DE60112807T2

DE60112807T2 - Zusammensetzung zur behandlung von durch arterielle irrigationsdefekt gewebeschäden

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Publication number: DE60112807T2
Application number: DE60112807T
Authority: DE
Inventors: Jorge Playa BERLANGA ACOSTA; Gerardo E. Guillen Nieto; Diana Garcia Del Barco Herrera; Julio Raul Fernandez Masso; Mario Pablo Estrada Garcia; Isabel Guillen Perez; Jose Suarez Alba; Rebeca Martinez Rodriguez
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 2001-01-03
Filing date: 2001-12-17
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2021-12-18
Also published as: CN1407899A; CA2789161A1; JP4181875B2; EA200200850A1; CA2398983A1; AU2002216897A1; KR100839857B1; WO2002053167A2; JP2008231121A; AR032217A1; MY129079A; EA007466B1; BRPI0108882B1; EP1354597A2; ZA200206954B; HK1053428A1; EP1354597B1; ATE302017T1; EA200500646A1; MXPA02008667A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Arzneimittel für Menschen und besonders mit einer pharmazeutischen Kombination aus epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und einem die Sekretion des Wachstumshormons anregenden Hexapeptid (GHRP); welches zur Verhinderung von Gewebeschädigungen aufgrund von Unterdrückung des Blutflusses und zur Verbesserung von Gewebereparatur nach ischämischen Schädigungen nützlich ist.
Alle Organe im Tierkörper sind anfällig für tödliche irreversible Gewebeschädigungen nach einem teilweisen oder vollständigen Entzug des Blutflusses der Arterien, oder aufgrund von Versagen von venöser Drainage. In diesen Szenarien ist Zelltod die Nachwirkung einer fortschreitenden Kaskade pathophysiologischer Veränderungen, welche letztendlich sachgemäße Multi-Organ-Funktion und das Überleben des Einzelnen bedrohen.
Übermäßige ROS-Erzeugung ist eine wesentliche pathologische Folge unzähliger Prozesse, die mit Hypoperfusion des Gewebes, Ischämie/Reperfusion und Entzündung (Peritonitis, Bauchspeicheldrüsenentzündung, usw.) in Zusammenhang stehen. Hypoperfusion des Gewebes und ROS-Überproduktion sind auch mit großen chirurgischen Eingriffen, Revaskularisationschirurgie, ausgedehnten Verbrennungen und multiplen Traumata verbunden. Peroxidation von Membranlipiden durch einen ROS-Angriff ist für den Zelltod bei vielen pathologischen Zuständen verantwortlich (T. D. Lucas und I. L. Szweda. Cardiac reperfusion injury. Aging, lipid peroxidation and mitochondrial dysfunction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95 (2): 510–514).
Die Entleerung der zellulären ATP-Vorräte ist die akuteste und die bedrohlichste Folge von Ischämie (Burns TA, Davies RD, McLaren JA, Cerundolo L, Morris JP, Fuggle VS. Apoptosis in ischemia/reperfusion injury of human renal allografts. Transplantation, 1998, 66 (7): 872–876). Während des ischämischen Prozesses werden ATP-Vorräte zu Hypoxanthin und Xanthin abgebaut, wobei beide als Substrate für das Enzym Xanthinoxidase (XO) wirken. Die große Verfügbarkeit ankommenden molekularen Sauerstoffs während des Reperfusionszeitraums führt zur Oxidation von Purinen über die XO-Aktivierung, was zur Erzeugung von Superoxidanionen und Hydrogenperoxid führt (Paller MS, Hoidall JR, Ferris JE. Oxygen free radicals in ischaemic acute renal failure in the rat. J. Clin. Invest., 1994, 74: 1156–1164).
Während der Ischämie-/Reperfusionszeiträume kombinieren sich die ROS-Erzeugung und das mikrovaskulare Versagen, um als Teufelskreis zu wirken, bei dem die Rekrutierung/Adhäsion von aktivierten Endothelzellen und zirkulierenden Leukozyten die territoriale Gewebeperfusion und somit die zelluläre Hypoxie weiter erhöhen (Redl H, Gasser H, Hallstrom S, Schlag G. Radical related cell injury. In Pathobiology of shock, sepsis and organ failure. G. Schlag, H. Redl, Hrsg. Springer-Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1993, 92–110); (Ledebur HC, Parks TP. Transcriptional regulation of the intercellular adhesion molecule 1 gene by inflammatory cytokines in human endothelial cells: essential roles of a variant NF-kB site and p65 homodimers. J. Biol. Chem., 1995, 270: 933–943).
ROS kann NF-kB in durch Entzündungszellen infiltrierten Geweben aktivieren (Conner EM, Brand SJ, Davis JM, Kang DY, Grisham MB. Role of reactive metabolites of oxygen and nitrogen in inflammatory bowel disease: toxins, mediators, and modulators of gene expression. Inflamm. Bowel Dis., 1996, 2: 133–147), wohingegen das Myeloperoxidase(MPO)-Enzymsystem in Polymorphonuklearzellen, die hypoxisches Gewebe infiltrieren, aktiviert wird, was die Kaskade der Gewebeschädigung weiter amplifiziert (Kurose I, Argenbright LW, Wolf R, Lianxi L, Granger DN. Ischaemia/reperfusion-induced microvascular dysfunction: role of oxidants and lipid mediators. Am. J. Physiol., 1997, 272: H2976–H2982). In dieser feindseligen Umgebung werden lokale thrombogene Mechanismen aktiviert, was zur Kapillarverstopfung und territorialen Erweiterung der Hypoxie führt. Als Folge dieser Kaskade schließt sich Zelltod durch Nekrose und/oder Apoptose an, was die Lebensfähigkeit eines Organs gefährden kann (Tredger MJ. Ischaemia-reperfusion injury of the liver: treatment in theory and practice. Biofactors, 1998, 8 (1–2): 161–164). Die Reaktivität der Endothel-/Entzündungszellen erbringt eine große Zahl an chemisch löslichen Vermittlern, wie zum Beispiel Stickstoffoxid, proentzündliche Cytokine, Prokoagulantien und vasoaktive Mittel, die das Syndrom der systemischen entzündlichen Reaktion (SIRS) auslösen können, falls der Körper nicht in der Lage ist, seiner Immun-Unstimmigkeit entgegenzuwirken (Kowal-Vem A, McGill V, Gamelli RL. Ischemic necrotic bowel disease in thermal injury. Archives of Surgery, 1997, 132 (4): 440–443).
Größere Verbrennungen sind medizinische Notfälle, die intensive und mehrfache medizinische Anstrengungen erfordern, um das Leben des Patienten zu retten. In Patienten mit Verbrennungen scheint Hypoperfusion/Ischämie der Gedärme eine entscheidende Rolle beim Instrumentieren des SRIS zu spielen (Wang P, Ba ZF, Cioffi WG, Bland KI und Chaudry IH. Is gut the "motor" for producing hepatocellular dysfunction after trauma and hemorrhagic shock? Journal of Surgical Research, 1998, 74: 141–148). Das Versagen der Darmschranke ist von höchster klinischer Relevanz, da das Epithel der Gedärme als Grenze zwischen einem septischen/toxischen Lumen und einer sterilen inneren Umgebung wirkt (Sheridan RL, Ryan CM, Yin LM, Hurley J, Tompkins RG. Death in the burn unit. Sterile multiple organ failure. Burns, 1998, 24 (4): 307–311).
In dieser Beziehung kommen sich sowohl experimentelle als auch klinische Befunde näher, um die Wichtigkeit einer adäquaten Darmperfusion während systemischem Stress zu zeigen, um die Integrität der Schranke zu erhalten (Tabata T, de Serres S, Meyer AA. Differences in IgM synthesis to gut bacterial peptidoglycan polysaccharide after burn injury and gut ischemia. Journal of Bum Care and Rehabilitation, 1996, 17 (3): 231–236). Des Weiteren zeigen neue Hinweise ebenfalls an, dass das Darmgewebe als eine pro-entzündliche, Cytokin-erzeugende Quelle wirkt, wenn mit dem Darm verbundenes lymphoides Gewebe durch Ischämie aktiviert wird. MOF ist eine primäre Todesursache bei Patienten, die unter Bedingungen der Intensivpflege aufgenommen werden, und ist die häufigste Komplikation bei Brandopfern, wobei bis zu 70 % der Patienten in hoch spezialisierten Behandlungseinheiten für Verbrennungen einbezogen sind.
Um die Folgen des Ischämie-/Reperfusions-Prozesses in bestimmten Organen abzuschwächen, ist eine große Zahl synthetischer oder natürlicher Verbindungen vorklinisch oder klinisch geprüft worden. Für den Fall der intestinalen Ischämie wurden Angiotensin II Inhibitoren experimentell bewertet (Tadros T, Taber DL, Heggers JP, Herndon DN. Angiotensin II inhibitor DuP753 attenuates burn and endotoxin-induced gut ischemia, lipid peroxidation, mucosal permeability and bacterial translocation. Ann. Surg., 2000, 231: 566–576). Inhibitoren des Plättchen-aktivierenden Faktors (Sun Z, Wang X, Deng X, Lasson A, Soltesz V, Borjesson A, Andersson R. Beneficial effects of lexipafant, a PAF antagonist on gut barrier dysfunction caused by intestinal ischemia and reperfusion in rats. Dig. Surg., 2000, 17: 57–65) und Verbesserer der Stickstoffoxidfreisetzung wurden ebenfalls untersucht (Ward DT, Lawson SA, Gallagher CM, Conner WC, Shea-Donohue DT. Sustained nitric oxide production via L-arginine administration ameliorates effects of intestinal ischemia-reperfusion. J. Surg. Res., 2000; 89: 13–19). Andere Ansätze schließen eine Therapie mit einem Antioxidans, wie zum Beispiel Allopurinol allein oder in Kombination mit den Vitaminen C und E ein (Kacmaz M, Otzurk HS, Karaayvaz M, Guven C, Durak I. Enzymatic antioxidant defense mechanism in rat intestinal tissue is changed after ischemia-reperfusion. Effects of allopurinol plus antioxidant combination. Can. J. Surg, 1999, 42: 427–431).
