DD298788A5

DD298788A5 - Neue insulinverbindungen

Info

Publication number: DD298788A5
Application number: DD90338860A
Authority: DD
Inventors: Per Balschmidt; Finn B Hansen
Original assignee: ��`��@�a�k��
Priority date: 1989-03-20
Filing date: 1990-03-19
Publication date: 1992-03-12
Also published as: ES2068384T3; YU53290A; FI914419A7; HU902706D0; HUT58349A; EP0463072A1; PT93502B; ATE116661T1; IL93792A0; NO913687L; AU5344890A; PT93502A; NO300640B1; DE69015811T2; EP0463072B1; IE66564B1; KR920701250A; GR1002545B; NZ232953A; CA2049961A1

Abstract

Neuartige Insulinverbindungen mit einer wuenschenswerten verzoegerten Insulinwirkung und/oder Antigenizitaet werden geschaffen. Die neuartigen Insulinverbindungen werden dargestellt durch die Formel II:{neuartige Humaninsuline; verzoegerte Insulinwirkung und/oder Antigenizitaet; vorgeschriebene Reste an den Positionen A0, A4, A17, A21, B13, B21, B27 und B30 der Aminosaeuresequenz}

Description

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Vorliegende Erfindung bezieht sich auf neuartige Insulinverbindungen, auf ein Verfahren zur Herstellung der neuartigen Insulinverbindungen und auf therapeutische Präparate, welche Langzeitwirkung haben und wenigstens eine der neuartigen Insulinverbindungen und, wenn das gewünscht wird, ein schnell wirkendes Insulin enthalten. Seit der Entdeckung des Insulins im Jahre 1922 wurden viele verschiedene Typen von Insulinpräparaten für die Behandlung von Diabetes mellitus eingesetzt. Zunächst wurden ausschließlich Insulinlösungen eingesetzt, die eine rasch beginnend« und eine

relativ rasch endende Insulinaktivität aufwiesen, aber später wurden Insulinpräprate mit einem breiteren Aktivitätsprofil durch

Senkung der Löslichkeit des Insulins durch den Zusatz von z. B. Zinksalz und/oder Protaminen entwickelt. Auf Grund der Verfügbarkeit wurde das bisher eingesetzte Insulin traditionell in der Regel aus der Pankreas von Haustieren, vor allem Rindern, Schweinen und Schafen, gowonnen. In jüngster Zeit erschienen auf dem Markt aber auch Insulinpräparate, die menschliches Insulin biotechnischer Herkunft enthielten. Die Struktur des menschlichen Insulins wird in der Formel I gezeigt.

A-Kette

I 7 I

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-1 2 3 4 5 6 I 3 9 10 11 12

B-Kette S

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Giy-Ser-His-Leu-Val 123456789 10 11 12

Α-Kette (fortgesetzt)

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-cys-Asn 13 14 15 16 17 18 19 | 21

I S

B-Kette (fortgesetzt) S

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cy.') (Uy-Glu-Arg-Gly-Phe-13 14 15 1.6 17 18 19 20 21 22 23 24

B-Kette (fortgesetzt)

Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr 25 26 27 28 29 30

Die Insuline von bestimmten Haustieren sind in der Struktur dem menschlichen Insulin sehr ähnlich. Hunde- und Schweineinsulin unterscheidet sich vom menschlichen Insulin nur darin, daß es AIa anstelle von Thr in der Position 30 in der B-KeUe enthält, und Kanincheninsulin enthält in der gleichen Position Ser. Diese Insuline können durch Ersatz des B30-Aminosäurerestes durch Thr nach semisynthetischen Verfahren, wie sie beispielsweise von Morihara u.a., Nature 280

(1979), 412-413, und Marcussen (US-PS4343898) beschrieben werden, in menschliches Insulin umgewandelt werden.

Präparate, die Insulin in Lösung enthalten, sind in der Regel schnellwirkend, wobei die Insulinaktivität wenige Stunden nach der Injektion aufhört. Folglich müssen häufige Injektionen, normalerweise mehrere am Tag, gegeben werden, um den Blutglukosepegel des Diabetikers zu normalisieren. Um diesen Nachteil zu überwinden, wurden Insulinpräparate mit Langzeitwirkung zusammengestellt, um die Insulinaktivität

über mehrere Stunden aufrechtzuerhalten, bis zu 24 Stunden oder sogar noch länger. Bei Anwendung dieser Langzeitpräparatebrauchen einige Diabetespatienten nur wenige Injektionen täglich zu erhalten, beispielsweise ein oder zwoi Injektionen in24 Stunden.

Eine solche Langzeitwirkung kann durch Umwandlung des Insulins in ein leicht lösliches Salz, beispielsweise Zinkineu'in oder Prtitamininsulin, erreicht werden. Die leicht löslichen Insulinsalze werden in Form von Suspensionen verwendet, aus de nen das Insulin nach der subkutanen oder intramuskulären Injektion allmählich freigesetzt wird. In jüngster Zeit wurden andere Methoden entwickelt, um eine Langzeitwirkung zu erreichen. Ein Beispiel dafür ist die Einkapselung von Insulinkristallen in polymerisiertes Serumalbumin. Ein anderes Beispiel ist die ständig wirkende Infusionsvorrichtung, die sogenannte Insulinpumpe, die jedoch unbequem sein und ein Risiko für den Patienten bergen kann. Die Beschreibungen der europäischen Patentveröffentlichungen Nr. EP132770, EP132769 und EP135720 legen die Herstellung

und den Einsatz von Insulinderivaten offen, bei denen der C-Terminus der B-Kette durch eine organische Gruppe erweitert wird,die wenigstens eine positive Ladung trägt, vorzugsweise Arg-OH oder Arg-Arg-OH. Präparate, die Suspensionen solcher

Insulinderivate enthalten, weißen eine hinausschiebende Wirkung auf. Diese Insulinverbindungen sind jedoch für die Zubereitung von neuartigen, brauchbaren Insulinpräparaten mit Langzeitwirkung nicht sehr geeignet, da festgestellt wurde, daß

der Grad der hinausschiebenden Wirkung sehr begrenzt ist (J. Markussen u. a., Protein Engineering 1,205-213 [1987]).

Die Eigenschaften von Insulinderivaten, bei denen der N-Terminus der B-Kette durch das Dipeptid Arg-Arg erweitert wird,

wurden von R. Geiger und F. Enzman in Proceedings of the Symposium on Prosinsulin, Insulin and C-peptide, Tokushima 1978;

Excerpta, Medica, Amsterdam 1979, S. 306-310, beschrieben. Es wurde festgestellt, daß die Löslichkeit dieser Insulinverbindung

um deren isoelektrischen Punkt sogar noch höher als die des normalen Insulins ist.

Substitutionen im Insulinmolekül können mit dem Zweck eingeführt werden, das Aktivitätsprofil des Insulins bei der Behandlung

von Diabetes zu verbessern. So legt die europäische Patentveröffentlichung Nr. EP194864 offen, daß eine oder mehrere

Substitutionen von GIu durch beispielsweise GIn und/oder die Substitution von Thr^B27 durch Arg, verbunden mit einem Blockieren der C-Terminal-Karboxylgruppe in Form eines Esters oder Amids, eine Verschiebung der Ausfällungszone des Insulins auf eine Art und Weise bewirken, welche eine langsame Freisetzung nach der Injektion ermöglicht. Die Verwendung von Insulinverbindungen dieser Art, die innere Aminosäuresubstitutionen enthalten, in Präparaten für die

lebenslange Verabreichung zur Behandlung von Diabetes birgt ein b<ji>-htliches Risiko de; Aktivierung des Immunsystems des

Patienten, was zur Einführung von Insulinantikörpern in das Blut führt. In den letzten Jahren wurden verschiedene Versuche unternommen, Sustitutionen für die herkömmlichen Insulinpräparate mit

verzögerter Insulinwirkung zu finden. Die Gründe dafür liegen darin, daß Diabetologen festgestellt haben, daß dieherkömmlichen Insulinlangzeitpräparate eine zu kurze Wirkungsdauer haben, vor allem nach Einführung des menschlichen

Insulins, und daß die Einführung des sogenannten Insulinstiftes die Forderung nach einem gelösten, langwirkenden Insulin

verstärkt hat.

