PT93876B

PT93876B - Processo para a preparacao de poliaminas e de polipeptideos uteis como antagonistas de neurotransmissores de aminoacidos excitadores e/ou como bloqueadores de canais de calcio

Info

Publication number: PT93876B
Application number: PT93876A
Authority: PT
Inventors: Nicholas Alex Saccomano; Robert Alfred Volkmann
Original assignee: Pfizer; Natural Product Sciences Inc
Priority date: 1989-04-28
Filing date: 1990-04-26
Publication date: 1996-09-30
Also published as: DD293959A5; ATE131813T1; CN1038931C; NO901881D0; YU84590A; IL112522A; CS215790A3; JP2747279B2; IE901496L; JPH09118693A; KR920007554B1; ZA903229B; PT93876A; CA2194103C; JPH07165793A; ES2081929T3; AU5453590A; CZ283830B6; JPH09118692A; CN1136960A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

Este invento diz respeito a um processo para a preparação de certas poliaminas s polipeptídeos que se observou estarem presentes no veneno da. aranha. Aqelenopsis aperta, e que tam uma das fórmulas:

apresenantagonizam neurotransmissores de neurotransmissores esses que afectam nismos. e são úteis em anta.aonizarem no controlo de pragas de invertebrados. Os invento e uma das referidas poliaminas e os os referidos canais de cálcio em células de são úteis no bloqueio das referidas doenças

As poliaminas referidas neste invento e os seus sais aminoácidos excitadores, as células de vários orgaos referidos neurotransmissores, per se, no tratamento de doenças e condições interpostas ou mediadas por neurotransmissores de aminoácidos excitadores e polipeptídeos deste seus sais bloqueiam vários organismos e ou condições interpostas ou mediadas por canais de cálcio e no controlo de pragas de invertebradas. Este invento também diz respeito a um processo para a preparação de composições compreendendo as referidas poliaminas, polipeptídeos e seus sais.

□ referido processo de preparação consiste, por exemplo, em se partir de veneno de Aqelenopsis aperta, o qual é submetido a eluição sob condições adequadas numa coluna cromatográfiaca, seguido de recolha da fracção apropriada. Mediante a selecção das condições de eluição é possível obter cada um dos compostos anteriormente referidos.

a certas

Este invento diz respeito a. certas polia.minas e polipeptídeos que se observou estarem presentes hd veneno da aranha ftqelenopsis aperta. As poliaminas e os seus sais f armaceu.ticamente aceitáveis antagonizam amino ácidos excitatórios neurotransmissores, cujos neurotransmissores afectam células incluindo células neuronais de uma variedade de organismos incluindo invertebrados e vertebrados. Os polipeptideos e uma das referidas poliaminas e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis bloqueiam canais de cálcio em células de vários organismos incluindo invertebrados e vertebrados. Este invento diz também respeito ao uso de tais poliaminas e seus sais amino ácidos excitatórios neurotransmissores, cujos neurotransmissores afectam células tal como células no sistema nervoso de um organismo, per se, no tratamento de doenças e condições interpostas ou mediadas por amino ácidos excitatórios neurotransmissores e no control de pestes invertebradas, e a composições compreendendo as referidas poliaminas e os seus sais no bloqueio de canais de cálcio em células tal como células do sistema nervoso e muscular de um organismo, per se, no tratamento de doenças e condições interpostas ou mediadas por canais de cálcio num mamifero, e no control de pestes invertebradas, e a composições compreendendo os referidos polipeptideos, poliaminas e seus sais.

Foi assinalado que o veneno da aranha ftqelenopsis aperta contem pelo menos duas toxinas as quais afectam as correntes de cálcio. Jackson, H. , et al., Soc. Neu. Sei. Abstr. 12:1078 (1987). Estes autores divulgam uma toxina, referida como AG2, a qual tem um peso molecular inferior a 1000 dal tons e parece íl ém suprimir correntes de cálcio numa ampla gama de tecidos.

disso, Jackson, H., et al., Soc. Neu.» Sei. Abstr. 12:730 (1986) apresentam outra toxina da Aqelenopsis aperta compreendendo um componente de cerca de όΟΟΘ P.M. (M.W.). Esta como efectuando o bloqueio pre-sinápticc< da sido sugerido que a toxina bloqueia os canais dos com a libertação de neurotransmissor.

toxina é assinalada transmissão e tem de cálcio associaOs compostos que são antagonistas de amino ácidos excicatórios neurotransmissores tem uma variedade de utilidades. Os antagonistas de amino ácidos excicatórios neurotransmissores podem encontrar aplicação clinica no tratamento de condições tal como apoplexia, enfarte de miocárdio, isquemia cerebral, desor— dens de degeneração neuronal tal como doença de Alzheimer e epilepsia tal como psicoterapeuticos, entre outras. Ver Excicatory Amino Acids in Health and Disease, D. Lodge, Ed., John Wiley and Sons Ltd., New York, NY 1988, os ensinamentos da qual são aqui incorporados para referencia. Além disso, tais compostos são uteis no estudo da fisiologia das células tal como células neuronais e no control de pestes invertebradas.

Qs compostos que são antagonistas ao cálcio tem urna variedade de utilidades. Qs antagonistas ao cálcio podem encontrar aplicação clinica no tratamento de condições tal como angina, hipertensão, cardiomi.opatias, arritmias supraventriculares, acalásia esofaqeal, parto prematuro e doença de Raynaud entre outras. Ver W. G. Nayler, Calcium Antaqonists, Academic Press, Harcourt Brace Javanovich Publishers, New York, NY 1983, > os ensinamentos da qual são aqui incorporados para referencia. Além disso, tais compostos são uteis no estudo da fisiologia das células tal como células neuronais e no control de pestes tebradas.

inver-

Este invento diz respeito a certas poliaminas e poli peptídeos que se observou estarem presentes no veneno da aranh Aqelenopsis aperta» As poliaminas deste invento e as fracções na quais elas estão presentes de acordo com este invento são a seguintes.

Fracção

A' (AGEL 452 ) :

HO

Fracção A^ (AGEL. 463)

Fracção A<-, (AGEL 443):

Fracção (AGEL 504):

FAB MS: alta resolução: 505,3361 calo, para C₇₇H_4gN_AO_?.

I

Fracção E (AGEL 439):

H

Os pol ipeptí cSeos deste invento e as fracções nas quais eles estão presentes de acordo com este invento são as seguintes,

Fracção G:

Uma sequência amino ácido amino terminal compreende; H,_,N-glu-lys~gly~leu-pro-glu.-gly-ala-glu-cys-asp~gly~ asn-g1u-ser-asp-cys-1ys-a1a-g1y-gln-trp-ile-lys-cysarg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly—glu-gly-procys-thr-cys-g lu-arg-g 1 y-leu-1 ys-1 ys-thr-cys-i le-sev— lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-; peso molecular para, o pol ipeptídeo total de acordo com FAB MS: 7267.

Fracção H_o:

Uma. sequência amino ácido amino terminal compreende;

H^N-a1a-1ys-a1 a-1eu-pro-pro-gly-ser—va1-cys-asp-g1y-asn-qlu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-q1y-1ys-trp-his-1ys-cys— arg-cys-pro-trp-lys-trp-lys-trp-his-phe-thr-gly-glu-g1y--pro--cys-t.hr—cys-g 1 li- 1 ys-g 1 y-met-1 ys-his-thr-cys-i 1 e— thr-1ys-1eu-his-cys-pro-asn-1ys-ala-g1u-trp-g1y-1eu-asp-trp-; peso molecular para o polipeptídeo total de acordo com o Atomizador de Ião MS: 7793.

)

Fracção I:

H₂N-asp~cys~va1-g1y-g1u-ser-g1n-g1n-c ys-a1a-asp-trρ-ala-gly-pro-his-cys-cys~asp~g1 y-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg— tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val—asn-asn-CONI-L-,: FAB MS: 4158.

-8Fracção J:

H^N-asp-glu-pro-cys-i1e-pro-1eu-g1y-1ys-ser-cys-ser-trp~lys-ile-g1y-thr-pro-tyr-cys-cys-pro-his-asp-ala-gly— arg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg-phe-val-thr-:i. le-cys-ser-g 1 y-arg-1 ys-tyr-CONH_? ; peso molecular para o polipeptídeo total de acordo com FAB MS: 5506.

Fracção :

Urna sequência amino ácido terminal compreendendo:

H^M-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-i le-g1η-1ys-1ys-g1y-g1y-phe-asp—; peso molecular aproximado para o polipetideo total de cerca de 20000.

Fracção L^,:

Um polipeptídeo obtido como descrito no Exemplo 9,

Fracção M:

Urna sequência amino ácido terminal compreendendo:

H^N—g 1 u-ala-thr-g lu-a. 1 a-ala-lys-val-leu-ser-asn-l eu-asp-glu-thr-val-asp-pro-; peso molecular aproximado para o polipetideo total de cerca de Q0000.

As poliaminas deste invente e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis antagonizam os amino ácidos excitatórios neurotransmissores, cujos neurotransmissores afectam as células. Assim, as referidas poliaminas são úteis para antagonizarem os

-9referidos neurotransmissores, per se. As poliaminas deste inventa sãa também úteis no contrai de pestes invertebradas e no tratamento de doenças e condições num mamífero mediadas ou interpostas por amino ácidos excitatórios neurotransmissores. As referidas poliaminas são úteis, também, como terapêuticos psíquicos para um mamífero.

A poliamina Bp anterior, e os polipeptídeos deste invento bloqueiam os canais de cálcio nas células. Assim, a referida poliamida B^ e os pol ipepítídeos são úteis no bloqueio de canais de cálcio nas células, per se. A referida poliamida B^ e os referidos polipeptídeos são também úteis no control de pestes invertebradas e no tratamento de doenças e condições num mamífero mediadas ou interpostas pela função canal de cálcio nas células.

Também dentro do âmbito deste inventa estão os polipeptídeos que tem substancia.lmente a. mesma sequência amino ácido e substancialmente a mesma actividade de bloqueio do canal de cálcio como os polipepitídeos acima descritos.

Este invento também diz respeito a composições farmacêuticas compreendendo as referidas poliaminas e polipeptídeos e métodos de admnistração das referidas poliaminas e polipeptídeos.

veneno é obtido a partir da aranha Aqelenopsis aperta através do processo de ordenha por estimulação eléctrica de acordo com métodos ptadrão bem conhecidos dos especialistas da arte, Prefere—se que o método empregado seja um que salvaguarde contra a contaminação global do veneno por regurgitação abdominal ou hemolinfo. Tais métodos são bem conhecidos dos especialistas da arte. 0 veneno global assim obtido é armazenado em estado de congelação a cerca de ~78'^:'C, até ser usado para, purificação como a seguir descrito.

A purificação dos constituintes do veneno global é acompanhada por cromatografia liquida de fase inversa de alta resolução (HF'LC) numa variedade de colunas preparativas e semiR

-preparativas tal como as colunas C-4 e C-18 Vydac (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn Massachutts ©1801). A detecção dos picos é detectada a 220-23© nm. A análise adicional das fraeções pode ser efectuada com., por exemplo, dados policromáticos UV recolhidos com um diodci detector de fileiras Waters 99© (Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachussets ©1757). As fraeções das colunas são recolhidas por métodos conhecidos tal como através do uso de um colector de traeções ISCO/FOXY e um detector de picos ISCO 2159 (ISCO, 47©© Superior, Lincoln, Nebraska 685©4>. As fraeções são recolhidas em vasos apropriadamenta dimensionadas tal como à base de polietileno estéril de laboratório. A concentração das fraeções é a seguir efectuada por liofi1ização do efluente seguida per liofilização a partir de água. A pureza das fraeções constituintes resultantes pode ser a seguir determinada por análise cromatográfica usando uma coluna analítica com um sistema, gradiente o qual é mais isocrático do que o sistema usado na purificação final das fraeções.

As estruturas comprendida.s nas respectivas fraeções são determinadas de acordo com métodos analíticos conhecidos tal como por espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear. 0 polipeptídeos deste invento são sequênciados por métodos conhecidos. For exemplo, a. S-piridil-etila.ção dos resíduos de cistiria do polipeptídeo em estudo pode ser efectuada em solução após a •sequência do amino ácido do polipeptídeo· Um tal processa para a S-piridiletilação é como se seque. Cerca de 1 a 10 qg de polipeptídeo é dissolvida ou diluida em até 50 qg de um tampão preparado por mistura de de 1 parte TrisHCl IM, pH 8,5 contendo EDTA 4 mM e 3 partes de guanidina.HC1 SM. A seguir, juntamos 2,5 μΐ de 2-mercaptoetanol aquoso a 10% e a mistura é incubada à temperatura ambiente no escuro sob árgon durante duas horas. Após incubação, juntamos 2 q.l de 4-vin.ilpiridina (reagente fresco armazenado sob árgon a -20*C.) e a mistura é incubada durante mais duas horas à temperatura ambiente no escuro sob árgon. A mistura é a seguir dessalinizada, de preferencia por cromatografia numa coluna pequena, de fase inversa. 0 polipeptídeo alquilado recolhida ê a seguir sequênciadao de acordo com métodos conhecidos.

Na prática deste invento e empregando o processo geral acima apresentado, observou-se que uma coluna apropriada para fraccionamento inicial do veneno é uma coluna C-18 Vydac^ 22 nm r,

250 nm, 300 A de qranulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas. A coluna é eluida usando um programa de gradiente linear 95% -> 80% A,

20% B C0 -> 30 min. 3 e a seguir 80% -> 30% A, 20% com um caudal de 15 ml/min.

_;··· 70%

BC30 --> 55 min . 3 onde A é ácido trifluoroacético aquosos a 0,1

/. (TFA) e B é acetoni tri 1 o. As fracçSes são recolhidas como acima descrito. A seguir assim obtidas, etiquetadas A, B, E, G, Η, I, J, K, L. e M, foram escolhidas para análise posterior e/ou purificação. Adicionalmente, observou—se que o fraceionamento de todo o veneno usando uma coluna C-18 Vvdac^ 22 nm

250 de (granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas. A coluna é eluida com um caudal de 15 ml/min. usando um programa gradiente linear 5% R, A -> 10% B, 95%, R, A -> 90% A [0

R, h -> 30 min.3 onde A e B são com os rendimentos como acima

-12descritos, inter alia, unia fracção aqui etiquetada A'. Os tempos de eluição das fracções são apresentados a seguir nos Exemplos 1 e 2.

As fracçSes A, B, G, H, I/J e L são submetidas a purificação adicional usando uma variedade de colunas e programas gradiente. As características especificas para cada subfracção e os seus resultados são apresentados nos Exemplos 3, 4, 6, 7, 8 e 10 a seguir.

Como se mostra nos Exemplos a seguir, as FracçSes A', Aj , A-,, Ei, B._, e E compreendem compostos poliamina. Aqueles compostos e as fracçSes nos quais eles são observados são os seguintes.

Fracção A'(AGEL 452):

HO

Fracção A, (AGEL 468):

Fracção Bj (AGEL 505):

H

NFracção B-> (AGEL 504)

FAB MS;

a1 ta reso1ução: 505

361 calc. para ^C27^H4S^N6°5

Fracção E (AGEL 489):

Ο

Os polipeptídeos deste invento e as fracções nas quais eles estão presentes de acordo com este invento são as seguintes»

Fraeção G:

Uma sequência amino ácido antino terminal compreende:

H_oN-glu-1ys-g1y-1eu-pro-glu-gly-ala-glu-cys-asp-glyasn-glu-ser—asp-cys-lys-ala-gly-gln-trp-i1e-lys-cysarg~cys-pro~trp~lys-trp-his~ile-thr-gly~qlu-g1y-procys-thr-cys-glu-arg-gly-1eu-lys-lys-thr-cys-i 1e-ser1ys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-ssn-glu-trp-1eu-ser-; peso molecular para o pol .ipeptídeo total de acordo cdíti FAB MS: 7267.

