 2-3 plus MTP-PE-LO (100 pg MTP-PE) immunisiert. Kontrolltiere erhielten die Adjuvans-Formulierung allein. Eine Woche nach jeder Immunisierung wurden den Tieren Blutproben entnommen und mit ELISA Anti-env-2-3-Antikörpertiter ermittelt. Tabelle 5 zeigt, daß, ähnlich wie bei den Hunden, alle Tiere Antikörpertiter zu env 2—3 entwickelten, aber diese Titer nur im Bereich 300-3100 lagen, d. h. wesentlich niedriger als vorher bei den Meerschweinchen beobachtet wurden.

Tabelle 5

Titer von env 2—3 spezifischen Antikörpern in Seren von Rhesus Macaques, immunisiert mit env 2—3 in MTP-PE-LO Adjuvans^a

Tierisches	Nummer	Vorprobe	1	Immunisierung	2	3	4	5	6
Antigen	1189	«100	«100	300	700	400	400	300
Env 2-3	«100	«100	1200	800	800	900	500
1190	«100	«100	500	2000	1300	1900	3100
1191	«100	«100	1100	900	400	400	500
1192	«100	«100	780	1100	700	900	1100
(Mittelwert)
Adjuvans-	1197	«100	«100	«100	«100	«100	«100	«100
Kontrolle	«100	«100	«100	«100	«100	«100	«100
1198	«100	«100	«100	«100	«100	«100	«100
1199	«100	«100	«100	«100	«100	«100	«100
1978	«100	«100	«100	«100	«100	«100	«100
(Mittelwert)

a. Die Tiere erhielten intramuskulär alle 30 Tage 250pg des Antigens in einem Biocin-Adjuvans (lOOpg MTP-PE). Die Seren wurden eine Woche nach jeder Immunisierung entnommen.

2. HSVgD a. Ziegen

Eine Reihe von Adjuvans-Formulierungen wurden mit gD 2 in Ziegen getestet. Die Tiere wurden alle 21 Tage mit 100 цд gD2 und den verschiedenen Adjuvantien immunisiert. Den Tieren wurden 10 Tage nach der zweiten und dritten Immunisierung Blut entnommen und mit ELISA wurden die anti-gD2-Titer bestimmt. Es wurden die folgenden Adjuvans-Formulierungen verwendet: CFA (1°) gefolgt von IFA (2°& 3°), wobei IFA100цд MTP-PE enthielt, 0,8mg/ml Aluminiumhydroxid (Alum), MTP-PE-LO (100цд MTP-PE), MTP-PE-LO-KE (ЮОцд MTP-PE) und MTP-PE-LO-KE (12% Squalen, 5,0mg MTP-PE). Die ELISA-Ergebnisse gibt Tabelle 6 wieder. Ein CFA/IFA-Tier, beide MTP-PE/IFA-Tiere und ein MTP-PE-LO-KE (5mg MTP-PE)-Tier entwickelten hohe Antikörpertiter (2187-13172). Ein CFA/IFA-Tier, beide Alum-Tiere und ein MTP-PE-LO-KE (5 mg MTP-PE)-Tier entwickelten mäßige Antikörpertiter (569-1489). Die MTP-PE-LO-Tiere und die MTP-PE-LO-KE-Tiere entwickelten niedrige anti-gD2-Titer (46-323). Daher löste die MTP-PE-LO-Formulierung, wie bereits bei env2 bemerkt, in Ziegen keine hohen Antikörpertiter aus. Abwandeln der Emulsion durch Verwendung des Kirkland-Emulgierers (Öltröpfchengröße 1-2 nm) verbesserte die Adjuvans-Wirksamkeit nicht. Beträchtliche Steigerung des MTP-PE-Dosis (auf 5,0 mg) schienen die Adjuvans-Wirksamkeit zu verbessern.

Tabelle 6

Adjuvans-Wirksamkeit mitgD2 bei den Ziegen

	Tier	Adjuvans	ELISA-Titernach	3 Immuni
	3606	CF A/I FA	2lmmuni-	sierungen
Gruppe	3 609		sierungen	13172
1	3610	Alum	2187	770
	3611		738	781
2	3612	MTP-PE-LO	1489	522
		(ЮОцд MTP-PE)	921
3	3613			194
	3614	MTP-PE-LO-KE	77	323
		(100 μg MTP-PE)	145
4	3615			227
	3624	MTP-PE-LO-KE	123	46
		(12% Squalen,	56	569
5	3 625	5,0 mg MTP-PE)	142
			2 291
		615

b. Paviane

Junge Paviane wurden mit gD2,dasmit Alum, MTP-PE-LO-KE, MTP/IFA und IFAallein formuliert wurde, immunisiert. Zusätzlich wurdeeine Dosisbereich-Untersuchung für gD2, kombiniert mit Alum und MTP-PE-LO-KE, durchgeführt. 2-3 Jahre alte Paviane (3,4 bis 12kg) wurden intramuskulär dreimal in Intervallen von 3 Wochen über den Schenkel immunisiert. Die Seren wurden 3 Wochen nach den ersten zwei Immunisierungen und zwei Wochen nach der letzten Impfstoffdosis zur Bestimmung von gD-spezifischen Antikörpern mit ELISA entnommen. Für vollständige Blutzellenanalysen (CBS) wurde zu jedem dieser Zeitpunkte Vollblut entnommen. Paviane, die mit 10O μg an Alum gebundenes gD2 immunisiert wurden, entwickelten mittlere Anti-gD2-Antikörpertitervon 3349 ± 550. In den Titern für die 3 getesteten Antigendosen 10,25 und ЮОцд Protein gab es keine signifikanten Unterschiede. Die Antikörperreaktionen in 4 Tiergruppen, die 10 oder 100 цд gD2, emulgiert mit 250 цд MTP-PE-LO-KE, oder 25 цд gD2, emulgiert mit 50 цд oder 1OOOug MTP-PE-LO-KE, erhielten, ähnelten denen der Gruppen, die mit gD2/Alum (Mittelwert im Bereich 1300 bis 3900) immunisiert oder mit 25ug gD2 und 250 цд MTP-PE-LO-KE geimpft wurden. In diesem Versuch wurde mit IFA emulgiertes MTP-PE als positive Kontrollgruppe verwendet. Die mit Alum immunisierten Tiere besaßen Titer, die 1 % der Werte mit MTP/IFA-Impfstoffen betrugen, und die MTP-PE-LO-KE-immunisierten Tiere besaßen Titer im Bereich 0,5 bis 1,3 der von MTP/IFA. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefaßt.

