DE69324367T2

DE69324367T2 - Kationische lipide

Info

Publication number: DE69324367T2
Application number: DE69324367T
Authority: DE
Inventors: Anna Chytil; Valentina Ciccarone; Gulilat Gebeyehu; Pamela Hawley-Nelson; Joel Jessee
Original assignee: Life Technologies Inc
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 1992-08-28
Filing date: 1993-08-27
Publication date: 1999-09-23
Anticipated expiration: 2013-08-28
Also published as: EP0656883A4; EP0656883A1; JPH08509953A; EP0656883B1; ATE178584T1; DK0656883T3; ES2132253T3; WO1994005624A1; CA2141334C; JP3210019B2; US5334761A; CA2141334A1; DE69324367D1; GR3030206T3

Description

Kationische Lipidverbindungen mit Anwendbarkeit in Lipidaggregaten zur Abgabe von Makromolekülen und anderen Verbindungen in Zellen werden offenbart.

Hintergrund der Erfindung

Lipidaggregate, wie Liposomen, sind als Abgabemittel zur Einführung von Makromolekülen, wie DNA, RNA, Protein und kleine chemische Verbindungen, wie Arzneimittel, in Zellen verwendbar. Insbesondere wurde von Lipidaggregaten, die kationische Lipidkomponenten umfassen, gefunden, daß sie besonders zur Abgabe von anionischen Molekülen in Zellen wirksam sind. Man nimmt an, daß die Wirksamkeit kationischer Lipide teilweise auf die erhöhte Affinität für Zellen zurückzuführen ist, von denen viele eine negative Nettoladung tragen. Die positive Nettoladung an Lipidaggregaten, die ein kationisches Lipid umfassen, verhilft auch teilweise dem Aggregat, an Polyanionen, wie Nukleinsäuren, zu binden. Lipidaggregate, die DNA enthalten, sind als wirksame Mittel zur effizienten Transfektion von Zielzellen bekannt.
Die Struktur der verschiedenen Arten von Lipidaggregaten ändert sich in Abhängigkeit von der Zusammensetzung und dem Verfahren zur Herstellung des Aggregats. Solche Aggregate schließen Liposomen, unilamellare Vesikel, multilamellare Vesikel, Mizellen und dergleichen mit Teilchengrößen im Nanometerbis Mikrometer-Bereich ein. Verfahren zur Erzeugung von Lipidaggregaten sind bekannt. Der hauptsächliche Nachteil der Verwendung von üblichen Phospholipid- enthaltenden Liposomen zur Abgabe besteht darin, daß das abzugebende Material eingekapselt werden muß und die Liposom-Zusammensetzung eine negative Nettoladung aufweist, die von der negativ geladenen Zelloberfläche nicht angezogen wird. Durch Kombination von kationischen Lipidverbindungen mit einem Phospholipid können positiv geladene Vesikel oder andere Arten von Lipid aggregaten DNA binden, die negativ geladen ist, durch Zielzellen aufgenommen werden kann und Zielzellen transfizieren kann. (Felgner, P. L. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417; Eppstein, D. et al., US-A-4 897 355.)
Ein bekanntes kationisches Lipid ist N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]- N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA). Die Struktur von DOTMA ist:
DOTMA selbst oder in einer 1 : 1-Kombination mit Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) wird unter Verwendung von üblichen Verfahren zu Liposomen formuliert. Felgner, et al. supra zeigten, daß solche Liposomen eine wirksame Abgabe von Nukleinsäuren für einigen Arten von Zellen bereitstellen. Eine DOTMA : DOPE (1 : 1)-Formulierung wird unter dem Handelsnamen LIPOFECTIN (Gibco/BRL: Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) vertrieben. Ein weiteres, kommerziell erhältliches kationisches Lipid ist 1,2-Bis(oleoyloxy)-3,3-(trimethylammoniak)propan (DOTAP), das sich von DOTMA nur darin unterscheidet, daß die Oleoyleinheiten über Ester, anstatt über Etherbindungen an das Propylamin gebunden sind. Von DOTAP wird angenommen, daß es relativ leicht durch Zielzellen abgebaut wird. Eine verwandte Gruppe der bekannten Verbindungen unterscheidet sich von DOTMA und DOTAP darin, daß eine der Methylgruppen der Trimethylammoniumgruppe durch eine Hydroxyethylgruppe ersetzt wird. Verbindungen dieses Typs sind ähnlich dem Rosenthal-Inhibitor (R¹) von Phospholipase A (Rosenthal, A. F. und Geyer, R. P. (1960) J. Biol. Chem. 235: 2202-2206), der Stearoylester, gebunden an den Propylaminkern, aufweist. Die Dioleoylanalogen von RI werden üblicherweise als DORI-Ether und DORI-Ester, in Abhängigkeit von der Bindung der Fettsäureeinheiten an den Propylaminkern, abgekürzt. Die Hydroxygruppe kann als eine Stelle für weitere Funktionalisierung, beispielsweise durch Veresterung zu Carboxyspermin verwendet werden.
