JP6283674B2 - 外膜小胞 - Google Patents

Description

この出願は、２０１２年９月１８日に出願された米国仮出願第６１／７０２，２９６号および２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９９，３１１号（これら全ての完全な内容は、全ての目的のために参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

本発明は、グラム陰性菌由来の小胞に関する。小胞は、それらの内腔内に異種タンパク質を含む。小胞は、免疫原性組成物、例えばワクチンに特に有用である。

グラム陰性菌は、成長の間に、細胞エンベロープの膨圧によって外膜小胞（ＯＭＶ）を自然に放出し得る。そのようなＯＭＶの形成は、特定の細菌成分を破壊することによって容易にすることができ、例えば、参考文献１および２では、Ｅ．ｃｏｌｉのＴｏｌ−Ｐａｌ系を破壊して、成長の間に培養培地中に小胞を放出する株がもたらされた。ＯＭＶは、細菌全体を破壊することによっても生成することができる。公知のＯＭＶ生成方法としては、洗浄剤処理（例えば、デオキシコール酸を用いる）を用いる方法［３＆４］、洗浄剤を用いない方法［５］、または超音波処理［６］などが挙げられる。

ＯＭＶは、免疫原性の細胞表面結合抗原、ペリプラズム抗原および分泌抗原が豊富であり、例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂに対するワクチンとして使用されている［７］。小胞は抗原に対する強力な免疫応答を惹起するアジュバントとしての機能を果たす化合物を含有するので、この使用に特に適している。このように、小胞は、免疫系に対して、精製された抗原性タンパク質または他の細菌成分よりも天然の細菌に近い模倣物である。したがって、ＯＭＶは、ワクチンおよび他の免疫原性組成物の魅力的な標的のままである。いくつかのタンパク質抗原の免疫原特性は、ＣｌｙＡを融合パートナーとして使用することにより、ＯＭＶの表面上に多数の抗原が提示されるようにＯＭＶを操作することによって増大させることができることが示唆されている［８］。

異種タンパク質、特に異種抗原をＯＭＶにターゲティングするために、いくつかの試みが行われてきた。しかし、現在まで、異種タンパク質の小胞への輸送に伴う困難に主に起因して、親細菌に対して外来である抗原が依然としてＯＭＶには存在しないことが明白である［１１］。異種タンパク質をＯＭＶにターゲティングするための大多数の試みは、異種タンパク質と内在性膜タンパク質を共有結合によって連結することによるものである。そのような共有結合によって連結した異種タンパク質の例としては、ＦＬＡＧエピトープとＯｍｐＡ（外膜タンパク質Ａ）の全長配列との融合物、ＦＬＡＧエピトープとＰａｇＰ（ＰｈｏＰＱ活性化遺伝子Ｐ）の全長配列との融合物［９］、およびＧＦＰとＣｌｙＡ（細胞溶解素）との融合物が挙げられる［１０］。それらと膜タンパク質が共有結合で連結することにより、生じた融合タンパク質が外膜にターゲティングされ、したがってＯＭＶ内に含まれる。これらの方法には欠点があり、特に、形質転換された細菌の有害な影響を伴わずに大量の内在性膜タンパク質を過剰発現させることが難しい。

ペリプラズムタンパク質をＯＭＶにターゲティングすることも、難しいことが証明されている。ＧＦＰとＴａｔ（ツインアルギニン輸送体）シグナル配列との融合により、ペリプラズムにターゲティングされたＧＦＰの過剰発現がもたらされるが、ＧＦＰ蛍光はＯＭＶにおけるバックグラウンドの蛍光レベルをほとんど超えず［１１］、これにより、ＧＦＰがＯＭＶに組み込まれなかったか、またはＯＭＶにおけるフォールディングが正しくないことに起因して機能的でないことが示唆された。

国際公開第２００６／０４６１４３号 欧州特許第００１１２４３号明細書 国際公開第２００４／０１９９７７号 国際公開第２０１０／０１０９８３号

ＯＭＶにおいて異種タンパク質を発現させるために適した方法、特に、ＯＭＶにおいて抗原性タンパク質を発現させる方法を開発することが依然として必要である。特に、ワクチンにおいて使用するための代替または改善されたＯＭＶも依然として必要である。

本発明者らは、異種タンパク質をＯＭＶの内腔にターゲティングすることにより、異種タンパク質をＯＭＶの膜にターゲティングすることに伴う問題の多くが克服されることを発見した。驚いたことに、本発明者らは、内腔内に異種タンパク質を含有するＯＭＶは、哺乳動物に投与されると、そのタンパク質に対する免疫応答を惹起することができることも見出した。

したがって、本発明は、内腔内に遊離する少なくとも１種の異種タンパク質を含み、哺乳動物に投与されると、異種タンパク質に対する免疫応答を惹起することができるグラム陰性菌由来の外膜小胞（ＯＭＶ）を提供する。

本発明は、本発明のＯＭＶを調製する方法であって、グラム陰性菌のペリプラズムにおいて異種タンパク質を発現させるステップを含む方法も提供する。本発明は、さらに、この方法によって得られたまたは得ることができるＯＭＶを提供する。

本発明は、（ａ）本発明のＯＭＶと、（ｂ）薬学的に許容されるキャリアとを含む薬学的組成物も提供する。

本発明は、哺乳動物において免疫応答を生じさせる方法であって、哺乳動物にグラム陰性菌由来のＯＭＶを有効量で投与することを含み、ＯＭＶが内腔内に少なくとも１種の異種タンパク質を含み、免疫応答がＯＭＶ内の異種タンパク質に対するものである方法も提供する。本発明のこの態様の一部の実施形態では、タンパク質はＯＭＶの内腔内で遊離している。本発明は、哺乳動物において免疫応答を生じさせる方法であって、哺乳動物に本発明の薬学的組成物を投与することを含み、免疫応答がＯＭＶ内の異種タンパク質に対するものである方法も提供する。

ＯＭＶ
本発明は、内腔内に遊離する少なくとも１種の異種タンパク質を含み、哺乳動物に投与されると、異種タンパク質に対する免疫応答を惹起することができるグラム陰性菌由来の外膜小胞（ＯＭＶ）を提供する。

ＯＭＶは、当技術分野で周知であり、細菌によって培養培地中に自然に放出される。「天然のＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」［１２］）、微小胞（ＭＶ［１３］）、洗浄剤により抽出されたＯＭＶ（ＤＯＭＶ）、変異体由来ＯＭＶ（ｍ−ＯＭＶ）、およびＭＶとして放出されるまで細菌に付着したままの外膜の突出であるブレブ（ｂｌｅｂ）（［１４］；［１５］）は全て、本発明の一部を成し、本明細書では集合的にＯＭＶと称される。

本発明のＯＭＶは、任意の適切なグラム陰性菌から得ることができる。グラム陰性菌は、典型的にはＥ．ｃｏｌｉである。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉの代わりに、別のグラム陰性菌であってもよい。本発明において使用するために好ましいグラム陰性菌としては、ヒトにおいて病原性ではない細菌が挙げられる。例えば、細菌はヒトにおいて片利共生的（ｃｏｍｍｅｎｓａｌｉｓｔｉｃ）であってよい。しかし、一部の実施形態では、典型的にはヒト宿主には全くは見出されない細菌が使用される。本発明において使用するための例示的な種としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｂｒｉｏなどの属のいずれかの種が挙げられる。特に、細菌は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓ．ｂｏｙｄｉｉまたはＳ．ｓｏｎｎｅｉなど）であってよい。あるいは、細菌は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、特に、非病原性種、例えば、Ｎ．ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎ．ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎ．ｅｌｏｎｇａｔａ、Ｎ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎ．ｍａｃａｃａｅ、Ｎ．ｍｕｃｏｓａ、Ｎ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ、Ｎ．ｓｉｃｃａまたはＮ．ｓｕｂｆｌａｖａなど、特にＮ．ｌａｃｔａｍｉｃａであってよい。あるいは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの病原性種、例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを使用することができる。他の例では、細菌は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｏｖｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（分類不可能な株を含む）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ（血清型ｔｙｐｈｉおよびｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびに血清型ｐａｒａｔｙｐｈｉおよびｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを含む）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａなどであってよい。光合成グラム陰性菌も使用することができる。典型的には、細菌はコンピテント株である。この特徴により、細菌の遺伝子改変が容易になる。

特定の実施形態では、グラム陰性菌は、その細菌の「過剰ブレブ形成（ｈｙｐｅｒｂｌｅｂｂｉｎｇ）」株である。ブレブをより容易により高い収率で作製することができ、またブレブの性質をより均一にすることができる過剰ブレブ形成グラム陰性菌がＷＯ０２／０６２３７８に記載されている。例えば、ブレブは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＭｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓからなる群より選択される細菌から得ることができる。

特定の実施形態では、細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｍｐＡ変異体および／またはＥ．ｃｏｌｉ ｔｏｌＲ変異体である。一部の実施形態では、細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｏｍｐＡΔｔｏｌＲ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｔｏｌＲ、Ｅ．ｃｏｌｉ ΔｎｌｐＩ、またはＥ．ｃｏｌｉ ΔｄｅｇＰから選択される。Δ符号は、本明細書では、Δ符号の後に記載されている遺伝子のコード配列が欠失している細菌株を指すために使用される。したがって、「ΔｏｍｐＡ」である細菌株は、ｏｍｐＡ遺伝子のコード配列を含まない。同様に、「ΔｔｏｌＲ」である細菌株は、ｔｏｌＲ遺伝子のコード配列を含まない。コード配列全体が欠失していてよい。しかし、その代わりに、コード配列は部分的に欠失していてよい。例えば、Ｎ末端の半分またはＣ末端の半分が欠失していてよい。あるいは、１または複数の置換および／または挿入が導入されることによってｏｍｐＡ遺伝子および／またはｔｏｌＲ遺伝子が変異していてよい。

Ｅ．ｃｏｌｉ ΔｔｏｌＲ変異体株およびＥ．ｃｏｌｉ ΔｏｍｐＡ変異体株は、野生型Ｅ．ｃｏｌｉと比較してＯＭＶを過剰産生する。したがって、ｏｍｐＡ遺伝子および／またはＴｏｌ−Ｐａｌ複合体の１もしくは複数の成分の変異により、野生型ｏｍｐＡ遺伝子および／またはＴｏｌ−Ｐａｌ複合体を有するそのそれぞれの野生型株と比較して増加した数のＯＭＶを産生する変異体細菌がもたらされる。ＯｍｐＡは内在性膜タンパク質であり、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて最も豊富な外膜タンパク質である。したがって、ＯｍｐＡタンパク質を欠くＥ．ｃｏｌｉが生存可能であることは驚くべきことである。実際に、Ｍｕｒａｋａｍｉら［１６］によると、Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｍｐＡの単一変異体は小胞の放出を促進することができない。

異種タンパク質
本発明の異種タンパク質をグラム陰性菌のペリプラズムにターゲティングし、そこで発現させ、したがって、異種タンパク質がＯＭＶの内腔内に存在する。一部の実施形態では、異種タンパク質はＯＭＶの内腔内で遊離している。

タンパク質は、任意の長さのアミノ酸のポリマーであってよい。アミノ酸のポリマーは、線状または分岐状であってよく、アミノ酸のポリマーは、修飾されたアミノ酸を含んでよく、また、アミノ酸のポリマーは、非アミノ酸が割り込んでいてもよい。この用語は、天然で修飾された、または介入；例えば、ジスルフィド結合の形成、追加的なグリコシル化、部分的または完全な脱グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または標識化成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは改変により修飾されたアミノ酸のポリマーも包含する。この定義には、例えば、アミノ酸の１または複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含めた）、ならびに当技術分野で公知の他の修飾を含有するタンパク質も含まれる。タンパク質は、単鎖または会合した鎖として生じ得る。タンパク質は、本発明に関しては、天然でまたは非天然でグリコシル化され得る（すなわち、ポリペプチドが、対応する天然に存在するポリペプチドに見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）。

本明細書で使用される場合、「異種性の」という用語は、タンパク質が、ＯＭＶを得る細菌の種とは異なる種（異種生物体）に由来することを意味する。典型的には、タンパク質は、ＯＭＶを得る細菌の属とは異なる病原体の属に由来する抗原である。

本発明の特定の実施形態では、異種タンパク質は、レシピエントにおいて免疫応答を惹起することができる免疫原性タンパク質である。特定の実施形態では、免疫原性タンパク質、したがって異種タンパク質は、抗原を含む、またはそれからなる。抗原は、原生生物、細菌、ウイルス、真菌、または、多細胞性病原体を含めた任意の他の病原体、または寄生生物に対する免疫応答（または、一部の実施形態では、アレルゲンに対する免疫応答；および他の実施形態では、腫瘍抗原に対する免疫応答）を惹起し得る。免疫応答は、抗体応答（通常ＩｇＧを含む）および／または細胞媒介性免疫応答を含んでよい。ポリペプチド抗原は、典型的には、対応する細菌、ウイルス、真菌または寄生生物（またはアレルゲンもしくは腫瘍）のポリペプチドを認識する免疫応答を惹起するが、一部の実施形態では、ポリペプチドは、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物の糖類を認識する免疫応答を惹起するミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）としての機能を果たし得る。抗原は、典型的には、表面ポリペプチド、例えば、アドヘシン、赤血球凝集素、エンベロープ糖タンパク質、スパイク糖タンパク質などである。

一部の実施形態では、抗原により、以下の細菌のうちの１つに対する免疫応答が惹起される：
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ：有用な抗原としては、これだけに限定されないが、アドヘシン、自己輸送体（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、毒素、鉄獲得タンパク質、Ｈ因子結合性タンパク質（ｆＨｂｐまたは７４１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａヘパリン結合性抗原（ＮＨＢＡまたは２８７）、ＮａｄＡ（または９６１）、９５３／９３６およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ血清群Ｂ ｂｐ（ｆＨｂｐ）などの膜タンパク質が挙げられる。３種の有用なポリペプチドの組み合わせが参考文献１７に開示されている。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用なポリペプチド抗原は、参考文献１８に開示されている。それらとしては、これだけに限定されないが、ＲｒｇＢ線毛サブユニット、ベータ−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ前駆体（ｓｐｒ００５７）、ｓｐｒ００９６、一般的なストレスタンパク質ＧＳＰ−７８１（ｓｐｒ２０２１、ＳＰ２２１６）、セリン／トレオニンキナーゼＳｔｋＰ（ＳＰ１７３２）、および肺炎球菌の表面アドヘシンＰｓａＡが挙げられる。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ：有用な抗原としては、これだけに限定されないが、参考文献１９および２０に開示されているポリペプチド、例えば、ＧＡＳ２５〜５７４、例えば、ＧＡＳ２５（配列番号４１、配列番号４２）、ＧＡＳ４０（配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０）、ＧＡＳ５７（配列番号３９、配列番号４０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４；配列番号７５）、８８、２３、９９、９７、２４、５、２０８、１９３、６７、６４、１０１、２０５、２６８、６８、１８９、１６５または２０１などが挙げられる。

Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ 。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：有用な百日咳抗原としては、これだけに限定されないが、無細胞または細胞全体の百日咳抗原、百日咳ホロ毒素またはトキソイド（ＰＴ）、線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、パータクチン、および凝集原２および３が挙げられる。

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：有用な抗原としては、これだけに限定されないが、参考文献２１に開示されているポリペプチド、例えば、溶血素、ｅｓｘＡ、ｅｓｘＢ、ｅｓｘＡＢ、フェリクロム結合性タンパク質（ｓｔａ００６）および／またはｓｔａ０１１リポタンパク質などが挙げられる。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ：典型的な抗原は破傷風トキソイドである。

Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ：典型的な抗原はジフテリアトキソイドである。

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ：有用な抗原としては、これだけに限定されないが、参考文献２２および２３に開示されているポリペプチドが挙げられる。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ 。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ：有用な抗原としては、これだけに限定されないが、参考文献１９に開示されているポリペプチド、例えば、６７、８０、１５２３、３、３２８または２１１などが挙げられる。

Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：有用な抗原としては、これだけに限定されないが、ＰｅｐＡ、ＬｃｒＥ、ＡｒｔＪ、ＤｎａＫ、ＣＴ３９８、ＯｍｐＨ様、Ｌ７／Ｌ１２、ＯｍｃＡ、ＡｔｏＳ、ＣＴ５４７、Ｅｎｏ、ＨｔｒＡおよびＭｕｒＧが挙げられる（例えば、参考文献２４に開示されている通り。ＬｃｒＥ［２５］およびＨｔｒＡ［２６］が２つの好ましい抗原である。

Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：有用な抗原としては、これだけに限定されないが、参考文献２７に開示されているポリペプチドが挙げられる。

Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ：有用な抗原としては、これだけに限定されないが、ＣａｇＡ、ＶａｃＡ、ＮＡＰ、および／またはウレアーゼが挙げられる［２８］。

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：有用な抗原としては、これだけに限定されないが、腸毒性大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ）、分散接着性大腸菌（ｄｉｆｆｕｓｅｌｙ ａｄｈｅｒｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ）（ＤＡＥＣ）、腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性大腸菌（ｅｘｔｒａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）および／または腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）に由来する抗原が挙げられる。ＥｘＰＥＣ株としては、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＵＰＥＣ）および髄膜炎／敗血症関連大腸菌（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ／ｓｅｐｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＭＮＥＣ）が挙げられる。有用なＵＰＥＣポリペプチド抗原は参考文献２９および３０に開示されている。有用なＭＮＥＣ抗原は参考文献３１に開示されている。いくつかのＥ．ｃｏｌｉ型の有用な抗原はＡｃｆＤである［３２］。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ 。

Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ：有用な抗原としては、これだけに限定されないが、参考文献３３および３４に開示されているものが挙げられる。

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、例えば、ＡＴＣＣ−３１４３２株、ＳＥ−３６０株およびＳＥ−１０株から得ることができるＩ型、ＩＩ型および／またはＩＩＩ型の莢膜多糖 。

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｓ 。

Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ 。

Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ 。

Ｂｒｕｃｅｌｌａ、例えば、Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂ．ｃａｎｉｓ、Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎｅｏｔｏｍａｅ、Ｂ．ｏｖｉｓ、Ｂ．ｓｕｉｓ、Ｂ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉａｅなど。

Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、例えば、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓなど。

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ 。

Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ 。

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ 。

Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ 。

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ 。

Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ 。

Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ 。

Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ 。

Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ 。

Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ 。

Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ 。

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ 。

Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ 。

Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ 。

Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ 。

Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ。

一部の実施形態では、抗原は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＮｅｉｓｓｅｒｉａまたはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ由来の抗原である。

一部の実施形態では、抗原により、以下のウイルスのうちの１つに対する免疫応答が惹起される：
オルソミクソウイルス：有用な抗原は、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスまたはＣ型インフルエンザウイルスに由来する抗原、例えば、赤血球凝集素、ノイラミニダーゼまたはマトリックスＭ２タンパク質などであってよい。抗原がＡ型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素である場合、それは、任意の亜型、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６に由来するものであってよい。

パラミクソウイルス科のウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、ニューモウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、ＲＳＶ）、ルブラウイルス（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス）、メタニューモウイルスおよびモルビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）に由来するものが挙げられる。

ポックスウイルス科：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、オルソポックスウイルスに由来するもの、例えば、これだけに限定されないが、大痘瘡および小痘瘡を含めた真正痘瘡などが挙げられる。

ピコルナウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、ピコルナウイルスに由来するもの、例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス（Ｈｅｐａｒｎａｖｉｒｕｓ）、カルジオウイルスおよびアフトウイルスなどが挙げられる。一実施形態では、エンテロウイルスは、ポリオウイルス、例えば、１型ポリオウイルス、２型ポリオウイルスおよび／または３型ポリオウイルスである。別の実施形態では、エンテロウイルスは、ＥＶ７１エンテロウイルスである。別の実施形態では、エンテロウイルスは、コクサッキーＡウイルスまたはコクサッキーＢウイルスである。

ブニヤウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、カリフォルニア脳炎ウイルスなどのオルソブニヤウイルス、リフトバレー熱ウイルスなどのフレボウイルス、またはクリミア−コンゴ出血熱ウイルスなどのナイロウイルスに由来するものが挙げられる。

ヘパルナウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、例えば、不活化ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、例えば、表面抗原および／もしくはコア抗原、またはＣ型肝炎ウイルスなどのヘパルナウイルスに由来するものが挙げられる。

フィロウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、フィロウイルス、例えば、エボラウイルス（ザイールエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、レストンエボラウイルスまたはスーダンエボラウイルスを含めた）またはマールブルグウイルスなどに由来するものが挙げられる。

トガウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、トガウイルス、例えば、ルビウイルス、アルファウイルス、またはアルテリウイルスなどに由来するものが挙げられる。これは、風疹ウイルスを含む。

フラビウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、フラビウイルス、例えばダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング（１型、２型、３型または４型）ウイルス、黄熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、ウエストナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルスなどに由来するものが挙げられる。

ペスチウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、ペスチウイルス、例えば、牛ウイルス性下痢（ＢＶＤＶ）、豚コレラ（ＣＳＦＶ）またはボーダー病（ＢＤＶ）などに由来するものが挙げられる。

ヘパドナウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、ヘパドナウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスなどに由来するものが挙げられる。組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含んでよい。

他の肝炎ウイルス：組成物は、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、またはＧ型肝炎ウイルスに由来する抗原を含んでよい。

ラブドウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、ラブドウイルス、例えば、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス）およびベシクロウイルス（ＶＳＶ）などに由来するものが挙げられる。狂犬病抗原の例は、凍結乾燥した不活化ウイルスである。

カリシウイルス科：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、例えば、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）、ならびにハワイウイルスおよびスノーマウンテンウイルスなどのノーウォーク様ウイルスなどに由来するものが挙げられる。

コロナウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、ＳＡＲＳコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、およびブタ伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来するものが挙げられる。コロナウイルス抗原は、スパイクポリペプチドであってよい。

レトロウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、オンコウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）またはスプーマウイルスに由来するもの、例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０またはｇｐ１６０が挙げられる。

レオウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、オルトレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、またはコルチウイルスに由来するものが挙げられる。

パルボウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、パルボウイルスＢ１９に由来するものが挙げられる。

ヘルペスウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、ヒトヘルペスウイルス、例えば、単に例として、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、１型ＨＳＶおよび２型ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、およびヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）などに由来するものが挙げられる。

パポーバウイルス：ウイルス抗原としては、これだけに限定されないが、パピローマウイルスおよびポリオーマウイルスに由来するものが挙げられる。（ヒト）パピローマウイルスは、血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３または６５のもの、例えば、血清型６、１１、１６および／または１８のうちの１または複数に由来するものであってよい。

アデノウイルス：ウイルス抗原としては、アデノウイルス血清型３６（Ａｄ−３６）に由来するものが挙げられる。

一部の実施形態では、抗原により、魚類に感染するウイルス、例えば、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ｓａｌｍｏｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死症ウイルス（ＩＰＮＶ）、ブチナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血器壊死症ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（タイセイヨウサケのピコルナ様ウイルスとしても公知である）、陸封型サケウイルス（ＬＳＶ）、タイセイヨウサケロタウイルス（ＡＳＲ）、マスイチゴ病ウイルス（ｔｒｏｕｔ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＴＳＤ）、ギンザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、またはウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）などに対する免疫応答が惹起される。

真菌の抗原は、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｕｄｏｕｉｎｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｄｉｓｔｏｒｔｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｎａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｇｎｉｎｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｑｕｉｎｃｋｅａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍの変種ａｌｂｕｍ、変種ｄｉｓｃｏｉｄｅｓ、変種ｏｃｈｒａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、および／もしくはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｆａｖｉｆｏｒｍｅを含めた皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅ）に由来するもの；または、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ ｃａｐｉｔａｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｅｎｏｌａｓｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｗｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｌａｖａｔｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ種、Ｓｅｐｔａｔａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｂｉｅｎｅｕｓｉに由来するもの；あまり一般的ではないものでは、Ｂｒａｃｈｉｏｌａ種、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種、Ｎｏｓｅｍａ種、Ｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ種、Ｔｒａｃｈｉｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ種、Ｖｉｔｔａｆｏｒｍａ種 Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍｎ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ、Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ種、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ種、Ｗａｎｇｉｅｌｌａ種、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ種、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ種、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ種、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ種、Ｍｕｃｏｒ種、Ａｂｓｉｄｉａ種、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ種、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ種、Ｓａｋｓｅｎａｅａ種、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ種、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ種、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種、Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ種、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ種、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ種、Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ種、およびＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種に由来するものであってよい。

一部の実施形態では、抗原により、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅまたはＰ．ｏｖａｌｅなどのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属の寄生生物に対する免疫応答が惹起される。したがって、本発明は、マラリアに対して免疫化するために使用することができる。一部の実施形態では、抗原により、Ｃａｌｉｇｉｄａｅ科、特に、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ属およびＣａｌｉｇｕｓ属の寄生生物、例えば、Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ ｓａｌｍｏｎｉｓまたはＣａｌｉｇｕｓ ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉなどの海シラミ（ｓｅａ ｌｉｃｅ）に対する免疫応答が惹起される。

一部の実施形態では、抗原により、花粉のアレルゲン（木、草本、雑草、およびイネ科植物の花粉のアレルゲン）；昆虫またはクモ類のアレルゲン（吸入性、唾液および毒液のアレルゲン、例えば、ダニのアレルゲン、ゴキブリおよびユスリカのアレルゲン、ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ毒液のアレルゲン）；動物の毛およびフケのアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウスなどのもの）；ならびに食物アレルゲン（例えば、グリアジン）に対する免疫応答が惹起される。木、イネ科植物および草本に由来する重要な花粉のアレルゲンは、これだけに限定されないが、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、クマシデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）およびオリーブ（Ｏｌｅａ）、ヒマラヤスギ（ＣｒｙｐｔｏｍｅｒｉａおよびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、スズカケノキ（Ｐｌａｔａｎｕｓ）を含めた、分類学的な目がＦａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓおよびｐｌａｔａｎａｃｅａｅであるもの、Ｌｏｌｉｕｍ属、Ｐｈｌｅｕｍ属、Ｐｏａ属、Ｃｙｎｏｄｏｎ属、Ｄａｃｔｙｌｉｓ属、Ｈｏｌｃｕｓ属、Ｐｈａｌａｒｉｓ属、Ｓｅｃａｌｅ属、およびＳｏｒｇｈｕｍ属のイネ科植物を含めたイネ目のもの、Ａｍｂｒｏｓｉａ属、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ属、およびＰａｒｉｅｔａｒｉａ属の草本を含めたＡｓｔｅｒａｌｅｓ目およびＵｒｔｉｃａｌｅｓ目のものである。他の重要な吸入性アレルゲンは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属およびＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ属のチリダニ、貯蔵庫ダニ、例えば、Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ属、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ属およびＴｙｒｏｐｈａｇｕｓ属に由来するもの、ゴキブリ、ユスリカおよびノミ、例えば、Ｂｌａｔｅｌｌａ属、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ属、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ属およびＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ属に由来するもの、ならびに哺乳動物、例えば、ネコ、イヌおよびウマなどに由来するもの、ミツバチ（Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、およびアリ（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）を含めた、分類学的な目がＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａであるものなどの刺咬昆虫に由来する毒液アレルゲンである。

一部の実施形態では、抗原は、（ａ）がん−精巣抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーのポリペプチド、例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、およびＭＡＧＥ−１２など（例えば、黒色腫、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、ＮＳＣＬＣ、乳房の腫瘍、胃腸腫瘍、および膀胱腫瘍に対処するために使用することができる；（ｂ）変異した抗原、例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍、例えば、結腸直腸がん、肺がん、頭頸部がんに関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵がんおよび結腸直腸がんに関連する）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関連する）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫に関連する）、カスパーゼ−８（例えば、頭頸部がんに関連する）、ＣＩＡ０２０５（例えば、膀胱がんに関連する）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、ベータカテニン（例えば、黒色腫に関連する）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関連する）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＫＩＡ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現抗原、例えば、Ｇａｌｅｃｔｉｎ４（例えば、結腸直腸がんに関連する）、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９（例えば、ホジキン病に関連する）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、ＷＴ１（例えば、種々の白血病に関連する）、炭酸脱水素酵素（例えば、腎がんに関連する）、アルドラーゼＡ（例えば、肺がんに関連する）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関連する）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳がん、結腸がん、肺がんおよび卵巣がんに関連する）、マンマグロビン、アルファ−フェトプロテイン（例えば、ヘパトーマに関連する）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸がんに関連する）、ガストリン（例えば、膵がんおよび胃がんに関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳がんおよび卵巣がんに関連する）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞癌に関連する）、ｐ５３（例えば、乳がん、結腸がんに関連する）、ならびにがん胎児性抗原（例えば、乳がん、肺がん、および胃腸管のがん、例えば、結腸直腸がんなどに関連する）；（ｄ）共通抗原、例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラニン形成細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２などの黒色腫−メラニン形成細胞分化抗原（例えば、黒色腫に関連する）；（ｅ）例えば、前立腺がんに関連する前立腺関連抗原、例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２など；（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫に関連する）などから選択される腫瘍抗原である。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原としては、これだけに限定されないが、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン−バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６およびＥ７を含めたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、Ｃ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス抗原、ＴＳＰ−１８０、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｍｎ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合性タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなどが挙げられる。

さらなる具体例では、異種タンパク質は、βラクタマーゼ（ＴＥＭ１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来のｆＨｂｐ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯの二重変異体（Ｓｌｏ−ｄｍ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞エンベロープセリンプロテアーゼＳｐｙＣｅｐ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｓｐｙ０２６９である。

異種タンパク質は、それが由来する異種生物体において発現された際、すなわち、その天然の環境に存在する際、可溶性タンパク質、表在性膜タンパク質または内在性膜タンパク質であってよい。例えば、異種タンパク質がグラム陰性菌に由来する場合、その異種タンパク質は、天然のグラム陰性菌の細胞質タンパク質、ペリプラズムタンパク質または膜結合タンパク質であってよい。しかし、ＯＭＶ内に存在する場合には、異種タンパク質はＯＭＶの内腔内に存在し、ＯＭＶの内腔内で遊離していることが好ましい。したがって、異種タンパク質は、野生型タンパク質と比較して、例えば、任意の膜アンカー（複数可）の欠失によって修飾されていてよい。

ＯＭＶの「内腔内」という用語は、膜に結合しているが表面に露出していないタンパク質とＯＭＶの内腔内で遊離しているタンパク質のどちらも包含する。本発明では、異種タンパク質は一般にＯＭＶの内腔内で遊離している。「内腔内で遊離している」とは、異種タンパク質がＯＭＶの膜と完全には結合していないことを意味する。膜との完全な結合とは、洗浄剤または他の無極性溶媒を使用してタンパク質を膜から解離させることが必要なタンパク質を記載するものである。膜との完全な結合のための膜アンカーについての総説は、参考文献３５に見出すことができる。ＯＭＶの内腔内で遊離しているタンパク質は、膜または内在性膜タンパク質と非共有結合性の相互作用によって結合していてもよく、ＯＭＶの膜と全く結合していなくてもよい。例えば、タンパク質は、例えば、脂質二重層および／または内在性タンパク質との疎水性相互作用、静電気性の相互作用、イオン性の相互作用および／または他の非共有結合性の相互作用によって膜と緩くまたは一時的に結合している。