Tabelle 7

HSV-Impfstoff-Versuch bei Pavianen: Antikörpertiter"

	Adjuvans	gD2	Dosis	Erste Blut	ELISA-Titer"	Dritte Blut	MTP-PE/IFAC
Gruppe	Zusammen	Dosis	(μ)	entnahme	Zweite Blut	entnahme	in%
	setzung (цд)	(μ)	10		entnahme
	Alum	400	25	287 (±123)		1566 (±350)	0,6
1	Alum	400	100	1 075 (±785)	1002 (±366)	1993 (±1156)	0,8
2	Alum	400	25	720(±184)	800 (±343)	3349 (±550)	1,3
3	MTP-PE/LO	50	10	140 (±63)	1882 (±489)	1320 (±430)	0,5
4	MTP-PE/LO	250	100	217(±103)	788 (±331)	3244 (±1582)	1,3
5	MTP-PE/LO	250	25	57 (±34)	2490 (±995)	2439(±510)	1,0
6	MTP-PE/LO	1000	25	91 (±70)	925 (±254)	3883 (±2 401)	1,6
7	MTP-PE/IFA	250	25	24101 (±5423)	1097 (±565)	250 382 (±64 771)	100
8	IFA			2591 (±2280)	62 775 (±28 634)	66132 (±75 095)	26,4
9			7631 (±6563)

a. Alle Tiere mit gO2 durch IM-Verabreichung in den Schenkel immunisiert, 4 Tiere/Gruppe.

b. 50% Endpunkt-Antikörpertiter, geometrisches Mittel ±SE (Standardabweichung).

с Anteil der Tiere mit einer positiven gD2-spezifischen, lymphoproliferativen Antwort, definiert als ein Anregungsindex >3,0.

Bei keinem der Tiere wurden Reaktionen gegen die Impfstoffe bemerkt; CBC-Profile waren normal.

Beispiel 3

MT-PE-LO-Formulierung, wirksam bei der Stimulierung der Immunität bei großen Tieren.

Wie im Beispiel 2 gezeigt, ergaben MTP-PE-LO-Formulierungen, die mit Spritze und Nadel (Tröpfchengröße ca. 10 mikron) und dem Kirkland-Emulgierer (Tröpfchengröße 1-2 mikron) hergestellt wurden, keine gute Immunostimulierung für Impfstoff-Antigene in großen Tieren und Menschen (Daten für Menschen nicht gezeigt). Der Mikrofluidierer Modell 110Y wurde zur Erzeugung stabiler Emulsionen mit kleiner Tröpfchengröße verwendet.

Diese Maschine ist ein Hochdruck (34,5-207 mPa [5000-30000 PSI])-Emulgierer vom Tauchdüsen-Typ. Es wurde eine Reihe von Emulsionen hergestellt, die abhängig von den Squalen-, Tween 80- und MTP-PE-Konzentrationen und den physikalischen Parametern Temperatur und Arbeitsdruck in Größe und Stabilität variierten. Tabelle 8 zeigt Beispiele für verschiedene Emulsionen, die mit dem Mikrofluidierer hergestellt wurden. Durch Ändern der physikalischen Parameter der Emulsionszusammensetzung können Öltröpfchengrößen von 1 mikron bis weniger als 0,2 mikron erreicht werden. Wie in Tabelle 8 gezeigt, wird die Tröpfchengröße der Emulsion durch die Parameter der gesteigerten Detergensmenge, des gesteigerten Verhältnisses von MTP-PE zu Squalen, des gesteigerten Arbeitsdrucks und der gesteigerten Arbeitstemperatur verringert. Diese Emulsionen mit kleiner Tröpfchengröße wurden dann als Adjuvantien für Impfstoff-Antigene bei Ziegen und Pavianen getestet.

Tabelle 8 Zusammensetzung und physikalische Parameter von MTP-PE-Squalen-Emulsionen, hergestellt mit dem Microfluidierer.

Formu	MTP-PE	Squalen	Tween 80	,16	Mannit	Wäßrige	Temp.	Druck	Größe
lierung	(mg/ml)	%	%	,016	%	Phase	(0C)	(KPSI)	(M)
A	,01	2	,004	0	0	H2O	40	5	,23
B	0,2	2	,004	0	H2O	40	5	,17
C	1,0	2	0,16	5	H2O	0	10	,19
D	0,5	2	0	5	H2O	40	10	,16
E	0,5	2	0	0	H2O	40	10	,17
F	1,0	4	0	0	H2O	30	10	,19
G	1,0	4	0	0	H2O	20	10	,20
H	1,0	4	0	0	H2O	0	15	,20
I	1,0	4	0	0	H2O	0	10	,29
J	1,0	4	0	0	H2O	0	5	,39
K	1,0	4	0	H2O	0	10	,22
L	1,0	4	0	H2O	0	10	,27
M	1,0	6	0	H2O	0	10	,29