D1 betrifft Verbindungen der Formel A:
und optische Isomere davon, worin R³, R&sup4; und R&sup5; gleich oder verschieden sind und C&sub1;-C&sub8;-Alkyl, Aryl, C&sub7;&submin;&sub1;&sub1;-Aralkyl darstellen oder zwei oder drei der Reste worin R³, R&sup4; oder R&sup5; zusammengenommen Chinuclidino, Piperidino, Pyrrolidino oder Morpholino bilden.
WO-A-9116024 betrifft kationische Lipide der allgemeinen Formel B, die ähnlich der Formel A sind:
worin Y¹ und Y² gleich oder verschieden sind und -OCH&sub2;-, -O-C(O)- oder -O- darstellen; R¹ und R² gleich oder verschieden sind und H oder C&sub1;&submin;&sub2;&sub3;-Alkyl oder -Alkenyl darstellen und R³ und R&sup4; H oder C&sub1;&submin;&sub2;&sub4;-Alkyl darstellen. R&sup5; eine Alkylgruppe darstellt; R&sup6; nicht vorliegt oder eine -C(O)-(CH&sub2;)m-NH-, eine Diaminocarbonsäuregruppe oder -C(O)-(CH&sub2;)m-NH-, gebunden an eine Diaminocarbonsäure, darstellt und R&sup7; eine Vielzahl an Gruppen, einschließlich Spermin, Spermidin und Aminosäuren, mit positiv geladenen Gruppen darstellt.
Zusätzlich offenbart WO-A-9116024 Verbindungen der Formel A, worin R¹ und R² über Ester- sowie Etherbindungen gebunden sein können. In diesen Verbindungen sind die Substituenten R³, R&sup4; und R&sup5; die gleichen wie in US-A- 4 897 355.
Eine weitere Klasse von Verbindungen des Standes der Technik wurde von Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982-6986, EP-A-039 411 (24. Oktober 1990) offenbart, wobei Carboxyspermin an zwei Arten von Lipiden konjugiert wurde. Die Strukturen von 5-Carboxyspermylglycindioctadecylamid (DOGS) ist:
R = CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub7;
Die Struktur von Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-5-carboxyspermylamid (DPPES) ist:
R = CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub5;
Sowohl DOGS, als auch DPPES wurden als Hüllenplasmide verwendet, unter Bildung eines Lipidaggregatkomplexes, der wirksame Transfektion bereitstellt. Die Verbindungen sind für die Transfektion einiger Zellinien angeblich als wirksamer und weniger toxisch als DOTMA. DOGS ist als TRANSFECTAMTM (Promega, Madison, WI) handelsüblich.
Ein kationisches Cholesterinderivat (DC-Chol) wurde synthetisiert und in Liposomen in Kombination mit DOPE formuliert (Gao, X. und Huang, L. (1991) Biochim. Biophys. Res. Comm. 179: 280-285). Die Struktur der Verbindung ist
Von, mit DC-Chol formulierten Liposomen wird mitgeteilt, daß sie für einige Zellinien eine wirksamere Transfektion und geringere Toxizität als DOTMA enthaltende Liposomen bereitstellen.
Von Lipopolylysin, das durch Konjugieren von Polylysin an DOPE gebildet wurde, wurde berichtet, daß es für die Transfektion in Gegenwart von Serum, einem Zustand, dem man sicherlich in vivo begegnet, besonders wirksam ist (Zhou, X. et al. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065: 8-14).
Trotz der Fortschritte auf dem Gebiet bleibt Bedarf für eine Vielzahl von verbesserten kationischen Lipidverbindungen. Insbesondere wurde bis jetzt kein einziges kationisches Lipid gefunden, das sich mit allen Zellarten gut verträgt. Da sich unterschiedliche Zellarten in der Membranzusammensetzung voneinander unterscheiden, ist es nicht überraschend, daß unterschiedliche Zusammensetzungen und Arten von Lipidaggregat für unterschiedliche Zellarten wirksam sind; entweder hinsichtlich ihrer Fähigkeit, mit Zielzellmembranen zu kontaktieren oder zu verschmelzen oder hinsichtlich Aspekten des Übertragungsverfahrens selbst. Bislang werden diese Verfahren nicht vollständig verstanden; folglich ist die Entwicklung von wirksamen kationischen Lipiden stark empirisch. Neben Inhalt und Übertragung sind andere Faktoren von Bedeutung; beispielsweise die Fähigkeit, Lipidaggregate, die für den vorgesehenen Zweck geeignet sind, zu bilden, die Toxizität für die Zielzelle, die Stabilität als Träger für die freizusetzende Verbindung und die Fähigkeit, in einer in vivo-Umgebung zu wirken. Zusätzlich können Lipidaggregate durch Verbreiterung des Bereichs von Substanzen, die in Zellen freigesetzt werden können, verbessert werden. Die kationischen Lipidverbindungen der vorliegenden Erfindung weisen bezüglich verschiedener, vorangehender Eigenschaften eine bessere Wirkung auf.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt neue kationische Lipide bereit gemäß der allgemeinen Formel:
worin R¹ und R² unabhängig voneinander ein C&sub1;&submin;&sub2;&sub3;-Alkylrest oder
Alkenylrest oder
-Alkylrest oder Alkenylrest
sind, Z&sub1; und Z&sub2; unabhängig voneinander H oder ein unverzweigter C&sub1;&submin;&sub6; Alkylrest sind, q eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist und X aus einem von X&sub1;-X&sub1;&sub6; ausgewählt ist, worin
X&sub1; -(CH&sub2;)nBr, (CH&sub2;)nCl, (CH&sub2;)nF oder (CH&sub2;)nI ist, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist;
X&sub2; -(CH&sub2;)nNH&sub2; ist, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist;
X&sub3; -NH-(CH&sub2;)m-NH&sub2; ist, worin m eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist;
X&sub4; -NH-(CH&sub2;)&sub3;-NH-(CH&sub2;)&sub4;-NH&sub2; ist;
X&sub5; -NH-(CH&sub2;)&sub3;-NH-(CH&sub2;)&sub4;-NH(CH&sub2;)&sub3;-NH&sub2; ist;
X&sub6;
ist;
X&sub7;
ist;
oder
X&sub8;
ist, worin p eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist,
Y H oder andere Gruppen, die durch Amid- oder Alkylaminogruppen gebunden sind, ist;
X&sub9; ein Polyamin ist, beispielsweise Polylysin, Polyarginin, Polybrene, Histon oder Protamin;
X&sub1;&sub0; ein Anzeigemolekül ist, beispielsweise
-Fluorescein, Biotin, Folsäure oder PPD;
X&sub1;&sub1; ein Polysaccharid oder ein substituiertes Polysaccharid ist;
X&sub1;&sub2; ein Protein ist;
X&sub1;&sub3; ein Antikörper ist;
X&sub1;&sub4; eine Amin- oder Halogen-reaktive Gruppe ist;
X&sub1;&sub5; -(CH&sub2;)r-SH ist, worin r eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist und
X&sub1;&sub6; -(CH&sub2;)s-S-S-(CH&sub2;)t-NH&sub2; ist, worin s eine ganze Zahl von 0 bis 6 und t eine ganze Zahl von 2 bis 6 sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind entweder einzeln oder in Kombination mit anderen Lipidaggregat-bildenden Komponenten, beispielsweise DOPE oder Cholesterin, zur Formulierung in Liposomen oder anderen Lipidaggregaten verwendbar. Solche Aggregate sind kationisch und können mit anionischen Makromolekülen, wie Nucleinsäuren, komplexieren. Der makromolekulare Lipidaggregat-Komplex steht mit Zellen, die die Makromoleküle zur Absorption und zur Aufnahme durch die Zelle verfügbar machen, in Wechselwirkung. Die erfindungsgemäßen halogenierten Verbindungen sind ebenfalls besonders als Zwischenprodukte zum chemischen Kuppeln des kationischen Lipids an Anzeigemoleküle, Proteine, Polypeptide, Antikörper, Polysaccharide und dergleichen verwendbar, um die zielgerichtete Abgabe, quantitative Bewertung des Ziels, größere Wirksamkeit der Abgabe und einen erhöhten Bereich der Abgabefähigkeit zu ermöglichen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können, an eine Vielzahl von verwendbaren Molekülen und Substanzen, wie Polyamine, Polyaminsäuren, Polypeptide, Proteine, Fluoreszenzfarbstoffe, interkalierende Farbstoffe, Anzeigemoleküle, Biotin, Polysaccharide, Monosaccharide, feste Trägermaterialien, Magnetkugeln, Dendrimerteilchen, DEAE-SephadexTM (Pharmacia, Inc.) und dergleichen, konjugieren. In Abhängigkeit von der speziellen Verbindung der Erfindung und der daran zu konjugierenden Substanz kann Konjugierung unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Verbindung als Alkylierungsmittel, unter Verwendung eines freien Amins davon zur Umsetzung mit einer Amino-reaktiven Gruppe der zu konjugierenden Substanz oder durch die Verwendung von Vernetzungsmitteln stattfinden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist ein diagrammartiges Reaktionsschema für die Synthese von erfindungsgemäßen kationischen Lipiden. Bezugsziffern geben die speziell numerierten, in den Beispielen beschriebenen Verbindungen wurde.
Fig. 2 ist ein diagrammartiges Reaktionsschema zum Konjugieren einer halogenierten, erfindungsgemäßen Verbindung (X = X&sub1;) an Moleküle mit einer Aminofunktionalität (W).
Fig. 3 ist ein diagrammartiges Reaktionsschema zum Konjugieren einer erfindungsgemäßen Verbindung (beispielsweise X = X&sub2; - X&sub8;) an ein Molekül oder eine Substanz mit einer Amin-reaktiven Gruppe (W&sub2;).
Fig. 4 ist ein diagrammartiges Reaktionsschema zum Konjugieren einer erfindungsgemäßen Verbindung (beispielsweise X = X&sub2; - X&sub8;) an ein weiteres Molekül oder eine Substanz durch Verwendung eines Vernetzungsmittels.