異種タンパク質が膜に結合し露出しているのではなく、ＯＭＶの内腔内にあることの１つの利点は、それにより異種タンパク質がｉｎ ｖｉｖｏにおけるプロテアーゼ分解から保護されることである。この保護により、今度は、より効率的なＢ細胞の活性化がもたらされる。

特定の実施形態では、異種タンパク質は可溶性タンパク質である。「可溶性タンパク質」とは、タンパク質が脂質膜といかなる結合も形成しないことを意味する。可溶性タンパク質は、膜アンカー、例えば、ペプチド膜貫通ドメイン、他のペプチド膜アンカードメイン、または脂質などの非ペプチド膜アンカーなどを含有しない。

ＯＭＶは、哺乳動物に投与されると、異種タンパク質に対する免疫応答を惹起することができる。免疫応答は、細胞性免疫応答または体液性免疫応答であってよい。典型的には、免疫応答は抗体応答である。

一実施形態では、本発明のＯＭＶは、異種タンパク質が由来する病原体に対する免疫応答を惹起することができる。例えば、異種タンパク質により、異種タンパク質が由来する病原体の感染および／またはビルレンスを中和することができるＴ細胞免疫応答が惹起されることが好ましい。したがって、本発明において使用するために好ましい異種タンパク質は、目的の病原体による感染の際に細胞免疫系によって認識されるものである。目的の病原体に対する防御Ｔ細胞免疫応答を惹起する異種タンパク質がより好ましい。

一実施形態では、本発明のＯＭＶは、異種タンパク質が由来する病原体を認識する抗体を惹起することができる。例えば、異種タンパク質により、異種タンパク質が由来する病原体に結合し、好ましくはその感染および／またはビルレンスを中和することができる抗体が惹起されることが好ましい。したがって、本発明において使用するために好ましい異種タンパク質は、目的の病原体による感染の際に抗血清によって認識されるものである。目的の病原体に対する防御免疫応答を惹起する異種タンパク質がより好ましい。

一部の実施形態では、異種タンパク質は、ＯＭＶ内で提示される場合には免疫原性であるが、精製された形態で投与される場合には免疫原性ではない。

一実施形態では、本発明の異種タンパク質は、ＯＭＶの内腔内で、および／またはＯＭＶの内腔から放出された際に（例えば、ＯＭＶの洗浄剤媒介性破壊によって）機能的に活性である。機能活性は、異種タンパク質が正確にフォールディングされており、天然の状態にある同じタンパク質と同じ、または実質的に同じ三次構造および四次構造を有することの指標である。「機能的に活性な」とは、異種タンパク質が、同じタンパク質が天然の環境で（例えば、それが由来する生物体において）発現された際の少なくとも１つの生物活性の少なくとも５０％以上を保持することを意味する。例えば、異種タンパク質は、同じタンパク質が天然の環境で発現された際の少なくとも１つの生物活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれを超えて保持する場合に、機能的に活性であるとみなすことができる。

異種タンパク質が野生型タンパク質の断片、または野生型タンパク質のバリアントを含む、またはそれからなる実施形態では、断片またはバリアントは機能的に活性であり得る。「野生型タンパク質の断片」とは、異種タンパク質が、野生型タンパク質に由来する少なくとも７個の連続したアミノ酸を含む、またはそれからなることを意味する。一部の実施形態では、断片は、野生型タンパク質に由来する少なくとも７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個またはそれより多くのアミノ酸からなる。断片は、野生型タンパク質の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより多くからなってよい。

断片は、異種タンパク質の免疫原性断片であることが好ましい。「免疫原性断片」とは、断片が異種タンパク質と共通のエピトープを少なくとも１つ有することを意味する。「エピトープ」という用語は、いかなる種類のエピトープも包含し、Ｂ細胞エピトープとＴ細胞エピトープの両方、および線状エピトープと不連続なエピトープの両方を含む。一実施形態では、異種タンパク質に特異的に結合する抗体は、免疫原性断片にも特異的に結合する、すなわち、異種タンパク質およびその免疫原性断片は、どちらも抗体が結合するエピトープを含有する。「特異的に結合する」とは、抗体が、ＢＳＡに対するものよりも実質的に大きな親和性で本発明の異種タンパク質に結合することを意味する。親和性は、本発明の異種タンパク質に対して、ＢＳＡに対するものよりも少なくとも１００倍、１０^３倍、１０^４倍、１０^５倍、１０^６倍大きいなどであることが好ましい。

異種タンパク質内に存在するエピトープは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定および／または予測することができる。例えば、コンピュータイムノミクス（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｓ）用のウェブサーバであるＥｐｉＴｏｏｌＫｉｔなどのエピトープ予測ソフトウェア［３６］。このエピトープ予測ソフトウェアにより、ＭＨＣクラスＩ結合性エピトープとＭＨＣクラスＩＩ結合性エピトープの両方について潜在的なＴ細胞エピトープを予測するためのいくつかの方法がもたらされる。

Ｂ細胞エピトープの存在も、例えば、参考文献［３７、３８および３９］に記載の当技術分野で公知の任意の方法を使用して予測することができる。そこに記載されている方法を使用して、連続的な線状エピトープおよび／または不連続なエピトープの存在を予測することができる。

「野生型タンパク質のバリアント」とは、異種タンパク質が、全長のタンパク質、例えば、野生型タンパク質とアミノ酸の数が同じであるタンパク質、または野生型配列と比較してアミノ酸配列の１または複数の変化を含有する野生型タンパク質の断片を含む、またはそれからなることを意味する。バリアントは、野生型タンパク質に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより高い配列同一性を有してよい。一部の実施形態では、バリアントも同様に機能的に活性である。

異種タンパク質は融合パートナーと融合していてよい、すなわち、異種タンパク質は融合タンパク質の一部であってよい。融合タンパク質は、−Ｘ−Ｙ−または−Ｙ−Ｘ−の配列を含んでよく、ここで−Ｘ−は上で定義された異種タンパク質であり、−Ｙ−は追加的なポリペプチド配列である。特定の一実施形態では、−Ｙ−は、異種タンパク質の検出を補助するタンパク質タグ、例えば、６ｘＨＩＳ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＧＳＴ、ＧＦＰもしくは別の蛍光タンパク質など、および／または異種タンパク質の機能を補助するルシフェラーゼもしくは任意の適切なポリペプチドである。異種タンパク質が融合タンパク質の一部である場合、融合タンパク質全体をＯＭＶの内腔内にある。一部の実施形態では、融合タンパク質はＯＭＶの内腔内で遊離している。

本発明のＯＭＶは、その内腔内に少なくとも１種の異種タンパク質を含む。したがって、ＯＭＶは、少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種またはそれより多くの異種タンパク質をＯＭＶの内腔内に含み、好ましくはＯＭＶの内腔内で遊離している。本発明のＯＭＶは、その内腔内にある少なくとも１種の異種タンパク質に加えて、その膜に結合した少なくとも１種の異種タンパク質も含んでよい。例えば、本発明のＯＭＶは、その内腔内にある少なくとも１種の異種タンパク質およびその膜に結合した１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種またはそれより多くの異種タンパク質を含んでよい。

特定の実施形態では、異種タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯの二重変異体（Ｓｌｏ−ｄｍ）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質Ｓｐｙ０２６９を含む。さらなる特定の実施形態では、異種タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯの二重変異体（Ｓｌｏ−ｄｍ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞エンベロープセリンプロテアーゼＳｐｙＣＥＰ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質Ｓｐｙ０２６９を含む。

本発明のＯＭＶを調製する方法
本発明は、本発明のＯＭＶを調製する方法であって、グラム陰性菌のペリプラズムにおいて異種タンパク質を発現させるステップを含む方法も提供する。

特定の実施形態では、異種タンパク質を、ペリプラズムタンパク質のシグナル配列をコードする核酸に作動可能に連結した異種タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを使用してグラム陰性菌のペリプラズム内で発現させる。

異種タンパク質のターゲティングは、ペリプラズムおよび／またはＯＭＶに天然に見出されるタンパク質のシグナル配列と異種タンパク質を融合することによって実現することができる。内膜を通したペリプラズムへのタンパク質のトランスロケーションは、例えば、３つの経路：ＳｅｃＢ依存性（ＳＥＣ）、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）またはツインアルギニントランスロケーション（ｔｗｉｎ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）（ＴＡＴ）のうちの１つの方式によって達成することができる。これらの経路のいずれも使用することができる。

本発明において使用することができるペリプラズムシグナル配列の例は、ＯｍｐＡのシグナル配列である。しかし、Ｔａｔシグナル配列、およびＤｓｂＡシグナル配列を含めた、他の可能性のあるシグナル配列を使用することができる。ペリプラズムへの移出は、それぞれが異なる移出経路をターゲティングする一連のベクターを使用して最適化することができる。例えば、ＡＣＥＳシグナル配列発現ベクター［４０］を使用して、異種タンパク質のペリプラズムへのトランスロケーションを最適化することができる。

一部の実施形態では、異種タンパク質の天然のシグナル配列がペリプラズムタンパク質のシグナル配列で置き換えられている。他の実施形態では、異種タンパク質は、天然のシグナル配列が存在する場合それを置き換えずに、ペリプラズムタンパク質のシグナル配列と融合している。

本発明のこの態様の特定の実施形態は、異種タンパク質をコードする核酸に作動可能に連結したＯｍｐＡのシグナル配列をコードする核酸配列を含む発現ベクター、例えば、図１に示されているｐＥＴ−ＯｍｐＡプラスミドを使用することを含む。この実施形態では、ＯｍｐＡシグナル配列は、ヌクレオチド配列ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＣＧＣＡＧＧＣＣ（配列番号１）を有してよい。この実施形態では、プラスミドはｐＥＴ２１ｂ由来のプラスミドである。しかし、当技術分野で公知の任意の他の適切なプラスミド骨格も使用することができる。適切なプラスミド骨格としては、ｐＧＥＸ、ｐＵＣ１９、ｐＡＬＴＲ、ｐＥＴ、ｐＱＥ、ｐＬＥＸ、ｐＨＡＴまたはグラム陰性菌において複製することができる任意の他のプラスミドベクターが挙げられる。

異種タンパク質がそれらの内腔内に含まれ、好ましくはそれらの内腔内で遊離しているＯＭＶを産生させるために、ＯＭＶを産生することができる任意のグラム陰性菌、例えば、本明細書で言及されているグラム陰性菌を、上記の発現ベクターを用いて形質転換することができる。

ＯＭＶを調製するための方法は当技術分野で公知であり、任意の適切な方法を使用して、本発明のＯＭＶを生じさせることができる。これらの方法は、一般に、細菌の培養物から小胞を得るステップを伴う。ＯＭＶは、細菌の外膜を破壊して、または細菌の外膜からブレブ形成させて、そこから小胞を形成することによって得ることができる。ＯＭＶは、細菌から、例えば、参考文献４１に記載の通り「ΔＧＮＡ３３」髄膜炎菌由来のＯＭＶをサルコシル抽出することによって人工的に調製することもできる。「天然のＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」［４２］）、微小胞（ＭＶ［４３］）、洗浄剤により抽出されたＯＭＶ（ＤＯＭＶ）、変異体由来ＯＭＶ（ｍ−ＯＭＶ）、およびＭＶとして放出されるまで細菌に付着したままの外膜の突出であるブレブ（［４４］；［４５］）は全て、本発明の一部を成し、本明細書では集合的にＯＭＶと称される。

ＯＭＶ（ブレブ、ＭＶおよびＮＯＭＶを含めた）は、細菌の成長の間に自然に形成され、培養培地中に放出される、天然に存在する膜小胞を含む。本発明のＯＭＶは天然に存在するＯＭＶであることが好ましい。なぜなら、自然に放出されたＯＭＶを培養培地から分離することが、外膜を意図的に破壊して（例えば、洗浄剤処理または超音波処理により）、人工的に誘導されたＯＭＶを生成することを伴う方法よりも都合がよいからである。さらに、天然に存在するＯＭＶは、内膜および細胞質のコンタミネーションを実質的に含まない。ＯＭＶは、典型的には、電子顕微鏡により、３５〜１２０ｎｍの直径、例えば、５０ｎｍの直径を有し、培養培地から精製することができる。精製は、ＯＭＶを生きており、かつ／またはインタクトな細菌から、例えば、ＯＭＶは通過させるがインタクトな細菌は通過させない０．２２μｍのフィルターなどのフィルターを使用したサイズに基づく濾過によって、または、低速遠心分離を使用して細胞をペレット化する一方でブレブを懸濁物中に残すことによって分離することが理想的である。２段階サイズ濾過プロセスを伴う好ましい方法が参考文献４６に記載されている。

したがって、培養培地とは異なり、本発明のＯＭＶを含有する組成物は、一般に、生きているか死んでいるかにかかわらず、細菌全体を実質的に含まない。ＯＭＶのサイズは、濾過、例えば、典型的には、フィルター滅菌に使用される濾過によってそれらを細菌全体から容易に分離することができることを意味する。ＯＭＶは標準の０．２２μｍフィルターを通過するが、フィルターには急速に他の材料が詰まり、したがって、０．２２μｍフィルターを使用する前に孔径を漸減させた一連のフィルターを通す、フィルター滅菌の逐次的なステップを実施することが有用であり得る。前述のフィルターの例は、孔径が０．８μｍ、０．４５μｍなどのフィルターである。

代替の実施形態では、ＯＭＶは、細菌から人工的に調製することができ、また、洗浄剤処理（例えば、デオキシコール酸またはサルコシルを用いる）を使用して、または非洗浄剤手段によって（例えば、参考文献４７を参照されたい）調製することができる。ＯＭＶを形成するための技法としては、胆汁酸塩洗浄剤（例えば、リトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、コール酸、ウルソコール酸などの塩、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａを処理するためにはデオキシコール酸ナトリウム［４８＆４９］が好ましい）を用い、洗浄剤の沈殿が起こらないよう十分に高いｐＨで、細菌を処理すること［５０］が挙げられる。例えば、超音波処理、均質化、マイクロフルイダイゼーション、キャビテーション、浸透圧ショック、粉砕、フレンチプレス、ブレンディングなどの技法を使用して、洗浄剤の実質的不在下で他の技法を実施することができる［４７］。洗浄剤を全く使用しないまたは少量使用する方法では、ＮｓｐＡなどの有用な抗原を保持することができる［４７］。したがって、ある方法では、約０．５％デオキシコール酸またはそれ未満、例えば、約０．２％、約０．１％、＜０．０５％またはゼロのデオキシコール酸を伴うＯＭＶ抽出緩衝液を使用することができる。

ＯＭＶを調製するための有用なプロセスは参考文献５１に記載されており、高速遠心分離の代わりに、粗ＯＭＶに対する限外濾過を伴う。プロセスは、限外濾過を行った後に超遠心分離を行うステップを伴ってよい。

本発明は、上記の方法によって得られたまたは得ることができるＯＭＶを提供する。

薬学的組成物
本発明は、（ａ）本発明のＯＭＶと、（ｂ）薬学的に許容されるキャリアとを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、本発明のＯＭＶと薬学的に許容されるキャリアを混合するステップを含む、そのような組成物を調製するためのプロセスも提供する。

本発明は、本発明の薬学的組成物が予め充填された容器（例えば、バイアル）または送達デバイス（例えば、シリンジ）も提供する。本発明は、容器またはデバイスに本発明の小胞を含有する組成物を導入することを含む、そのような容器またはデバイスをもたらすためのプロセスも提供する。