1.HSVgD2 bei Ziegen

Der erste mit dem gD2-Antigen verwendete Mikrofluidierer war eine Emulsion mit 4% Squalen und 100цд/тІ MTP-PE ohne Tween 80 (MTP-PE-LO-MF* 13; Nummembezeichnung der MTP-PE-LO-MF-Formulierungen sind willkürlich und sind nur zur Verwendung als Bezugsnummern gedacht). Dieses Material wurde bei geringem Druck in dem Mikrofluidierer hergestellt und besaß eine Oltröpfchengröße von ungefähr 0,8 mikron. Die Ziegen wurden dreimal in Abständen von 21 Tagen intramuskulär mit 100pg gD2 in dieser Formulierung immunisiert. Ziegen, die in CFA für erste und IFA für zweite und dritte Immunisierungen mit 100мд gD2 immunisiert wurden, dienten als Kontrolle. 10 Tage nach der zweiten und dritten Immunisierung wurden den Tieren Blutproben entnommen und mit ELISA anti-gD2-Antikörpertiter bestimmt. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 9. Beide Tiere, die die MTP-PE-LO-MF erhielten, zeigten bedeutende anti-gD 2-Titer. Diese Titer 1661-2 966 lagen zwischen den Titern der zwei CFA/IFA-Kontrollziegen (140-24269). Die MTP-PE-LO-MF-Tierezeigten Titer, die bedeutend höher als bei Ziegen, die in Spritze und Nadel oder in dem Kirkland-Emulgierer (sieheTabelle 6) hergestellte MTP-PE-LO-Formulierungen enthielten, waren. In einem zweiten Versuch bei Ziegen wurden alle 21 Tage ЮОцд gD2 mit MTP-PE-LO-MF ♦ 16 verabreicht. Diese Formulierung enthielt 4% Squalen, 500цд/тІ MTP-PE und kein Tween 80. Die Oltröpfchengröße dieser Emulsion betrug 0,5-0,6 mikron. Wie man aus Tabelle 10 ersieht, scheint diese Formulierung sogar höhere Antikörpertiter als die vorherige Formulierung zu ergeben. Daher verbessert die Verringerung der Oltröpfchengröße und/oder die Steigerung der MTP-PE-Menge die Adjuvans-Wirksamkeit dieser Emulsion.

Tabelle 9	Nummer des	Adjuvans	Antigen	ELISA-Titernach:	3 Immuni
	Tieres	CFA/IFA	gD2	2 Immuni	sierungen
	4519	CFA/IFA	gD2	sierungen	24269
Gruppe	4520	MTP-PE-	gD2	9868	980
1	4 598	LO-MF3	(100 μ	140	2 207
		MTP-PE-	gD2	2966
2	4 599	LO-MF"	dOOua)		N.T."
				1661

a. 4% Squalen, 100pg MTP-PE, 0 Tween 80, H₂O, ungefähre Öltröpfchengröße 0,8 Mikron.

b. N. T. — Nicht getestet. Tiere starben aus Gründen, die nicht mit der Immunisierung zusammenhängen.

Tabelle 10 Test von MTP-PE-LO-MF # 16 als ein Adjuvans für gD2 in Ziegen

	Adjuvans	Antigen	ELISATiter nach:	3 Immuni
Nummer des	MTP-PE-LO-MF	дО2(100цд)	2 Immuni	sierungen
Tieres	#16		sierungen	386
5013	MTP-PE-LO-MF	дО2(100цд)	1299
	#16			2 806
5014	MTP-PE-LO-MF	gD2(100Mg)	6657
	#16			1943
5015	MTP-PE-LO-MF	9Ο2(100μ9)	8 206
	#16			1514
5016		7 886

a. MTP-PE-LO-MF # 16-4% Squalen, 500ид/тІ MTP-PE, 0 Tween 80, H₂O. Oltröpfchengröße von 0,5-0,6 Mikron.

2.HIV env 2-3 und gP120 bei Ziegen.

Es wurden Mikrofluidierer-Zubereitungen mit CFA/IFAund MTP-PE-LO-KE als Adjuvantien unter Verwendung des HIV-Antigens env2-3 und gp 120 verglichen. DieTiere wurden dreimal in Abständen von 21 Tagen mit 100 цд des gp120-Antigens in GFA(1°)/ IFA(2° & 3°), MTP-PE-LO-MF # 14 (4% Squalen, 500pml MTP-PE, kein Tween, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) MTP-PE-LO-KE (4% Squalen, 100 цд MTP-PE, 0,008% Tween 80, phosphatgepufferte Kochsalzlösung emulgiert in dem Kirkland-Emulgierer) und MTP-PE-LO-MF* 15 (4% Squalen, 100цд MTP-PE, 0,008%Tween 80, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) immunisiert. Die Tiere wurden auch mit 100 цд des HIV-Antigens env 2-3 in CFA/IFA und in MTP-PE-LO-MF #14 immunisiert. Den Tieren wurden 10 Tage nach der zweiten und dritten Immunisierung Blutproben entnommen und mit ELISA anti-env 2-3-Antikörpertiter ermittelt. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 11. Bei env 2-3 zeigten die mit den MTP-PE-LO-MF # 14-Formulierung immunisierten Tiere nach zwei Immunisierungen den CFA/IFA-Tieren äquivalente Titer und nach drei Immunisierungen höhere Titer als die CFA/IFA-Tiere. Mit gp 120 waren die Ergebnisse nicht ganz so klar. Die MTP-PE-LO-MF # 14-Tiere zeigten wesentlich mehr Schwenkungen als die CFA/IFA-Tiere. Daher sind die mittleren Titer der Mikrofluidierer-Gruppe niedriger als die der CFA-Gruppe, aber einzelne Tiere, die MTP-PE-LO-MF #14 erhielten, zeigten Titer, die so hoch wie bei jedem Tier der CFA/IFA-Gruppe waren. Ein direkter Vergleich für gp 120 zwischen gleichen Adjuvans-Komponenten (4% Squalen, 100 цд MTP-PE, 0,008%Tween 80, phosphatgepufferte Kochsalzlösung), die mit zwei verschiedenen Verfahren (Kirkland-Emulgierer gegen Mikrofluidierer) emulgiert wurden, veranschaulicht die Wichtigkeit kleiner Tröpfchengrößen in der Emulsion. Die Kirkland-Emulgierer-Gruppe zeigte ein mittleren Titer von 632 nach den Immunisierungen, während die Mikrofluidierer-Gruppe einen mittleren Titer von 3 277 zeigte.