Ungeachtet dessen sind Anstrengungen, die vorangetrieben werden, um natürliche Abwehrmechanismen auszulösen, selten (Pialli SB, Hinmn CE, Luquette MH, Nowicki PT, Besner GE. Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor protects rat intestine from ischemia/reperfusion injury. J. Surg. Res.1999, 87: 225–231).
Nierentod nach Ischämie/Reperfusion hat die Suche nach nierenschützenden Mitteln angetrieben, einschließlich der Erzeugung der sogenannten Lazaroide, von denen gezeigt wurde, dass sie der ischämischen Niere globalen Schutz verleihen (De Vecchi E, Lubatti L, Beretta C, Ferrero S, Rinaldi P, Galli K M, Trazzi R, Paroni R. Protection from renal ischemia-reperfusion injury by the 2-methylaminochroman U83836. Kidney. Int., 1998, 54: 857–863). Andere Untersuchungen dokumentieren die heilsamen Wirkungen von Theophyllin beim Schutz der Niere, hauptsächlich als Antagonist für Adenosinrezeptoren (Jenik AG, Ceriani JM, Gorenstein A, Ramirez JA, Vain N, Armadans M, Ferraris JR. Randomized, double-blind, placebo-controlled trial of the effect of theophylline on renal function in term neonates with perinatal asphyxia. Pediatrics, 2000, 105: E45).
Verabreichung des atrialen natriuretischen Peptids (Auriculin) zeigte keine Verringerung der Mortalität in Patienten, die von akutem Nierenversagen betroffen sind. Komplikationen entfernter Organe wurden auch nicht verringert (Weisberg LS, Allgren RL, Genter FC, Kurnik BR. Cause of acute tubular necrosis affects its prognosis. The Auriculin Anaritide Acute Renal Failure Study Group. Arch. Intern. Med., 1997; 157: 1833–1839). Ein Schutz der Niere ist dem Enzym Superoxiddismutase (SOD) zugeschrieben worden, wenn es auf hohen Dosierungsniveaus bei Patienten, die sich einer chirurgischen Nierentransplantation unterziehen, injiziert wird (Schneeberger H, Schleibner S, Illner WD, Messmer K, Land W. The impact of free-radical mediated reperfusion injury on acute und chronic rejection events following cadaveric renal transplantation. Clin. Transpl., 1993, 219–232).
Die Vorteile von EGF und TGF-alpha bei der Linderung von toxischem und ischämischem akuten Nierenversagen werden in US-Patent Nr. 5.360.790 gezeigt. Obwohl die parenterale Verabreichung einiger Wachstumsfaktoren, die nierenschützende Wirkungen aufweisen, sich als bei experimentellen Modellen wirksam erwiesen hat, sind die klinischen Ergebnisse bis jetzt entmutigend. Ein kontrollierter klinischer Multicenter-Test zeigte nicht die erwarteten Vorteile von IGF-I bei Patienten mit akutem Nierenversagen, verglichen mit Plazebo-Gegenspielern (Hirschberg R, Kopple J, Lipsett P, Benjamin E, Minei J, Albertson T, Munger M, Meztler M, Zaloga G, Murray M, Lowry S, et al. Multicenter clinical trial of recombinant human insulin-like growth factor I in patients with acute renal failure. Kidney Int., 1999, 55: 2423–2432). In einem weiteren klinischen Test, bei dem IGF-1 bei akutem Nierenversagen eingesetzt wurde, wurde das Fehlen einer Wirkung bestätigt (Kopple JD, Hirschberg R, Guler HP, Pike M und Chiron Study Group: Lack of effect of recombinant human insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in patients with acute renal failure (ARF). J. Am. Soc. Nephrol., 1996, 7: 1375).
Die seltenen Fortschritte bei der Organerhaltungstechnologie, die bisher ereicht wurden, bleiben als die wichtigste Beschränkung der Verfügbarkeit neuer Organe zur Transplantation bestehen. Des Weiteren haben ex vivo Konservierungsmittel widersprüchliche Wirkungen erzielt (Schlumpf-R, Candinas-D, Weber-M, Rothlin-M, Largiader-F. Preservation of kidney transplants with a modified UW solution initial clinical results. Swiss-Surg., 1995 (4): 175–80, Diskussion 180–1); und die biochemische und funktionelle Verschlechterung des Organs nach der Implantation in den Empfänger bleibt als die primäre Ursache für eine nicht durch die Immunabwehr hervorgerufene Abstoßungsreaktion bestehen (Barber E, Menéndez S, León OS, Barber MO, Merino N, Calunga JL, Cruz E, und Bocci V. Prevention of renal injury after induction of ozone tolerance in rats submitted to warm ischemia. Mediators of Inflammation, 1999, 8: 37–41). Eine bedauerliche Wirkung, die von einigen Konservierungsmitteln berichtet wurde, ist ihre Wechselwirkung mit dem Mechanismus zur Plättchenaggregation, was somit zu starker Blutung führt (Salat A, Mueller MR, Boehm D, Stangl P, Pulaki S, Laengle F. Influence of UW solution on in vitro platelet aggregability. Transpl-Int., 1996, 9 Erg. 1: S. 429–431). Vasospasmus und Thrombose im post-reperfundierten Organ gehören zu den berichteten Unannehmlichkeiten (Jeng-LB; Lin-PJ; Yao-PC; Chen-MF; Tsai-KT; Chang-CH. Impaired endotheliumdependent relaxation of human hepatic arteries after preservation with the University of Wisconsin solution. Arch-Surg., 1997 Jan., 132 (1): 7–12). Die medizinische Gemeinschaft erwartet noch immer effizientere und preiswertere Organerhaltungslösungen (Rentsch M, Post S, Palma P, Gonzalez AP, Menger MD, Messmer K. Intravital studies on beneficial effects of warm Ringer's lactate rinse in liver transplantation. Transpl. Int., 1996, 9 (5): 461–7). Das Versagen von IGF-I beim Erreichen einer effizienten nierenschützenden Wirkung am klinischen Schauplatz hat die Vorstellung eingeführt, dass die Behandlung mit einem einzigen Wachstumsfaktor nicht ausreicht, um das Überleben der Zellen während der Ischämie/Reperfusion zu stimulieren, und dass Cocktails aus Wachstumsfaktoren wirksamer sein werden (Playford RJ. Peptides and gastrointestinal mucosa integrity. Gut, 1995, 37: 595–597).
Die heilsamen Wirkungen des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) beim Schützen vor Organschädigungen während Episoden von Ischämie/Reperfusion wurden durch das Europäische Patent EP 0 357 240 B1 beansprucht. Allerdings wird zerebraler Schutz nur mit sehr hohen EGF-Konzentrationen (1 mg/kg) erreicht. Eine niedrigere Dosis von 0,1 mg/kg zeigte nur eine bescheidene schützende Wirkung, ungeachtet dessen, dass die Dosis für einen Stoff wie einen Wachstumsfaktor noch immer hoch ist. Diese Tatsachen zwingen der Erfindung Beschränkungen auf, die erste ist auf die hohen Behandlungskosten bezogen, da wiederholte Injektionen (4 bis 5) erforderlich sind, um eine Wirkung beim Tier zu erreichen. Als Beispiel würde eine 70-kg schwere menschliche Person 70 mg EGF in einer einzigen Injektion erfordern, die periodisch wiederholt werden muss, um eine klinische Wirkung sicherzustellen. Die zweite Beschränkung ist pharmakologisch. Die gezeigten Beispiele im Patent legen nahe, dass es ein sehr enges therapeutisches Fenster gibt, das die Möglichkeit des Etablierens einer Effektivdosis 50 (ED₅₀) und einer Dosis-Wirkungs-Kurve behindert. Eine dritte Beschränkung ist mit den hohen EGF-Dosen verbunden. Es bestehen Berichte, die zeigen, dass EGF in Ratten und Affen die Herzleistung und den Arteriendruck vermindern kann (Keiser JA, Ryan NJ. Hemodynamic effect of EGF in conscious rats und monkeys. PNAS USA 1996, 93 (10): 4957–4961). Auch der normale Zellzyklusfortgang kann durch hohe EGF-Konzentrationen gestört werden (Bennett NT, Schultz GS. Growth factors and wound healing: Biochemical properties of growth factors and their receptors. Am. J. Surg., 1993, 165: 728–737). Die möglichen Vorteile einer EGF-Intervention, um die Leber und den Darm gegen Ischämie/Reperfusion zu schützen, scheinen eine Erläuterung zu erwarten. Immer mehr Hinweise zeigen an, dass die parenterale Verabreichung von EGF einer Vielfalt von internen Epithelorganen nach Unterdrückung des akuten Blutflusses Schutz zu verleihen scheint. Unter experimentellen Bedingungen erwies sich die EGF-Intervention bei Tieren, die Chemikalien ausgesetzt wurden, die die ATP-Synthese blockieren oder die Geschwindigkeit der EROs-Erzeugung erhöhen, durch das Verringern von Organschädigungen nützlich. Des Weiteren sind wiederholte EGF-Verabreichungen bei der Verbesserung der Geweberegeneration, -adaptation und -funktionalität behilflich. All diese Vorteile der EGF-Therapie können nur unter wiederholten Verabreichungsschemen und hohen Konzentrationen des Polypeptids erreicht werden. Häufig sind diese Vorteile bescheiden, was ferner die Vorstellung stärkt, dass eine Kombinationstherapie von Wachstumsfaktoren eher vorzuziehen ist.
Im Rahmen der Ischämie scheint EGF Gewebeschädigung abzuschwächen, falls die Ischämiezeit weniger als 60 Minuten beträgt. Bei längeren Ischämiezeiträumen ist eine EGF-Therapie wertlos. Dies ist eine offensichtliche Beschränkung für die EGF-Therapie, da ein Schutz für längere Ischämiezeiträume in der chirurgischen Praktik erfordert wird.
Obwohl der Bedarf einer Wachstumsfaktorkombination nachdrücklich für einen großen Zeitraum beansprucht worden ist, gibt es keine im klinischen Rüstzeug erhältliche Kombination.