Fraeção H,-,:

Uma sequência amino ácido amino terminal compreende:

Ης,Ν-al a-1 y s-a 1 a-1 eu.-pro-pro-q 1 y-ser-va 1 -cys-asp-g 1 y-asn-g1u-ser-ssp-eys-1ys-eys-tyr-g1y-1ys-trp-his-lys-cys— arg-cys-pro-trp-lys-trp-lys-trp-his-phe-thr—gly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-lys-g1y~met~lys-his-thr-eys-ile—

-15thr-1ys-1eu-his-cys-pro-asn-1ys-a1a-g1u-trp-g1y-1eu-asp-trp-; peso molecular para o polipeptídeo total de acordo com o Atomizador de Ião MS: 7793.

Fracção I:

H^M-asp-cys-val-g1y-glu-ser-gIn-gln-cys-a1a-asp-trp-ala-qly-pro-his-cys-cys-asp-g1y-tyr-tyr-cys-thr—cys-arg— tyr-phe-pro-lys-cys-i le-cys-val-asn-asn-CONH,-,: FAB MS: 4153.

Fracção J:

H^N-asp~glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys~ser-trp~lys-ile-gly~thr-pro-tyr-cys-cys-pro-his-asp-ala-gly— arg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg-phe-val-thr-i le-cys-ser-g 1 y-arg-lys-tyr-CDNI-L,; peso molecular para o polipeptídeo total de acordo com FAB MS: 55©ó.

Fracção L:

Uma sequência amino ácido terminal compreendendo: 1 e-va 1 —g 1 y-gly-lys-thr-ala-1ys-phe-g 1 y-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-i1e-gln-1ys-1ys-g1y-g1y-phe-asp-; peso molecular aproximado para o polipetideo total de cerca de 2©0€>0.

Fracção L_r,:

Um polipeptídeo obtido como descrito no Exemplo 9.

Fracção M:

Uma sequência, amino ácido terminal compreendendo: H^N-glu-a 1a-thr-glu-a1a-a1 a-1ys-va1-1eu-sei—asn -1eu-asp-glu-thr-val-asp-pro-; peso molecular aproximado para o polipetideo total de cerca de 8©€>©Θ.

Dado o beneficio da divulgação aqui apresentada em relação aos compostos presentes nas fracçoes do veneno de fíqelenopsis aperta, é· agora possível obter os referidos compostos por outros métodos além dos de isolamento/purificação do veneno global., Todos estes métodos estão dentro do âmbito deste invento. Por exemplo, as poliamidas que são formadas por fracçSes A', A^ , métodos

B_? e E podem ser fabricadas directamente por sintéticos. Os polipeptídeos que são formados por fracçSes 8,

I, J, Lj, e Me para os quais se descreve a sequência amino ácido total podem ser produzidos sinteticamente por síntese de proteínas in vit.ro de acorda com métodos bem conhecidos. Por exemplo, tais polipeptídeos podem ser sintetizados usando um sintetizadar de peptideos em fase sólida ABI 430A (Applied Biosystems, Inc., 85© Lincoln Center E>rive, Foster City, Califórnia 94404) empregando métodos químicos Merrifield padrão ou outras químicas de fase sólida bem conhecidas dos especialistas da arte. Qs polipeptídeos podem também ser produzidos usando técnicas DMA recombinantes por identificação de sequências de código para os polipeptídeos ou suas porções. Qs polipeptídeos só se conhece parte da sequência amino ácido podem ser classificados, por exemplo, através do uso de sondas de hibridização as qu.ais tiram vantagem da informação sequencial amino ácido agora conhecida. A combinação das técnicas DMA recombinante sintese de proteínas in vitro pode também ser empregada produzir os polipeptídeos deste invento.

e a para

έ bem conhecido na arte que certas substituições amino ácido podem ser feitas em polipeptídeos as quais não afectam, ou não afectam substancialmente, a função dos referidos polipeptídeos. As substituições exactas que são possíveis variam de polipeptídeo para polipeptídeo. A determinação das substituições permissiveis é efectuada de acordo com processos bem conhecidos dos especialistas da arte. Assim, todos os polipeptídeos tendo substancialmente a mesma sequência amino ácido e substancialmente a mesma actividade de bloqueio do canal de cálcio estão de;ntro do âmbito deste invento.

Um esquema sintético para produção de certas poliaminas deste inventa de fórmula

em que R é H ou OH, a seguir.

é apresentado nos Esquemas Reaccionais A a D, )

18ESQUEMA REACCIONAL A

H₂N-^—^\x^^NH2 + NC^> -►

H

X (III) (BOCJ ₂O ▼

BOC *

BOC (V)

BOC

I

N\_

N-BOC

H (VI) (BOC)₂O

BOC

I

BOC

I

BOC

H (VII)

BOC BOC

BOC

I

BOC

I

BOC

N-BOC

H )

(X)

-19ESQUEMA REACCIONAL B

(XI)

BOC (XII)

BOC (XIII) )

ESQUEMA REACCIONAL C

OCH₂OCH₃

h₃c_x

H₃C^x

NH

N·

H

(XX)

(XXII) (XIX)

OCH₂CH=CH₂ (XXI)

1ESQUEMA REACCIONAL D + XIII or . XXII χ

N

H

N^z

H (XXIV )

N-BOC

H nh₂ nh₂

ESQUEMA REACC IOiMAL E

(XXVI)

ESQUEMA REACCIONAL F

(XXIX)

(XXXI)

(XXX)

ESQUEMA REACCIONAL G

XXVIII or XXXI -

(XXXII) or

N-BOC

H

N-BOC

H (XXXIV) or

(XXXV)

ESQUEMA REACCIONAL G (cont.) (XXXIV) ΟΓ (XXXV)

(XXXVI) or

(XXXVII) as

ESQUEMA REACCIONAL H

BOC

(XXXVIII)

XXXVIII + XXII

BOC (XXXIX)

BOC (XL)

(XL')

:θDe acordo com o Esquema Reaccional A, □ composto intermediário poliamina de fórmula X é preparado através de uma sequência de etapas começando com diaminobutano. As condições de reacção próprias para preparar o composto intermediário de fórmula X de acordo com o Esquema Reaccional A são dadas no Exemplo 11, partes A a I, □ Esquema Reaccional B ilustra um método para a preparação do composto intermediário de fórmula. XIII. As condições de reacção próprias para preparar o intermediário de acordo com o Esquema Reaccional B são dadas no Exempla 11, partes □ a !_. A preparação cio composto intermediário de fórmula XXI é apresentada rio Esquema Reaccional C. As condições ds reacção próprias para preparar o composto intermediário de fórmula XXI de acordo com o Esquema Reaccional C são dadas no Exemplo 12, partes A a F. A preparação cios compostos poliamina deste invento de fórmulas XVI e XXV é apresentada no Esquema Reaccional D, As ccndiçSes de reacção próprias para o acoplamento dos compostos intermediários de fórmulas X e XIII ou X ε XXII e a preparação subsequente dos compostos de fórmulas XVI e XXV são dadas no Exemplo 11, pa.rters M a 0 e Exempla 12, partes G a I.

esquema reaccional E e F ilustram métodos para a preparação dos compostos intermediários XXVIII e XXXI respectivamente. As condiçSes da reacção próprias para preparar o intermediário de acordo com o Esquema. Reaccional E são dadas no Exempla 13, partes A a C. As condiçSes de reacção próprias para preparar o intermediário de? acordo com o Esquema Reaccional F são darias no Exemplo 14, partes A a C. A preparação dos compostos poliamina deste invento das fórmulas XXXVI ε XXXVII é apresentada na Esquema Reaccional G. As condiçSes de reacção próprias para a ligação dos compostos intermediários de fórmula X e XXVIII ου. X e XXXI e a subsequente preparação dos compostos de fórmulas XXXVI e

-έ/

XXXVII são apresentadas no Exemplo 13, partes D a F e no Exemplo 14, partes D a F, respectivamente.

□ Esquema Reaccional H ilustra um método para a preparação de um composto poliamina deste invento de fórmula XLI.

As eondiçSes de reacção próprias para preparar o composto intermediário de fórmula XXXVIII, o seu acoplamento ao composto intermediário de fórmula XXII e a subsequente preparação do composto poliamida deste invento de fórmula XLI são dadas no Exemplo 15.

As poliaminas deste invento antagonizam reversivelmente amino ácidos excitatórios neurotransmissores, cujos neurotransmissores afectam células tal como células no sistema nervoso central de uma variedade de organismos incluindo invertebradas e vertebrados. 0 termo vetebrados conforme aqui sempre usado significa incluir, por exemplo, insectos, ectoparasitas e endoparasitas. A poliamida de fracção 5^, como acima descrito, bloqueiam também reversivelmente os canais de cálcio presentes numa variedade de células no sistema nervoso e muscular, incluindo o sistema cardiovascular, de invertebrados e vertebrados.

A capacidade das poliaminas do presente invento para antagonizarem amino ácidos excitatórios neurotransmissores é demonstrada pela sua capacidade em bloquear elavações de cBMF induzidas por ácido N-meti 1 -D-aspártica (NMDA) em cerebelos de ratos neonatais de acordo com o processo seguinte. Os cerebelos de ciez ratos Wistar com 8—14 dias de idade são rapidamente extirpados e colocados a 4 ’-'C. em Krebs/bicarbonato tampão, pH 7,4 e a seguir cortados em secções de Θ,5 mm x 9,5 mm usando um cortador de tecido Mcllwain (The Nickle Laboratory Engineerinq

23Co., Gomshall, Surrey, England). Os prdaços de cerebelo resultante são transferidos para IO© ml de Krebs/bicarbonatD tampão a 37'^:' C. o qual é continuamente equilibrado com 75:5 O^/CO^. Os pedaços de cerebelo são incubados de tal modo du.rante noventa minutos com tres mudanças do tampão. 0 tampão é a seguir decantado, o tecido centrifugado (1 min., 32©© r.p.m.) e o tecido suspenso de novo em 2© ml de Krebs/bicarbonato tampão. A seguir, removemos partes aliquotas de 25© μΐ (aproximadamente 2 mg) e colocamos em tubos de centrifugação de 1,5 ml. A estes tubos juntamos 1© μΐ do composto em estudo tirados de uma solução armazenada seguidos por 1© μΐ de uma solução NMDA 2,5 mM para iniciar a reacção. A concentração final da NMDA é 1©© μΜ. Aos controlos não juntamos NMDA. Os tubos são incubados durante um minuto a 37 *C. num banho de água agitada, e a seguir juntamos 75© μΐ de uma solução Tris-Cl 5© mM, EDTA 5 mM para parar a reacção. Os tubos são imediatamente colocados, durante cinco minutos, num banho de água a ferver. Os teores de cada tubo são a seguir sonicados durante 15 segundos usando uma sonda sonicadora colocada no ponto tres da potência. Removemos dez microlitros e a proteína é determinada pelo método de Lowtv, Anal. Biochem. 1©©:22© (1777). Os tubos são a seguir centrifugados (5 min., 1©©©© xg>, removemos 1©©μ1 da parte sobrenadante e o nivel de GMP cíclico é ensaiado usando um ensaio cGMF' RIA New England Nuclear (Boston, Massac husetts) de acordo com o método de fornecedor. Os dados são apresentados em pmole cGMF' gerados por mg. de proteína.

Os polipeptídeos deste invento bloqueiam irreversívelmente os canais de cálcio presentes numa variedade de células tal como células no sistema nervoso e muscular de invertebrados e vertebrados.

-29A capacidade da poliamina de Fracção e os polipeptídeos de FracçSes S, Hj, H^, I, J, K, Lj, L-, ε M para bloquear os canais de cálcio é demonstrada pelo processo seguinte. Meuroes neocorticais dissociados de ratos são suspensos em bicarbonato tampão de Krebs, pH 7,4 contendo CaCl_? 2 mM e 1% de albumina de soro de boi (BSA). Os neurSes sedimentam por centrifugação e são suspensos no mesmo tampão o qual contem adicionalmente fura 2/AM 1 μΜ (Sigma Chem. Co., P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63179). As células são a seguir lavadas no tampão anterior contendo agora CaCl-, 1,5 mM e equilibradas à temperatura ambiente com uma suspensão de células concentradas durante cerca de 5 a 10 minutos. A uma cuveta de quartzo juntamos 1,2 ml de tampão sem BSA pre-aquecido (37'^:'C) contendo CaCl_o 1,5 mM e glicose 10 mM, e a segu.ir juntamos 0,3 ml da suspensão celular concentrada acima preparada. A cuveta é colocada num suporte termostatizado (37 °C) equipado com um agitador magnético e a fluorescência é medida CDm um espectrofotómetro de fluorescência tal como um Perkin Elmer 650-40 (Perkin Elmer, Wilton, Connecticut 06S97). 0 sinal de fluorescência é deixado estabilizar durante cerca de um minuto. A seguir juntamos è cuveta 1-4 μ.1 de uma solução armazenada do composto em estudo num tampão bicarbonato Krebs com as concentrações apropriadas. A calibração dos sinais fluorescentes e a correcção da fuga de fura-2, são efectuadas usando os processos estabelecidos ou provados de Nemeth, et al., J. Biol. Chem. 262:5ÍSS Í19S7). Após a completação ou acabamento de cada teste, determinamos o valor da fluorescência máxima (Fmax) por adição de ionomicina e o valor de fluorescericia mínimo (Fmin) é determinado por adição subsequente de EGTA 5 mM ao quelato de cálcio. Empregando o processo anterior, o bloqueio do canal de cálcio por u.m composto com propensão para tal prova-se que ocorre por decréscimo na fluorescência após a adição do referido composto.

um

Também dentro do âmbito deste invento estão os polipeptídeos tendo substaneialmente a mesma sequência amino ácido que os polipeptídeos de fraeções G, Η^, I, J, e M e os quais tem substancialmente a mesma actividade de bloqueio do canal de cálcio que os referidos polipeptídeos.

As poliaminas deste invento são úteis na antagonização dos amino ácidos excitatórios neurotransmissores, per se. Por isso, as poliaminas são também no control de pestes invertebradas e na tratamento de doenças e condições num mamífero mediadas ou interpostas por amino ácidos excitatórios neurotransmissores, tal coma apoplexia, enfarte de miocárdio, isquemia cerebral, desordens neuronais degeneradas tal como doença de Alzheimer e epilepsia.. As referidas poliaminas são úteis, também, como terapêuticos psíquicos num mamífero. Além disso, as poliaminas são úteis no estudo da fisiologia das células incluindo, ma.sa não limitadas, as do sistema nervoso.

A poliamina de Fracção B^ , e os polipeptídeos deste invento são úteis no bloqueio dos canais de cálcio nas células, per se. Assim, estes compostos são também úteis no control de pestes invertebradas e no tratamento de doenças e condições num mamífero mediadas ou interpostas pela função canal de cálcio nas células, num mamífero tal como angina, hipertensão, cardiomiopatias, arritmias supraventriculares, acalásia esofagial, parto prematuro e doença de Raynaud. Além disso, estes compostos são úteis no estudo da. fisiologia das células, mas não limitadas a, células do sistema nervoso e do sistema muscular.

Também dentro do âmbito deste invento estão os sais farmaceuticamente aceitáveis das poliaminas e polipeptídeos deste

invento. Tais sais são formados por métodos bem conhecidas das especialistas da arte. Por exemplo, os sais ácidos de adição das poliaminas e sais básicos dos polipeptídeos podem ser preparados ’ de acordo com métodos convencionais.