Tabellen

Test von MTP-PE-LO-MF als ein Adjuvans mit den HIV-Antigens env 2 und gp 120

Nummer Gruppe des Tieres

Adjuvans

Antigen

ELISATiter nach:

2lmmuni- Geometrischer 3lmmuni- Geometrischer

sierungen Mittelwert sierungen Mittelwert

±SE ±SE

1 5018 CFA/IFA др120(100цд) 900 7300

5019 CFA/IFA др120(100цд) 3700 1861 ± 539 5700 6630 ± 996

5020 CFA/IFA др120(100цд) 2000 7100

5021 CFA/IFA др120(100цд) 1800 3400

2 5022 CFA/IFA епѵ2(100цд) 2400 3000

5023 CFA/IFA епѵ2(100цд) 4600 2235 ±680 3400 5074 ±1378

5024 CFA/IFA env 2(100 цд) 2400 8900

3 5026 MTP-PE-LO-MF* 14^s др120(100цд) 0 800

5026 MTP-PE-LO-MF* 14" др120(100цд) 300 101 ±1089 500 1324 ± 994

5029 MTP-PE-LO-MF* 14' gp 120(100 цд) 3407 5800

4 5030 MTP-PE-LO-MF* 14 епѵ2(100цд) 7900 19500

5031 MTP-PE-LO-MF* 14 епѵ2(100цд) 4600 2351 ±1688 6600 9896 ± 2493

5032 MTP-PE-LO-MF* 14 епѵ2(100цд) 300 6900

5033 MTP-PE-LO-MF* 14 епѵ2(100цд) 2800 10800

5 5034 MTP-PE-LO-KE" др120(100цд) 0 600

5035 MTP-PE-LO-KE" др120(100цд) 1400 721 ± 416 600 632 ± 32

5037 MTP-PE-LO-KE¹" др120(100цд) 400 700

6 5038 MTP-PE-LO-MF* 15^е др120(100цд) 1000 5100

5040 MTP-PE-LO-MF* 15^е др120(100цд) 0 10 ±333 2300 3277 ± 767

5041 MTP-PE-LO-MF* 15^е др120(100цд) 0 3000

a. MTP-PE-LO-MF #14-4% Squalen, SOOpg/ml MTP, 0Tween, phosphatgepufferte Kochsalzlösung.

b. MTP-PE-LO-KE - 4% Squalen, 100pg/ml MTP-PE, 0,0008% Tween 80, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, emulgiert in dem Kirkland-Emulgierer.

с MTP-PE-LO-MF* 15-4% Squalen, ЮОЮОцтІ MTP-PE, 0,008%Tween 80, phosphatgepufferte Kochsalzlösung.

3. HIV env 2-3 und gp 120 bei Pavianen.

MTP-PE-LO-MF # 1 (2% Squalen, 500цд/тІ MTP-PE, kein Tween 80, H₂O, Öltröpfchengröße ca. 0,17 mikron) wurde mit den HIV-Antigenen env 2-3 und gp 120 bei Pavianen als Adjuvans getestet. MTP-PE in IFA und Alum wurden als Kontrolle verwendet. Die Tiere wurden in Abständen von einem Monat immunisiert. 2 Wochen nach der zweiten Immunisierung wurden den Tieren Blutproben entnommen und es wurden anti-env 2-3-Antikörper-Virus neutralisierende Titer bestimmt. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 12. Antikörpertiter gegen gp 120 waren mit MTP-PE-LO-MF * 1 höher als mit MTP-PE-IFA. Die anti-env 2-3-Titer waren in MTP-PE-IFA- und MTP-PE-LO-MF * 1 -Gruppen ähnlich. Mit Alum erhaltene anti-gp 120-Titer lagen in demselben Bereich wie bei MTP-PE-LO-MF # 1, aber mit Alum erhaltene anti-env 2-3-Titer schienen größer als bei MTP-PE-Adjuvantien zu sein.

Tabelle 12

Test von MTP-PE-LO-MF # 1 als ein Adjuvans für die HIV-Proteine env2 und gp 120 in Pavianen

	Nummer	Adjuvans	Antigen	Virus	Titer zur Neutralisie
	des Tieres	MTP/IFA	др120(55цд)	EUSA-Titernach	rung von Antikörpern
Gruppe	2947	(350 цд MTP-PE)	дР120(55цд)	2 Immunisierungen	<10
1	2 948	(350 цд MTP-PE)	др120(55цд)	<100	<10
	2949	MTP-PE/IFA	епѵ2(25цд)	<100	<10
	2 550	(250цд MTP-PE)	епѵ2(25цд)	3000	<10
2	2451	(250 цд MTP-PE)	епѵ2(25цд)	400	30
	2 952	MTP-PE-LO-MF* 1е	др120(55цд)	34500	200
	2953	MTP-PE-LO-MF* 1'	др120(55цд)	142300	200
3	2954	MTP-PE-LO-MF* 1*	др120(55цд)	51000	35
	2595	MTP-PE-LO-MF* 1'	епѵ2(25цд)	43000	50
	2 956	MTP-PE-LO-MF* 1	епѵ2(25цд)	800	<10
4	2957	MTP-PE-LO-MF* 1	епѵ2(25цд)	600	35
	2 958	Alum"	др120(55цд)	14400	>250
	2964	Alum"	др120(55цд)	87400	150
5	2965	Alum	епѵ2(25цд)	56600	<10
	2 966	Alum	env2(25ug)	100	80
6	2967		4900	<10
			700

a. MTP-PE-LO-MF * 1 -2% Squalen, 500цд/тІ MTP-PE,OTween 80, H₂O.Öltröpfchengröße ca. 0,17 Mikron.

b. Alum-Antigen gebunden an 0,8mg/ml Aluminiumhydroxid.

