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Die Erfindung betrifft Verbindungen mit antimetastatischer Aktivität
und insbesondere die Verwendung von Verbindungen als antimetastatische
Mittel bei Tieren und Menschen.
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Eines der Schlüsselereignisse bei der Tumor-Metastasierung ist das
Anheften von Leukozyten oder Tumorzellen an Blutgefäßwände und ihre
anschließende Wanderung in Gewebe. Über die molekulare Grundlage dieser
Vorgänge weiß man wenig, obgleich allgemein angenommen wird, daß das
Eindringen in die Gefäßwände einen lokalisierten Abbau der
interendothelialen Zellverbindungen und der subendothelialen Matrix durch spezifische,
abbauende Enzyme benötigt.
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Es wurde nunmehr festgestellt, daß bestimmte sulfatierte
Polysaccharide die Tumorzellen-Metastasierung hemmen können. Obgleich einige dieser
sulfatierten Polysaccharide (wie Heparin) eine antikoagulierende
Aktivität besitzen, scheint die antimetastatische Aktivität nicht mit ihrer
antikoagulierenden Aktivität in Zusammenhang zu stehen, wobei die
Polysaccharide nicht das Anheften von Tumorzellen an Gefäßwänden hemmen,
jedoch ein Eindringen in die Gefäßwände verhindern. Anschließende
Untersuchungen haben ergeben, daß die sulfatierten Polysaccharide von
Tumorzellen abgeleitete Endoglycosidasen hemmen, die die subendotheliale
extrazelluläre Matrix (ECM) abbauen und ein Eindringen und die Passage von
Tumorzellen ermöglichen. Insbesondere wurde festgestellt, daß diese
sulfatierten Polysaccharide die Wirkung von für Heparinsulfat spezifischer
Glycosidase (Heparanase), die die Heparinsulfat-Seitenketten der ECM
abbaut, hemmen.
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Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die
Verwendung mindestens eines sulfatierten Polysaccharids, welches die
Endoglycosidase-Aktivität blockiert oder hemmt, wobei das Polysaccharid
eine Heparinfraktion mit niedriger Affinität zu Antithrombin III oder
periodatoxidiertes, reduziertes Heparin ist, zur Herstellung eines
Arzneimittels zur Bekämpfung von Metastasen in einem tierischen oder
menschlichen Patienten.
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Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine
pharmazeutische oder tierarzneiliche Zusammensetzung zur Bekämpfung von Metastasen,
welche mindestens ein sulfatiertes Polysaccharid, welches die
Endoglycosidase-Aktivität blockiert oder hemmt, wobei das Polysaccharid unter
einer Heparinfraktion mit niedriger Affinität zu Antithrombin III und
periodatoxidiertem, reduziertem Heparin ausgewählt ist, zusammen mit
einem pharmazeutisch oder tierarzneilich geeigneten Träger oder
Verdunnungsmittel dafur umfaßt.
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Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von sulfatierten
Polysacchariden, die die Heparinase-Aktivität blockieren. Bei den
geeigneten sulfatierten Polysacchariden handelt es sich um eine
Heparinfraktion mit niedriger Affinität zu Antithrombin III und um
periodatoxidiertes, reduziertes Heparin, das eine vernachlässigbare
antikoagulierende Aktivität aufweist, aber ein starkes antimetastatisches Mittel ist.
Die Endoglycosidase-Hemmaktivität des Polysaccharids wird
aufrechterhalten.
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Das folgende Beispiel zeigt, daß
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(a) eine Gruppe von sulfatierten Polysacchariden die Metastasierung
des Mamma-Adenokarzinoms 13762 MAT hemmen kann;
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(b) die antimetastatische Aktivität der sulfatierten Polysaccharide
nicht mit ihrer antikoagulierenden Aktivität korreliert; und
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(c) die sulfatierten Polysaccharide nicht die Haftung von
Tumorzellen am Gefäßendothel hemmen, jedoch offensichtlich eine Passage der
Tumorzellen durch die Blutgefäßwände verhindern.
Materialien und Methoden
Beispiel 1
Polysaccharide
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Hyaluronsäure (Qualität III-S aus menschlicher Nabelschnur),
Chondroitin-4-sulfat (Chondroitinsulfat Typ A aus Walknorpel), Chondroitin-6-
sulfat (Chondroitinsulfat Typ C aus Haiknorpel), Fucoidan (aus Fucus
vesiculosus), Pentosanpolysulfat, Carrageenan-kappa (Typ III aus Eucheuma
cottonii) und Carrageenan-lambda (Typ IV aus Gigartina aciculaire und
Gigartina pistillata) wurden von der Fa. Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo)
bezogen. Heparin (mukös) wurde von der Fa. Evans Medical Ltd. (Liverpool,
U. K.) bezogen. Heparin CSL wurde von den Commonwealth Serum Laboratories
(Melbourne; Australien) erhalten. Dextransulfat (2,3
Sulfatreste/Monosaccharid, MG 500 000) wurde von der Fa. Pharmacia Fine Chemicals
(Uppsala, Schweden) erhalten. Arteparon (Luitpold-Werk, München,
Deutschland) war eine Spende von Dr. P. Ghosh, Royal North Shore Hospital (St.
Leonards, Sydney, Australien). Die Polysaccharide, die mit Ausnahme von
Heparin, CSL, das in Form einer Lösung bezogen wurde, wurden in 0,15 M
NaCl gelöst, in den meisten Fällen in einer Vorratskonzentration von 20
mg/ml. Hyaluronsäure und die Carrageenane wurden aufgrund ihrer
Viskosität in Lösung in 0,15 M NaCl in Konzentrationen von 10 mg/ml bzw. 2 mg/ml
gelöst. Sämtliche Polysaccharidlösungen wurden bei -20ºC gelagert.