Ziel der Erfindung ist die Schaffung von neuartigen Insulinanalogen, die eine hinausschiebene Insulinwirkung haben und die

eine möglichst niedrige Antigenizität auUveisen.

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß Insulinverbindungen mit der allgemeinen Formel Il

A-Kette

S S

I 7 I

H-Arg-Gly-Ile-Val-E-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-0 1 2 3 4 5 6 I 8 9 10 11 12

B-Kette S

H-Phe-Val-Asn-Gln-lUs-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Α-Kette (fortgesetzt)

20

Leu-Tyr-Gln-Leu-E-Asn-Tyr-ijys-N-OH 13 14 15 16 17 18 19 |

I S

B-Kette (fortgesetzt)

E-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-E-Arg-Gly-Phe-13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B-Kette (fortgesetzt)

Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y 25 26 27 28 29 30

E einzeln GIu oder einen neutralen Aminosäurerest darstellt, der durch Nukleotidsequenzen codiert werden kann, N einen Aminosäurerest darstellt, der durch Nukleotidsequenzen codiert werden kann, T Thr oder Arg darstellt, X Thr, Ser, Ala oder OH

darstellt und VOR oder NR¹R² darstellt, worin R, R¹ und R² jeweils Wasserstoff oder ein niederes Alkyl sind, nicht aber vorhanden

sind, wenn X OH darstellt, die gewünschte hinausschiebende Insulinwirkung und/oder Antigenizität aufweisen.

Die Erfindung bezieht sich daher auf Insulinverbindungen mit der allgemeinen Formel II: ,

A-Kette b

I 7 I

H-Arg-Gly-Ile-Val-E-Gln-Cys-cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-0 1 2 345 6 I 8 9 10 11

B-Kette

H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-cys-Gly-Ser-His-Leu-Val 1 2 3 4 5 6 ? 8 9 10 11

Α-Kette (fortgesetzt)

Leu-Tyr-Gln-Leu-E-Asn-Tyr-Cys-N-OH 13 14 15 16 17 18 19 | 21

B-Kette (fortsetzt) 8

E-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-E-Arg-Gly-Phe-13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

B-Kette (fortgesetzt)

Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y 25 26 27 28 29 30

worin E jeweils GIu oder einen neutralen Aminosäurerest darstellt, der durch Nukleotidsequenzen codiert werden kann, N einen

Aminosäurerest darstellt, der durch Nukleotidsequenzen codiert werden kann, T Thr oder Arg darstellt, X Thr, Ser, Ala oder OH

darstellt und Y CA oder NR¹R² darstellt, wobei R, R¹ und R² jeweils Wasserstoff oder ein niederes Alkyl darstellen, aber nicht

vorhanden sind, wenn X OH darstellt.

Unter dem Begriff »niederes Alkyl" versteht man im vorliegenden Zusammenhang gerade oder verzweigte Alkylgruppen mit 1

bis 6 Kohlenstoffatomen.

Oie Erfindung bezieht sich insbesondere auf Insulinverbindungen mit der Formel II, bei denen E jeweils GIu oder GIn darstellt, N Asn, Asp, Ser oder GIy darstellt, T Thr oder Aig darstellt, X Thr darstellt und Y NH₂ darstellt. Die Erfindung bezieht sich vorzugsweise auf Insulinverbindungen mit der Formel II, bei denen wenigstens eines der Symbole E, N und T einen Aminosäurerest darstellt, der sich von dem entsprechenden Rest des menschlichen Insulins unterscheidet, wenn Y OH darstellt. Die Erfindung bezieht sich speziell auf Insulinverbindungen mit der Formel II, bei denen alle E GIu darstellen, N Asn darstellt, T

und X beide Thr darstellen und Y NH₂ darstellt.

Die Erfindung bezieht sich speziell auf Insulinverbindungen mit der Formel II, bei denen alle E GIu darstellen, N Ser darstellt, R

und X beide Thr darstellen und Y NH₂ darstellt.

Die Erfindung bezieht sich speziell auf Insulinverbindungen mit der Formel II, bei denen E in der Position B13 GIn und alle

übrigen E GIu darstellen, N Asn darstellt, T und X beide Thr darstellen und Y NH₂ darstellt. ,

Die Erfindung bezieht sich speziell auf Insulinverbindungen mit der Formel II, bei denen E in der Position A4 GIn und alle übrigen EGIu darstellen, N Asp darstellt, T und X beide Thr darstellen und Y NH₂ darstellt. Die Erfindung bezieht sich speziell auf Insulinverbindungen mit der Formel II, bei denen alle E GIu darstellen, N. Asn darstellt, T Arg darstellt und X OH darstellt. Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Methode zur Herstellung von Insulinverbindungen mit der Formel II, nach welcher ein Insulinvorläufer mit der allgemeinen Formel III

j _s s

¹ I I

Arg-^ly-Ile-Val-E-Gln-CysM^s-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-lÄU-Tyr-Gln-Leu-E-Asn-Tyr-Cys-N-OH 1 2 3 4 5 6 1 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 j 21

I 1 (AA)₁

I 1

B-Kette ^{s s}

1

Z-Phe-Väl-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-E-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-S-Arg 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

B-Kette (fortgesetzt)

Gly-Phe-Phe-Tyr-T-Pro-Lys 23 24 25 26 27 23 29

worin E, N und T alle die oben angegebene Bedeutung haben, (AA)η eine Peptidkette mit η Aminosäureresten und Lys als C-Terminalrest darstellt oder eine Peptidbindung ist, wenn η = 0, und Z Wasserstoff oder eine Peptidkette von willkürlicher Länge mit Lys als C-Terrninalrest darstellt, transpeptidiert oder durch eine Endopeptidas geschnitten wird, welche eine ausschließliche Spezifizität für das Schneiden an der Karboxyseite eines Lysinrestes hat.

Die Erfindung bezieht sich auch auf Insulinpräparate, die wenigstens eine Insulinverbindung mit der Formel Il und wahlweise auch ein schnell wirkendes Insulin, wie menschliches Insulin, das Insulin von Haustieren oder deren Derivate oder Analoge, enthält. Diese Präparate können die Form einer anwendungsbereiten Lösung oder eines lyophilisierten Präparates, das beispielsweise durch sterilisiertes Wasser vor der Anwendung wiederhergestellt werden muß.

Ein besonders vorteilhaftes Ausführungsbeispiel des Insulinpräparates nach der Erfindung ist ein Präparat für die parenteral Verabreichung mit hinauszögernder Insulinwirkung, das aus einer Lösung von wenigstens einer Insulinverbindung nach der Erfindung in einem wäßrigen Medium, das mit dem Blutserum isoosmotisch ist, einen pH-Wert zwischen 4 und 5,5 hat und wahlweise einen Puffer und/oder ein Präservierungsmittel enthält, und gegebenenfalls einem schnellwirkenden Insulin besteht. Die Insulinverbindungen nach der Erfindung erfüllen die Forderungen der Diabetologen durch minimale Änderungen am menschlichen Insulinmolekül, die jeweils entweder dem menschlichen Körper vertraut oder über mehrere Jahre hinweg geprüft sind und bei denen auf diese Weise keine Auslösung einer Immunreaktion festgestellt wurde. Das Hauptmerkmal der Insulinverbindungen nach der Erfindung besteht darin, daß sie als menschliches Insulin beschrieben werden können, bei dem an das N-Terminal und die Α-Kette ein Argininrest angefügt wurde und bei dem die C-Terminal-Karboxyl-Gruppe der B-Kette vorzugsweise in Form des Amids blockiert wurde. Es ist vorgesehen, die Insulinverbindungen so einzusetzen, daß sie in einer schwach sauren Lösung aufgelöst werden, und unter diesen Bedingungen kann während der Lagerungszeit des Präparats eine beachtliche Deamidierung des Asparginrestes in der Position A21 eintreten, was der verlängerten Wirkung entgegenwirkt. Durch Einführung einer Substitution von einem oder möglicherweise zwei der Glutaminsäurereste durch Glutamin kann diese Wirkung kontrolliert werden.