Beschreibung der Erfindung im einzelnen

Die vorliegende Erfindung stellt neue kationische Lipide der DORI- Familie bereit, jedoch stellen sie gleiche Eigenschaften und Vorteile bereit, die im Stand der Liposomen-Technik bis jetzt nicht verfügbar waren. Die Verbindungen können einzeln oder in Kombination mit anderen Verbindungen, beispielsweise DOPE, verwendet werden, um Liposomen und andere Lipidaggregate, die für Transfektion oder Abgabe von Verbindungen, die sich von DNA-Zielzellen unterscheiden, entweder in vitro oder in vivo, geeignet sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem Halogensubstituenten (X ist X&sub1;) sind weiterhin für die Synthese von weiteren kationischen Lipidkomplexen verwendbar, wobei das Halogen durch eine gewünschte Verbindung ersetzt wurde. Die Eignung des Halogens als eine verwendbare Abgangsgruppe macht solche Substitutionen geradlinig. Beispiele für verwendbare Substituenten schließen, ohne Begrenzung, Anzeigegruppen, Proteine, Peptide, Antikörper, Kohlenhydrate, Polysaccharide und dergleichen ein. Anzeigegruppen können ein leicht analysiertes oder visualisiertes Molekül, einschließlich, ohne Begrenzung, Fluoreszenztags (Fluorescein, Rhodamin), Lumineszenztags (4-Methoxy-4-(3-phosphatphenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan] (PPD)), Biotin, Farbstoffe, Chelatoren, Affinitätsproben, usw., sein. Solche Anzeiger ermöglichen Visualisierung und Messung von Zielzell-Lipidaggregat-Wechselwirkungen. Solche Anzeiger stellen ebenfalls ein Mittel zur anschließenden Bewertung von Zielzelten durch Bereitstellung von Oberflächenbindungsstellen, die mit den Zielzellen gleich sind, bereit. Zusätzlich können bestimmte Arzneimittel und therapeutische Verbindungen an der Halogenstelle unter Erhöhen der Wirksamkeit der Arzneimittelabgabe durch eine metabolisierbare Bindung substituiert werden. Ebenfalls können DNA- interkalierende Verbindungen substituiert werden, unter Bereitstellen weiterer DNA-Bindung und Erhöhen der Transfektionswirksamkeit.
Erfindungsgemäße Verbindungen mit einem Amid-verbundenen Carboxyspermin (X = X&sub5;), Lysin (X = X&sub8;) und kürzeren Diaminosäuren (X = X&sub7;) sind besonders wirksame DNA-Abgabe-Verbindungen und können in Form von Lipidaggregaten selbst, ohne Kombination mit DOPE oder anderer, Liposomenbildender Verbindung verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die die kationische Lipidkomponente, gekuppelt an ein Kohlenhydrat oder Polysaccharid (X = X&sub1;&sub1;), ein Polypeptid oder Protein (X = X&sub1;&sub2;) oder einen Antikörper (X = X&sub1;&sub3;) aufweisen, sind bei Anwendungen verwendbar, bei denen die Wirkung der Substituentengruppe von Bedeutung ist. Beispielsweise kann eine spezielle Abgabe an eine ausgewählte Ziel- Zellenart durch ein kationisches Lipid der Erfindung mit einem Substituenten, der an Antigen oder Rezeptor-spezifisch an die gewünschte Zielzelle bindet, erleichtert werden. Die Fähigkeit, eine ausgewählte Ziel-Zellenart anzusprechen, ist insbesondere bei in vivo-Anwendungen, beispielsweise bei der Gentherapie, verwendbar.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, worin die kationische Lipidkomponente Enoletherbindungen umfaßt, unterliegen der Hydrolyse in saurer Umgebung. Diese Verbindungen, die strukturell den Plasmalogenen ähnlich sind, werden in Zellmembranen gefunden, die bei der pH-gesteuerten Abgabe von Makromolekülen verwendbar sind. In Enoletherverbindungen sind R&sub1; und R&sub2; Alkenylgruppen mit einer zu der Etherbindung benachbarten Doppelbindung und X ist Wasserstoff oder X&sub1; - X&sub1;&sub6;.

