DD293959A5 - Verfahren zur herstellung von polyaminen und polypeptiden, die geeignet sind als antagonisten exzitatorischer aminosaeure-neurotransmitter und/oder blocker der calciumkanaele - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung bestimmter Polyamine, die in dem Gift der Agelenopsis aperta Spinne gefunden wurden. Die Polyamine der Erfindung und die Salze davon wirken exzitatorischen Aminosaeure-Neurotransmittern entgegen, wobei diese Neurotransmitter Zellen verschiedener Organismen beeinflussen und sind geeignet zur Gegenwirkung fuer Neurotransmitter an sich bei der Behandlung von durch exzitatorische Aminosaeure-Neurotransmitter vermittelten Krankheiten und Zustaende und bei der Kontrolle von wirbellosen Schaedlingen. Eines der Polyamine und dessen Salze blockieren Calciumkanaele in Zellen verschiedener Organismen und sind geeignet zum Blockieren der Calciumkanaele in Zellen an sich, in der Behandlung von mit Calciumkanaelen in Verbindung stehenden Krankheiten und Zustaende und zur Kontrolle von wirbellosen Schaedlingen. Die Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen, enthaltend die Polyamine, Polypeptide und deren Salze.{Polyamine; Polypeptide; Agelenopsis; Spinne; Neurotransmitter, exzitatorisch; Calciumkanaele; Schaedlinge; Gift}
Description
Die Erfindung betrifft bestimmte Polyamine, die im Geift der Agelenopsis aperta Spinne gefunden wurden. Die Polyamine und deren pharmazeutisch annehmbare Salze wirken den exzitatorischen Aminosäure-Neurotransmittern entgegen, die aus Zellen einschließlich Nervenzellen einer Vielzahl von Organismen einschließlich wirbellosen Tieren und Wirbeltieren einwirken. Eines dieser Polyamide und deren pharmazeutisch annehmbare Salze blockieren Calciumkanäle in Zellen einschließlich Nerven- und Muskelzellen verschiedener Organismen einschließlich Wirbellosen und Wirbeltieren. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser Polyamide und ihre Salze zur Gegenwirkung exzitatorischer Arr.inosäure-Neurotransmitter, die Zellen, wie Zellen im Nervensystem eines Organismus an sich, beeinflussen zur Behandlung von durch exzitatorische Aminosäure-Neurotransmitter übermittelten Krankheiten und Zuständen in einem Säugetier und zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen und Zusammensetzungen, die diese Polyamine und deren Salze enthalten. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung dieses Polyamins und dessen Salze zum Blockieren von Calciumkanälen in Zellen wie Zellen des Nerven- und Muskelsystems eines Organismus an sich, zur Behandlung von Calciumkanal-übermittelten Krankheiten und Zuständen in einem Säugetier und zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen und Zusammensetzungen, wie Polypeptide, Polyamine und deren Salze enthalten.
Es wurde berichtet, daß das Gift der Spinne Agelenopsis aperta mindestens zwei Toxine enthält, die Calciumströme beeinflussen. H.Jackson et al., Soc. Neu. Sei. Abstr. 12:1078(1987). Diese Autoren beschreiben ein Toxin, das sie mit AG 2 bezeichnen, das ein Molekulargewicht von weniger als 1000 Dalton hat und Calciumströme in einem breiten Bereich von Geweben zu unterdrücken scheint. Weiter berichten H.Jackson et al., Soc. Neu. Sei. Abstr. 12:730 (1986) von einem anderen Toxin von Agelenopsis aperta, das eine Komponente von ungefähr 6000 MG enthält. Von diesem Toxin wird berichtet, daß es die präsynaptirche Blockade der Transmission bewirkt und es wurde vorgeschlagen, daß das Toxin Calciumkanäle, die mit der Freisetzung von Neurotransmittern in Zusammenhang stehen, blockiert.
Das Ziel der Erfindung besteht darin. Mittel zur Verfügung zu stellen, die durch exzitatorische Aminosäure-Neurotransmitter vermittelten Krankheiten und Zuständen sowie Calcium-abhängigen Krankheiten oder Zustände entgegenwirken.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, exzitatorische Aminosäure-Neurotransmitter-Antagonisten und Verbindungen, die Calciumkanäle blockieren, sie enthaltende Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Herstellung zur Verfügung stellen. Verbindungen, die exzitatorische Aminosäure-Neurotransmitter-Antagonisten sind, haben eine Vielzahl von Verwendbarkeiten. Exzitatorische Aminosäure-Neurotransmitter-Antagonisten können klinische Anwendung bei der Behandlung solcher Zustände wie Krampfanfall, Schlaganfall, Hirnischämie, neuronale Degenerations-Störungen wie Alzheimer Kranheit und Epilepsie und als Psychotherapeutika, unter anderen, finden. Siehe Excitatory Amino Acids in Health and Disease, Ed.D.Lodge, John Wiley and Sons Ltd., New York, NY1988, deren Lehren hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden. Weiterhin sind solche Verbindungen nützlich beim Studium der Physiologie von Zellen wie Nervenzellen und für die Kontrolle von wirbellosen Schädlingen. Verbindungen, die Calcium-Antagonisten sind, haben eine Vielzahl von Anwendbarkeiten. Calcium-Antagonisten finden klinische Anwendung bei der Behandlung solcher Zustände wie Angina, Bluthochdruck, Cardiomyopathien, supraventrikuläre Arrythmien, Oesophagus-Achalasie, vorzeitige Wehen und Raynauds Krankheit unter anderem. Siehe W. G. Nayler, Calcium Antagonists, Academic Press, Harcourt Brace Javanovich Publishers, New York, N. Y. 1988, deren Lehren durch Bezugnahme aufgenommen werden. Weiterhin sind solche Verbindungen nützlich für das Studium der Physiologie von Zellen wie Nerven- und Muskelzellen und zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Polyamine, die im Gift der Agelenopsis aperta Spinne gefunden wurden. Die Polyamine dieser Erfindung und die Fraktionen, in denen sie erfindungsgemäß vorhanden sind, sind die folgenden. Fraktion A'(AGEL 452):
Fraktion Ai (AGEL 468): OH 0
,NH.
HO
H NH2
Fraktion B1 (AGEL 505): HO
Die Polyamine der Erfindung und deren pharmazeutisch annehmbare Salze wirken exzitatorischen Aminosäure-Neuroir ansmittern, die Zellen beeinflussen, entgegen. Daher sind diese Polyamine geeignet zur Gegenwirkung für Neurotransmitter an sich. Die Polyamine der Erfindung sind auch geeignet zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen und zur Behandlung von Krankheiten und Zuständen in einem Säugetier, die durch exzitatorische Aminosäure-Neurotransmitter vermittelt werden. Diese Polyamine sind auch geeignet als Psychotherapeutika für Säugetiere.
Das Polyamin B, oben dieser Erfindung blockiert Calciumkanäle in Zellen. Daher ist dieses Polyamin Bi geeignet zum Blockieren von Calciumkanäien in Zellen an sich. Das Polyamin B1 ist auch geeignet zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen und zur Behandlung von Krankheiten und Zuständen in einem Säugetier, die durch Calciumkanalfunktionen in Zellen vermittelt werden. Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Polyamine umfassen und Verfahren zum Verabreichen dieser Polyamine.
Gift wird erhalten aus der Agelenopsis-aperta-Spinne durch das Verfahren des Melkens durch elektrische Stimulation gemäß den auf diesem Gebiet wohlbekannten Standard-Methoc' λ. Es ist bevorzugt, daß das angewendete Verfahren eines ist, das gegen die Kontamination des gesamten Giftes durch abdominalen Reflux oder Hämolymphe gesichert ist. Solche Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt. Das gesamte so erhaltene Gift wird in gefrorenem Zustand bei etwa -78°C gelagert, bis es zur unten beschriebenen Reinigung verwendet wird.
Die Reinigung der Konstituenten aus dem gesamten Gift wird bewirkt durch Reverse-phase-Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) auf einer Vielzahl von präparativen und halbpräparativen Säulen wie C-4 und C-18 Vydac®- Saulen (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Woburn Massachusetts 01801). Die Peakdetektion wird monochromatisch bei 220 bis 230 nm ausgeführt. Eine weitere Analyse der Fraktionen kann z. B. mit polychromen UV-Daten, die mit einem Waters Dioden-Felddetektor (Millipore Corporation, Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757) gesammelt wurden, durchgeführt werden. Die Fraktionen aus den Säulen werden durch bekannte Verfahren wie durch die Verwendung eines ISCO7„FOXY"-Fraktionssammlers und eines ISCO 2159 Peakdetektors (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska 68504) gesammelt werden. Die Fraktionen werden in Gefäßen geeigneter Größe wie sterilen Polyethylenlaborgeräten gesammelt. Die Konzentrierung der Fraktionen wird dann durch Lyophilisation von dem Elutionsmittel, gefolgt von einer Lyophilisation von Wasser, bewirkt. Die Reinheit der erhaltenen Konstituenten-Fraktionen kann dann durch chromatographische Analyse unter Verwendung einer analytischen Säule mit einem Gradientensystem bestimmt werden, das isokratischer ist als das System, das bei der Endreinigung der Fraktionen verwendet wird.
Die Strukturen, die in den jeweiligen Fraktionen enthalten sind, werden mit bekannten analytischen Verfahren wie Massenspektrometrie und kernmagnetische Resonanz bestimmt.
Bei Durchführung dieser Erfindung und Anwendung der oben erläuterten allgemeinen Methode wurde gefunden, daß eine geeignete Säule für die anfängliche Fraktionierung des Giftes eine C-18 Vydac*-Säule, 22mm x 250mm, 300 A Porengröße, 10μηι Teilchengröße ist. Diese Säule wird eluiert mit einer Durchflußrate von 15ml/min unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programs von 95%-* 80% A, 5% -> 20% B (0 -> 30min) dann 80% -> 30% A, 20% -> 70% B (30 -> 55min), worin A 0,1%ige wäßrige Trifluoressigsäure (TFA) und B Acetonitril ist. Die Fraktionen werden wie oben beschrieben gesammelt. 10 so erhaltene Fraktionen, benannt A, B, E, G, H, I, J, K, L und M, wurden für die weitere Analyse und/oder Reinigung ausgewählt. Zusätzlich wurde gefunden, daß die Fraktionierung des gesamten Giftes unter Verwendung einer C-18 Vydac®-Säule, 22mm x 250mm, 300 A Porengröße, 10μ Teilchengröße, die mit einer Durchflußrate von 15ml/min eluiert wird unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5% -> 10% B, 95% ->90% A (0 -» 30min), worin A und B wie oben beschrieben sind, unter anderem eine Fraktion liefert, die hier mit A' bezeichnet wird. Die Elutionszeiten der Fraktionen sind unten in den Beispielen 1 und 2 angegeben.
Die Fraktionen A, B, G, H, I, J und L werden einer weiteren Reinigung unterzogen unter Verwendung einer Vielzahl von Säulen und Gradienten-Programmen. Die Einzelheiten für jede Subfraktionierung und deren Ergebnisse sind in den Beispielen 3,4,6,7, 8 und 10 unten angegeben.
Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, umfassen die Fraktionen A', A1, A2, B1, B2 und E Polyjtmin-Verbindungen. Diese Verbindungen und die Fraktionen, in denen sie gefunden werden, sind die folgenden. Fraktion A'(AGEL 452):
Fraktion A, (AGEL 468):
OH
OH
OH Fraktion A2 (AGEL 448):
OH
Fraktion B1 (AGEL 505):
Fraktion B2 (AGEL 504!:
FAB MS: Hochauflösung: 50t\W
Fraktion E (AGEl. 489):
berechnet für
Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, enthalten die Fraktionen G, H2,1, J, L1, L2 und M Polypeptide. Diese Polypeptide und die Fraktionen, in denen sie gefunden werden, sind die folgenden:
Fraktion G:
l!ine aminoterminale Aminosäuresequenz, umfassend:
gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala-gly-gln-trpile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-ile-thrgly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-arg-gly-leu-lyslys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp-pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-;
Fraktion H2
val-cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lyscys-tyr-gly-lys-trp-his-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp-his-phe-thrgly-glu-gly-pro-cys-thr-cys-glu-lys-gly-met-lys-his-thr-cys-ile-thr-lys-leu-hiscys-pro-asn-lys-ala-glu-trp-gly-leu-asp-trp-;
Fraktion I:
cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys-cysasp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONHj; FAB
Fraktion J:
ser-cys-ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro-tyrcys-cys-pro-his-pro-asp-asp-ala-gly-arg-arg-thr-trp-cys-leu-val-asp-tyr-ser-argphe-val-thr-ile-cys-ser-gly-arg-lys-tyr-CONHi;FAB MS: 5506.
Fraktion L1
gly-asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ilegln-gln-lys-asn-lys-lys-gly-gly-phe-asp-;und ein ungefähres Molekulargewicht für das gesamte Polypeptid von etw 20000.
Fraktion L2:
Fraktion M:
gesamte Polypeptid von etwa 800GO.
vorhanden sind, ist es nun möglich, die Verbindungen durch andere Verfahren als durch Isolierung/Reinigung aus demgesamten Gift zu erhalten. Alle diese Verfahren liegen im Bereich der Erfindung. Zum Beispiel können die Polyamine, die in den
worin R H oder OH ist, wird in den Reaktionsschemen A bis D unten gezeigt.
(I)
'N-BOC H
(ID
-BOC
(V)
-BOC
BOC
(VI (BOC]2O
BOC
BOC
(VII)
BOC
(VIII)
BOC
BOC
(IX)
BOC
(X)
BOC
BOC
.N-BOC H
-BOC
(XI)
[BOC]
OCH2OCH3
(XX)
OCH2OCH3
OCH3OCH3
(XVII)
OCH2OCH3
NH
OCH2OCH3
OCH2OCH3
.OCH2CH=CH2
N^
BOC (XXI)
X +
BOC BOC
[R1 = H(XIV), R1- OCH2OCh3(XXIII)]
OH BOC BOC
(R' = H(XV), R' » OCH2OCH3(XXIV)]
(XXIV1
Reaktionsschema E
CH3OCH2O
OCH2CH=CH2
(XXVI)
CH3OCH3O
OCH2CH=CH2
(XXVIII)
(XXVII)
OH 0
OH
OH
OCH2OCH3
OH
OCH2OCH3 (XXXI)
OH 0
OCH0CH=CH.
2 *
OH (XXIX)
OCH2OCH3
OCH2CH=CH2
OCH3OCH3 (XXX)
6CH3OCH3
OCH2OCH3
OCH2OCH3
BOC BOC
(XXXII) or
(XXXIII)
(XXXIV) or
OCH^OCH *
(XXXV)
BOC
(XXXIV) or (XXXV)
(XXXVI) or
(XXXVII)
BOC
(XXXVIII)
N-BOC
XXXVIII
XXII
(XXXIX)
(XL)
(XLI)
(XL1)
-BOC
BOC H
-BOC
BOC H
Gemäß Reaktionsschema A wird die Polyamin-Zwischenprodukt-Verbindung der Formel X hergestellt durch ei ie Folge von Stufen, beginnend mit Diaminobutan. Reaktionsbedingungen, die geeignet sind, die Zwischenprodukt-Verbindung von Formel X gemäß dem Reaktionsschema A herzustellen, sind in Beispiel 11, Teile A bis I angegeben. Reaktionsschema B stellt ein Verfahren zur Herstellung der Zwischenprodukt-Verbindung von Formel XIII dar. Die Reaktionsbedingungen, die geeignet sind, dieses Zwischenprodukt gemäß Reaktionsschema B herzustellen, sind in Beispiel 11, Teile J bis L angegeben. Die Herstellung der Zwischenprodukt-Verbindung von Formel XXI ist Reaktionsschema C gezeigt. Die Reaktionsbedingungen, die geeignet sind für die Herstellung der Verbindung der Formel XXI gemäß dem Reaktionsschema C sind Beispiel 12, Teile A bis F angegeben. Die Herstellung der Polyamin-Verbindungen der Erfindung der Formeln XVI und XXV sind in Reaktionsschema D gezeigt. Die Reaktionsbedingungen, die geeignet sind zum Kuppeln der Zwischenprodukt-Verbindungen der Formeln X und XIII oder X und XXI und die nachfolgende Herstellung der Verbindungen der Formeln XVI und XXV sind in Beispiel 11, Teile M bis O und Beispiel 12, Teile G bis I angegeben.
Reaktionsschema E und F stellen Methoden für die Herstellung der Zwischenprodukt-Verbindungen XXVIII bzw. XXXI dar. Die Reaktionsbedingungen, die geeignet sind zur Herstellung des Zwischenprodukts gemäß dem Reaktionsschema E, sind im Beispiel 13, Teile A bis C angegeben. Die Reaktionsbedingungen, die geeignet sind für die Herstellung des Zwischenprodukts gemäß Reaktionsschema F, sind in Beispiel 14, Teile A bis C angegeben. Die Herstellung der Polyaminverbindungen der Erfindung der Formeln XXXVI und XXXVII wird in Reaktionsschema G gezeigt. Die Reaktionsbedingungen, die geeignet sind zum Kuppeln der Zwischenprodukt-Verbindungen der Formel X und XXVIII oder X und XXXI und die nachfolgende Herstellung der Verbindungen der Formeln XXXVI und XXXVII sind in Beispiel 8, Teile D bis F bzw. Beispiel 9, Teile D bis F angegeben. Das Reaktionsschema H stellt ein Verfahren für die Herstellung der erfindungsgemäßen Polyaminverbindung der Formel XLI dar. Die Reaktionsbedingungen, die geeignet sind für die Herstellung der Zwischenprodukt-Verbindung der Formel XXXVIII, das Kuppeln an die Zwischenprodukt-Verbindung der Formel XXII und die nachfolgende erfindungsgemäße Herstellung der Polyaminverbindung der Formel XLI werden in Beispiel 10 gezeigt.
Die Polyamine dieser Erfindung wirken reversibel exzitatorischen Aminosäure-Neurotransmittern, die Zellen, wie Zellen im Nervensystem einer Vielzahl von Organismen einschließlich Wirbellosen und Wirbeltieren beeinflussen, entgegen. Der Ausdruck Wirbeltiere, wie er hier durchweg verwendet wird, schließt Säugetiere ein. Der Ausdruck Wirbellose, wie er hier durchweg verwendet wird, soll z. B. Insekten, Ektoparasiten und Endoparasiten einschließen. Die Polyamine der Fraktion B1, wie oben beschrieben, blockieren auch reversibel Calciumkanäle, die in einer Vielzahl von Zellen wie Zellen im Nerven- und Muskel-, einschließlich Cardiovaskulär-System von Wirbellosen und Wirbeltieren vorhanden sind. Die Fähigkeit der Polyamine der vorliegenden Erfindung, den exzitatorischen Aminosäure-Neurotransmittern entgegenzuwirken, wird gezeigt durch ihre Fähigkeit N-Methyl-D-asparaginsäure (NMDA) induzierten Erhöhungen von cGMP in neugeborenen Rattenkleinhirnen zu blockieren gemäß dem folgenden Verfahren. Kleinhirne von 10 8 bis 14 Tage alten Wistar-Ratten werden schnell herausgeschnitten und in 40C KrebS'/Bicarbonatpuffer, pH 7,4 gebracht und dann in 0,5 mm χ 0,5 mm Abschnitte gehackt unter Verwendung eines Mcllwain- Gewebezerhackers (The Nickle Laboratory Engineering Co., Gomshall, Surrey, England). Die entstehenden Kleinhirnstücke werden in 100ml KrebsVBicarbonatpuffer mit 370C überführt, der kontinuierlich mit 95:5O2/CO2äquilibriert wird. Die Kleinhirnteile werden in dieser Weise 90 Minuten inkubiert mit dreimaligem Wechseln des Puffers. Der Puffer wird dann dekantiert, das Gewebe zentrifugiert (eine Minute, 3200 rpm) und das Gewebe in 20ml Krebs-/Bicarbonatpuffer resuspendiert. Dann werden 250μΙ Aliquots (ungefähr 2mg) entfernt und in 1,5ml Mikrozentrifuge-Röhrchen gebracht. Zu diesen Röhrchen werden 10μ der zu untersuchenden Verbindung aus einer Stammlösung zugegeben und anschließend 10μΙ einer 2,5mM Lösung von NMDA, um die Reaktion zu starten. Die endgültige NMDA-Konzentration ist 10μΜ. Den Kontrollen wird kein NMDA zugegeben. Die Röhrchen werden eine Minute bei 370C in einem Schüttelwasserbad inkubiert und dann werden 750μΙ einer 5OmM Tris-Cl, 5mM EDTA-Lösung zugegeben, um die Reaktion abzustoppen. Die Röhrchen werden sofort 5 Minuten in ein kochendes Wasserbad gestellt. Der Inhalt jeder Röhre wird dann 15 Sekunden beschallt unter Verwendung eines Sonden-Beschallungs-Sets auf Leistungsstufe 3.10μΙ werden entfernt und das Protein wird nach der Methode von Lowry, Anal. Biochem. 100:201-220 (1979) bestimmt. Die Röhrchen werden dann zentrifugiert (5 Minuten, lOOOOxg), 100μΙ des Überstands werden entfernt und der Gehalt an cyclischem GMP (cGMP) wird unter Verwendung eines New England Nuclear (Boston, Massachusetts) cGMP RIA-Tests nach dem Verfahren des Lieferers bestimmt. Die Daten werden angegeben als pmol cGMP erzeugt pro mg Protein.
Die Polypeptide der Erfindung blockieren irreversibel Calciumkanäle, die in einer Vielzahl von Zellen wie Zellen im Nerven- und Muskelsystem von Wirbellosen und Wirbeltieren vorhanden sind.
Die Fähigkeit des Polyamins der Fraktion B) und der Polypeptide der Fraktionen G, Hi, H2,1, J, K, L1, L2 und M, Calciumkanäle zu blockieren, wird durch das folgende Verfahren dargestellt. Dissoziierte Ratten-Neocortical-Neurone werden in Krebs-Bicarbonatpuffer, pH 7,4, enthaltend 2 mM CaCI2 und 1 % Rinderserumalbumin (BSA), suspendiert. Die Neuronen werden durch Zentrifugation sedimentiert und im selben Puffer, der zusätzlich 1 \im Fura2/AM (Sigma Chem. Co., P.O.Box 14508, St. Louis, Missouri 63178) enthält, resuspendiert. Die Zellen werden 15 Minuten bei 370C inkubiert, gewaschen und dann für weitere 15 Minuten Im selben Puffer ohne Fura2/AM inkubiert. Die Zellen werden dann im obigen Puffer, der jetzt 1,5mM CaCI2 enthält, gewaschen und bei Raumtemperatur etwa 5 bis 10 Minuten äquilibriert als konzentrierte Zellsuspension. In eine Quarzküvette werden 1,2ml des vorgewärmten (370C) BSA-freien Puffers, enthaltend 1,5mM CaCI2 und 1OmM Glucose gegeben, dann 0,3ml der oben hergestellten konzentrierten Zellsuspension. Die Küvette wird in einen thermostatisch geregelten (370C) Halter gestellt, der mit einem magnetischen Rührer ausgestattet ist und die Fluoreszenz wird mit einem Fluoreszenz-Spektrophotometer, wie Perkin Eimer 650-40 (Perkin Elmer, Wilton, Connecticut 06897) gemessen. Das Fluoreszenzsignal läßt man etwa 1 Minute sich stabilisieren. Dann werden 1 bis 4μΙ einer Stammlösung der zu untersuchenden Verbindung in Krebs-/Bicarbonatpuffer in geeigneten Konzentrationen zu der Küvette zugegeben. Die Kalibrierung der Fluoreszenzsignale und der Fura-2-Streulichtkorrektur wird unter Verwendung der eingeführten Verfahren von Nemeth et al., J. Biol. Chem. 262:5188 (1987) durchgeführt. Nach Vervollständigung jeden Tests wird der maximale Fluoreszenzwert (F018x) bestimmt durch Zugabe von lonomycin und der minimale Fluoreszenzwert (Fmi„) wird bestimmt durch anschließende Zugabe von 5 mM EGTA, um Calcium zu komplexieren. Unter Anwendung des vorhergehenden Verfahrens wird das Auftreten einer Calciumkanal-Blockade durch eine bestimmte Verbindung gezeigt durch einen Abfall der Fluoreszenz bei Zugabe der bestimmten Verbindung. Die Polyamine der Erfindung sind nützlich, um exzitatorischen Aminosäure-Neurotransmittern an sich entgegenzuwirken. Die Polyamine sind als solche auch nützlich zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen und zur Behandlung von durch exzitatorische
Aminosäure-Neurotransmitter übermittelten Krankheiten und Zustände in einem Säugetier wie Krampf, Schlaganfall, zerebrale Ischärr.ie, neuronal degenerative Störungen wie Alzheimer Krankheit und Epilepsie. Die Polyamine sind auch nützlich als Psychotherapeutika in einem, Säugetier. Weiterhin sind die Polyamine nützlich für die Untersuchung der Physiologie von Zellen einschließlich, aber nicht beschränkt auf Zellen des Nervensystems.