Bei einem insulinabhängigen Diabetes besteht eine häufig angewandte Therapie in der Verabreichung von zwei täglichen Injektionen eines Langzeit-Insulinpräparates, einer am Morgen und der anderen am Abend, unmittelbar vor dem Schlafengehen, um einen Insulinbasalpegel zu schaffen. Außerdem werden drei Injektionen eines schnellwirkenden Insulinpräparates vor den Hauptmahlzeiten gegeben. Der Nachteil dieser Therapie besteht darin, daß die späte Injektion des Langzeitpräparates zu einem gefährlich niedrigen Glukoseblutpegels im Verlauf der Nacht führen kann. Das kann dadurch vermieden werden, daß man vor dem Abendessen ein gemischtes Präparat aus einem verzögert wirkenden und einem schnellwirkenden Insulin injiziert, wodurch Hypoglykämie, wenn überhaupt, während des Abends auftritt, wo sie durch beispielsweise einen leichten Imbiß behoben werden kann. Bei dieser Art von Therapie kommt es aber oft am Morgen zu Hyperglykämie, da die am häufigsten gebrauchten Insulinpräparate mit verzögerter Wirkung, „Insulatard"® und „Monotard"·, nicht über eine ausreichend lange Zeit wirken. Es ist also notwendig, für die Diabetes-Patienten ein Insulinpräparat zu schaffen, das langer als die normalerweise eingesetzten Präparate wirkt, besonders, wenn eine Injektion eines solchen Präparats über einen oder sogar mehrere Tage ausreicht. Insulinpräparate, die nach der Erfindung hergestellt werden, weisen eine verzögerte Insulinwirkung von längerer Dauer als das gegenwärtig angewendete Insulinpräparat mit verzögerter Wirkung, „Monotard"®, auf.

Die bevorzugten Insulinverbindungen der Erfindung sind besonders vorteilhaft bei der Anwendung in Lösungspräparaten, da die Löslichkeit hoch ist, selbst bei einem pH-Wert von etwa 5 (bei dem die Deamidierung wesentlich verringert wird), und eine ausgeprägte verzögerte Wirkung nach der subkutanen Injektion beibehalten wird. Die Erfindung bezieht sich besonders auf die folgenden spezifischen Verbindungen: |Arg^A0l-menschlicheslnsulin-(BSO-Amid) IArg^A0, Gln^au]-menschliches Insulin-(B3O-Amid) [Arg^A0, GIn*⁴, Asp^A2t]-menschliches Insulin (B30-Amid) iArg^A0, Ser^'l-menschliches Insulin-(B3O-Amid) lArg^A0, Arg⁸"l-des [Thr^B30]-menschliches Insulin.

Die Insulinverbindungen nach der Erfindung können aus anderen Insulinen unter großen Schwierigkeiten durch Einführung des zusätzlichen Arginin-Restes am N-Tenninal der Α-Kette des Insulinmoleküls durch chemische Synthese hergestellt werden. Eine weit attraktivere Route ist die enzymatisch katalysierte Umwandlung eines einzelnen Kettenvorläufers, z. B. eines natürlich vorkommenden Proinsulins oder Präproinsulins oder eines biosynthetisch hergestellten Vorläufers mit der allgemeinen Formel III:

1 s s I

¹I-I I

Arg-^ly-Ile-Val-E-Gln-C^s-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-lÄU-Tyr-Gln-Leu-E-Asn-Tyr-Cys-N-OH |

1 2 3 4 5 6 J 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 \ 21 |

S I— S I

I ' I (AA)_n

ι ? ι I

B-Kette S S I

I ¹I

Z-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-E-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-E-Arg J

1 2 3 4 5 6 7 8 9 IC 11 12 13 14 15 16 17 13 19 20 21 22 j

B-Kette (fortgesetzt) I

G2y-Kie-Phe-Tyr-T-Pro-Lys 23 24 25 26 27 28 29

IO (O OO

worin E, N und T alle die in der Formel Il gegebene Bedeutung haben, (AA)η eine Peptidkette mit η Aminosäureresten und Lys als dem C-Terminalrest darstellt oder eine Peptidbindung ist, wenn η = 0, und Z Wasserstoff oder eine Peptidkette von willkürlicher Länge mit Lys als dem C-Terminalrest darstellt,

Das für die enzymatische Umwandlung verwendete Enzym sollte eine trypsinartige Endopeptidas sein, die eine Peptidkette an der Karboxyseite eines Lysinrests schneiden kann. Oft kannTrypsin direkt verwendet werden, besonders vorteilhaft aber ist eine Endopeptidase, die Lysinspezifizität aufweist, z. B. Endoproteinase Lys-C von Lysobacter-Enzymogenen (Boehringer Mannheim) oder Lysyl-Endopeptidase von Achromobacter Ivticus (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Die Reaktion kann als Transpeptidation unter Verwendung von Threoninamid unter ähnlichen Bedingungen ausgeführt werden, wie sie z. B. in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. FP163529 beschrieben werden, was dann direkt zum B 30-Amid führt, sie kann aber auch als zweistufige Reaktion ausgeführt werden, wobei mit einer enzymatischen Schneidung begonnen wird, die zu einer des (Thr^B30)-Verbindung führt, die dann durch eine Kopplungsreaktion, wie sie von Morihara u.a., ebenda, beschrieben wurde, in das B 30-Amid umgewandelt wird.

Die Vorläufer der Insulinverbindungen nach der Erfindung können biosynthetisch in einem Hefewirt, der eine DNA-Foige expressiert, die den Vorläufer codiertl, hergestellt werden. Um die Sekretion in das Wachstumsmedium zu erreichen, kann die DNA-Folge, welche den Insulinvorläufer codiert, mit einer anderen DNA-Folge verschmolzen werden, welche ein in Hefe funktionelles Signalpeptid codiert. Die Sekretion kann erreicht werden durch Einführung der MFa 1-Führungsfolge von Saccharomyces cerevisiae in das Expressionsplasmid (Kurjan und Horskowitz, Cell 30,933-943 [1982]). Bei einer bevorzugten Konstruktion wird die DNA-Folge, welcho die gesamte MFa 1-Führungsfolge, einschließlich der dibasischen Stelle LysArg, aber ausschließlich der Peptidfolge GIuAIaGIuAIa, die das Substrat für die Hefeprotease DPAP (Dipeptidylaminopeptidase) ist, codiert, verwendet. Auf diese Weise wird eine effektive Sekretion der Insulinvorläufer mit dem korrekten N-Terminal erreicht. DNA-Folgen mit der Codierung für modifizierte Insulinvorläufer wurden unter Durchführung der In-vitro-Mutagenese auf der Expressionskassette konstruiert, welche im BamHI-Restriktionsfragment des Expressionsplasmids pYGABA enthalten ist, wie dasinder Abb. 1 gezeigt wird. Das Plasmid enthält Selektionsmarker und Replikationssignale, die in Hefe funktional sind, und hat eine Länge von 1103 Basenpaaren. Das BamHI-Fragment enthält folgendes: Den GAPDH-Fußaufwärts-Bereich (Glyzeraldehyd-3-phosphatdehydrogenase), der die Promotersequenzen von Position -389 bis -1 nach Bitter und Egan, Gene 32 (1984), 263-274, enthält. Dem 5'-Ende des Flußaufwärts-Bsreiches wurden BamHI-Linker angefügt. Diese Promotersequenz wird direkt an die von Kurjan und Herskowitz beschriebene Sequenz verschmolzen, welche die 85 N-Terminal-Aminosäuren der MFa 1 -Führungssequenz codiert. Die MFa 1-Führungsfolge wird direkt mit der Codierungssequenz für die einzelne Kette des Insulinvorläufers des-|Thr^B30]-menschliches Insulin (SCI) verschmolzen, das ein synthetisches, konstruiertes Gen mit folgender Sequenz ist:

TTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGT-

aagcaattggttgtgaacacaccaagagtgaaccaacttcgaaacatgaaccaaacacca-PheValAsnGinHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGly-

GAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGGGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTGT-CTTTCTCCAAAGMGATGTGAGGTTTCCCATAACAACTTGTTACAACATGAAGATAAACA-GluArgGlyPhePheTyrThrProLysGlylleValGluGlnCysCysThrSerlleCys-

SaII

TCTTTGTACCAATTGGAAAACTACTuTAACTAAfAGCGTCG AGAAACATGGTTAACCTTTTGATGACATTGATTATCGCAGCAGCT SerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsnEndEnd

Gezeigt wird auch, daß die Translation des Insulinvorläufer-Gens mit zwei Stoppkodonen beendet wird, und unmittelbar dahinter befindet sich eine Sall-Restriktionsstelle. Der Terminatorbereich ist mit dem Sall-BamHI-Restriktionsfragment identisch, das in der europäischen Patentveröffentlichung Nr.0116201A1 beschrieben wird. Die Sequenz wird vollständig unter Anwendung von Standardtechniken konstruiert.