Quando uma poliamina ou um polipeptídeo deste invento é admnistrado a um mamífero, ele pode ser admnistrado sózinho ou em combinação com suportes ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis

-) numa composição farmacêutica de acordo com práticas farmacêuticas padrão. As poliaminas e polipeptídeos podem ser admnistrados oral ou parenteral men te sendo a. via de admnistração parenteral a preferida para os polipeptídeos. A admnistração parenteral inclui a admnistração intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea e tópica.

Para uso oral de uma poliamina ou polipeptídeo deste inventa, a composto pode ser admnistrado, por exemplo, na forma de pastilhas ou cápsulas, ou como uma solução ou suspensão aquosa. Na casa de pastilhas para uso oral, os suportes que são vulgarmente usados incluem a lactose e o amido de milho, e agentes lubrificantes, tal como estearato de maésio, são vulgarí mente adicionados. Para, admnistração oral na forma de cápsulas, os diluente úteis são a lactose e o amido de milho seco. Quando é necessária uma suspensão aquosa para uso oral, o ingrediente activo junta-se com agente emulsionantes e de suspensão. Se o j desejarmos, certos agentes de adoçamento e/ou fragrantes podem ser adicionados.

Para uso intramuscular, intraperitonea1, subcutâneo e intravenoso, preparamos normalmente soluções estereis do ingrediente activo, e o pH das soluções deve ser apropriadamente ajustado e tamponado. Para uso intravenoso, a concentração total dos solutos deve ser controlada para tornar a preparação isotónica.

Quando uma poliamina ou polipetideo ou seu sal deste invento é usada num ser humano, a dose diária será normalmente determinada pelo doente assistente. Além disso, a dosagem variará de acordo com a idade, peso e resposta do doente individual, bem como da severidade dD5 sintomas do doente e da potência do composto particular a ser admnistrado.

Quando uma poliamina ou polipetideo ou seu sal deste invento é usada no control de pestes invertebradas, o referido composto é admnistrado ao referido invertebrado directamente ou fornecida ao ambiente circundante do referido invertebrado. Por exemplo, um composto deste invento pode ser atomizado como uma solução sobre o referido invertebrado. A quantidade de composto necessária para controlar o referido invertebrado variará de acordo com o invertebrado e condições ambientes e será determinada pela pessoa que aplica o composto.

Quando uma poliamina ou polipetideo ou seu sal deste invento é usada no estudo fisiológico das células, o referido composto é admnistrado às células de acordo com métodos bem conhecidos dos especialistas da arte. F'or exemplo, o referido composto pode ser admnistrado às célu.las num tampão fisiológico apropriado. Uma concentração apropriada dos compostos deste invento para uso em tais estudos é 100 μΜ. Além disso a concentração dos referidos compostos em tais estudos pode ser maior do que ou menor do que 100 μΙΊ. A quantidade de composto admnistrado será determinada pela pessoa especialista da arte de acordo com métodos bem conhecidos.

EXEMPLO 1

Fraccionamento inicial de todo o veneno de ftqelenenopsis aperta foi

2©©

25© μΐ foram diluídas a -> (22 mm :·:

Todo o veneno de flqelgnopsis aperta, obtido a partir de Natural Product Sciences Inc., Salt Lake City, Utah 841©S e o qual foi armazenado no estado congelado a. cerca de ~7S^r-'C., descongelado e porçSes suas de 1© a 6© μΐ, e carregadas numa coluna C-13 Vydac R, Ã r» mm, 3©© R, A -> de tamanho dos poros, 1© μ de qranulometria das partículas) e eluido usando um caudal de 15 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 57. -----> 2©7. B,

R5/Í----> 8©7. A C© ---> 3© min.3 e a seguir 2©7.---> 7©7. B, B©7.

---> 3©7. A C3© ---> 55 min.3 onde A é TFA aquoso a ©,17. e B é acetonitrilo. A detecção dos picos foi efectuada monocromáticamente a 220-23© nm e as fracçôes foram recolhidas com um colector de fracções ISCO/FOXY e u.m detector de picos ISCO 2159. As fracçôes foram recolhidas durante 2© minutas a 6© minutos. Com base na detecção dos picos, recolhemos as fracçôes seguintes:

Fracção

Tempo de Eluição

A	cerca	de	21	minutos
B	cerca	de	22,	75 minuto
E	cerca	de	27,	5 minutos
G	cerca	de	τ m LO	minutos
H	cerca	de	39	minutos
I	cerca	de	4©	minutos
J	cerca	de	40	minutos
L	cerca	de	43	minutos
ΙΊ	cerca	de	49,	3 minutos

EXEMPLO 2

Fraccionamento de todo o veneno de Aqelenencpsis aperta para obtermos a Fracção A'

Todo o veneno de Aqelenopsis aperta foi obtido e o carregado numa coluna C-18 Vydac R, A -> como descrito no

Exemplo 1. A coluna foi eluida usando um caudal de 15 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 57.

----> 107. B, 957.---> 90% A E© ------> 30 min.3 onde A é TFA aquoso a €7,17. e B é acetonitrilo. A detecção dos picos e a recolha da fracção foi efectuada como descrito no Exemplo 1. Obtivemos a fracção A' que eluiu a cerca de 12,5 minutos. A fracção A' foi a seguir preparada para análise espectral por liofilização a partir do eluente seguida por liofilização a partir de água destilada, de acordo com métodos padrão.

A estrutura do composto que é formado pela fracção A' foi a seguir determinada pelo uso de FAB MS. Os dados assim obtidos e a estrutura dai deduzida são os seguintes:

A': FAB MS: M/Z 453 (M+l)

Estrutura: Benzamida, M-(2Ô-amino-4-hidroxi~4,8,12, 17-tetraazeicos-l-il)-4-hidroxi

EXEMPLO 5

Subfraccionamento da fracção A e determinação das suas estruturas

A fracção A, obtida como descrito no Exemplo 1, foi

O carregada numa coluna C-4 Vydac R, A -> ( 1® mm 25® mm, 30®

R, h > de tamanho dos poros, 5 μι de granulometria das partículas) e eluida. usando um caudal de 4,® ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de ®X ------> 1®7. B,

1W®X -----9®7. A, L®---> 3® min.D onde A è TFA aquoso a ®,17. e B é acetortitri lo. A detecção dos picos foi efectuada. usando um diodo Waters 99® detector de fileiras e si recolha das fraeções foi efectuada. como descrito no Exemplo 1. Obtivemos duas fraeções coma se segue:

Fracção

Tempo de Eluição

A} cerca de 7 minutos

A.-, cerca de 9 minutos i As fraeções A^ e A^ foram a. seguir preparadas para análise espectral por 1iofi1icação a partir do eluente seguida por liofilicação a partir de água destilada, de acordo com m é t o d o s p a d r ão.

A estrutura dos compostos que são formadas pelas fraeções A^ e A^ foi a seguir determinada pelo uso de FAB MS. Os dados assim obtidos e as estruturas dai deduzidas são os seguintes:

FAB MS: M/Z 469 (M+l), resolução elevada:

469,3863 calc. para com erro de 2,0 mmp

Estrutura: Eiencamida, N-(2€>-amino-4~hidraxi--4,0 ,

12, 17-tetraazeicos-l-i 1 ) -25-dihidroxi

Α_?:

FAB MS; M/Z 44? CM+1), 433, 37ó, 26®, 2ó® Estrutura; lH~imclole~3-acetamida, N-( ló-am.ino-4hidroxi-4, S, 13-tr iazahexadec-1 -i 1 )-4-hidroxi

EXEMPLO 4

Subfraccionamento da fracção B e determinação das suas estruturas

A tracção B, obtida como descrito no Exemplo 1, foi carregada numa coluna C-4 Vydac R, Â -> (1® mm x 25® mm, 3®® r»

R, A -de tamanho dos poros, 1® μ de granu lometria das partículas) e eluida usando um caudal de 15 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente não linear de 0% ---> 0%

B, 1007, ----> 100% A C0----> 5 miri. 3 , e a. seguir 0% -----> 10% B,

100%---> 90% A E0---> 20 min. 3 (curva Waters 6>, e a seguir 207.

----> 50% B, 80%---> 50% A L30---> 40 min. 3 (curva. Waters 11) , onde A ê TFA aquoso a 0,1% e B é acetonitri1 o. A detecção dos picos foi efectuada usando um diodo Waters 990 detector de fileiras e a recolha das fracçSes foi efectuada como descrito no Exemplo 1. Obtivemos duas fracçSes como se segue:

Fracção Tempo de Eluição

B^ cerca, de 18,5 minutos cerca de 21,5 minutos

As fracçSes foram a seguir preparadas para análise espectral por liofilização a partir do eluente sequida por liofilização a partir de água destilada, de acordo com métodos padrão.

A estrutura do composto que é formado pela fracção B^ foi a seguir determinada pelo uso de FAB MS. Os dados assim obtidos e as estruturas dai deduzidas são os seauintes:

FAB MS: M/Z 506 (M+l), 439, 461, 433, 378, 333, 260, 231, 215, 203, 155, 119 resolução elevada: 506,3810 calc. para Ο-^Η^θΜ-,Ο·, Estrutura: 1H--indo le-3-acetam ida, W-(20-amino-4hi d roxi-4,8,12,17-te t raa z e i cos-1-i1)-4-hid rox i

Ο

Ο peso molecular do composto que é formado pela fracção B^ foi a seguir determinada pelo uso de FAB MS. Os dados assim obtidos e as estruturas dai deduzidas são os seguintes:

H

EXEMPLO 5

Estrutura do composto formado pela fracção E

A fracção E, obtida como descrito no Exemplo 1, foi preparada para análise espectral por liofilização a partir de água de acordo com métodos padrão. A estrutura do composto compreendido na. fracção E foi determinada usando FAB MS, ¹H-NMR e Os dados assim obtidos e a estrutura dai deduzida são os que se seguem:

FAB MS: M/Z 490 CM+1), 472, 433, 362, 333, 260, 215, 203, 177, 155, 119 resolução elevada: 490,3860 calc. para C-^H^qNyO.-, com erro de 0,6 mmp

^-NMR (500 Mh	·“ ?	dó	-DMSO)s	10,39	(s, 1H), 3	Qp- , * V
-7,85 (m, 6H),	7	,55	<d.	J=8,	0 Hz ,	1H), 7,34 (d	, 3 =
8,0 Hz, 1H),	·' t	19 (	s $	1H) ,	7,08	(dd, J=8,0	Hz,
J=8,0 Hz, 1H),	b	,93	(dd	, 3=8	,0 Hz,	3=8,0 Hz,	1H) ,
3,50 (s, 2H>,		13	(m,	2H> ,	3,03	-2,82 (ín, 18H),

1,88 (m, 6H), 1,78 (m, 2H), 1,62 (m, 4H>

¹ 'C-NMP: (125,76 Mhz, dó~DMSO) : 170,94, 136,10,

127,17, 123,75, 120,92, 113,67, 113,26, 111,33,

108,97, 57,39, 57,07, 46,12, 46,12, 44,06, 43,89,

43,39, 36,52, 36,22, 32,73, 26,71, 23,79, 23,06, 22,65, 22,65, 22,45 Estrutura: 1H—indole-3-acetamida, IM-(20-amino-4hidroxi-4,8,12,17-tetraazeicos—1-i1)

H filternativamente e de preferencia, todo o veneno foi fraccionado como descrito no Exemplo 1 excepto qu.e o sistema solvente e o programa de gradiente linear usado foram 07.----> 207.

B, 1007.----> 807. A C0---> 30 min. 3 com detecção dos picos a 220 nm. A fracção que eluiu a cerca de 26,O minutos foi carregada ç>

numa colunô Bynamax Phenyl (4<ó mm x 25Θ mm, 60 R, A -> t;íe granulometria dos poros, 8 μ de tamanho das partículas) e foi eluida usando um caudal de 1 ml/min. e condiçaes isocráticas de 107. B, 907 A onde A e B são como descrito no Exemplo 1. A

-41detecção dos picos foi efectuada usando um diodo detector de fileiras. Waters 990 (R, A -> = 220 nm) e a sfracçSes foram recolhidas como descrito no Exemplo ί. A fracção que eluiu a cerca de 55,27 minutos foi liofilizada a partir do efluente seguida por liofilização a. partir de água de acordo com métodos padrão para obtermos o composto deste Exemplo.

EXEMPLO 6

Subfraccionamento da fracção G

Aí fracção G, obtida como descrito no Exemplo 1, foi carregada numa coluna C-19 Vydac A -> (22 mm x 250 mm, 300 Ã

-----> de tamanha dos poros, 10 μι de granulometria das partículas) e eluida usando um caudal ds 10 ml/min. e um sistema solvente usando um programa, de gradiente linear de 20%---> 307. B, 807.

-----> 707. A C0---> 40 min.l (curva Waters 6) onde A é TFA aquoso a 0,17. e Ei é acetonitrilo. A detecção dos picos foi efectuada usando um diodo Waters 990 detector de fileiras e a recolha das fraeções foi efectuada como descrito no Exemplo 1. A fracção G, após subfraccionamento como acima descrito, foi eluida a partir da coluna durante cerca de 22 minutos. Aquela fracção, que compreende um polipeptídeo, foi a seguir preparada para seqienciação por liofilização a. partir de água de acordo com métodos padrão

A análise amino ácido do polipeptídeo alquilado da fracção foi obtida usando o método de Waters Fico-Tag de acordo com as especificações do fabricante. Ds dados sequenciais foram recolhidos a partir a partir de Applied Biosystems, sequênc: iador model 47vA F'rotein/F'eptide (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln

-42Center Drive, Foster City, Califórnia. 94404) com conversão de TFA aquoso,, A análise dos amino ácidos feni 1 tiohidantoina resultantes foi efectuada em linha com um analisador Applied Biosystems modelo 12©A FTH ou sem estar em linha numa coluna DuPont Zorbai: PTH (Biomedical Product Department, Chromatoqraphy Products, E. I» duPont de Nemours and Co., Inc., 1©©7 Market Street, Wilmington, Delaware 1989S).

Como resultado da análise amino ácido e da FAB MS de todo o polipeptídeo determinou-se que a sequência amino ácido amino terminal de parte do polipeptídeo compreendido pele fracção G foi determinado como se seque:

Η,-,Ν-g lu- lys-q ly- leu-pro-g lu-g ly-ala-g lu-cys-asp-q lyasn-glu-ser-asp-cys-lys-a.la-gly-gIn-trp-i1e-lys-cysarq-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thr-gly-g1u-g1y-procys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-serlys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-; e FAB MS: 72Ó7.

EXEMPLO 7

Subfraccionamento da fracção H e determinação das suas estruturas

A fracção H, obtida como descrito no Exemplo 1, foi.

carregada numa coluna C-1B Vydac A -> (22 mm :< 25© mm, 3©© A

--> de? tamanho dos poros, í© μ de granulometria das partículas) e eluida usando um caudal de 1© ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente não linear de 2©7.---> 257 B, Q©7 .·· 757, A L© ---.> 3© min.3, (curva Watecs 6), e a seguir 2©7.

ζ 5©7. B, 757. > 507. A C3©---> 45 min.3 (curva Waters 11), onde A ê TFA aquoso a ©,1X e B ê acetonitrilo. A detecção picos foi efectuada usando um diodo Waters 99© detector fileiras e a recolha das fracçSes foi efectuada como descrito Exemplo 1. Obtivemos duas fracçSes como se segue:

dos de no l- racção

FU xl

FU 'empo de Eluição cerca de 36 mi nu toc cerca de 41 minutos

As fracçSes FU e H^., que compreendem os pol ipeptídeos foram a seguir preparadas para sequênciação e sequenciadas de acordo com os processos descritos no Exemplo 6.