Das Polyamin der Fraktion B1 und die Polypeptide der Erfindung sind nützlich als Calciumkanal-Blocker in Zellen an sich. Als solche sind diese Verbindungen auch nützlich für die Kontrolle von wirbellosen Schädlingen und zur Behandlung von Krankheiten und Zuständen, die durch Calciumkanal-Funktionen in Zellen in einem Säugetier vermittelt werden wie Angina, Hochdruck, Cardiomyopathien, supraventrikuläre Arrythmien, Oesophagus Achalasie, vorzeitige Wehen und Raynaud's Krankheit. Weiterhin sind diese Verbindungen nützlich bei der Untersuchung der Physiologie von Zellen einschließlich, aber nicht beschränkt auf Zellen des Nerven- und Muskelsystems.
Auch im Bereich der Erfindung liegen die pharmazeutisch annehmbaren Salze der Polyamine und Polypeptide der Erfindung.
Diese Salze werden nach dem Fachmann wohlbekannten Verfahren gebildet. Zum Beispiel können Säureanlagerungssalze der Polyamine und Basensalze der Polypeptide gemäß üblichen Methoden hergestellt werden.
Wenn ein Polyamin oder Polypeptid dieser Erfindung an ein Säugetier verabreicht wird, kann es allein oder in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln in einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der üblichen pharmazeutischen Praxis verabreicht werden. Die Polyamine und Polypeptide können oral oder parenteral verabreicht werden, wobei der parenteral Weg der Verabreichung bevorzugt ist für die Polypeptide. Parenterale Verabreichung schließt intravenöse, intramuskuläre, intraperitoneale, subcutane und topische Verabreichung ein.
Für die orale Verwendung eines Polyamine oder Polypeptide der Erfindung kann die Verbindung z. B. in Form von Tabletten oder Kapseln verabreicht werden oder als wäßrige Lösung oder Suspension. Im Fall von Tabletten für orale Verwendung schließen Träger, die üblicherweise verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein und Gleitmittel wie Magnesiiimstearat, können üblicherweise zugegeben werden. Für die orale Verabreichung in Kapselform sind geeignete Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke. Wenn wäßrige Suspensionen für die orale Verwendung erforderlich sind, wird der aktive Inhaltsstoff mit emulgierenden und suspendierenden Mitteln kombiniert. Wenn gewünscht, können bestimmte Süßungs- und/oder Aromatisierungsmittel zugegeben werden.
Für intramuskuläre, intraperitoneale, subcutane oder intravenöse Verwendung werden üblicherweise sterile Lösungen des aktiven Inhaltsstoffes hergestellt und der pH der Lösungen sollte in geeigneter Weise eingestellt und gepuffert werden. Für intravenöse Verwendung sollte die Gesamtkonzentration der gelösten Stoffe kontrolliert werden, um die Zubereitung isotonisch zu machen.
Wenn ein Polyamin oder Polypeptid oder Salz davon dieser Erfindung für einen Menschen verwendet wird, wird die tägliche Dosierung normalerweise durch den verschreibenden Arzt bestimmt. Darüber hinaus wird die Dosierung mit Alter, Gewicht und Ansprechvermögen des jeweiligen Patienten ebenso wie mit der Schwere der Symptome des Patienten und der Wirkung der jeweiligen zu verabreichenden Verbindung variieren.
Wenn ein Polyamin oder Polypeptid odei deren Salz gemäß dieser Erfindung verwendet wird zur Kontrolle von wirbellosen Schädlingen, wird diese Verbindung dem Wirbellosen direkt verabreicht oder die Umgebung des Wirbellosen damit versorgt.
Zum Beispiel kann eine Verbindung dieser Erfindung als Lösung auf den Wirbellosen gesprüht werden. Die Menge der für die Kontrolle des Wirbellosen notwendigen Verbindung variiert mit dem Wirbellosen und den Umweltbedingungen und wird von der Person, die die Verbindung anwendet, bestimmt.
Wenn ein Polyamin oder Polypeptid oder deren Salz gemäß dieser Erfindung verwendet wird zur physiologischen Untersuchung von Zellen, wird die Verbindung gemäß dem Fachmann wohlbekannten Verfahren den Zellen zugeführt. Zum Beispiel kann die Verbindung den Zellen in einem geeigneten physiologischen Puffer zugeführt werden. Eine geeignete Konzentration der Verbindungen dieser Erfindung zur Anwendung in solchen Untersuchungen ist 100μΜ. Jedoch kann die Konzentration der Verbindungen in diesen Untersuchungen größer oder viel geringer als 100 pm sein. Die Menge der verabreichten Verbindung wird vom Fachmann gemäß wohlbekannten Methoden bestimmt.
Ausführungsbeispiele
Anfangsfraktionierung des Gesamtgiftes von Agelenopsis aperta
Das gesamte Gift von Agelenopsis aperta, das erhalten wurde von Natural Product Sciences Inc., Salt Lake City, Utah 84108 und das im gefrorenen Zustand bei etwa -780C gelagert wurde, wurde aufgetaut und 10 bis 60μΙ Menge davon wurden verdünnt auf 200μΙ
und aufeineC18-Vydace-Säule (22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße) geladen und eluiert unter Verwendung einer Durchflußrate von 15ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5% -♦ 20% B, 95% -> 80% A (0 -> 30 M'.iuten) dann 20% -> 70% B, 80% -* 30% A (30 -» 55 Minuten), worin A 0,1 % wäßrige TFA und B Acetonitril ist. Die Peakdetektion wurde monochromatisch bei 220 bis 230ηm durchgeführt und die Fraktionen wurden mit einem Isco/„FOXY" Fraktionssammler und einem Isco 2159 Peakdetektor gesammelt. Die Fraktionen wurden gesammelt von 20 Minuten bis 60 Minuten. Basierend auf der Peakdetektion wurden die folgenden Fraktionen gesammelt.
| Fraktion | Elutionszeit |
| A | etwa 21 Minuten |
| B | etwa 22,75 Minuten |
| E | etwa 27,5 Minuten |
| G | etwa 38 Minuton |
| H | etwa 39 Minuten |
| I | etwa 40 Minuten |
| J | etwa 40 Minuten |
| L | etwa 43 Minuten |
| M | etwa 48,3 Minuten |
beladen. Die Säule wurde unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter
durch Lyophilisation aus dem Elutionsmittei, gefolgt von einer Lyophilisation aus destilliertem Wasser gemäß
erhaltenen Daten und die davon abgeleitete Struktur sind wie folgt:
A': FABMS:M/Z453(M + 1)
(0 —> 30 Minuten), worin A 0,1 % wäßrige TFA und B Acetonitril ist. Die Peakdetektion wurde erreicht unter Verwendung eines
| Fraktion | Elutionszeit |
| A1 | etwa 7 Minuten |
| A2 | etwa 9 Minuten |
Die Fraktionen Ai und A2 wurden dann vorbereitet für die Spektralanalyse durch Lyophilisation aus dem Elutionsmittei, gefolgt von einer Lyophilisation aus Wasser gemäß Standardmethoden.
Die Struktur der Verbindungen, die in den Fraktionen Ai und A2 enthalten sind, wurde dann bestimmt unter Verwendung von FAB MS. Die so erhaltenen Daten und die davon abgeleiteten Strukturen sind wie folgt: A1: FABMS: M/Z 469 (M + 1), Hochauflösung: 469,3863 berechnet für C23H46N6O mit 2,0mmp Fehler Struktur: N-(20-Amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeicos-1-yl)-2,5-dihydroxy-benzamid,
OH
A2: FABMS: M/Z 449 (M + 1), 433,376,260,203
(0 -> 5 Minuten), dann 0%-»10% B, 100% -* 90% (5 -> 20 Minuten) (Waters Kurve 1) dann 10% -> 20% B, 90% -» 80% A(20 -♦ 30 Minuten) (Waters, Kurve 6) dann 20% -> 50% ö, 80% -»50% A (30 -* 40 Minuten) (Waters Kurve 11), worin A 0,1 %wäßrige TFA und B Acetonitril ist. Die Peakdetektion wurde durchgeführt unter Verwendung eines Waters 990 Dioden· Felddetektorsund die Fraktiossammlung wurde durchgeführt wie in Beispiel 1 oeschrieben. Zwei Fraktionen wurden erhalten wie folgt:
| Fraktion | Elutionszeit |
| B, | etwa 18,5 Minuten |
| B2 | etwa 21,5 Minuten |
Die Fraktionen wurden dann vorbereitet für die Spektralanalyse durch Lyophilisation aus dem Elutionsmittel, gefolgt von einer Lyophilisation aus Wasser gemäß Standardmethoden.
Die Struktur der Verbindung, die in Fraktion B1 enthalten ist, wurde unter Verwandung von FAB MS bestimmt, und die Ergebnisse hiervon sind wie folgt:
FAM MS: M/Z 506 (M + 1), 489,461,433,378,333, 260,231,215, 203,155,119 Hochauflösung: 506,3810 berechet für C26H48N7O3 Struktur: N-(20-Amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeicos-1-yl)-4-hydroxy-1 H-indol-3-acetamid,.
Das Molekulargewicht der Verbindung, die in Fraktion B2 enthalten ist, wurde unter Verwendung von FAB MS bestimmt, und das Ergebnis hiervon ist wie folgt: FABMS: Hochauflösung: 505,3861, berechnet für C27H48N6O3.
Struktur der in Fraktion E enthaltenen Verbindung
Fraktion E, die wie im Beispiel 1 beschrieben erhalten wurde, wurde für die Spektralanalyse vorbereitet durch Lyophilisation vom Elutionsmittel, gefolgt von einer Lyophilisation von Wasser gemäß Standardmethoden. Die Struktur der Verbindung, die in Fraktion E enthalten ist, wurde unter Verwendung von FAB MS, 'HNMR und 13CNMR bestimmt. Die so erhaltenen Daten und die davon abgeleitete Struktur sind wie folgt:
FAB MS: M/Z 400 (M + 1), 472,433,362,333,260,215,203,177,155,119.