免疫原性組成物は、薬学的に許容されるキャリアを含んでよく、これは、それ自体は組成物を受けている患者に有害な抗体の産生を誘導しない任意の物質であってよく、過度の毒性を伴わずに投与することができる。薬学的に許容されるキャリアは、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含んでよい。湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質も、そのようなビヒクル中に存在してよい。適切なキャリアに関する詳細な論述は、参考文献５２において入手可能である。

細菌は身体の種々の領域に影響を及ぼす可能性があり、したがって、本発明の組成物は、様々な形態で調製することができる。例えば、組成物は、注射剤として、液剤または懸濁物のいずれかとして調製することができる。注射前の液体ビヒクル中での溶解または懸濁のために適した固体形態も調製することができる。組成物は、局所投与するために、例えば、軟膏剤、クリーム剤または散剤として調製することができる。組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤もしくはカプセル剤として、またはシロップ剤（必要に応じて風味付けした）として調製される。組成物は、肺への投与のために、例えば、細粉または噴霧剤を使用した吸入器として調製することができる。組成物は、坐薬または膣坐薬として調製することができる。組成物は、鼻、耳または眼に投与するために、例えば、点滴薬として調製することができる。

医薬キャリアは、温度保護剤（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）を含んでよく、この成分は、アジュバント化された（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）組成物（特に、アルミニウム塩などの無機質アジュバントを含有する組成物）において特に有用であり得る。参考文献５３に記載の通り、液体温度保護剤を水性ワクチン組成物に加えて、その凝固点を低下させること、例えば、凝固点を０℃よりも下に低下させることができる。したがって、組成物を、０℃を下回るが組成物の凝固点よりも上で貯蔵して、熱による分解を阻害することができる。温度保護剤により、無機塩アジュバントを凍結および解凍後の凝塊形成または沈降から保護しながら組成物を凍結させることも可能になり、また、組成物を高温、例えば、４０℃超で保護することもできる。液体温度保護剤が最終的な混合物の１〜８０体積％を形成するように出発水性ワクチンと液体温度保護剤を混合することができる。適切な温度保護剤は、ヒトへの投与に関して安全であり、水中に容易に混和／可溶することができるべきであり、また、組成物中の他の成分（例えば、抗原およびアジュバント）を損傷しないべきである。例としては、グリセリン、プロピレングリコール、および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。適切なＰＥＧの平均分子量は２００〜２０，０００Ｄａにわたる。好ましい実施形態では、ポリエチレングリコールの平均分子量は約３００Ｄａである（「ＰＥＧ−３００」）。

組成物は、滅菌されていることが好ましい。組成物は、発熱物質を含まないことが好ましい。組成物は、例えば、ｐＨ６からｐＨ８の間、一般におよそｐＨ７に緩衝されていることが好ましい。本発明の組成物はヒトに対して等張性であり得る。

免疫原性組成物は、免疫学的有効量の免疫原性小胞、ならびに、必要に応じて任意の他の特定の成分を含む。「免疫学的有効量」とは、その量を単回用量でまたは一連のものの一部として個体に投与することが、処置または予防のために有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体の状態、処置される個体の年齢、分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望の防御の程度、ワクチンの処方、処置にあたる医師による医学的な状況に関する評価、および他の関連因子に応じて変動する。常套的な試験によって決定することができる量は比較的広範な範囲に入ることが予想される。

小胞ワクチンを用いた以前の研究（例えば、髄膜炎菌に関して）により、本発明の組成物に関する薬学的手引き、薬量学的手引きおよび処方の手引きがもたらされる。本発明の組成物中の小胞の濃度は、一般に、１０μｇ／ｍｌから５００μｇ／ｍｌの間、好ましくは２５μｇ／ｍｌから２００μｇ／ｍｌの間、より好ましくは約５０μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌになる（小胞中の総タンパク質量として表す）。注射するためには、０．５ｍｌの投与体積が典型的である。

組成物は、他の免疫調節剤と併せて投与することができる。

本発明の組成物に使用することができるアジュバントとしては、これだけに限定されないが、以下が挙げられる：
Ａ．無機質を含有する組成物
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した無機質を含有する組成物は、無機塩、例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩を含む。本発明は、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトリン酸塩）、硫酸塩などの無機塩［例えば、参考文献５７の第８章および第９章を参照されたい］、または異なる無機化合物の混合物を含み、化合物は任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）を取り、吸着していることが好ましい。無機質を含有する組成物は、金属塩の粒子として処方することもできる。

「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、オキシ水酸化アルミニウム塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶である。オキシ水酸化アルミニウムは、式ＡｌＯ（ＯＨ）で表すことができ、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）_３などの他のアルミニウム化合物とは、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に１０７０ｃｍ^−１に吸着バンドが存在することおよび３０９０〜３１００ｃｍ^−１に強力なショルダーが存在することによって区別することができる［参考文献５７の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度は、半分の高さにおける回析バンドの幅（ｔｈｅ ｗｉｄｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｂａｎｄ ａｔ ｈａｌｆ ｈｅｉｇｈｔ）（ＷＨＨ）に反映され、結晶性が不十分な粒子は、微結晶サイズが小さいことに起因してより大きな線幅拡大を示す。ＷＨＨが増加するにつれて表面積が増加し、ＷＨＨ値が高いアジュバントほど、抗原吸着の能力が大きいことが認められている。繊維状の形態（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントに典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的に約１１であり、すなわち、アジュバント自体は生理的なｐＨにおいて正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４でＡｌ^＋＋＋１ｍｇ当たり１．８〜２．６ｍｇのタンパク質の吸着能力が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。

「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、アルミニウムヒドロキシホスフェートであり、多くの場合、少量の硫酸塩も含有する（すなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート）。これらは、沈殿により得ることができ、沈殿の間の反応条件および濃度は、塩中のヒドロキシルのホスフェートによる置換の程度に影響する。ヒドロキシホスフェートは、一般に、０．３から１．２の間のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシホスフェートは、厳密なＡｌＰＯ_４とは、ヒドロキシル基が存在することによって区別することができる。例えば、３１６４ｃｍ^−１におけるＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃で）により、構造的なヒドロキシルの存在が示される［参考文献５７の第９章］。

リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ_４／Ａｌ^３＋モル比は、一般に、０．３と１．２との間、好ましくは０．８と１．２との間、より好ましくは０．９５±０．１である。リン酸アルミニウムは、一般に、特にヒドロキシリン酸塩ではアモルファスである。典型的なアジュバントは、０．８４と０．９２との間のＰＯ_４／Ａｌモル比を有するアモルファスのヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇＡｌ^３＋／ｍｌで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般に、粒子状である（例えば、透過電子顕微鏡写真で見られる通りプレート様の形態である）。粒子の典型的な直径は、任意の抗原の吸着後に、０．５〜２０μｍの範囲（例えば、約５〜１０μｍ）である。ｐＨ７．４でＡｌ^＋＋＋１ｍｇ当たりタンパク質０．７〜１．５ｍｇの吸着能が、リン酸アルミニウムアジュバントでは報告されている。

リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルに対するホスフェートの置換の程度に逆に関連し、この置換度は、沈殿によって塩を調製するために使用される反応条件および反応物の濃度に応じて変えることができる。溶液中の遊離ホスフェートイオンの濃度を変化させることによって（より多くのホスフェート＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝液などの緩衝液を添加する（ＰＺＣをより塩基性にする）ことによって、ＰＺＣを変える。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０と７．０との間のＰＺＣ、より好ましくは、５．０と６．５との間のＰＺＣ、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。

本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液、またはＴｒｉｓ緩衝液）を含有し得るが、これは、必ずしも必要であるとは限らない。懸濁物は、好ましくは、滅菌であり、発熱物質を含まない。懸濁物は、例えば、１．０ｍＭと２０ｍＭとの間、好ましくは、５ｍＭと１５ｍＭとの間、より好ましくは、約１０ｍＭの濃度で存在する遊離水性ホスフェートイオンを含み得る。懸濁物は、塩化ナトリウムも含み得る。

一実施形態において、アジュバント成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム両方の混合物を含む。この場合、水酸化アルミニウムよりリン酸アルミニウムが多くてよい、例えば、少なくとも２：１、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比であり得る。

患者へと投与するための組成物中のＡｌ^＋＋＋の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどであることが好ましい。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌとの間である。１用量当たり最大＜０．８５ｍｇが好ましい。

Ｂ．油エマルジョン
本発明でのアジュバントとしての使用に適した油エマルジョン組成物として、ＭＦ５９［参考文献５７の１０章；参考文献５４も参照のこと］（５％ スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％ Ｓｐａｎ ８５、マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子に処方される）などのスクアレン−水エマルジョンが挙げられる。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も使用され得る。

種々の適切な水中油型エマルジョンが公知であり、それらは、典型的には、少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を含み、油（複数可）および界面活性剤（複数可）は、生分解性（代謝性）および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般に直径が５μｍ未満であり、有利には、エマルジョンは、サブミクロンの直径を有する油滴を含み、これらの小型のサイズは、安定的なエマルジョンを提供するために、マイクロフルイダイザーにより達成される。サイズが２２０ｎｍ未満の液滴は、濾過滅菌にかけ得るので好ましい。

本発明は、動物（魚類など）供給源または植物供給源からのものなどの油とともに使用され得る。植物油のための供給源は、堅果、種子、および穀類を含む。最も一般的に利用可能であるラッカセイ油、大豆油、ココナッツ油、およびオリーブ油が堅果油のよい例となる。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油が、使用され得る。種子油は、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などを含む。穀類群において、トウモロコシ油が最も容易に利用可能であるが、その他の穀物粒（ｃｅｒｅａｌ ｇｒａｉｎｓ）（例えば、コムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなど）の油も使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然には存在しないが、堅果油および種子油から開始して、適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製され得る。哺乳動物の乳汁からの脂肪および油は、代謝性であり、したがって、本発明の実施において使用され得る。動物供給源から純粋な油を得るために必要とされる分離、精製、けん化、およびその他の手段のための手順は、当技術分野で周知である。ほとんどの魚類は、容易に回収され得る代謝性油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書中で使用され得る魚油のうちのいくつかのよい例となる。ある数の分枝鎖状油は、５−炭素イソプレンユニットにおいて生化学的に合成され、一般にテルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知である分枝不飽和テルペノイドを含有する。その他の好ましい油は、トコフェロールである（下記を参照のこと）。スクアレンを含む水中油型エマルジョンが特に好ましい。油の混合物が使用され得る。

界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類され得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０のＨＬＢ、好ましくは、少なくとも１５のＨＬＢ、およびより好ましくは、少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、界面活性剤とともに使用され得、それには、これだけに限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどの、ＤＯＷＦＡＸ^ＴＭの商品名の下で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が、特に目的のものである）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ ３０）などのラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知である）が挙げられる。エマルジョン中に含むための好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。上記で言及したように、Ｔｗｅｅｎ ８０などの洗浄剤は、以下の実施例で見られる熱安定性に寄与し得る。

界面活性剤の混合物（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物）が使用され得る。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエチレンエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）などのオクトキシノールとの組み合わせも適している。別の有用な組み合わせは、ラウレス９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。

界面活性剤の好ましい量（重量％で）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ ８０など）０．０１％〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズにおけるその他の洗浄剤など）０．００１％〜０．１％、特に０．００５％〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）０．１％〜２０％、好ましくは０．１％〜１０％、および特に０．１％〜１％、または約０．５％である。

本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとして、これだけに限定されないが、以下が挙げられる：
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０およびＳｐａｎ ８５のサブミクロンエマルジョン。エマルジョンの体積による組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０、および約０．５％のＳｐａｎ ８５であり得る。重量では、これらの比が、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．４８％のＳｐａｎ ８５となる。このアジュバントは、参考文献５７の１０章および参考文献５８の１２章により詳細に記載される通り、「ＭＦ５９」［５４〜５６］として公知である。ＭＦ５９エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液を包含すると有利である。

・スクアレン、αトコフェロール、およびポリソルベート８０を含むエマルジョン。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロール、および０．３〜３％のＴｗｅｅｎ ８０を有してもよく、スクアレン：トコフェロールの重量比は、これがより安定的なエマルジョンを提供するので、≦１（例えば、０．９０）であることが好ましい。スクアレンとＴｗｅｅｎ ８０とは、約５：２の体積比、または約１１：５の重量比で存在し得る。１つのこのようなエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ ８０をＰＢＳ中に溶解させて２％の溶液をもたらし、次いで、９０ｍｌのこの溶液を、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いで、この混合物をマイクロフルイダイズすることにより作製することができる。結果として得られるエマルジョンは、例えば平均直径が１００ｎｍと２５０ｎｍとの間、好ましくは約１８０ｎｍであるサブミクロンの油滴を有し得る。

・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）も含むことができる。エマルジョンは、リン酸緩衝液を含有し得る。

・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、およびトコフェロール（例えばコハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３つの成分を、約７５：１１：１０（例えば７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）の質量比で含むことができ、これらの濃度は、抗原に由来するこれらの成分のあらゆる寄与を包含するものとする。エマルジョンはまた、スクアレンも含むことができる。エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（下記を参照のこと）も含むことができる。水性相は、リン酸緩衝液を含有し得る。

・スクアラン、ポリソルベート８０、およびポロキサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｌ１２１」）のエマルジョン。エマルジョンは、ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水中で処方することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドに有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント［５９］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）中でトレオニル−ＭＤＰとともに用いられている。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバント［６０］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１、および０．２％のポリソルベート８０）中のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰを伴わずに用いることもできる。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。

・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）、および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンモノオレエートまたは「Ｓｐａｎ ８０」などのソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、かつ／または２００ｎｍ未満のサイズを有する油滴を少なくとも９０％（体積で）有する［６１］。エマルジョンは、アルジトール；凍結保護剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖）；および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１種または複数も含み得る。そのようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。

・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献６２に記載される通り、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、およびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。

・非代謝性油（軽鉱油（ｌｉｇｈｔ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）など）と少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０、またはＳｐａｎ ８０など）とによるサブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性結合体（参考文献６３に記載され、脂肪族アミンを、グルクロン酸のカルボキシル基を介して、デスアシルサポニンへと付加することにより作製されるＧＰＩ−０１００など）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤も含まれ得る。

・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６４］。

・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６４］。

・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えばコレステロール）とをヘリックスミセルとして会合させたエマルジョン［６５］。

組成物中の抗原およびアジュバントは、代表的には、患者への送達時に混合物中にある。エマルジョンは、製造中に、または送達時に即席で抗原と混合され得る。したがって、アジュバントおよび抗原は、パッケージまたは配布されたワクチン中に別個に保持され得、使用時に最終処方物の準備ができている。抗原は、ワクチンが２つの液体を混合することによって最終的に調製されるように、一般に水性形態である。混合のための２つの液体の体積比は、変化し得る（例えば、５：１と１：５との間）が、一般に、約１：１である。

Ｃ．サポニン処方物［参考文献５７の第２２章］
サポニン処方物も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花において見出されるステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の不均一な群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮に由来するサポニンがアジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（カスミソウ）から、商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント処方物としては、ＱＳ２１などの精製された処方物、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質処方物が挙げられる。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭとして市販されている。

サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されてきた。これらの技法を用いて特異的に精製された画分が同定されており、それらとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。サポニンはＱＳ２１であることが好ましい。ＱＳ２１の生成方法は参考文献６６に開示されている。サポニン処方物は、コレステロールなどのステロールも含んでよい［６７］。

サポニンとコレステロールの組み合わせを用いて、免疫賦活複合体（ＩＳＣＯＭ；参考文献５７の第２３章；また参考文献６８および６９を参照のこと）と呼ばれる独特の粒子を形成することができる。ＩＳＣＯＭは、典型的には、リン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンも含む。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭに用いることができる。ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１または複数を含むことが好ましい。必要に応じて、ＩＳＣＯＭは、追加的な洗浄剤（複数可）を欠いてよい［７０］。