Definitionen

Lipidaggregat ist ein generischer Ausdruck, der Liposomen aller Arten, sowohl unilamellar, als auch multilamellar, sowie Mizellen, als auch amorphere Aggregate von kationischem Lipid oder Lipid, gemischt mit amphipathischen Lipiden, wie Phospholipiden, einschließt.
Zielzelle bedeutet eine Zelle, zu der eine gewünschte Verbindung unter Verwendung eines Lipidaggregats als Träger für die gewünschte Verbindung abgegeben wird.
Hierin verwendet bedeutet Transfektion die Abgabe von exprimierbarer Nucleinsäure an eine Zielzelle, so daß die Zielzelle in die Lage versetzt wird, die Nucleinsäure zu exprimieren. Es ist selbstverständlich, daß der Ausdruck "Nucleinsäure" sowohl DNA, als auch RNA ohne Rücksicht auf das Molekulargewicht einschließt und der Ausdruck "Expression" ein beliebiges Vorliegen der funktionellen Gegenwart von Nucleinsäure innerhalb der Zelle, einschließlich ohne Begrenzung sowohl transiente Expression, als auch stabile Expression bedeutet.
Abgabe wird verwendet, um ein Verfahren, durch das eine gewünschte Verbindung zu einer Zielzelle überführt wird, so daß die gewünschte Verbindung am Ende innerhalb der Zielzelle oder in oder an der Zielzellenmembran angeordnet ist. In vielen Anwendungen der erfindungsgemäßen Verbindungen wird die gewünschte Verbindung nicht leicht durch die Zielzelle aufgenommen und die Abgabe über Lipidaggregate ist ein Mittel zum Erreichen der gewünschten Verbindung in der Zelle. In bestimmten Anwendungen, insbesondere unter in vivo- Bedingungen, wird die Abgabe an eine spezielle Ziel-Zellenart bevorzugt und kann durch erfindungsgemäße Verbindungen erleichtert werden.
Die kationischen Lipide wurden durch die nachstehenden, unten angegebenen Reaktionsschemata (Fig. 1) hergestellt.
3-Dimethylamino-1,2-propandiol wurde mit einer Alkalibase behandelt, gefolgt von einem Alkylierungsmittel der gewünschten Länge, unter Gewinnung des entsprechenden Dialkoxyderivats. Um die Acylderivate zu erhalten, wurde das Diol mit dem gewünschten Acylchlorid in Pyridin behandelt. So wurde Verbindung 1 durch Behandeln von 3-Dimethylamino-1,2-propandiol mit Oleylmesylat in Gegenwart von KOH in Xylol unter Rückfluß erhalten.
Verbindung 1 wurde unter Verwendung von Dibromethan bei hoher Temperatur zu Verbindung 3 alkyliert. Die Behandlung von Verbindung 3 mit Diaminopropan oder Spermin bei hoher Temperatur ergab Verbindung 4 bzw. Verbindung 5.
Die Alkylierung von Verbindung 1 bei 130ºC mit 2-Bromethylphthalimid ergab Verbindung 7. Das Entfernen der Phthalimidogruppe mit Hydrazin ergab Verbindung 2. Verbindung 2 wurde mit Tetra-t-butoxycarbonylspermincarbonsäure in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid acyliert, unter Gewinnung von Verbindung 6. Entfernen der BOC-Schutzgruppe von Verbindung 6 mit Trifluoressigsäure ergab Verbindung 8.
Das Schema stellt ein allgemeines Verfahren zur Konjugation von Lipiden an andere Moleküle oder eine Substanz von Interesse bereit. Das Alkylbromid 3 kann als ein allgemeines Alkylierungsmittel verwendet werden. Somit kann jedes Molekül von Interesse, das eine nukleophile Einheit aufweist, mit Verbindung 3 umgesetzt werden (Fig. 2) (J. March (1985) Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York, Seiten 364-366; Hilgetag & A. Martini, Hrsg. (1972) Preparative Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York, Seiten 448-460). Beispielsweise reagiert die primäre Aminogruppe von Polylysin mit dem Bromid zu dem Polylysin-Lipid-Konjugat. Andere Makromoleküle, die Aminogruppen, wie Proteine und Antikörper, enthalten, können auch in dieser Weise zu Lipiden konjugiert werden. Kleinere Moleküle, die Aminogruppen, wie interkalierende Stoffe (Methidiumspermin), Fluoreszenzfarbstoffe, Nukleotide, Nukleoside, Aminosäuren, Peptide und andere Anzeigemoleküle, wie Biotin, enthalten, können ebenfalls in dieser Weise konjugiert werden.
