DE3854969T2

DE3854969T2 - Polynukleotid-Bestimmung mit selektierbaren Spaltstellen

Info

Publication number: DE3854969T2
Application number: DE3854969T
Authority: DE
Inventors: Michael S. Alamo Ca 94507 Urdea
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1988-09-29
Filing date: 1988-10-03
Publication date: 1996-05-30
Anticipated expiration: 2008-10-04
Also published as: US5118605A; ES2083955T3; US5380833A; EP0360940A2; DE3854969D1; EP0360940A3; EP0360940B1; CA1340231C; JP2676535B2; JPH0292300A

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung

Die Fähigkeit, Oligonukleotidsequenzen nach Bedarf zu synthetisieren und die Polynukleotidsequenzen, die nach synthetischen Verfahren hergestellt wurden oder die aus natürlich vorkommenden Quellen erhalten wurden, zu clonieren, hat die Möglichkeiten für den Nachweis der Anwesenheit spezifischer Sequenzen in einer verlängerten Oligonukleotidsequenz, beispielsweise bei einem Chromosom oder bei Chromosomen, Gemischen von Sequenzen, mRNAS oder ähnlichen, stark expandiert. Das Interesse an spezifischen Sequenzen kann die Diagnose der Anwesenheit von Pathogenen, die Bestimmung der Anwesenheit von Allelen, die Anwesenheit von Läsionen in einem Wirtsgenom, den Nachweis einer besonderen mRNA oder der Überwachung der Modifizierung eines zellularen Wirts umfassen, um nur einige erläuternde Möglichkeiten zu erwähnen. Während die Verwendung von Antikörpern zur Durchführung von diagnostischen Assays bezuglich der Anwesenheit verschiedener Antigene in Proben eine explosive Ausdehnung in Techniken und Vorschriften seit der Verfügung über den Radioimmunoassay genommen hat, gab es bis vor kurzem keine parallele Aktivität auf dem Gebiet der DNA-Sonden. Daher hat in den meisten Fälten der Nachweis von Sequenzen verschiedene Hybrisierungstechniken umfaßt, die die Bindung einer Polynukleotidsequenz an einen Träger und die Verwendung einer radiomarkierten Sonde erfordern.
Im Hinblick auf die zunehmende Möglichkeit, Oligonukleotidsequenzen in großen Mengen auf wirtschaftliche Weise herzustellen, wird die Aufmerksamkeit der Forscher darauf gerichtet werden, einfache, genaue und effiziente Techniken für den Nachweis spezifischer Oligonukleotidsequenzen zur Verfügung zu stellen. Wünschenswerterweise werden diese Techniken schnell sein, die Möglichkeit für einen Laborantenfehler minimieren, automatisiert werden können, und einfach und genaue Nachweisverfahren erlauben. Bis heute hat man bereits Bemühungen unternommen, um Mittel für die Markierung von Oligonukleotidsonden mit Markierungen, ausgenommen von Radioisotopen, zur Verfügung zu stellen und die Genauigkeit des Transfers der DNA-Sequenzen an den Träger von einem Gel zu verbessern. Man hat auch verbesserte Verfahren zur Derivatisierung von Oligonukleotiden zur Verfügung gestellt, um die Bindung an eine Markierung zu erlauben. Es besteht weiterhin ein Bedarf für die Zurverfügungstellung neuer Vorschriften, die eine Flexibilität beim Nachweis von DNA- Sequenzen von Interesse bei einer Vielzahl von Situationen erlauben, bei denen die DNA von verschiedenen Quellen kommen kann.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Meinkoth und Wahl, Anal. Biochemistrv (1984) 138:267-284 liefern eine ausgezeichnete Übersicht über Hybridisierungsverfahren. Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:4045-4049, beschreiben die Verwendung von biotinylierter DNA zusammen mit einem Avidin-Enzymkonjugat für den Nachweis spezifischer Oligonukleotidsequenzen. Ranki et al., Gene (1983) L1:77-85, beschreiben die von ihnen so genannte "Sandwich"-Hybridisierung für den Nachweis von Oligonukleotidsequenzen. Pfeuffer und Helmrich, J. of. Biol. Chem. (1975) 250:867-876, beschreiben die Kupplung von Guanosin-5'-0-(3-thiotriphosphat) an Sepharose 48. Bauman et al., J. of Histochem. and Cvtochem. (1981) 29:227-237, beschreiben die 3'-Markierung von RNA mit Fluoreszenzmitteln. In der PCT-Anmeldung WO/8302277 werden die Addition an DNA-Fragmente von modifizierten Ribonukleotiden für die Markierung und Verfahren zur Analyse solcher DNA-Fragmente beschrieben. Renz und Kurz, Nucl. Acids. Res. (1984) 12:3435-3444, beschrieben die kovalente Bindung von Enzymen an Oligonukleotide. Wallace, DNA-Recombinant Technology (Woo, S., Hrsg.) CRC Press, Boca Raton, Florida, liefert einen allgemeinen Hintergrund für die Verwendung von Sonden bei der Diagnose. Chou und Merigan, N. Eng. J. of Med. (1983) 308:921-925, beschreiben die Verwendung von Radioisotop-markierten Sonden für den Nachweis von CMV. Inman, Methods in Enzymol. 348, 24 (1974) 30-59, beschreibt Verfahren für die Bindung an Polyacrylamide, während Parikh et al., Methods in Enzymol. 348, 24 (1974) 77-102, Kupplungsreaktionen mit Agarose beschreiben. Alwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) L4:5350-5354, beschreiben ein Verfahren zur Übertragung von Oligonukleotiden von Gelen an einen festen Träger für die Hybridisierung. Chu et al., Nucl. Acids Res. (1983) 11:6513-6529, beschreiben ein Verfahren für die Derivatbildung terminaler Nukleotide. Ho et al., Biochemistry (1981) 20:64-67, beschreiben die Derivatbildung terminaler Nukleotide über ein Phosphat unter Esterbildung. Ashley und Macdonald, Anal. Biochem. (1984) 140:95-103, beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von Sonden aus einem an der Oberfläche gebundenen Templat. Auf diese Literaturstellen, in denen Verfahren beschrieben werden, wird expressis verbis in der vorliegenden Anmeldung bezug genommen, insbesondere für die Offenbarung der Herstellung der markierten Oligonukleotide.
In der W088/01302 wird ein Nukleinsäuresonden-Assayverfahren beschrieben, bei dem ein Oligonukleotidsonden-derivatisierter fester Träger verwendet wird, an den eine Oligonukleotidsonde mit 15 bis 100 Basen in einer Sequenz komplementär zu der Sequenz eines Nukleinsäureanalyten thermisch kovalent gebunden ist. In der US-A-4 772 691 werden biotinylierte Nukleotide mit einem chemisch spaltbaren Linkerarm zwischen einem Biotin und einer organischen basischen Gruppe beschrieben.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit einer Oligonukleotidsequenz von Interesse in einem Nukleinsäureanalyten, der in einer Nukleinsäureprobe vorhanden ist, wobei das Verfahren umfaßt:
Vereinigung unter hybridisierenden Bedingungen der Nukleinsäureprobe mit einem Polynukleotidreagens, wobei entweder die genannte Probe oder eine Komponente des Reagens an einen Träger gebunden ist, und Hybridisierung des Analyten und des Polynukleotidreagens, die dazu führt, daß der Marker an den Träger über eine selektierbare Spaltstelle gebunden wird, wobei die selektierbare Spaltstelle eine durch OH-, Hydroxylamin, SH- oder Periodat spaltbare Bindung umfaßt;
im wesentlichen Befreiung des Trägers von dem Marker, der an dem Träger anders als durch die selektierbare Spaltungsstelle gebunden ist;
Spalten der besagten Spaltungsstelle und
Nachweis eines von dem Träger freien Markers.
Beispielsweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Spaltungsstelle zwischen dem Marker und dem Träger durch Duplikation einer markierten Sonde und der Proben-DNA gebildet, wobei der Duplex an den Träger gebunden ist. Die Spaltungsstelle kann dann gespalten werden, was die Trennung von dem Träger und dem oder den Marker bzw. Markern ermöglicht. Der Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit des Trägers kann dann nach an sich bekannten Verfahren erfolgen.
Es ist ein primärer Vorteil der Erfindung, verglichen mit dem Stand der Technik, daß es gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich ist, zwischen einer spezifischen und einer nicht-spezifischen Bindung des Markers zu unterscheiden. Das heißt, gemäß dem Stand der Technik wurde der Marker typischerweise an einem festen Träger, d.h. die Probe ist an dem Träger fixiert, nachgewiesen und mit einer komplementären markierten Sonde kontaktiert, und die Duplexbildung wurde dann an dem Träger analysiert. Die Schwierigkeit mit diesem Verfahren ist die, daß der Marker in Abwesenheit des Analyten an den Träger binden kann und bindet. Diese direkte Bindung des Markers an den Träger wird hier als "nicht-spezifische" Bindung bezeichnet. Wenn eine signifikante Menge der nicht-spezifischen Bindung auftritt, wird die Markierung an dem Träger nachgewiesen, unabhängig von der Anwesenheit des Analyten, wodurch falsche positive Ergebnisse erhalten werden.
Im Gegensatz dazu wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Marker nur nachgewiesen, wenn der Analyt von Interesse vorhanden ist, d.h. es wird nur die "spezifische" Bindung nachgewiesen. Dies erfolgt durch Einführung einer Spaltungsstelle zwischen dem Träger und dem ausgewählten Marker durch ein Duplex zwischen der Probe und einer oder mehreren Sonden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In Fig. 1 wird der Unterschied zwischen der spezifischen und nichtspezifischen Bindung eines Markers an einem festen Träger erläutert.
In den Fig. 2A bis 2D wird das bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren schematisch erläutert, wobei eine selektiv spaltbare Stelle zwischen einem Träger und einem Marker durch einen Analyt-Sonden-Komplex eingeführt wird.
In der Fig. 3 wird ein alternatives Verfahren schematisch erläutert, wobei ein spezifisch gebundener Marker gemäß einem Strangersatzverfahren freigesetzt wird.