Tiere und Zellinien
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Weibliche Fisher F344-Inzuchtratten wurden an der John Curtin School
of Medical Research gezüchtet und im Alter von 10 Wochen eingesetzt.
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Bei der 13762-MAT-Zellinie handelt es sich um ein
Mamma-Adenokarzinom von Fisher 344-Ratten, die an eine in vitro-Kultur in RPM1
1640-Medium (Gibco) unter Ergänzung mit 10% fötalem Kälberserum (FCS, Flow
Labs), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycinsulfat gemäß
früheren Angaben (4) angepaßt war.
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Diese Zellen sind stark metastatisch und weisen über eine Anzahl von
Passagen in der Kultur stabile metastatische Eigenschaften auf.
Hämatogener Metastasentest
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13762 MAT-Zellen wurden von der Oberfläche von Gewebekulturflaschen
durch heftiges Schütteln entfernt. Sodann wurden die Zellen gewaschen und
in Komplettmedium resuspendiert. 2x10&sup5; lebensfähige Zellen in 0,6 ml
wurden in die Schwanzvene von Fisher 344-Ratten injiziert. 12 Tage nach der
Injektion wurden die Tiere getötet. Die Lungen wurden entnommen und in
Bouin-Flüssigkeit fixiert. Die Anzahl an metastatischen Oberflächenherden
wurde bestimmt. Durch diesen Injektionsweg wurden die Metastasen auf die
Lunge begrenzt.
Weichagarplattierung
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Die Plattierung der Zellen in Weichagar wurde im wesentlichen gemäß
den Angaben von Reid (5) durchgeführt. Kurz zusammengefaßt, wurde eine
Unterschicht von 2 ml 0,5% Difco-Bacto-Agar in 1640-Medium mit einem
Gehalt an 10% Kälberserum in 60 mm-Petri-Schalen (Sterilin, Teddington,
Middlesex) gegossen und 1 Stunde bei 4ºC zum Erstarren gebracht. Die
auszustreichenden Zellen wurden in 0,33% Agar in 1640-Medium und 10%
Kälberserum suspendiert. 6 ml dieses Gemisches wurden über die Unterschicht
gegossen. Die Platten wurden zuerst 1 Stunde bei 4ºC gehalten, um den Agar
zum Erstarren zu bringen, und sodann 14 Tage in einer angefeuchteten, 5%
CO&sub2; enthaltenden Atmosphäre bei 37ºC inkubiert. Kolonien sind nach 7-10
Tagen bei 37ºC sichtbar und können nach 14 Tagen bewertet werden.
Rosettentest auf Zelloberflächenrezeptoren für sulfatierte
Polysaccharide
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Rosettentests wurden in Mikrotiterplatten mit 96
Rundbodenvertiefungen (Linbro Chemical Co.) auf der Basis eines veröffentlichten Verfahrens
(3) durchgeführt. 13762-MAT-Zellen wurden gewaschen und in
phosphatgepufferter 0,15 M NaCl (pH-Wert 7) unter Supplementierung mit 0,1%
Rinderserumalbumin (PBS/BSA) resuspendiert. 25 µl eisgekühlte 13762-MAT-Zellen
(1x10&sup6;/ml in PBS/BSA) wurden entweder mit 25 µl einer 1% Suspension von
gewaschenen Schaferythrozyten oder mit Schaferythrozyten, die mit
sulfatiertem Polysaccharid unter Verwendung von CrCl&sub3; gemäß Literaturangaben
(3) gekoppelt worden waren, in PBS/BSA versetzt. Dieses Gemisch wurde bei
1000 Ulmin 1 min bei 4ºC pelletisiert und sodann 1 Stunde stehengelassen,
um die Rosetten zu stabilisieren. Sodann wurden die Zellpellets
vorsichtig mit einer kurzen Pasteur-Pipette resuspendiert und mit Methylviolett
gefärbt. 50 µl 0,05% Methylviolett wurden jeweils in die Vertiefungen
gegeben. Die Zellproben wurden in eine Hämozytometer-Kammer übertragen. Der
prozentuale Anteil der rosettenbildenden Zellen wurde bestimmt. Ein
Minimum von 100-200 Tumorzellen wurde auf Rosetten untersucht. Eine
Tumorzelle mit 6 oder mehr anhaftenden Erythrozyten wurde als Rosette
angesehen.
Markierung von 13762-MAT-Zellen mit Hoechst-Farbstoff Nr. 33342
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Hoechst-Farbstoff Nr. 33342 (H33342; Calbiochem-Behring, Kingsgrove,
NSW, Australien) wurde bei 4ºC in Form einer Vorratslösung von 600 µg/ml
in destilliertem Wasser aufbewahrt. Zur Markierung wurden
13762-MAT-Zellen gewaschen und in einer Konzentration von 5x10&sup7; Zellen/ml in RPM1-
1640-Medium unter Supplementierung mit 10% FCS resuspendiert. Die Zellen
wurden in ein 37ºC-Wasserbad übertragen, und 6 µg/ml H33342 wurden
zugesetzt. Die Markierung wurde 15 min fortgesetzt, wonach die Zellen 2 mal
mit kaltem RPMI-1640-Medium gewaschen und für Injektionszwecke
resuspendiert wurden.
Quantitative Bestimmung der Aufnahme von Tumorzellen
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Das angewandte Verfahren war ähnlich dem von Brenan und Parish (2).