Die Neuheit der vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzung wird durch die pharmakologische Synergie gegeben, die durch die Kombination des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) und eines die Sekretion des Wachstumshormons anregendes Peptids (sechs) (GHRP-6) dargelegt wird. Diese Kombination verbessert die zelluläre Lebensfähigkeit in Organen oder Geweben, die einer teilweisen oder vollständigen Unterdrückung der Blutversorgung für einen Zeitraum von Minuten bis Stunden unterzogen worden sind. Diese Kombination verringert oder verhindert die Erzeugung von EROs ebenso wie anderer toxi scher Metaboliten in hypoxischen oder anoxischen Organen, was das Überleben von Zellen während Ischämiezeiträumen stimuliert. Die Kombination dieser beiden Peptide übt eine starke synergistische Wirkung bei der Verbesserung der Organadaptation aus; d. h. intestinale Adaptation nach ausgedehnten Traumata und der Reparaturprozess.
Mittels einer prophylaktischen vorbehandelnden Intervention lässt die Kombination der Peptide die Aktivierung von zellulären Selbstverteidigungsmechanismen zu, wodurch die Toleranz der Zellen für cytotoxische Mittel oder Stresszustände erhöht wird. Somit verwandelt diese Kombination etwas, das sonst unter gewöhnlichen Bedingungen tödlich ist, durch zelluläres Vorbehandeln in etwas nicht tödliches. Dies lässt die Einsetzbarkeit dieser Kombination bei Organen oder Organismen zu, die kritischen und bedrohlichen Zuständen, wie Ischämie, Zustände mit schwachem Blutfluss, Schock, hämodynamischem Versagen usw. unterzogen wurden. Neben den schützenden Wirkungen der Kombination verbessert sie die Gewebe-Reparatur, -Regeneration und funktionelle -Adaptation nach Traumata. Personen, die ausgedehnte Verbrennungsverletzungen, multiple Traumata oder Schock aufweisen, sind davon abhängig, die Kombination so bald wie möglich zu erhalten, um die in Gang befindliche Kaskade der inneren Organschädigungen abzuschwächen, um den Beginn von Multi-Organ-Versagen zu verhindern oder zu verzögern. Personen, die für größere oder verlängerte chirurgische Eingriffe, Unterstützung des Kreislaufs mit einem Gerät ausserhalb des Körpers, usw. gewählt sind, müssen die vorliegende Kombination erhalten, um die Risiken für Schädigungen der Eingeweide und anderer innerer Organe zu lindern, sowie um das Syndrom der systemischen entzündlichen Reaktion abzuschwächen. Die Kombination ist ebenso zum Abschwächen von Organ-/Gewebeschädigungen, die mit Thrombose und Embolie verbunden sind, einsetzbar, sobald die geeignete thrombolytische Therapie etabliert ist.
Aufgrund der synergistischen Wirkung der Peptide in Bezug auf trophische/regenerative Wirkungen ist diese Kombination nützlich, um die intestinale Adaptation in Patienten mit verkürztem Darm zu beschleunigen. Die Regeneration der hepatischen Masse und des Nierentubulussystems können auch durch die Kombination stimuliert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung kombiniert eine pharmazeutische Zusammensetzung in einem einzigen Produkt EGF und GHRP-6, die eine starke zellschützende Wirkung auf Gewebe und Organe, die hypoxischen oder anoxischen Ereignissen ausgesetzt sind, ausüben. Die Kombination erreicht Zellschutz durch unterschiedliche Mechanismen, die nach einer einzigen vorbehandelnden Dosierung hochreguliert werden. Die Kombination kann mit jeder therapeutischen Antioxidans- Standardmodalität verbunden werden.
Andererseits erfordert die therapeutische Verabreichung der Kombination wiederholte Verabreichungen, wenn beabsichtigt ist, die Geweberegeneration zu stimulieren. Das EGF, auf das sich hier bezogen wird, umfasst EGF aus natürlichem, synthetischem oder rekombinantem Ursprung. Das die Sekretion anregende Peptid, auf das sich hier bezogen wird, ist das Hexapeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz: His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂. Es wird als GHRP-6 bezeichnet als Abkürzung für Wachstumshormon freisetzendes Peptid.
Die Kombination bezeichnet auch die unabhängige Verabreichung beider Peptide an ein einzelnes Individuum, jedoch innerhalb eines einzigen therapeutischen Schemas.
Wenn die Kombination prophylaktisch eingesetzt wird, um ischämische Gewebeschädigung zu verhindern, liegt die EGF-Konzentration in der pharmazeutischen Kombination zwischen 0,5 und 50 μg/ml, ohne Rücksicht auf ihr Vorliegen als gefriergetrocknetes Salz oder Lösung. Die Konzentration von GHRP-6 kann von 2–100 μg/ml im gleichen Träger reichen. Dosierungsbereiche von 0,5 und 1 μg/kg werden sowohl für EGF als auch GHRP-6 für prophylaktische Ziele empfohlen.
Die Kombination muss als Bolus verabreicht werden. Verabreichungswege können periphere oder tiefe Venen, intra-arteriell und/oder intraperitoneal einbeziehen. Für die Verabreichungen zu verwendende Träger schließen ein: normale Kochsalzlösung, Ringer-Lactat-Lösung, menschliches Plasma, menschliche Albuminlösung, 5 % Dextrose oder Gemische davon.
Um die höchste Wirksamkeit der Therapie sicherzustellen, sollte die erste Verabreichung so bald wie möglich getätigt werden, sobald Ischämie diagnostiziert wird, vermutet wird oder wenn sie durch einen chirurgischen Eingriff geschaffen wird. Für Patienten, die unter ausgeprägter Verbrennung, multiplen Traumata, Schock usw. leiden, sollte die Behandlung ungeachtet der Abwesenheit einer klinischen oder Komplementärindikation von Ischämie der Eingeweide als prophylaktische Intervention initiiert werden. Patienten, die unter nicht septischer Bauchspeicheldrüsenentzündung leiden, sind ebenfalls von der Behandlung unter den vorstehenden Vorgaben abhängig.
Ein prophylaktisches Verabreichungsschema kann gemäß dem Schweregrad des klinischen Bilds und/oder des Ausmaßes der Aggression, die dem Ermessen eines Fachmanns unterliegt, schwanken. Die Bolusverabreichung kann alle 6 Stunden wiederholt werden, um vier Verabreichungen pro Tag abzuschließen. Es ist notwendig, einen Zeitabstand von 6 Stunden zwischen jedem Einsatz einzuhalten: Die Kombination der Peptide kann unter Verwendung von technologischen Vorrichtungen zur langsamen Freisetzung verabreicht werden. Die Kombination der Produkte muss, falls sie gefriergetrocknet ist, vor der Verwendung resuspendiert werden.
Wie zuvor beschrieben, müssen die Behandlungen, wenn die Kombination für therapeutische Ziele bestimmt ist, was bedeutet, dass ihre Verwendung dazu bestimmt ist, Regeneration und Adaptation zu stimulieren, vorzugsweise über Systeme zur langsamen Freisetzung oder durch alternative Mittel verabreicht werden, um ein Gleichgewicht der Phasen in den zwei Kompartimenten sicherzustellen. Bolusinfusionen sind zur Stimulierung der Geweberegeneration nicht wirksam. Falls venöse Wege verwendet werden, muss der Verabreichungszeitraum mindestens etwa 4 Stunden lang kalibriert werden. Mehr als zwei Verabreichungen können in einem Zeitraum von 24 Stunden durchgeführt werden, falls ein Clearance-Zeitraum von mindestens 8 Stunden zwischen den Behandlungen liegt. Empfohlene Dosen für beide Peptide zur Regeneration sind 0,01 μg/kg/h bis zu 5 μg/kg/h. Diese Verabreichungs- und Dosierungsschemen lassen zu, Gewebeschädigungen aufgrund von Ischämie, bei denen Nekrose und/oder Apoptose einbezogen sind, wiederherzustellen. Wenn Gewebe kurzen Ischämiezeiträumen ausgesetzt werden, unterbricht das Verabreichen der Kombination weitere Komplikationen. Die Verwendung der Kombination wird nach chirurgischer Transplantation zur Verbesserung des anastomotischen Heilens, der Geweberegeneration und Readaptation des implantierten Organs empfohlen.
Wiederholte Verabreichungen der Kombination werden ebenfalls empfohlen, um das Syndrom des kurzen Darms und das akute Darmversagen nach großen darmchirurgischen Eingriffen zu behandeln.
BEISPIELE
Beispiel 1. Zellschützende Wirkung des die Sekretion des Wachstumshormons anregenden Hexapeptids (GHRP-6) an einem Tiermodell für akute Magenschädigung durch Stress.
Erwachsene, männliche OF-1 Mäuse (20–23 g) wurden zufällig eingeteilt, GHRP-6 (0,1 μg/Tier) oder normale Kochsalzlösung 0,9 % (beide i. p.) zu erhalten. Zehn bis dreißig Minuten später wurden die Tiere dazu gezwungen, 30 Minuten lang in kaltem Wasser zu schwimmen und später für einen Zeitraum von 20 Minuten bei 4 °C festgehalten. Die Tiere wurden danach betäubt und für die Prüfung der Magenschleimhaut getötet. Die Proben wurden mit 10 % gepuffertem Formalin fixiert und mit H&E und PAS zur mikroskopischen Untersuchung gefärbt. Erosion, Hämorrhagie und Geschwürbildung waren die groben Pathologiekriterien, die im Experiment in Betracht gezogen wurden (Playford RJ. Peptides and gastrointestinal mucosa integrity. Gut 1995, 37: 595–597). Mikroskopische Geschwürbildung wurde nur in Betracht gezogen, wenn mehr als das erste Drittel der Schleimhaut drüsen einbezogen war. Luminale Blutung wurde durch das Messen von Hämoglobin durch die Cyan-Methämoglobin-Methode (Reactivos Spinreact, Barcelona) untersucht. Die Daten werden in g/dl ausgedrückt. Alle Bestimmungen wurden blind unter Verwendung eines Scheincodes getätigt.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, verringerte GHRP-6 die Intensität der Schleimhautschädigung als Zahl der Geschwüre auf der Parietalschleimhaut signifikant.
Tabelle 1
Eine Gesamtzahl von 20 Mäusen wurde für jede Gruppe verwendet.