Beschreibung spezifischer Ausführungsformen

Der Nachweis (Detektion) spezifischer Sequenzen erfolgt unter Hybridisierung, wobei die Duplexierung der DNA-Probe und einer Sonde die Fähigkeit beeinflußt, die räumliche Beziehung zwischen der Sonde und dem Träger zu modifizieren. Auf diese Weise kann die Anwesenheit oder Abwesenheit einer besonderen Sequenz in einer Probe leicht durch die Menge des Markers, der in das Medium freigesetzt wird, bestimmt werden.
Das gewünschte Verfahren erlaubt die Variation der Vorschriften und Reagentien, wobei die Nukleinsäureprobe an den Träger gebunden sein kann oder in frei in Lösung vorliegen kann. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Bildung eines Nukleinsäureduplex, wobei ein Marker von dem Träger gemäß einer selektiv spaltbaren Bindung abgetrennt wird, so daß die Menge an Marker, die bei den Bedingungen, die eine selektive Spaltung ermöglichen, freigesetzt wird, ein Maß für die Anwesenheit und Menge der Sequenz von Interesse in einer Nukleinsäureprobe ist. Die selektierbare Spaltungsstelle kann die Folge der Bildung der Restriktionsenzyms-Erkennungsstelle durch Homoduplexierung sein, oder die Anwesenheit einer solchen selektierbaren Spaltungsstelle in der einsträngigen Polynukleotidkette kann das Ergebnis der früheren Einführung einer solchen Stelle in die einsträngige Kette sein.
Ein Reagens kann verwendet werden, welches eine Polynukleotidsequenz mit einer Oligonukleotidsequenz von Interesse umfaßt, die zu dem Nukleinsäureanalyten hybridisiert. Diese Reagens wird manchmal in der vorliegenden Anmeldung als "Einfangsonde" bezeichnet, welche bei dem erfindungsgemäßen Verfahren an den ausgewählten festen Träger gebunden wird. Eine Markersonde kann ebenfalls verwendet werden, welche die Sequenz von Interesse umfassen oder nicht umfassen kann.
Gemäß der ersten bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die Bildung eines Polynukleotidduplex in einem Hybridisierungsmedium, was eine Sonde, gebunden an den Träger, über eine selektierbare Spaltungsstelle ergibt. Verschiedene Vorschriften können verwendet werden, bei denen die DNA-Probe an den Träger gebunden ist oder in einer Lösung dispergiert ist.
Zur Unterscheidung der verschiedenen auftretenden Nukleotidsequenzen werden die folgenden Ausdrücke verwendet,
Nukleinsäureprobe - Probe, von der vermutet wird, daß sie eine Nukleinsäuresequenz mit einer Oligonukleotidsequenz von Interesse enthält,
Nukleinsäureanalyt - DNA oder RNA in der Nukleinsäureprobe mit einer Oligonukleotidsequenz von Interesse,
Oligonukleotidsequenz von Interesse - eine DNA- oder RNA-Sequenz, die die gesamte Nukleotidkette oder ein Teil davon sein kann, üblicherweise mit mindestens sechs Basen, noch üblicher mindestens 10 Basen, bevorzugt mindestens 16 Basen, die 5kb oder mehr sein können, üblicherweise nicht mehr als 0,2kb, die eine Eigenschaft, die nachgewiesen werden soll, diagnostiziert, wobei die Eigenschaft ein Gen oder eine Sequenz sein kann, das bzw. die eine Erbkrankheit, ein Pathogen usw. diagnostiziert;
Polynukleotidsequenz - DNA- oder RNA-Sequenzen, die als Reagentien für den Nachweis der Oligonukleotidsequenz von Interesse verwendet werden, wobei die Polynukleotidsequenz markiert oder unmarkiert, gebunden oder nicht gebunden an einen Träger sein kann, und eine Sequenz, die komplementär ist zu der Oligonukleotidsequenz von Interesse, aufweisen kann oder nicht. Es werden eine oder zwei Polynukleotidsequenzen, die indiviuell oder zusammen mit Nukleinsäureanalyten als Brücke zwischen der Markierung und dem Träger wirken, vorhanden sein, mit einer selektierbaren Spaltungsstelle zwischen dem Marker und dem Träger und
selektierbare Spaltungsstelle - eine Funktionalität oder Vielzahl von Funktionalitäten, die selektiv gespalten werden können und sie können Restriktionsstellen, Phosphatester, Purine, Peptidbindungen, usw. umfassen.
Zur Erleichterung der Beschreibung wird die bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform, bei der eine selektierbare Spaltungsstelle erzeugt wird, in vier primäre Sub-Ausführungsformen unterteilt. Bei der ersten von diesen (vgl. Fig. 2A) ist das verwendete Reagens eine einzige Komponente, welche ein Polynukleotid ist, das benachbart zu einem Ende an einen Träger gebunden ist und benachbart zu dem entgegengesetzten Ende an ein oder mehrere nachweisbare Marker gebunden ist.
Bei dem zweiten Fall (vergl. Fig. 2B) wird das verwendete Reagens zwei Komponenten aufweisen, die in Abhängigkeit davon, ob die Nukleinsäureprobe an den Träger gebunden ist oder nicht, und der Natur der selektierbaren Spaltungsstelle variieren. Wenn die Nukleinsäureprobe an den Träger gebunden ist, werden die beiden Komponenten (1) eine Überbrückungs-Polynukleotidsequenz und (2) eine Polynukleotidsequenz, komplementär und hybridisiert zu einem Teil der Überbrückungs-Polynukleotidsequenz, sein. Entweder die Überbrückungs- oder die komplementäre Polynukleotidsequenz kann markiert sein.
Außer dem Auftreten einer Sequenz in Duplexform mit der Komplementärsequenz wird die Überbrückungs-Polynukleotidsequenz einen Bereich aufweisen, der in Duplexierung mit der Oligonukleotidsequenz von Interesse steht.
Wenn die Nukleinsäureprobe in Lösung vorliegt, werden die beiden Komponenten (1) eine erste Polynukleotidsequenz, die an den Träger gebunden ist, sein, welche einen Bereich aufweist, der zu der Sequenz, welche in dem Nukleinsäureanalyten vorhanden ist, komplementär ist, wobei die Sequenz eine Restriktionsstelle definieren kann oder nicht, und die Oligonukleotidsequenz von Interesse definieren kann oder nicht, und (2) eine markierte zweite Polynukleotidsequenz, die einen Bereich aufweist, der zu der Sequenz, die in dem Nukleinsäureanalyten vorhanden ist, komplementär ist, wobei der Bereich den gleichen Beschränkungen unterliegt, wie der Bereich der ersten Polynukleotidsequenz. Mindestens einer der duplexierten Bereiche wird eine Sequenz von Interesse definieren. Es wird eine selektierbare Spaltungsstelle in der ersten oder zweiten Polynukleotidsequenz vorhanden sein.
In dem dritten Fall (vgl. Fig. 2C) ist der Analyt an einen Träger gebunden, und das verwendete Reagens ist eine einzige Komponente, die eine markierte Polynukleotidsequenz mit einem Bereich komplementär zu der Oligonukleotidsequenz von Interesse, die eine Restriktionsstelle definieren kann, ist. Die an der markierten Polynukleotidsequenz vorhandene Funktionalität kann als selektierbare Spaltungsstelle dienen.
In einem vierten Fall (vgl. Fig. 2D) wird eine Einfangsonde vorgesehen, welche eine Polynukleotidkette, gebunden an einen festen Träger über eine Bindung "Y" ist, und wobei ihr gegenüberliegendes Ende komplementär zu einer ersten Sequenz ist, die in dem Nukleinsäureanalyten vorhanden ist. Eine Markierungssonde, die eine markierte zweite Polynukleotidkette besitzt, besitzt einen Bereich, der komplementär zu der zweiten Sequenz in dem Analyten ist, wobei diese sich von der ersten Sequenz unterscheidet und mit dieser nicht überlappt. Die Bindung, die als "Y" in der Fig. 2D bezeichnet wird, bedeutet irgendeine übliche Möglichkeit der Bindung einer Sonde an den Träger. Die Bindung "X" ist eine selektierbare Spaltungsstelle, umfassend eine Bindung, welche durch OH&supmin;, Hydroxylamin, SH&supmin; oder Periodat spaltbar ist, d.h. eine chemisch spaltbare Bindung, wie eine Disulfidbindung, Periodat-spaltbare 1,2-Diole oder ähnliche.
Die Nukleinsäure enthaltende Probe wird mit dem geeigneten Reagens unter solchen Bedingungen vereinigt, unter denen eine Duplexbildung zwischen komplementären Sequenzen stattfindet. Das Gemisch kann unter Bedingungen der vorbestimmten Stringenz hybridisieren, wodurch mindestens eine Heteroduplexbildung oder Homoduplexbildung über der Oligonukleotidsequenz von Interesse stattfinden kann. Nachdem die für die Hybridisierung ausreichende Zeit vergangen ist, kann der Träger von dem Überstand abgetrennt werden und mindestens im wesentlichen von dem nicht-spezifisch gebundenen Marker freigewaschen werden. Die an den Träger gebundenen Oligonukleotide werden dann mit einem oder mehreren der genannten chemischen Reagentien behandelt, wodurch eine Spaltung von mindestens einem Strang und die Freigabe des Markers, der an den Träger gebunden ist, resultiert.
Abhängig von der Anwesenheit einer bestimmten Sequenz der Probe, durch die die Duplexbildung resultiert, wird die Freigabe der Markierung(en), gebunden an den Träger, beobachtet. Verschiedene Vorschriften können verwendet werden, wobei normalerweise das Überstandsmedium auf die Anwesenheit des Markers analysiert werden kann, obgleich in einigen Fällen der Träger gemessen werden kann. Die Vorschriften und Reagentien können verwendet werden, wo eine physikalische Trennung des Trägers von dem Überstand erforderlich sein kann oder nicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann für den Nachweis von Oligonukleotidsequenzen, entweder DNA oder RNA, bei einer Vielzahl von Situationen verwendet werden. Ein wichtiges Interessengebiet ist der Nachweis von pathogenen Viren, Bakterien, Fungi, Protozoa oder ähnlichen, die einen besonderen Wirt infizieren können. Vergleiche beispielsweise U.S. Patent Nr. 4 358 535. Ein anderes Gebiet von Interesse ist der Nachweis von Allelen, Mutationen oder Läsionen, die in dem Genom eines Wirts vorhanden sind, wie solche, die bei der Amniozentese, bei genetischer Beratung, Wirtsempfindlichkeits- oder -suszeptibilitätsbestimmungen und bei der Überwachung von Zellpopulationen eine Rolle spielen. Ein drittes Gebiet von Interesse ist die Bestimmung der Anwesenheit von RNA für solche diversen Gründe, wie die Überwachung der Transkription, der Nachweis von RNA-Viren, die Differenzierung von Organismen durch nicht exprimierte RNA und ähnliche. Andere Gebiete von Interesse, die als Erläuterung dienen sollen, umfassen die Überprüfung modifizierter Organismen für die Anwesenheit von extrachromosomaler DNA oder integrierter DNA, die Vervielfältigung von DNA-Sequenzen und die Aufrechterhaltung solcher Sequenzen.
Die physiologischen Proben können aus einer großen Vielzahl von Quellen erhalten werden, wie es aus den unterschiedlichen Zwecken, für die das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, offensichtlich ist. Quellen können umfassen: verschiedene physiologische fluide Materialien, wie exkretierte Materialien, beispielsweise Stuhl, Sputum, Urin, Saliva, usw., Plasma, Blut, Serum, Okularlinsenflüssigkeit, Spinalflüssigkeit, Lymphe und ähnliche. Die Probe kann ohne weitere Modifizierung verwendet werden oder sie kann durch Expandieren der Probe, Clonieren oder ähnlichem, verwendet werden, wobei ein Isolat erhalten wird, so daß eine Gesamtverstärkung von DNA oder RNA und eine Verringerung der externen RNA oder DNA erhalten wird. Die Viren können auf einen Teppich aus verträglichen Zellen plattiert werden, um die Menge an viraler DNA zu verstärken. Klinische Isolate können von Proben erhalten werden, die auf einem Nährmedium aufgestrichen oder als Flecken aufgetragen werden, und individuelle Kolonien können analysiert werden, oder die gesamte Probe kann in eine flüssige Brühe bzw. eine Flüssigkeit eingeführt werden und die Zellen können selektiv oder nicht selektiv expandieren. Die besondere Weise, gemäß der die Probe behandelt wird, wird von der Natur der Probe, der Natur der DNA- oder RNA-Quelle, der Menge an Oligonukleotidsequenz von Interesse, von der man annimmt, daß sie vorhanden ist, verglichen mit der Gesamtmenge der vorhandenen Nukleinsäure, wie auch von der Empfindlichkeit der verwendeten Vorschrift und dem/des Markers, abhängen.
Die Nukleinsäureprobe oder das Polynukleotidreagens können entweder kovalent oder nicht kovalent, aber in jedem Fall nicht diffundierbar an den Träger gebunden werden. Im Falle der in der Fig. 2D dargestellten Ausführungsform wird die Einfangsonde alleine an den festen Träger gebunden. Wenn eine Nukleinsäureprobe an den Träger gebunden ist, haben verschiedene Träger besondere Verwendung gefunden und in diesem Ausmaß werden solche Träger bevorzugt sein. Diese Träger umfassen Nitrocellulosefilter, diazotiertes Papier, Ecteola-Papier oder einen anderen Träger, der solche gewünschten Eigenschaften, wie ein niedriges oder ein nicht-spezifisches Binden, Retention der Nukleinsäureprobe, leichte Manipulation, ermöglicht und verschiedene Behandlungen, wie das Wachstum von Organismen, das Waschen, das Erhitzen, den Transfer und den Markernachweis, je nach Bedarf, erlaubt.
Wenn eine Komponente des Polynukleotidreagens an den Träger gebunden ist, kann die Art des Trägers stark mit der Art des Trägers variieren, der bei der Oligonukleotidprobe eine Rolle spielt. Der Träger kann Teilchen, Papier, Kunststoffblätter- bzw. -folien, Haltewände eines Behälters, Unterteiler, Millipore-Filter, usw. umfassen, wobei die Materialien organische Polymere, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, wie Polysaccharide, Polystyrol, Polyacrylsäure und Derivate davon, beispielsweise Polyacrylamid, Glas, keramische Materialien, Metall, Kohlenstoff, Polyvinylchlorid, Protein und ähnliche, umfassen können. Die verschiedenen Materialien können funktionalisiert oder nicht funktionalisiert sein, abhängig davon, ob eine kovalente oder nicht kovalente Bindung gewünscht wird.