13762-MAT-Zellen (2x10&sup6;) wurden intravenös Ratten in 0,6 ml
RPM1-1640-Medium mit einem Gehalt an entweder 200 Einheiten CSL-Heparin (etwa 1,6 mg)
oder 4 mg Chöndroitin-4-sulfat injiziert. Markierte Zellen, die mit RPM1-
1640 allein injiziert wurden, dienten als Kontrollen. Zu verschiedenen
Zeitpunkten nach der Injektion wurden die Ratten betäubt und durch
Herzpunktur entblutet. Die Lungen wurden entfernt, gewaschen und in
Kochsalzlösung gelegt. Sodann wurde jede Lunge in PBS zerkleinert und zu einer
Einzelzellsuspension verarbeitet, indem man die Gewebefragmente
vorsichtig durch ein feines Sieb preßte. Sodann wurde die Zellsuspension
zentrifugiert, mit PES gewaschen und in 4 ml PBS resuspendiert. Ein
Hämozytometer
wurde zur Bestimmung der Anzahl an fluoreszierenden Zellen innerhalb
jeder Lunge verwendet. Mindestens 3 Tiere wurden für jeden Zeitpunkt und
für jede Behandlung eingesetzt.
Antikoagulations- und Prokoagulationstests
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Zur Gewinnung von Rattenplasma wurde Blut durch Herzpunktur von
betäubten Ratten gewonnen. Neun Volumenteile Rattenblut wurden in 1
Volumenteil 3,8% Natriumcitrat aufgezogen. Die Erythrozyten wurden durch
Zentrifugation (10 000 g, 4ºC) entfernt. Das Plasma wurde gewonnen und bis
zur Verwendung bei -70ºC gelagert.
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Der Einfluß der sulfatierten Polysaccharide auf den
Koagulationszustand des Plasmas wurde auffolgende Weise bestimmt. Polysaccharid, 100
µl verdünnt in 0,15 M NaCl, wurde mit 50 µl Normalplasma und 50 µl 0,15 M
NaCl vermischt. Das Gemisch wurde 2 min auf 37ºC erwärmt. Zur Aktivierung
des Koagulationswegs wurden entweder 20 µl Rinderthrombin (Sigma) in
einer Konzentration von 30 NIH-Einheiten/ml in 1,5 M NaCl oder 20 µl
aktiviertes optimiertes "Thrombofax"-Reagenz (partielles Thromboplastin mit
Aktivator, Ortho Diagnostic Systems Inc.) zu dem Gemisch gegeben. Die
Gerinnungsreaktion wurde sodann durch Zugabe von 100 µl 30 mM CaCl&sub2;
eingeleitet. Die Zeitspanne (in Sekunden), die zur Gerinnselbildung
erforderlich war, wurde aufgezeichnet. Diese Werte wurden mit dem Wert
verglichen, der für Plasma zur Gerinnselbildung in Abwesenheit von sulfatierten
Polysacchariden erforderlich war, d. h. bei Ersatz von 100 µl
Polysaccharid durch 100 µl Kochsalzlösung Die höchste Polysaccharid-Konzentration,
die keinen nachweisbaren Einfluß auf die Gerinnungszeit hatte, wurde als
Endpunkt genommen. Die Zugabe von Thrombin oder "Thrombofax" war
erforderlich, um die Variabilität auszuschließen, die durch die unvollständige
Aktivierung des natürlichen Gerinnungswegs, der sich ergab, wenn der
Oberflächenkontakt das einzige Mittel zur Aktivierung der
Koagulationskaskade darstellte, herbeigeführt wurde.
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Ein ähnlicher Test wurde verwendet, um den Einfluß von sulfatierten
Polysacchariden auf die Prokoagulationsaktivität der 13762-MAT-Zellen zu
bestimmen. 100 µl normales Rattenplasma wurden mit 50 µl Polysaccharid in
0,15 M NaCl und 50 µl 1640-Medium (kein Serum) mit einem Gehalt an 2x10&sup4;
13762-MAT-Zellen versetzt. Nach 2-minütigem Erwärmen auf 37ºC wurden 1000
µl 30 nM CaCl&sub2; zugegeben. Die Zeitspanne (Sekunden) bis zur
Gerinnselbildung wurde gemessen. Die Gerinnungszeit von Plasma bei Aktivierung der
Koagulationskaskade mit 2x10&sup4; MAT-13762-Zellen in Abwesenheit von
Polysaccharid (die 50 µl Polysaccharid wurden durch 50 µl Kochsalzlösung
ersetzt)
diente als Kontrolle. Die höchste Polysaccharid-Konzentration, die
keine nachweisbare Verlängerung der Gerinnungszeit über den Wert für die
Kontrolle herbeiführte, wurde als Endpunkt genommen. Für beide Tests
wurde der Einfluß der jeweiligen Polysaccharid-Konzentrationen in
Doppelbestimmungen gemessen. Die Kontrollwerte wurden aus dem Mittelwert für
mindestens acht Gerinnungszeiten bestimmt.
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Fig. 1: Positionierungsmuster innerhalb der Rattenlunge bei
intravenöser Injektion von mit H33342 markierten MAT-Zellen. Die Zellen wurden
entweder in Kochsalzlösung allein (A und C) oder in Kochsalzlösung mit
einem Gehalt an 1,6 mg Heparin (B und D) injiziert. Das Muster der
Positionierung der 13762-MAT-Zellen ist 15 min (A und B) und 360 min (C und
D) nach der Injektion dargestellt. Vergrößerung: x55.
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Fig. 2: Quantitative Bestimmung des Einflusses von sulfatierten
Polysacchariden auf die Positionierung von mit H33342 markierten 13762-MAT-
Zellen innerhalb der Rattenlunge in einer Zeitspanne von 22 h. Versuch 1:
Die Zellen wurden intravenös in Kochsalzlösung allein ( ) oder
Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 1,6 mg Heparin ( ) injiziert. Versuch 2: Die
Zellen wurden intravenös in Kochsalzlösung allein (o) oder in
Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 4 mg Chondroitin-4-sulfat (Δ) injiziert. Der
Mittelwert und die Standardabweichung der Anzahl an fluoreszierenden
Tumorzellen in Rattenlungen bei mindestens 3 Versuchen ist angegeben.