A sequência amino ácido amino terminal de parte do polipeptídeo compreendido pela fracção FU foi determinado como:

FUN-ala-Tys-ala~leu-pro-pro-gly-ser-val-cys-asp-g1y-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys— arg-cys-pro-trp-lys-trp-lys-trp-his-phe-thr-gly-glu-g1y-pro-cys-thr-cys-glu-1ys-g1y-met-1ys-his-thr-cys-i1e— thr-lys-leu-his-cys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leu-asp-trp-; e o peso molecular para o polipeptídeo total de acordo com o Atomizador de Ião MS: 7793.

EXEMPLO S

Subfraccionamento das fracçSes I e 3 e determinação das suas estruturas

As fracções I e J, obtidas como descrito no Exemplo 1, e as quais não foram adequadamente separadas devido aos tempos de eluição similares como se mostra no Exemplo 1, foram carregada.

em conjunto numa coluna C-4 Vydac A -> (22 mm x 25® mm, 3O0

-----> de tamanho dos poros, 10 μ de granu.lame tr ia das partículas) e eluida usando um caudal de 10 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente nãa linear de 207.----> 307 B, 807

------> 707. A [0 ---> 30 min.j, (cu.rva Waters 6), e a seguir 307.

---> 507. B, 707---> 507 A C30----> 45 min.l (curva Waters 11), onde A é TFA aqu.oso a 0,17 e B é acetonitrilo. A detecção dos picos foi efectuada. u.sando o processa como descrito no Exemplo 6. Das frexçoes recolhidas, as fracçSes de interesse foram as que se seguem:

raccão

Tempo de Eluição

I cerca de 22 minutos

J cerca de 27,5 minutos foram a acordo

As fracçSes I e seguir preparadas com os processes des

J, que compreendem os polipeptídeos para sequênciação e sequênciadas de critos no Exempla 6.

A sequência amino ácido e FAfcí MS do polipeptídeo compreendido pela fracção I foi. determinada como:

-45H^N-asp-cys-val-gly-glu-sec—gln-gln-cys-ala-asp-trp-ala.-gly-pro-his-cys-cys-asp~gly-tyf—tyr-cys-thf—cys-arg— tyr-phe-pro-1ys-cys-ile-cys-val-asn-asn-CONH^: FAB MS: 4158.

A sequência amino ácido amino terminal de parte do palipeptídeo e FAB MS de todo o polipeptídeo compreendida pela fracção J foi determinado como:

H^N-asp-glu-pra-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyr—cys-cys-pro-his-asp-ala-gly— arg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-arg-phe-val-thr-i le-cys-ser—gly-arg-1 ys-tyr—COIMI-L,; e FAB MS: 5506..

EXEMPLO 9

Subfraccionamento da fracção L e determinação das suas estruturas

A fracção L, obtida como descrito no Exemplo 1, foi i“« i”i carregada numa coluna C-18 Vydac A --> <1© mm x 25© mm, 3©© A

-------> de tamanho dos poros, 5 μ de granulometria das partículas) e eluida usando um caudal de 3,5 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente não linear de 257. ----> 4©7. B, 757.

------> 6©7. A C© ---> 3© min.3 onde A é TF A. aquoso a ©,1% e B ê acetonitrilo. A detecção dos picos foi efectuada como descrito no Exemplo 6. Bas fraeções recolhidas, as fraeções de interesse eram:

-46Fracção Tempo de Elu.ição l_i cerca de 20,25 minutos

L.-, cerca de 22,5 minutos

As fraeções L^ e I__que compreendem os polipeptídeos foram a seguir preparadas para sequênciação e sequênciadas de acordo com os processos descritos no Exempla 6.

í

A sequência amino ácido amino terminal de parte do polipeptídeo compreendido pela fracção foi determinado cornos

H^N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-i1e-gln-1ys~lys-q1y~g1y-phe-asp-;

e o peso molecular do polipetideo total foi determinado por electroforese de gel de acordo com métodos conhecidos como sendo de cerca de 20000.

EXEMPLO 10

Subfraccionamento da fracção 14 e determinação das suas estruturas

A fracção 14, obtida como descrito no Exemplo 1 e a qual compreende um polipeptídeo, foi preparada para seqenciação e sequênciada de acordo com os processos descritos no Exemplo 6.

A sequência amino ácido amino terminal de parte do polipeptídeo compreendido pela fracção 14 foi determinado como:

-47H^N-g1u-al a-tht—q1u-a1a-a1a-lys-va1-1eu-set—asn-leu-asp-glu-thr-va1-asp-pro-, e o pesa molecular do polipetideo total foi determinado por electroforese de gel de acorda com métodos conhecidos como sendo de cerca de 80000.

EXEMPLO 11

ΙΗ-Indol-3-acetamida, IM-(20-amino-4-hidroxi- 4,8,12,17~tetrazeicos-1~i1

A síntese do composto em titulo, verificando-se que compreende a fracção E como descrito rto Exemplo 4, foi efectuada como descrito a seguir.

Sob uma atmosfera de azoto, agitamos 13,22 g (0,15 mole) de diaminobutano e 3,5 ml de metanol e juntamos 9,94 ml (0,15 mole) de acrilonitrilo através de uma bomba de seringa )

-48durante um período de du.as horas com arrefecimento a 0-5 A mistura, após cerca de 18 horas, foi cromatografada sobre ó©© g de silica gel usando um sistema solvente de 3:1 CH^Cl^/MeDH (2 litros) seguido por 3:1 CH^Cl _,/MeOH contenda 5/1 em volume de isopropilamina (2 litros). As fracçSes contenda o produto acoplado foram concentradas por evaporação in vacuo e originaram um óleo viscoso amarela. A análise NMR confirmou o produto como sendo o produto acoplado de fórmula (I) acima apresentado.

H (I)

BOC-NH

NH (III)

Sob uma atmosfera de azoto, juntamos 5,78 g (©,©41 mole) do composto de fórmula I, preparado como descrito na parte A acima, a 75 ml de CH_.CN e 11,48 g de KF Celite e agitamos. 4 mistura agitada juntamos uma solução de 9,75 g (©,©41 mole) do composto de fórmula II, preparado de acordo com o processo descrito na Preparação A, em 25 ml de CH^CN. a reacção foi aquecida a refluxo e vigiada por TLC (3:1 CI^Cl^/meQH) . Após tres horas, a reacção foi deixada a arrefecer e em repouso à temperatura ambiente. A Celite foi a segu.ir filtrada e o sólido filtrado foi bem lavado com diclorometano. 0 filtrado foi concentrado in

-49vacuo. 0 produto em bruto contido no filtrado concentrado foi cromatografado sobre silica gel usando 2 litros de 3:1 CH^Cl^/MeOH, e seguir 2 litros de 3:1 CH^Cl^/MeOH e 3® ml de ' isopropilamina. □ produto eluiu da coluna após a coluna se tornar saturada com isopropi1amina mas era ainda impuro. Juntamos e concentramos todas as fracçSes do produto. A silica gel foi preparada empapando 5®® g de silica gel em CH_OC1_O e 125 ml de xL xL isopropi1amina e foi a seguir usada para encher a coluna numa maneira padrão. 0 produto em bruto foi carregado numa coluna usando diclorometano. a seguir, fazemos passar na coluna 5®® ml de diclorometano, seguidos por um litro de 3:1 CH^Cl^/MeOH. Juntamos as fracçSes do produto e concentramos in vácuo para obtermos 1,5 g do produto de fórmula III, acima. Outros 2 g do produto de fórmula III foram eluidas da coluna usando um litro de 3:1 CH^Cl^/MeOH e 3® ml de isopropi1amina.

Γ:.

III + [BOCJ₂O --->

BOC

(IV)

Sob uma atmosfera de azoto, agitamos 3,5 g (11,8 mmoles) do composto de fórmula III, preparado como descrito na parte B anterior, e 15® ml de diclorometano e juntamos 5,2 q )

(23,6 mmoles) de di-t-butildicarbanato. A mistura foi agitada durante aproximadamente 68 horas à temperatura ambiente. A mistura foi a seguir concentrada in vacuo e cromatografada usando 400 g de silica gel usando um sistema solvente de 60:40 de hexano/acetata de etilo para originar 5,62 g do composto de fórmula IV na forma de um óleo.

BOC

BOC (V)

Sob uma atmosfera de azoto, 3,0 q do composto de fórmula IV, preparado como descrita na parte C, anterior, foram dissolvidos em 30 ml de ácido acético numa garrafa Parr^ de 250 ml. A esta solução juntamos 3,0 q de F‘d (OH) -,/carbono e a mistura foi hidroqenada a 50 p. s» i. de pressão de H-, durante 2 horas. 0 catalizador foi removido por filtração e o sólido filtrado foi bem lavado com ácido acético. 0 filtrado foi concentrado, processado em 75 ml de diclorometano, lavado duas vezes com 75 ml de MaOH íiM e secamos sobre K^C0₇. A solução foi concentrada in vacuo para obtermos 2,36 g de produto de fórmula V anterior.

-5 ΙΕ- Ε. V + NC^\

Sob uma. atmosfera de azoto, dissolvemos 2,86 g (5,7 mmoles) do composto de fórmula V, preparado como descrito na parte D anterior, em 75 ml de metanol. Com agitação, juntamos 0,41 ml (6,3 mmoles) de acrilonitrilo á mistura e a reacção foi agitada durante a noite. A mistura reagente foi a seguir concentrada, reconcentrada tres vezes a. partir de 30 ml de diclorometano e vaporizada do solvente in vac uo para originar 3,18 q do composto de fórmula VI na forma de um óleo.

)

Sob uma atmosfera de azoto, 3,18 q <5,7 mmoles) do composto de fórmula VI, preparado como descrito na parte E, anterior, combinaram-se com 10® ml de diclorometano e agitamos em solução., A esta solução .juntamos 1,37 g <6,3 mmoles) de di-t-buti Idicarbonato e a reacção foi agitada durante 9® minutos à temperatura ambiente. A mistura reagente foi a seguir concentrada e cromatografada sobre 3®® g de sílica gel usando 60:4® hexano/acetato de etilo como eluente. As fracçSes dD produto foram . combinadas, concen tradas, estraida.s 3 χ 2® ml com d ic 1 orometa.no e vaporizadas do solvente in va c uo para obtermos 3,12 q de produto de fórmula VII, anterior.

)

G.

VII

BOC BOC > Η₂Ν

BOC

BOC (VIII)

Seguindo o processo descrita na parte D, anterior, dissolvemos 3,12 g (4,7ó mmoles) do composto de fórmula VII, preparado como descrito na parte F anterior, em 3® ml de ácido acética e hidragenamog a 55 p. 5. i. de pressão durante 2 horas na presença de 3,® q de Pd(OH)^/carbono para obtermos 3,®2 g do produto de fórmula VIII, anterior, na forma de um óleo.

H»

VIII + NC<^

BOC

-BOC

BOC (IX)

Sob uma atmosfera de azoto, dissolvemos 1,0 q (1,5 mmoles) do composto de fórmula VIII, preparado como descrito na parte G, anterior, em 10 ml de metanol. A esta solução juntamos 0,1 ml (1,07 mmoles) de acrilonitrilo e a reacção foi agitada durante a noite. A seguir, a mistura reagente foi concentrada, reconcentrada tres vezes a partir de 20 ml de diclorometano e vaporizada do solvente in vácuo para obtermos 1,0 q de produto de fórmula IX, anterior.

IX

BOC BOC

H | I

N-BOC

H

BOC (X,

Seguindo o processo descrito na parte D, anterior, dissolvemos 1,0 g (1,4 mmoles) do composto de fórmula IX, preparado como descrito na. parte H anterior, em 3Θ ml de ácido acético a hidrogenamos a 55 p. s. i. de pressão durante 2,5 horas para obtermos C,85 g do produto de fórmula X, anterior.

Uma. solução contendo 6,78 g (20 mmoles) de hidrogeno sulfato de tetrabutilamónio e 75 ml de H^D, foi preparada por agitação, e juntamos 3,36 g (40 mmoles) de ÍMaHCO^. conforme a espuma for permitindo. A seguir, juntamos 3,5 g (20 mmoles) de indole ácido acético, a mistura foi agitada durante 5 minutos e juntamos 75 ml de CHC1.,. A mistura foi agitada durante mais cinco minutos e separamos as duas camadas do fundo. A camada aquosa foi salificada comi Na^SD. e extraída com CHC1_. Todos os extractos de de CHCl-ç foram juntos e secos sobre Na^SO^. A solução cor de ambar claro resultante foi concentrada, presa, com 3 x 75 ml de acetona e finalmente dissolvida em 75 ml de acetona. í-\ seguir juntamos 1,9 ml (22 mmoles) de brometo de alilo e a mistura foi deixada em repouso durante 30 minutos. A mistura foi a seguir concentrada e cromatografada sobre silica gel usando 3:1 hexano/acetato de etilo para obtermos 3,57 g de produto de fórmula XI» anterior, na forma de um óleo amarelo claro.

XI >

BOC (ΧΙΌ

Seguindo o processo de Angew. Chem. Int. Ed. Enql. 25:298 (1984), combinamos 2,15 g (1© mmoles) do composto de fórmula XI, preparado como descrita na parte J, anterior, combinaram-se com 2© ml de acetonitrilo e juntamos 2,61 g (12 mmoles) de di-t-butildicarbonato, à mistura. A seguir, juntamo 0,122 g (1 mmole) de 4-(N, N-dimeti 1 amiriD) piridina e deixamos prosseguir a reacção durante 15 minutos. A mistura foi a seguir diluida. a 125 ml com acetato de etilo, lavada 2 x HC1 dluido, 3 x 25 ml de H._,0, 1 x água salgada e concentrada. 0 produto foi purificado por cromatografia sobre silica gel usando 14,5:1 hexano/acetato de etilo como eluente para obtermos 2,97 g de composto de fórmula XII, anterior, na forma de um óleo incolor.

,1

A 3,27 g (10,4 mmoles) do composto de fórmula XII, preparado como descrito ns parte F anterior, em 20 ml de diclorometano juntamos 7,4 ml de 2-eti1hexanoato de sódio em acetato de etilo (0,231 g/ml>. A seguir, juntamos 0,5 g de ·?_,Ρ e 0,5 g de (Vi^FU^Pd e a mistura foi agitada durante 60 minutos. A mistura foi a seguir concentrada, processada, em 150 ml ds acetato de etilo e lavada 5 x 25 ml de Η^,Ο. Juntamos os extractos aquosos e extraímos de novo com 1 x 25 ml de acetato de etilo e 1 x 25 ml de éter dietilico. A camada aquosa juntamos 75 ml de acetato de etilo fresco e a seguir acidificamos a pH 3. A camada de acetato de etilo foi separada e a camada aquosa foi extraída com 1 :·; 50 ml de acetato de etilo fresco. Juntamos os dois extractos de acetato de etilo e lavamos com 2 x 20 ml de H₇0, a seguir com 1 x 20 ml de água salgada, secamos, concentramos, e prendemos com 3 x 30 ml de hexano onde se formaram os cristais durante a segunda prisão. A mistura foi diluida a 75 ml com hexano. Os sólidos foram filtrados, bem lavados com hexano e secos por ar para obtermos 1,37 g de sólidos brancos. A NMR confirmou a estrutura do composto em titulo de fórmula XIII.