Wenn die Nukleinsäureprobe an den Träger gebunden ist, kann, abhängig von dem besonderen Träger, ein Erhitzen für die ausreichende Bindung der Nukleinsäure ausreichen. In anderen Fällen können Diazogruppen zum Binden der Nukleinsäure verwendet werden. Wenn jedoch die Polynukleotidreagens-Komponente an den Träger gebunden ist, können eine Vielzahl unterschiedlicher Verfahren verwendet werden, um sicherzustellen, daß das Polynukleotidreagens an den Träger gebunden bleibt. Beispielsweise können die Träger funktionalisiert werden, so daß sie aktive Aminogruppen für die Bindung aufweisen, die von der Bindung von Alkylaminen, Hydraziden oder Thiosemicarbaziden an den Träger resultieren. Man kann dann mittels terminaler Transferase ein Ribonukleotid an das DNA-Polynukleotidreagens addieren. Bei der Glykolspaltung mit einem geeigneten Oxidationsmittel, beispielsweise einem Periodat, Osmiumtetroxid plus Wasserstoffperoxid, Bleitetraacetat oder ähnlichen, wird ein Dialdehyd gebildet, der sich dann an die Aminogruppe an der Oberfläche bindet, wodurch eine monosubstiutierte oder disubstituierte Aminogruppe gebildet wird. Alternativ kann man eine Maleimidgruppe vorsehen, die mit Thiophosphat einen Alkylthioester bildet. Verschiedene Verfahren, die von Parikh et al., supra, und von Inman, supra, für Agarose und Polyacrylamid beschrieben wurden, können verwendet werden, wobei diese Verfahren Anwendung bei anderen Materialien finden.
Die Gesamtzahl der Polynukleotidreagens-Komponenten an dem Träger, die in dem Assaymedium verfügbar sind, wird variieren, wobei der größte Teil empirisch bestimmt wird. Wünschenswerterweise sollte eine relativ hohe Konzentration pro Einheitsoberfläche des Polynukleotids für verfügbare funktionelle Gruppen an dem Träger verwendet werden, solange die Polynukleotiddichte die Hybridisierung nicht stört.
Die Größe des Polynukleotids wird stark variieren und beträgt üblicherweise nicht weniger als 15 Basen und kann 50 Basen oder mehr betragen, wobei sie üblicherweise nicht etwa 500 Basen, noch üblicher, nicht 250 Basen, übersteigt. Es wird üblicherweise ein Bereich in der Polynukleotidreagens- Komponente vorliegen, der mit einer Sequenz in der Nukleinsäureprobe homolog ist, üblicherweise mit der Sequenz von Interesse, von mindestens 6 Basen, üblicherweise mindestens 12 Basen. Der Bereich für die Hybridisierung kann 16 Basen oder mehr betragen, wobei er üblicherweise nicht etwa 1kbp überschreitet, wobei eine perfekte Homologie nicht erforderlich ist. Es reicht aus, daß eine Homologie von mindestens etwa 50%, bevorzugter eine Homologie von mindestens 80% besteht. (Der Prozentgehalt Homologie bedeutet, daß die komplementären Insertionen größer als fünf Basen sind, wobei die nicht komplementären Insertionen, die ausgeloopt werden können, ignoriert werden.)
Insbesondere wird es, wenn man an einer Gruppe von allelischen Genen, einer Anzahl unterschiedlicher Stämme oder an verwandten Spezies interessiert ist, wo die Messenger-RNA oder genomische Teile hoch konserviert sind, aber nichtsdestotrotz Gegenstand des Polymorphismus sind, häufig wünschenswert sein, eine Sonde herzustellen, welche die Unterschiede reflektiert und die Homologie für alle Sequenzen von Interesse gegenüber irgendeiner besonderen Sequenz optimiert.
Der Marker der markierten Polynukleotidreagens-Komponente kann an der Polynukleotidsequenz über eine selektiv spaltbare Stelle oder über eine Bindung, die während des Assays beibehalten wird, gebunden sein. Eine Vielzahl von Markern können verwendet werden, wobei der Marker ein nachweisbares Signal oder ein Mittel für den Erhalt eines nachweisbaren Signals ermöglicht.
Marker umfassen daher diverse Substituenten, wie Liganden, Radioisotope, Enzyme, Fluoreszenzmittel, Chemiluminiszenzmittel, Emzymsuizidinhibitoren, Enzymcofaktoren, Enzymsubstrate oder andere Substituenten, die entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal ergeben.
Wenn Liganden involviert sind, wird normalerweise ein Rezeptor verwendet, der spezifisch an den Liganden bindet, beispielsweise Biotin und Avidin, 2,4-Dinitrobenzol- und Anti-(2,4-dinitrobenzol)-IGG, usw., wobei der Rezeptor mit geeigneten Markern, wie oben beschrieben, substituiert ist. Auf diese Weise kann man die Zahl der Marker, die für ein nachweisbares Signal pro Polynukleotidsequenz vorgesehen sind, verstärken.
In den meisten Fällen können die Marker, die in Immunoassays verwendet werden, in den erfindungsgemäßen Assays verwendet werden. Diese Marker werden beispielsweise in den US-Patenschriften Nr. 3 850 752 (Enzym), 3 853 914 (Spinnmarker), 4 160 016 (Fluoreszenzmittel), 4 174 384 (Fluoreszenzmittel und Abschreckmittel), 4 160 645 (Katalysator), 4 277 437 (Chemilumineszenzmittel), 4 318 707 (Abschreckteilchen) und 4 318 890 (Enzymsubstrat) beschrieben.
Beispiele für Fluoreszenz- und Chemilumineszenzmarker umfassen Fluorescein, Rhodamin, Dansyl, Umbelliferon, Biliproteine, Luminol, usw.
Beispiele für Enzyme von Interesse umfassen Meerrettichperoxidase, Glucose-6-phosphat, Dehydrogenase, Acetylcholinesterase, β-Galactosidase, α- Amylase, Uricase, Malatdehydrogenase, usw. Das heißt, die Enzyme von Interesse werden hauptsächlich Hydrolasen und Oxidoreduktasen sein.
Die Art, in der der Marker an die Polynukleotidsequenz gebunden wird, wird stark variieren, abhängig von der Natur des Markers. Wie bereits angegeben, kann ein Ribonukleotid an die Oligonukleotidsequenz addiert werden, gespalten werden, und der entstehende Dialdehyd kann an eine Amino- oder Hydrazingruppe konjugiert werden. Die Dauerhaftigkeit der Bindung kann weiter verstärkt werden, wenn reduzierende Bedingungen, die in der Bildung eines Alkylamins resultieren, verwendet werden. Alternativ kann der Marker mit einem aktiven Halogen, wie alpha-Brom- oder -Chloracetyl substituiert sein. Dieses kann an eine Thiophosphatgruppe oder an Thiopurin unter Bildung eines Thioethers gebunden sein. Alternativ kann der Marker Maleimid-Funktionalität aufweisen, wobei eine an dem Polynukleotid vorhandene Mercaptogruppe einen Thioether bilden wird. Das terminale Phosphat des Polynukleotids kann mit Carbodiimid aktiviert werden, wobei das entstehende Phosphorimidazolid mit Aminogruppen oder Alkohol reagieren wird, was in Phosphoramidaten oder Phosphatestern resultiert. Polypeptidbindungen können mit aminomodifizierten Purinen gebildet werden. Man hat somit eine große Auswahimöglichkeit in der Wahl der Marker, der Art der Bindung und der Wahl der Bindungsgruppe.
Durch Vermischen des Polynukleotidreagens mit der Probe wird irgendein Nukleinsäureanalyt, der vorhanden ist, an den Träger gebunden. Die Menge an Marker, die von dem Träger bei der Spaltung der selektierbaren Spaltungsstelle freigesetzt wird, wird zu der Anwesenheit des Analyts in Beziehung stehen, wobei die Menge des Analyts auch quantitativ bestimmt werden kann.
Die Modifizierung der räumlichen Beziehung zwischen dem Marker und dem Träger kann auf einer Reihe von Wegen erreicht werden.
Die Art der selektiven Spaltungsstelle wird von der Bindungsgruppe abhängig sein.
Die Stelle wird eine oder mehrere Bindungen umfassen, welche die Trennung des Markers von dem Träger erlaubt bzw. erlauben.
Phosphodiesterase kann verwendet werden, wo Random-Hydrolyse den Marker von dem Träger abtrennt. Das Polynukleotid kann am Ende mit modifizierten Nukleotiden, welche markiert sind oder anschließend markiert werden, versehen sein.
Eine große Vielzahl von Bindungsgruppen können verwendet werden, wobei die Nukleotide für die Bindung des Markers modifiziert oder nicht modifiziert sein können. In der W083/02277 wird die Verwendung von 8-Aminoalkyladenosin beschrieben, wobei ein Marker an die Aminogruppe gebunden sein kann. Das DNA-Polynukleotidreagens kann dann am Ende mit den Ribonukleotiden gebunden sein, so daß eine Vielzahl von Markern am Terminus von jedem markierten Polynukleotid vorhanden ist. Die schwänzigen Ribonukleotide können selektiv unter Verwendung von Rnase gespalten werden. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn Marker verwendet werden, die wechseiwirken und das Signal modifizieren. Beispielsweise besitzen Fluoreszenzmittel in enger Nachbarschaft die Neigung, sich selbst abzuschrecken. Das beobachtete Fluoreszenzsignal kann stark verstärkt werden, wenn die Phosphatbindungen hydrolysiert werden, so daß die einzelnen Fluoreszenzmoleküle randomartig vorhanden sind. Selbstverständlich müssen Fluoreszenzmittel nicht die einzigen Marker sein, die dieses Phänomen zeigen, und andere der Marker können ähnliche Wirkungen zeigen. Wenn Enyzmsubstrate oder Cofaktoren verwendet werden, wird ihre Anwesenheit auf einem Polymeren, gebunden an einen Träger, eine wesentliche stensche Störung bei der Enzymannäherung bzw. dem -approach ergeben. Somit wird die Depolymerisation des Markers und die Freisetzung von dem Träger wesentlich die Enzymrate verstärken.
Ein weiteres Verfahren besteht darin, ein Ribonukleotid zu dem DNA- Polynukleotidreagens zuzugeben und dann die Ribosylgruppierung unter Bildung eines Dialdehyds zu spalten. (Vergleiche beispielsweise Lee et al., Biochemistry (1970) 9:113-118.) Der Dialdehyd kann an eine Aminogruppe gebunden werden, die an einen Marker über eine selektiv spaltbare Stelle gebunden ist. Beispielsweise kann eine Disulfidbindung zwischen der Schiff'schen Base und dem Marker vorhanden sein, welche durch Reduktion mit Ellmans Reagens oder einem ähnlichen unter Freisetzung des Markers gespalten werden kann.
Ein anderes Bindungsverfahren umfaßt die Aktivierung eines endständigen Phosphats mit Carbodiimid unter Bildung von Phosphorimidazolid. (Chu et al., Nucleic Acids Res. (1983) 11:6513-6628.) Das Phosphorimidazolid kann mit Ammen unter Bildung von Phosphoramidaten umgesetzt werden. Wie zuvor, umfaßt die Amino-Bindungsgruppe eine selektierbare Spaltungsstelle, wie benötigt.
Ein anderes Verfahren zur Anbringung des Markers umfaßt die chemische Synthese von Polynukleotiden mit einem modifizierbaren Nukleosidderivat, wie einem Cytosin oder Uracil, welches einen 12-Atom-Amin-Bindungs(bzw. Linker-)arm enthält, gefolgt von der Einarbeitung einer Reportergruppe, wie Fluorescein oder Dinitrobenzol (Ruth, DNA (1984) 3:123).
Ligandensubstituierte Nukleotide können verwendet werden, wo der Ligand nicht ein nachweisbares Signal direkt gibt, aber an den Rezeptor bindet, an den ein oder mehrere Marker konjugiert sind. Erläuternde Beispiele umfassen die biotinylierten Nukleotide, die an Avidin binden, Haptene, welche an Immunoglobuline binden, und verschiedene natürlich vorkommende Verbindungen, welche an proteinhaltige Rezeptoren binden, wie Zucker mit Lectinen, Hormone und Wachstumsfaktoren mit Zelloberflächen-Membranproteinen und ähnliche.
Bei der in Fig. 2D dargestellten Ausführungsform kann die selektierbare Spaltungsstelle gemäß einem von zwei Wegen eingeführt werden.
Zuerst kann eine Vernetzungsverbindung in die Einfangsonde 1 selbst, d.h. in der Stellung "X", wie in der Figur angegeben, eingearbeitet werden. Irgendeine Anzahl von Vernetzungsmitteln kann zu diesem Zweck verwendet werden, die einzige Beschränkung ist die, daß die Spaltungsstelle, die in die Einfangsonde eingeführt wird, mit Reagentien spaltbar sein muß, die mit den verschiedenen Sondenmarkern usw., die bei dem Rest des Verfahren verwendet werden, verträglich ist. Beispiele von geeigneten Vernetzungsmitteln umfassen die folgenden:
N-Hydroxysuccinimid (NHS), welches eine Amidbindung in die Sonde einführt, Ethylenglykolbis(succinimidylsuccinat) (EGS), welches eine Hydroxylamin-empfindliche Bindung erzeugt, Bis-[2-(succinimidooxycarbonyloxy)ethyljsulfon (BSOCOES), welches eine Basen-empfindliche Sulfonbindung ergibt, Disuccinimidyltartrat (DST), welches 1,2-Diole einführt, die durch Periodat spaltbar sind und Dithio-bis(succinimidylpropionat) (DSP), welches die Thiol-spaltbare Disulfidbindungen ergibt. Das Vernetzungsmittel wird bevorzugt in die Einfangsonde durch (1) Herstellung einer Alkylaminsonde, wie von Urdea et al. in Nucleic Acids Research 16 (11):4937-4956 (1988), beschrieben, (2) Umsetzung der freien Aminfunktionalitäten an der Sonde mit dem ausgewählten Vernetzungsmittel unter Bildung von einem an die Sonde gebundenen Vernetzungsmittel, (3) Reinigung des an die Sonde gebundenen Vernetzungsmittels unter Verwendung chromatographischer oder anderer Verfahren und (4) Umsetzung des an die Sonde gebundenen Vernetzungsmittels mit einem festen Träger mit freien reaktiven Gruppierungen, z.B. freien Aminogruppen, hergestellt, wobei eine an den Träger gebundene Sonde mit der gewünschten Spaltungsstelle erhalten wird.
Die Spaltungsstelle kann daher beispielsweise die folgenden Arten von Bindungen umfassen: Hydroxylamin-empfindlich Basen-empfindlich Thiol-empfindlich und Periodat-empfindlich
Die selektierbare Spaltungsstelle "X" in der Fig. 2D kann ebenfalls durch geeignete Modifizierung der Einfangsonde vor der Anbringung an den festen Träger eingeführt werden. Dieses Verfahren umfaßt die Herstellung eines Polynukleotids der Struktur
worin X die selektierbare Spaltungsstelle, wie oben beschrieben, ist oder sie enthält. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform besitzt das Polynukleotid die Struktur
Diese Verbindung kann dann an einen festen Träger unter Verwendung üblicher Maßnahmen, die auf diesem Gebiet der Technik gut bekannt sind, gebunden werden, wobei die in Fig. 2D dargestellte Einfangsonde erhalten wird. Diese letztere Verbindung wird unter Verwendung eines Reagenses hergestellt, welches sich von Weinsäure ableitet, wobei das 1,2-Diolsystem als Dibenzoylverbindung während der DNA-Synthese geschützt ist und weiter eine Dimethoxytrityl-(DMT)-geschützte Hydroxylgruppe und eine sich von Phosphoramidit-ableitende Hydroxylgruppe enthält (worin "iPr" Isopropyl bedeutet):