Umgekehrt können Verbindungen 2, 4, 5 oder 8 für die Konjugation von beliebigen Molekülen von Interesse verwendet werden, die elektrophile oder nukleophile Stellen aufweisen. Verbindungen 2, 4, 5 oder 8 können mit Anzeigemolekülen oder anderen gewünschten Molekülen umgesetzt werden, falls diese Moleküle Carbonsäurestellen, NHS-Ester oder andere aktive Gruppen, wie Isothiocyanate, Alkylhalogenide oder Chlortriazine, enthalten (Fig. 3) (Keezer, F. und Douraghi-Zdeh, K. (1967) Chem. Rev. 67: 107; Dottario-Martin, B. und Ravel, J. H. (1978) Anal. Biochem. 76: 562; Staros, J. V. (1982) Biochemistry 21: 3950.
Verbindungen 2, 4, 5 oder 8 können ebenfalls an Moleküle konjugiert werden, die nukleophile Stellen, wie Amine, enthalten, unter Verwendung von Vernetzungsmitteln (Fig. 4). Disuccinimidylsuberat kann verwendet werden, um Verbindungen 2, 4, 5 oder 8 an Moleküle, die eine Aminogruppe enthalten (Staros, J. V. (1982) Biochemistry 21: 3990), zu konjugieren. Vernetzungsmittel, die NHS-Ester und Maleimid enthalten, können verwendet werden, um Verbindungen 2, 4, 5 oder 8 an Moleküle, die eine Sulfhydrylgruppe enthalten (Fig. 4) (Ji, T. H. (1979) Biochem. Biophys. Acta 559: 39), zu konjugieren.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in der gleichen Weise wie Verbindungen des Standes der Technik, wie DOTMA, DOTAP, DOGS und dergleichen, verwendet werden. Verfahren zum Einbau solcher kationischer Lipide in Lipidaggregate sind im Stand der Technik gut bekannt. Repräsentative Verfahren werden von Felgner et al., supra; Eppstein et al., supra; Behr et al. supra; Bangham, A. et al. (1965) M. Mol. Biol. 23: 238-252; Olson, F. et al. (1979) Biochim. Biophys. Acta 557: 9-23; Szoka, F. et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194-4198; Mayhew, E. et al. (1984) Biochim. Biophys. Acta 775: 169-175; Kim, S. et al. (1983) Biochim. Biophys. Acta 728: 339-348 und Fukunaga, M. et al. (1984) Endocrinol. 115: 757-761 offenbart. Üblicherweise verwendete Techniken zum Herstellen von Lipidaggregaten geeigneter Größe zur Verwendung als Abgabevehikel schließen Beschallung und Gefrieren-Auftauen plus Extrusion ein. Siehe beispielsweise Mayer, L. et al. (1986) Biochim. Biophys. Acta 858: 161-168. Mikrofluidisierung wird verwendet, wenn im wesentlichen kleine (50-200 nm) und relativ gleichförmige Aggregate erwünscht sind (Mayhew, E., supra). Aggregate im Bereich von etwa 50 nm bis etwa 200 nm Durchmesser sind bevorzugt, jedoch sind sowohl größere, als auch kleinere Aggregate funktionell.
Verfahren von Transfektion und Abgabe von anderen Verbindungen sind im Stand der Technik gut bekannt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen ergeben Lipidaggregate, die in den gleichen Verfahren wie jene Verbindungen des Standes der Technik verwendet werden können.
Ein eins-zu-eins-Gemisch (auf das Gewicht) des gewünschten Lipids und Dioleylphosphatidylethanolamin wurde in CHCl&sub3; hergestellt. Das CHCl&sub3; wurde am Rotationsverdampfer entfernt, unter Gewinnung eines dünnen Films von Lipidgemisch. Das Gemisch wurde mit ausreichend Wasser hydratisiert, unter Gewinnung von ungefähr 1,25 mg Lipid pro ml Lösung. Die Lösung wurde zweimal durch einen Mikrofluidizer geleitet und auf 1 mg/ml verdünnt. Die Liposomformulierung wurde dann durch ein 0,2 u-Filter filtriert. Verbindung 8 wurde ebenfalls ohne DOPE formuliert; entweder durch Beschallung bei 1 mg/ml in Wasser oder durch Auflösen eines getrockneten Lipidfilms mit Ethanol und anschließend Zugeben von Wasser zu einer Endkonzentration von 2,5 mg/ml. Ethanol betrug 10% des Volumens. In einigen Fällen wurde dies mit Wasser weiter verdünnt auf 1 mg/ml, 4% Ethanol.
Die Verwendung der repräsentativen Verbindungen der Erfindung wird im weiteren Einzelnen mit Bezug auf die nachstehenden Beispiele erläutert. In jedem Fall wurde die Fähigkeit der verschiedenen erfindungsgemäßen Verbindungen, wirksame Transfektion bereitzustellen, mit einer Kontrolle unter Verwendung von LipofectinTM -Reagenz verglichen. Alle hierin verwendeten Abkürzungen sind im Stand der Technik übliche Abkürzungen. Spezielle, nicht im einzelnen beschriebene Verfahren, sind entweder in der Literatur angegeben oder im Stand der Technik bekannt.