サポニンに基づくアジュバントの開発についての総説は、参考文献７１＆７２に見出すことができる。

Ｄ．細菌誘導体または微生物誘導体
本発明において用いるのに適したアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体、例えば、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドおよびＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を含む。

ＬＰＳの無毒性の誘導体として、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５または６のアシル化された鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。好ましい３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの「小粒子」形態は、参考文献７３に開示されている。そのような３ｄＭＰＬの「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌濾過するのに十分小さい［７３］。他の無毒性のＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物（ｍｉｍｉｃ）、例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えば、ＲＣ−５２９が挙げられる［７４、７５］。

リピドＡ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡの誘導体、例えば、ＯＭ−１７４などが挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献７６＆７７に記載されている。

本発明においてアジュバントとして用いるのに適した免疫賦活性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（リン酸結合によってグアノシンと連結した、メチル化されていないシトシンを含有するジヌクレオチド配列）が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含有する二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも、免疫賦活性であることが示されている。

ＣｐＧは、ヌクレオチドの修飾／類似体、例えば、ホスホロチオエート修飾を含んでよく、また、二本鎖または一本鎖であってよい。参考文献７８、７９および８０には、可能性のある類似体の置換、例えば、グアノシンの、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置き換えが開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献８１〜８６においてさらに論じられている。

ＣｐＧ配列、例えば、ＧＴＣＧＴＴモチーフまたはＴＴＣＧＴＴモチーフは、ＴＬＲ９に向けられ得る［８７］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮなどの、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であってよく、または、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなどのＢ細胞応答誘導により特異的であってよい。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献８８〜９０において論じられている。ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮであることが好ましい。

ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、受容体を認識するために５’末端を利用できるように構築することが好ましい。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、それらの３’末端で結合させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成することができる。例えば、参考文献９１〜９３を参照されたい。

免疫賦活性オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ−３１（商標）として公知である［９４〜９６］。したがって、本発明で使用するアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つの（好ましくは複数の）ＣｐＩモチーフを含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜４０ヌクレオチド）（すなわち、イノシンとシトシンとが連結してジヌクレオチドを形成する）と、（ｉｉ）少なくとも１つの（好ましくは複数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列（複数可）を含むオリゴペプチド（例えば、５〜２０アミノ酸）などのポリカチオンポリマーとの混合物を含んでよい。オリゴヌクレオチドは、２６ｍｅｒの配列５’−（ＩＣ）_１３−３’（配列番号２）を含むデオキシヌクレオチドであってよい。ポリカチオンポリマーは、１１ｍｅｒのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号３）を含むペプチドであってよい。この配列番号６と配列番号７の組み合わせにより、ＩＣ−３１（商標）アジュバントがもたらされる。

細菌性のＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体を、本発明においてアジュバントとして用いることができる。タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来することが好ましい。解毒されたＡＤＰ−リボシル化毒素の、粘膜アジュバントとしての使用は、参考文献９７に記載されており、非経口的なアジュバントとしての使用は参考文献９８に記載されている。毒素または類毒素は、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態であることが好ましい。Ａサブユニットは、解毒性変異を含有することが好ましく、Ｂサブユニットは変異していないことが好ましい。アジュバントは、解毒されたＬＴ変異体、例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２であることが好ましい。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒された誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の、アジュバントとしての使用は、参考文献９９〜１０６に見出すことができる。有用なＣＴ変異体は、ＣＴ−Ｅ２９Ｈである［１０７］。アミノ酸置換についての数値での参照は、その全体が参照により具体的に本明細書に組み込まれる参考文献１０８に記載のＡＤＰ−リボシル化毒素のＡサブユニットとＢサブユニットのアラインメントに基づくことが好ましい。

Ｅ．ヒト免疫調節物質
本発明においてアジュバントとして用いるのに適したヒト免疫調節物質としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１０９］など）［１１０］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。好ましい免疫調節物質は、ＩＬ−１２である。

Ｆ．生体接着剤（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜接着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）
生体接着剤および粘膜接着剤も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。適切な生体接着剤としては、エステル化されたヒアルロン酸ミクロスフェア［１１１］または粘膜接着剤、例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋した誘導体が挙げられる。キトサンおよびそれらの誘導体も、本発明においてアジュバントとして用いることができる［１１２］。

Ｇ．微小粒子
微小粒子も、本発明においてアジュバントとして用いることができる。ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を用いて、生分解性かつ無毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された微小粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、必要に応じて、それを、負に荷電した表面を有するように処理する（例えば、ＳＤＳを用いて）または正に荷電した表面を有するように処理する（例えば、ＣＴＡＢなどの陽イオン洗浄剤を用いて）。

Ｈ．リポソーム（参考文献５７の第１３章＆第１４章）
アジュバントとして用いるのに適したリポソーム処方物の例は、参考文献１１３〜１１５に記載されている。

Ｉ．イミダゾキノロン（Ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）化合物
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノロン化合物の例としてはイミキモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびその同族化合物（例えば、「レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）３Ｍ」）が挙げられ、これは参考文献１１６および１１７においてさらに記載されている。

本発明は、上で識別されたアジュバントの１または複数の態様の組み合わせも含んでよい。例えば、以下のアジュバント組成物を本発明において使用することができる：（１）サポニンおよび水中油エマルジョン［１１８］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性のＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［１１９］；（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性のＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）［１２０］；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンの組み合わせ［１２１］；（６）サブミクロンのエマルジョンに微小流動化した、またはボルテックスしてより大きな粒子サイズのエマルジョンを生じさせたかのいずれかの、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０（商標）、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ。（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁の骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群からの１または複数の細菌の細胞壁成分を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；および（８）１または複数の無機塩類（例えば、アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの無毒性の誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）。

免疫賦活剤としての機能を果たす他の物質は、参考文献５７の第７章に開示されている。

水酸化アルミニウムアジュバントが有用であり、一般に、抗原は、この塩に吸着される。サブミクロンの油滴を伴うスクアレンを含む水中油エマルジョンも、特に、高齢者に好ましい。有用なアジュバントの組み合わせとしては、Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントの組み合わせ、例えば、ＣｐＧとアルミニウム塩、またはレシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）とアルミニウム塩などが挙げられる。アルミニウム塩と３ｄＭＰＬの組み合わせを使用することができる。

免疫化
上記の免疫原性組成物を提供することに加えて、本発明は、哺乳動物において免疫応答を上昇させるための方法であって、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む方法も提供する。典型的には、免疫応答は抗体応答である。抗体応答は、防御抗体応答であることが好ましい。本発明は、そのような方法において使用するための本発明の組成物も提供する。

本発明は、哺乳動物を細菌感染および／または疾患から保護するための方法であって、哺乳動物に本発明の免疫原性組成物を投与することを含む方法も提供する。

本発明は、医薬品として（例えば、免疫原性組成物としてまたはワクチンとして）使用するための本発明の組成物を提供する。本発明は、哺乳動物における細菌感染を予防するための医薬品の製造における本発明のＯＭＶの使用も提供する。

哺乳動物はヒトであることが好ましい。ヒトは、成人、または好ましくは、小児であってよい。ワクチンが予防的に使用するためのものである場合、ヒトは、小児（例えば、よちよち歩きの小児（ｔｏｄｄｌｅｒ）または乳児）であることが好ましく、ワクチンが治療的に使用するためのものである場合、ヒトは、成人であることが好ましい。例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために小児用ワクチンを成人に投与することもできる。

治療的処置の効力は、本発明の組成物を投与した後に、細菌感染をモニターすることによって試験することができる。予防的処置の効力は、組成物を投与した後に、小胞内の免疫原性タンパク質または他の抗原に対する免疫応答をモニターすることによって試験することができる。本発明の組成物の免疫原性は、該組成物を試験の被験体（例えば、生後１２〜１６カ月の小児）に投与し、次いで、標準の血清学的パラメータを決定することによって決定することができる。これらの免疫応答は、一般に、組成物を投与した約４週間後に決定され、組成物を投与する前に決定された値と比較される。１より多い用量の組成物を投与する場合、１より多い投与後決定を行うことができる。

本発明の組成物は、一般に、患者に直接投与される。直接的な送達は、非経口的な注射（例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、もしくは組織の間質腔へ）、または直腸投与、経口投与、膣への投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼への投与、耳への投与、肺への投与は他の粘膜投与によって達成することができる。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば、皮下針）を介してよいが、その代わりに無針注射を用いることができる。典型的な筋肉内用量は約０．５ｍｌである。

本発明は、全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するために用いることができる。

投薬処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであってよい。複数回用量は、一次免疫化スケジュールおよび／または追加免疫化スケジュールで使用することができる。一次用量スケジュールの後に、追加免疫用量スケジュールを続けることができる。初回刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）用量の間（例えば、４〜１６週の間）、および初回刺激と追加免疫との間の適切なタイミングは、常套的に決定することができる。

一般
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘから独占的になり、または、追加的な何か、例えば、Ｘ＋Ｙを含んでよい。

「実質的に」という単語により、「完全に」は排除されず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてよい。必要な場合、「実質的に」という単語を本発明の定義から除くことができる。

数値ｘとの関連での「約」という用語は、任意選択のものであり、例えば、ｘ±１０％を意味する。

ポリペプチド配列間の同一性は、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって、ギャップオープンペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１２およびギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）＝１のパラメータを用いたアフィンギャップ検索を使用して決定することが好ましい。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
グラム陰性菌由来の外膜小胞（ＯＭＶ）であって、前記ＯＭＶは、内腔内に遊離する少なくとも１種の異種タンパク質を含み、そして前記ＯＭＶは、哺乳動物に投与されると、前記異種タンパク質に対する免疫応答を惹起することができる、外膜小胞。
（項目２）
前記異種タンパク質が可溶性タンパク質である、項目１に記載のＯＭＶ。
（項目３）
前記異種タンパク質が前記ＯＭＶの内腔内で機能的に活性である、項目１または項目２に記載のＯＭＶ。
（項目４）
前記免疫応答が抗体免疫応答である、前記項目のいずれか一項に記載のＯＭＶ。
（項目５）
項目１〜３のいずれか一項に記載のＯＭＶを調製する方法であって、グラム陰性菌のペリプラズムにおいて異種タンパク質を発現させるステップを含む、方法。
（項目６）
前記異種タンパク質を、ペリプラズムタンパク質のシグナル配列をコードする核酸に作動可能に連結した前記異種タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを使用して前記グラム陰性菌のペリプラズム内で発現させる、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記異種タンパク質の天然のシグナル配列がペリプラズムタンパク質のシグナル配列で置き換えられている、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ＯＭＶを単離するステップをさらに含む、項目５〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
項目５〜８のいずれか一項に記載の方法によって得られたまたは得ることができるＯＭＶ。
（項目１０）
前記グラム陰性菌が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、およびＳｈｉｇｅｌｌａ種からなる群より選択される、前記項目のいずれか一項に記載のＯＭＶまたは方法。
（項目１１）
前記グラム陰性菌が、前記グラム陰性菌の過剰ブレブ形成株である、前記項目のいずれか一項に記載のＯＭＶまたは方法。
（項目１２）
前記グラム陰性菌がΔｔｏｌＲ Ｅ．ｃｏｌｉ株またはΔｏｍｐＡ Ｅ．ｃｏｌｉ株である、項目１１に記載のＯＭＶまたは方法。
（項目１３）
前記異種タンパク質が抗原である、前記項目のいずれか一項に記載のＯＭＶまたは方法。
（項目１４）
前記異種タンパク質が異種生物体内の細胞質タンパク質またはペリプラズムタンパク質である、前記項目のいずれか一項に記載のＯＭＶまたは方法。
（項目１５）
前記異種タンパク質が異種生物体内の膜結合タンパク質であり、膜アンカーが欠失している、項目１〜１３のいずれか一項に記載のＯＭＶまたは方法。
（項目１６）
前記異種タンパク質が、βラクタマーゼ（ＴＥＭ１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来のｆＨｂｐ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯの二重変異体（Ｓｌｏ−ｄｍ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞エンベロープセリンプロテアーゼＳｐｙＣＥＰ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質Ｓｐｙ０２６９である、前記項目のいずれか一項に記載のＯＭＶまたは方法。
（項目１７）
前記ＯＭＶが、内腔内に遊離する少なくとも２種の異種タンパク質を含む、前記項目のいずれか一項に記載のＯＭＶまたは方法。
（項目１８）
前記ＯＭＶが、内腔内に遊離する少なくとも３種の異種タンパク質を含む、項目１７に記載のＯＭＶまたは方法。
（項目１９）
前記異種タンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯの二重変異体（Ｓｌｏ−ｄｍ）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質Ｓｐｙ０２６９を含む、項目１７または１８に記載のＯＭＶまたは方法。
（項目２０）
前記異種タンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯの二重変異体（Ｓｌｏ−ｄｍ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞エンベロープセリンプロテアーゼＳｐｙＣＥＰ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質Ｓｐｙ０２６９を含む、項目１８に記載のＯＭＶまたは方法。
（項目２１）
（ａ）項目１〜４または９〜２０のいずれか一項に記載のＯＭＶと、（ｂ）薬学的に許容されるキャリアとを含む薬学的組成物。
（項目２２）
免疫原性組成物である、項目２１に記載の薬学的組成物。
（項目２３）
ワクチンである、項目２１または項目２２に記載の薬学的組成物。
（項目２４）
哺乳動物において異種タンパク質に対する免疫応答を生じさせる方法であって、前記方法は、前記哺乳動物にグラム陰性菌由来のＯＭＶを有効量で投与することを含み、前記ＯＭＶが内腔内に少なくとも１種の異種タンパク質を含み、前記免疫応答が前記ＯＭＶ内の前記異種タンパク質に対するものである、方法。
（項目２５）
哺乳動物において異種タンパク質に対する免疫応答を生じさせる方法であって、前記方法は、前記哺乳動物に、項目１〜４もしくは９〜２０のいずれかに記載のＯＭＶ、または項目２１〜２３に記載の薬学的組成物を有効量で投与することを含み、前記免疫応答が前記ＯＭＶ内の前記異種タンパク質に対するものである、方法。
（項目２６）
療法において使用するための、項目１〜４もしくは９〜２０のいずれか一項に記載のＯＭＶ、または項目２１〜２３に記載の薬学的組成物。