wodurch die Einarbeitung in ein DNA-Fragment unter Verwendung von Standard- Phosphoramidit-Chemievorschriften möglich wird. Nach der Synthese und der vollständigen Schutzgruppenabspaltung enthält das DNA/DNA-Hybridmolekül, wie oben angegeben, ein 1,2-Diol, d.h. eine Bindung, die spezifisch mit NaIO&sub4; gespalten werden kann. Wie es dem Fachmann leicht geläufig ist, kann die DMT- Schutzgruppe mittels irgendeiner geeigneten Gruppierung R¹, die säureempfindlich und basenstabil ist, beispielsweise unsubstituierte oder substituierte Aryl- oder Arylkylgruppen, worin Alkyl z.B. Phenyl, Naphthyl, Furanyl, Biphenyl oder dergleichen bedeutet, und worin die Substituenten 0 bis 3, üblicherweise 0 bis 2 sind und irgendwelche nicht störenden stabilen Gruppen, neutral oder polar, Elektronen-liefernd oder -abziehend, umfassen, ersetzt werden. Ähnlich kann die Phosphoramiditgruppierung durch andere Spezies R² einschließlich Phosphorderivaten (beispielsweise ein Phosphotriester, ein Phosphodiester, ein Phosphit, ein H-Phosphonat, ein Phosphorothioat, usw.), die für die Polynukleotidsynthese geeignet sind, oder durch Wasserstoff ersetzt werden. Vergleiche beispielsweise EP-Publikation Nr. 0225807 (Urdea et al., "Solution Phase Nucleic Acid Sandwich Assay and Polynudeotide Probes Useful Therein").
Wie bei der in den Fig. 2A-2C dargestellten Ausführungsform, erlaubt die Ausführungsform der Fig. 2D den Nachweis spezifisch gebundener Marker in Lösung (und so die genaue Messung des Analyten 2), während nicht-spezifisch gebundener Marker 6 an den festen Träger 5 gebunden verbleibt.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform, die in den Fig. 3A und 3B erläutert ist, wird ein Komplex zwischen der Einfangsonde 1 (gebunden an den festen Träger 5 über die Bindung Y), dem Nukleinsäureanalyt 2 und der Markierungssonde 3, wie bei der Ausführungsform von Figur 2D, gebildet. Das Verfahren, das verwendet wird, um den Hybridisierungskomplex zu erhalten, wird voll in der EP-Publikation Nr. 0225807, die oben erwähnt wurde, beschrieben. Zur Freisetzung des spezifisch gebundenen Markers in die Lösung wird ein "Ersatz"-Polynukleotidstrang 4 eingeführt, der so ausgewählt wird, daß ein stabileres Hybrid mit der Einfangsonde 1 gebildet wird, als es der Analyt mit der Einfangsonde bildet. Obgleich der G/C-Gehalt ebenfalls ein Faktor ist, wird dieses Verfahren typischerweise erfordern, daß die Länge "B" des Ersatzstrangs etwas länger ist als die Länge "A" des Duplex, der zwischen der Einfangsonde und dem Analyt gebildet wurde.
Eine große Vielzahl von Trägern und Verfahren für die nicht-diffundierbare Bindung von Oligonukleotidketten werden in der Literatur beschrieben. Für eine Zusammenfassung vergleiche Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem. (1984), 138:267-284. Träger umfassen Nitrocellulosefilter, bei denen Temperaturen von 80ºC während 2 Stunden ausreichen, diazotierte Papiere, bei denen die Bindung ohne weitere Aktivierung erfolgt, Ecteola-Papier, usw. Agarose- Kügelchen können mit Cyanbromid für die direkte Reaktion mit DNA aktiviert werden (Bauman et al., J. Histochem. Cytochem. (1981) 29:227-237) oder sie können mit Cyanbromid und einem Diamin, gefolgt von der Reaktion mit α-Halogenacetyl, beispielsweise Bromacetyl, oder mit einem aktiven Carbonsäure-substituierten Olefin, beispielsweise Maleinsäureanhydrid, unter Bildung von Perlen umgesetzt werden, die mit einer Thiolfunktionalität, die an der Polynukleotidkette vorhanden ist, umgesetzt werden können. Beispielsweise kann DNA unter Bildung von einem α-Thiophosphat für die Kupplung modifiziert werden (Pfeuffer und Hilmreich, J. Biol. Chem. (1975) 250:867-876). Es ist ebenfalls möglich, mittels chemischer Maßnahmen ein Oligonukleotid, das an einen Teflonträger gebunden ist, zu synthetisieren, und dann das Material vollständig von der Schutzgruppe zu befreien, ohne es zu entfernen (Lohrmann et al., DNA (1984) 3:122).
Im Hinblick auf die große Vielzahl der Marker und Reagentien werden die gemeinsamen Merkmale des Verfahrens beschrieben, gefolgt von einigen beispielhaften Vorschriften. Gemeinsam ist den Verfahren die Hybridisierung. Die Hybridisierung kann bei unterschiedlichen Graden von Stringenz durchgeführt werden, so daß eine größere oder geringere Homologie für die Duplexbildung erforderlich ist. Für die meisten Fälle werden wäßrige Medien verwendet, die ein Gemisch aus verschiedenen anderen Komponenten enthalten können. Insbesondere können organische polare Lösungsmittel zur Verstärkung der Stringenz verwendet werden. Beispiele für Lösungsmittel umfassen Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, d.h. organische Lösungsmittel, die in den verwendeten Mengen mit Wasser mischbar sind. Die Stringenz kann ebenfalls verstärkt werden, indem die Salzkonzentration erhöht wird, so daß man eine verstärkte lonenstärke erhält. Ebenfalls kann eine Erhöhung der Temperatur für die Stringenz verwendet werden. In jedem Fall ergibt die Umkehrrichtung eine verringerte Stringenz. Andere Additive können ebenfalls zur Modifizierung der Stringenz verwendet werden, wie Detergentien.
Die Zeit für die Hybridisierung wird mit der Konzentration der Sequenz von Interesse, der Stringenz, der Länge der Komplementärsequenzen und ähnlichem variieren. Üblicherweise wird die Hybridisierung mindestens etwa 15 Minuten und im allgemeinen nicht mehr als etwa 72 Stunden, noch üblicher nicht mehr als etwa 24 Stunden erfordern. Weiterhin kann die Hybridisierung bei einer Stringenz vorgesehen werden und dann kann bei höherer Stringenz gewaschen werden, so daß Heteroduplexe, denen eine ausreichende Homologie fehlt, entfernt werden.
Die Nukleinsäureprobe wird gemäß einer Vielzahl von Wegen behandelt, wobei man das intakte Genom verwenden kann, mechanische Scherkräfte einwirken lassen kann, oder durch Restriktionsenzym-digerierte Fragmente des Genoms, variierend von etwa 0,5kb bis 30kb, oder Fragmente, die entsprechend der Größe, beispielsweise durch Elektrophoresese, aufgetrennt worden sind. In einigen Fällen werden die Sequenzen von Interesse geclonte Sequenzen sein, die in einem geeigneten Vektor, beispielsweise einem einsträngigen DNA- oder RNA- Virus, beispielsweise M13, geclont wurden.
Enthalten in dem Assaymedium können andere Additive, einschließlich Puffern, Detergentien, beispielsweise SDS, Ficoll, Polyvinylpyrrolidon und Fremd-DNA zur Minimierung der nicht-spezifischen Bindung sein. Alle diese Additive werden in der Literatur erläutert und müssen hier nicht in Einzelheiten beschrieben werden.
Gemäß einer besonderen Vorschrift werden die Nukleinsäureprobe und das bzw. die Polynukleotidreagens bzw. -reagentien in dem Hybridisierungsmedium bei vorbestimmter Stringenz zusammengebracht. Nach einer ausreichenden Zeit für die Hybridisierung wird der Träger mindestens einmal mit einem Medium mit größerer oder geringerer Stringenz als das Hybridisierungsmedium gewaschen. Der Träger mit dem gebundenen Polynukleotid und dem Analyt wird dann mit den erforderlichen Reaktionsteilnehmern (einschließlich einer physikalischen Behandlung, beispielsweise Licht), zum Spalten der selektierbaren Spaltungsstelle kontaktiert, wobei eine einsträngige oder doppelsträngige Spaltung erhalten wird. Nach der Spaltung können der Träger und der Überstand getrennt oder nicht getrennt werden, abhängig von dem Marker und der Art der Messung und der Menge des Markers, die von dem Träger freigesetzt wurde und bestimmt wurde.
Zur weiteren Erläuterung der Erfindung werden einige beispielhafte Vorschriften näher erläutert. Gemäß einer ersten beispielhaften Vorschrift wird eine Mikrotiterplatte verwendet, wobei Fluoreszenzmittel-markierte Polynukleotide an dem Boden von jeder Vertiefung gebunden werden. DNA von einem Pathogen, welches geclont wurde, wird mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen einer Restriktion unterworfen, wobei Fragmente von etwa 0,5 bis 2kb erhalten werden. Die Fragmente werden bei milden basischen Bedingungen für die Denaturierung isoliert und in dem Hybridisierungsmedium dispergiert, welches dann aufeinanderfolgend in die verschiedenen Vertiefungen gegeben wird, wobei jede der Vertiefungen unterschiedliche Sequenzen aufweist, welche spezifisch homolog mit Sequenzen unterschiedlicher Stämme einer besonderen pathogenen Spezies sind.
Die Vertiefungen werden bei erhöhter Temperatur, beispielsweise 60ºC, während ausreichender Zeit gehalten, so daß die Hybridisierung stattfinden kann. Daraufhin wird der Überstand entfernt und die Vertiefungen werden gut wiederholt mit gepuffertem Medium mit niedrigerer Stringenz als das Hybridisierungsmedium gewaschen. Die Digerierung ergibt die Freisetzung eines Fluoreszenzmarkers in den Überstand. Der Überstand wird von jedem der Vertiefungen aspiriert und bestrahlt. Die Menge an Fluoreszenz wird dann als Anzeichen für die Anwesenheit der Sequenz von Interesse bestimmt. Auf diese Weise kann man schnell ein Screening durchführen, welcher der Stämme vorhanden ist, indem die Anwesenheit von Fluoreszenz in der flüssigen Phase beobachtet wird.
Gemäß einer zweiten beispielhaften Vorschrift kann man eine Säule verwenden, die Glasperlen enthält, an die nicht-markiertes Polynukleotid gebunden ist. Zu der Säule wird dann die Nukleinsäureprobe gegeben, welche DNA- Fragmente enthält, die von Säugetierzellen erhalten wurden. Die Fragmente liegen im Bereich von etwa 0,5 bis 10kb. Die DNA-Probe wird dann in einem geeigneten Hybridisierungsmedium dispergiert und zu der Säule gegeben und in der Säule während einer ausreichenden Zeit, damit die Hybridisierung stattfindet, gehalten. Nach der Hybridisierung der Probe wird das Hybridisierungsmedium aus der Säule freigesetzt und das Polynukleotidreagens, mit Meerrettichperoxidase (HRP) über eine Disulfidbindung markiert, wird zu einem zweiten Hybridisierungsmedium bei stärker stringenten Bedingungen als in dem ersteren Medium zugegeben und das zweite Medium wird in der Säule während einer Zeit freigesetzt, die ausreicht, daß die Hybridisierung stattfindet. Das markierte Polynukleotid besitzt eine Sequenz, die zu der Sequenz von Interesse komplementär ist. Das Hybridisierungsmedium wird aus der Säule evakuiert.
Die Säule kann dann ein oder mehrere Male mit einem Medium mit höherer Stringenz zur Entfernung von irgendwelchen Polynukleotidsequenzen, die eine ungenügende Homologie mit dem markierten Polynukleotid besitzen, gewaschen werden. Ellman's Reagens wird dann zu der Säule gegeben, was eine Spaltung der Disulfidbindung und die Freisetzung von HRP ergibt. Das HRP enthaltende Medium wird aus der Säule evakuiert und gesammelt, wie auch ein nachfolgendes Waschmaterial, um sicherzustellen, daß das befreite Enzym nicht in der Säule zurückgehalten wird. Das entstehende Medium, welches den HRP-Marker enthält, kann nun auf den HRP-Marker analysiert werden. Anstelle von HRP kann eine Vielzahl anderer Enzyme verwendet werden, die Produkte ergeben, die spektrophotometrisch oder fluorometrisch nachgewiesen werden können.
Gemäß einer anderen Vorschrift sind die Polynukleotidreagens-Komponenten ein erstes Polynukleotid, welches eine Sequenz komplementär zu einem Bereich des Nukleinsäureanalyten aufweist und an die Wände der Vertiefung einer Mikrotiterplatte gebunden ist, und ein markiertes zweites Polynukleotid, welches eine Sequenz komplementär zu einem anderen Bereich des Nukleinsäureanalyten aufweist. Der Marker ist das Ergebnis der Schwanzbildung des Polynukleotids mit N&sup8;-Aminohexyldesoxyadenosintriphosphat-Umbelliferylcarboxamid. Die Nukleinsäureprobe wird in die Vertiefungen mit einem Überschuß an markiertem Polynukleotid bei Hybridisierungsbedingungen eingeführt. Nach ausreichender Zeit für die Hybridisierung wird die Hybridisierungslösung aus den Vertiefungen aspiriert, die Vertiefungen werden gewaschen und die verbleibende DNA in den Vertiefungen wird durch Zugabe einer Lösung von 90%iger Ameisensäure und Erhitzen auf 60ºC während 1 Stunde oder durch Zugabe von Piperidin und Erhitzen auf 90ºC während 30 Minuten depuriniert.
Alternativ kann der Marker das Ergebnis der Ligasierung des Polynukleotids sein, das mit einem Überschuß eines Oligomeren markiert ist, das durch Behandlung von Poly-dA mit Chloracetaldehyd gemäß Silver und Feisht, Biochemistrv (1982) 21:6066, unter Bildung des fluoreszierenden N&sup6;-Ethenoadenosins erhalten wurde. Die Freisetzung des Markers wird mit mikrococcaler Nuklease in einer Lösung von 100 ugm CaCl&sub2; während einer Stunde bei 37ºC erreicht.
In beiden Fällen verschwindet die Fluoreszenz des Polymeren im wesentlichen bedingt durch Selbstlöschung. Nach der Auflösung wird eine we sentliche Verstärkung der Fluoreszenz beobachtet. Somit würde ein nicht-spezifisch gebundenes markiertes Polynukleotid, das gegenüber der Depolymerisierung resistent ist, nicht das beobachtete Signal stören. Weiterhin könnte man die Rate der Erhöhung der Fluoreszenz als quantitatives Maß für den Nukleinsäureanalyt messen, da der Hintergrundsfluoreszenzniveau niedrig wäre. Anstelle einer Selbstlöschung können Systeme verwendet werden, in denen Fluoreszenzmittel und Abschreck- bzw. Löschmittel alternieren oder in Zweikomponenten-Reagenssystemen vorliegen, wobei nicht löschende Fluoreszenzmittel in einer Komponente und Löschungsmittel in der anderen Komponente vorhanden sind.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Versuchsteil