Hochauflösung: 490,3860 berechnet für C26H48N7O2 mit Ο,βπιιημ Fehler
lHNMR(500Mhz,d6-DMSO):10,89(s,1H),8,90-7,85(m,6H)7,55(d,J = 8,0Hz,1H),7,34(d,J = 8,0Hz,1H),7,19(s,1H),7,08(dd, J = 8,0 Hz, J = 8,0Hz, 1H), 6,98 (dd, J = 8,0 Hz, J = 8,0 Hz, 1 H), 3,50 (s, 2 H), 3,13 (m, 2 H), 3,03 bis 2,82 (m, 18 H), 1,88 (m, 6 H), 1,78 (m, 2H), 1,62 (m, 4 H)
13C-NMR (125,76 Mhz, d 6-DMSO): 170,94,136,10,127,17,123,75,120,92,118,67,118,28,111,33,108,97,57,39,57,07,46,12,46,12, 44,06,43,89,43,89,36,52,36,22,32,78,26,71, 23,79,23,06,22,65,22,65,22,45
Struktur: N-(20-Amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazaeicos-1-yl)-1 H)-1 H-indol-3-acetamid
Alternativ und bevorzugt wurde das gesamte Gift wie in Beispiel 1 beschrieben fraktioniert mit der Ausnahme, daß als Lösungsmittelsystem und lineares Gradientenprogramm verwendet wurde 0% -> 20% B, 100% -> 80% A (0 -» 30 Minuten) mit der Peakdetektion bei 220nm. Die Fraktion, die bei etwa 26,0 Minuten eluierte, wurde auf eine Dynamax Phenylsäule (4,6mm x 250mm, 60 A Porengröße, 8 μ Teilchengröße) geladen und unter Verwendung einer Durchflußrate von 1 ml pro Minute und von isokratischen Bedingungen von 10% B, 90% A eluiert, wobei A und B wie in Beispiel 1 beschrieben waren. Die Peakdetektion erfolgte unter Verwendug eines Waters 990 Diodenfeld-Detektors (lambda = 220nm), und dio Fraktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, gesammelt. Die Fraktion, die bei etwa 55,27 Minuten eluierte, wurde vom Elutionsmittel lyophilisiert und anschließend von Wasser lyophilisiert gemäß den Standardmethoden, um die Verbindung dieses Beispiels zu liefern.
N-(20-Amino-4-hydroxy-4,8,12,17-tetraazeicos-1-yl-1 H-indol-3-acetamid
Die Synthese der Titelverbindung, von der festgestellt wurde, Haß sie in Fraktion E enthalten ist, wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
A.
(D
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 13,22g (0,15 Mol) Diaminobutan und 3,5ml Methanol gerührt, und 9,94ml (0,15 Mol) Acrylnitril wurden über eine Einspritzpumpe über einen Zeitraum von 2 Stunden unter Kühlung auf 0 bis 50C zugegeben. Die Mischung wurde nach etwa 18 Stunden auf 600g Silicagel chromatographiert unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems von 3:1 CH2CI2ZMeOH (21), gefolgt von 3:1 CH2CI2/Me0H, enthaltend 5 Vol.-% Isopropylamin (21). Die Fraktionen, die das gekuppelte Produkt enthielten, wurden durch Abdampfen im Vakuum konzentriert und lieferten ein gelbes viskoses Öl. Die NMR-Analyse bestätigte, daß das Produkt das gekuppelte Produkt von Formel I, das oben gezeigt ist, war.
(I)
(II)
^N-BOC H
BOC-
(III)
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 5,78g (0,041 Mol) der Verbindung der Formel I, hergestellt wie in Teil A oben beschrieben, zu 75 ml CH3CN und 11,48g KF Celite zugegeben und gerührt. Zu der Rührmischung wurde eine Lösung von 9,75g (0,041 Mol) der Verbindung von Formel II, die gemäß dem in Darstellung A beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, in 25ml CH3CN zugegeben. Der Ansatz wurde am Rückfluß erhitzt und durch TLC (3:1 CH2CI2/Me0H) überwacht. Nach 3 Stunden wurde der Ansatz abkühlen gelassen und bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Celite wurde dann abgefiltert, und der Filterkuchen wurde gut mit Dichlormethan gewaschen. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Da 3 rohe Produkt, das in dem konzentrischen Filtrat enthalten war, wurde auf Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 2 Litern 3:1 CH2CI2/Me0H, dann 2 Litern 3:1 CH2CI2ZMeOH und 10ml Isopropylamin, dann 2 Litern 3:1 CH2CI2/Me0H und 30ml Isopropylamin. Das Produkt eluierte von der Säule, nachdem die Säule mit Isopropylamin gesättigt worden war, war aber immer noch unrein. Alle Produktfraktionen wurden vereinigt und konzentriert. Silicagel wurde bereitet durch Aufschlämmen von 500g Silicagel in CH2CI2 und 125 ml Isopropylamin und dann verwendet, um eine Säule in üblicher Weise zu packen. Das rohe Produkt wurde auf die Säule geladen unter Verwendung von Dichlormethan. Dann wurden 500ml Dichlormethan durch die Säule laufen gelassen, gefolgt von 1 Liter 3:1 CH2CI2ZMeOH. Die Produktfraktionen wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, was 1,5 g Prcuukt der Formel III oben ergab. Weitere 2g des Produkts von Formel III wurden von der Säule unter Verwendung eines Liters 3:1 CH2CI2Z MeOH und 30 ml Isopropylamin eluiert.
C. III
[BOC)2O
BOC-
BOC
(IV)
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 3,5g (11,8mmol) der Verbindung von Formel III, die wie in Teil B oben beschrieben hergestellt wurde, und 150ml Dichlormethan gerührt und 5,2g (23,6mmol) Di-t-butyldicarbonat wurden zugegeben. Die Mischung wurde ungefähr 68 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde dann im Vakuum konzentriert und unter Verwendung von 4COg Silicagel und einem 60:4 HexanZEthylacetat-Lösungsmittel chromatographiert, was 5,62 g der Verbindung von Formel IV als Öl lieferte.
BOC
BOC
(IV)
BOC
(V)
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 3,0g der Verbindung der Formel IV, die wie in Teil C oben beschrieben, hergestellt wurde, in 30ml Essigsäure in einer 250ml Parr®-Bombe gelöst. Zu dieser Lösung wurden 3,0g Pd(OH)2/Kohlenstoff zugegeben und die Mischung wurde bei 50 psi H2 Druck 2 Stunden hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt, und der Kuchen wurde gut mit Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wurde konzentriert, in 75ml Dichlormethan aufgenommen, 2x mit 75ml 1 N NaOH gewaschen und über K2COj getrocknet. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, was 2,86g des Produkts von Formel V oben ergab.
-BOC
BOC
(VI)
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 2,86g (5,7 mmol) der Erfindung der Formel U, die wie in Teil D oben beschrieben hergestellt wurde, in 75ml Methanol gelöst. Unter Rühren wurden 0,41 ml (6,3mmol) Acrylnitril zu der Mischung zugegeben, und die Reaktion wurde über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann konzentriert, 3χ aus 30 ml Dichlormethan rokonzentriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen, was 3,18g der Verbindung der Formel Vl als Öl lieferte.
P BOC BOC
(VII)
Unter Stickstofatomosphäre wurden 3,18g (5,7 mmol) der Verbindung von Formel Vl, die wie in Teil E oben beschrieben hergestellt wurde, mit 100ml Dichlormethan vereinigt und zu einer Lösung gerührt. Zu dieser Lösung wurden 1,37g (6,3mmol) Di-t-butyldicarbonat zugegeben, und der Ansatz wurde 90 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann konzentriert und auf 300g Silicagel unter Verwendung von 60:40 Hexan/Ehylacetat als Elutionsmittel Chromatographien. Die Produktfraktionen wurden vereinigt, konzentriert, extrahiert mit 3x 20 ml Dichlormethan und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen, was 3,12g des Produkts der Formel VII oben lieferte.
VII
-BOC
(VIII)
Anschließend an das in Teil D oben beschriebene Verfahren wurden 3,12g (4,76mmol) der Verbindung der Formel VII, die wie in Teil F oben beschrieben hergestellt wurde, in 30ml Essigsäure gelöst und bei 55psi 2 Stunden in Gegenwart von 3,0g Pd(OH)2/ Kohlenstoff hydriert, was 3,02 g des Produkts der Formel VIII oben als Öl lieferte.
H. VIII
BOC
-BOC
(IX)
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 1,0g (1,5mmol) der Verbindung der Formel VIII, die wie in Teil G beschrieben hergestellt wurde, in 10ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,1 ml (1,67mmol) Acrylnitril zugegeben, und der Ansatz wurde über Nacht gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung konzentriert, 3x aus 20ml Dichlormethan rekonzentriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen, was 1,0g des Produkts der Formel IX oben ergab.
I. IX
BOC
(X)
Anschließend an das in Teil D oben beschriebene Verfahren wurden 1,0g (1,4mmol) der Verbindung der Formel IX, die wie in Teil H oben beschrieben hergestellt wurde, in 30 ml Essigsäure gelöst und bei 50 psi 2,5 Stunden hydriert, was 0,85g des Produkts der Formel X oben ergab.
Eine Lösung, die 6,73g (20mmol) Tetrabutylammoniumhydrogensulfat und 75ml H2O enthielt, wurde durch Rühren hergestellt und 3,36g (40 mmol) NaHCO3 wurden so wie es das Schäumen zuließ, zugegeben. Dann wurden 3,5g (20 mmol) Indolessigsäure zugegeben, die Mischung wurde 5 Minuten gerührt, und 75ml CHCI3 wurden zugegeben. Die Mischung wurde weitere 5 Minuten gerührt, und die zwei Bodenschichten wurden getrennt. Die wäßrige Phase wurde mit Na2SO4 ausgesalzen und mit CHCI3 extrahiert. Alle CHCI3-Extrakte wurden vereinigt und über Na2SO4 getrocknet. Die entstehende klare bernsteinfarbige Lösung wurde konzentriert, mit 3x 75 ml Aceton zerdrückt und schließlich in 75 ml Aceton gelöst. Dann wurden 1,9 ml (22 mmol) Allylbromid zugegeben, und die Mischung wurde 30 Minuten stehengelassen. Die Mischung wurde dann konzentriert und auf Silicagel unter Verwendung von 3:1 Hexan/Ethylacetat chromatographiert, was 3,75g des Produkts der Formel Xl oben als hellgelbes Öl lieferte.
XI
(XII)
Gemäß dem Verfahren in Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23:298 (1984) wurden 2,15g (lOmmol) der Verbindung der Formel Xl, die wie in Teil J oben beschrieben hergestellt wurde, mit 20ml Acetonitril vereinigt, und 2,61 g (12mmol) Di-t-butyldicarbonat wurden zu der Mischung zugegeben. Dann wurden 0,122g (1 mmol) 4-(N,N-dimethylamino)-pyridin zugegeben und die Reaktion 15 Minuten fortschreiten gelassen. Die Mischung wurde dann auf 125ml mit Ethylacetat verdünnt, mit 2x verdünnter HCI, 3x 25ml H20,2x Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und konzentriert. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Silicagel unter Verwendung von 14,5:1 Hexan/Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt, was 2,87 g der Verbindung der Formel XII oben als farbloses Öl lieferte.
XII
(XIII)
Zu 3,27g (10,4 mmol) der Verbindung der Formel XII, die gemäß Teil K oben hergestellt wurde, in 20ml Dichlormethan wurden 7,4ml Natrium-2-ethylhexanoat in Ethylacetat (0,231 g/ml) zugegeben. Dann wurden 0,5g 03P und 0,5g (03P)4Pd zugegeben, und die Mischung wurde 60 Minuten gerührt. Die Mischung wurde dann konzentriert, in 150ml Ethylacetat aufgenommen und mit 5x 25 ml H2O gewaschen. Die wäßrigen Extrakte wurden vereinigt und rückextrahiert mit 1 x 25 ml Ethylacetat und 1 x 25ml Diethylether. Zu der wäßrigen Phase wurden 75ml frisches Ethylacetat zugegeben und dann auf pH 3 angesäuert. Die Ethylacetatphase wurde abgetrennt, und die wäßrige Phase wurde mit einmal 50ml frischem Ethylacetat extrahiert. Die zwei Ethylacetat-Extrakte wurden vereinigt und mit 2x 20ml H2O, dann 1 x 20ml Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet, konzentriert, mit 3x 30 ml Hexan zerdrückt, wobei sich während des zweiten Zerdrückens Kristalle bildeten. Die Mischung wurde auf 75 ml mit Hexan verdünnt. Die Feststoffe wurden abgefiltert, gut mit Hexan gewaschen und an der Luft getrocknet, was 1,37 g weißen Feststoff lieferte. NMR bestätigte die Titelstruktur der Formel XIII.