図１は、異種タンパク質をコードする目的の遺伝子（ＧＯＩ）と融合した、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯｍｐＡシグナル配列（ＳＳ）をコードする核酸配列を含有するｐＥＴ２１ｂ誘導体プラスミドであるｐＥＴ−ＯｍｐＡプラスミドのマップを示す。ＯｍｐＡ ＬＳにより、ＧＯＩによりコードされるタンパク質がＯＭＶの内腔内にターゲティングされる。 図２は、１ｍＭのＩＰＴＧを用いた誘導の前後の、培養物の全溶解物のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示す。ＳｐｙＣＥＰ、Ｓｌｏ、Ｂｌａ、ｆＨｂｐおよびＳｐｙ０２６９に対応するバンドが矢印によって強調表示されている。 図３は、形質転換されたΔｔｏｌＲ株およびΔｏｍｐＡ株の培養上清の超遠心分離によって調製した３０μｇのＯＭＶのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＳｐｙＣＥＰ、Ｓｌｏ、ＢｌａおよびｆＨｂｐの重量に対応するバンドが矢印によって示されている。 図４は、Ｓｌｏ（Ａ）およびＳｐｙＣＥＰ（Ｂ）についてのウエスタンブロットの結果を示す。陰性対照として空のＯＭＶもローディングした。化学発光シグナルを既知量の精製されたタンパク質からの化学発光シグナルと比較することにより、３０μｇのＯＭＶにおよそ２４０ｎｇのＳｌｏ−ｄｍ、２４０ｎｇのＳｐｙＣＥＰが含有されることが実証された。 図５は、Ｂｌａ（Ａ）およびｆＨｂｐ（Ｂ）についてのウエスタンブロットの結果を示す。陰性対照として空のＯＭＶもローディングした。化学発光シグナルを既知量の精製されたタンパク質からの化学発光シグナルと比較することにより、３０μｇのＯＭＶにおよそ２４０ｎｇのＢｌａが含有されることが実証された。 図６は、ＳｌｏおよびＳｐｙＣＥＰが、ＯＭＶの細胞外表面に付着するのではなく、ＯＭＶの内腔の成分として発現されることを示すウエスタンブロットを示す。１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを、ＳｌｏまたはＳｐｙＣＥＰを発現しているインタクトな可溶化された（１％ＳＤＳ中）小胞１５μｇに加え、３７℃で１０分インキュベートした。タンパク質分解をウエスタンブロット分析によって検出した。 図７は、Ｂｌａが、ＯＭＶの細胞外表面に付着するのではなく、ＯＭＶの内腔の成分として発現されることを示すウエスタンブロットを示す。１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを、Ｂｌａを発現しているインタクトな可溶化された（１％ＳＤＳ中）ＯＭＶ１５μｇに加え、３７℃で１０分インキュベートした。タンパク質分解をウエスタンブロット分析によって検出した。 図８Ａは、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて可溶化した、ＳｐｙＣＥＰを含有するＯＭＶのＳｐｙＣＥＰ活性を示す。ＳｐｙＣｅｐタンパク質を発現しているＯＭＶを種々の濃度で、５０μｇ／ｍｌのＩＬ−８と一緒に３７℃で２時間インキュベートした。ＳｐｙＣｅｐ野生型タンパク質を１０μｇ／ｍｌで陽性対照として使用し、ＩＬ−８の加水分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。 図８Ｂは、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて可溶化した、ＳｐｙＣＥＰを含有するＯＭＶのＳｐｙＣＥＰ活性を示す。ＳｐｙＣｅｐタンパク質を発現しているＯＭＶを種々の濃度で、５０μｇ／ｍｌのＩＬ−８と一緒に３７℃で２時間インキュベートした。陽性対照としてＳｐｙＣｅｐ野生型タンパク質を１０μｇ／ｍｌで使用し、ＩＬ−８の加水分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。 図９Ａは、Ｂｌａを含有するＯＭＶおよび空のＯＭＶのＢｌａ活性を示す。ＯＭＶ調製物を、ニトロセフィン（０．５ｍｇ／ｍｌ；Ｏｘｏｉｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）と一緒に、暗所中、３７℃で３０分インキュベートした。色素原の加水分解およびその後の上清の色の変化を、Ｔｅｃａｎ分光光度計を用いてＯＤ_４８５ですぐに決定した。ＯＤ_４８５が加水分解されたニトロセフィンの量に関連する標準曲線を使用して酵素活性を推定した。これを、組換えβ−ラクタマーゼ（ＶＷＲ）を使用して定量化した。図９Ｂは、野生型（ｗｔ）Ｓｌｏを含有するＯＭＶと、空のＯＭＶを、ヒツジ血液中の赤血球と一緒にインキュベートした場合の、ＯＭＶと一緒にインキュベートした血液の吸光度（ＯＤ５４０ｎｍ）と、水と一緒にインキュベートした血液（１００％溶血）の吸光度の間の比率として表した溶血活性を示す。 図１０は、３回目の免疫化後（４９日目）に免疫化の各群についてマウス８匹から得たＥＬＩＳＡ力価の幾何平均を示す。 図１１は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した、１００ｎｇの組換えＳｐｙＣＥＰおよび３回免疫化した後（ａｆｔｅｒ ３（ｐｏｓｔ ３）ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）に採取した種々の希釈度の免疫血清の存在下での切断されていないＩＬ−８の量の百分率を示す。 図１２Ａは、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した、１００ｎｇの組換えＳｐｙＣＥＰおよび２回免疫化した後（ａｆｔｅｒ ２（ｐｏｓｔ ２）ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）に採取した種々の希釈度の免疫血清の存在下の切断されていないＩＬ−８の量の百分率を示す。 図１２Ｂは、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した、組換えＳｐｙＣＥＰ、またはＳｐｙＣｅｐを含有するＯＭＶもしくは空のＯＭＶおよびＳｐｙＣｅｐを用いて２回免疫化した後（ａｆｔｅｒ ２（ｐｏｓｔ ２）ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）に採取した種々の希釈度の免疫血清の存在下の切断されていないＩＬ−８の量の百分率を示す。ＰＢＳを陰性対照として使用した。 図１３は、陽性対照として組換えＳｌｏを用いて、またはＳｌｏを含有する操作したＯＭＶ（ＯＭＶ−Ｓｌｏ）を用いて免疫化したマウスから採取した種々の希釈度の免疫血清の存在下での溶血の量の百分率を示す。 図１４は、アラム（ａｌｕｍ）への吸収前に超音波処理を伴うまたは伴わない、Ｓｌｏを有するＯＭＶを用いて免疫化したマウス８匹の試料およびＳｐｙＣＥＰを有するＯＭＶを用いて免疫化したマウス８匹の試料の生存プロットを示す。アラムに吸収させた組換えＳｌｏを用いて免疫化したマウスおよびアラムに吸収させた組換えＳｐｙＣＥＰを用いて免疫化したマウスの生存プロットを対照として使用する。 図１５Ａは、ｐＥＴ−ｓｌｏ＋ｓｐｙ０２６９プラスミドのマップを示す。図１５Ｂは、ｐＥＴ−ｓｌｏ＋ｓｐｙ０２６９＋ｓｐｙｃｅｐプラスミドのマップを示す。 図１６Ａは、ＩＰＴＧを用いた誘導後に、タンパク質の全てがバイシストロン構築物およびトリシストロン構築物から発現されることを示すウエスタンブロットを示す。図１６Ｂは、Ｓｌｏタンパク質とＳｐｙ０２６９タンパク質の両方がＯＭＶ内で発現され、存在することを示すウエスタンブロットを示す。

実施例１ Ｅ．ｃｏｌｉ ＯＭＶ内での異種タンパク質の発現
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔｔｏｌＲおよびΔｏｍｐＡ ｋｏ変異体の作製
高性能相同組換え系（ｒｅｄオペロン）を使用することにより、組換えを起こしやすいＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を生成した［１２２］。簡単に述べると、エレクトロコンピテント細菌細胞を、５μｇのプラスミドｐＡＪＤ４３４を用いて電気穿孔によって（２．５ｋＶで５．９ｍｓ）形質転換した。次いで、細菌を、ＳＯＣブロス１ｍｌ中、３７℃で１時間成長させ、次いで、トリメトプリム（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）プレートに蒔いた。０．２％Ｌ−アラビノースを培地に加えることにより、ｐＡＪＤ４３４に保持させたｒｅｄ遺伝子の発現を誘導した。

大量のＯＭＶを自然に産生することが公知であるΔｔｏｌＲ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１変異体株およびΔｏｍｐＡ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１変異体株を、それぞれｏｍｐＡおよびｔｏｌＲのコード配列をカナマイシン（ｋｍｒ）耐性カセットおよびクロラムフェニコール（ｃｍｒ）耐性カセットで置き換えることによって生成した。３ステップＰＣＲプロトコールを使用して、ｏｍｐＡおよびｔｏｌＲの上流および下流の領域をそれぞれｋｍｒ遺伝子およびｃｍｒ遺伝子と融合した。簡単に述べると、ｔｏｌＲ遺伝子およびｏｍｐＡ遺伝子の上流および下流の領域を、ＢＬ２１（ＤＥ３）ゲノムＤＮＡから、それぞれ特異的なプライマー対ｔｏｌＲ−１／ｔｏｌＲ−２およびｔｏｌＲ−３／ｔｏｌＲ−４；ｏｍｐＡ−１／ｏｍｐＡ−２およびｏｍｐＡ−３／ｏｍｐＡ４を用いて増幅した（表１）。プライマーＰＵＣ４Ｋ−ｒｅｖおよびＰＵＣ４Ｋ−ｆｏｒを使用してｋｍｒカセットをプラスミドｐＵＣ４Ｋから増幅し、プライマーＣＭＲ−ｆｏｒ／ＣＭＲ−ｒｅｖを使用してｃｍｒを増幅した。最後に、３つの増幅された断片のそれぞれ１００ｎｇを、１／４プライマーを含有するＰＣＲにおいて混合することによって一緒に融合した。

抗生物質耐性遺伝子がｔｏｌＲ／ｏｍｐＡの上流および下流の領域に隣接する線状断片を使用して、冷水での３つの洗浄ステップによってエレクトロコンピテントにした組換えを起こしやすいＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ株を形質転換した。形質転換は２．５ｋＶで５．９ｍｓの電気穿孔によって行った。３０μｇ／ｍｌのカナマイシンまたは２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢプレートに細胞を蒔くことにより形質転換体を選択した。ｔｏｌＲ遺伝子およびｏｍｐＡ遺伝子の欠失を、プライマー対ｔｏｌＲ−１／ＰＵＣ４Ｋ−ｒｅｖおよびＰＵＣ４Ｋ−ｆｏｒ／ｔｏｌＲ−４；ｏｍｐＡ−１／ＣＭＲ−ｒｅｖおよびＣＭＲ−ｆｏｒ／ｏｍｐＡ−４を使用してゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅することによって確認した。

実施例２ プラスミド構築
グラム陽性およびグラム陰性の両方の、異なる細胞区画に属する異なる細菌の種由来の５種の異種タンパク質をモデルタンパク質として選択して、異種タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ ＯＭＶにそれらの天然のコンフォメーションで組み込むことができるかどうかを決定した。これらのタンパク質は、（１）Ｅ．ｃｏｌｉ由来のペリプラズムＴＥＭ１ベータラクタマーゼ（Ｂｌａ）、（２）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＨ因子結合性タンパク質（ｆＨｂｐ）リポタンパク質、（３）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯ（Ｓｌｏ、ＧＡＳ２５とも称される）、（４）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞エンベロープセリンプロテアーゼＳｐｙＣＥＰ（ＧＡＳ５７とも称される）および（５）同様にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質Ｓｐｙ０２６９（ＧＡＳ４０としても公知である）を含んだ。これらの５種のタンパク質のそれぞれの核酸コード配列を、ポリメラーゼ不完全プライマー伸長（ＰＩＰＥ）クローニング法［１２３］を使用してｐＥＴ−ＯｍｐＡプラスミドにクローニングした。ｐＥＴ−ＯｍｐＡプラスミド（例えば、［１２４］および［１２５］において提供される）はｐＥＴ２１ｂ由来のプラスミドである。

簡単に述べると、Ｓｌｏ−ｄｍ（ｓｌｏ二重変異体、配列番号４２）を、ｓｌｏ−ｄｍ遺伝子を含有するプラスミドｐＥＴ２１−Ｓｌｏ−ｄｍからＧＡＳ２５−Ｆ／ＧＡＳ２５−Ｒプライマーを使用してＰＣＲ増幅した（表１参照）。ＳｐｙＣＥＰ遺伝子（二重変異体配列も配列番号４０で提供される）を、Ｃ末端ＬＰＸＴＧモチーフ細胞壁アンカー（アミノ酸１６１４〜１６４７に位置する）が排除されるように設計したＳｐｙＣＥＰ−Ｆ３／ＳｐｙＣＥＰ−Ｒ３プライマーを使用してＭ１ ＧＡＳ株ＩＳＳ３３４８からＰＣＲ増幅した。ｓｐｙ０２６９（配列番号４４）遺伝子を、ｓｐｙ０２６９−Ｆ／ｓｐｙ０２６９−Ｒプライマーを使用してＭ１ ＧＡＳ株ＩＳＳ３３４８からＰＣＲ増幅した。ｆＨｂｐ遺伝子を増幅するためのプライマーは、膜への係留を回避するためにｌｉｐｏｂｏｘ（ｆＨｂｐのアミノ酸１７〜２５に位置する）が排除されるように設計した。タンパク質をペリプラズムにターゲティングするために、これらのタンパク質のそれぞれのシグナル配列をコードする配列を除去し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯｍｐＡシグナル配列（ＳＳ）で置き換えた（図１を参照されたい）。ＢｌａおよびｆＨｂｐを、それぞれｐＥＴ２１ｂおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＭＣ５８のゲノムから、それぞれプライマーＢｌａ−ｏｍｐ−Ｆ／Ｂｌａ−ｏｍｐ−ＲおよびｆＨｂｐ−Ｆ／ｆＨｂｐ−Ｒを使用して増幅した。ｐＥＴ−ＯｍｐＡプラスミドを、プライマーｏｍｐｒｅｖ／ｎｏｈｉｓｆｌａｇを使用してＰＣＲによって増幅した。このようにプラスミドｐＥＴ−２１＿Ｂｌａ（配列番号３７）、ｐＥＴ−２１＿ｓｌｏ（配列番号３３）、ｐＥＴ−２１＿ＳｐｙＣＥＰ（配列番号３４）、ｐＥＴ−２１＿ｆＨｂｐ（配列番号３６）およびｐＥＴ２１＿ｓｐｙ０２６９（配列番号３５）を作製した。

実施例３ ΔｔｏｌＲ変異体およびΔｏｍｐＡ変異体、ＯＭＶおよび全溶解物の調製物内での異種タンパク質の発現
Ｂｌａタンパク質、ｓｌｏタンパク質、ＳｐｙＣＥＰタンパク質、ｆＨｂｐタンパク質およびＳｐｙ０２６９タンパク質がＯＭＶ内にパッケージングされるかどうかを調査するために、ΔｔｏｌＲ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株およびΔｏｍｐＡ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株を、プラスミドｐＥＴ−２１＿Ｂｌａ、ｐＥＴ−２１＿ｓｌｏ、ｐＥＴ−２１＿ＳｐｙＣＥＰ、ｐＥＴ−２１＿ｆＨｂｐおよびｐＥＴ２１＿ｓｐｙ０２６９で形質転換した。陰性対照として、ΔｔｏｌＲ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株およびΔｏｍｐＡ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株をｐＥＴ−ＯｍｐＡ空ベクターで形質転換した。

全ての株を、液体培養物中で対数期まで成長させ、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を加えることによって遺伝子の発現の誘導を行った。図２は、１ｍＭのＩＰＴＧを用いた誘導の前後のこれらの培養物の全溶解物のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。Ｂｌａタンパク質、ｓｌｏタンパク質、ＳｐｙＣＥＰタンパク質、ｆＨｂｐタンパク質およびＳｐｙ０２６９タンパク質に対応するバンドが誘導した試料の全てに存在し、矢印によって示されている。したがって、試験した異種タンパク質５種全てがＥ．ｃｏｌｉにおいて首尾よく誘導された。

各形質転換体の一晩培養物を使用して、ＬＢ培地２００ｍｌにＯＤ_６００＝０．０５で接種した。培養物をＯＤ_６００＝０．５まで成長させ、次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを加えることによって組換えタンパク質の発現を誘導し、その後、さらに２時間インキュベートした。ＯＭＶ調製物については、８，０００×ｇで２０分遠心分離することによって細胞を回収した。生じた上清を、０．２２μｍ孔径のフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。次いで、濾液を高速遠心分離（２００，０００×ｇで２時間）に供し、ＯＭＶを含有するペレットを、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を伴うＰＢＳに再懸濁させた。示されている場合、マウスの免疫化については、ＯＭＶを、低張緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＫＣｌ）中でそれぞれ３０秒の１０回のバーストによって超音波処理し、その後、氷上で冷却した。全溶解物を培養物１ｍｌから調製し、１３，０００×ｇで５分遠心分離した。ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料ローディング緩衝液に再懸濁させ、１００℃で５分加熱し、４〜１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にローディングした。ゲルにＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を流し、Ｃｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅを用いて染色した。図３は、種々の異種タンパク質を発現させるためのプラスミドを含有するΔｔｏｌＲ株およびΔｏｍｐＡ株から得たおよそ３０μｇのＯＭＶについてのポリアクリルアミドゲルを示す。ＳｐｙＣＥＰ、Ｓｌｏ、ＢｌａおよびｆＨｂｐの重量に対応するバンドが矢印によって示されている。タンパク質同定を確認するために、バンドを切り出し、トリプシンを用いて消化し、次いで、生じたタンパク質分解性ペプチドを飛行時間型マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって分析した。