Beispiel 5

Zusätzliche Adjuvans/Antigen-Formulierungen

Zusätzlich zu den oben dargestellten ausführlichen Beispielen wurde in Impfstoff-Formulierungen eine Anzahl anderer Antigene hergestellt, die Adjuvans-Zusammensetzungen der Erfindung enthielten. Diese umfassen sowohl Antigene von Pathogenen, die für Grippe und Malaria verantwortlich sind, als auch andere mit HIV und HSV assoziierte Antigene als die in den vorherigen Beispielen beschriebenen. Antigene des Cytomegalie-Virus (CMV) und des Hepatitis-C-Virus (HCV) werden ebenfalls beschrieben, da diese Antigene in den gleichen Adjuvans-Formulierungen, die für die anderen genannten Antigene beschrieben wurden, verwendet werden können.

Antigene

Für die Verwendung bei der Impfstoffherstellung geeignete Grippeantigene sind im Handel erhältlich. In den folgenden Beispielen verwendete Antigene sind Fluogen®, hergestellt von Parke-Davis; Duphar, hergestellt von Duphar B.V.; und der Grippeimpfstoff Charge A41, hergestellt von dem Instituto Vaccinogeno Pozzi.

Für die Verwendung bei der Impfstoffherstellung geeignete Malariaantigene sind in der US-Patentanmeldung Nr. 336288, eingereicht am 11.April 1989, und in der US-PS 4826957, herausgegeben am 2.Mai 1989, beschrieben.

Für die Verwendung bei der Impfstoffherstellung geeignete zusätzliche HIV-Antigene sind in der US-Patentanmeldung Nr.

490858, eingereicht am 9. März 1990, beschrieben. Siehe auch die EP-A181150 (14. Mai 1986) für zusätzliche HIV-Antigene. Für die Verwendung bei der Impfstoffherstellung geeignete zusätzliche HSV-Antigene sind in PCT WO 85/04587, herausgegeben am

24. Oktober 1985, und in PCTWO 88/02634, herausgegeben am 21 .April 1988, beschrieben. Gemische von gB- und gD-Antigenen, die gestutzte Oberflächenantigene, denen die Ankerregionen fehlen, darstellen, sind besonders bevorzugt.

Für die Verwendung bei der Impfstoffherstellung geeignete Cytomegalie-Virus-Antigene sind in US-PS4689225, herausgegeben am 25. August 1987, und in PCT/US89/00323, herausgegeben am 10. August 1989 unter der internationalen Veröffentlichungsnummer WO 89/07143, beschrieben. Siehe auch US-Patentanmeldung Nr. 367363, eingereicht am 16. Juni

Für die Verwendung bei der Impfstoffherstellung geeignete Hepatitis-C-Antigene sind in PCT/US 88/04125, in der veröffentlichten EP-A 318216 (31 .Mai 1989), in der veröffentlichten JP-A 1-500565 (eingereicht 18. November 1988) und in der CA-Patentanmeldung Nr.0583561 beschrieben. Ein anderer Satz von HCV-Antigenen ist in EP-A 90302866.0, eingereicht am

16. März 1990, beschrieben. Siehe auch US-Patentanmeldung Nr.456637, eingereicht am 21. Dezember 1989, und PCT/US 90/

Es wird angemerkt, daß sowohl die veröffentlichten Fassungen der verschiedenen oben aufgeführten unveröffentlichten Anmeldungen als auch eine Liste der entsprechenden Anmeldungen in anderen Ländern von einem Indexdienst wie dem World Patent Index erhalten werden können.

Adjuvans-Formulierungen und Herstellungsverfahren

Die folgenden Zusammenfassungen beschreiben sowohl Adjuvans-Formulierungen und wie sie hergestellt werden, als auch Impfstoff-Zusammensetzungen, die unter Verwendung der Adjuvantien und verschiedener antigener Substanzen hergestellt werden. In einigen Fällen werden Zusammenfassungen von Impfstudien vorgestellt, aber ohne die Ausführlichkeit der obigen Beispiele, weil die oben dargestellten Impfstudien bereits eine ausreichende Anleitung für die Verwendung der Impfstoff-Zusammensetzungen erbringen.