M. XIII
BOC
BOC
(XIV)
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 200mg (0,73mmol) der Verbindung der Formel XIII mit 25ml Dichlormethan, 84mg (0,73mmol)N-Hydroxysuccinimid und 150mg (O^SmmoDDicyclohexylcarbodiimid vereinigt, wonach sich fast sofort ein Niederschlag bildete. Die Mischung wurde 3 Stunden gerührt. Dann wurde der Dicyclohexyl-Harnstoff abgefiltert und zu dem Filtrat wurde tropfenweise 40ml Lösung der Verbindung der Formel X, die wie in Beispiel 11, Teile A bis I beschrieben, hergestellt wurde, in Dichlormethan zugegeben. Die Mischung wurde 12 Stunden gerührt, dann mit 0,1 NaOH gewaschen und über K2CO3 getrocknet, konzentriert und unter Verwendung von 150g Silicagel Chromatographien und eluiert mit 9:1 Dichlormethan/ Methanol (0,5 Liter), um Verunreinigungen zu entfernen, dann mit 9:1:0,1 Dichlormethan/Methanol/Isopropylamin (2 Liter). Das Produkt wurde dann konzentriert, mit Dichlormethan zerdrückt und weiter konzentriert, was 400mg der Verbindung der Formel XIV ergab, was durch 300MHz NMR bestätigt wurde.
N.
XIV
BOC
BOC
(XV)
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 0,34 g (0,35 mmoi) der Verbindung der Formel XIV, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, mit 30ml Aceton vereinigt, zur Lösung gerührt und auf etwa O0C in einem Eis/Acetonbad gekühlt. Dann wurden 0,212g (1,05mmol) 85%ige 3-Chlorperoxybenzoesäure in 20ml Aceton tropfenweise 8 bis 10 Minuten lang zugegeben. Der Ansatz wurde 30 Minuten gerührt, dann auf 150ml mit Diethylether verdünnt und mit 2x 25 ml 10% K2CO3,2x 25ml H20,2x 25ml 10% K2CO3,2 χ 25ml H2O gewaschen und über K2CO3 getrocknet. Die Mischung wurde konzentriert, mit 2x 30ml Dichlormethan zerdrückt und im Vakuum konzentriert auf ein gleichbleibendes Gewicht von 0,33g. Die NMR-Analyse zoigte, daß das Produkt eine Mischung des gewünschten Produkts der Formel XV, des Ausgangsmaterials und eines Nebenprodukts war. Die Produktmischung wurde zu 3ml Essigsäure zugegeben, zu der 20mg NaCNBH3 zugegeben worden waren. Die Mischung wurde über Nacht gerührt, die Essigsäure im Vakuum abgezoppr,, in 50ml Dichlormethan gelöst und mit 1 x 75 ml wäßrigem Puffer, pH 7 gewaschen. Wenn notwendig, wurde der pH auf pH 7 mit 1N NaOH eingestellt, und die Dichlormethanphase wurde abgetrennt und mit 1 χ 50 ml wäßrigem Puffer, pH 7 und 1x 25 ml Kochsalzlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und im Vakuum konzentriert auf ein gleichbleibendes Gewicht von 0,31 g. Das entstehende Produkt wurde auf 100g Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 95:5 Ethylacetat/Methanol zur Elution und zum Sammeln von 25 ml Fraktionen. Das gereinigte Produkt der Formel XV kam herunter in den Abschnitten 18 bis 25. Diese Abschnitte wurden vereinigt, konzentriert, mit 2x 5ml Dichlormethan zerdrückt und im Vakuum konzentriert zu einem weißen Schaum von 68 mg, der bei — 80°C gelagert wurde. Die Abschnitte 26 bis 40, die at ch das gewünschte Produkt enthielten, enthielten auch einige Verunreinigungen. Die Abschnitte 26 bis 40 wurden vereinigt, konzentriert, mit Dichlormethan zerdrückt und im Vakuum auf ein gleichbleibendes Gewicht von 66mg konzentriert. Das letztere Produkt wurde mit 6mg des vorherigen Produkts vereinigt, das für NMR-Untersuchungen verwendet worden war und mit einer Mischung, die gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt worden war. Die entstehende Mischung wurde auf 75g Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 9:5 Ethylacetat/Methanol zur Elution und 25 ml Fraktionen gesammelt. Das gereinigte Produkt der Formel XV war in den Abschnitten 16 bis 21 vorhanden. Diese Abschnitte wi -r, vereinigt, konzentriert, mit 2x 5ml Dichlormethan zerdrückt und im Vakuum konzentriert auf ein gleichbleibendes Gev/icht von 46mg, das bei -80X gelagert wurde.
XV
(XVI)
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 108 mg (0,109mmol) der Verbindung der Formel XV, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, in 1,5ml Dichlormethan gelöst. Dann wurden 2ml Trifluoressigsäure zugegeben, und die Mischung wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann zu einem Film konzentriert, und 15ml Diethylether wurden zugegeben. Der Film verwandelte sich in einen Feststoff, und nach 30 Minuten Rühren ergab sich ein weißes Pulver. Das Pulver wurde gefiltert, gut mit Diethylether gewaschen, unter Stickstoit getrocknet, dann eingedampft auf ein gleichbleibendes Gewicht von 109 mg der Titelverbindung dieses Beispiels.
N-(20-Amino-4-hydroxyA8,12,17-tetraazeicos-1-yl)-4-hydroxy-1H-indol-3-acetamid Die Synthese der Titelverbindung, von der festgestellt wurde, daß sie in Fraktion B1 enthalten ist, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
OCH2OCH3
Unter Argonatmosphäre wurden unter Verwendung von flammengetrockneten Glaswaren 4,0g (30 mmol) 4-Hydroxyindol mit 25ml trockenem Aldrich DMF vereinigt und zur Lösung gerührt. Dann wurden 1,44g (30mmol) NaH als 50% öldispersion zugegeben. Nachdem sich der Schaum zersetzt hatte, wurden 2,5ml Chlormethylmethyiether (Aldrich) zugegeben und die entstehende dunkelgrüne Lösung wurde über Nacht gerührt. Dann wurde die Lösung auf 125 ml mit Ethylacetat verdünnt, mit 5x 25 ml H2O und 1x 25 ml Kochsalzlösung gewaschen, über Na2SO* getrocknet und unter Verwendung von 4:1 Hexan/ Ethylacetat Chromatographien. Die Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert, was 2,70g der Verbindung XVII als Öl ergab.
H Cn
XVII + NH
OCH2OCH3
(XVIII)
In einem 50-ml-Dreihals-Rundkolben, der mit einem mechanischen Rührer ausgestattet war und unter Stickstoffatmosphäre wurden 1,3g wäßriger Formaldehyd (37%) und 2,28g Essigsäure gekühlt. Dann wurden 3,23ml gekühltes Dimethylamin (25% in H2O) zugegeben. Zu der entstehenden gekühlten Lösung wurden 2,7g (15,2 mmol) der Verbindung der Formel XVII zugegeben unter Verwendung von etwa 1,5 bis 2,0ml Tetrahydrofuran als Übertragungs-Lösungsmittel. Der Ansatz wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Dann wurden 40ml 10% NaOH zugegeben, wonach sich ein Niederschlag bildete. Nach Rühren wurde der Niederschlag filtriert, mit H2O gewaschen und luftgetrocknet, was 3,26g der Verbindung der Formel XVIII lieferte.
C.
XVIII
(XIX) (XX)
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 4,62g KCN mit 10 ml H2O vereinigt und zu einer Lösung gerührt. Dann wurden 30ml Ethanol und 3,26g (14 mmol) der Verbindung XVIII zugegeben, und die Mischung wurde gerührt und am Rückfluß 65 Stunden erhitzt. Der Ansatz wurde gekühlt und konzentriert. Der entstehende Niederschlag, de·· die Verbindung XX enthielt, wurde filtriert, mit H2O gewaschen und luftgetrocknet. Die wäßrige Phase wurde mit 4x 15ml Dichlormethan extrahiert, wobei die organischen Extrakte aufgehoben wurden. Die wäßrige Phase wurde dann mit 50ml Ethylacetat überschichtet und auf pH 2 angesäuert. Die Ethylacetatphase wurde abgetrennt, entgast, indem Stickstoff durch die Ethylacetatphase geperlt wurde, getrocknet und zu einem Feststoff konzentriert, der mit Diisopropyletherverriebon wurde, was 1,03g der Verbindung XIX als grauweißen Feststoff lieferte. Dann wurden alle Extrakte aus der basischen wäßrigen Phase vereinigt, getrocknet, mit den Filtraten von oben vereinigt und konzentriert, was 0,4g der Verbindung XX als Feststoff lieferte.
u XX-^XIX
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 1,Gg der Verbindung XX mit7,5ml Ethanol, 30ml H2O l a 1,3g KOH vereinigt. Die Mischung wurde am Rückfluß erhitzt und über Nacht gerührt. Dann wurde der Ansatz gekühlt, mit 2; ' Ethylacetat extrahiert, mit
frischem Ethylacetat überschichiet und auf pH 2 angesäuert. Die vereinigten Ethylacetatph . ... wurden getrocknet und konzentriert. Der entstehende Feststoff wurde mit IPE verrieben, was 1,1g der Verbindung AlX lieferte.
E.
OCH2OCH3
XIX
OCH2CH=CH2
BOC (XXI)
In 10ml H2O wurden 1,44g (4,25mmol) TBAHSO4 gelöst. Dann wurden 714mg (8,5mmol) NaHCO3 zugegeben. Nachdem der Schaum zerl alien war, wurden 1,0g (4,25mmol) der Verbindung der Formel XIX zugegeben, und die Mischung wurde eine Minute gerührt, bevor 40ml Chloroform zugegeben wurden. Die Reaktion wurde 5 Minuten gerührt, die Chloroformschicht abgetrennt und dann die wäßrige Mischung mit 1 χ 15ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte wurden getrocknet, konzentriert und mit 2x 30ml Aceton zerdrückt. Dann wurde das Produkt wieder in 30ml Aceton unter Stickstoffatmosphäre gelöst, 0,37 ml (4,25mmol) Allylbromid zugegeben, und der Ansatz wurde 2 Stunden gerührt. Die Mischung wurde konzentriert und chromatographiert unter Verwendung von Ethylacetat als Elutionsmittel. Das Produkt wurde konzentriert, was 1,1 g eines Öls ergab. Das gesamte Produkt wurde vereinigt mit 25ml Dichlormethan und 0,98g (4,5mmol) Di-t-butyldicarbonat, und 51 mg (0,425mmol) 4-(N,N-Dimethylamino)-pyridin wurden zugegeben. Der Ansatz wurde über Nacht gerührt. Dann wurde die Reakticnsmischung konzentriert und chromatographiert unter Verwendung von 9:1 Hexan/Ethylacetat, was nach Konzentration 1,33g der Verbindung der Formel XXI als viskoses Öl lieferte.
F.