1. Anbringung von Ribonukleotiden an das 3'-Ende von DNA

a. Schwanzbildung mit terminaler Desoxynukleotidtransferase (TdT).

Das Folgende ist eine Modifizierung des Verfahrens beschrieben von R. Roychoudry, Method in Enzymology (1980) 65:43. Ein synthetisches Oligonukleotid der Zusammensetzung (5' bis 3') ATTCGACGCTTATGG (Fragment 1) wurde mit rATP am Ende umgesetzt. Zu einer Lösung von 5005 pmol des Fragments 1 (beruhend auf 20 OD&sub2;&sub6;&sub0; Einheiten pro mg) in 15 ul 0,83 mM ATP, werden 2,5 ul 10x TdT-Puffer (1,4 M Kaliumcacodylat, 0,6 M Tris pH 7,6, 10 MM CoCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol (DTT)), 2 ul TdT (Kälberthymus, P-L Biochemicals, Inc., 13,5 Einheiten) zugegeben. Die 24,5 ul Probe wurde 1 Stunde bei 37ºC aufgewahrt und dann zur Trockenheit eingedampft. Das Pellet wurde in 10 ul 90% Formamid, 0,05% Bromphenolblau, 1% Ficoll gelöst, auf 90ºC während 5 Minuten erhitzt und auf 20% denaturierendes Polyacrylamidgel, gelaufen bei 4oma, geladen. Eine Bande, die dem Fragment 1 entsprach, ausgedehnt um eine Riboadenosin- Einheit, wurde durch UV-Schattenbildung visualisiert, aus dem Gel herausgeschnitten und über Nacht in 0,1 M Tris pH 8,0, 5 mM EDTA, 0,5 m NaCl (Maxam und Gilbert, Methods in Enzvmology (1980) 65:499-560) eluiert. Die Entsalzung wurde mit C-18 SEP-PAK (Waters Associates) wie folgt erreicht: Die Patrone wurde zuerst mit 5 ml Methanol Reagensqualtität und dann mit 10 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die gefilterte Probe wurde dann mit einer Spritze auf SEP-PAK gegeben. Nach dem Waschen mit 20 ml Wasser wurde die DNA mit 3 ml 1:1 (V:V) Triethylaminacetat, pH 7,3 : Methanol eluiert. Die Lösung wurde dann zur Trockene eingedampft (Ausbeute ca. 80%).

b. Ligasierung mit T&sub4;-Ligase

Das folgende Verfahren wurde zur Herstellung eines 137-Basen-Fragments, welches ein 3'-terminales Riboadenosin enthielt, verwendet. Das Fragment 1 von oben wurde als "Universal"-Adapter in der Reihenfolge verwendet, um durch Ligasierung eine Ribonukleotid-geschwänzelte DNA-Sequenz zu bilden.