Grippe

In einer Reihe von Versuchen wurden Hamster mit einem handelsüblichen Grippeimpfstoff des Institute Vaccinogeno Pozzi immunisiert. Dieser Impfstoff enthält gereinigtes HA aus zwei Α-Stämmen (A/Leningrad/360/86 und A/Singapur/6/86) und einem B-Stamm (B/Ann Arbor/1 /86). Der Impfstoff wurde allein, mit einer mit einem Kirkland-Emulgierer (Fluoromed Pharmaceutical, Inc., La Mesa, CA) hergestellten MTP-PE/LO-Emulsion und mit einer in einem Mikrofluidierer (Modell 110Y, Microfluidics, Newton, MA) hergestellten MTP-PE/MF-Emulsion getestet. Die ersten zwei sind Vergleichszusammensetzungen, während die „MF"-Zusammensetzung eine Zusammensetzung der Erfindung darstellt. MTP-PE/MF steht für „ MTP-PE-Mikrofluidierer"-Emulsion undenthält4%Squalenund 1,0mg/ml MTP-PE, emulgiert mit dem Mikrofluidierer. Die MTP-PE-Kirkland-Emulsion enthält 4% Squalen, 0,5mg/ml MTP-PE und 0,008% Tween 80, emulgiert mit dem Kirkland-Emulgierer. Die Tiere erhielten drei Immunisierungen, die 8,3 μg von jedem HA-Antigen enthielten. MTP-PE wurde in beiden Formulierungen mit 50цд pro Dosis verwendet. Nach jeder Immunisierung wurden die ELISA-Titer gegen die immunisierenden Antigene und nach der zweiten Immunisierung die HAI-Titer bestimmt. Die EÜSA-Titer wurden durch beide getestete Adjuvans-Formulierungen wesentlich gesteigert.

In anderen Versuchen wurden Hamster entweder mit dem im Handel erhältlichen Parke-Davis-Fluogen-Impfstoff (HA A/ Shanghai/11 /87, A/Taiwan/1 /86 und B/Yamagata/16/88) oder mit dem im Handel erhältlichen Duphar-Grippeimpfstoff (HA A/Sechuan/ 2/87, A/Singapur/6/86 und B/Beijing/1/87), allein oder mit der MF69-Adjuvans-Formulierung (MF69 ist 5% Squalen, 0,2% Tween 80,0,8% Span 85 und 400цд/тІ MTP-PE, emulgiert in dem Mikrofluidierer) immunisiert. Es wurden gleiche Volumen des Impfstoffs mit MF69-Adjuvans vermischt. Die Tiere erhielten in Abständen von 3 Wochen drei Immunisierungen mit 11,25цд des Parke-Davis-Impfstoffs oder 7,5pg des Duphar-Impfstoffs. Tiere, die das MF69-Adjuvans erhielten, bekamen БОцд-Ооэеп MTP-PE. Die Tiere, die Duphar und MF69 erhielten, zeigten nach einer und zwei Immunisierungen wesentlich höhere Anti-HA-Titer als bei Duphar allein (mittlere Titer nach einer Immunisierung 80mal höher als bei dem Impfstoff allein und nach zwei Immunisierungen 170mal höher). Das MF69-Adjuvans zeigte eine gute Stimulierung einer Immunantwort auf den Parke-Davis-Impfstoff und erzeugte nach einer, zwei bzw. drei Immunisierungen mittlere Titer von 2951,14927 bzw. 12878. Dies stellt 82-, 29- bzw. 10mal höhere Titer als bei dem Impfstoff allein nach einer, zwei bzw. drei Immunisierungen dar. Bei beiden Impfstoffen wurden maximale Antikörpertiter mit MF69 nach zwei Immunisierungen beobachtet.

In weiteren Versuchen wurde bei Ziegen die Immunogenität zweier im Handel erhältlicher Impfstoffe, Parke-Davis-Fluogen und Duphar-Untereinheit-Grippe, ohne Adjuvans mit verschiedenen MTP-PE enthaltenden Adjuvans-Formulierungen verglichen. Die Tiere wurden intramuskulär mitO,5ml jedes Impfstoffs gemischt mit entwederO,5ml PBS oderO,5ml der MTP-PE-Adjuvans-Formulierungen immunisiert. Es wurden drei Adjuvans-Formulierungen verglichen: 200ид MTP-PE, gelöst in PBS und 200pg MTP-PE in zwei verschiedenen mikrofluidisierten Emulsionen, bezeichnet als Gaulin-1/4- und MF40/4-Emulsion. Gaulin-1/4 besteht aus 1,6 % Squalen und 400 мд/ті MTP-PE, emulgiert in dem Gaulin-Homogenisierer (APV Gaulin, Everett, MA). MTP-PE/ MF-40/4 besteht aus 1,6% Squalen, 400мд/тІ MTP-PE, 0,154% Tween 85 und 0,166% Span 85, emulgiert in dem Mikrofluidierer (Modell 110Y, Microfluidics, Newton, MA). Die Tiere erhielten 0,5 ml Impfstoff, der zum Erhalt eines Injektionsvolumens von 1,0ml entweder mit 0,5ml PBS oder 0,5ml der angegebenen Adjuvans-Formulierung vermischt wurde. Wie bei den Hamstern zeigten die Ziegen, die die Grippeimpfstoffe zusammen mit den Adjuvans-Emulsionen erhielten, viel höhere Antikörpertiter als diejenigen Ziegen, die den Impfstoff allein erhielten. Das ist zu einem frühen Zeitpunkt des Immunisierungsplans besonders ausgeprägt. Nach einer Immunisierung erzeugte die Gaulin-1/4-Emulsion mehr als ЗОтаІ höhere Anti-HA-Titer als der Parke-Davis-Impfstoff allein. Die MTP-PE/MF-40-Emulsion erzeugte Anti-HA-Titer, die mehr als 130mal höher als bei dem Parke-Davis-Impfstoff allein und mehr als 60mal höher als bei dem Duphar-Impfstoff allein waren. MTP-PE in PBS zeigte nach einer Immunisierung keine Stimulierung eines Antikörpertiters. Nach zwei Immunisierungen wurden mit den Emulsionen ähnliche Steigerungen der Antikörpertiter beobachtet. Die mit den Adjuvans-Emulsionen beobachtete frühe Stimulierung von Anti-HA-Titern ist besonders signifikant, weil Grippeimpfstoffe im allgemeinen Erwachsenen als Ein-Dosis-Impfstoffe und Kindern als Zwei-Dosis-Impfstoffe gegeben werden. So zeigten die MTP-PE-Emulsionen wie bei Hamstern große Steigerungen der Immunantwort auf Grippeimpfstoffe.