Angewendet wurde die Mutagenesemethode der „auf die Oligonukleotidstelle gerichteten Mutagenese", die von Zollsr und Schmith, DNA, Bd. 3, Nr. 6,479-488 (1984), beschrieben wurde. Die Methode ist nachstehend kurz aufgeführt und wird ausführlicher im Beispiel 1 beschrieben. Die Insulinvorläuferfolge, die aus dem Expressionsplasmid isoliert wurde, wird in einen einzelsträngigen, runden M 13-Bakteriophag-Vektor eingefügt. An das einzelsträngige Genom wird ein chemisch synthetisierter, komplementärer DNA-Strang hybridisiert. Der DNA-Strang enthält die gewünschte Sequenz, umgeben von Sequenzen, die zu den Insulinsequenzen auf der runden DNA vollkommen homolog sind. Der Starter wird dann in vitro über dia gesamte Länge des runden Genoms unter Verwendung von Klenow-Polymerase biochemisch erweitert. Dieser Strang ergibt einzelsträngige Phase, die, wenn sie in E.coli gezogen werden, die Möglichkeit der Isolierung von doppelsträngiger DNA mit der gewünschten Folge bieten. Aus dieser doppelsträngigen DNA wird ein Restriktionsfragment isoliert und wieder in den Expressionsvektor eingesetzt.

Die Erfindung wird unten ausführlicher unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erklärt, in denen

Abb. 1 das Expressionsplasmid pYGABA 14276 zeigt,

Abb. 2 den Hefevektor ρ AB 24 zeigt und

Abb. 3 eine grafische Darstellung der Absorption des Insulins aus einem subkutanen Depot zeigt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.

Beispiel I

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das zur Expression des Vorläufers B(1 -29)-AKR-A{1-2l) verwendet werden kann. Die Expressionskassette, die im Expressionsplasmid pYGABA (das in der Abb. 1 gezeigt wird) an einem BamHI-Restriktionsfragment enthalten ist, wurde isoliert: Das Expressionsplasmid wurde mit der Restriktionsendonuklease BamHI inkubiert. Es wurden folgende Bedingungen angewendet: 20pg Plasmid, 50 Einheiten BamHI, 10OmM NaCI, 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂ und 1 mM DTT in einem Volumen von 100μΙ. Die Temperatur betrug 37⁰C, die Reaktionszeit 2 Stunden. Die beiden DNA-Fragmento wurden auf einem 1%igen Agarose-Gel getrennt, und das gewünschte Fragment wurde isoliert.

Llgatlon an den M13-Vektor M13 mp 18:

Das isolierte Restriktionsfragment wurde an den Bakteriophag-Vektor M 13mp18 ligiert, der ebenfalls mit der Restriktionsendonuklease BamHI im folgenden heaktionsgemisch geschnitten worden war: Fragment 0,2 μα, Vektor 0,02 μg, 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,4,1OmM MgCI₂,1OmM DTT und 1 mM ATP in einem Volumen von 20μΙ. Es wurden 5μΙ dieses Gemische in den E.coli-Stamm JM101 transformiert. Das Vorhandensein des Fragments im Vektor und die Orientierung des Fragmentes wurden durch Restriktionsenzymkartierung auf doppelsträngiger M13-DNA, die aus den Transformanten isoliert wurde, bestimmt.

Isolierung von elnzelstrSnglger (ss) DNA (Matrize):

Aus dem oben beschriebenen Transformaten wurde ss-DNA nach einer Methode isoliert, die von Messing in Gene, 19,269 bis 276 (1982), beschrieben wurde.

5'-Phosphorylierung des Mutagenisatlonsstarters:

Der Mutagenisationsstarter mit der Folge S'-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-a' wurde am 5'-Ende in 30μΙ Reaktionsgemisch phosphoryliert, das 7OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,0,1OmM MgCI₁,5mM DTT, 1 mM ATP, 10OpMoI Oligonukleotid und 3,6 Einheiten von T4-Polynukleotidkinase enthielt. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 37⁰C ausgeführt. Dann wurde das Enzym durch zehnminütiges Inkubieren des Gemische bei 65°C inaktiviert.

Hybridisierung von Matrize und phosphoryliertem Mutagenisationsstarter:

Die Hybridisierung von Matritze und Starter erfolgte in 10 μΙ eines Volumens, das 0,5 pMol Matrize, 5 pMol Starter, 2OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,5OmM NaCI und 1 mM DTT enthielt, durch zehnminütiges Erhitzen auf 65⁰C und anschließendes Abkühlen auf O⁰C.

Erweiterungs-/Ligationsreaktion:

Dem oben gewonnenen Reaktionsgemisch wurden 10μΙ des folgenden Gemischs zugesetzt: 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3mM TTP, 1 mM ATP, 2OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,1OmM DTT, 3 Einheiten von T4-DNA-Ligase und 2,5 Einheiten der Klenow-Polymerase. Anschließend wurde die Reaktion über 16 Stunden bei 16°C ausgeführt.

Transformation von JM101:

Das oben genannte Reaktionsgemisch wurde in verschiedenen Verdünnungen in CaCI₂-behandelte E.coll-JM 101-Zellen unter Anwendung von Standardtechniken transformiert und in 2x YT-Topagar auf 2x YT-Agarplatten plattiert. (Es wurden 2x YT = Trypton,16g/I, Hefeextrakt, 10g/l, NaCI, 5g/l als Abkürzung verwandt. 2x YT-Topagar = 2x YT unter Zusatz von 0,4% Agarose und Autoklavbehandlung. 2x YT-Agarplatten = 2x YT unter Zusatz von 2% Agar und Autoklavbehandlung). Die Platten wurden bei 37⁰C über Nacht inkubiert.

Identifizierung der positiven Klone:

Es wurde die Methode der „plaque"-LifM lybridisierung angewendet, die nachstehend beschrieben wird: Ein Nitrozellulosefilter wurde auf eine Platte mit einer geeigneten „plaque"-Dichte gebracht, so daß der Filter benetzt wurde. Dann wurde der Filter in folgenden Lösungen gebadet: 1,5M NaCI, 0,5 M NaOH über 30s, 1,5M NaCI, 0,5M Tris-HCI, pH-Wert 8,0, für 1 Minute, 2x SSC (0,3 M NaCI, 0,03 M Natriumzitrat) bis zur späteren Verwendung. Der Filter wurde auf 3-mm-Filterpapier getrocknet und 2 Stunden bei 8O⁰C in einem Vakuumofen gebacken.

Der Mutagenisationsstarter mit der Folge S'-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGAGTG-S' wurde am 5'-Ende in 30μΙ eines Volumens radioaktiv markiert, welches 7OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂,5mM DTT, 1OpMoI Oligonukleotid, 2OpMoI Gamma-³²P-ATP und 3,5 Einheiten von T4-Polynukleotidkinase enthielt. Das Gemisch wurde bei 37⁰C 30 Minuten lang inkubiert und dann 5 Minuten lang bei 100⁰C.

Der getrocknete Filter wurde 2 Stunden lang bei 65⁰C in 6x SSC, 0,2% Rinderserumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Natriumdodekylsulfat (SDS) und δΟμς/ΓηΙ Lackssperma-DNA vorhybridisiert. Dann wurde das Reaktionsgemisch, das die markierte Sonde enthielt, zu 15ml frischem Vorhybridisationsgemisch gegeben, und der Filter wurde dann darin über Nacht bei 40°C unter sanftem Rühren gebadet. Nach dem Hybridisieren wurde der Filter dreimal über jeweils 15 Minuten in 2x SSC + 0,1 % SDS gewaschen und einer Autoradiographbehandlung unterzogen. Nach dem Waschen in der gleichen Lösung, jetzt aber bei 62⁰C, und einer weiteren Autoradiographbehandlung wurden „plaques" identifiziert, die DNA-Folgen enthielten, welche zum Mutagenisationsstarter komplementär waren.

Erneutes Screenieren auf positive Klone:

Da der identifizierte Klon ein Ergebnis eines Heteroduplexes ist, wurde das „plaque" erneut plattiert. Hybridisierung und Identifizierung wurden wiederholt.