*p < 0,01 etabliert für den zweiseitigen t-Test. Signifikanzniveau von p < 0,05.

Dieses Experiment demonstriert die zellschützende Wirkung von GHRP-6, ausgedrückt auf der Magenschleimhaut von Tieren, die einem schwerwiegendem systemischen Stress ausgesetzt sind. Ischämie/Reperfusion der Magenschleimhaut ist mit der Pathophysiologie dieses akuten Schädigungsmodells in Zusammenhang gebracht worden.
Beispiel 2. Schütrende Wirkung der prophylaktischen Verabreichung von EGF und GHRP-6 an einem Tiermodell für Ischämie/Reperfusion der Niere.
Experimentelle Gestaltung:
Die möglichen nierenschützenden Wirkungen jedes dieser Peptide allein oder in Kombination wurden an einem Rattenmodell für bilaterale Ischämie/Reperfusion der Niere untersucht. In einem Test der ersten Phase wurde ein Ischämiezeitraum von 1 Stunde, gefolgt von einem Repertusionszeitraum von 3 Stunden etabliert. Weibliche Wistar Ratten (200–220 g) wurden zufällig in die folgenden experimentellen Gruppen (N = 10) eingeteilt:
Gruppe I: Scheinischämisch.
Gruppe II: Ischämisch und normale 0,9 % Kochsalzlösung.
Gruppe III: Ischämisch und EGF – 20 μg/Ratte.
Gruppe IV: Ischämisch und GHRP-6–50 μg/Ratte.
Gruppe V: Kombination aus EGF (5 μg) und GHRP-6 (10 μg).
Alle Behandlungen wurden 30 Minuten vor der Ischämie intraperitoneal verabreicht.
Ischämiemodell
Nierenarterien wurden mit mikrovaskularen Klemmen 60 Minuten lang abgeklemmt (Moria, Fine Science Tools, USA). Nachdem die Tiere 3 Stunden Reperfusion abgeschlossen hatten, wurden sie weitere 30 Minuten lang überwacht, um das Funktionieren der Niere zu etablieren.
Funktionieren der Nieren
Die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) und der renale Plasmafluss (RPF) wurden unter Verwendung von Molekulargewichtsmarkern wie Inulin und p-Aminohippursäure untersucht. Der Clearance-Koeffizient wurde wie folgt bestimmt: C = Uv(m) × [PM]u/[PM]p