Ergebnisse
Hemmung der Metastasierung mit sulfatierten Polysacchariden
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Um festzustellen, ob sulfatierte Polysaccharide die Anzahl an 13762-
MAT-Zellen-Lungenmetastasen verändern konnten, wurde folgender Versuch
durchgeführt. Einzelzellsuspensionen von 13762-MAT-Zellen (2x10&sup5;) wurden
mit 4 mg sulfatiertem Polysaccharid in RPM1-1640-Medium unmittelbar vor
der Injektion in die Schwanzvene von Ratten vermischt. 12 Tage nach der
Injektion wurde die Anzahl an sichtbaren Oberflächen-Lungenläsionen
bestimmt. Obgleich eine Bewertung der Anzahl an sichtbaren Läsionen nicht
die Gesamtzahl an Tumoren innerhalb der Lunge wiedergibt, wird sie als
zuverlässiger Schätzwert für das Ausmaß der metastatischen
Tumorkolonisierung angesehen (8).
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Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß bestimmte sulfatierte
Polysaccharide in erheblichem Maße die Anzahl an Lungenläsionen verringerten.
Heparin war das wirksamste Polysaccharid, gefolgt von Carrageenan-lambda,
Pentosansulfat und Fucoidan.
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Es war notwendig, die Möglichkeit auszuschließen, daß
offensichtliche antimetastatische Wirkungen der sulfatierten Polysaccharide durch
ihre direkte Toxizität auf Tumorzellen hervorgerufen wurden. Demgemäß
wurden Proben von 13762-MAT-Zellen 1 h bei 37ºC mit jeweils einem der
Zucker, für die eine Hemmung der Metastasierung gezeigt worden war,
inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und auf Weichagar
ausgestrichen. Die Konzentrationen an Zellen und Zuckern waren die
gleichen wie bei der Injektion an die Ratten, d. h. 3,3x10&sup5; Zellen/6,6 mg
Zucker/ml oder 3,3x10&sup5;zellen/3,3 mg Zucker/ml im Fall der Carrageenane.
Zellen, die nur in RPM1-1640-Medium inkubiert worden waren, dienten als
Kontrollen. Der Einfluß der Zucker auf die Lebensfähigkeit der
Tumorzellen wurde aus der Anzahl der Zellkolonien, die 14 Tage nach dem
Ausstreichen sichtbar waren, ermittelt. Dextransulfat war der einzige Zucker, für
den festgestellt wurde, daß er die Größe oder die Anzahl von 13762-MAT-
Zellkolonien verringerte (Tabelle II). Die übrigen Zucker zeigten keinen
nachweisbaren Einfluß auf die in vitro-Lebensfähigkeit von Tumorzellen.
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Dies läßt darauf schließen, daß mit Ausnahme von Dextransulfat die
Verringerung der Anzahl an Metastasen eine Folge einer gewissen in vivo-
Wirkung der Polysaccharide war. Um die Richtigkeit dieser Interpretation
festzustellen, wurde Heparin unabhängig von den intravenös injizierten
Tumorzellen verabreicht. Es wurde festgestellt, daß der Weg der
Heparininjektion, unabhängig davon, ob die Injektion intraperitoneal,
subkutan oder über die Schwanzvene erfolgte, das Ergebnis nicht veränderte.
Heparin verringerte in jedem Fall die Anzahl an Metastasen auf weniger
als 10% der Kontrolle (Daten nicht dargestellt). Somit wurde bestätigt,
daß zumindest Heparin in vivo die Anzahl von Metastasen verringerte.
Nachweis von Rezeptoren für sulfatierte Polysaccharide an 13762-MAT-
Zellen
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Sulfatierte Polysaccharide stellen eine Hauptkomponente der
extrazellulären Matrix von Endothelzellen dar. Daher ist es möglich, daß
13762-MAT-Zeilen am Lungenendothel über Rezeptoren für diese Moleküle
haften können. Um festzustellen, ob mit der Oberfläche von
13762-MAT-Zellen assoziierte Moleküle sulfatierte Polysaccharide binden, wurde ein
Rosettentest angewandt.
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Sulfatierte Polysaccharide aus verschiedenen Quellen wurden mit der
Oberfläche von Schaferythrozyten gekuppelt. Die Fähigkeit dieser
Erythrozyten zur Bindung an 13762-MAT-Zellen wurde bestimmt. Ungekuppelte
Schaferythrozyten dienten als Kontrollen. Es wurde festgestellt, daß
Erythrozyten,
die mit den Glycosaminoglycanen (GAG) Chondroitin-4-sulfat und
Chondroitin-6-sulfat gekuppelt waren, eine starke Bindung mit der
Oberfläche von 13762-MAT-Zellen eingingen, während mit Hyaluronsäure (ein
nicht-sulfatiertes GAG) gekuppelte Erythrozyten nur mäßig banden, d. h.
77% der 13762-MAT-Zellen werden als Rosetten klassifiziert (Tabelle III)
Im Gegensatz dazu binden Arteparon (ein künstlich übersulfatiertes GAG
aus Rinderlunge) und mit Heparin gekuppelte Erythrozyten nur sehr schwach
an 13762-MAT-Zellen. Ein ähnliches Muster einer selektiven Haftung
zeigten 13762-MAT-Zellen für mit sulfatierten Polysacchariden aus
Nichtsäugetierquellen gekuppelte Erythrozyten. Obgleich die Carrageenane-kappa und
-lambda sehr stark an 13762-MAT-Zellen banden, band eine Subpopulation
dieser Zellen (etwa 32%) konsistent nicht mit Carrageenan-lambda. Keine
Bindung von mit Pentosansulfat gekuppelten Erythrozyten konnte
nachgewiesen werden. Nur eine Subpopulation von 13762-MAT-Zellen (etwa 50%) band
recht schwach an mit Dextransulfat gekuppelte Erythrozyten.