Reinigung der doppelstranglgen M 13-Phag-DNA:

Ein re-screenierter Klon wurde für die Infizierung des E. coll-Stammes JM101 verwendet. Eine Kultur, die etwa 10* Phage und 5 Kolonien von JM101 enthielt, wurde 5 Stunden lang in 5ml eines 2x YT-Mediums bei 37⁰C gezogen. Dann wurde die doppelsträngige, runde DNA aus dem Pellet nach einer Methode gereinigt, die von Birnboim und DoIy, Nucleic Acids Res. 2,1513 (1979), beschrieben wurde.

Isolierung eines Restriktionsfragmentes, welches den modifizierten Insulinvorläufer enthält:

Das DNA-Präparat (etwa 5pg), das oben isoliert worden war, wurde mit 10 Einheiten der Restriktionsendonuklease BamHI in 6OpHOOmM NaCI, 5OmMTHs-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI₂ und 1mMDTT2 Stunden lang bei 37⁰C verdaut. Die DNA-Produkte wurden auf einem Agarose-Gel getrennt, und die Fragmente wurden aus dem Gel gereinigt.

Ligation an den Hefevektor pAB24 (Abb.2):

Das isolierte Restriktionsfragment wurde an den Hefevektor pAB 24 ligiert, der mit der Restriktionsendonuklease BamHI verdaut worden war, in folgendem Reaktionsgemisch: Fragment 0,2pg. Vektor 0,02pg, 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,4,1OmM MgCI₂, 1OmM DTT, 1 mM ATP in einem Gesamtvolumen von 20μΙ. Von diesem Reaktionsgemisch wurden 5μΙ für die Transformation des E. coli-Stammes MC 1061 verwendet, worin das modifizierte Expressionsplasmid identifiziert und vermehrt wurde. Das Plasmid wurde pYGAB-AKR-A bezeichnet und war mit Ausnahme des angefügten Kodons mit pYGABA identisch.

Transformation von Hefe:

Die Tranformation des Expressionsplasmids in den Hefestamm Saccharomyces cerevislae JC482 A pep A Leu 2 cir° (α 1, his4, pop4, ura3, Ieu2, cir") wurde so ausgeführt, wie das von Ito u.a., J. Bact., Bd. 153, Nr. 1,163-168 (1983), beschrieben wurde. Die transformierten Zeilen wurden auf SC-ura-Medium (0,7% Hefestickstoffbasis, 2,0% Glukose, 0,5% Kasaminosäuren, 2,0% Agar) zur Selektion nach den plasmidhaltigen Zellen plattiert.

Beispiel Il

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das für die Produktion des Vorläufers B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1 -21) genutzt werden

Das Verfahren war im wesentlichen das gleiche wie im Beispiel I, mit der Ausnahme, daß der eingesetzte Mutngenisationsstarter die Folge 5'-CAACAATACCTCTCTTAGAACCCtTTGGAGTG-S' hatte, daß die Hybridisierungstemperatur 42⁰C betrug und daß die Waschtemperatur nach dem Hybridisieren 64°C betrug. Das modifizierte Plasmid hatte eine mit pYGABA identische Sequenz, ausgenommen die hinzugefügten Codone.

Beispiel III

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das für die Produktion des Vorläufers (Gln^BlJl-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21) genutzt werden kann.

Das Verfahren war im wesentlichen das gleiche wie im Beispiel I, mit der Ausnahme, daß die verwendete Matrize durch Klonierung der BamHI-Kassette von pYGAB-AKR-A in M13 gewonnen wurde, daß der Mutagenisationsstarter die Folge 5'-GTACAAAGCTTGAACCAAGTg-S' hatte, daß die Hybridisierungstemperatur 31⁰C betrug und daß die Waschtemperatur nach dem Hybridisieren 53⁰C betrug. Das modifizierte Plasmid hatte eine mit pYGABA identische Sequenz, ausgenommen die geänderten und hinzugefügten Codone.

Beispiel IV ,

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das für die Produktion des Vorläufers [Gln^A4,Asp^A2']-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21) SOP.vt't werden ksnn.

Das Verfahren wa .· im wesentlichen das gleiche wie im Beispiel I, mit den Ausnahmen, daß die verwendete Matrize durch Klonierung der BamHI-Kassette von pYGAB-AKR-A in M13 gewonnen wurde und daß die Mutagenese in zwei Schritten ausgeführt wurde. Beim Schritt 1 hatte der Starter die Sequenz 5'-ACAACATTGTTGAACAATAcC-S', die Hybridisierungstemperatur betrug 27⁰C und die Waschtemperatur nach dem Hybridisieren betrug 49⁰C, und im Schritt 2 hatte der Starter die Sequenz ö'-CGCTATTAGTCACAGTAGTTT-S', die Hybridisierungstemperatur betrug 29⁰C, und die Waschtemperatur nach dem Hybridisieren lag bei 51 °C. Das modifizierte Plasmid hatte eine mit pYGABA identische Sequenz, ausgenommen die geänderten und hinzugefügten Codone.

Beispiel V

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das für die Produktion des Vorläufers Ser*²¹ -B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1 -21) genutzt werden kann.

Das Verfahren war im wesentlichen das gleiche wie im Beispiel I, mit den Ausnahmen, daß die eingesetzte Matrize durch Klonieren der BamHI-Kassette von pYGAB-AKR-A in M13 gewonnen wurde, daß der Mutagenisationsstarter die Sequenz 5'-GACGCTATTAAGTACAGTAGt-S' hatte, daß die Hybridisierungstemperatur 29⁰C betrug und daß die Waschtemperatur nach dem Hybridisieren bei 51⁰C lag. Das modifizierte Plasmid hatte eine mit pYGABA identische Sequenz, ausgenommen die geänderten und hinzugefügten Kodone.

Beispiel VI

Konstruktion eines Expressionsplasmids, das für die Produktion des Vorläufers [Arg^B")-B(1 -29)-Ala-Lys-Arg-A(1 -21) genutzt werden kann.

Das Verfahren war im wesentlichen das gleiche ν ': im Beispiel I, mit den Ausnahmen, daß die eingesetzte Matrize durch Klonieren der BamHI-Kassette von pYGAB-AKR-a in M13 gewonnen wurde, daß der Mutagenisationsstarter die Sequenz B'-CAACAATACCTCTCTTAGCCTTTGGTCTGTAGAAGA-a' hatte, daß die Hybridisierungstemperatur43°C betrug und daß die Wasohtemperatur nach dem Hybridisieren bei 65⁰C lag. Das modifizierte Plasmid hatte eine mit pYGABA identische Folge, ausgenommen die geänderten und hinzugefügten Kodone.

Beispiel VII

Expression des Vorläufers und Isolierung aus dem Kulturmedium.

Hefe, die auf die in den Beispielen I bis Vl beschriebene Art und Weise transformiert worden war, wurde auf Petrischalen vermehrt, die Minimalmedium ohne Uracil enthielten, Dauer48 Stunden bei 30°C. Rüttelflaschen zu 100ml, die Minimalmedium ohne Uracil + 5g/l Kasaminosäuren + 10g/l Sukzinsäure + 30g/l Glukose bei einem pH-Wert von 5,0 enthielten, wurden mit einer einzigen Kolonie von den Petrischalen geimpft. Die Flaschen wurden dann bei 3O⁰C in einem Inkubator 72 Stunden lang gerüttelt.

Nach dem Zentrifugieren wurde 11 der zusammengefaßten, obenaufschwimmenden Schichten durch Filtern sterilisiert und durch den Zusatz von 5 M HCI und Wasser auf einen pH-Wert von 4-4,5 und eine Leitfähigkeit von < 10 mS aogestimmt. Mit einem Strom von 120ml/h wurde die obenaufschwimmende Schicht dann einer S-Sepharose®-FF-Kolonne, 1,6 x 6cm, zugeführt, welche vorher mit 5OmM Essigsäure, 50% (Volumenbasis) Ethanol, mit NaOH auf einen pH-Wert von 4,0 abgestimmt, äquilibriert worden war. Die Kolonne wurde mit 60ml Puffer gewaschen, und der Vorläufer wurde durch einen linearen Gradienten von NaCI von 0 bisO,35 M in 360 ml Puffer mit einem Strom von 10rr.l/h eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen von 4 ml aufgeteilt und auf UV-Absorbanz untersucht. Fraktionen, die den Vorläufer enthielten, wurden durch RP-HPLC-Analyse identifiziert und zusammengefaßt. Nach dem Entsalzen auf einer Sephadex'G 25-Kolonne in 1M Essigsäure wurde der Vorläufer durch Lyophilisieren isoliert.