Uv(m):: maximales Urinvolumen pro Minute.

[PM]u und [PM]p stellen Plasma- und Urinkonzentrationen für jeden Marker dar. Die Daten werden in ml/min/g Gewicht ausgedrückt.
Harnausscheidevolumen:
Ein Katheter wurde in der Harnblase befestigt, und die Harnröhre wurde abgeklemmt. Das freie Ende des Katheters wurde in ein graduiertes Röhrchen eingeführt, und das Urinvolumen wurde 10 Minuten lang gesammelt.
Biochemische Bestimmungen:
Proben von Nierengewebe wurden in KCl/Histidin-Puffer (pH-Wert 7,3) homogenisiert und der Überstand wurde verwendet, um die Aktivität der Enzyme PLA2 und Katalase als MDA-reaktive Metaboliten zu messen.
Histologische Bestimmungen:
Proben von Nierengewebe wurden in 10 % gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, mit H&E gefärbt und durch unabhängige Pathologen unter Verwendung der folgenden Kriterien untersucht: Zahl der kollabierten Glomeruli, kortikale Hämorrhagie, medullare Hämorrhagie, schwerwiegende tubuläre Schädigung und schwerwiegende interstitielle Schädigung.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, provozierte das Ischämie-/Reperfusionsereignis eine bemerkenswerte Verschlechterung der Urinbildungskapazität der Niere. EGF-Intervention schwächte die verminderte Harnausscheidung mit Bezug auf die mit Kochsalz behandelten Kontrollen ab. GHRP-6-Intervention erhöhte die Urinbildung im Vergleich zu mit Kochsalz behandelten Tieren vierfach, was für einen funktionellen Nierenschutz spricht. Für die kombinierte Verabreichung von EGF/GHRP-6 zeigte sich, dass sie das Versagen der Niere vollständig verhinderte, sodass die Harnausscheidung ähnlich wie bei einer nicht ischämischen Referenzgruppe war. Diese Daten bestätigen den synergistischen Effekt der vorliegenden Peptidkombination. Tabelle 2:

** Bedeutet einen unterschied von p < 0,01 in Bezug auf ischämische Tiere, die 0,9 % Kochsalz erhielten.
* Bedeutet einen Unterschied von p < 0,05 in Bezug auf ischämische Tiere, die 0,9 % Kochsalz erhielten. Mann-Whitney-U-Test.

Die mikroskopische Prüfung zeigte, dass Ischämie die drei Hauptstrukturen der Niere beeinträchtigt: Glomeruli, Tubulusapparat und das interstitielle Gewebe. Bei Tieren, die Kochsalz erhielten, wurden die Schädigungen schwerwiegend. Sowohl EGF als auch GHRP-6 zeigten, dass sie bei Tieren, die der jeweils unabhängigen Behandlung zugeteilt wurden, Nierenschutz verleihen. Im allgemeinen und qualitativen Sinne scheint GHRP-6 einen größeren Schutz für das Nierenparenchym als EGF allein zu erreichen. Die Kombination beider Peptide ist im Vergleich zu jedem Mittel allein zuverlässig besser. Die Daten werden in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3: Prozentsatz der Tiere/Gruppe, die Nierengewebeschädigung zeigen

** Bedeutet einen Unterschied (p < 0,01) zu den ischämischen Gruppen, die Kochsalz erhielten.
♠ Bedeutet einen Unterschied (p < 0,05) zu den ischämischen Gruppen, die Kochsalz erhielten.
♣ Bedeutet einen Unterschied p < 0,01 zwischen Gruppen, die EGF und GHRP-6 erhielten, im Vergleich zu der Gruppe, die mit der Peptidkombination behandelt wurde. Vergleiche durch Einweg-ANOVA und Duncan's Multiple Range Test.

Die histopathologischen Daten wurden durch funktionelle Nierentests bestätigt, die durch die Clearance beider plasmatischer Marker gegeben wurden. EGF und GHRP-6 schwächen Nierenversagen teilweise ab, wenn sie unabhängig gegeben werden. Die Kombination hat wieder bewiesen, dass sie einen Schutz für die gesamte Niere verleiht. Diese Daten werden in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4: Nierenfunktion

(*) Unterschied zwischen der Gruppe, die mit der Peptidkombination behandelt wurde und derjenigen, die normale Kochsalzlösung erhielt (p < 0,01).
(♣) Unterschied zwischen der Gruppe, die mit der Peptidkombination behandelt wurde und jenen, die jedes Peptid alleine erhielten (p < 0,05).
(#) p < 0,05 zwischen der Gruppe, die GHRP-6 erhielt und derjenigen, die Kochsalzlösung erhielt. Vergleiche durch Einweg-ANOVA und Duncan's Multiple Range Test.

Während einer Untersuchung der zweiten Phase wurde ein größerer Zeitraum der Ischämie eingeführt, was das Untersuchen der Wirkung des Peptids in einem praktischeren Modell hinsichtlich der klinischen Praktik zuließ. Nieren wurden einem 3 Stunden langen Ischämiezeitraum und einer ähnlichen Reperfusionszeit ausgesetzt. Wie in Tabelle 5 demonstriert, wird nach einem 3 Stunden langen Ischämiezeitraum offenkundliches Nierenversagen festgestellt. Das Urinvolumen von Tieren, die Kochsalz und EGF erhalten, ist vernachlässigbar und enthält Hämoglobin. Partieller Nierenschutz ist bei Tieren, die mit GHRP-6 behandelt wurden, nachweisbar, sodass die Urinausscheidung signifikant höher ist als die in den Kochsalz- und EGF-Gruppen beobachtete. Sie war niedriger als jene, die für die nicht ischämische Referenzgruppe nachgewiesen wurde. Die EGF/GHRP-6 Kombination stellte einen Nierenschutz bereit, wie durch die Ähnlichkeit der Urinausscheidungswerte zu der nicht ischämischen Referenzgruppe beurteilt wurde.
Tabelle 5: Urinproduktion während des Reperfusionszeitraums.
Die Daten werden als Mittelwert und SD ausgedrück.