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Die selektive Natur des Bindungsmusters von 13762-MAT-Zellen zeigt,
daß die Bindung nicht einfach auf die anionische Natur der Polysaccharide
zurückzuführen ist. Beispielsweise reagierten die Tumorzellen stark mit
den Chondroitinsulfaten und gingen keine Bindung mit Heparin, einem GAG
mit wesentlich höherer Ladungsdichte, ein. In ähnlicher Weise wurde
festgestellt, daß Hyaluronsäure, ein Molekül mit einer relativ geringen
Ladungsdichte, recht stark an 13762-MAT-Zellen haftete. Daraus kann der
Schluß gezogen werden, daß 13762-MAT-Zellen oberflächenassozuerte
Moleküle (Rezeptoren) besitzen, die bestimmte sulfatierte Polysaccharide
binden. Es gab jedoch keine positive Korrelation zwischen den
antimetastatischen Eigenschaften der Zucker und ihrer Fähigkeit zur Bindung an die
Tumorzelloberfläche (Tabellen I und III). Tatsächlich war mit Ausnahme von
Carrageenan-lambda eine negative Korrelation ersichtlich. Dies läßt
darauf schließen, daß die antimetastatische Aktivität des Großteil der
sulfatierten Polysaccharide nicht auf die Blockierung der spezifischen
Rezeptoren für sulfatierte Polysaccharide an der 13762-MAT-Zelloberfläche
zurückzuführen ist.
Antikoagulationsaktivitat der sulfatierten Polysaccharide
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Es ist bekannt, daß 13762-MAT-Zellen in vitro eine prokoagulierende
Aktivität besitzen (1), eine Eigenschaft, von der angenommen wird, daß
sie zum Metastasenbildungsvermögen von Tumorzellen beiträgt, wobei die
Wahrscheinlichkeit erhöht ist, daß diese Zellen im Mikrokreislauf eines
Organs eingeschlossen werden (6). Von den als antimetastatischen Mitteln
besonders wirksamen Zuckern wurde festgestellt, daß sie in recht
niedrigen Konzentrationen sowohl eine antikoagulierende Aktivität besitzen als
auch die prokoagulierende Aktivität der 13762-MAT-Zellen hemmen (Tabelle
IV). Trotzdem ist es bemerkenswert, daß die Korrelation zwischen der
antimetastatischen und der antikoagulierenden Aktivität nicht absolut ist.
Dextransulfat hemmte beispielsweise die Gerinnung von Plasma in
Konzentrationen von nur 1-0,5 µg/ml, was auch für Carrageenan-lambda der Fall
war (Tabelle IV), während Carrageenan-lambda im Vergleich zu
Dextransulfat eine wesentlich stärkere Wirkung bei der Verhinderung von Metastasen
hatte (Tabelle I). Außerdem wurde festgestellt, daß Dextransulfat die
Lebensfähigkeit der 13762-MAT-Zellen hemmte (Tabelle II), so daß es
wahrscheinlich ist, daß die bei diesem Zucker beobachtete 50% Verringerung
der Metastasierung dessen Toxizität wiederspiegelte. Pentosansulfat und
Arteparon zeigten gleichermaßen identische Endpunkte bei den
Antikoagulationstests, unterschieden sich aber signifikant in ihrer Wirksamkeit als
antimetastatische Mittel. Es ist bemerkenswert, daß die
Antikoagulationsund Prokoagulationstests genaue Endpunkte ergeben, da ein enger Bereich
an Zuckerkonzentrationen bei Plasma zu einer Änderung von gegebenen
Koagulationszeiten, die identisch mit den Zeiten der Kontrolle sind, zu
einem inkoagulierbaren Zustand führen kann (Daten nicht aufgeführt).
Einfluß von sulfatierten Polysacchariden auf den Stillstand von
Tumorzellen in der Lunge
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Es stellt sich die Frage, ob die sulfatierten Polysaccharide, die
die Metastasierung verringern, den Stillstand und/oder die Haftung von
Tumorzellen am Lungenendothel verhindern oder ob sie in einem späteren
Stadium im Metastasierungsprozeß wirken. Um diese Frage zu prüfen, wurde
der Einfluß von Heparin und Fucoidan auf den Stillstand von mit einem
fluoreszierenden Farbstoff (H33342) markierten 13762-MAT-Zellen in der
Lunge bestimmt. Dieser Farbstoff wurde bereits früher zur Verfolgung der
Lymphozyten-Rezirkulation verwendet und soll gemäß den Literaturangaben
weder toxisch sein, noch die Zelloberfläche modifizieren (2).
Fluoreszierend markierte 13762-MAT-Zellen (2x10&sup6;) wurden intravenös in
Kochsalzlösung oder mit Fucoidan (4 mg) oder Heparin (4 mg und 1,6 mg) injiziert.
15, 90 oder 360 Minuten nach der Injektion wurde bei den Ratten eine
Blutentnahme durch Herzpunktur durchgeführt. Sodann wurden sie getötet,
und die Lungen wurden entfernt. Die Lungen wurden gewaschen und in 5%
neutralem Formalin 20 h bei Raumtemperatur fixiert. Handschnitte des
fixierten Gewebes wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops
geringer Leistung (100x) geprüft. In sämtlichen Fällen zeigten die Zellen
eine über die gesamten Lungenflügel verteilte ungleichmäßige Verteilung
(Fig. 1a und b). Nach 15 Minuten konnte kein qualitativer Unterschied in
der Anzahl der Stillstandszellen festgestellt werden. Jedoch hatte 6
Stunden nach der Injektion die Anzahl an in der Lunge sichtbaren Zellen
wesentlich abgenommen, wenn Heparin oder Fucoidan verabreicht worden
waren (Fig. 1c und d).