Beispiel VIII

Herstellung von (Arg^AO]-des[Thr^B30)-menschlichem Insulin aus dem Vorläufer B(1-29)-Ala-Ly3-Arg-A(1-21).

Bei 4⁰C wurden 250mg von B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), das nach den Methoden in den Beispielen I und VII hergestellt worden war, in 25ml von 5OmM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 20% Ethanol, mit HCI auf einen pH-Wert von 10 abgestimmt, aufgelöst. Sepharose®, die 0,8 mg immobilisiertes Trypsin/ml enthielt, wurde auf einem Glasfilter mit dem gleichen Puffer gewaschen und abgeleitet. Es wurde Puffer zu 40g des abgeleiteten Gels gegeben und das Volumen auf 75 ml abgestimmt. Die Lösung, die den Vorläufer enthielt, wurde der Suspension zugesetzt, und man ließ das Gemisch eine Stunde lang bei 4⁰C unter sanftem Rühren stehen, anschließend wurde es gefiltert.

Die HPLC-Analyse (Analyse durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie) ergab eine 61%ige Umwandlung in [Arg^A0)-des-(Thr^B3Ol-menschliches Insulin.

Das Gel wurde mit 50ml Puffer (ohne Ethanol) gewaschen und abgeleitet, und die Proteine in den zusammengefaßten Filtraten wurden durch Abstimmung des pH-Wertes auf 6 ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren und Lyophilisieren isoliert. .

Der Niederschlag wurde bei 4⁰C in 20 ml von 7 M Harnstoff durch Abstimmung des pH-Wertes auf 8,1 aufgelöst, und die Lösung wurde einer Kolonne von Q-Sepharose'FF von 1,6cm χ 20cm zugeführt, die vorher mit 2OmM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan,7 M Harnstoff, mit HCI auf einen pH-Wert von 8,1 abgestimmt, bei 4°C äquilibriert worden war. Unter Anwendung eines Stromes von 40ml/h wurde die Kolonne dann mit einem linearen Gradienten von 0 mM bis 5OmM NaCI in dem gleichen Puffer über 24 Stunden eluiert. Das Eluat wurde durch UV-Absorption nachgewiesen, und die erste der beiden eluierten Hauptspitzen wurde aufgefangen. Das zusammengefaßte Material wurde in 1M Essigsäure auf einer Sephadex® G 25-Kolcnne

entsaht und lyophilisert. Die Ausbeute betrug 75mg an [Arg^AO)-des(Thr^B30]-menschlichem Insulin. ,

Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch Plasmadesorptionsmassenspektrometrie und durch sequentiellen Edman-Abbau der getrennten vinylpyridylierten A- und B-Ketten bestätigt.

Beispiel IX

Herstellung von Arg^A0-desThr^BM-menschlichem Insulin aus dem Vorläufer B(1-29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1-21).

In 50ml von 5OmM Tris-(hydi oxymethyOaminomothan, 20% Ethanol, mit HCI auf einen pH-Wert von 10 abgestimmt, wurden 400mg B(1 -29)-Gly-Ser-Lys-Arg-A(1 -21), hergestellt nach den in den Beispielen Il und VII beschriebenen Methoden, aufgelöst.

Sepharose®, die 0,8g immobilisiertes Trypsin/ml enthielt, wurde auf einem Glasfilter mit dem gleichen Puffer gewaschen und dann abgeleitet. Zu 80g des abgeleiteten Gels wurde Puffer gegeben, und das Volumen wurde auf 150ml abgestimmt. Die Lösung, die den Vorläufer enthielt, wurde zu der Suspension gegeben, und man ließ das Gemisch 30 Minuten lang unter sanftem Rühren bei 2O⁰C stehen, anschließend wurde es gefiltert.

Die HPLC-Analyse zeigte eine Umwandlung von 50% in [Arg^AO)-d<3s(.Thr^B30]-menschliches Insulin.

Das Gel wurde mit 100ml Puffer (ohne Ethanol) gewaschen und abgeleitet, und die in den Fiitraten zusammengefaßten Proteine wurden durch Abstimmung des pH-Wertes auf 6 ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren und Lyophilisieren isoliert.

Der Niederschlag wurde bei 4⁰C in 20 ml von 7 M Harnstoff durch Abstimmung des pH-Wertes auf 8,1 aufgelöst, und die Lösung wurde einer Q-Sepharose®FF-Kolonne von 1,6cm x 20cm zugeführt, die vorher bei 4⁰C in 2OmM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, 7 M Harnstoff, mit HCI auf einen pH-Wert von 8,1 abgestimmt, äquilibriert worden war. Unter Anwendung eines Stromes von 40ml/h wurde die Kolonne dann mit einem linearen Gradienten von OmM bis 5OmM NaCI in dem gleichen Puffer über 24 Stunden eluiert. Das Eluat wurde durch UV-Absorption nachgewiesen, und die erste der beiden eluierten Hauptspitzen wurde aufgefangen. Das zusammengefaßte Material wurde in 1M Essigsäure auf einer Sephadex® G 25-Kolonne entsalzen und lyophili: rt. Die Ausbeute betrug 145mg [Arg^AO]-des[THr^B30]-menschliches Insulin.

Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch HPLC-Analyse und durch sequentiellen Edman-Abbau bestätigt.

Beispiel X

Herstellung von [Arg^AO]-des(Thr^B30|-menschlichem Insulin aus Schweins-Proinsulin.

In 800μΙ von 0,1 M HCI wurden 40mg Schweins-Proinsulin aufgelöst, und es wurden 8ml von 5OmM Tris-(hydroxymethyl)aminomethan zugesetzt. Es wurde eine Lösung von einer Einheit Endoproteinase Lys-C von Lysobacterenzymogenen (Boehringer, Mannheim) in 200 μΙ von 0,1 M Tris-(hydroxymethyl)aminomethan, mit HCI auf einen pH-Wert von 8,5 abgestimmt, hergestellt. Die beiden Lösungen wurden miteinander gemischt und 16 Stunden lang bei 12°C stehengelassen.

Die Reaktion wurde durch Abstimmung des pH-Wertes auf 6,2 nach dem Zusatz von 1,8ml 96%igen Ethanols gestoppt, und die resultierende Suspension wurde bei 4⁰C über Nacht stehengelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren isoliert und bei 4°C wieder in 2 ml von 7 M Harnstoff unter Abstimmung des pH-Wertes auf 8,1 aufgelöst. Diese Lösung wurde einer Q-Sepharose®FF-Kolonne von 1,6cm χ 20cm, die vorher bei 4°C in 20 rnM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 7 M Harnstoff, mit HCI auf einen pH-Wert von 8,1 abgestimmt, ä'quilibriert worden war. Unter Anwendung eines Stroms von 40 ml/h wurde die Kolonne dann mit einem linearen Gradienten von OmM bis zu 5OmM NaCI in dem gleichen Puffer über 24 Stunden eluiert. Das Eluat wurde durch UV-Absorption nachgewiesen, und die Hauptspitze wurde aufgefangen. Das zusammengefaßte Material wurde in 1 M Essigsäure auf einer Sephadex®G25-Kolonne entsalzt und lyophiliert. Die Ausbeute betrug 15mg [Arg^A0]-des[Thr^B30]-menschliches Insulin.

Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäurenanalyse, durch HPLC-Analyse und durch sequentiellen Edman-Abbau bestätigt.

Beispiel Xl

Herstellung von [Arg^A0)-menschlichem Insulin-(B3O-Amid).