(*) Unterschied (p < 0,05) zwischen der GHRP-6-Gruppe und jener, die normales Kochsalz erhielt.
(♣) Unterschied zwischen der Gruppe, die mit der Peptidkombination behandelt wurde, der EGF-behandelten und der ischämischen Kontrolle, die Kochsalz erhielt (p < 0,01).
(#) Unterschied zwischen der Gruppe, die die Kombination erhielt, im Vergleich zu der Gruppe mit GHRP-6 allein. Vergleich durch Einweg-ANOVA und Duncan's Multiple Range Test.

Vom histopathologischen Gesichtspunkt aus waren die Nierenschädigungen in den meisten Tieren gewaltig und schwerwiegend. Schutz im qualitativen Sinne wurde wie folgt nachgewiesen: Peptidkombination/GHRP-6/EGF. Von den Tieren, die die Peptidkombination erhielten, war der Schutz durch EGF und GHRP-6 vernachlässigbar, wenn sie unabhängig gegeben wurden. In Tabelle 6 werden die Daten gezeigt, die den Schutz durch die Peptidkombination demonstrieren. Tabelle 6: Prozentsatz der Tiere/Gruppe, die Nierengewebeschädigung zeigen

(♦) Unterschied zwischen der Gruppe, die mit GHRP-6 behandelt wurde und der ischämischen Kontrollgruppe, die Kochsalzlösung erhielt (p < 0,05).
(♠) Bedeutet den Unterschied zwischen der Gruppe, die die Peptidkombination erhielt und dem Rest der Gruppen unter Ischämie, ohne Rücksicht auf die Behandlung (p < 0,05/p < 0,01) Signifikanzniveau für p < 0,05. Vergleiche durch Einweg-ANOVA und Duncan's Multiple Range Test.

Die Nierenfunktionsanalyse zeigte wieder, dass die Peptidkombination geeignete Geschwindigkeiten des glomerularen Blutflusses und der Tubulusfiltration sicherstellte. Sogar unter den vorliegenden Ischämiebedingungen lagen diese funktionellen Marker innerhalb der normalen Bereiche, wie in den scheinischämischen Tieren nachgewiesen wurde. Die Daten werden in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7: Nierenfunktion

(*) Unterschied zwischen der Gruppe, die die Kombination erhielt, und dem Rest der ischämischen Gruppen (p < 0,01).
(♣) Unterschied zwischen der Gruppe, die mit GHRP-6 behandelt wurde, und der mit 0,9 Kochsalz behandelten Gruppe (p < 0,05). Signifikanzebene für p < 0,05. Vergleiche durch Einweg-ANOVA und Duncan's Multiple Range Test.

Diese Untersuchung hat die Überlegenheit der Peptidkombination bei der Verhinderung von strukturellen Nierenschädigungen und von funktionellem Tod durch verlängerte Ischämie-/Reperfusionszeiträume bestätigt.
Beispiel 3. Schütrende Wirkung der EGF/GHRP-6 Kombination an einem intestinalen Ischämie-/Reperfusionsmodell.
Männliche Sprague Dawley (220–250 g) Ratten wurden zufällig in die folgenden Behandlungsgruppen eingeteilt:

I: Ischämie/normales Kochsalz.
II: Ischämie EGF 500 μg/Ratte.
III: Ischämie/GHRP-6 100 μg/Ratte.
IV: Ischämie/Kombination – EGF (5 μg)/GHRP-6 (2 μg)/Ratte.

Alle Behandlungen wurde 30 Minuten vor der Initiation des Ischämiezeitraums intraperitoneal verabreicht.
Experimentelles Modell:
Unter Anästhesie mit Methoxyfluoran und unter einer Wärmedecke wurde eine vorsichtige Bauchhöhleneröffnung durchgeführt, um die erstrangige Verzweigung der mesenterischen Oberflächenarterie freizulegen. Die Arterie wurde für einen Zeitraum von 2 Stunden abgeklemmt, wodurch eine schwerwiegende Ischämiezeit an den Leerdarm- und Ileumteilen des Dünndarms provoziert wurde. Reperfusion wurde 3 Stunden lang zugelassen. Die Ratten wurden eingeschläfert und einer vollständigen Autopsie unterworfen. Der Dünndarm wurde seziert, und die Länge der hämorrhagischen Schleimhaut- und/oder luminalen Schädigung wurde erfasst. Der Luminalinhalt wurde mit einem Standardvolumen Kochsalzlösung ausgespült, um den Hämoglobingehalt zu bestimmen. Die Darmschleimhaut wurde mit warmer normaler Kochsalzlösung gewaschen, gewogen und Teile wurden verwendet, um den Gesamtproteingehalt durch die Lowry-Methode zu bestimmen. Andere Teile wurden für den Gesamt-DNA-Gehalt und die mikroskopische Analyse verwendet. Die Zotten-/Schleimhautschädigung wurde mikroskopisch wie von Chiu beschrieben analysiert.
Dieser Maßstab betrachtet Grad 0 als intakte Schleimhaut, fortschreitend bis zu Grad 5 als vollständige Entkleidung.
Um die Schutzwirkung der Behandlung mit der Kombination in diesem Modell der intestinalen Ischämie/Reperfusion vollständig aufzuklären, wurde das Überleben bis zu 96 Stunden Reperfusion überwacht.
Tiere, die normales Kochsalz erhielten, wurden ernsthaft durch den hierin venrwendeten Ischämie-/Reperfusionszeitraum beeinträchtigt, und wiesen ein transmurales Geschwür mit vollständiger Entkleidung und starke Blutung auf. Wie in Tabelle 8 gezeigt, wiesen die meisten Darmsegmente, die in dieser Gruppe untersucht wurden, ein Schädigungsmuster von Grad 5 auf. EGF-Behandlung verlieh einen minimalen Schutz, der in der klinischen Praktik unbedeutend scheint. EGF-Intervention stellte eine minimale Wirkung bereit. Ein teilweiser Schutz wurde bei Tieren, die das GHRP-6 erhielten, bewiesen, sodass die Schleimhautschädigung oberflächlicher und begrenzter war. Wieder verringerte die Peptidkombination Schleimhautschädigungen signifikant (Tabelle 8). Alle Kriterien, die in der Untersuchung verwendet wurden, bestätigen, dass die Peptidkombination eine bemerkenswerte zellschützende Wirkung während des Ischämie-/Reperfusionsereignisses verleiht.
Tabelle 8: Parameter der intestinalen Schädigung
Die Daten werden als Mittelwert und SD ausgedrückt.

(*) Bedeutet den Unterschied zwischen der Gruppe, die die Peptidkombination erhielt, und der ischämischen Gruppe, die die Kochsalzlösung erhielt (p < 0,01).
(♣) Bedeutet den Unterschied zwischen der Gruppe, die GHRP-6 erhielt, und der mit Kochsalz behandelten Gruppe (p < 0,05). Vergleiche durch Einweg-ANOVA und Duncan's Multiple Range Test.