Fragment 2

AGTTGGCAGTACAGCCTAGCAGCCATGGAAACGATGTATATTTCCGCGAGAGGACGACAG

Fragment 3

GGTCGTCCGCGGGATTCAGCGCCGACGGGACGTAAACAAAGGACGTCCCGCGAAGGATCC

Fragment 4

TTCCATGGCTGCTAGGCTGTACTGCCAACTGGATCCTTCGCGGGACGTCCTTTGTTTACG

Fragment 5

AATTCTGTCGTCCTCTCGCG

Fragment 6

CCATAAGCGTCG
Alle Sequenzen waren, sofern nicht anders angegeben, 5'-, 3'-Hydroxyl. Die Sequenzen können wie folgt ligasiert werden: 1) Ligasierung 2) Gelisolierung
Das Fragment 2 wurde mit T&sub4;- Polynukleotidkinase 5'-phosphoryliert. Zu 900 pmol des Fragments, die zur Trockene eingedampft waren, wurden 2 ul lox KB-TS (500 nim Tris, 100 mM MgCl&sub2;, 10 ug/ml Spermidin), 2 ul 10 VNM ATP, 2 ul 10 mM DTT, 1 ul (8 Einheiten) T&sub4;-Kinase (New England Nuclear) und 13 ul Wasser gegeben. Nach 30 Minuten bei 37ºC wurden weitere 8 Einheiten T&sub4;-Kinase zugegeben. Nach weiteren 30 Minuten bei 37ºC wurden 45 ul (990 pmol) Fragment 1, welches zuvor auf ähnliche Weise 5'-phosphoryliert wurde, zugegeben. Nach der Zugabe von 22 ul 2 M Natriumacetat und 8 ul 250 mM EDTA wurde die Lösung während 5 Minuten auf 65ºC zur Inaktivierung der T&sub4;-Kinase erhitzt. Die Fragmente 3 bis 6 wurden dann zugegeben (2,6 ul, 902 pmol; 8 ul, 1008 pmol; 32 ul, 1003 pmol bzw. 45 ul, 936 pmol). Die Lösung wurde einer Wirbelströmung unterworfen, 680 ul kaltes Ethanol wurden zugegeben und die Lösung wurde bei -80ºC 20 Minuten lang aufbewahrt. Das Pellet wurde dann bei 12800 UpM während 10 Minuten zentrifugiert, dekantiert, mit kaltem Ethanol zweimal gewaschen und getrocknet.
Zur Reassozuerung der Stücke wurden 18 ul Wasser zum Auflösen des Pellets zugegeben, das Gemisch wurde zur Auflösung des Pellets erhitzt, in siedendem Wasser erhitzt und auf Raumtemperatur (langsam) abgekühlt (ca. 10 min). Zu diesem Zeitpunkt wurden 3 ul 10xKB-TS, 3 ul 10 mM ATP und 3 ul T&sub4;- DNA-Ligase (New England Biolabs, 40000 Einheiten pro ml) zugegeben. Nach 30 Minuten bei 14ºC wurde die Lösung getrocknet und an einem 10%igen Denaturier- Polyacrylamidgel, wie oben für das Fragment 1 beschrieben, gereinigt (Ausbeute ca. 75 pmol).

c. Synthese von DNA an einem 2'-Nitrobenzyluridin-Kontroll-Poreng 1 asträger.

Das 5'-Dimethoxytrityl-2'-nitrobenzyluridin-Derivat des Kontroll-Porenglases (langkettiges Alkylamino, Pierce Chemical Company) wurde von Cruachem, Bend, Oregon, gemäß Gough et al., Tetrahedron Lett. (1981) 22:4177, hergestellt. Die Oligonukleotidsynthese erfolgte an einer automatischen Synthesevorrichtung (Warner et al., DNA 3, in Vorbereitung).
Die 2'-Nitrobenzyl-Funktionalität wurde durch UV-Bestrahlung, wie von Ohtsuka et al., Nucleic Acids Res. (1974) 1:1351 beschrieben, entfernt, ausgenommen, daß eine 2100 Watt Quecksilberbirne verwendet wurde. Es wurde eine Fünf-Minuten-Bestrahlung in einer Pyrex-Küvette für alle Proben (etwa 14,5 umol 2'-Nitrobenzyluridin) verwendet.
Eine Sequenz entsprechend 5' TTCCATGGCTGCTAGGCTGTACTGCCAACTGGATCCTT CGCGGGACGTCCTTTGTTTACGrU 3' (Fragment 7) wurde auf diese Weise hergestellt und für das Kuppeln wie im folgenden beschrieben verwendet. II. Anbringen von DNA durch das 3'-Ende an feste Träger.

a. Synthese von Thiosemicarbazido-Kontrollporenglas (TSC-CPG)

Isothiocyanat-Kontrollporenglass (Pierce Chemical) wurde mit Hydrazin zur Herstellung des Thiosemicarbazido-Derivats wie folgt modifiziert. 400 mg Isothiocyanat CPG wurden in einen 50-ml-Rundkolben gegeben. 25 ml Dimethylsulfoxid, 200 ul destilliertes Pyridin und 500 ul 0,6% Hydrazin in Dimethylsulfoxidlösung wurden zugegeben (vergleiche beispielsweise J. Bauman et al., J. of Histochem. and Cytochem. (1981) 29:227). Nach 18 Stunden mit gelegentlichem Mischen in der Dunkelheit wurde der Träger mit je 50 ml Dimethylsulfoxid, Pyridin, Methanol und 2 L 0,01 M Tris, pH 7,5 gewaschen.

b. Anbringung des Fragments 7 an den festen Träger.

Ungefähr 2000 pmol des Fragments 7 wurden aus Wasser durch Verdampfen getrocknet. Dazu wurden 100 uCi ³²P-ATP (New England Nuclear), 2 ul 10xKB (0,5 M Tris HCL, pH 7,8, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM DDT), 1 j£l (8 Einheiten) T&sub4;-Kinase (New England Nuclear) gegeben. Nach 30 Minuten bei 37 C wurde die Lösung auf 1 ml mit Geleluierungspuffer verdünnt und SEP-PAK entsalzt, wie oben beschrieben. Fragment 7 (20 ul, 982 pmol) wurde mit 20 ul 1 mM Natriumperiodat (Sigma) in 0,01 M Tris-HCL, pH 8,0, während 1 Stunde bei 0ºC in der Dunkelheit behandelt. Dazu wurden 10 mg TSC-CPG in 100 ul 0,1 M Natriumacetat, pH 5,6, gegeben und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 0ºC in der Dunkelheit und dann bei 4ºC über Nacht aufbewahrt.
Zur Blockierung der verbleibenden Thiosemicarbazido-Funktionalitäten wurde Periodat-oxidiertes ATP verwendet. Eine 20 ul Probe von 100 mM ATP wurde mit 20 mg Natriumperiodat in 100 ul 0,01 M Tris-HCL, pH 8,0, behandelt. Nach 1 Stunde in der Dunkelheit wurden 45 ul der Lösung zu 10 mg Fragment 7- TSC-CPG in 150 ul 0,1 M Natriumacetat gegeben. Nach 6 Stunden bei 4ºC wurde der Träger ausgiebig mit viermal Standard-Natriumcitrat (SSC) gewaschen.
Bezogen auf die eingearbeiteten "counts" bzw. Zählungen, waren 13% des Fragments 7 (128 pmol) an dem Glasträger angebracht bzw. verfestigt. III. Befestigung der 5'-Enden der DNA an feste Träger

a. Herstellung von Bromacetyl-Kontroll-Porenglas (BA-CPG).

Die Synthese von O-Bromacetyl-N-hydroxysuccinimid erfolgte ungefähr wie von Cuatreacasas, J. Biol. Chem. (1974) 245:3059, beschrieben.
Ein Gemisch aus 347 mg Bromessigsäure und 345 mg N-Hydroxysuccinimid (Sigma) wurde in 20 ml destilliertem Dioxan hergestellt. Zu diesem Gemisch wurden 532 mg Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Nach 70 Minuten Schütteln bei Raumtemperatur wurde die trübe Lösung durch Glaswolle filtriert.
Zu 500 mg langkettigem Alkylamino-Kontroll-Porenglas (Pierce Chemical, 0,1 meq/g) wurden 10 ml 0,10 M Natriumphosphat, pH 7,6, zugegeben. Die Aufschlämmung wurde auf Eis gegeben und die O-Bromacetyl-N-hydroxysuccinimid- Lösung wurde langsam zugegeben. Nach 30 Minuten unter gelegentlichem Rühren wurde das BA-CPG mit 5 l 0,1 M NaCl gewaschen.
Die Zahl der Äquivalente an Bromacetat an dem Träger wurde mit 5',5'- Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure)-säure-(DTNB)-Test (Butterworth et al., Arch. Biol. Biophysl. (1967) 118:716) bestimmt. Vorratslösungen, welche 200 mg DTNB in 50 ml Wasser und 114 mg 2-Mercaptoethylamin in 100 ml Wasser enthielten, wurden hergestellt. BA-CPG (10 mg) wurde mit 10 ul der 2-Mercaptoethylamin- Lösung plus 500 ul 0,05 M Natriumphosphat bei pH 8,0 während 10 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Lösung wurde dann mit 100 ul DTNB getestet und das sichtbare Spektrum wurde aufgezeichnet (E=1,36x10&sup4; mol&supmin;¹cm&supmin;¹ bei pH 8). Eine Kontrolle wurde mit 2-Mercaptoethylamin ohne BA-CPG durchgeführt. Aus der Menge an 2-Mercaptoethylamin, die bei der Behandlung mit BA-CPG verlorenging, wurde bestimmt, daß BA-CPG 10 mmol Bromacetat pro mg enthielt.

b. 5'-Befestigung von DNA an BA-CPG

Zu 10 ul (333 pmol) Fragment 3 (vergleiche oben) wurden 10 ul 3-³&sup5;S-ATP (Adenosin-5'-0-(3-thiotriphosphat, 0,25 mCi, New England Nuclear)), 2 bis 5 ul 10xKB und 1 ul (8 Einheiten) T&sub4;-Polynukleotidkinase gegeben. Nach 30 Minuten bei 37 C wurde 1 ul 50 mM 3-S-ATP (Lithiumsalz, P.-L. Biochemicals) und 1 ul (8 Einheiten) T&sub4;-Kinase zugegeben. Nach weiteren 30 Minuten bei 37ºC wurde das Fragment, wie oben beschrieben, gelisoliert (Ausbeute 266 pmol). Die Proben wurden am einem Beckmann LS7000 Flüssigkeits-Szintillationszähler in Atomlite (New England Nuclear) gezählt.
Eine 5 mg Probe von BA-CPG wurde durch Zentrifugieren 3 Mal mit Wasser und 2 Mal mit 0,10 M Natriumphosphat, pH 7,6, gewaschen. Das 5'-Thiophosphat-Fragment 2 wurde in 100 ul Phosphatpuffer gelöst und zu dem gewaschenen BA-CPG gegeben. Die Aufschlämmung wurde durch Rotation an einem Rotationsverdampfer während 2 Stunden bei Raumtemperatur vermischt. Die Lösung wurde abdekantiert und verworfen. Zur Blockierung der verbleibenden Bromacetat-Funktionalitäten wurde der Träger mit 2 ul 50 mM Natriumphosphat, pH 8,0 und 50 ul 2-Mercaptoethanol für weitere 2 Stunden behandelt. Danach wurde die Lösung dekantiert und der Träger wurde extensiv mit 4XSSC gewaschen (Ausbeute ca. 10 pmol pro mg CPG).