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In einem anschließenden Versuch wurde der Einfluß von sulfatierten
Polysacchariden auf den Stillstand und die Positionierung von 13762-MAT-
Zellen in der Lunge innerhalb eines Zeitraums von 22 Stunden quantitativ
bestimmt. Mit H33342 markierte Tumorzellen wurden entweder mit Zucker,
Heparin (1,6 mg) oder Chondroitin-4-sulfat (4 mg) oder in RPM1-1640
allein injiziert. Zu den angegebenen Zeitpunkten (Fig. 2) wurde die Anzahl
an in den Lungen verbliebenen markierten Zellen bestimmt. Aus den zu den
jeweiligen Zeitpunkten entnommenen Blutproben gewonnenes Plasma wurde zur
Überwachung des Antikoagulationszustands der Ratten verwendet. Es wurde
festgestellt, daß 1,6 mg Heparin in signifikanter Weise bei den Tieren
eine Antikoagulation herbeiführten und die Prokoagulationsaktivität der
Tumorzellen für 3-5 Stunden hemmten. Den Ratten 5 Stunden nach der
Injektion von Heparin entnommenes Plasma zeigte ein Gerinnungsmuster, das vom
Muster bei normalem Plasma nicht unterscheidbar war. Chondroitin-4-sulfat
hatte keinen Einfluß auf den Koagulationszustand der Ratten.
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Die Ergebnisse dieses Versuchs bestätigten die qualitative
Bestimmung. Heparin verhinderte nicht den anfänglichen Stillstand der
Tumorzellen, erhöhte aber die Geschwindigkeit, mit der diese Zellen aus der Lunge
verlorengingen, so daß nach 22 Stunden nur 38% der anfänglich arretierten
Zellen nachgewiesen werden konnten. Im Gegensatz dazu hatte Chondroitin-
4-sulfat, ein Zucker ohne antikoagulierende und ohne antimetastatische
Aktivität, keinen Einfluß auf die Retention der Tumorzellen in der Lunge
(Fig. 2). Die Verdrängung von Zellen aus der Lunge, die bei Heparin und
Fucoidan beobachtet wurde, ist somit nicht einfach auf die Einführung des
sulfatierten Polysaccharids an sich zurückzuführen, sondern scheint
spezifischer zu sein. Ob die Verdrängung der Zellen auf die
antikoagulierende Wirkung der Zucker zurückzuführen ist, ist nicht klar. Jedoch
lassen die Daten darauf schließen, daß die prokoagulierende Aktivität der
13762-MAT-Zellen nur geringe Auswirkungen auf die anfänglichen Stufen der
Arretierung von Tumorzellen hat, da Heparin und Fucoidan starke
Inhibitoren der prokoagulierenden Aktivität sind (Tabelle IV).
Einfluß der Zeit der Heparinverabreichung auf dessen
antimetastatische Aktivitat
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Der Einfluß von Heparin auf die Anzahl an 13762-MAT-Zellen, die in
der Lunge verbleiben, machte sich erst 1-2 Stunden nach der Injektion
bemerkbar (Fig. 2). Somit kann argumentiert werden, daß Heparin den
metastatischen Prozeß hemmt, nachdem die Zellen in den Lungenkapillaren
plaziert sind, aber bevor eine Penetration des Gefäßendothels stattfindet.
Um den Zeitpunkt der Heparinverabreichung, der zur Verhinderung von
Metastasen am wirksamsten ist, zu ermitteln&sub1; wurde Heparin vor und nach den
Tumorzellen verabreiclit. Die sich ergebende Anzahl an Lungenläsionen
wurde aufgezeichnet.
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Heparin hemmte die Metastasenbildung am wirksamsten, wenn sich einer
intravenösen Injektion von Tumorzellen sofort eine Heparininjektion in
eine andere Schwanzvene anschloß. Jedoch konnte noch eine etwa 70%-ige
Hemmung der Metastasen erreicht werden, wenn Heparin bis 1 Stunde vor
oder 3 Stunden nach den Tumorzellen verabreicht wurde (Tabelle V). Wie
zuvor zeigten die Ratten eine signifikante Antikoagulation 3 Stunden nach
der Heparininjektion, jedoch war 6 Stunden danach ihr Koagulationszustand
auf den Zustand der Kontrolltiere mit Injektion einer Kochsalzlösung
zurückgekehrt (Daten nicht aufgeführt).
Trennung der antimetastatischen und antikoagulierenden Wirkung von
Heparin
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Aus den vorstehend aufgeführten Daten ist ersichtlich, daß eine
Antikoagulation keine vollständige Erklärung für die antimetastatische
Wirkung der sulfatierten Polysaccharide darstellt. Handelsübliche Präparate
von sulfatierten Polysacchariden sind aus einem heterogenen Satz von
Molekülen zusammengesetzt, wobei unterschiedliche Präparate des gleichen
Polysaccharids einen leicht unterschiedlichen Satz von Molekülen
aufweisen. Es ist daher möglich, daß Heparinchargen bezüglich ihrer
Wirkungsstärke als antimetastatische Mittel variieren können, jedoch identische
Antikoagulationseigenschaften besitzen. Dies wurde bestätigt.
Heparinpräparate aus zwei verschiedenen Quellen wiesen identische antikoagulierende
Eigenschaften auf, unterschieden sich aber um etwa das 10-fache in ihrer
antimetastatischen Wirkung (Tabelle VI). Die Menge an Evans Medical Ltd.-
Heparin und CSL-Heparin, die erforderlich war, um Lungenmetastasen um 50%
zu verringern, betrug 0,53 mg bzw. 0,06 mg. Diese Ergebnisse zeigen, daß
die antimetastatische Wirkung zumindest teilweise auf eine bestimmte
Heparinkomponente zurückzuführen ist, die sich von der für die
Antikoagulation erforderlichen Komponente unterscheidet.