Eine mikroskopische Prüfung der inneren Hauptorgane demonstrierte eine enge Übereinstimmung zwischen dem Ausmaß der intestinalen Schädigung und den extraintestinalen Veränderungen, die in entfernten Organen festgestellt wurden. Die Hauptschädigungen, von denen festgestellt wurde, dass sie sich bei Tieren, die mit der Kombination behandelt wurden, abschwächten, waren: (I) neutrophile Infiltration im Lungenparenchym, (II) Verhinderung der Hepatocytenoncose und (III) Verhinderung des glomerularen Gefäßbündelkollapses und tubulärer Veränderungen.
Ein zweites und unabhängiges Experiment wurde ausgeführt, um zu lernen, ob die Kombination das Überleben der Tiere stimulierte. Die experimentelle Methodik ist wie vorstehend beschrieben. Alle Ratten erhielten eine intraperitoneale Injektion von Ringer-Lactat-Lösung nach dem Wundschluss. Die Tiere wurden 96 Stunden lang überwacht, sobald die Reperfusion initiiert wurde. 100 % der Ratten, die die Peptidkombination erhielten, überlebten 96 Stunden und darüber hinaus (Tabelle 9).
Tabelle 9:
Die pathologische Untersuchung dieser Tiere bestätigte vorhergehende Befunde darin, dass die Peptidkombination nicht nur einen zuverlässigen Schutz des Darmes durch Verringerung des Ausbruchs nekrotischer Veränderungen erbrachte. Des Weiteren waren Schädigungen in den Lungen und Nieren als entfemten Zielorganen, die durch neutrophile Rekrutierung beeinträchtigt wurden, ebenfalls abgeschwächt. Diese Befunde bestätigen den systemischen und Multi-Organ-Schutz, der durch die Kombination von EGF/GHRP-6 ausgelöst wird.
Beispiel 4. Wirkung der therapeutischen Verabreichung von EGF/GHRP-6 an einem experimentellen Modell für mehrfache Organschädigung durch ausgedehnte Verbrennung.
Die dorsale Region von Balb/c Mäusen (22–25 g) wurde enthaart und hypodermalem Verbrühen unter Einbeziehung von 25 % der Körperoberfläche durch 5 Sekunden langes Eintauchen in äquilibriertes Wasser bei 95–97 °C unterworfen. Alle Mäuse erhielten unmittelbar danach 1,5 ml normale Kochsalzlösung als Fluid-Wiederbelebung. Dieses Tiermodell ist zuvor in unserem Labor etabliert und kalibriert worden, und ist für unsere Ziele nützlich, da ausgedehnte innere Veränderungen zuverlässig reproduziert werden. In den nächsten 24 Stunden wurden die überlebenden Mäuse zufällig in die folgenden Gruppen eingeteilt:
Referenz. Scheinverbrannte Mäuse, die 0,9 % Kochsalz erhielten (N = 5).
Verbrüht, welche nur normales 0,9 % Kochsalz erhielten (N = 7).
Verbrüht und mit EGF behandelt (N = 10; 0,1 μg EGF/Tier).
Verbrüht und mit GHRP-6 behandelt (N = 9; 0,1 μg GHRP-6/Tier).
Verbrüht, mit der Peptidkombination behandelt (N = 10). EGF (0,01 μg) und GHRP-6 (0,01 μg)
Verabreichungen wurden zwei Mal täglich und bis zum 10. Tag nach der Verbrühung getätigt. Sobald die Behandlungen abgeschlossen waren, wurden die Tiere wieder gewogen und zur Nekropsie und mikroskopischen Prüfung eingeschläfert. Sechs Stunden vor dem Tod erhielt jede Maus eine Injektion mit Vincristin (1 mg/kg), um die Zellen in der Metaphase zu arretieren. Die Därme wurden seziert, gespült und gewogen. Teile wurden für den Gesamt-DNA- und Proteingehalt gesammelt. Andere Teile wurden mit Formalin fixiert und für die Routineprozessierung oder für die Mikrosezierung der Darmzotten und -krypten verwendet. Morphometrische Verfahren auf den mikroskopischen Objektträgern wurden vom DIGIPAT Bildverarbeitungssystem abgeleitet.
Die folgenden Parameter wurden in dieser Untersuchung in Betracht gezogen:
Gewicht der Tiere.
intestinales Gewicht, Protein- und DNA-Gehalt.
Zellzahl in der Metaphase pro Krypte.
Zahl der sich verzweigenden Krypten.
Zottenhöhe.
Tiefe der Krypten.
Alle Mäuse, die EGF und GHRP-6 allein oder in Kombination erhielten, zeigten eine signifikante Erhöhung des Körpergewichts am Ende des Experiments. Der Unterschied war bei den Tieren, die beide Peptide erhalten hatten, noch größer. Diese Daten werden in Tabelle 10 gezeigt. Dieser Befund zeigt die trophische Wirkung, die durch die Kombination auf die Darmschleimhaut ausgeübt wird, an. Tabelle 10:

(*) Bedeutet den unterschied zwischen Anfangs- und Endkörpergewicht p < 0,05.
(#) Unterschied zwischen der Gruppe, welche die Kombination erhielt, und dem Rest der Gruppen. Einweg-ANOVA und Duncan.

Wie in Tabelle 11 gezeigt, übte jede einzelne Peptidbehandlung eine trophische/regenerative Wirkung auf die Darmschleimhaut im Vergleich zu der Behandlung mit Kochsalz aus. Die wichtigsten Wirkungen werden in der Tat in der Gruppe festgestellt, die die Peptidkombination erhielt.
Tabelle 11: Regenerative Darmreaktion
Die Daten werden als Mittelwert und SD ausgedrückt.

(*) Bedeutet den Unterschied zwischen der Gruppe, die die Peptidkombination erhielt, und der mit Kochsalz behandelten (p < 0,01).
(♣) Bedeutet den Unterschied zwischen den Gruppen, die jedes Peptid allein erhielten, und der Kochsalzgruppe (p < 0,05). Einweg-ANOVA und post-hoc Duncan-Test.

Der wichtigste Hinweis dieses Experiments ist, dass demonstriert wird, dass die Peptidkombination Darmwachstum und intestinale Adaptation beschleunigt, die sich durch die Stimulierung des Krypten-Spaltungs-Prozesses entlang des Dünndarms und des Dickdarms ergeben.
Die Krypte ist die Wachstums- und proliferative Einheit der Darmschleimhaut und ist ebenso die morphologische Untermauerung der intestinalen Mengenadaptation. Tabelle 12 zeigt die Daten, die sich auf die morphologische Rekonstitution der Därme beziehen. Zotten- und Kryptenvergrößerungen stimmen mit der Geweberegeneration und Nährstoffabsorption überein.
Tabelle 12: Wiederherstellung der Darmschleimhaut
Die Daten werden als Mittelwert und SD ausgedrückt.

(*) Bedeutet den Unterschied zwischen der Gruppe, die die Peptidkombination erhielt, und dem Rest der Gruppen (p < 0,05).
(♥) Bedeutet den Unterschied zwischen der EGF-Gruppe und derjenigen, die 0,9 % Kochsalz erhielt (p < 0,05). Einweg-ANOVA und Duncan-Tests.