χιιι

ÍXIV)

Sob uma atmosfera, de azoto, combinamos 200 mq ( , 73 mmoles) do composto de fórmula XIII com 25 ml de diclorometano, 84 mg (0,73 mmoles) de N-hidroxi-succinimida e 150 mg (0,73 mmoles) de dicic1o-hexi1carbodi-imida, após o que um precipitado se formou quase imediatamente. A mistura foi agitada durante 3 horas, a seguir, a dicic1ohexilureia foi filtrada e ao filtrado foi adicionada gota a gota 40 ml de uma solução do composto de fórmula X, preparado como descrito no Exemplo 11, Partes A-I em diclorometano. A mistura foi agitada durante 12 horas e a seguir lavada com NaOH 0,1 Me seca sobre K^CD-., concentrada e cromatografada usando 150 g de silica gel e eluindo com 9:1 diclorometano/metanol (0,5 litros) para, remover impurezas e a seguir com 9:1:0,1 dic1orometano/metanol/isopropilamina (2 litros). 0 produto foi a seguir concentrado, preso com diclorometano e a seguir concentrado para obtermos 400 mg do composto de fórmula XIV, confirmado por NMR 300 MHz.

-59-XIV

N-BOC

Η

BOC (XV)

Sob unta atmosfera de azoto, combinamos ©,34 g (0,35 mmoles) preparados como acima descrito, com 30 ml de acetona, agitada em solução e arrefecemos a cerca de 0 °C. num banho de gelo/acetona. A seguir, juntamos gota a gota durante 8-10 minutos 0,212 q (1,05 mmoles) de ácido 3-c1oroperoxibenzóico a 85 % em 2© ml de acetona, A reacção foi agitada, durante 30 minutos e a seguir diluída a 150 ml com éter dietilico e lavada com 2 ;·: 25 ml de a 10%, 2 x 25 ml de H_o0, 2 x 25 ml de K^CO^, a 10%, 2 x ml de H^Q e seca sobre K^CO^.. A mistura foi concentrada, presa com 2 x 3© ml de diclorometano e concentrada in vacuo até um peso estacionário de 0,33 g. A análise NMR mostou o produto como sendo uma mistura do produto desejado de fórmula XV, material de partida e sub-produto. A mistura produto foi adicionada, a 3 ml de ácido acético ao qual juntamos 2© mg de NaCNBH^. A mistura foi agitada durante a noite, vaporizada do é,cido acético in vacuo.

dissolvida em 5© ml de diclorometano e lavada 1 x 75 ml tampão aquoso, pH 7. Se nacessário, o pH foi. ajustado a pH 7 NaOH IN e a camada de diclorometano foi separada e lavada com 1 com com

-6050 ml com tampão aquosa pH 7 e 1 x 25 ml de égua salgada, seca sobre Na^SO^, e concentrada in vacuo até um peso estável de 0,31 g. 0 p roduto resultante foi cromatografado sobre 10O g de silica gel usando 95:5 acetato de etilo/metanol para eluir e recolhemos fracçSes de 25 ml. 0 produto purificado de fórmula XV saiu nos cortes ÍS-25. Juntamos aqueles cortes, concentramos, prendemos com 2 x 5 ml e concentramos in vacuo até uma espuma branca de 68 mg a qual foi armazenada a -30 °C. Os continham o produto desejado, continham também alguma impureza. Juntamos os cortes 26-40, concentramos, prendemos com diclorometano e concentramos in vacuo até um peso estacionário de 66 mg. 0 último produto juntou-se com 6 mg

NMR tinha sido usado para estudo:

cortes 26-40 que também do primeira produto a e com uma mistura que qual tinha sido preparada de acordo com o processa acima descrita. A mistura resultante foi cromatografada sobre 75 mg de silica qel usando 9:5 acetato de etilo/metanol para eluir e recolhemos fracçSes de 25 ml. 0 produto purificacjo de fórmula XV estava presente nos cortes 16-21. Juntamos esses cortes, concentramos, prendemos com 2 x 5 ml de diclorormetano e concentramos in vacuo até um estacionário de 46 mg o qual foi armazenado a -80 *C.

i

(XVI)

-61Sab uma atmosfera de azoto, dissolvemos 108 mq (0,109 mmoles) do composto de fórmula XV, preparada coma acima descrito, em 1,5 ml de diclorometano- A seguir, juntamos 2 ml de ácido trif Iuoroacético e a mistura foi agitada durante um hora. à temperatura ambiente, A mistura reagente foi a seguir concentrada num filme e juntamos 15 ml de éter dietílico. 0 filme tornou-se sólido e, após 30 minutos de agitação, originou um pó branco. 0 pó foi filtrado, bem lavada com éter dietílico, seco sob azoto, e a seguir evacuado até um peso estável de 109 mg do composto em titulo deste Exemplo.

EXEMPLO 12 lH-I.ndol-3-acetamida , N- (20-amino-4-hidroxi-4,8,12,17-t'etrazeicos-l-i 1 ) -4-hidroxi

A síntese do composto em titulo, verificando-se que compreende a fracção como descrito no Exemplo 3, foi efectuada como descrito a seguir.

(XVII)

-62Sob uma atmosfera de árgon, usando utensílios de vidro secos à chama, juntamos 4,® g 25 ml de DMF Aldrich seco e juntamos 1,44 g <3® mmoles) de <3® mmoles) de 4-hidroxindole com agitamos em solução. A seguir, NaH na forma de uma dispersão de ®7„ de óleo. Após a espuma ter assentado ou sedimentado, juntamos ,5 ml de éter clorometiImeti1 (Aldrich) e a solução verde escura noite. A seguir, a solução foi i x 25 ml de resultante foi agitada durante a diluída a 125 ml com acetato de etilo, lavada com e 1 x 25 ml de água salgada, seca sobre Na^SO^ e fada usando 4:1 hexano/acetato de etilo, cromatoqra2 4

Juntamos as fracçSes contendo o produto e concentramos para obtermos 2,7® g do produto XVII como um óleo.

B.

XVII + h₃<\

NH

H,C

(XVIII) )

Num frasco de tres tubuladuras de fundo redondo, de 5® ml,, equipado com um agitador mecânico e uma atmosfera de azoto, arrefecemos 1,3 g de formaldeido aquosos (377.) e 2,2£3 g de ácido acético. A seguir, juntamos 3,23 ml de dimetilamina arrefecida (257. em H^,0). À solução arrefecida resultante juntamos .i, / g (15,2 mmoles) de composto de fórmula XVII usando cerca de 1,5-2,0 ml de tetrahidrofurano como solvente de transferencia. A reacção foi aquecida A temperatura ambiente e agitada durante a noite. A seguir, juntamos 40 ml de NaOH 10% após o que se formou um precipitado. Após agitação, o precipitado foi filtrado, lavado com H_o0 e seco por ar para obtermos 3,26 g de composto de fórmula XVIII.

XVIII

(XX) (XIX)

Sob uma atmosfera de azoto, combinamos 4,62 g de KCN com 10 ml de H_OU e agitamos em solução. A seguir juntamos 30 ml de etanol e 3,26 g (14 mmoles) do composto XVIII e a mistura foi agitada e aquecida a refluxo durante aproximadamente 65 horas. A reacção foi arrefecida e concentrada. □ precipitado resultante compreendendo o composto XX foi filtrado, lavado com H-.0 e seco por ar. A camada aquosa foi extraida com 4 x 15 ml de diclorometano, guardando os extractos orgânicos» A camada aquosa foi a segui sobrenadada coni 50 ml de acetato de etilo e acidificada a pH 2. A camada de acetato de etilo foi separada, desgazifiçada fazendo borbulhar azoto através da. camada. de acetato de etilo, secamos e concentramos num sólido o qual foi digerido com éter diisopropi1ico para obtermos 1,®3 q do composto XIX como um sólido quase branco. A seguir, juntamos todos os extractos da camada aquosa básica, secamos, juntamos com os filtrados de cima

I e concentramos para obtermos 0,4 g do composto XX como um sólido.

D.

XX -► XIX )

Sob uma atmosfera de azoto, l,ó g do composto de fórmula XX foram combinadas com 7,5 ml de etanol, 3® ml de H^O e 1,3 g de KOH. A mistura foi aquecida a refluxo e agitada durante a noite. A seguir, a reacção foi arrefecida, extraída com 2 x 15 ml de acetato de etilo, sobrenadada com acetato de etilo fresco e acidificada a pH 2. o ponjunto das camadas de acetato de etilo foi seco e concentrado. 0 sólido resultante foi digerido com IPE parai obtermos 1,1 g do composto XIX.

XIX

BOC (xxi)

Em 1Θ ml de H„0 dissolvemos 1,44 g (4,25 mmoles) de

TBAHSO^. A seguir, juntamos 714 mg (8,5 mmoles) de NaHCO^. Após ter assentado a espuma, juntamos 1,0 g (4,25 mmoles) do composto de fórmula XIX e a mistura foi agitada durante um minutD antes de juntarmos 40 ml de clorofórmio. A reacção foi agitada durante 5 minutos, a camada de clorofórmio foi separada e a seguir a mistura aquosa foi extraída com 1 x 15 ml de clorofórmio. 0 conjunto dos extractos de clorofórmio foram secos, concentrados e presos com 2 χ 30 ml de acetona. A seguir o produto foi redissolvido em 30 ml de acetona sob atmosfera de azoto, juntamos 0,37 ml (4,25 mmoles) de brometo de alilo e a reacção foi agitada durante 2 horas. A mistura foi concentrada e cromatografada usando acetato de etilo como eluente. □ produto foi concentrado para obtermos 1,1 g de um óleo. Juntamos todo o produto com 25 ml de diclorometano e juntamos 0,98 g <4,5 mmoles) de di-t-butildicarbonatci e 51 mg (0,425 mmoles) de 4-(N,N-dimeti lamina) piridina - a reacção foi agitada durante a noite, a seguir, a mistura reagente foi concentrada e cromatografada usando 9:1 hexano/acetato de etilo para obtermos, após concentração, fórmula. XXI na forma de um óleo viscoso.

1,33 g do composto de

BOC (XXII)

-66Em 2 ml de metanol dissolvemos 64 mg <0,17 mmales) do composto de fórmula XXI. A esta solução juntamos 1,7 ml de NaOH 0,1 M e a mistura reagente resultante foi agitada durante a noite, a reacção foi a segir acidificada, seca, extraída com acetato de etilo e concentrada. A análise NMR mostrou que todo o ester alilico do composto XXI tinha sido removido mas que tinha ocorrido alguma trans esterificação e que estava presente algum ester metilico. F'or isso, o produto combinou-se com a quantidade restante do composto XXI (aprax. 1,26 g), dissolveu—se em 5 ml de tetrahidrofurano e arrefecemos a 0 *C. a seguir juntamos 3,8 ml de NaOH IN, a reacção foi agitada durante 5 minutos a 0 *C. e a seguir deixamos aquecer à temperatura ambiente. A reacção ocasionou duas fases a qual precisou da adição de 5 ml de metanol para eliminar as fases. A reacção foi aqitada durante a noite. A seguir, o tetrahidrofurano e o metanol foram vaporizados e a solução aquosa restante foi sobrenadada com 50 ml de acetato de etilo e acidificada a pH 2. A camada de acetato de etilo foi separada, lavada com 1 x 2€? ml de H^O, uma vez com água salgada, zi seca com Na^SO^, filtrada e concentrada até uma goma a qual cristalizou e a seguir foi digerida com hexano para obtermos 1,08 g de sólido branco. 0 sólido foi cromatografado usando 70:30 acetato de etilo/hexano e juntamos os cortes com o produto limpo, concentramos e cristalizamos a partir de acetato de etilo/hexano para obtermos O,884 g do composto de fórmula XXI1.

G.

XXII

BOC

N-BOC (X)

N-BOC

BOC (XXIII)

Sob uma atmosfera de azoto, dissolvemos 271 mg (O,SI mmoles) do composto de fórmula XXII com agitação em 4 ml de tetrahidrofurano anidro. A seguir, juntamos 93 mg (0,SI mmoles) de IM-hidroxi-succinimida e 167 mg (0,81 mmoles) de diciclo-hexilcarbodi-imida e a mistura foi agitada. Após uma hora e cinquenta minutos, juntamos 0,53 g (0,8 mmoles) do composto de fórmula X, preparado de acordo com o processo descrito no Exemplo 11, em 30 ml de diclorometano, e a mistura foi agitada durante o fim de semana. A seguir, filtramos a diciclohexi1 ureia, e a mistura foi extraída com 2 x 3 ml de NaOH IN, seca sobre K₉CO·?; e concentrada» 0 produto foi a seguir cromatografado sobre 100 g de silica gel usando 9:1 diclorometano/metanol para eluir tudo menos o produto desejado e a seguir com 90:10:1 de dic1orometano/metano1/isopropilamina para eluir o produto. As fracçSes contendo o produto foram concentradas, presasa várias vezes com diclorometano e vaporizadas do solvente para obtermos 349 mg do composto de fórmula XXIII como uma espuma branca.

Alternativamente, e de preferencia, uma solução de 50 ml contendo 0,480 g (1,43 mmoles) do composto de fórmula XXII em diclorometano foi tratada com 0,165 g (1,43 mmoles) de N-hidroxi-succinimida seguida por 0,294 g (1,43 mmoles) de diciclo-hexi1carbodi-imida e deixada a agitar durante 5 horas. A mistura reagente foi filtrada e o filtrado contenda hidroxi-succinimida em bruto foi adicionado gota a gota durante um periodo de 20 minutos a 100 ml de uma solução de 1,03 g (1,43 mmoles) do composto de fórmula X, preparado de acordo com o processo descrito no Exempla 11, em diclorometano. A reacção foi agitada durante 72 horas. A seguir, a mistura reagente em bruto foi lavada duas vezes com 20 ml de NaOH IN, seca sobre K^CO-,, filtrada e concentrada. □ produto foi a seguir cromatografado sobre silica gel usando 4:1 diclorometano/metanol seguido por 9:1:1 diclorometsηα/metanol/diisopropilamina para obtermos 912 mg do composto de fórmula. XXIII.

H,

XXIII

BOC (XXIV)

N-BOC

Sob uma atmosfera de azoto, dissolvemos indoleacetamida XXIII <900 mg, 0,87 mmol) em 4Ô ml de diclorometano. A esta solução juntamos 2-( fenilsolfonil)-3-feniloxaziridina (500 mg, 1,92 mmol). 0 progresso da reacção foi vigiado por cromatografia de camada fina. Após 1 hora a mistura reagente foi concentrada in vacuo para obtermos predominantemente nitrona em bruto a qual foi dissolvida em 35 ml de ácido acético» Juntamos um grande excesso de cianoborohidreto de sódio (1,00 g, 15,9 mmoles) e a reacção foi deixada a agitar durante cerca de 2 horas. A reacção foi concentrada, in vácuo, processada em dic lorometano (50 ml), lavada com tampão de pH 7(1 x 50 ml) ajustada a pH 7 com NaOH IN. A camada orqanica foi de novo lavada com tampão de pH 7(1 x 50 ml), seca, sobre carbonato de cálcio, e concentrada in vacuo para gerar o produto em bruto o qual foi cromatografado sobre silica gel usando 95:5 acetato de etilo/metanol para obtermos 612 mg (677.) de XXIV na forma de uma espuma branca.

I .

XXIV -►

Exercendo alternativamente um vácuo e purgando com argon tres vezes, desgazifiçamos 3 ml de ácido trif1uororacétíco. A seguir, o frasco foi embrulhado em folha de alumínio e juntamos

-7093 mg da composta XXIV usando como material de transferencia 2,5 ml de diclorometano. Após 45 minutos, a mistura foi concentrada para obtermos um óleo o qual, após digestão com éter dietílico, originou 83 mg do composto XXV como um sólido branco o qual foi armazenada a -30 °C.