Tabelle I
Einfluß von sulfatierten Polysacchariden auf die durch 13762-MAT-
Zellen gebildeten Metastasen
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¹ 4 mg Polysaccharid wurden pro Ratte injiziert, mit Ausnahme der
beiden Carrageenane, bei denen die Injektionsmenge 2 mg betrug.
-
² Mittelwert von 5 Wiederholungsversuchen.
-
* Signifikant unterschiedlich zur Kontrolle, bestimmt durch
Varianzanalyse und anschließendem a priori- t-Test (7). In jedem Fall p < 0,001.
Tabelle II
Einfluß von sulfatierten Polysacchariden auf die Lebensfähigkeit von
13792 -HAT-Zellen
-
13762-MAT-Zellen wurden 1 h bei 37ºC in Polysaccharid < 3,3 mg/ml für
die Carrageenane-kappa und -lambda und 6,6 mg/ml für die übrigen
Polysaccharide
in 1640-Medium inkubiert, bevor sie dem Agar zugesetzt und
ausgestrichen wurden. Für jeden Zucker wurden vier Platten angesetzt.
Tabelle III
Rezeptorstatus von 13762-HAT-Zellen für sulfatierte Polysaccharide
-
¹Die Polysaccharide wurden an Schaferythrozyten gekuppelt.
-
²13762-MAT-Zellen mit 6 oder mehr haftenden Erythrozyten stellen
eine Rosette dar. Die angegebenen Zahlenwerte stellen den
Mittelwert von drei getrennten Versuchen dar.
Tabelle IV
Einfluß von sulfatierten Polysacchariden auf den Koagulationsstatus
von Rattenplasma
-
¹Höchste Konzentration des Zuckers ohne nachweisbaren Einfluß
auf die Plasmakoagulation.
-
²Höchste Konzentration des Zuckers ohne Hemmwirkung auf die
Prokoagulationswirkung von 2x10&sup4; 13762-MAT-Zellen.
Tabelle V
Einfluß des Zeitpunkts der Heparinverabreichung auf dessen
antimetastatische Aktivität
-
¹2x10&sup5; Zellen intravenös
injiziert.
-
²Jede Ratte erhielt eine intravenöse Injektion von 1,6 mg Heparin.
-
³Mittelwert von mindestens 3 Versuchen.
Tabelle VI
Vergleich der antimetastatischen und antikoagulierenden Aktivität
von zwei Heparinchargen
-
¹Mittelwert ± Standardabweichung, berechnet aus mindestens 3
Versuchen.
-
²Höchste Konzentration von Heparin ohne nachweisbaren Einfluß auf
die Plasmakoagulation.
-
³Test der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit.
-
&sup4;Thrombinzeit-Test.
-
ND nicht bestimmt.
-
Das nachstehende Beispiel zeigt, daß sulfatierte Polysaccharide die
Tumormetastasierung durch Hemmung der von Tumorzellen abgeleiteten
Endolglycosidasen blockieren.
Beispiel 2
-
Tabelle VII zeigt Ergebnisse von Endoglycosidase-Hemmversuchen, die
belegen, daß es eine Korrelation zwischen der Endoglycosidase-Hemmwirkung
der verschiedenen sulfatierten Polysaccharide und ihrer Fähigkeit zur
Hemmung der Tumormetastasierung gibt. So stellten die fünf
Polysaccharide, die eine antimetastatische Aktivität zeigten, vergleichbare
Inhibitoren der von Tumorzellen abgeleiteten Endoglycosidasen dar. Im Gegensatz
dazu wiesen von den vier Polysacchariden, die keine Hemmung der
Tumormetastasierung bewirkten, drei keine nachweisbare
Endoglycosidase-Hemmwirkung auf und ein Polysaccharid (Carrageenan-kappa) war etwa 4- bis 7-fach
weniger wirksam in bezug auf die Hemmung von Tumor-Endoglycosidasen als
die antimetastatischen Polysaccharide.
-
Obgleich die im vorstehenden Beispiel 1 beschriebenen Versuche
darauf schließen lassen, daß die antikoagulierende Aktivität der
sulfatierten Polysaccharide eine geringe oder gar keine Rolle bei deren
antimetastatischer Aktivität spielt, ist es wichtig, einen direkteren Beweis zu
finden, daß dies tatsächlich der Fall ist. In Tabelle VIII sind die
Ergebnisse eines Versuchs zusammengestellt, bei dem Heparin durch Passage
über eine Antithrombin III-Säule in Fraktionen, die in bezug auf ihre
Antikoagulationswirkung angereichert waren, und in Fraktionen, die in bezug
auf ihre Antikoagulationswirkung verarmt waren, getrennt wurden (Heparin
übt seine antikoagulierende Wirkung durch eine Wechselwirkung mit
Antithrombin III in Plasma aus). Etwa 40% des bei diesem Versuch verwendeten
Heparinpräparats ging eine Bindung mit der Antithrombin III-Säule ein und
wurde mit 2 M NaCl eluiert (als Heparin hoher Affinität bezeichnet). Es
wurde festgestellt, daß die Heparinfraktionen mit hoher und niedriger
Affinität für Antithrombin III eine identische Endoglycosidase-Hemmwirkung
aufwiesen und eine fast identische antimetastatische Aktivität besaßen
(vergleichbar mit der von unfraktioniertem Heparin), sich aber in bezug
auf ihre antikoagulierende Aktivität um etwa das 300- bis 500-fache
unterschieden. Ein derartiges Ergebnis zeigt klar, daß die
antikoagulierende Aktivität von Heparin eine geringe oder gar keine Rolle für die
antimetastatischen Eigenschaften des Polysaccharids spielt.