In einem anderen Versuch wurde der Duphar-Impfstoff allein verglichen mit dem Duphar-Impfstoff zusammen mit der Adjuvans-Formulierung MF69. Der Parke-Davis-Impfstoff wurde allein und mit MF101, MF69, MF-68 + MTP-PE sowie mit dem in dem Gaulen-Homogenisierer (Mikrofluidierer) hergestellten Ribi-Adjuvans-System verglichen. MF-101 besteht aus 1,6% Squalen und 400цд/ті MTP-PE, emulgiert in dem Mikrofluidierer. MF-68 besteht aus 5% Squalen, 0,8% Span 85 und 0,2% Tween 80, emulgiert in dem Mikrofluidierer. MF-68 + MTP-PE besteht aus MF-68, dem nach der Emulgierung 400 цд/ті MTP-PE zugegeben wurden. Ribi-MF enthält 2% Squalen, 0,4%Tween 20,250цд/тІ Monophosphoryllipid A, 250цд/тІ Trehalosedimycolat und 250 pg/ml Zellwand-Skelett (Ribilmmunochem, Hamilton, Montana), emulgiert in dem Gaulin-Homogenisierer. Alle Adjuvantien wurden in einer Dosis von 0,5ml pro Injektion mit den gleichen Volumina Impfstoff (Antigen) verwendet. MF69 steigerte den ELISA-Titer des Duphar-Impfstoffs wesentlich. Ebenso steigerten alle getesteten Adjuvantien die sowohl mit dem ELISA-Titer als auch mit dem Hämagglutinierungstiter gemessene Immunogenität des Parke-Davis-Impfstoffs wesentlich. In einem weiteren Versuch wurden MF69- und MF59-Formulierungen (die sich nur in dem Tween 80:Span 85-Verhältnis unterscheiden; siehe obige Beschreibungen) als Adjuvantien für den Parke-Davis-Grippeimpfstoff in Ziegen verglichen. Die Tiere wurden einmal mit der Hälfte einer menschlichen Impfstoffdosis (7,5 \ig jeder der drei HA-Bestandteile), kombiniert mit den Adjuvans-Formulierungen, immunisiert. MTP-PE wurde in den Formulierungen in einer Dosis von 100μg verwendet. Wie erwartet ergaben sich zwei Formulierungen sehr ähnliche Titer, wobei die MF59 einen mittleren Titer von 926 und die MF59 einen mittleren Titer von 821 zeigten,

Malaria

Es wurde eine Impfstudie, bei der MF59 (oben beschrieben) als Adjuvans verwendet wurde, begonnen. Es wurde ein Gemisch der im Handel erhältlichen Antigene der sporozoiten, merozoiten und erythrozytären Stadien der Krankheit verwendet: FaIc. 2.3-Zirkumsporozoit-Antigen, HP195-Merozoit-Antigen und SERA 1-Blutrot-Stadium-Antigen. Impfstoff-Zusammensetzungen werden wie oben beschrieben hergestellt, nämlich durch Vermischen gleicher Volumina des vorher hergestellten MF59-Adjuvans und der Antigen-Zusammensetzung.

Es wurde ein Immunisierungsversuch zum Vergleich der Herstellung neutralisierender Antikörper durch eine Anzahl verschiedener gp 120-Antigene durchgeführt. Einzelheiten der Herstellung der Antigene sind in der US-Patentanmeldung Nr. 490858, eingereicht am 9. März 1990, dargestellt. Ein Antigen war ein in Hefe hergestelltes gp120-Analogon (env 2-3), das denaturiert und nicht-glycosyliert ist. Ein anderes Antigen war glykosyliertes gp 120, das seine natürliche Konfiguration behielt. Beide gp120-Materialien wurden aus derselben Genquelle, HIV-i-SF-2-lsolat, erhalten. Es wurde die Antikörperproduktion bei Pavianen gemessen. Anfangsstudien, bei denen Öl enthaltende Adjuvantien mit Partikelgrößen größer als 1 Mikron verwendet wurden, ergaben Titer, die kleiner als die bei der Verwendung üblicher Alum-Adjuvantien erhaltenen waren. Dagegen ergaben spätere Studien mit Submikronpartikel-Adjuvantien Antikörpertiter, die mindestens 10mal höher als mit Alum waren. Die Ausgangs-Submikron-Zusammensetzung enthielt 2% Squalen und 0,5mg/ml MTP-PE in Wasser und wies Öltröpfchen mit einem mittleren Durchmesser von ungefähr 0,17 Mikron auf. Impfstoff-Zusammensetzungen für Paviane, bei denen MF59 (oben beschrieben) oder MF58 (MF59, bei dem aber MTP-PE exogen zugegeben wurde) als Adjuvans verwendet wurde, haben sich ebenfalls wirksamer als die verwendete Ausgangs-Submikron-Zusammensetzung bei der Stimulierung der Antikörperproduktion erwiesen. MF59 wurde in einer 1:2-Verdünnung mit einer Menge von 0,1 mg MTP-PE verwendet.

Herpes Simplex-Virus

Zusätzlich zu den oben beschriebenen gD2-Versuchen wurden Versuche durchgeführt, bei denen MF59 und verschiedene Mengen MTP-PE und Antigenen verwendet wurden. Befriedigende Antikörpertiter wurden bei Verwendung von 0,003 bis 0,250mg gD2 mit MF59-Adjuvans und 0,05mg MTP-PE für Meerschweinchen (intramuskuläre Verabreichung) und bei Verwendung von 0,01 bis 0,1 mg gD2 mit MF59 und 0,1 mg MTP-PE erhalten.