簡単に述べると、タンパク質バンドをゲルから切り出し、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム−アセトニトリル（５０／５０、ｖｏｌ／ｖｏｌ）で洗浄し、風乾した。乾燥したスポットを、５ｍＭの炭酸水素アンモニウム中０．０１２μｇ／μｌの配列決定用等級の改変トリプシン（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｇｒａｄｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｔｒｙｐｓｉｎ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）１２μｌ中、３７℃で２時間にわたって消化した。消化後、消化産物０．６μｌをｍａｔｒｉｘ−ｐｒｅｓｐｏｔｔｅｄ Ａｎｃｈｏｒｃｈｉｐ（ＰＡＣ３８４ ＨＣＣＡ；Ｂｒｕｋｅｒ−Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にローディングし、風乾した。スポットを、７０％エタノールおよび０．１％トリフルオロ酢酸を含有する溶液０．６μｌで洗浄した。ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて質量スペクトルを取得した。ＰＡＣ ｃｈｉｐ（Ｂｒｕｋｅｒ−Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）上に存在する標準物質の組み合わせを使用することによってスペクトルを外部較正した。ローカルデータベースで実行する、ＭＡＳＣＯＴソフトウェア（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）の認可バージョンを使用してモノアイソトピックペプチドマッチングおよびタンパク質検索を自動的に実施した。使用したＭＡＳＣＯＴ検索パラメータは以下の通りであった：（ｉ）未切断の許容数（ａｌｌｏｗｅｄ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅｓ）＝１；（ｉｉ）可変翻訳後修飾（ｖａｒｉａｂｌｅ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＝メチオニンの酸化；および（ｉｉｉ）ペプチド許容度（ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）＝１００ｐｐｍ。ＭＡＳＣＯＴ確率解析によって定義される有意なヒットのみを考慮した。ＭＡＳＣＯＴソフトウェアにより、Ｂｌａタンパク質、Ｓｌｏタンパク質、ＳｐｙＣＥＰタンパク質およびｆＨｂｐタンパク質にそれぞれ対応するバンドが同定された。これらの結果により、Ｂｌａ、Ｓｌｏ、ＳｐｙＣＥＰおよびｆＨｂｐは全て、ΔｔｏｌＲ Ｅ．ｃｏｌｉ株によって産生されたＯＭＶおよびΔｏｍｐＡ Ｅ．ｃｏｌｉ株によって産生されたＯＭＶのどちらにおいても発現させ、それに組み込むことができることが確認される。

実施例４ ＯＭＶ内の異種タンパク質の定量化
Ｅ．ｃｏｌｉ ＯＭＶに組み込まれた異種タンパク質の量を定量化するために、ウエスタンブロット分析を実施した。

異種タンパク質を含有するＯＭＶ３０μｇを、漸増濃度（２０〜８０ｎｇ）の対応する精製タンパク質と一緒に４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにローディングした。陰性対照として空のＯＭＶもローディングした。次いで、標準の方法によってポリアクリルアミドゲルをニトロセルロースフィルターに転写した［１２６］。フィルターを、ブロッキング溶液（ＰＢＳ中１０％スキムミルクおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ）中で撹拌することによって４℃で一晩ブロッキングし、その後、ＰＢＳ中３％スキムミルクおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ中の必要な抗体血清（抗Ｂｌａ（Ａｂｃａｍ）、抗ｓｌｏ、抗ＳｐｙＣＥＰおよび抗ｆＨｂｐ）の１：１０００希釈物と一緒に３７℃で９０分インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでの３つの洗浄ステップの後、フィルターを、ＰＢＳ中３％スキムミルクおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ中のペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ）の１：２０００希釈物中で１時間インキュベートし、３つの洗浄ステップの後、生じたシグナルを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用することによって検出した。

図４および図５は、実施された４つの異なるウエスタンブロットからの結果を示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析から予測された通り、全てのＯＭＶ調製物が選択された異種タンパク質を含有する。化学発光シグナルを既知量の精製されたタンパク質からの化学発光シグナルと比較することにより、３０μｇのＯＭＶにおよそ２４０ｎｇのＳｌｏ、ＳｐｙＣＥＰおよびＢｌａが含有されることが実証された。

実施例５ 異種タンパク質はＯＭＶペリプラズム内に局在する
上記の通り、４種全ての異種タンパク質のシグナル配列を、該タンパク質をＥ．ｃｏｌｉペリプラズム内にターゲティングするためにＥ．ｃｏｌｉ ＯｍｐＡシグナル配列で置き換えた。したがって、該タンパク質が、ＯＭＶの細胞外表面に付着するのではなく、ＯＭＶの内腔の成分として発現されることを確認することが重要であった。

これを試験するために、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）をＳｌｏ−ｄｍまたはＳｐｙＣＥＰを発現しているインタクトな可溶化された（１％ＳＤＳ中）ＯＭＶ１５μｇに加え、次いで、混合物を３７℃で１０分インキュベートした。１０ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてプロテイナーゼＫを非活性化した後、試料を４〜１２％ポリアクリルアミドゲルにローディングし、異種タンパク質の存在を検出するために必要な抗体を用いてウエスタンブロット分析を実施した。

図６および図７は、Ｓｌｏ−ｄｍ、ＳｐｙＣＥＰおよびＢｌａが全て、可溶化されていないＯＭＶにおいてプロテイナーゼＫに媒介される分解から保護された（しかし、可溶化されたＯＭＶでは保護されなかった）ことを示し、これにより、これらがいずれもＥ．ｃｏｌｉ ＯＭＶの内腔内のペリプラズムタンパク質として発現されることが実証された。

実施例６ ＳｐｙＣＥＰを含有するＯＭＶはＩＬ−８を加水分解することができる
ＳｐｙＣＥＰは、ＩＬ−８を加水分解し、それを６ｋＤａの不活性な断片に変換することが報告されている［１２７］。ＳｐｙＣＥＰがこの加水分解活性をＯＭＶ調製物中で維持するかどうかを決定するために、ＳｐｙＣＥＰタンパク質を発現しているＯＭＶを異なる濃度で、ヒトＩＬ−８（５０μｇ／ｍｌ）と一緒に３７℃で２時間インキュベートした。ＳｐｙＣＥＰ野生型タンパク質（１０μｇ／ｍｌの濃度）を陽性対照として使用した。陽性対照として、ＩＬ−８を１０ｎｇ／ｍｌのＧＡＳ５７精製タンパク質（ＩＬ−８を加水分解することが公知である）と一緒にインキュベートした。１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用し、銀染色を用いて加水分解生成物を分析した。ＳｐｙＣＥＰタンパク質の活性形態が、ＯＭＶの内側に位置するかどうかを試験するために、ＯＭＶの内腔からのＳｐｙＣＥＰの漏出を、ＯＭＶを０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中、室温で２０分透過処理することによって誘導した（図８Ａを参照されたい）。１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用してＯＭＶを透過処理する追加的な実験を行った（図８Ｂを参照されたい）。

図８Ａおよび図８Ｂに示されているように、ＩＬ−８は、ＳｐｙＣＥＰを含有するＯＭＶ３０μｇと一緒に２時間インキュベートした後、ほぼ完全に切断された。したがって、ＳｐｙＣＥＰの生物活性はＯＭＶ内で保存される。機能活性が保持されたことにより、ＯＭＶ内で異種タンパク質が正確にフォールディングされ、したがって、その天然の環境にある野生型タンパク質と同じ、または実質的に同じ構造エピトープが提示されることが示される。ＩＬ−８加水分解活性は透過処理したＯＭＶにおいて増大し、これにより、ＳｐｙＣＥＰの活性形態がＯＭＶの内側に位置することが示唆される。機能活性が保持されたことにより、異種タンパク質がＯＭＶ内で正確にフォールディングされ、したがって、その天然の環境にある野生型タンパク質と同じ、または実質的に同じ抗原が提示されることが示される。

実施例７ ＢｌａおよびＳｌｏを含有するＯＭＶ
Ｂｌａを発現しているＯＭＶを、発色基質であるニトロセフィンと一緒にインキュベートし、本明細書に記載の通りＢｌａ活性を測定した。ＯＭＶ調製物を、ニトロセフィン（０．５ｍｇ／ｍｌ；Ｏｘｏｉｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）と一緒に、暗所中、３７℃で３０分インキュベートした。色素原の加水分解およびその後の上清の色の変化を、Ｔｅｃａｎ分光光度計を用いてＯＤ４８５ですぐに決定した。ＯＤ４８５が加水分解されたニトロセフィンの量に関連する標準曲線を使用して酵素活性を推定した。これを、組換えβ−ラクタマーゼ（ＶＷＲ）を使用して定量化した。

図９Ａは、空のＯＭＶではＢｌａ活性が示されなかったが、Ｂｌａを含有するＯＭＶではＢｌａ活性が示されたことを示す。したがって、Ｂｌａの生物活性はＯＭＶにおいて保存される。

Ｂｌａの活性形態がＯＭＶの内側に位置するかどうかを試験するために、ＯＭＶを１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中、室温で２０分透過処理することによってＯＭＶの内腔からのＢｌａの漏出を誘導した。図９Ａに示されているように、透過処理したＯＭＶではＢｌａ活性が増大し、これにより、Ｂｌａの活性形態がＯＭＶの内側に位置することが示唆される。

Ｓｌｏ溶血活性を、以下の方法を用いて、野生型（ｗｔ）形態の毒素を発現しているＯＭＶをヒツジ血液中の赤血球と一緒にインキュベートすることによって試験した。試料の段階希釈物を、希釈緩衝液としてＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡを使用してＵ形状の底の９６ウェルプレート中に調製した。ヒツジ血液１ｍｌをＰＢＳ中で３回洗浄し（３０００×ｇでの遠心分離を伴って）、血液細胞を最終的に５ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。この懸濁物５０μｌを希釈された試料のそれぞれ５０μｌに加え、３７℃で３０分インキュベートした。水を使用して１００％溶血をもたらし、ＰＢＳ＋ＢＳＡ０．５％を陰性対照として使用した。次いで、プレートを１，０００×ｇで５分遠心分離し、上清を９６ウェルの平底プレートに慎重に移して、５４０ｎｍにおける吸光度を読み取った［１２８］。

図９Ｂに示されているように、陰性対照である空のＯＭＶでは溶血活性は示されなかったが、Ｓｌｏ−ｗｔを含有するＯＭＶでは高レベルの溶血活性が示され、これは、存在するＯＭＶの量に依存した。したがって、Ｓｌｏの生物活性はＯＭＶ内で保存される。ＳｌｏおよびＢｌａの機能活性が保持されたことにより、これらの異種タンパク質がＯＭＶ内で正確にフォールディングされ、したがって、その天然の環境にある野生型タンパク質と同じ、または実質的に同じ抗原が提示されることが示される。

実施例８ 操作したＯＭＶ内のＳｌｏおよびＳｐｙＣＥＰを用いて免疫化したマウスにおいて惹起される抗体価
Ｅ．ｃｏｌｉ ＯＭＶ内のＳｌｏおよびＳｐｙＣＥＰの免疫原性を調査するために、５週齢の雌ＣＤ１マウス８匹の群を、０日目、２１日目および３５日目に、超音波処理したまたは超音波処理していない、Ｓｌｏタンパク質またはＳｐｙＣＥＰタンパク質を過剰発現しているＯＭＶ２５μｇを腹腔内に用いて免疫化した。全ての試料を、２ｍｇ／ｍｌのアラム水酸化物をアジュバントとして用いて処方した。対照マウスをＰＢＳおよびアジュバントで免疫化した。陽性対照群は、組換え型の精製されたＳｌｏタンパク質またはＳｐｙＣＥＰタンパク質２０μｇを用いて免疫化したマウスからなった。ＯＭＶアジュバント活性（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）を試験するために、マウスを、空のＯＭＶ２５μｇまたは空のＯＭＶ２５μｇとそれに加えてＳｌｏ抗原もしくはＳｐｙＣＥＰ抗原２０μｇを用いても免疫化した。

１回目の免疫化の前（免疫前血清）および３回の免疫化のそれぞれの後（１回目後の血清、２回目後の血清および３回目後の血清）に血清を採取し、ＥＬＩＳＡ力価を分析した。それぞれＰＢＳ中３μｇ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌのＳｌｏタンパク質またはＳｐｙＣＥＰタンパク質でコーティングした９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＥＬＩＳＡを実施した。プレートを室温で２時間インキュベートし、次いで、ＴＰＢＳ（ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）を用いて３回洗浄し、ウェル当たり２５０μｌの２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて室温で１時間ブロッキングした。各インキュベーションステップの後にＴＰＢＳで３回洗浄した。血清試料を最初にＴＰＢＳ中２％ＢＳＡ中に１：５００〜１：１０００に希釈し、コーティングしブロッキングしたプレートに移し（２００μＬ）、段階的に希釈し（２倍ずつ）、その後、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、１：２０００に希釈した、アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇＧをウェル当たり１００μｌ加え、３０℃で２時間置いた。１Ｍのジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）中３ｍｇ／ｍＬのパラ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をウェル当たり１００μＬ加えることにより、結合したアルカリホスファターゼを可視化した。室温で１０分展開した後、マイクロプレート分光光度計で４０５ｎｍにおいてプレートを分析した。ＯＤを参照較正曲線に内挿することによって抗体価を算出し、１ｍＬ当たりのＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）で表した。

図１０は、３回目の免疫化後（４９日目）に免疫化の各群についてマウス８匹から得たＥＬＩＳＡ力価の幾何平均を示す。ＰＢＳおよびアジュバントを単独で用いて、または空のＯＭＶを用いて免疫化したマウス由来の血清により陰性の結果がもたらされた。図１０に示されているように、５種の調製物全てに対する抗体応答は統計学的に同等であり、これにより、操作したＯＭＶ調製物がＳｌｏ抗原に対する抗体およびＳｐｙＣＥＰ抗原に対する抗体を誘導することができることが示唆される。

実施例９ ＯＭＶ−ＳｐｙＣＥＰ免疫血清により、ＳｐｙＣＥＰに媒介されるＩＬ−８のプロセシングが阻害される
ＰＢＳを単独で用いて免疫化したマウス、空のＯＭＶを用いて免疫化したマウス、ＯＭＶ−ＳｐｙＣＥＰを用いて免疫化したマウスおよびＯＭＶ＋ＳｐｙＣＥＰを用いて免疫化したマウスから得た血清を、ＳｐｙＣＥＰのＩＬ−８タンパク質分解活性を中和するそれらの能力について試験した。このＩＬ−８阻害アッセイを実施するために、ＳｐｙＣＥＰ（０．１μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−８（１μｇ／ｍｌ）を、各群について免疫化したマウス８匹からのマウスポリクローナル血清のプールを５つの異なる希釈度（１：２、５、１：５、１：１０、１：２０、および１：４０）で用い、ＰＢＳ、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中、３７℃で２時間インキュベートした。対照として、ＳｐｙＣＥＰを緩衝液のみと一緒にインキュベートし、ＳｐｙＣＥＰを伴わない血清を使用した。２時間後に、切断されていないＩＬ−８の量をＥＬＩＳＡ（ｈｕｍａｎ ＩＬ−８ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって定量化し、対照反応（緩衝液のみと一緒にインキュベート）におけるＩＬ−８と比較した反応（ＳｐｙＣＥＰと一緒にインキュベート）における切断されていないＩＬ−８の百分率として表した。