-
In zusätzlichen Experimenten wurde versucht, Heparin klinisch so zu
modifizieren, daß die antikoagulierende Aktivität des Polysaccharids
zerstört wurde, aber die antimetastatische Aktivität des Moleküls erhalten
blieb. Derartige Verfahren bewirken folgendes: (i) sie beseitigen die
unerwünschten Antikoagulationseigenschaften von Heparin, wenn dieses
klinisch als antimetastatischer und entzündungshemmender Arzneistoff
verwendet wird, und (ii) im Gegensatz zu einer Antithrombin III-Fraktionierung
liefern sie einen wirtschaftlich leistungsfähigen Weg zur Herstellung
eines wirksamen Arzneistoffs. Die Ergebnisse mit zwei chemisch
modifizierten Präparaten von Heparin, die praktisch frei von antikoagulierender
Aktivität waren, sind in Tabelle IX zusammengestellt. Beide Präparate
wiesen eine erhebliche antimetastatische Aktivität auf, obgleich sie
weniger wirksam als unmodifiziertes Heparin waren.
Tabelle VII
Fähigkeit von verschiedenen sulfatierten Polysacchariden zur Hemmung
von Endoglycosidasen aus Tumorzellen
-
¹Polysaccharidkonzentration&sub1; die zur Erzielung einer 50%-igen
Hemmung des Abbaus der extrazellulären Matrix (³&sup5;SO&sub4;-markiert) von
Endothelzellen durch 13762-MAT-Zellen erforderlich war.
Tabelle VIII
Biologische Aktivität von Heparinfraktionen mit hoher und geringer
Affinität für Antithrombin III
-
¹Höchste Polysaccharidkonzentration ohne nachweisbaren Einfluß auf
die Plasmakoagulation. APTT: Test der aktivierten, partiellen
Thromboplastinzeit, TT: Test der Thrombinzeit.
-
²Polysaccharidkonzentration, die eine 50%-ige Hemmung des Abbaus
der extrazellulären Matrix von Endothelzellen durch 13762-MAT-
Zellen
bewirkt.
-
³2x10&sup5; MAT-Zellen wurden intravenös jeder Ratte mit 2 mg der
jeweiligen Heparinfraktion injiziert. Die Anzahl der
Lungenmetastasen wurde 12 Tage später quantitativ ermittelt.
-
&sup4;Heparin wurde in Fraktionen mit hoher und geringer Affinität für
Antithrombin III fraktioniert, indem man eine Passage über eine
mit Antithrombin III gekuppelte Säule durchführte.
Herstellung von chemisch modifizierten Heparinen
-
Heparin wurde gemäß dem Verfahren von Fransson (9) mit Periodat
oxidiert und mit Kaliumborhydrid reduziert. Heparin (10 mg/ml, Rinderlunge)
in 50 mM Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt an 40 mM
Natriumperiodat wurde im Dunkeln 20 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die
Reaktion wurde durch Zugabe von D-Mannit (5 mg/ml) beendet. Niedermolekulare
Reaktionsprodukte wurden durch Dialyse gegen destilliertes Wasser
entfernt. Das oxidierte Heparin wurde sodann durch Zugabe von 20 mg/ml KBH&sub4;
reduziert und 3 Stunden bei 20ºC inkubiert. Überschüssiges Borhydrid
wurde durch Zugabe von 20 µl/ml Eisessig zersetzt. Das oxidierte und
reduzierte Heparin wurde 2 mal bei 4ºC durch Zugabe von 2 Volumenteilen
Ethanol gefällt und schließlich in 0,15 M NaCl erneut in Lösung gebracht.
-
N-desulfatiertes Heparin wurde durch 90-minütiges Erwärmen des
Materials in 0,04 M HCl auf 100ºC hergestellt. N-acetyliertes Heparin wurde
durch Behandlung von N-desulfatiertem Heparin mit Essigsäureanhydrid
gemäß den Literaturangaben (10) erhalten.
Tabelle IX
Antimetastatische Aktivität von chemisch modifizierten Heparinen mit
vernachlässigbarer Antikoagulationsaktivität
-
¹Chemisch modifizierte Heparine zeigten < 0,1% der
Antikoagulationsaktivität von unmodifiziertem Heparin.
-
²Metastasenexperiment wie in Tabelle VIII.
Literatur
-
1. BADENOCH-JONES, P. and RAMSHAW, I.A., Aust.
J. Exp. Biol.Med.Sci, 63, 91-98 (1985).
-
2. BRENAN, M., and PARISH, C.R.
J.Immunol.Meth., 74, 31-38 (1984).
-
3. PARISH, C.R. and SNOWDEN, J.M. Cell
Immunol., 91, 201-214 (1985).
-
4. RAMSHAW, I.A., CARLSEN, S., WANG, H.C., and
BADENOCH-JONES, p. Int.J.Cancer. 32, 471-478
(1983).
-
5. REID, L.C.M., Cloning. In: Jakoby, W.B.,
and Pastan, I.G. (eds). Methods of
Enzymology. Vol LVIII, pp 152-164, Academic
Press, New York (1979).
-
6. RICKLES, F.R. and EDWARDS, R.L. Blood, 62,
14-31 (1983).
-
7. SOKAL, R.R. and ROHLF, F.J. Biometry.
W.H.Freman and Co., San Francisco, p.770
(1969).
-
8. WELCH, D.R., NERY, A., and NICOLSON, G.L.
Invas. Metast. 3, 65-80 (1983).
-
9. FRANSSON, L-A. Carbohydr. Res. 62, 235-244
(1978).
-
10. LEVVY, G.A. and McALLAN, A. Biochem. J. 73,
127-133 (1959).