Cytomegalie-Virus

Impfstoff-Formulierungen können durch Vermischen von 0,001 bis 0,25mg CMV-Antigenen in 0,5ml physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5 ml MF59-Adjuvans, das 0,050 mg MTP-PE enthält, hergestellt werden. MF69, MF101 und andere Submikronpartikel-Adjuvantien können auf dieselbe Weise verwendet werden.

Heptatits-C-Virus

Impfstoff-Formulierungen können durch Vermischen von 0,001 bis 0,25mg HCV-Antigenen in 0,5ml physiologischer Kochsalzlösung mit 0,5ml MF59-Adjuvans, das 0,05mg MTP-PE enthält, hergestellt werden. MF69, MF101 und andere Submikronpartikel-Adjuvantien können auf dieselbe Weise verwendet werden.

Obwohl die vorliegende Erfindung zum Zweck der Klarheit des Verständnisses im Zuge der Veranschaulichung und mit Verwendungszwecken in einigen Einzelheiten beschrieben wurde, wird dem Durchschnittsfachmann im Licht der Lehre der Erfindung verständlich werden, daß daran geeignete Änderungen und Modifizierungen vorgenommen werden können, ohne den Inhalt oder den Umfang der beigefügten Ansprüche zu verlassen.

Claims (35)

1. Adjuvans-Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie

enthält, wobei das Öl und der Emulgator in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion mit Öltröpfchen, von denen im wesentlichen alle einen Durchmesser von <1 Mikron aufweisen, vorliegen und die Zusammensetzung kein Polyoxypropylen-Polyoxyethylen-Blockcopolymeres enthält.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Öl ein Öl tierischer Herkunft ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Öl ein ungesättigter Kohlenwasserstoff ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Öl ein Terpenoid ist.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Öl ein Öl pflanzlicher Herkunft ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung 0,5 bis 20VoI.-% des Öls in einem wäßrigen Medium umfaßt.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Emulgator ein nichtionisches Detergens umfaßt.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Emulgator einen Polyoxyethylensorbitanmono-, -di- oder -triester oder einen Sorbitanmono-, -di- oder -triester umfaßt.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung 0,01 bis 0,5Gew.-% des Emulgators umfaßt.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung zusätzlich ein getrenntes Immunostimulans umfaßt.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunostimulans Alum oder eine Bakterienzellwand-Komponente umfaßt.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung 0,0001 bis 1,0Gew.-% des Immunostimulans umfaßt.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunostimulans ein Muramylpeptid umfaßt.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Emulgator zusätzlich als ein Immunostimulans wirkt.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung 0,01 bis 0,5 Gew.-% des Immunostimulans umfaßt.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunostimulans ein lipophiles Muramylpeptid umfaßt.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid ein Muramyldipeptid oder ein Muramyltripeptid umfaßt.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid weiterhin ein Phospholipid umfaßt.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid ein Phosphoglycerid umfaßt.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid eine Verbindung mit der Formel

(D

wobei R Wasserstoff oder COCH₃;

R¹, R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen Lipidrest; R⁴ Wasserstoff oder eine Alkylgruppe;

X und Z unabhängig voneinander einen Aminoacyl-Rest, ausgewählt aus der von Alanyl, VaIyI, Leucyl, Isoleucyl, a-Aminobutyryl, Threonyl, Methionyl, Cysteinyl, Glutamyl, Isoglutamyl, Glutaminyl, Isoglutaminyl, Aspartyl, Phenylalanyl, Tyrosyl, Tryptophanyl, Lysyl, Ornithinyl, Arginyl, Histidyl, Asparginyl, Prolyl, Hydroxypropyl, Seryl und Glycyl gebildeten Gruppe; η O oder 1;

Y-NHCHR⁵Ch₂CH₂CO-, wobei R⁵ eine gegebenenfalls veresterte oder amidierte Carboxyl-Gruppe darstellt; und

L OH, NR⁶R⁷, wobei R⁶ und R⁷ unabhängig voneinander H oder eine niedere Alkyl-Gruppe darstellen, oder ein Lipidrest

bedeuten.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß R⁴ Methyl, X Alanyl und Y Isoglutaminyl bedeuten.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß η = 1, Z Alanyl, R Acetyl sowie R¹, R² und R³ Wasserstoffatome bedeuten.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß L einen Phospholipidrest umfaßt.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Phospholipidrest ein Diacylphosphoglycerid umfaßt.

25. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin^ti^-dipalmitoyl-sn-glycero-S-ihydroxyphosphoryloxy)]ethylamid ist.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gruppen R¹ und R² eine Acyl-Gruppe mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen darstellt.

27. Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Gruppen R¹, R² und R³ eine Acyl-Gruppe mit 14 bis 22 Kohlenstoffatomen darstellt.

28. Impfzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie

(1) eine immunostimulierende Menge einer Antigen-Substanz und

(2) eine immunostimulierende Menge des Adjuvans nach Anspruch 1 enthält.

29. Verfahren zur Stimulierung einer Immunreaktion in einem Wirtstier, gekennzeichnet durch eine Verabreichung eines Schutzantigens in Anwesenheit einer immunostimulierenden Menge von metabolisierbaren Submikron-Öltröpfchen in einer kontinuierlichen wäßrigen Phase.

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Öltröpfchen zusätzlich einen Emulgator enthalten.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Öltröpfchen zusätzlich ein Immunostimulans getrennt von dem Öl und dem Emulgator enthalten.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunostimulans Alum oder eine bakterielle Zellwandkomponente umfaßt.

33. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunostimulans ein Muramylpeptid umfaßt.

34. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Emulgator ebenfalls als Immunostimulans wirkt.

35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunostimulans ein lipophiles Muramylpeptid umfaßt.