Al ternativamente, e de preferencia, a. uma solução saturada de 100 ml de dioxano-HCl, purgada com argon, juntamos, durante 1,5 minutos, 0,520 g (O,495 mmoles) do composto de fórmula XXIV, preparado de acordo com o processo descrito na parte H, anterior, em 10 ml de dioxano. Formou-se imediatamente um precipitado e a reacção foi agitada durante 1 hora. A seguir, juntamos éter dietílico e, após cinco minutos, a solução foi filtrada. Os sólidos resultantes foram lavados com éter di.et.il ico, secos sob uma atmosfera de azoto e a seguir a pressão reduzida para obtermos 345 mg do ácido de fórmula XXIV' o qual pde ser armazenado a -78 °C. A seguir, a uma solução aquosa, purgada com argon, juntamos, 150 mg (0,205 mmoles) do ácido de fórmula XXIV' . A reacção foi vigiada por HF'LC. Após completação da reacção passadas cerca de 7 horas, a mistura reagente foi seca por congelação para obtermos 103 mg do composto de fórmula XXV na forma do seu sal cloreto.

EXEMPLO 13 », Benzamida, N-(20-amino-4-hidroxi-4,8,12,17-tetrazeicos-l-il)-4-hidroxi

A sintese do composto em titulo, verificando-se que compreende a. fracção A' como descrito no Exemplo 2, foi efectuada como descrito a seguir.

Num copo (beaker) de 4®0 ml, combinamos 6,79 g (20 mmoles) de hidrogeno sulfato de tetrabutilamónio com 6® ml de H_,0 e a solução agitada. A seguir, juntamos 3,36 g (40 mmoles) de NaHCO^ conforme a formação de espuma. permitir, seguida pela adição de 4® ml de uma solução contenda 2,76 g (2® mmoles) de ácido p-hidroxibenzóico, ®,8 g de NaQH e 4® ml de H_0. A mistura reagente foi agitada durante 5 minutos e a seguir juntamos 2®® ml de diclorometano. A mistura ídí agitada durante mais 5 minutos e deixamos separar as camadas. A camada aquosa foi extraída duas vezes com 50 ml de dic1orometano. 0 conjunto dos extractos de diclorometano foram secos sobre Na^.50. , concentrados, presos duas vezes com 75 ml de acetona e redissolvidos em 5® ml de acetona. A seguir, juntamos 1,9 ml (22 mmoles) de brometo de alilo e a mistura foi agitada. A mistura reagente foi a seguir concentrada, processada em 10® ml de acetato de etilo, lavada duas vezes com H-,0 e uma vez com água salgada. 0 produto resultante foi seco e concentrado para obtermos u.m óleo. 0 óleo foi digerido com 5® ml de éter de petróleo durante uma hora. A seguir, a mistura foi

-72filtrada, bem lavada com éter de petróleo e seca por ar para obtermos 1,7 q de composto de fórmula XXVI, anterior.

XXVI

OCH₂CH=CH₂

Sob uma atmosfera de azoto, combinamos 1,7 q (8,55 mmoles) do composto de fórmula XXVI, preparada como descrito na parte A, acima, com 50 ml de DMF Aldrich seco e agitamos em solução. A seguir, juntamos 0,38 g (9,55 mmoles) de NaH na forma de uma dispersão de 607. de óleo e a reacção foi agitada durante a noite. A seguir, juntamos 0,76 ml de éter c1orometi1 meti 1 (Aldrich) após o que se formou imediatamente um pecipitado. A mistura reagente foi agitada durante 18 horas. A reacção foi arrefecida, em 200 ml de acetato de etilo/100 ml de HUO. A camada de acetato de etilo foi separada, lavada 3 vezes com 50 ml de uma vez com 50 ml de NaOH IN, uma vez com 50 ml de H^O, uma vez com 5b ml de NaOH IN, uma vez com 50 ml de H.-,Ο e uma vez com água salagada. A solução resultante foi seca, concentrada e cromatografada sobre silica qel usando 4:1 de hexano/acetato de etilo para obtermos 1,63 g do composto de fórmmula XXVII, acima.

XXVII

c.

Em 75 ml de tetrahidrofurano dissolvemos 1,62 g (7,3 mmoles) do composto de fórmula XXVII, preparado como descrito na parte B, acima. A seguir juntamos uma solução O,4 g (10 mmoles) de NaOH em 15 ml de Ημ,Ο originando a formação de duas camadas. Juntamos metanol até obtermos uma mistura homogénea. A reacção foi a seguir agitada durante a noite. 0 tetrahidofuranno e o metanol foram vaporizados in vacuo e a solução aquosa restante foi extraída duas vezes com 15 ml de acetato de etilo. A seguir, a camada aquosa foi sobrenadada com 50 ml de acetato de etilo fresco e acidificada a pH 2,5 com HC1 óN. A seguir separamos a camada de acetato de etilo, lavamos uma vez com 10 ml de H^O e uma vez com 25 ml de áqua salgada. A solução resultante foi concentrada para obtermos sólidos os quais foram digeridos com hexano, filtrados e secos por ar para obtermos 1,2 g do composto de fórmu.la XXVIII, acima.

>

D.

XXVIII

(XXXII)

Uma solução de 2® ml de diclorometano contendo ®,127 g (®,7 mmoles) do composto de fórmula XXVIII, preparado como descrita na parte C, acima, foi tratada com ®,®31 g (®,7 mmoles) de N-hidroxi-succinimids seguida por ®,144 g (®,7 mmoles) de diciclo-hexilcarbodi-imida e deixamos agitar durante 4 horas. A seguir, a mistura reagente foi filtrada e o filtrado contendo hidroxi-succinimida em bruto foi adicionada gota a gota durante um periodo de 2® minutos a uma solução de 8® ml de diclorometano contendo ®,5® g (0,7 mmoles) do composto de fórmula X, preparado de acordo com o processo descrito no Exemplo 11, F'artes A~I , acima. A reacção foi a seguir agitada durante 17 horas. A mistura reagente foi a seguir lavada com NaOH IN (2 x 2® ml), seca sobre carbonato de potássio, filtrada e concentrada. Q concentrado foi cromatografado sobre silica gel usando 9:1 diclorometanc/metanol seguido por 9:1:®,25 diclorometano/metanol/diisopropilamina para obtermos 37® mg do composto de fórmula XXXII, qcima.

-75XXXII

(XXXIV)

N-BOC

Η

Sob uma atmosfera de azoto, dissolvemos ©,335 g (0,38 mmoles) do composto de fórmula XXXII, preparado de acordo com o processo descrito na Parte D, acima, em 30 ml de diclorometano. A esta solução juntamos 0,23© g (©,33 mmoles) de 2-(sulfeni1feni1>-3-feni1-oxaziridina. Após 0,5 horas a reacção foi concentrada in vacuo e o concentrado foi dissolvido em 15 ml de ácido acético. Juntamos um grande excesso de ciarioborohidreto (.100 g, 1,6 mmoles) e a reacção foi agitada durante 2 horas. A seguir, a reacção foi concentrada in vacuo, processada em 50 ml de diclorometano, lavada uma vez com 5© ml de tampão pH 7, ajustada a pH 7 com NaOH IN. A camada organica foi de novo lavada com 5© ml de tampão pH 7, seca sobre carbonato de potássio a concentrada in vacuo. 0 concentrado foi cromatografado sobre silica gel usando 5©:5© acetona/hexano para obtermos 253 mg de composto de fórmula XXXIV, acima.

(XXXIV)

(XXXVI)

Sob uma atmosfera de argon à temperatura mbiente combinamos 0,20 g (0,223 mmoles) íd composto de fórmula XXXIV, preparada de acordo com o processo descrito na Parte E, acima, e 5 ml de ácido trifluoroacético. A reacção foi agitada durante 1,5 horas. Juntamos mais 2 ml de ácido trifluoroacético para lavar as paredes do frasco. Deixamos prosseguir a reacção durante mais 1,5 horas. A seguir a reacção foi concentrada in vácuo., digerida com éter etilico, filtrada e seca sob uma atmosfera de azoto para obtermos 21S mg de composto de fórmula XXXVI, o composto em titulo deste Exemplo.

EXEMPLO 14

Benzamida, N-(20-ainino-4—hidroxi-4,8,12,17-tetrazeicos-l-il )-2,5-d i h idr o i

A síntese do composto em titulo, verifiçando—se que compreende a fracção A^ como descrita no Exemplo 3, foi efectuada como descrito a seguir.

(XXIX)

Empregando p processo descrito no Exemplo 12, Parte A, mas partindo de 3,CS g (20 mmoles) de ácido 2,5-dihidroxibenzóico obtemos 3,0 g de composto de fórmula XXIX, anterior.

OCH₂OCH

XXIX

OCH₂CH=CH₂ och₂och (XXX)

-78Sob uma atmosfera de azoto, combinamos 3,0 q (15,5 mmoles) do composto de fórmula XXIX com 50 ml de DMF Aldrich seco e agitamos em solução. A seguir, juntamos 1,24 g (31 mmoles) de

NaH ri_ca forma de uma dispersão de 607. de óleo e a reacção foi agitada. Após 3 horas, juntamos 2,5 ml (33 mmoles) de éter clorometiImeti1 e a reacção foi agitada durante 18 horas. A mistura reagente foi a seguir adicionada a. 300 ml de acetato de acetato de etilo foi a seguir de H^O, duas vezes com 75 ml de Η^,Ο e uma vez com água eca e concentrada para obter— mos 2,9' g de um óleo o qual foi cromatografado sobre silica gel u.sando 4:1 hexano/acetato de etilo para obtermos duas fracçSes, a segunad fracção das quais continha 1,16 g do composto de fórmmula XXX, acima.

etilo e 100 ml de H^D. A camada de separada e lavada 3 vezes com 75 ml de MaOH IN, duas vezes com 50 ml salgada. A solução resultante foi s

c.

XXX

(XXXI)

A 10 ml de tetrahidrofurano juntamos 1,16 g (4,1 mmoles) do composto de fórmula XXX, acima. A seguir juntamos 0,24 g (ó mmoles) de Na.OH em 10 ml de H->0 originando a formação de duas fases. Juntamos metanol à mistura, até obtermos uma fase e a

-79seguir a mistura foi agitada durante 13 horas. Qs solventes foram a seguir removidos e a solução aquosa restante foi extraída duas vezes com 15 ml de acetato de etilo. A camada aquosa foi a seguir sobrenadada com 35 ml de acetato de etilo fresco e acidificada a pH 2,5 com HC1 óN. A seguir separamos a camada de acetato de etilo, lavamos uma vez com 10 ml de H^O e uma vez com água salgada, secamos e concentramos para obtermos 1,0 q do composto de fórmula XXXI, acima, na forma de um óleo.

D.

XXXI

BOC (XXXIII)

Empregando o processo descrito no Exemplo 13, Parte D, e usando ©,17 g (0,7 mmoles) do composto de fórmula XXXI, preparado como descrito na Parte C, acima, 0,081 g (0,7 mmoles) de M—hidroxi—succinimida, 0,144 g (0,7 mmoles) do composto de fórmula X, preparado de acordo com o processo descrito no Exemplo

11, Partes A~I, obtemos, após cromatografia, 370 mg do composto de fórmula XXXIII, acima.

XXXIII

(XXXV,

Empregando o processo descrito no Exemplo 13, Parte E, e usando 0,308 g (0,33 mmoles) do composto de fórmula XXXIII, preparado como descrito na Parte D, acima, e 0,250 g (0,96 mmoles) de 2-(sulfoni1í-3-feni1-oxaziridina obtemos, após cromatografia sobre sílica gel usando acetato de etilo seguido por 50:50 acetona/hexano, 210 mg do composto de fórmula XXXV, acima.

F. XXXV —-►

(XXXVII)

Empregando o processo descrito no Exemplo 13, Parte F, e usando 0,100 g (0,104 mmoles) do composto de fórmula XXXV,

-81preparado como descrito na Parte E., acima, obtemos 108 mg do composto de fórmula XXXVII, o composto em titulD deste Exemplo»

EXEMPLO 15 lH-Indole-3-acetamida, N-(ló-amino-4-hidroxi-4,3,15-triazahexadec-1-iI)-4-hidroxi

A sintese da composto em titulo, verificando-se que compreende a fracção A^, como descrito no Exempla 3, foi efectuada como descrito a seguir»

VI

Empregando α processo descrito no Exemplo 11, Parte D, e u.sando 1,15 g (2,07 mmoles) do composto de fórmula VI, preparado como descrito no Exemplo 11, Partes A-E, obtivemos 1,10 g de composto em bruto de fórmula XXXVIII, acima.

XXXVIII

XXII

BOC (XXXIX)

Empregando o processa alternativo descrito no Exempla 12, Parte G, e usando uma solução de diclorometano (15 ml) contendo O,228 g <6,3 mmoles) do composto de fórmula XXII, preparado como descrito no Exemplo 12, Partes A a F, acima, 0,380 g <6,3 mmoles) do composta de fórmula XXXVIII, preparado como descrito na Parte A, acima, 0,078 g (6,8 mmoles) de N-hidroxi-succinimida e 0,140 g (6,8 mmoles) de diciclo-hexi1carbodi-imida, obtivemos 0,407 g de composto em bruto de fórmula XXXIX após cromatografia sobre silica gel usando 9:1 diclororaetano/metanol seguida por 9:1:0,5 diclorometano/metanol/diisopropi1amina.

XXXIX

BOC (XL)

-83Empregando α processo descrito no Exemplo 12, Parte H, e usando 0,350 g (0,4 0,230 g ( 0,88 mino 1 es) mmoles) do composto de fórmula XXXIX e de 2-(sulfoni1feni1)-3-feniloxiziridina.

obtivemos 0,274 g do composto de fórmula XL, acima, após cromatografia sobre silica gel usando 50:50 acetona/hexano. □ produto continha uma quantidade minima de fenilsulfonamida e foi portanto adicionalmente purificado sobre silica gel usando acetato de etilo seguido por 50:50 acetona/hexano.

Empregando o processo alternativa descrita no Exemplo 12, Parte I, e usando 0,166 g (0,186 mmoles) do composto de fórmula XL, preparado de acordo com o processa descrito na Parte C, acima, obtemos, após tratamento por dioxano/HCl o ãcido em bruto. 0 ácido de fórmula XL' foi dissolvido em água durante 8 horas, seguido por secagem por congelação para obtermos 88 mg de composto de fórmula XLI.

-84PREPARAC/ÃQ A

N-BOC

H

Sob atmosfera de azoto, agitamos 34,5 g (157,6 mmoles) de 3-bromopropilamina-HBr em 600 ml de N,N-dimeti1formamida. A esta solução juntamos 34,4 g (157,6 mmoles) de di-t-butildicarbonato seguido por 32,3 ml (236 mmoles) de trietilamina. Formou-se imediatamente um precipitado. A reacção foi agitada durante a noite. A mistura reagente foi a seguir diluida a 1,5 litros com acetato de etilo, lavada uma vez com 500 ml de HC1 IN, tres vezes com 5Θ0 ml de água, uma vez com áqua salgada e seca sobre Na„SO_n. Após concentração, o produto foi cromatografado sobre 800 g de sílica gel usando 4:1 hexano/acetato de etilo e as fracçoes foram vigiadas por cromatografia de camada fina (KMNO^/I^). Juntamos as fracçoes contendo o produto, concentramos in vacuo, prendemos duas vezes com 50 ml de diclorometano e purgamos com vácuo elevado para obtermos 25,8 g do produto desta Preparação.