Es wurden 200mg an lArg^AO]-deslThr^B30]-menschlichem Insulin, das nach einer der Methoden in den Beispielen VIII bis X hergestellt worden war, in einem Gemisch aufgelöst, das 400 mg Threoninamid, 2,0 ml Ethanol und 0,8 ml Wasser enthielt. Der pH-Wert wurde mit Essigsäure auf 6,3 abgestimmt, und es wurde ein (abgesetztes) Volumen von 4 ml Sepharose*zugesetzt, das 3,2 mg immobilisiertes Trypsin enthielt. Diese Mischung wurde 2 Stunden bei 20°C unter sanftem Rühren stehengelassen, anschließend wurde das Gel durch Filtern entfernt, und das Protein wurde durch den Zusatz von 10 Volumen an 2-Propanol ausgefällt. Der luftgetrocknete Niederschlag wurde bei 4⁰C in 20ml von 7 M Harnstoff unter Abstimmung des pH-Wertes auf 8,1 aufgelöst, und die Lösung wurde einer Q-Sepharose®FF-Kolonne von 1,6cm χ 20cm, die vorher bei 4°C mit 2OmM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 7 M Harnstoff, mit HCI auf einen pH-Wert von 8,1 abgestimmt, äquilibriert worden war. Unter Anwendung eines Stroms von 40 ml/h wurde die Kolonne dann mit einem linearen Gradienten von OmM bis zu 5OmM NaCI in dem gleichen Puffer über 24 Stunden eluiert. Das Eluat wurde durch UV-Absorption nachgewiesen, und die Hauptspitze wurde aufgefangen. Das zusammengefaßte Material wurde in 1M Essigsäure auf einer Sephadex*G 25-Kolonne entsalzt und lyophilisiert. Die Ausbeute betrug 80mg [Arg^AO)-menschlicheslnsulin-(B30-Amid).

Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäurenanalyse, durch Plasmadesorptionsmassenspektrometrie und durch sequentiellen Edman-Abbau bestätigt.

Beispiel XII

Herstellung von [Gln^BI3,Arg^AO]-des|Thr^B30]-menschlichem Insulin.

Es wurden 250mg von [Gln^B13]-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21),das nach den in den Beispielen III und VII beschriebenen Methoden hergestellt worden war, mit immobilisiertem Trypsind behandelt, und das Reaktionsprodukt wurde im wesentlichen so gereinigt, wie das im Beispiel VIII beschrieben wurde. Die Ausbeute betrug 60mg lGln^B13,Arg^AO]-des[Thr^B30]-menschliches Insulin.

Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäureanalyse, durch Plasmadesorptionsspektrometrie und durch sequentiellen Edman-Abbau bestätigt.

Beispiel XIII

Herstellung von [Gln^A4,Asp^A21,Arg^AO]-menschlichem Insulin-(B3O-Amid).

Es wurden 500mg von (Gln^A4,Asp^A2I)-B(1-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), die nach den in den Beispielen IV und VII beschriebenen Methoden hergestellt worden waren, mit immobilisiertem Trypsin behandelt, und das resultierende Produkt wurde im wesentlichen so gereinigt, wie das im Beispiel VIII beschrieben wurde. Die Ausbeute betrug 175mg an (Gln^A4,Asp^A21,Arg^AOldes(Thr^B30|-menschlichem Insulin.

Das wurde durch Kopplung mit Threoninamid nach der im Beispiel Xl beschriebenen Methode in das B30-Amid umgewandelt.

Die Ausbeute an gereinigtem (Gln^A4,Asp^A21,Arg^AO]-menschlichem Insulin-(B3O-Amid) betrug 50mg.

Beispiel XIV

Herstellung von |Ser^A21,Arg^A0]-menschlichem lnsulin-(B30-amid).

Es wurden 400mg [Se^²¹J-B(I-29)-Ala-Lys-Arg-A(1-21), das nach den in den Beispielen V und VII beschriebenen Methoden hergestellt worden war, mit immobilisiertem Trypsin behandelt, und das resultierende Produkt wurde im wesentlichen so gereinigt, wie das im Beispiel VIII beschrieben wurde. Die Ausbeute betrug 125 mg [Ser^A2t,Arg^AO)-des|Thr^B30]-menschliches Insulin.

Das wurde durch Kopplung mit Threoninamid nach der im Beispiel Xl beschriebenen Methode in das B30-Amid umgewandelt. Die Ausbeute an gereinigtem [Ser^A2',Arg^A0)-menschlichem Insulin-(B3O-Amid) betrug 40 mg.

Beispiel XV

Herstellung von [Arg^B",Arg^AO]-des[Thr^B30]-menschlichem Insulin.

Es wurden 250mg [Arg^B27]-B(1 -29)-Ala-Lys-Arg-A(1 -21), das nach den in den Beispielen Vl und VII beschriebenen Methoden hergestellt worden war, mit immobilisiertem Trypsin behandelt, und das resultierende Produkt wurde im wesentlichen so gereinigt, wie das im Beispiel VIII beschrieben wurde. Die Ausbeute betrug 50 mg [Arg^B",ARg^AO]-des[Thr^B30)-menschliches Insulin.

Die Identität des Produktes wurde durch Aminosäurenanalyse und durch sequentiellen Edman-Abbau bestätigt.

Beispiel XVI

Zubereitung eines injizierbaren Präparates mit verzögernder Wirkung, das aufgelöstes [Arg^A0]-menschliches Insulin-(B3O-Amid) enthält.

Es wurden 60 μΜοΙ des (Arg^AOl-menschlicheslnsulin-(B30-Amids) in 4 ml von 0,1 M HCI aufgelöst, und es wurden 20ml 1,5%iges m-Kresol zugesetzt. Die Lösung wurde mit 70ml von 1%igem NaCI und 3,25 ml von 0,1 M ZnCI₂ gemischt, und der pH-Wert wurde auf 4,0 abgestimmt. Das Volumen wurde abschließend auf 100ml mit Wasser abgestimmt und durch Filtern sterilisiert.

Beispiel XVII

Zubereitung eines injizierbaren Präparates mit verzögernder Wirkung, das eine kristalline Suspension von [Arg^A0]-menschlichem Insulin-(B3O-Amid) enthält.

Es wurden 60μΜοΙ von (Arg^A0]-menschliches lnsulin-(B30-amid) in 70ml einer 1%igen NaCI-Lösung aufgelöst, die 0,5% m-Kresol enthielt, wobei der pH-Wert mit 1M NaOH auf 9,7 abgestimmt wurde, und es wurden 325μΙ von 0,1 M Zinkazetat zugesetzt. Nach der erneuten Abstimmung des pH-Wertes auf 9,7 wurde das Volumen mit Wasser auf 80ml abgestimmt, und die Lösung wurde durch Filtern sterilisiert.

Es wurden 20 ml von 65 mM NaH₂PO₄, dio 0,3% m-Kresol enthielten und mit NaOH auf einen pH-Wert von 6,0 abgestimmt worden waren, durch Filtern sterilisiert.

Unter sterilen Bedingungen wurden die beiden Lösungen gemischt, und die resultierende Suspension ließ man unter sehr sanftem Rühren bei 20°C eine Stunde lang stehen. Abschließend wurde der pH-Wert mit HCI auf 7,3 abgestimmt.

Beispiel XVIII

Nachweis der hinauszögernden Wirkung nach der subkutanen Injektion bei Ratten durch Gammazählung von außen.

Für die Experimente wurden weibliche Wistar-Ratten von ca. 25Og Körpergewicht und einem Alter von mehr als 90 Tagen verwendet. Die Ratten wurden vor der Verwendung etwa eine Woche lang akklimatisiert und wurden id libitum gefüttert. Vier Tage vor den Experimenten erhielten die Ratten eine wäßrige Lösung von 20 mM Kaliumiodid als Trinkwasser.

Verwendet wurden folgende Testpräparate:

I. Suspensionspräparat, das [Arg^A0]-menschliches Insulin-(B3O-Amid) enthielt und nach dem Beispiel XVII hergestellt worden war.

II. Lösungspräparat, das [Arg^A0]-menschliches Insulin-(B3O-Amid) enthielt und nach dem Beispiel XVI hergestellt worden war.

III. Schnellwirkendes Lösungspräparat, das semisynthetisches menschliches Insulin enthielt (Velosulin®, 100 Einheiten/ml).

Alle drei Zubereitungen enthielten zusätzliche 50uCi/ml [Mono-¹²⁶l)-lnsulin bzw. -Insulinverbindungsmarker, das nach Standardmethoden der Radiojodierung hergestellt worden war.

Den Ratten wurden auf der Rückseite des Femur subkutan 50μΙ Präparat injiziert, das 3,5nMol Insulinverbindung und 2,5μΏ |^ml]-markiertem Tracer enthielt. Während der Untersuchung wurden die Ratten in einer Rattenhalterung immobilisiert.