BEISPIELE

Herstellungsbeispiel 1

2,3-Dioleyloxy-1-(N,N-dimethylamino)propan (1). Zu einem 2-Liter- Dreihals-Rundkolben, ausgestattet mit einer Dean-Stark-Falle, wurden 3- Dimethylamino-1,2-propandiol (6,08 g, 51,1 mMol), Xylol (1300 ml) und KOH (8,0 g) gegeben. Die Lösung wurde 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt, unter azeotropem Entfernen des Wassers über die Dean-Stark-Falle. Oleylmesylat (40,0 g, 115,6 mMol) in 100 ml Xylol wurde tropfenweise innerhalb 30 Minuten zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Erhitzen unter Rückfluß wurde 3 Stunden fortgesetzt und das Reaktionsgemisch zu einem Gummi aufkonzentriert. Das Gummi wurde mit 400 ml Hexan verrieben und filtriert. Der Feststoff wurde mit 100 ml Hexan gewaschen, gefolgt von 200 ml Essigsäureethylester. Die Filtrate wurden vereinigt, aufkonzentriert und Flashchromatographie unterzogen. 2,3-Dioleyloxy-1- (N,N-dimethylamino)propan wurde als farbloses Öl in 76%-iger Ausbeute erhalten, DC: Rf = 0,37 (Kieselgel: 5% EtOAc : Hexan); IR: 2925, 2850, 1469, 1120, 1040 cm&supmin;¹; H-NMR (CDCl&sub3;) δ 5,35 (t, 4H), 4,13 (q, 1H), 3,4-3,65 (m, 6H), 2,35-2,45 (m, 2H), 2,25 (s, 6H), 1,95-2,05 (m, 8H), 1,5-1,65 (m, 4H), 1,2-1,45 (m, 4H), 0,9 (t, 6H).

Herstellungsbeispiel 2

2H-Isoindol-2-ethanaminium-N-[2,3-bis(9-octadecenylox)propyl]-1,3- dihydro-N,N-dimethyl-1,3-dioxobromid (7). 2,3-Dioleyloxy-1-(N,N-dimethylamino)propan (1,238 g, 2 mMol) wurde mit N-(2-Bromethyl)phthalimid vereinigt und unter Argon (130ºC) 18 Stunden erhitzt. DC-Analyse (Kieselgel 20% Me- OH/CHCl&sub3;) zeigte, daß das flüssige Ausgangsmaterial vollständig verbraucht war. Das gewünschte Material wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt, unter Verwendung eines Stufengradienten von Hexan/CHCl&sub3; (1 : 1) bis 20% Me- OH/CHCl&sub3;. Das gewünschte Material wurde in 25%-iger Ausbeute als Gummi erhalten. IR: 2920, 2850, 1760(s), 1720, 1460, 1390 cm&supmin;¹.

Beispiel 3

1-Propanaminium-N-(2-amino)ethyl-N,N-dimethyl-2,3-bis(9-octadecenyloxy)bromid (2). Verbindung 7 (800 mg) wurde mit Hydrazin (200 ul) in MeOH (30 ml) vereinigt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Stunden unter Argon unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und der Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wurde zur Trockne aufkonzentriert. Das gewünschte Produkt wurde nach Umkehrphasen-Chromatographie (C-18, 20%-iges wässeriges Methanol) in 48%-iger Ausbeute erhalten. IR: 3300, 2920, 2850, 1460 cm&supmin;¹.

Beispiel 4

3-Oxa-5,9,15-triazaheptadecan-17-aminium-N-[2,3-bis(9-octadecenyloxy)propyl]-9-[(1,1-dimethylethoxy)carbonyl]-13-{[1,1-dimethylethoxy)carbonyl][3- {[(1,1-dimethylethoxy)carbonyl]amino}pronyl]amino}-N,N-2,2-tetramethyl-4,14-dioxobromid (6). N,N,N,N-Tetra-t-butoxy-5-spermincarbonsäure (470 mg, 0,7 mMol) wurde mit Dicyclohexylcarbodiimid (206 mg, 1 mMol) und N-Hydroxysuccinimid (115 mg, 1 mMol) in 50 ml 1 : 1 Dioxan : CH&sub2;Cl&sub2; behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert. Verbindung 2 (220 mg) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml), das Triethylamin (24 ul) enthielt, gelöst und zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde zur Trockne aufkonzentriert und in 100 ml CHCl&sub3; aufgenommen und mit 0,1 M NaHCO&sub3; (2 · 100 ml) extrahiert, gefolgt von H&sub2;O (100 ml). Die CHCl&sub3;- Schicht wurde über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und aufkonzentriert. Das gewünschte Material wurde in 53%-iger Ausbeute nach Flash-Chromatographie erhalten. Rf = 0,8 (20% MeOH in CHCl&sub3;) IR: 2920, 2850, 1680, 1375, 1175 cm&supmin;¹.