IV. Synthese von Meerrettich-Peroxidase-DNA-Konjugaten

a. Reinigung gemäß Elutip

Meerrettich-Peroxidase (HRP) (2 mg, Typ VI, Sigma, 10000 Einheiten/38 mg) wurde in 0,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, gelöst. 0-Bromacetyl-N-hydroxysuccinimid (15 ul) wurde zu der obigen Lösung zugegeben und die Reaktion konnte während 30 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen. Die Lösung wurde über eine PD-10 Sephadex( )-G-25M-Säule (Pharmacia) geleitet, die zuvor mit 30 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,5, equilibriert worden war. Die braune Fraktion (1 bis 1,2 ml) wurde gesammelt. Fragment 8 ( 5' bis 3', GGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTG), das zuvor mit 3'-³&sup5;S-ATP wie oben beschrieben 5'-thiophosphoryliert und getrocknet worden war (30 pmol), wurde in 50 ul Phosphatpuffer aufgenommen. Zu dieser thiophosphorylierten Fragment-8- Lösung wurde das funktionalisierte HRP zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten aufbewahrt. Das Gemisch wurde über eine Elutip-d (Schleicher und Schuell) Säule gegeben. Das Peroxidase-DNA-Konjugat wird in das Leer- bzw. Hohlraumvolumen eluiert (26% der Zählungen wurden wiedergewonnen). Ein Kontroliversuch, der wie oben beschrieben durchgeführt wurde, aber unter Verwendung von 5'-³² P-Phosphat-markiertem Fragment 8, zeigte, daß weniger als 0,5% der Zählungen unter diesen Bedingungen eluiert wurden.

b. Trennung mittels eines Gels

Ein Peroxidase-Konjugat von Fragment 9 (5' bis 3', TTGAAGAAC- TACGGTTTGTTGTCTTGTTTCAGAAAGGACTTGCACAAGACCCAAACC) wurde wie oben beschrieben hergestellt, ausgenommen, daß 360 pmol Bromacetyl-Meerrettich-Peroxidase mit 156 pmol von Fragment 9 in 120 ul 0,025 M Natriumphosphat, pH 7,5, kombiniert wurden. Anstatt daß das Gemisch über eine Elutip-d-Säule geleitet wurde, wurde das Gemisch zur Trockene eingedampft, in 1 ul 75%igem Glycerin, 10 ul H&sub2;O und 1 ul 1%igem Bromphenolblau suspendiert. Das Gemisch wurde dann an 10%igem nativen Proteingel laufengelassen. (Lindle et al., Methods in Enzymol. (1983) 92:309). Ein Kontrollversuch mit 5'-³²P-Phosphat-Fragment-9 wurde ebenfalls laufengelassen. Das Enzym-DNA-Konjugat wurde von nicht-konjugierter Peroxidase als schneller laufende ³&sup5;S-markierte Spezies gut abgetrennt. Das Gel wurde mit 100 ml 10 mM Tris-HCL, pH 7,5, 50 mM NaCl, 60 ul 30% H&sub2;O&sub2;, zu dem 60 mg 4-Chlor-1-naphthol gelöst in 20 ml kaltem Methanol zugegeben worden war, angefärbt. Da die Anfärbung auf der Meerrettich-Peroxidaseaktivität beruht, war es möglich, zu zeigen, daß das Peroxidase-DNA-Konjugat selbst aktiv war. Mit der ³²P-Fragment-9-Kontrolle wurde keine neue aktive Spezies gebildet.

c. Hybridisierung der DNA-Peroxidase zu der komplementären DNA

5'-thiophosphoryliertes Fragment 11 (5' bis 3', CCAAGAGCTGGTCAAATCTTGAAGCAAACCTACGACAAGTTCGACACCAACATGAGATCTGACGACGCTTTG)
wurde wie oben ³²P-markiert. Ein 10%iger Überschuß des Fragments 12 (bezogen auf das Fragment 11) wurde zu dem Reaktionsgemisch aus 5'-Thiophosphat-Fragment-11 plus Bromacetylperoxidase gegeben. Die Lösung wurde auf 60ºC während 3 Minuten erhitzt und auf Raumtemperatur gekühlt. Eine Kontrolle wurde mit dem Fragment 12 plus Bromacetylenzym ohne 5'-Thiophosphat-Fragment-11 durchgeführt. Ein Gel wurde wie zuvor laufengelassen und das Reaktionsgemisch des Fragments 11 plus Bromacetylenzym wurden als ein Standard laufengelassen. Die Bahn von Fragment 12 plus Enzym und Fragment 11 zeigte eine neue langsamlaufende Bande (relativ zu dem Fragment-11-Peroxidase-Konjugat), die ³²P-Marker enthielt. Diese Bande war ebenfalls gegenüber Peroxidase-Aktivität positiv. Es wurde keine enzympositive ³²P-markierte Bande für die Fragment-12-Peroxidase-Kontrolle gefunden.
V. Assay
Die Fragmente in diesem Assay stellen ein Modelisystem dar und umfassen einen Teil des Hepatitis-B-Virus-Genoms, das sich etwa 60 Basen in der 5'-(Fragment 3) und in der 3'-Richtung (Fragment 2) von der BAMHI-Stelle bei Base Nr. 1403 von HBV-DNA aus erstreckt. Der Analyt, das Fragment 4, ist komplementär zu dem 3'-Ende von Fragment 3 und dem 5'-Ende von Fragment 2. Das an einem festen Träger vorhandene Fragment 3 wurde wie in Teil IIIb beschrieben hergestellt. Das Fragment 2 wurde mit ³²P-ATP entsprechend dem Anfangsteil von Teil lib (wie er für das Fragment 7 verwendet wurde) 5'-markiert.

a. Hybridisierung, Sondeneinfang

Ungefähr 3 pmol einer Suspension von an festem Träger vorhandenen Fragment 3 (0,3 mg) und 5 pmol von ³²P-Fragment 2 (in 10 ul H&sub2;O) wurden bei jedem Versuch verwendet. Geeignete Mengen von Reagentien (vergleiche folgende Tabelle 1) wurden bis zu einem Endvolumen von 50 bis 100 ul zugegeben, dann wurde auf 90ºC erhitzt und auf Raumtemperatur im Verlauf von 1 Stunde abgekühlt. Nach dem viermaligen Waschen mit SSC bei Raumtemperatur wurden Proben des festen Trägers auf einem Beckman-LS7000-Flüssigkeits-Szintillationszähler gemäß Chernenkov gezählt. Tabelle 1 von Fragment gebunden

VI. Herstellung von PCL (Periodat-spaltbarer Linker)

O,O-Dibenzoylweinsäuremonohydrat (18,8 g, 50 mmol) wurden in 250 ml CH&sub3;CN gelöst und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Dieses Verfahren wurde wiederholt. Das entstehende Öl wurde in 250 ml THF gelöst und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (10,6 g, 50 mmol), gelöst in 50 ml THF, wurde zugegeben. Nach einigen Minuten begann sich ein Niederschlag zu bilden. Nach dem Rühren während 18 Stunden bei 20ºC wurde das Reaktionsgemisch filtriert und der Niederschlag mit wenig THF gewaschen. Der Niederschlag wurde dann in einem Hochvakuum getrocknet, wobei 10,8 g (100%, 50 mmol) Dicyclohexylharnstoff (DCHU) erhalten wurden. Zu dem vereinigten Filtrat wurde 2-(N-Methyl)aminoethanol (4,0 ml, 50 mmol) gegeben und das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 20ºC gerührt. Dann wurde DCC (10,6 g, 50 mmol) in 50 ml THF zugegeben; es bildete sich ein geringer Niederschlag. Nach etwa 1 Stunde wurde 2- (N-Methyl)aminoethanol (4,0 ml, 50 mmol) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden bei 20ºC gerührt.
Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und mit wenig THF gewaschen. Der getrocknete Niederschlag an DCHU wog 10,8 g (100%). Die vereinigten Filtrate wurden zu einem Öl eingedampft. Die Chromatographie an Silicagel ergab 8 g (17 mmol) O,O-Dibenzoylweinsäuredi(N-methyl-2-hydroxyethyl)amid (1). Das Produkt wurde mit 6% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; eluiert.
Zu (1) (8,6 mmol) in 50 ml CH&sub2;Cl&sub2;, enthaltend Dimethylaminopyridin (DMAP) (0,11 g) und Triethylamin (TEA) (2,4 ml), wurde tropfenweise DMT-C1 (8,6 mmol), gelöst in 50 ml CH&sub2;Cl&sub2;, gegeben. Nach der Zugabe von DMT-C1 wurde das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 20ºC gerührt und das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in 600 ml Ethylacetat gelöst und die organische Phase wurde mit 400 ml 5%igem NaHCO&sub3; und 400 ml 80%igem gesättigtem wäßrigem NaCl gewaschen. Die organische Phase wurde über festem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Nach 30 Minuten wurde das Na&sub2;SO&sub4; abfiltriert, und der Überstand wurde zu einem Öl konzentriert und dann mit Toluol und CH&sub3;CN coverdampft.
Das Rohmaterial wurde der Silicagelchromatographie unter Verwendung von n-Butanol/CH&sub2;Cl&sub2; für die Eluierung unterworfen. Das reine Mono-DMT-Produkt eluierte mit 2 bis 3% n-Butanol/CH&sub2;Cl&sub2;, wobei 1,53 9 (2 mmol) 0,0-Dibenzoylweinsäure-2-(O-dimethoxytrityl)hydroxyethyl-N-methyl,N-methyl-2-hydroxyethyldiamid erhalten wurden.
Dieses Material wurde in 20 ml CH&sub2;Cl&sub2;, enthaltend Dusopropylethylamin (DIPEA) (3 mmol) gelöst. Nach dem Kühlen auf 10ºC wurden 2,2 mmol Methoxy-N,N-diisopropylaminochlorphosphin unter Argon zugegeben. Nach 15 Minuten wurde Ethylacetat zugegeben und die organische Phase mit 80%iger gesättigtem wäßrigem NaCl gewaschen, über festem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und dann zur Trockene eingedampft. Nach der Co-Verdampfung mit Toluol und trockenem CH&sub3;CN wurde der Rückstand in 10 ml trockenem CH&sub3;CN gelöst. Die Lösung wurde in aliquoten Teilen in 19 trockene Weaton-Ampullen gegeben und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Die Ampullen wurden mit Septum-Schraubkappen verschlossen und bei -20ºC gelagert.
Das DMT-PCL-Phosphoramidit wurde an Oligonukleotide unter Verwendung von Standardverfahren gekuppelt. Das folgende Oligonukleotid wurde syntheti siert:
In der zuvor gegebenen Struktur bedeutet "PCL" die Periodat-spaltbare Bindung.
"BLA3c" bedeutet die Nukleotidsequenz (5' bis 3') GATGTGGTTGTCGTACTT und "T-LLA2-TT" bedeutet die Nukleotidsequenz (5' bis 3') TTGACACGGGTCCTAT GCCTAAT. Nach vollständiger Schutzgruppenabspaltung wurde das Oligonukleotid mit PAGE gereinigt, die Produktbande herausgeschnitten, mit MG-Puffer eluiert und unter Verwendung einer SEP-PA -Patrone, wie von Sanchez-Pescador et al., DNA 3:339-343 (1984) beschrieben, entsalzt.
Der Abbau wurde wie folgt durchgeführt:
etwa 0,6 OD gereinigtes Material in 6 λ H&sub2;O wurde mit 50λ 0,1 M NaIO&sub4; behandelt und 1 Stunde bei 20ºC stehengelassen. 0,4 ml einer Lösung von Glycerin in H&sub2;O (1λ º/ml) wurden zugegeben. Die vereinigte Lösung wurde durch eine PD-10-Säule (Sephadex( )-G25) geleitet und mit 0,1 M Triethylammoniumacetat (TEAA) equilibriert und mit dem gleichen Puffer eluiert. 0,5 ml-Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt, und das Lösungsmittel wurde in einem Speed-Vac entfernt. Analyse mittels 15%iger PAGE zeigte einen vollständigen Abbau des Ausgangsmaterials in zwei neue Banden unerwarteter Größe.