Das Verschwinden des Tracers aus der Injektionsstelle, das ein Maß für die Absorption des Insulins aus dein subkutanen Depot ist (C. Binder, Absorption of Injected Insulin [Absorption von injiziertem Insulin]. Munksgaard, Kopenhagen, 1969), wurde unter Verwendung von zwei stationären Mengenstrommessern MIP-10 und Detektoren E749 mit 3mm Nal-Szintillationskristallen mit

Be-Fenslern und Kollimatoren mit 60° Sichtwinkel und 10-mm-Öffnungen (Raytronic) gemessen. Die Mengenstrommesser wurden mit Minirecordern 121N (Raytronic) verbunden. Die Detektoren wurden 2cm über der Haut an der Injektionsstelle angebracht. Die Radioaktivität wurde jeweils über einen Fünfminutenzeitraum zu Stunde 0,0,5,1,1,5,2,2,5 3,4,5,6,8,12, und 24 nach der Injektion des Präparates überwacht. Nach Abzug der Hintergrundszählung wurden die Zählraten in Prozentsätze der anfänglichen Zählrate umgewandelt.

In der Abb. 3 werden die Mittelwerte für die Restradioaktivität als Funktion der Zeit für jedes Präparat gegeben. Wenn man den Zeitpunkt der Restradioaktivität von 50% (T₆Os) als Maß für die hinauszögernde Wirkung nimmt, ergeben sich aus den Kurven folgende Werte:

Präparat I > 12 Stunden Präparat II« 8 Stunden Präparatill» 0,5 Stunden

Diese Ergebnisse zeigen, daß beide Präparate, die [Arg^AOj-menschliches Insulin-(B3O-Amid) enthalten, eine ausgeprägte hinauszögernde Wirkung gegenüber dem schnellwirkenden menschlichen Insulinpräparat haben.

Beispiel XIX

Zubereitung eines injizierbaren Präparates, das eine Lösung von (Arg^AO,Arg^B27)-des[Thr^B30l-menschliches Insulin enthält und eine hinauszögernde Wirkung hat.

Es wurden 12μΜοΙ von (Arg^A0,Arg^B"l-deslThr^BMl-menschliches Insulin in 35ml einer 1%igen NaCI-Lösung aufgelöst, die 0,5% m-Kresol enthielt, wobei der pH-Wert mit 1 M HCI auf 3,5 abgestimmt wurde, und es wurden 650 μΙ von 0,1 M Zinkazetat zugesetzt.

Nach erneuter Abstimmung des pH-Wertes auf 3,5 wurde das Volumen mit Wasser auf 50ml gebracht, und die Lösung wurde durch Filtern sterilisiert.

Beispiel XX

Nachweis der hinauszögernden Wirkung bei Kaninchen nach subkutaner Injektion.

Der Grad der hinauszögernden Wirkung eines Lösungspräparates, das 0, iM IArg^AO,Arg^B27]-des[Thr^B30l-menschliches Insulin enthielt und wie im Beispiel XIX hergestellt worden war, wurde bei Kaninchen nach der Methode bestimmt, die in der British Pharmacopoeia 1980 beschrieben wurde.

Sechs Kaninchen wurde subkutan jeweils 65μΙ des Präparats injiziert, und zur Glukosebestimmung wurden unmittelbar vor der Injektion und 1,2,4 und 6 Stunden nach der Injektion Blutproben entnommen. Die Glukosewerte wurden als Prozentsatz des Wertes vor der Injektion ausgedrückt.

Die Bestimmung ergab folgende Mittelwerte:

Zeit nach der Injektion: Oh 1h 2h 4 h 6h

% Glukose oes Anfangswertes: 100% 68,2% 65,0% 80,1% 79,4%

Durch Bestimmung des Prolongationsindexes nach der Methode, die von Markussen u.a., Protein Engineering, Bd. 1, Nr.3, S. 205-213 (1987), beschrieben wurde, wurde ein Wert von 42 berechnet. Durch den Vergleich der Ergebnisse mit denen in der Tabelle 1, ebenda, kann festgestellt werden, daß das Lösungspräparat, das [Arg^AO,Arg^B2']-des[Thr^B30)-menschliches Insulin enthält, die gleiche Prolongation wie das normalerweise eingesetzte Zink-Insulin-Suspensions-Präparat mit verzögernder Wirkung, Actrapid* Human, aufweist.

Claims

1. Insulinverbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Formel Il haben: A-Kette

S S

I 7 I

H-Arg-Gly-Ile-Val-E-Gln-Cyß Oys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-O 1 2345 6 I 8 9 IO 11 12

B-Kette S

I
H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-cys-Gly-Ser-His-Leu-Val •123456789 10 11 12

Α-Kette (fortgesetzt)

Leu-Tyr-Gln-Leu-E-Asn-Tyr-Cys-N-OH 13 14 15 16 17 10 19 | 21

I S

I
B-Kette (fortgesetzt) S

E-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-E-Arg-Gly-Phe- 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

B-Kette (fortgesetzt)

Phe-Tyr-T-Pro-Lys-X-Y
25 26 27 28 29 30

E jeweils GIu oder einen neutralen Aminosäurerest darstellt, der durch Nukieotidsequenzen codiert werden kann, N einen Aminosäurerest darstellt, der durch Nukieotidsequenzen codiert werden kann,

T Thr oder Arg darstellt,
X Thr, Ser, AIa oder OH darstellt und

YOR oder NR¹R² darstellt, wobei R, R¹ und R² jeweils Wasserstoff oderein niederes Alkyl darstellen, mit der Ausnahme, daß Y nicht vorhanden ist, wenn X gleich OH ist.

2. Insulinverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jedes E jeweils GIu oder GIn darstellt, N Asn, Asp, Ser oder GIy darstellt, T Thr oder Arg darstellt, X Thr darstellt und Y NH₂ darstellt.

3. Insulinverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß alle E GIu darstellen, N Asn darstellt, T und X beide Thr darstellen und Y NH₂ darstellt.

4. Insulinverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß alle E GIu darstellen, N Ser darstellt, T und X beide Thr darstellen und Y NH₂ darstellt.

5. Insulinverbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß E in der Position B13 GIn darstellt und die restlichen E alle GIu darstellen, daß N Asn darstellt, daß T und X beide Thr darstellen und Y NH₂ darstellt.

6. Insulinverbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß E in der Position A4 GIn darstellt und alle übrigen E GIu darstellen, N Asp darstellt, T und X beide Thr darstellen und Y NH₂ darstellt.

7. Insulinverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß alle E GIu darstellen, N Asn darstellt, T Arg darstellt und X OH darstellt.

8. Verfahren für die Herstellung von Insulinverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Insulinvorläufer mit der allgemeinen Formel III

s s

I I

Arg-Gly-Ile-Val-E-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-E-Asn-Tyr-Cys-N-OH

2 3 4 5 6 j 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 | 21

S I— S

I (AA)₁

.B-Kette ! 1

S S

ι

Z-Phe-Val-Asn-G^.π-His-Lεu-C7s-Gly-Ser-Kis-L·£u-Val-E-AIa-L·eu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-E-Arg
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

B-Kette (fortgesetzt)

Gly-Phe—Phe-Tyr-T-Pro-Lys
24 25 26 27 28 29

ro co oo

E, N und T die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 haben, (AA)η eine Peptidkette mit η Aminosäureresten und Lys als C-Terminalrest darstellt oder eine Peptidbindung ist, wenn η = 0, und

Z Wasserstoff oder eine Peptidkette von willkürlicher Länge mit Lys als dem C-Terminalrest darstellt, transpeptidiert oder durch eine Endopeptidase mit einer ausschließlichen Spezifizität zum Schneidert an der Karboxyseite eines Lysinrestes geschnitten wird. 9. Insulinpräparate, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine Insulinverbindung nach Anspruch 1 und wahlweise auch ein schnellwirkendes Insulin, wie menschliches Insulin, Insulin von Haustieren oder deren Analoge oder Derivate, enthalten.

10. Insulinpräparate nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie bestehen aus einer Lösung von wenigstens einer Insulinverbindung nach Anspruch 1 in einem wäßrigen Medium, das mit Blutserum isoosmotisch ist, einen pH-Wert zwischen 4 und 5,5 hat und wahlweise einen Puffer und/oder ein Präservierungsmittel enthält, und wahlweise einem schnellwirkenden Insulin.