XXI
BOC
(XXII)
In 2 ml Methanol wurden 64 mg (0,17 mmol) der Verbindung der Formel XXI gelöst. Zu der Lösung wurden 1,7 ml 0,1 NaOH zugegeben und die entstehende Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt. Der Ansatz wurde dann angesäuert, getrocknet, mit Ethylacetat extrahiert und konzentriert. Die NMR-Analyse zeigte, daß alles von dem Allylester der Verbindung XXI entfernt worden war, daß aber etwas Umesterung stattgefunden hatte und etwas Methylester vorhanden war. Daher wurde das Produkt mit der verbleibenden Menge der Verbindung XXI (ungefähr 1,26g) gelöst in 5 ml Tetrahydrofuran vereinigt und auf O0C gekühlt. Dann wurde 3,8ml 1 N NaOH zugegeben, der Ansatz 5 Minuten bei 0°C gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Die Reaktion orgab zwei Phasen, die die Zugabe von 5ml Methanol erforderten, um die Phasen zu entfernen. Der Ansatz wurde über Nacht gerührt. Dann wurden Tetrahydrofuran und Methanol abgezogen, und die verbleibende wäßrige Lösung wurde mit 50 ml Ethylacetat überschichtet und auf pH 2 angesäuert. Die Ethylacetatphase wurde abgetrennt, mit 1 χ 20 ml HjO, 1 χ mit Kochsalzlösung gewaschen, mit Na2SO4 getrocknet, filtriert und konzentriert zu ejnem Gummi, der kristallisierte, sobald er mit Hexan verrieben wurde, was 1,08g eines weißen Feststoffs ergab. Der Feststoff wurde chroma'ographiert unter Verwendung von 70:30 Ethylacetat/Hoxan, und die reinen Produktabschnitte wurden vereinigt, konzentriert und kristallisiert aus Ethylacetat/ Hexan, was 0,884g der Verbindung der Foirmel XXII lieferte.
G.
XXII
BOC
N-BOC
POC
OCH-OCH
BOC
N-BOC
BOC
(XXIII)
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 271 mg (0,81 mmol) der Verbindung der Formel XXII unter Rühren in 4 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Dann wurden 93mg (0,81 mmol) N-Hydroxysuccinimid und 167mg (0,81 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben, und die Mischung wurde gerührt. Nach einer Stunde und 50 Minuten wurden 0,58g (0,8 mmol) der Verbindung der Formel X, die gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, in 30 ml Dichlormethan zugegeben, und die Mischung wurde über das Wochenende gerührt. Dann wurde der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, und die Mischung wurde mit 2x 3ml 1 N NaOH extrahiert, über K2CO3 getrocknet und konzentriert. Das Produkt wurde dann auf 100g Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 9:1 Dichlormethan/Methanol, um alles bis auf das gewünschte Produkt zu eluieren und dann mit 90:10:1 Dichlormethan/Methanol/Isopropyiamin, um das Produkt zu eluieren. Die Produkt enthaltenden Fraktionen wurden konzentriert, mehrere Male mit Dichlormethan zerdrückt und das Lösungsmittel abgezogen, was 349 mg der Verbindung der Formel XXIII als weißen Schaum lieferte. Alternativ und bevorzugt wurde eine 50-ml-Lösung, die 0,480g (1,43mmol) der Verbindung der Formel XXII in Dichlormethan enthielt mit 0,165g (1,43mmol) N-Hydroxysuccinimid und anschließend 0,294g (1,43mmol) Dicyclohexylcarbodiimid behandelt und 5 Stunden rühren gelassen. Die Reaktionsmischung wurde filtriert, und das das rohe Hydroxysuccinimid enthaltende Filtrat wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 20 Minuten zu einer 100-ml-Lösung von 1,03g (1,43 mmol) der Verbindung der Formel X, die nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, in Dichlormethan zugegeben. Der Ansatz wurde 72 Stunden gerührt. Dann wurde die rohe Reaktionsmischung zweimal mit 20ml 1N NaOH gewaschen, über K2CO3 getrocknet, filtriert und konzentriert. Das Produkt wurde dann auf Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 4:1 Dichlormethan/Methanol und anschließend 9:1:1 Dichlormethan/Methanol/Diisopropylamin, um 912 mg der Verbindung der Formel XXIII zu ergeben.
H.
XXIII
OCH2OCH3
OH
BOC
BOC
N-BOC
BOC
(XXIV)
Unter einer Stickstoffatmosphäre wurde lndolacetamid XXIII (900 mg, 0,87 mmol) in 40 ml Dichlormethan gelöst. Zu dieser Lösung wurde 2-(Phenylsulfonyl)-3-phenyloxaziridin (500mg, 1,92 mmol) zugegeben. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch Dünnschicht-Chromatographie überwacht. Nach einer Stunde wurde die Reaktionsmischung im Vakuum konzentriert, was hauptsächlich das rohe Nitron ergab, das in 35ml Essigsäure gelöst wurde. Ein großer Überschuß Natriumcyanoborhydrid (1,00g, 15,9 mmol) wurde zugegeben und die Reaktion etwa 2 Stunden rühren gelassen. Der Ansatz wurde im Vakuum konzentriert, in Dichlormethan (50mi) aufgenommen, mit Puffer, pH (1 χ 50ml) gewaschen, wobei der pH auf 7 mit 1 N NaOH eingestellt wurde. Die organische Phase wurde wieder mit Puffer, pH 7 (1 x 50 ml) gewaschen, über Kaliumcarbonat getrocknet und im Vakuum konzentriert, um ein Rohprodukt zu erzeugen, das auf Silicagel chromatographiert wurde unter Verwendung von 95:5 Ethylacetat/Methanol, was 612mg (67%) von XXIV als weißen Schaum lieferte.
I.
XXIV
>
(XXV)
3 ml Trifluoressigsäure wurden entgast, indem dreimal ein Vakuum angelegt und mit Argon entlüftet wurde. Dann wurde der Kolben in Aluminiumfolie eingewickelt, und 98 mg der Verbindung XXIV wurden zugegeben, wobei etwa 2,5 ml Dichlormethan als Übertragungsmittel verwendet wurden. Nach 45 Minuten wurde die Mischung konzentriert, was ein Öl lieferte, das bei Verreibung mit Diethylether 88 mg der Verbindung XXV als weißen Feststoff ergab, der bei -80°C gelagert wurde. Alternativ und vorzugsweise wurden zu einer gesättigten 100-ml-Dioxan-HCI-Lösung, die mit Argon gespült wurde, über 1,5 Minuten 0,520g (0,495mmol) der Verbindung der Formel XXIV, die gemäß dem in Teil H oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, in 10ml Dioxan zugegeben. Es bildetesich sofort ein Niederschlag, und der Ansatz wurde eine Stundegerührt. Dann wurde Diethylether zugegeben, und nach 5 Minuten wurde die Lösung filtriert. Die entstehenden Feststoffe wurden mit Diethylether gewaschen, unter Stickstoffatmosphäre und dann unter vermindertem Druck getrocknet, was 345 mg der Säure der Formel XXIV lieferte, die bei —78°C gelagert werden konnte. Dann wurden zu einer wäßrigen Lösung, die mit Argon gespült wurde, 150mg (0,205mmol) der Säure der Formel XXIV zugegeben. Die Reaktion wurde durch HPLC überwacht. Nach Vervollständigung der Reaktion nach etwa 7 Stunden wurde die Reaktionsmischung gefriergetrocknet, was 103 mg der Verbindung der Formel XXV als Hydrochloridsalz ergab.
wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
OCH2CH=CH2
(XXVI)
In einem 400-ml-Becherglas wurden 6,78g (20mmol) Tetrabutylammonium-hydrogensulfat mit 60ml Wasser vereinigt und zu einer Lösung gerührt. Dann wurden 3,36g (40mmol) NaHCO3 zugegeben so wie es das Schäumen erlaubte, gefolgt von der Zugabe von 40ml einer Lösung, die 2,76g (20mmol) p-Hydroxvbenzoesäure, 0,8g NaOH und 40ml H2O enthielt. Die
Reaktionsmischung wurde 5 Minuten gerührt, und dann wurden 200ml Dichlormethan zugegeben. Die Mischung wurde weitere 5 Minuten gerührt und die Phasen wurden sich trennen gelassen. Die wäßrige Phase wurde zweimal mit 50ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten Dichlormethanextrakte wurden über Na2SO4 getrocknet, konzentriert und zweimal mit 75 ml Aceton zerdrückt und wieder gelöst in 50ml Aceton. Dann wurden 1,9ml (22mmol) Allylbromid zugegeben, und die Mischung wurde gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann konzentriert, h 100ml Ethylacetat aufgenommen, zweimal mit 30ml H2O, einmal mit 50ml gesättigtem Bicarbonat, einmal mit 30ml H2O, ein.nal mit Kochsalzlösung, einmal mit H2O und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen. Das entstehende Produkt wurde getrocknet und konzentriert, was ein Öl lieferte. Das Öl wurde mit 50ml Petrolether eine Stunde verrieben. Dann wurde die Mischung filtriert, gut mit Petrolether gewaschen und luftgetrocknet, was 1,7d der Verbindung der Formel XXVI oben ergab.
B.
XXVI
CH3OCH2O
OCH2CH=CH2
(XXVII)
Untsr einer Stickstoffatmosphäre wurden 1,7g (9,55 mmol) der Verbindung der Formel XXVI, die wie in Teil A oben beschrieben hergestellt wurde, mit 50ml trockenem Aldrich DMF vereinigt und zur Lösung gerührt. Dann wurden 0,38g (9,55mmol) NaH als 60%ige Öldispersion zugegeben und die Reaktion über Nacht gerührt. Dann wurden 0,76 ml Chlormethylmethylether (Aldrich) zugegeben, wonach sich sofort ein Niederschlag bildete. Die Reaktionsmischung wurde 18 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde in 200ml Ethylacetat/IOOml H2O abgeschreckt. Die Ethylacetatphase wurde abgetrennt, dreimal mit 50ml H2O, einmal mit 50ml 1N NaOH, einmr! mit 50ml H2O und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen. Die entstehende Lösung wurde getrocknet, konzentriert und auf Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 4:1 Hexan/Ethylacetat, was 1,63 g der Verbindung der Formel XXVII lieferte.
C.
XXVII
CH3OCH2O
(XXVIII)
In 75ml Tetrahydrofuran wurden 1,62g (7,3mmol) der Verbindung der Formel XXVII, die wie in Teil B oben beschrieben hergestellt wurde, gelöst. Dann wurde eine Lösung, die 0,4g dOmmol) NaOH in 15ml H2O enthielt, zugegeben, was zur Bildung von zwei Phasen führte. Methanol wurde zugegeben, bis eine homogene Mischung erhalten wurde. Der Ansatz wurde dann über Nacht gerührt. Das Tetrahydrofuran und Methanol wurden im Vakuum abgezogen, und die verbleibende wäßrige Lösung wurde zweimal mit 15ml Ethylacetat extrahiert. Dann wurde die wäßrige Phase mit 50 ml frischem Ethylacetat überschichtet und auf pH 2,5 mit 6N HCI angesäuert. Dann wurde die Ethylacetatphase abgetrennt, einmal mit 10ml H2O und einmal mit 25ml Kochsalzlösung gewaschen. Die entstehende Lösung wurde konzentriert, was Feststoffe ergab, die mit Hexan verrieben wurden, filtriert wurden und luftgetrocknet wurden, was 1,2g der Verbindung der Formel XXVIII oben lieferte.
0.
XXVIII
OCH2OCH3
BOC
(XXXII)
BOC
Eine 20ml Dichlormethanlösung, enthaltend 0,127g (0,7mmol) der Verbindung der Formel XXVIII, die wie oben in Teil C beschrieben hergestellt wurde, wurde mit 0,081 g (0,7mmol) N-Hydroxysuccinimid, anschließend 0,144g (0,7mmol) Dicyclohexylcarbodiimid behandelt und 4 Stunden rühren gelassen. Dann wurde die Reaktionsmischung filtriert, und das Filtrat, das das rohe Hydroxysuczinimid enthielt, wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 20 Minuten zu einer 80ml DrMormethanlösung, enthaltend 0,50g (0,7mmol) derVerbindung der Formel X, die nach dem in Beispiel 6,Tr-Ie A bis I oben be.'.criebenen Verfahren hergestellt war, zugegeben. Der Ansatz wurde dann stundenlang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit 1N NaOH (2x 20ml) gewaschen, über Kaliumcarbonat getrocknet, filtriert und konzentriert. Das Konzentrat wurde auf Silicagel chromatographiert unter Verwendung von 9:1 Dichlormethan/Methanol und anschließend 9:1:0,25 Dichlormethan/Methanol/Diisopropylamin, was 370 mg derVerbindung der Formel XXXII oben lieferte.