Claims

REIVINDICAÇBES lã. - Processo para a preparação de um composto tancialmente puro seleccionado entre o grupo formado por

5Ub5-

H f

-87um composto tenda as características identificadoras seguintes:

(a) presente numa fracção de veneno em bruto da aranha figelenopsis aperta que se separa por eluiçao de uma coluna C-18 Vydac 22 mm :·: 25© mm, 3©© A de granulometria dos poros, e 1© μ de granulometria das partículas usando um caudal de 15 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de

5%--> 2©% B, 95% -> 8©% A C© -> 3© min.l e a seguir
2©% -> 7©% B, 8©% -> 3©% A C3© -> 55 min.l onde A é ácido trifluoroacético aquoso a 0,1 % (TFA) e B é acetonitrilo, durante cerca de 22,75 minutos;

(b> presente numa fracção da fracção anteriormente descrita em (a), que se liberta por eluição numa coluna C-13 R °

Vydac 22 mm 25© mm, 300 A de granulometria dos poros, e 1© μ de granulometria das partículas usando um caudal de 15 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente não linear de ©%--> ©% B, 10©% -> 1©0% A C© -> 5 min.l, e a seguir ©% ---> 10% B, 10©% -> 9©% A C5 ->20 min.l (curva Waters 1) e a seguir 10% -> 20% B, 9©% -> 80% A C2© -> 3© min.l (curva

Waters ó) e a seguir 2©% -> 5©% B, 8©% _> 5©% A C3© _> 40 min.l (curva Waters 11), onde A é ácido trifluoroacético aquoso a ©,1 % (TFA) e B é acetonitrilo, durante cerca de 21,5 minutos; e j (c) EM BAR: alta resolução: 5©5,3Qól;

e de seus sais farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado pelo facto de:

(a) quando se deseja um composto de fórmula se eluir todo o veneno da Aqelenoosis aperta de uma coluna C-18 F\ ⁰

Vydac (22 mm χ 250 mm, 3Θ0 A de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., u.m sistema solvente usando um programa de gradiente linear de
5% ----> 10% de acetonitrilo, 95% -> 90% de ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% e detecção dos picos monocromáticos a 220230 nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 12,5 minutos e, vpcionalmente, se liofilizar a referida fracção, se re-suspender em água e se liofilizaç a partir de água ou, alternativamente, se fazer reagir um composta de fórmula (XXVIII) num solvente inerte à reacção sob uma atmosfera de azoto com N-hidroxi-succinimida seguida por dicic lo-hexi lcarbodi-im.ida e a seguir com um composto de fórmula

N-BOC

Η num solvente inerte à reacção, se fazer reagir a seguir o produto numa atmosfera inerte com 2-(sulfoni1feni1>-3-feni1-oxaziridina seguida por cianoboro-hidreto e se fazer reagir o produto resultante sob uma atmosfera inerte com ácido trifluoroacético;

(b) quando se deseja um composto de fórmula se eluir todo o veneno da Aqelenopsis aperta numa coluna C-18 Vydac (22 mm x 250 mm, 300 Ã de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 57. -> 207. de acetonitrilo, 957. -> 80% de ácido trifluoroacético min.l e a seguir 207.

-> 70% de acetoaquoso a 0,17. EO _ nitrilo, 807. -> 30% de ácido trif luoroacético aquoso a 0,1% [30

-.· 55 (Tiin.3 e detecção dos picos monocromáticos a 220-230 nm, se recolher a fracção que elu.i a cerca de 21 minutos e se carregar esta numa coluna C-4 Vydac^R (10 mm x 250 mm, 300 À de granulometria dos poros, e 5 μ de granulometria das partículas) e se e 5 μ de granulometria das partículas) e um sistema solvente usando eluir usando um caudal de 4 ml/min., um programa de gradiente linear de 07. -> 107. de acetonitrilo,

1007. -> 907. de ácido trifluoroacético aquoso a ®,1% e detecção dos picos monocromáticos a 220-23® nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 7 minutos e, opcionalraente, se liofilizar a referida fracção, se re-suspender em água e e se liofilizar a partir de água ou, alternativamente, se fazer reagir um composto de fórmula (XXXI) num solvente inerte à reacção sob uma atmosfera de azoto cora N-hidroxi-succinimida seguida por diciclo-hexilcarbodi-imida e a seguir com um composto de fórmula

BOC

I

BOC (X) se fazer reagir em seguida o produto obtido numa com (sulfoni1feni1) f eni l-o;:aziridina atmosfera inerte seguida por

-91cianoboro-hidreto e se fazer reagir o seu produto sob uma atmosfera inerte com ácido trifluoroacético;

(c> quando se deseja um composto de fórmula se eluír todo o veneno da flqelenopsis aper ta numa coluna C-18 Vydac^ (22 mm x 25© mm, 3©© A de granulometria dos poros, e 1© μ de granulometria das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usagdo um programa de gradiente linear de 57.

-> 2©7. de acetonitrilo, 957. -> B©7. de ácido trifluoroacético aquoso a ©, 17. t<ô > 3© min.3 e a seguir 2©7 > 7&7. de acetonitrilo, 8©7. -> 3©% de ácido trif luoroacético aquoso a ©,17. C3©

-> 55 min.3 e detecção dos picos monocromáticos a 220-23© nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 21 minutos e se carreR ° gar esta numa coluna C-4 Vydac (1© mm x 25© mm, 3©© A de granulometria dos poros, e 5 μ de granulometria das partículas) e se eluir usando um caudal de 4 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de ©7. -> 107. de acetonitrilo,
10©7. -> 9©7. de ácido trif luoroacético aquoso a ©,17. e detecção dos picos monocromáticos a 22©~23© nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 9 minutos e, opcionalmente, se liofilizar a referida fracção, se re-suspender em áqua e se liofilizar a partir de água ou, alternativamente, se fazer reagir um composta de fórmula

OCH₂OCH

BOC (XXII, num solvente inerte à reacção sob uma atmosfera de azoto com M-hidroxi-succinimida seguida por d ic ic lo-hexi lca.rbod i-imida e a seguir com um composta de fórmula

BOC (XXXVIII) se fazer reagir o produto a. seguir numa atmosfera inerte com 2-(sulfoni1feni1)-3-feniI-oxaziridina seguida por cianoboro-hidre to e se fazer reagir o seu produto sob uma atmosfera inerte com ácido trifluoroacético ou, sob uma atmosfera inerte, se dissolver em dioxano-HCl saturado, se recolher a partir daí e se adicionar a uma solução aquosa sob uma atmosfera inerte;

<d> quando se deseja um composto de fórmula se eluir todo o veneno da Aqelenopsis aperta numa coluna 8-13 R °

Vydac (22 mm :< 250 mm, 300 A de granulometría dos poros, e 1© μ de granulometría das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 57. --> 207. de acetonitrilo, 357. -> 307. de ácido trifluoroacético aquoso a 0,17. 10 -> 30 min.l e a seguir 207. -> 707. de acetonitrilo, 3Θ7. -> 307. de ácido trifluoroacético aquoso a 0,17. I30

-> 55 m.in.3 e detecção dos picos monocromáticos a 220-230 se recolher a fracção què elui a cerca de 22,75 minutos e p

carregar esta numa coluna C-4 Vydac (2 nm, se de mm

250 mm, 300 A granulometría dos poros, e 10 μ de granulometría das partículas) e se eluir usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente não linear de 07 -> 07 de acetonitrilo, 1007. 0,17. 10 -> 5 min.l,

1007---> 907. de ácido trif luoroacético aquoso a 0,17. 15

1007. de ácido trif luoroacético aquosa a e a seguir 07 -> 107 de acetonitrilo, _> 20 acetonitria 0,17 120 —> 507 de min.l (curva Waters 1), e a seguir 107 -> 207 de lo, 907 --> 307 de ácida trifluoroacético aquosa

-> 30 min.l (curva Waters 6), e a seguir 207 acetonitrilo, 807 -> 507 de ácido trifluoroacético aquoso a

0,17. 130 -> 40 min.l (curva Waters 11) e detecção dos picos monocromáticos a 220-230 nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 13,5 minu.tos e, opcional mente, se liofilizar a referida fraeção, se re-suspender em água e se liofilizar a partir de água ou, alternativamente, se fazer reagir um composto de fórmula

BOC (XXII) num solvente inerte à reacção sot) uma atmosfera de azoto com N-hidroxi-succinimida seguida por diciclo—hexiIcarbodi-imida e a seguir com um composto de fórmula

BOC se fazer reaqir o produto 2-(sulfoni1feni1>-3-feni1-o to e se fazer reagir o seu ácido trifluoroacético ou, inerte, se dissolver em partir daí e se adicionar a a seguir numa atmosfera inerte com xaziridina. seguida por cianoboro-hidre produto sob uma atmosfera inerte com sob uma atmosfera dioxano-HCl saturado, se recolher a uma solução aquosa sob uma atmosfera inerte:

(e) quando se deseja um composto de fórmula )

se eluir todo o veneno da Aqelenopsis aperta numa coluna C-18 R °

Vydac (22 mm x 25® mm, 3®® A de granulometria dos poros, e lô μ de granulometria das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 5%

----> 2®7. de acetonitrilo, 957. ->· 8®% de ácido trifluoroacética aquoso a 0,1% C® -> 3® min.l e a seguir 2®7. -> 7®7. de acetonitrilo, 8®7. -> 3®% de ácido trifluoroacética aquoso a 0,1%

C3® -> 55 min.3 e detecção dos picos monocromáticos a. 22®--23® nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 27,5 minutos e, opcionalmente, se liofilizar a referida fracção, se re-suspender em água e se liofilizar ou, alternativamente, se eluir todo o veneno da Aqelenopsis aperta da referida coluna usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 5% -> 2Ô7. de acetonitrilo, 1®®% -> 8®% de ácido trifluoroacética aquoso a ®,1% e detecção dos picos a 22® nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 26,® minutos e se c· carregar numa coluna Dynamax Phenyl (4,ó mm x 25® mm, ó® A de granulometria dos poros, e 8 μ de granulometria das partículas) e se eluir usando um caudal de 1 ml/min., condiçoes isocráticas de 1®% de acetonitrilo, 9®% de ácido trifluoroacético aquoso a ®,1% e detecção dos picos a 22® nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 55,27 minutos e, opcionalmente, se liofilizar a referida fracção, se re-suspender em água e se liofilizar ou, alternativamente, sefazer reagir um composto de fórmula (XIII) num solvente inerte á reacção sob uma atmosfera de azoto com N-hidraxi-succ.inimida seguida por diciclo-hexilcarbodi-imida e a seguir com um composto de fórmula se fazer reagir a seguir o produto em acetona numa atmosfera inerte com ácido 3-cloroperoxibenzóico, se recolher e se fazer reagir com cianoboro-hidreto_na presença de ácido acético e a seguir se fazer reagir o seu produto sob uma atmosfera inerte? com ácido trifluoroacético sob uma atmosfera inerte;

(f) guando se deseja um composto tenda as características seguintes (a) presente numa fracção de veneno em bruto da aranha

Aqelenopsis aperta que Vydac^' 22 mm χ 250 mm, de granulometria das p se separa por eluição numa coluna C-18 30Θ A de granulometria dos poros, e ΙΟ μ articulas usando um caudal de 15 ml/min. e )

-97um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 57.

-> 207. B, 957 -> 807. A CO -> 30 min. 3 e a seguir 207 ------>

707 B, 807 -> 307 A C30 -> 55 min „3 onde A é ácido trifluoroacético aquoso a 0,1 7 (TFA) e B é acetonitrilo, durante cerca de 22,75 minutos;

(b) presente numa fracção da fracção descrita anteriormente em (a), que se separa por eluição numa coluna C-18 Vydac^

O

22 mm x 250 mm, 300 A de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas usando um caudal de 15 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente não linear de 07

------> 07 B, 1Θ07 -> 1007 A CO -> 5 min . 3 , e a seguir 07 ->

107 B, 1007 -> 907 A C5 -> 20 min.J (curva Waters 1) e a seguir 107. -> 207 B, 907 -> 807. A C20 -> 30 min. 3 (curva

Waters 6) e a seguir 207. --> 507. B, 807 -> 507. A C30 -> 40 min.3 (curva Waters 11), onde A é ácido trifluoroacético aquoso a 0,1 7 (TFA) e B é acetonitrilo, durante cerca de 21,5 minutos; e (c) LM FAB: alta resolução: 505,3361, se elu.ir todo o veneno Aqelenopsis aperta numa coluna R o

C-18 Vydac (22 nm x 250 nm, 300 A de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 57 -> 207. de acetonitrilo, 957. -> 807. de ácido trif luoroacético aquoso a 0,17. CO -> 3Õ min. 3 e a seguir 207.

-.> 707 de acetonitrilo, 807 -> 307 de ácido trifluoroacético aquoso a 0,17 C3U -> 55 min.3 e detecção dos picos monocromáticos a 220-23O nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 22,75 minutos e se carregar esta numa, coluna C-4 Vydac^R (22 mm x 250 mm, 300 A de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das

-98partículas) e se eluir usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente não linear de 07 -> 07.

de acetonitrilo, 1007. -> 1007. de ácido trif Iuoroacético aquoso a 0,17. [0 -> 5 min.], e a seguir 07 -> 107. de acetonitrilo,

1007. -> 907 de ácido trif Iuoroacético aquoso a 0,17 E20 -> 30 min.] (cu.rva Waters 1), e a seguir 107 -> 207 de acetoni tri lo,

907. -----> 807 de ácido trif Iuoroacético aquoso a 0,17 E2Õ -> 30 min.] (curva Waters 6), e a seguir 2071 -> 507 de acetonitrilo,

807 ----> 507 de ácido trifIuoroacético aquoso a 0,17 E30 -> 4õ min.] (curva Waters 11) e detecção dos picos monocromáticos a 220-230 nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 21,5 minutos e, opcionalmente, se liofilizar a referida fracção, se re-suspender em água e se liofilizar; e se converterem opcionalmente os referidos compostos nos seus sais farmaceuticamente aceitáveis por métodos conhecidos per se.

2â. - Processo para a preparação de um polipeptídeo substancialmente puro seleccionado entre o grupo formado por um polipeptídeo (I) tendo as características identificadoras seguintes:

(a) presente numa fracção de veneno em bruto da aranha Aqelenopsis aperta que se separa por eluição numa coluna C-1S Vydac^R 22 mm 250 mm, 300 Â de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas usando um caudal de 15 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 57 •--^? 207. B, 957 -> 807 A [0 -> 30 min.) e a seguir 207 _>

707 B, 307 -> 307. A E30 -> 55 min.] onde A é ácido trifluoroacético aquoso a 0,1 7 (TFA) e B é acetonitri1o, durante cerca de 38 minutos;

(b) presente riuma fracção da fracção descrita anteriormente em Ca), a qual se liberta numa coluna C-13 Vydac^' 22 mm x 250 ίΤιΠι, 300 Ã de granu 1 ometria dos poros, e 10 μ de granu 1 ometria das partículas usando um caudal de 10 ml/mirt. e um sistema solvente usando um programai de gradiente não linear de 207,-->

307, B, 807--> 707 A 10---> 4ú min.3 (curva Waters 6), onde A é ácido trifluoroscético aquoso a 0,1 7 (TFA) e B é acetonitrilo, durante cerca, de 22 minutos;

(c) uma sequência de aminoácidos amino terminal compreendendo :

Η,-JM-g 1 u-1 is~g 1 i -1 eu-pro-glu-g 1 i-a 1 a-g 1 u-cis-asp-g 1 iasn-g 1 u-ser-asp-c is-1 is-a 1 a-g .1 i-g ln-trp-i 1 e-1 i s-cisarg-cis-pro-trp-1 is-trp-his-i 1 e-tre-g 1 i-g lu-g 1 i-procis-1re-cis-glu-arg-gIi-1eu-1 is-1 is-tre-cis-i1e-ser1is-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-qlu-trp-leu-ser-;

id) EM BAR: 7267;

e um polipeptídeo tendo substanciaImente a mesma sequência de aminoácidos e substancialmente canal de cálcio que o referido a mesma actividade de bloqueio do polipeptídeo (I), um polipeptídeo (II) de férmu. 1 a

H^N-asp-cis-val-gli-glu-ser-gln-gln-cis-ala-asp-trp— ala—g1i-pro—his—c is-cys-asp—gli —tir—ti r—cis—tre—cis— -arg t i r- f en -pro-1 is-c is-i 1 e-c is-va 1 -asn -asn -CONHç.