Die vorliegende Erfindung hat die folgenden Vorteile:

1. Die Kombination kann prophylaktische und/oder therapeutische Wirkungen ausüben, die von den Anforderungen, die für den zu behandelnden pathologischen Zustand erfüllt werden müssen, abhängen können. Die Wirkungen können von einem Fachmann durch das Verabreichungsschema leicht angepasst werden.
2. Die Methode zum Induzieren von zellulärem Schutz beruht auf der Stimulation von Selbstverteidigungsmechanismen in jeder Zelle des Körpers. Die zu aktivierenden Mechanismen sind unterschiedlich, aber funktionell redundant. Viele frühere Lösungen für den Zellschutz führen fremde chemische Strukturen ein (Xenobiotika).
3. Kleine Dosen genügen, um die erwartete therapeutische Reaktion ohne Risiko der Toxizität zu induzieren. Peptide haben sich bei sehr hohen Dosen in unterschiedlichen Säugerspezies als sicher erwiesen. Frühere Interventionen erfordern höhere Dosen für eine bescheidene Wirkung.
4. Die biologische Reaktion wird bei der Wechselwirkung von sowohl EGF als auch GHRP-6 mit einem spezifischen Zellrezeptor schnell aktiviert. Dies beugt dem Bedarf, sich dem Peptid länger auszusetzen, vor, wobei toxische Risiken verringert werden.
5. Die Peptidkombination hat keine Gegenindikationen und kann bei jeder Person ohne Risiko verwendet werden. Keine unerwünschten Arzneistoffwechselwirkungen können stattfinden.
6. Die Methode muss in einem sehr breiten Bereich gewöhnlicher klinischer Zustände und Komorbidität verwendet werden, wobei für viele davon bis jetzt keine therapeutische Wahl erhältlich ist.
7. Diese Methode ist für etliche pathologische Zustände, einschließlich jener Patienten, die sich einer chirurgischen Transplantation unterziehen, angezeigt.
8. Die zellschützenden Wirkungen der vorliegenden Erfindung haben eine breites therapeutisches Fenster im Sinne von Schutzzeit gegen Ischämie/Reperfusion. Die Schutzzeit erfüllt den gegenwärtigen klinischen Bedarf für Transplantation, Revaskularisation, diagnostische Manöver, Management-Verfahren, usw.
9. Vom mechanistischen Gesichtspunkt aus kann die Kombination der Ischämie/Reperfusionsschädigungskaskade an unterschiedlichen kritischen Punkten entgegenwirken, was ihre pharmakologischen Mechanismen polyvalent und somit wirksam werden lässt.
10. Die Verwendung der vorliegenden Kombination ist einzigartig als ein trophisches/regeneratives Mittel für viele Epithelorgane, wie dem Gedärm, der Leber, Bauchspeicheldrüse und Niere.
11. Die vorliegende Kombination hat sich als für die Korrektur des Syndroms des kurzen Darms/für die intestinale Adaptation nützlich erwiesen. Dieser Prozess hat keine alternative Wahl in der gegenwärtigen klinischen Praktik.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung oder Kit, umfassend ein Peptid mit der Aktivität des epidermalen Wachstumsfaktors und ein die Sekretion des Wachstumshormons anregendes Hexapeptid (GHRP-6).
Zusammensetzung oder Kit nach Anspruch 1, wobei das Peptid mit der Aktivität des epidermalen Wachstumsfaktors aus der Gruppe des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF), des transformierenden Wachstumsfaktors Typ α (TGF-α) und des Heparin bindenden, EGF-ähnlichen Wachstumsfaktors (HB-EGF) ausgewählt ist.
Zusammensetzung oder Kit nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Peptid mit der Aktivität des epidermalen Wachstumsfaktors und das die Sekretion des Wachstumshormons anregende Hexapeptid (GHRP-6) Komponenten einer einzigen pharmazeutischen Zusammensetzung sind, die ferner ein geeignetes Corrigens umfaßt.
Zusammensetzung oder Kit nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Peptid mit der Aktivität des epidermalen Wachstumsfaktors in einer Konzentration von 0,5 bis 50 μg/ml vorliegt, wenn sie bzw. es als Lösung oder in gefriergetrockneter Form hergestellt ist.
Zusammensetzung oder Kit nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das die Sekretion des Wachstumshormons anregende Hexapeptid (GHRP-6) in einer Konzentration von 2 bis 100 μg/ml vorliegt, wenn sie bzw. es als eine Lösung oder in einer gefriergetrockneter Form hergestellt ist.
Zusammensetzung oder Kit nach einem der vorstehenden Ansprüche, für die Verwendung bei einer medizinischen Behandlung.
Zusammensetzung oder Kit nach Anspruch 6, wobei die medizinische Behandlung die Prophylaxe oder Behandlung einer Gewebeschädigung aufgrund eines mangelnden Blutflusses der Arterien und Folgen davon in einem menschlichen oder tierischen Organismus umfaßt.
Verwendung einer Zusammensetzung oder eines Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 5, für die Herstellung eines Medikamentes für die Prophylaxe oder Behandlung einer Gewebeschädigung aufgrund eines mangelnden Blutflusses der Arterien und Folgen davon in einem menschlichen oder tierischen Organismus.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Peptid mit der Aktivität des epidermalen Wachstumsfaktors und das die Sekretion des Wachstumshormons anregende Hexapeptid (GHRP-6) gleichzeitig oder unabhängig voneinander verabreicht weiden sollen.
Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Medikament parenteral als Bolus für eine prophylaktische Wirkung verabreicht werden soll, die in einem Dosierungsbereich von 0,5 bis 1 μg jedes wirksamen Peptids pro kg Körpergewicht hervorgerufen werden kann.
Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Medikament, um trophische/regenerierende Wirkungen hervorzurufen, als kontinuierliche Infusion in einem Dosierungsbereich von 0,01 bis 5 μg jedes wirksamen Peptids pro kg Körpergewicht verabreicht werden soll.
Verwendung eines die Sekretion des Wachstumshormons anregenden Hexapeptids (GHRP-6) und eines geeigneten Corrigens für die Herstellung eines Medikamentes, um die Prophylaxe bei einer ischämischen Schädigung einzuleiten, damit eine Gewebeschädigung verhindert wird, wenn bei einem menschlichen oder tierischen Organismus der Blutfluß der Arterien versagt hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, zur Verhinderung einer Gewebeschädigung, entweder tödlich oder nicht, bei Geweben und/oder Organen, die von totaler Ischämie ohne Rückfluß, Zuständen mit schwachem Blutfluß oder Ischämie/Reperfusion betroffen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, als begleitende Therapie zur Abschwächung oder Korrektur von Atemnot beim Erwachsenen (ARDS).
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, zur Verhinderung oder Korrektur des Syndroms der mehrfachen Organfehlfunktion oder eines verwandten Prozesses, der Intensivbehandlungsmaßnahmen erfordert.
Verwendung nach Anspruch 15, bei der Behandlung eines Brandopfers, eines Patienten mit multiplem Trauma, eines Patienten der Extensivchirurgie, eines Empfängers eines chirurgischen Transplantats, eines Patienten, der der chirurgischen Revaskularisation unterzogen wird, eines mit einer Herz-Lungen-Maschine verbundenen Patienten, eines eine thrombolytische und/oder fibrinolitische Therapie erhaltenden Patienten, bei dem die Reperfusion erreicht worden ist, eines Quetschsyndroms, eines Patienten, der Hypovolämie, Schock oder eine geringe Herzleistung zeigt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, für eine begleitende Therapie bei Hämorrhagie, gestörter Fluidverteilung, Schock oder Ischämie/Reperfusion der Eingeweide.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Medikament als prophylaktisches oder vorbehandelndes Mittel bei der Transplantationschirurgie, einer chirurgisch vermittelten längeren Ischämie oder irgendeinem anderen Zustand dient, der zu dem Beginn einer Eingeweideischämie, dem Syndrom der systemischen entzündlichen Reaktion oder einer mehrfachen Organfehlfunktion führt.
Verwendung nach Anspruch 18, für den Erhalt der Homöostase der inneren Organe und Gewebe während der Revaskularisationschirurgie oder zur Verbesserung des Überlebens des Transplantats nach einer Transplantation von Organen, wie Nieren, Leber, Bauchspeicheldrüse, Därme, Lungenflügel, Herz oder Hautlappen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, um eine Zellschädigung nach einem Fall zu verhindern, der die Durchblutung des Gewebes mit mit Sauerstoff angereichertem Blut behindern könnte.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, für die Wiederherstellung der morphofunktionellen Complianc von Gewebe/Organen nach einer ischämischen Episode, die zur Nekrose und/oder Apoptose geführt hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, um die intestinale Adaptation nach der Enterektomie, dem Syndrom des kurzen Darms, dem Darmversagen, das mit der vollständigen parenteralen Ernährung verbunden ist oder nicht, zu beschleunigen.