VII. Natriumperiodat-Freigabe

A. Eine ³²P-markierte Sonde wurde, wie von Urdea al. in Nucleic Acids Research L6 (1988) beschrieben, in dem vorhergehenden Absatz zitiert, hergestellt. Die Sonde hatte die Sequenz (5' bis 3') AAGTACGACAACCACATCGGATGACCTCGGATCGACCT*T-³²P, worin * das modifizierte Nukleotid ist, das durch die Struktur Fluorescein oder langkettiges Biotin von Pierce Chemicalwie in der EP-A-O 225 807 oben beschrieben. Ein synthetisches Oligonukleotid mit der Sequenz (5' bis 3') GATGTGGTTGTCGTACTTCTTCTTTGGAGAAAGTGGTG wurde als Analyt verwendet. Microtiter-Einfangvertiefungen wurden unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Sonden hergestellt: (1) *CACCACTTTCTCCAAAGAAG (bezeichnet als XT1 * 1ca in der folgenden Tabelle 3) und (2) *TT-X- CACCACTTTCTCCAAAGAAG (* stellt obiges Alkylaminnukleotid dar), worin X die Periodat-spaltbare Bindung, wie in dem vorhergehenden Absatz beschrieben, bedeutet. Es wurde das folgende Verfahren verwendet. Die Vertiefungen wurden aus einem Immulon-II-Streifen durch Zugabe in jede Vertiefung von 200 ul einer 200 ug/ml-Lösung von Polyphenylalanyllysin (Sigma Chemical Inc.) in Wasser hergestellt. Die bedeckten Streifen wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten bis 2 Stunden aufbewahrt und dann wie oben gewaschen. Eine 10 OD&sub2;&sub6;&sub0;-Probe des Oligonukleotids von 38 oben in 60 ul 1 × PBS wurde mit 140 ul DMF enthaltend 10 mg Ethylenglykolbis(succinimidylsuccinat) (Pierce Chemicals Inc.) behandelt. Das Gemisch wurde einem Wirbelstrom unterworfen und im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 15 Minuten wurde die Lösung über eine Sephadex( )-G-25-Säule (PD-10 von Pharmacia), die zuvor mit 30 ml 1 × PBS equilibriert worden war, geleitet. Das Leervolumen der Säule wurde bis zu einem Endvolumen von 35 ml mit 1 × PBS verdünnt. Zu jeder Vertiefung wurde ein 50 ul aliquoter Teil der Einfangsondenlösung zugegeben. Nach Bedecken mit einer Plastikumhüllung wurden die Vertiefungen bei Raumtemperatur in der Dunkelheit während 30 Minuten bis über Nacht inkubiert. Die Vertiefungen wurden nicht mit einer Hybridisierungsmischung überschichtet.
Vorratslösungen, welche 1 fmol, 100 amol und 10 amol des Analytfragments enthielten, wurden in einem Hybridisierungspuffer, welcher 4X SSC enthielt, hergestellt. Eine Kontrollösung wurde auf ähnliche Weise hergestellt, die keinen Analyten enthielt. Vier Sätze von Vertiefungen wurden dann vorbereitet. Zu jeder Vertiefung wurden 40 ul der ausgewählten Lösung, d.h. die entweder 1 fmol, 100 amol, 10 amol oder keinen Analyten enthielt, zugegeben. Die Hybridisierung erfolgte bei 55ºC in einem Wasserbad während einer Stunde. Die Röhrchen wurden verschlossen und die Vertiefungen wurden mit einer Klebstoff-Linbro/Titertek-Membran versiegelt. Nach dem zweimaligen Waschen mit 380 ul 4X SSC wurden zusätzlich 40 ul 4X SSC, enthaltend 10 fmol einer ³²P-markierten Sonde zugegeben. Die Vertiefungen wurden während 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, wobei sie zu diesem Zeitpunkt erneut zweimal mit 380 ul 4X SSC gewaschen wurden.
Die Gesamtzählungen ³²P wurden unter Verwendung eines LKB 1214-Rackbeta-Szintillationszählers festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unter "Gesamtzäh lungen" angegeben.
In einen Satz von Vertiefungen, welche das Periodat-spaltbare Polynukleotid enthielten, und in einen Satz von Vertiefungen, welche XTI * 1ca-Lösungen enthielten, wurden 100 ul 100 mM NaIO&sub4; in 4X SSC gegeben. Die Vertiefungen wurden bei Raumtemperatur eine Minute lang inkubiert. Die Periodat-Lösung wurde in saubere Vertiefungen transferiert und gezählt. Die Ergebnisse sind in den Spalten mit den Überschriften "100 mM NaIO&sub4;" und "4X SSC" in Tabelle 3 aufgeführt.
Als Kontrolle wurden 100 ul 4X SSC zu einem Satz von Vertiefungen, welche das Periodat-spaltbare Polynukleotid enthielten, gegeben. Die Vertiefungen wurden dann bei Raumtemperatur eine Minute lang inkubiert und die Lösung wurde in saubere Vertiefungen transferiert. Die transferierte Lösung wurde gezählt und die Ergebnisse sind unter der Überschrift "XT1* 1ca-Vertiefungen" in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Analytmenge Gesamtzählungen Vertiefungen Null S/N Verhältnisse: keine Freigabe mol
B. In einem zweiten Experiment wurde das zuvor beschriebene Verfahren mit den folgenden Variationen wiederholt: (1) die verwendete Sonde war ³²P- markiertes 19-meres der Sequenz *CGTGTCAGGCATAGGACC (5' bis 3', * wie oben), (2) der "Analyt" war ein synthetisches Oligonukleotid der Sequenz GGTCCTATGCCTGACACGCTTCTTTGGAGAAAGTGGTG, (3) eine Analytkonzentration wurde bewertet anstelle der drei (1 fmol) und (4) 100 fmol wurden anstelle von 10 fmol ³²P-markierte Sonde verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4 Analytmenge Gesamtzählungen Null S/N Verhältnisse: keine Freigabe fmol
Aus den obigen Ergebnissen ist erkennbar, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine einfache, schnelle und genaue Möglichkeit zum Nachweis spezifischer Polynukleotidsequenzen aus verschiedenen Quellen ist. Das Verfahren zeigt eine hohe Empfindlichkeit und große Flexibilität, was die Verwendung unterschiedlicher Typen von Markern erlaubt, wobei nachweisbare Signale erhalten werden, welche in Immunoassays verwendet wurden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann leicht für die Verwendung in üblichen Vorrichtungen für Immunoassays angepaßt werden, mit denen Radioaktivität, Lichtabsorption in Spektrophotometern und Lichtemission in Fluorometern oder Szintillationszählern nachgewiesen werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren kann bei jeder DNA-Sequenz verwendet werden, und es können relativ kleine Sonden verwendet werden, wobei falsche positive Werte verringert werden und unerwünschte Heteroduplexierungen minimal gehalten werden. Durch Spaltung der Marker von dem Träger für die Messungen können die Hintergrundwerte stark verringert werden, da das Ablesen von dem Träger entfernt erfolgen kann. Ebenfalls ist eine weitere Umdirigierung im Hintergrund möglich, bedingt durch die Notwendigkeit, den Marker von der Polynukleotidkette abzuspalten. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit eine genaue und wirtschaftliche Bestimmung von DNA-Sequenzen für die Diagnose von Krankheiten, die Überwachung von Hybrid-DNA-Manipulationen, die Bestimmung genetischer Eigenschaften und ähnlichem.
Obgleich die vorstehende Erfindung in gewissen Einzelheiten zur Erläuterung und beispielhaft beschrieben wurde, um ein klares Verständnis zu ermöglichen, ist es offensichtlich, daß bestimmte Änderung und Modifizierungen durchgeführt werden können, die auch unter den Rahmen der beigefügten Ansprüche fallen.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins einer Oligonukleotidsequenz von Interesse in einem Nukleinsäureanalyten, der in einer Nukleinsäureprobe vorhanden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man

unter hybridisierenden Bedingungen die Nukleinsäureprobe mit einem Polynukleotidreagens vereinigt, wobei entweder die Probe oder eine Komponente des Reagenses an einen Träger gebunden wird, und die Hybridisierung des Analyten und des Polynukleotidreagenses dazu führt, daß ein Marker an den Träger über eine selektierbare Spaltstelle gebunden wird, wobei die selektierbare Spaltstelle eine durch OH&supmin;, Hydroxylamin, SH&supmin; oder Periodat spaltbare Bindung umfaßt,

den Träger von dem an den Träger außer über die selektierbare Spaltstelle gebundenen Marker im wesentlichen befreit,

die Spaltstelle spaltet und

den von dem Träger befreiten Marker nachweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotidreagens eine erste an einen Träger gebundene Polynukleotideinfangsonde und eine zweite Polynukleotidmarkersonde umfaßt, wobei die erste und die zweite Sonde Oligonukleotidsequenzen besitzen, die den in dem Analyten vorhandenen Sequenzen komplementär sind, so daß damit unter den genannten Hybridisierungsbedingungen Doppelstränge gebildet werden, wobei mindestens eine der genannten Oligonukleotidsequenzen eine Sequenz von Interesse ist, wobei die Einfangsonde die selektierbare Spaltstelle enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis des Vorhandenseins einer oligonukleotidsequenz von Interesse in einem Nukleinsäureanalyten, der in einer Nukleinsäureprobe vorhanden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man

unter hybridisierenden Bedingungen in einem wäßrigen Medium die Nukleinsäureprobe mit einem Polynukleotidreagens vereinigt, wobei entweder die Probe oder eine Komponente des Reagenses an einen Träger gebunden wird, und die Hybridisierung des Analyten und des Polynukleotidreagenses dazu führt, daß ein Marker an den Träger über eine selektierbare Spaltstelle gebunden wird, wobei die selektierbare Spaltstelle eine durch OH&supmin;, Hydroxylamin, SH&supmin; oder Periodat spaltbare Bindung umfaßt,

den Träger, an den das Polynukleotidreagens und der Nukleinsäureanalyt gebunden sind, von dem wäßrigen Medium abtrennt,

den Träger mit einem Medium mit einer anderen Hybridisierungsstringenz als das wäßrige Medium wäscht, um an den Träger außer über die selektierbare Spaltstelle gebundenen Marker zu entfernen,

die Spaltstelle spaltet und

den von dem Träger befreiten Marker nachweist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Polynukleotidreagens eine an einen Träger gebundene erste Polynukleotideinfang sonde und eine zweite Polynukleotidmarkersonde umfaßt, wobei die erste und die zweite Sonde Oligonukleotidsequenzen besitzen, die den in dem Analyten vorhandenen Sequenzen komplementär sind, so daß Doppelstränge damit unter Hybridisierungsbedingungen gebildet werden, wobei mindestens eine der Oligonukleotidsequenzen eine Sequenz von Interesse ist, wobei die Einfangsonde die selektierbare Spaltstelle enthält.

5. Sonde, die zum Nachweis des Vorhandenseins einer Oligonukleotidsequenz von Interesse in einem Nukleinsäureanalyten, der in einer Nukleinsäureprobe vorhanden ist, nützlich ist, umfassend eine Polynukleotidsequenz, die in der Nähe eines Endes an einen Träger gebunden ist, und an dem gegenüberliegenden Ende eine Sequenz, die der Sequenz von Interesse komplementär ist, besitzt, wobei die Polynukleotidsequenz zusätzlich eine selektierbare Spaltstelle, umfassend eine durch OH&supmin;,Hydroxylamin, SH&supmin; oder Periodat spaltbare Bindung, umfaßt.

6. Polynukleotidreagens mit der Struktur worin DNA&sub1; ein erster DNA-Strang ist, DNA&sub2; ein zweiter DNA- Strang ist, und X eine durch OH&supmin;'Hydroxylamin, SH oder Periodat spaltbare Bindung umfaßt.

7. Polynukleotidreagens nach Anspruch 6, worin X eine Bindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

umfaßt.

8. Polynukleotidreagens nach Anspruch 6, worin X die Einheit

umfaßt.

9. Polynukleotidreagens nach Anspruch 6, worin X

bedeutet.

10. Reagens, das zur Synthese eines Polynukleotidreagenses nützlich ist, wiedergegeben durch die Struktur

worin R¹ eine säureempfindliche, basenstabile Schutzgruppe ist, R² aus der Gruppe bestehend aus H, Phosphoramidit, Phosphotriester, Phosphodiester, Phosphit, H-Phosphonat und Phosphonothionat ausgewählt ist und φ Phenyl bedeutet.

11. Reagens nach Anspruch 10, worin R¹ DMT (Dimethoxytrityl) bedeutet, und R² bedeutet, worin iPr für Isopropyl steht.

12. Verwendung eines Reagenses nach Anspruch 10 oder 11 zur Herstellung eines Polynukleotids nach Anspruch 6.