図１１、図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した、１００ｎｇの組換えＳｐｙＣＥＰおよび３回免疫化した後（ａｆｔｅｒ ３（ｐｏｓｔ ３）ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）および２回免疫化した後（ａｆｔｅｒ ２（ｐｏｓｔ ２）ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）にそれぞれ採取した種々の希釈度の免疫血清の存在下での切断されていないＩＬ−８のパーセントを示す。

陽性対照として組換えＳｐｙＣＥＰを用いて免疫化したマウス由来の血清、およびＳｐｙＣＥＰを含有する操作したＯＭＶ（ＯＭＶ−ＳｐｙＣＥＰ）を用いて免疫化したマウス由来の血清は、ＳｐｙＣＥＰタンパク質分解活性を用量依存的に中和することができ、統計学的に同等の結果がもたらされた。

実施例１０ ＯＭＶ−Ｓｌｏ免疫血清により、Ｓｌｏに媒介される溶血が阻害される
ＰＢＳを単独で用いて免疫化したマウス、空のＯＭＶを用いて免疫化したマウス、ＯＭＶ−Ｓｌｏを用いて免疫化したマウス、２０μｇのＳｌｏを用いて免疫化したマウスおよび０．５μｇのＳｌｏ（２０μｇのＯＭＶに含有されるＳｌｏの量に大体対応する）を用いて免疫化したマウスから得た血清を、Ｓｌｏの溶血活性を中和するそれらの能力について試験した。このアッセイを実施するために、Ｓｌｏ（６０ｎｇ）を、プールした、各群について免疫化したマウス８匹からのポリクローナル血清を６つの異なる希釈度（１：３１．２５；１：６３；１：１２５；１：２５０；１：５００および１：１０００）で用い、ＰＢＳ、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中、室温で２０分インキュベートした。ヒツジ血液１ｍｌをＰＢＳ中で３回洗浄し（３０００×ｇでの遠心分離を伴う）、血液細胞を最終的に５ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。この懸濁物５０μｌを試料のそれぞれに加え、試料を３７℃で３０分インキュベートした。６０ｎｇのＳｌｏを陽性対照として使用して１００％溶血をもたらし、ＰＢＳ＋ＢＳＡ０．５％を陰性対照として使用した。次いで、プレートを１，０００×ｇで５分遠心分離し、上清を９６ウェルの平底プレートに移し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した［１２８］。

図１３は、異なる血清希釈度で各試料によってもたらされた溶血のパーセントを示す。陽性対照として組換えＳｌｏを用いて免疫化したマウス由来の血清、およびＳｌｏを含有する操作したＯＭＶ（ＯＭＶ−Ｓｌｏ）を用いて免疫化したマウス由来の血清はＳｌｏの溶血活性を用量依存的に中和することができ、統計学的に同等の結果がもたらされた。

実施例１１ 内腔内に外来抗原を有するＯＭＶにより強力な防御応答が惹起される
組換え抗原がＯＭＶの内腔内に存在していても、そのようなＯＭＶを用いて免疫化することにより抗原特異的な機能性抗体が誘導されることが実証されたので、本発明者らは、最後に、免疫化することにより抗原特異的な防御免疫も誘導することができるかを問うた。これを試験するために、５週齢の雌ＣＤ１マウスを、０日目、２１日目および３５日目に、アラム水酸化物中に処方したＳｌｏまたはＳｐｙＣＥＰのいずれかを有するＯＭＶ２５μｇを含むワクチン処方物を腹腔内に用いて免疫化した。陽性対照として、マウスを、アラム水酸化物に吸収させる直前に超音波処理したＳｌｏを有するＯＭＶおよびＳｐｙＣＥＰを有するＯＭＶを２５μｇで用いて、ならびに全てアラム水酸化物中に処方したＭ１株由来の組換えＳｌｏ、組換えＳｐｙＣＥＰおよび組換えＭタンパク質（各２０μｇ）を用いても免疫化した。３回目の免疫化の３週間後に、マウスを、約２．５Ｅ＋０６ＣＦＵのＭ１ ３３４８株を含有する細菌懸濁物２００μｌを腹腔内に用いて感染させた。マウスを処置後６日間毎日モニターし、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｐｏｌｉｃｉｅｓに従ってこの試験のために予め確立した、定義された人道的エンドポイントを示したところで安楽死させた。

群当たりマウス８匹を用いた実験からのデータが報告されている図１４に示されているように、Ｓｌｏを有するＯＭＶおよびＳｐｙＣＥＰを有するＯＭＶにより、超音波処理していない場合、それぞれ８７．５％および７５％の防御がもたらされ、ＯＭＶをアラムへの吸収前に超音波処理し、免疫化した場合に得られた８７．５％および１００％の防御値とほぼ同等であった。この防御は、アラムに吸収させた組換えＳｌｏを用いて得られた防御およびアラムに吸収させた組換えＳｐｙＣＥＰを用いて得られた防御とも同様であり（それぞれ８１．３％および８７．５％）、これは、組換えＯＭＶがＳｌｏおよびＳｐｙＣＥＰをおよそ０．２〜０．４μｇ有し、これは組換えＳｌｏおよび組換えＳｐｙＣＥＰを用いた免疫化のために使用されるもののおよそ１００分の１であることを考えると注目すべき結果である。

実施例１２ ＯＭＶの内腔内でＳｐｙ０２６９およびＳｌｏ−ｄｍを発現させるためのバイシストロン構築物、Ｓｐｙ０２６９、ＳｌｏおよびＳｐｙＣＥＰを発現させるためのおよびトリシストロン構築物の作製
バイシストロン構築物を作製するために、ｓｌｏ−ｄｍ遺伝子およびｓｐｙ０２６９遺伝子をｐＥＴ−２１＿ｓｌｏおよびｐＥＴ−２１＿ｓｐｙ０２６９からそれぞれｓｌｏ−ｆｕｓ−Ｆ／ｓｌｏ−ｆｕｓ−Ｒ３およびＳｐｙ０２６９−ｆｕｓ３／Ｓｐｙ０２６９−Ｒプライマーを使用して増幅した。生じた断片をリン酸化し、ライゲーションし、ＰＩＰＥクローニング法［１２３］を使用してｐＥＴ−ＯｍｐＡプラスミドにクローニングし、それによりｐＥＴ−ｓｌｏ＋ｓｐｙ０２６９プラスミド（配列番号３８）を作製した（図１５Ａ）。

Ｓｌｏ−ｄｍタンパク質およびＳｐｙ０２６９タンパク質を、同じＴ７プロモーターの下でｐＥＴ−ＯｍｐＡプラスミドにクローニングして、バイシストロン構築物を作製した。ＯｍｐＡリーダー配列を各遺伝子の上流にクローニングし、その発現がその後に生成されるＯＭＶの内腔に向けられるようにした（以下を参照されたい）。

トリシストロン構築物を作製するために、ｐＥＴ−ｓｐｙ０２６９＋ｓｌｏプラスミドを、ｎｏｈｉｓｆｌａｇ／Ｓｐｙ０２６９−ｆｕｓ−Ｒプライマーを用いて増幅し、ｓｐｙｃｅｐ遺伝子をｐＥＴ−２１＿ｓｐｙｃｅｐプラスミドからｓｐｙｃｅｐ−ｆｕｓ−Ｆ／ｓｐｙｃｅｐ−Ｒ３プライマーを使用して増幅し、ＰＩＰＥクローニング法を用いてプラスミドにクローニングした。生じた断片をリン酸化し、ライゲーションし、ＰＩＰＥクローニング法［１２３］を用いてｐＥＴ−ＯｍｐＡプラスミドにクローニングし、それによりｐＥＴ−ｓｌｏ＋ｓｐｙ０２６９＋ｓｐｙｃｅｐプラスミドを作製した（図１５Ｂ）。

タンパク質誘導およびＯＭＶの調製のために、生じたプラスミドをΔｏｍｐＡ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１変異体株および野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１変異体株に形質転換した。１ｍＭのＩＰＴＧを培養物に加えることにより、クローニングされた遺伝子の発現を誘導した。全溶解物に対してウエスタンブロットを実施して、タンパク質の発現を検証した。図１６ＡのパネルＩおよびパネルＩＩは、バイシストロン構築物およびトリシストロン構築物からのクローニングされたタンパク質の全てがＩＰＴＧを用いた誘導後に発現されたことを示す。

上記の通り、バイシストロン構築物を含有するΔｏｍｐＡ株および野生型株からＯＭＶを調製した。図１６Ｂのウエスタンブロットの結果は、Ｓｌｏタンパク質とＳｐｙ０２６９タンパク質の両方がＯＭＶ内で発現され、存在することを示す。

ｓｐｙ０２６９（ＧＡＳ４０）のバリアント配列が配列番号４３〜６９に提供される。ｓｐｙＣＥＰ（ＧＡＳ５７）のバリアント配列が配列番号７１〜７５に提供され、解毒したまたは酵素的に不活性な変異体（ＧＡＳ５７ Ｄ１５１Ａ−Ｓ６１７Ａ）が配列番号３９および配列番号４０に提供される。ｓｌｏ（ＧＡＳ２５）Ｗ５３５Ｆ−Ｐ４２７Ｌ二重変異体が配列番号４１および配列番号４２に提供される。

Claims (36)

1. グラム陰性菌由来の外膜小胞（ＯＭＶ）であって、前記ＯＭＶは、内腔内において遊離している少なくとも１種の異種タンパク質を含み、前記異種タンパク質が可溶性タンパク質であり、そして前記ＯＭＶは、哺乳動物に投与されると、前記異種タンパク質に対する免疫応答を惹起することができる、外膜小胞。
2. 前記異種タンパク質が前記ＯＭＶの内腔内で機能的に活性である、請求項１に記載のＯＭＶ。
3. 前記免疫応答が抗体免疫応答である、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＯＭＶ。
4. 請求項１〜２のいずれか一項に記載のＯＭＶを調製する方法であって、前記グラム陰性菌のペリプラズムにおいて前記異種タンパク質を発現させるステップを含む、方法。
5. 前記異種タンパク質を、ペリプラズムタンパク質のシグナル配列をコードする核酸に作動可能に連結した前記異種タンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを使用して前記グラム陰性菌のペリプラズム内で発現させる、請求項４に記載の方法。
6. 前記異種タンパク質の天然のシグナル配列が前記ペリプラズムタンパク質のシグナル配列で置き換えられている、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＯＭＶを単離するステップをさらに含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法によって得られたまたは得ることができるＯＭＶ。
9. 前記グラム陰性菌が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、およびＳｈｉｇｅｌｌａ種からなる群より選択される、請求項１〜３または８のいずれか一項に記載のＯＭＶ。
10. 前記グラム陰性菌が、前記グラム陰性菌の過剰ブレブ形成株である、請求項１〜３、８または９のいずれか一項に記載のＯＭＶ。
11. 前記グラム陰性菌がΔｔｏｌＲ Ｅ．ｃｏｌｉ株またはΔｏｍｐＡ Ｅ．ｃｏｌｉ株である、請求項１０に記載のＯＭＶ。
12. 前記異種タンパク質が抗原である、請求項１〜３または８〜１１のいずれか一項に記載のＯＭＶ。
13. 前記異種タンパク質が異種生物体内の細胞質タンパク質またはペリプラズムタンパク質である、請求項１〜３または９〜１２のいずれか一項に記載のＯＭＶ。
14. 前記異種タンパク質が異種生物体内の膜結合タンパク質であり、膜アンカーが欠失している、請求項１〜３または９〜１２のいずれか一項に記載のＯＭＶ。
15. 前記異種タンパク質が、βラクタマーゼ（ＴＥＭ１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来のｆＨｂｐ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯの二重変異体（Ｓｌｏ−ｄｍ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞エンベロープセリンプロテアーゼＳｐｙＣＥＰ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質Ｓｐｙ０２６９である、請求項１〜３または９〜１４のいずれか一項に記載のＯＭＶ。
16. 前記ＯＭＶが、内腔内において遊離している少なくとも２種の異種タンパク質を含む、請求項１〜３または９〜１５のいずれか一項に記載のＯＭＶ。
17. 前記ＯＭＶが、内腔内において遊離している少なくとも３種の異種タンパク質を含む、請求項１６に記載のＯＭＶ。
18. 前記異種タンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯの二重変異体（Ｓｌｏ−ｄｍ）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質Ｓｐｙ０２６９を含む、請求項１６または１７に記載のＯＭＶ。
19. 前記異種タンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯの二重変異体（Ｓｌｏ−ｄｍ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞エンベロープセリンプロテアーゼＳｐｙＣＥＰ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質Ｓｐｙ０２６９を含む、請求項１７に記載のＯＭＶ。
20. 前記グラム陰性菌が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、およびＳｈｉｇｅｌｌａ種からなる群より選択される、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記グラム陰性菌が、前記グラム陰性菌の過剰ブレブ形成株である、請求項４〜７または２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記グラム陰性菌がΔｔｏｌＲ Ｅ．ｃｏｌｉ株またはΔｏｍｐＡ Ｅ．ｃｏｌｉ株である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記異種タンパク質が抗原である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記異種タンパク質が異種生物体内の細胞質タンパク質またはペリプラズムタンパク質である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記異種タンパク質が異種生物体内の膜結合タンパク質であり、膜アンカーが欠失している、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記異種タンパク質が、βラクタマーゼ（ＴＥＭ１）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ由来のｆＨｂｐ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯの二重変異体（Ｓｌｏ−ｄｍ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞エンベロープセリンプロテアーゼＳｐｙＣＥＰ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質Ｓｐｙ０２６９である、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記ＯＭＶが、内腔内において遊離している少なくとも２種の異種タンパク質を含む、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記ＯＭＶが、内腔内において遊離している少なくとも３種の異種タンパク質を含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記異種タンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯの二重変異体（Ｓｌｏ−ｄｍ）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質Ｓｐｙ０２６９を含む、請求項２７または２８に記載の方法。
30. 前記異種タンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞外コレステロール依存性ストレプトリジンＯの二重変異体（Ｓｌｏ−ｄｍ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞エンベロープセリンプロテアーゼＳｐｙＣＥＰ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の推定表面排除タンパク質Ｓｐｙ０２６９を含む、請求項２８に記載の方法。
31. （ａ）請求項１〜３または８〜１９のいずれか一項に記載のＯＭＶと、（ｂ）薬学的に許容されるキャリアとを含む薬学的組成物。
32. 免疫原性組成物である、請求項３１に記載の薬学的組成物。
33. ワクチンである、請求項３１または請求項３２に記載の薬学的組成物。
34. 哺乳動物において異種タンパク質に対する免疫応答を生じさせるための組成物であって、前記組成物は、グラム陰性菌由来のＯＭＶを有効量で含み、前記ＯＭＶが内腔内に少なくとも１種の異種タンパク質を含み、前記異種タンパク質が可溶性タンパク質であり、前記免疫応答が前記ＯＭＶ内の前記異種タンパク質に対するものである、組成物。
35. 哺乳動物において異種タンパク質に対する免疫応答を生じさせるための組成物であって、前記組成物は、請求項１〜３もしくは８〜１９のいずれかに記載のＯＭＶ、または請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の薬学的組成物を有効量で含み、前記免疫応答が前記ＯＭＶ内の前記異種タンパク質に対するものである、組成物。
36. 療法において使用するための、請求項１〜３もしくは８〜１９のいずれか一項に記載のＯＭＶを含む組成物、または請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。