- 1 00e um polipeptídeo tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos e substancialmente a mesma actividade de bloqueio do canal de cálcio que o referido polipeptídeo <11), um polipeptídeo (III) tendo as características identificadoras seguintes:

(a) presente numa fracção de veneno em bruto da aranha

Aqelenopsis aperta que se separa por eluição numa coluna C-1S R °

Vydac 22 mm x 250 mm, 300 A de granulometria dos poros, e ly μ de granulometria das partículas usando um caudal de 15 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 57.

----> 207. B, 957. -> 807 A CO -> 30 min. 3 e a seguir 207. ->

707» Et, 307. -> 307 A C30 -> 55 min. 1 onde A é ácido trifluoroacético aquoso a 0,1 7 (TFA) e Et é acetonitrilo, durante cerca de 39 minutos;

(b) presente numa fracção da fracção descrita anteriormente em (a), que se separa por eluição numa coluna C-18 Vydac:^ 22 mm x 250 mm, 300 Ã de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas usando um caudal de IO ml/min. e um sistema solvente u.sando um programa de gradiente não linear de

207 ----> 257. Et, 307 -> 357 A E0 -> 30 min. 3 (curva Waters 6) e a seguir 257 -> 507 Et, 757 -> 507 A C30 -> 45 min. 3 (curva Waters 11), onde A á ácido trifluoroacético aquoso a 0,1 7 (TFA) eB é acetonitrilo, durante cerca de 36 minutos; e (c) uma sequência de aminoácidos amino terminal compreendendo:

FyM-a 1 a-1 .is-a 1 a-1 eu-pro-pro-gl i-ser-val-cis-asp-gl i-101 —

-asn~g1u-ser-asp-cis-1is-cis-tir-q1i-1is-trp-his-1is-ci5-arg-ci5-pro-trp-lis-trp-1is-trp-his-fen-tre-q1 i-g lu-g 1i-pro-cis-tre-cis-glu-1 is-q li-met-1is-his-tre-cis-ile—tre-1is-leu-his-c is-pro-asn-1is-ala-g1u-trp-g1i-leu-asp-trp-; e (d) EM de Pulverização de ISes: 7793;

' e um polipeptídeo tendo substancialmente a mesma sequência amino ácido e substancialmente a mesma actividade de bloqueio do canal de cálcio que o referido polipeptídeo (III), um polipeptídeo (IV) de fórmula

H_QN-asp-g 1 u.-pro-c is-i 1 e-pro-1 eu-g 1 i-1 is-se r~c i s-ser-trp-1is-ile-gli-tre-pro-tir-cis-cis-pro-his-asp~ala-g1i-arg-arg-tre-trp-cis-leu-val-asp-tir-ser-arg-fen-val-tre-ile-cis-ser-g1i-arg-1is-tir-CONH^ e um polipeptídeo tendo substancialmente a mesma sequência, de aminoécidos e substancialmente a mesma, actividade de bloqueio do )

canal de cálcio que o referido polipeptídeo (IV), um polipeptídeo (V) tendo as características identificadoras sequ.intes:

I r

(a) presente numa fracção de veneno em bruto da aranha fiqelenopsis aperta que se separa por eluição numa coluna C--1S Vydac^ 22 mm ;·; 250 mm, 300 A de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas usando um caudal de 15 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 574

----> 20% Β, 95% -> S0% A L0 ---> 30 min.l e a seguir 20% ->

70% B, 80% -> 30% A E30 -> 55 min.3 onde A é ácido trifluoroacético aquoso a 0,1 % (TFA) e B é acetonitrilo, durante cerca de 43 minutos;

(b> presente numa fracção da fracção anteriormente descrita em (a) a qual se liberta numa coluna C-13 Vydac*³' 10 mm x

O

250 mm, 30€» A de granulometria dos poros, e 5 μ de qranulometria das partículas usando um caudal de 3,5 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 25%--> 40%

B, 75% -> 60% A E0 -> 30 min.3 onde A é ácido trifluoroacético aquoso a 0,1 % (TFA) e B é acetonitrilo, durante cerca de 20,25 minutos; e (c) uma sequência de aminoácidos amino terminal compreendendo:

H_oN-ile-val-gli-gli-1is-tre-ala-1is-fen-gli-asp-tir— -pro-trp-met-val-ser-ile-gln-1is-1is-g1i-g1i-fen-asp-;

e (d) um peso molecular aproximado de cerca de 20 000;

e um polipeptídeo tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos e substancialmente a mesma actividade de bloqueio do canal de cálcio que o referido polipeptídeo (V), um polipeptídeo cadoras seguintes:

(VI) tendo as características identifi(a) presente numa fracção de veneno em bruto da aranha

Aqelenopsis aperta que se separa por eluição numa coluna C-18 R °

Vydac 22 mm x 25© mm, 3©© A de granulometria dos poros, e 1© μι de granulometria das partículas usando um caudal de 15 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 5%

-> 2©7» 8, 857. -> 807» A CC' -> 3© mín » 3 e a seguir 2©7 ---->

707. B, 807» -> 307 A C3© -> 55 min. 3 onde A é ácidc· trifluoroacético aquoso a 0,1 7 (TFA) e B é acetonitrilo, durante cerca de 43 minutos; e (b) presente numa fracção da fracção anteriormente

R descrita em (a) que se separa por eluição numa coluna C-18 Vydac 10 mm ;·: 25© mm, 3©© Ã de granulometria dos paras, e 5 μ de granulometria das partículas usando uni caudal de 3,5 ml/min. e um sistema solvente usando um programai de gradiente linear de 257

-----> 407. B, 757 -> 6©7 A C© -> 3© min. 3 onde A é ácido trifluoroacétíco aquoso a ©,1 7. (TFA) e B é acetonitrilo, durante cerca de 22,5 minutos; e e um polipeptídeo tendo substancialmente a mesma sequência de aminoécidos e substancialmente a mesma actividade de bloqueio dD canal de cálcio que o referido polipeptídeo (VI), um polipeptídeo (VII) tendo as características identificadoras seguintes:

(a) presente numa fracção de veneno em bruto da aranha Age 1 enopsis aperta qu.e se separa. por eluição numa coluna C-18 Vyda.c^' 22 mm x 25© mm, 3©© A de granulometria dos poros, e 1© μι de granulometria das partículas usando um caudal de 15 ml/min. e um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de

B,

807. A LO

30 min.3 e a seguir 207.

707. B, 307.--> 307. A C30 -> 55 min.3 onde A é acética aquosa a 0,1 7» (TFA) e B ê acetonitrilo, ácido trifluorodurante cerca, de

48,3 minutos;

(b) uma sequência de aminoácidos amino terminal compreendendo

Η^,Ν-g 1 u-a 1 a-1 re-g 1 u-a 1 a.-a 1 a-1 is-va 1-1 eu-ser-asn-1 eu-asp-g1u-tre-val-asp-pro- ; e (c) um peso molecular aproximado de cerca de 80 <500 e um polipeptídeo tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos e substancialmente a mesma actividade de bloqueio do canal de cálcio que o referido polipeptídeo (VII), e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis caracterizados pelo facto (a) quando se deseja o polipeptídeo (I) substancialmente puro, se R eluir todo o veneno da Aqelenopsis aperta numa coluna C-13 Vydac (22 mm x 250 mm, 300 Ã de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa. de gradiente linear de 57.

-----> 207. de acetonitrilo, 957. -> 80% de ácido trifluoroacético aquosa a 0,1% C0 -> 30 min.3 e a seguir 20% -> 707. de acetonitrilo, 80% --> 30% de ácido trifluoroacético aquoso a 0,1%

L30

55 min.3 e detecção dos picos monocromáticos a 220-230 nm, se recolher a. fracção que elui a cerca de 38 minutos e, se o o carregar esta numa coluna C-13 Vydac (22 mm x 250 mm, 300 A de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas) e se eluir usando um caudal de 10 ml/min., um sistema solvente

-105- usando um programa de gradiente não linear de 20% -> 30% de acetonitrilo, 80% -> 70% de ácido trif luoroacético aquoso a.

0,1% E0 -> 40 min.3, (curva Waters 6), e detecção dos picos monocromáticos a 220-230 nm, se recolher a fraeção que elui a cerca de 22 minutos e, opcionalmente, se liofilizar a referida fraeção, se re-suspender em água e se liofilizar;

(b) quando se deseja o polipeptídeo (II) substancialmente puro, se eluir todo o veneno da Aqelenopsis aperta numa coluna C-18 Vyda.c¹^ (22 mm κ 250 mm, 300 Ã de granulometria. dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 5%

-> 20% de acetonitri1 o, 95% -> 80% de ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% [0 -> 30 min.3 e a seguir 20% -> 70% de acetonitrilo, 80% -> 30% de ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% [30 -> 55 min.3 e detecção dos picos monocromáticos a 220-230 nm, se recolher a -fraeção que elui a cerca de 40 minutos e, se o o carregar numa coluna C-4 Vydac (22 inm x 250 mm, 300 A de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas) e se eluir usando um caudal de 10 ml/miri., um sistema solvente usando u.m programa de gradiente não linear de 20% -> 30% de acetonitrilo, 80% -> 70% de ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% [0 ------->

30 min.3, (curva Waters 6), e a seguir 30% -> 50% de acetonitrilo, 70% -> 50% de ácido trifluoroacético aquosa a

0,1% E30 -> 45 min.3, (curva Waters 11) e detecção dos picos monocromáticos a 220-23© nm, se recolher a fraeção que elui a cerca de 22 minutos e, opcionalmente, se liofilizar a referida fraeção, se re-suspender em água e se liofilizar;

(c) quando se deseja o polipeptídeo (III) substancialmente puro, se eluir todo o veneno da Aqelenopsis aperta numa coluna C-18

-106R *

Vydac (22 mm x 250 mm, 300 A de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 57.

-> 207. de acetonitrilo, 957. -> 80% de ácido trif luoroacético aquoso a Θ,1% EO -> 30 min.3 e a seguir 20% -> 70% de acetonitrilo, 80% --> 30% de ácido trif luoroacético aquoso a O, 17.

E30 -> 55 min.1 e detecção dos picos monocromáticos a 220-230 nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 39 minutos e, se R carregar numa coluna C-18 Vydac <22 mm x 250 mm, 300 A de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas) e se eluir usando um caudal de 10 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente não linear de 20% -> 25% de acetonitrilo, 80% -> 75% de ácido trifluoroacético aquoso a

0,1% EC -> 30 min.1, (curva Waters 6), e a seguir 25% --> 50% de acetonitrilo, 75% -> 50% de ácido trifluoroacético aquoso a

0,1% E30 -> 45 min.], (curva Waters 11) e detecção dos picos monocromáticos a 220-230 nm, recolhemos a fracção que elui a cerca de 36 minutos e, opcionalmente, se liofilizar a referida fracção, se re-suspender em água e se liofilizar;

(d) quando se deseja o polipeptídeo (IV) substancialmente puro, se eluir todo o veneno da Aqelenopsis aperta numa coluna C~18 R ⁰

Vydac <22 mm x 250 mm, 300 A de granulometria dos poros, e 1.0 μ de granulometria das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 57.

-> 20% de acetonitrilo, 95% -> 80% de ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% E0 -> 30 min.] e a seguir 20% -> 70% de acetonitrilo, 807. -> 30% de ácido trifluoroacético aquoso a 0,17.

E30 -> 5 min.] e detecção dos picos monocromáticos a 220-230

-nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 40 minutos e, se carregar numa coluna C-4 Vydac^R (22 mm x 250 mm, 300 Ã de

-107granulometria dos poros, e 1© μ de granulometria das partículas) e se eluir usando um caudal de 1© ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente não linear de 20% -> 3ô% de acetonitrilo, 8©% -> 7©% de ácido trifluoroacético aquosa a ©,1% [ô -> 3© min.3, (curva Waters 6), e a seguir 3©%--> 5©% de acetonitrilo, 7©% -> 50% de ácido trif1uoroacético aquoso a

0,1% C30 -> 45 min.3, (curva Waters 11) e detecção dos picos monocromáticos a 220-23© nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 27,5 minutos e, opcionalmente, se liofilizar a referida fracção, se re-suspender em água e se liofilizar;

(e) quando se deseja o polipeptídeo (V) substancialmente puro, s;e eluir todo o veneno da fiqelenppsis aperta numa coluna C-18 Vydac^' (22 mm x 25© mm, 30© Ã de granulometria dos poros, e 1© μι de granulometria das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 5%

---> 2®% de acetonitrilo, 95% -> 90% de ácido trif luoroacético aquoso a ©,1% [© -> 3© min.3 e a seguir 2©% -> 7©% de acetanitrilo, 8©% -> 3©% de ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% [30 -> 55 min.3 e detecção dos picos monocromáticos a 220-23® nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 43 minutos e se R carregar esta numa coluna C-18 Vydac <1© mm 25© mm, 3©© A de granulometria dos poros, e 1® μι de granulometria das partículas) e se eluir usando um caudal de 3,5 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 25% -> 4©% de acetonitrilo, 75% -> 6©% de ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% [©

-> 3© min.3 e detecção dos picos monocromáticos a 220-23© nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 20,25 minutos e, opcionalmente, se liofilizar a referida fracção, se em água e se liofilizar;

re-suspender

-108(f) quando se deseja o polipeptídeo (VI) substancialmente puro, se eluir todo o veneno da Aqelenopsis aperta numa coluna C-18 R °

Vydac (22 mm 250 min, 300 A de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 5%

-> 207. de acetcnitrilo, 957. -> 807. de ácido trif luoroacético aquoso a 0,17. L0 -> 30 min. 3 e a seguir 207. -> 707. de acetonitrilo, 807. -> 307. de ácido trif luoroacético aquoso a 0,1%

C30

-> 55 min.3 e detecção dos picos monocromáticos a 220-230 nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 43 minutos e se carregar esta numa coluna C-18 Vydac^R CIO mm χ 250 mm, 300 Ã de granulometria dos poros, e 5 μ de granulometria das partículas) e se eluir usando um caudal de 3,5 ml/min., um sistema solvente usando um programa de gradiente linear de 25% -> 40% de acetonitrilo, 75% -> 60% de ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% CO

-> 30 miri.3, e detecção dos picos monocromáticos a 220-230 nm, se recolher a fracção que elui a cerca de 22,5 minutos e, opcionalmente, se liofilizar a referida fracção, se re-suspender em água e se liofilizar;

(g) quando se deseja o polipeptídeo (VII) substancialmente puro, se eluir todo o veneno da Aqelenopsis aperta numa coluna C-18 R °

Vydac (22 mm ;·: 250 mm, 300 A de granulometria dos poros, e 10 μ de granulometria das partículas) usando um caudal de 15 ml/min., um sistema solvente usando u.m programa de gradiente linear de 5%

----.> 207. de acetoni tri I o , 95% -> 807. de ácido tri f luoroacético aquoso a 0,1% C0 > 30 min.3 e a seguir 20% > 70% de acetonitrilo, 8©7. -> 30% de ácido trif1uoroacético aquoso a 0,1% L30

-> 55 min.3 e detecção dos picos monocromáticos a 220-230 nm, se recolher a. fracção que elui a cerca de 48,3 minutos e,

-109opcionalmente, se liofilizar a referida fracção, se re-suspender em água e se liofilizar;

ou, alternativamente, se sintetizar qualquer dos referidos polipeptídeos por métodos conhecidos per se; e quando são desejados os polipeptídeos que tem substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que qualquer dos referidos polipep tídeos, se sitetizar(em) tal(tais) polipeptídeo ou polipeptídeos por métodos conhecidos per se; e opcionalmente se converterem os referidos polipeptídeos nos seus sais farmaceuticamente aceitáveis por métodos conhecidos per se.