E. XXXII
OCH2OCH3
BOC
BOC
(XXXIV)
Unter einer Stickstoffatmosphäre wurden 0,335g (0,38 mmol) der Verbindung der Formel XXXII, die nach dem in Teil D oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, in 30ml Dichlormethan gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,230g (0,88mmol) 2-(Sulfonylphenyl)-3-phenyloxaziridin zugegeben. Nach 0,5 Stunden wurde der Ansatz im Vakuum konzentriert, und das Konzentrat wurde in 15ml Essigsäure gelöst. Ein großer Überschuß an Cyanoborhydrid (0,100 g, 1,6 mmol) wurde zugegeben, und der Ansatz wurde 2 Stunden gerührt. Dann wurde der Ansatz im Vakuum konzentriert, in 50ml Dichlormethan aufgenommen, einmal mit 50ml Puffer, pH 7 gewaschen, wobei der pH auf 7 min N NaOH eingestellt wurde. Die organische Phase wurde wieder mit 50ml Puffer, pH 7 gewaschen, über Kaliumcarbonat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wurde auf Silicagelchromatographiert unter Verwendung von 50:10 Aceton/Hexan, was 253mg der Verbindung der Formel XXXIV oben lieferte.
(XXXIV)
(XXXVI)
Unter einer Argonatmosphäre wurden bei Raumtemperatur 0,20g (0,223 mmol) der Verbindung der Formel XXXIV, die gemäß dem in Teil E oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, und 5ml Trifluoressigsäure vereinigt. Der Ansatz wurde 1,5 Stunden gerührt. Weitere 2 ml Trifluoressigsäure wurden zugegeben, um die Wände des Kolbens zu waschen. Die Reaktion wurde weitere 1,5 Stunden fortschreiten gelassen. Dann wurde der Ansatz im Vakuum konzentriert, mit Ethylether verrieben, filtriert und unter einer Stickstoffatmosphäre getrocknet, was 218mg der Verbindung der Formel XXXVI, der Titelverbindung dieses Beispiels, lieferte.
wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
OCH2CH=CH2
Unter Anwendung des in Beispiel 7, Teil A beschriebenen Verfahrens, jedoch beginnend mit 3,08 g (20 mmol) 2,5-Dihydroxybenzoesäure erhielt man 3,0g der Verbindung der Formel XXIX oben.
B.
OCH2OCH3
XXIX
OCH2CH=CH2
OCH2OCH3
(XXX)
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 3,0g (15,5 mmol) der Verbindung der Formel XXIX mit 50 ml trockenem Aldrich DMF vereinigt und zur Lösung gerührt. Dann wurden 1,24g (31 mmol) NaH als 60%ige Öldispersion zugegeben, und die Mischung wurde gerührt. Nach 3 Stunden wurden 2,5ml (33mmol) Chlormethylmethylether zugegeben, und die Reaktion wurde 18 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wur J j dann zu 300 ml Ethylacetat und 100ml HiO zugegeben. Die Ethylacetatphase wurde dann abgetrennt und dreimal mit 75ml H20,2x mit 75ml 1N NaOH,zweimal mit 50ml H2O und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen. Die entstehende Lösung wurde getrocknet und konzentriert, was 2,9g eines Öls ergab, das auf Silicagel chromatographiert wurde unter Verwendung von 4:1 Hexan/Ethylacetat, was zwei Fraktionen lieferte, von denen die zweite Fraktion 1,16g der Verbindung der Formel XXX oben enthielt.
C.
OCH2OCH3
XXX
OCH2OCH3 (XXXI)
Zu 10ml Tetrahydrofuran wurden 1,16g (4,1 mmol) der Verbindung der Formel XXX oben zugegeben. Dann wurden 0,24 g (6mmol) NsOH in 10ml H2O zugegeben, was zur Bildung von zwei Phasen führte. Methanol wurde zugegeben zu der Mischung, bis eine Phase erhalten wurde, und dann wurde die Mischung 18 Stunden lang gerührt. Die Lösungsmittel wurden dann entfernt, und die verbleibende wäßrige Lösung wurde zweimal mit 15ml Ethylacetat extrahiert. Die wäßrige Phase wurde dann mit 35 ml frischem Ethylacetat überschichtet, und der pH wurde auf 2,5 mit 6N HCI eingestellt. Die Ethylacetatphase wurde dann abgetrennt, einmal mit 10ml H2O und einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und konzentriert, was 1,0g der Verbindung der Formel XXXI oben als Öl ergab.
D.
XXXI
OCH2OCH3
N-BOC
BOC
OCH2OCH3
(XXXIII)
Unter Anwendung des in Beispiel 8, Teil D beschriebenen Verfahrens und unter Verwendung von 0,17g (0,7 mmol) der Verbindung der Formel XXXI, die wie in Teil C oben beschrieben hergestellt wurde, 0,081 g (0,7 mmol) N-Hydroxysuccinimid, 0,144g (0,7 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid und 0,50g (0,7mmol) der Verbindung der Formel X, die gemäß dem in Beispiel 11, Teile A bis I beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, enthielt man nach Chromatographie 370 mg der Verbindung der Formel XXXIII oben.
XXXIII
OCH2OCH3
BOC
,N-BOC H
BOC
BOC
(XXXV)
Unter Anwendung des im Beispiel 8, Teil E beschriebenen Verfahrens und unter Verwendung von 0,308g (0,33 mmol) der Verbindung der Formel XXXIII, die nach dem in Teil D oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde und 0,250g (0,96 mmol) 2-(Sulfonylphenyl)-3-phenyloxaziridin erhielt man nach Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von Ethylacetat und anschließend 50:50 Aceton/Hexan 210mg der Verbindung der Formel XXXV oben.
P.
XXXV
OH
OH
(XXXVII)
Unter Anwendung des in Beispiel 8, Teil F beschriebenen Verfahrens und unter Verwendung von 0,100g (0,104 mmol) der Verbindung der Formel XXXV, die gemäß dem oben in Teil E beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, erhielt man 108 mg der Verbindung der Formel XXXVII, der Titelverbindung dieses Beispiels.
N-Ue-Amino^-hydroxy^.e.iS-triazahexadec-i-ylM-hydroxy-IH-indol-S-acetamid Die Synthese der Titelverbindung, von der festgestellt wurde, daß sie in Fraktion A2 enthalten ist, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
VI
N-BOC
(XXXVIII)
Unter Anwendung des in Beispiel 11, Teil D beschriebenen Verfahrens und unter Verwendung von 1,15g (2,07mmol) der Verbindung der Formel Vl, die wie in Beispiel 6, Teile A bis E beschrieben hergestellt wurde, erhielt man 1,10g der rohen Verbindung der Formel XXXVIII oben.
B* XXXVIII
XXII
OCH2OCH3
BOC
-BOC
BOC
(XXXIX)
Unter Anwendung des in Beispiel 7, Teil G beschriebenen alternativen Verfahrens und unter Verwendung einer Dichlormethanlösung (15ml), die 0,228 g (6,8mmol) der Verbindung der Formel XXII, die wie in Beispiel 12, Teile A bis F oben beschrieben hergestellt wurde, 0,380g (6,8 mmol) der Verbindung der Formel XXXVIII, die wie in Teil A oben beschrieben
hergestellt wurde, 0,078 g (6,8 mmol) N-Hydroxysuccinimid und 0, v,0g (6,8 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid enthielt, erhielt man 0,407g der Verbindung der Formel XXXIX nach Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von 9:1 Dichlormethan/Methanol und anschließend 9:1:0,5 Dichlormethan/Methanol/Diisopropylamin.
C.
XXXIX
OCH2OCH3
BOC
(XL)
Die Anwendung des in Beispiel 7, Teil H beschriebenen Verfahrens und die Vervyendung von 0,350fj (0,4mmol) der Verbindung der Formel XXXIX und 0,230g (0,88mmol) 2(Sulfonylphenyl)-3-phenyloxaziridin ergab 0,274g der Verbindung der Formel XL oben nach Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von 50:50 Aceton/Hexan. Das Produkt enthielt eine geringe Menge Phenylsulfonamid und wurde daher weiter gereinigt auf Silicagel unter Verwendung von Ethylacetat und anschließend 50:50 Aceton/Hexan.
D.
XL
(XLI)
Die Anwendung des alternativen Verfahrens von Beispiel 7, Teil I und die Verwendung von 0,166g (0,186 mmol) der Verbindung der Formel XL, die nach dem in Teil C oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, lieferte nach Dioxan/HCI-Behandlung die rohe Säure. Die Säure der Formel XL' wurde in Wasser 8 Stunden gelöst, anschließend gefriergetrocknet, was 88 mg der Verbindung der Formel XLI ergab.
Unter Stickstoffatmosphäre wurden 34,5g (157,6mmol) 3-Brompropylamin HBr in 600ml Ν,Ν,-Dimethylformamid gerührt. Zu dieser Lösung wurden 34,4g (157,6mmol) Di-t-butyldicarbonat und anschließend 32,3ml (236mmol) Triethylamin zugegeben. Es bildete sich sofort ein Niederschlag. Der Ansatz wurde über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf 1,5I mit Ethylacetat verdünnt, einmal mit 500ml 1 N HCI, dreimal mit 500ml Wasser, einmal mit Kochsalzlösung gewaschen und über Na2SO* getrocknet. Nach Konzentration wurde das Produkt auf QOO g Silicagel unter Verwendung von 4:1 Hexan/Ethylacetat chromatographiert und die Fraktionen wurden durch Dünnschicht-Chromatographie (KMnO4ZI2) überwacht. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen w *Hen vereinigt, im Vakuum konzentriert, zweimal mit 50ml Dichlormethan zerdrückt und im Hochvakuum gereinigt, was 25,8g des Produkts dieser Darstellung lieferte.
Claims (2)
- Patentanspruch:Verfahren zur Herstellung einer im wesentlichen reinen Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend ausH? H H H
- 2 'einer Verbindung mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften:(a) vorhanden in einer Fraktion aus dem rohen Gift der Agelenopsis aperta Spinne, die von einer C-18 Vydac®-Säule, 22 mm x 250 mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße, unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradientenprogramms von 5% -» 20% B, 95% -» 80% A [0 -» 30 Minuten], 20% -» 70% B, 80% -> 30% A [30 -> 55 Minuten], worin A 0,1%ige wäßrige TFA und B Acetonitril ist, bei etwa 22,75 Minuten eluiert wird;(b) vorhanden in einer Fraktion der in (a) oben beschriebenen Fraktion, die von einer C-18 Vydac®- Säule, 22mm χ 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße, unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines nicht linearen Gradientenprogramms von 0% -> 0% B, 100% -> 100% A, [0 -» 5 Minuten], dann 0% -> 10% B, 100% -> 90% A [5 -> 20 Minuten] (Waters Kurve 1) dann 10% -» 20% B, 90% -h> 80% A, [20 -» 30 Minuten] (Waters Kurve 6) dann 20% -> 50% B, 80% -> 50% A [30 -> 40 Minuten] (Waters Kurve 11), worin A 0,1 % wäßrige TFA und B Acetonitril ist, bei etwa 21,5 Minuten eluiert wird; und(c) FAB MS: Hochauflösung: 55,3861und deren pharmazeutisch annehmbaren Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß (a) wenn eine Verbindung der Formelgewünscht ist, das gesamte Gift von Agelenopsis aperta eluiert wird von einer C-18 Vydac®-Säule (22 mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße) unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradientenprogramms von 5% -» 10% Acetonitril, 95% ->90% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230 nm, die Fraktion, die bei etwa 12,5 Minuten eluiert, gesammelt wird und gegebenenfalls diese Fraktion lyophilisiert wird, in Wasser resuspendiert wird und von Wasser lyophilisiert wird oder ajternativ eine Verbindung der FormelCH3OCH2O(XXVIII)in einem reaktionsinerten Lösungsmittel umgesetzt wird unter einer inerten Atmosphäre mit N-Hydroxysuccinimid und anschließend Dicyclohexylcarbodiimid und dann einer Verbindung der Formel(X)BOCin einem reaktionsinerten Lösungsmittel, das Produkt dann unter einer inerten Atmosphäre mit 2-(Sulfonylphenyl)-3-ph6nyl-oxaziridin anschließend Cyanoborhydrid umgesetzt wird und das Produkt davon unter inerter Atmosphäre mit Trifluoressigsäure umgesetzt wird; wenn eine Verbindung der FormelOH O Hgewünscht ist, das gesamte Gift von Agelenopsis aperta von einer C-18 Vydac®-Säule (22mm χ 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße) eluiert wird unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5% -»20% Acetonitril, 95% -> 80% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [0-> 30 Minuten] dann 20%-> 70% Acetonitril, 80% -> 30% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [30 -> 55 Minuten] und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230nm, die Fraktion, die bei etwa 21 Minuten eluiert gesammelt und auf eine C-4 Vydac®-Säule (10mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 5μ Teilchengröße) geladen und eluiert wird unter Verwendung einer Durchflußrate von 4,0ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 0%-> 10% Acetonitril, 100%->90%, 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure und monochromatischer Peak-Detektion bei 200 bis 230 nm, die Fraktion, die bei etwa 7 Minuten eluiert, gesammelt und gegebenenfalls diese Fraktion lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiert wird oder alternativ eine Verbindung der Formel(XXXI)OCH2OCH3in e.nem reaktionsinerten Lösungsmittel umgesetzt wird unter inerter Atmosphäre mit N-Hydroxysuccinimid anschließend Dicyclohexylcarbodiimid und dann einer Verbindung der Formel(X)das Produkt dann unter inerter Atmosphäre mit 2-(Sulfonylphenyl)-3-phenyl-oxaziridin, anschließend Cyanoborhydrid umgesetzt wird und das Produkt davon unter inerter Atmosphäre mit Trifluoressigsäure umgesetzt wird;
(c) wenn eine Verbindung der Formelgewünscht ist, das gesamte Gift von Agelenopsis aperta von einer C-18 Vydac®-Säule (22mm x 250mm), 300Ä Porengröße, "!(^Teilchengröße) unter Verwendung einer Durchflußrate von 15ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5% -> 20% Acetonitril, 95% -> 80% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [0 -» 30 Minuten], dann 20% -> 70% Acetonitril, 80% -» 30% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [30 -> 55 Minuten] und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230nm eluiert wird, die Fraktion, die bei etwa 21 Minuten eluiert, gesammelt und auf eine C-4 Vydac®-Säule (10mm χ 250mm, 300Ä Porengröße, 5μ Teilchengröße) geladen und unter Verwendung einer Durchflußrate von 4,0ml/min, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 0% -> 10% Acetonitril, 100% -»90% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230 nm eluiert wird, die Fraktion, die bei etwa 9 Minuten eluiert, gesammelt, und gegebenenfalls diese Fraktion lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiert wird oder alternativ eine Verbindung der FormelOCH2OCH3(XXII)BOCin einem reaktionsinerten Lösungsmittel unter inerter Atmosphäre mit N-Hydroxysuccinimid und anschließend Dicyclohexylcarbodiimid und dann einer Verbindung der FormelBOC(XXXVIIi)BOCumgesetzt wird, das Produkt dann unter inerter Atmosphäre mit 2-(Sulfonylphenyl)-3-phenyloxaziridin undanschließendCyanoborhydridumgesetztwirdunddasProduktdavonentwedermitTrifluoressigsäure unterinerter Atmosphäre umgesetzt oder unterinerter Atmosphäre in gesättigtem Dioxan-HCI gelöst, daraus gewonnen und zu einerwäßrigen Lösung unter inerter Atmosphäre zugegeben wird; wenn eine Verbindung der Formelgewünscht ist, das gesamte Gift von Agelenopsis aperta von einerC-18 Vydac®-Säule (22 mm x 250 mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße) unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5% -» 20% Acetonitril, 95% -> 80% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [0 -> 30 Minuten], dann 20% -» 70% Acetonitril, 80% -> 30% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [30—» 55 Minuten] und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230nm eluiertwird, die Fraktion, die bei etwa 22,75 Minuten eluiert, gesammelt und auf eine C-4 Vydac®-Säule (22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße) geladen und unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines nicht linearen Gradienten-Programms von 0% -» 0% Acetonitril, 100% -> 100% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [0-» 5 Minuten], dann 0%-> 10% Acetonitril, 100%-» 90% 0,1% wäßrige Trifluoressigsäure [5-» 20 Minuten] (Waters Kurve 1), dann 10%-» 20% Acetonitril, 90%-» 80% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [20 -♦ 30 Minuten] (Waters Kurve 6), dann 20% -»50% Acetonitril, 80%-» 50% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [30 -» 40 Minuten] (Waters Kurve 11) und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230 nm eluiert wird, die Fraktion, die bei etwa 18,5 Minuten eluiert, gesammelt und gegebenenfalls diese Fraktion lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophiiisiert wird oder alternativ eine Verbindung der FormelOCH0OCH,(XXII)in einem reaktionsinerten Lösungsmittel unter inerter Atmosphäre mit N-Hydroxysuccinimid, gefolgt von Dixyclohexyl-carbodiimid und dann einer Verbindung der Formel-BOC,(X)BOCumgesetzt wird, das Produkt dann unter inerter Atmosphäre mit 2-(Sulfonylphenyl)-3-phenyloxaziridin gefolgt von Cyanoborhydrid umgesetzt wird und das Produkt davon entweder mit Trifluoressigsäure unter inerter Atmosphäre umgesetzt oder unter inerter Atmosphäre in gesättigtem Dioxan-HCI gelöst, daraus gewonnen und zu einer wäßrigen Lösung unter inerter Atmosphäre zugegeben wird;
wenn eine Verbindung dor FormelHOgewünscht ist, das gesamte Gift von Agelenopsis aperta von einer C-18 Vydacö-Säule(22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, ΙΟμΤβϋοΓίθηοΓΰβθ) unter Verwendung einer Durchflußrate von15ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5% —> 20% Acetonitril, 95% -» 80% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [0-> 30 Minuten], dann 20% -> 70% Acetonitril, 80%-» 30% 0,1% wäßrige Trifluoressigsäure [30 —> 55 Minuten] und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230nm eluiert wird, die Fraktion, die bei etwa 27,5 Minuten eluiert, gesammelt und gegebenenfalls diese Fraktion lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiert wird oder alternativ das gesamte Gift von Agelenopsis aperta von der Säule eluiert wird unter Verwendung einer Durchflußrate von 15ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 0% —> 20% Acetonitril, 100% -> 80% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure und Peak-Detektion bei 220nm, die Fraktion, die bei etwa 26,0 Minuten eluiert, gesammelt und auf eine Dynamax Phenyl-Säule (4,6mm x 250mm, 60Ä Porengröße, 8μ Teilchengröße) geladen und eluiert wird unter Verwendung einer Durchflußrate von 1 ml pro Minute, isokratischen Bedingungen von 10% Acetonitril, 90% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure und Peak-Detektion bei 220nm, die Fraktion, die bei etwa 55,27 Minuten eluiert, gesammelt und gegebenenfalls lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiert wird oder alternativ eine Verbindung der Formel(XIII)in einem reaktionsinerten Lösungsmittel unter inerter Atmosphäre mit N-Hydroxysuccinimid, Dicyclohexylcarbodiimid und dann einer Verbindung der Formel(X)umgesetzt wird, das Produkt in Aceton, dann unter inerter Atmosphäre mit 3-Chlorperoxybenzoesäure umgesetzt, daraus gewonnen und mit Cyanoborhydrid in Gegenwart von Essigsäure umgesetzt wird und dann das Produkt davon mit Trifluoressigäsure und unter inerter Atmosphäre umgesetzt wird;
wenn eine Verbindung gewünscht ist mit den folgenden kennzeichnenden Eigenschaften(a) vorhanden in einer Fraktion aus rohem Gift der Agelenopsis aperta Spinne, die von einer C-18 Vydac®-Säule, 22 mm x 250mm,300ÄPorengröße, 10μTeilchengröße, unlerVerwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute und eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5% -> 20% B, 95 -> 80% A [0 -» 30 Minuten], dann 20% -> 70%B,80% -> 30%A, [30 -» 55 Minuten],worin AO, 1 % wäßrigeTFAund B Acetonitril ist, bei etwa 22,75 Minuten eluiert wird;(b) vorhanden in einer Fraktion der in (a) oben beschriebenen Fraktion, die von einer C-18 Vydac®- Säule, 22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μTeilchengröße unter Verwendung einer Durchflußrate von 15 ml pro Minute und eines Lösungsmittel-Systems unter Verwendung eines nichtlinearen Gradienten-Programms von 0% -> 0% B, 100% -> 100% A [0 -» 5 Minuten], dann 0% -» 10% B, 100% -» 90% A [5 -> 20 Minuten] (Waters Kurve 1), dann 10% -> 20% B, 90% -> 80% A [20 -> 30 Minuten] (Waters Kurve 6), dann 20% -» 50% B, 80% -»50% A [30 -»40 Minuten] (Waters Kurve 11), worin AO, 1 wäßrigeTFA und B Acetonitril ist, bei etwa 21,5 Minuten eluiert wird; und(c) FABMS: Hochauflösung: 505,3861, das gesamte Gift von Agelenopsis aperta von einer C-18 Vydac®-Säule(22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μTθilchθngrößθ) unter Verwendung einer Durchflußrate von 15ml pro Minute,eines Lösungsmittelsystems unterVerwendung eines linearen Gradienten-Programms von 5% -> 20% Acetonitril, 95% -> 80% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [0 -> 30 Minuten], dann 20% -> 70% Acetonitril, 80% -> 30% 0,1 % wäßrige Trifluoressipsäure [30 -> 55 Minuten] und monochromatischer Foak-Detektion bei 220 bis 230nm eluiert wird, die Fraktion, die bei etwa 22,75 Minuten eluiert, gesammelt und auf eine C-4 Vydac®-Säule (22mm x 250mm, 300Ä Porengröße, 10μ Teilchengröße) geladen und unter Verwendung einer Durchflußrate von 15ml pro Minute, eines Lösungsmittelsystems unter Verwendung eines nicht linearen Gradienten-Programms von 0%-»0% Acetonitril, 100% -> 100% 0,1%wäßrige Trifluor-essigsäure [0 -> 5 Minuten], dann 0%-» 10% Acetonitril, 100% -> 90% 0,1% wäßrige Trifluoressigsäure [5 -> 20 Minuten] (Waters, Kurve 1), dann 10% -» 20% Acetonitril, 90% -» 80% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure 120 -> 30 Minuten] (Waters, Kurve 6), dann 20% -> 50% Acetonitril, 80% -> 50% 0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure [30 -> 40 Minuten] (Waters Kurve 11) und monochromatischer Peak-Detektion bei 220 bis 230 nm eluiert wird, die Fraktion, die bei etwa 21,5 Minuten eluiert, gesammelt und gegebenenfalls rtie Fraktion lyophilisiert, in Wasser resuspendiert und lyophilisiert wird undgegebenenfalls die Verbindungen in ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze durch an sich bekannte Verfahren umgewandelt werden.
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