Beispiel 5

1-Propanaminium-N-2-[[2,5-bis[(3-aminopropyl)amino]-1-oxopentyl]amino]ethyl]-N,N-dimethyl-2,3-bis(9-octadecenyloxy)-tetra(trifluoracetat)salz (8). Eine Lösung von Verbindung 6 in CH&sub2;Cl&sub2; (160 mg in 2 ml) wurde mit 2 ml Trifluoressigsäure/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 1) bei Raumtemperatur 15 Minuten behandelt. Das Gemisch wurde dann zur Trockne aufkonzentriert und gemeinsam mit Methanol (3 · 30 ml) verdampft. Das gewünschte Produkt wurde in 68%-iger Ausbeute nach Umkehrphasen-Chromatographie (C-18, 20% wässeriger Methanoleluent) erhalten. IR: 1920, 2850, 1680, 1210, 1140 cm&supmin;¹

Beispiel 6

1-Propanaminium-N-[2-(2-brom)ethyl]-N,N-dimethyl-2,3-bis(9-octadecenyloxy)bromid (3). 2,3-Dioleyloxy-1-(N,N-dimethylamino)propan (1,8 g) wurde in 9 ml Dibromethan (das durch eine Aluminium(III)oxid-Säule geleitet wurde) gelöst. Die Lösung wurde 8 Stunden auf 80ºC erhitzt und im Vakuum zu einem Gummi aufkonzentriert. Das Gummi wurde dann in einer minimalen Menge ( 60 ml) heißem CH&sub3;CN gelöst und über Nacht auf -20ºC abgekühlt. Der gelbliche Niederschlag wurde durch Dekantieren abgetrennt. Der Niederschlag wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (120 ml) gelöst und mit neutralem Norit entfärbt. Das CH&sub2;Cl&sub2; wurde eingedampft und der Rückstand wurde aus CH&sub3;CN wie vorstehend kristallisiert, unter Gewinnung des gewünschten Materials in 43%-iger Ausbeute.

Beispiel 7

1-Propanaminium-N-{2-[[3-[[4-[(3-aminopropyl)amino]butyl]amino]propyl]amino]ethyl}-N,N-dimethyl-2,3-bis(9-octa-decenyloxy)bromid (5). Verbindung 3 (1,2 g) wurde mit 3 ml Spermin bei 80ºC 2 Tage unter Argon behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei einer hohen Temperatur (50ºC) unter Vakuum aufkonzentriert. Das Gemisch wurde mit Wasser (50 ml), gefolgt von Ethanol (50 ml) coverdampft und bei der Transfektion ohne weitere Reinigung verwendet.

Beispiel 8

1-Propanaminium-N-[2-[(3-aminopropyl)amino]ethyl]-N,N-dimethyl-2,3- bis(9-octadecenyloxy)bromid (4). Verbindung 3 (460 mg) wurde bei 60ºC in 3 ml Diaminopropan unter Argon 3 Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde bei 50ºC unter Vakuum zur Trockne aufkonzentriert. Das erhaltene gummiartige Material wurde mit Wasser (50 ml), gefolgt von Ethanol (50 ml) coverdampft. Das Material wurde bei der Transfektion ohne weitere Reinigung verwendet.

Beispiel 9

Zellkultur und Plasmide. Baby-Hamster-Nieren (BHK-21)-, COS-7-, He- La-S3-Zellen und normale menschliche Fibroblasten, isoliert aus postnatalem Präputium, wurden im Dulbecco's-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin (Gln), 0,1 mM MEM nichtessentielle Aminosäuren (NEAA), 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin enthielt, gezüchtet. NIH-3T3-Zellen wurden in DMEM, das 10% Kalbsserum (CS), 2 mM Gln, 0,1 mM NEAA, 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin enthielt, gezüchtet. PC12-Zellen wurden in DMEM, das 10% Pferdeserum, 5% FBS, 2 mM Gln, 0,1 mM NEAA, 100 U/ml Penicillin und 100 u/ml Streptomycin enthielt, gezüchtet. Jurkat-Zellen (Human-lymphoide Zellinie) wurden in RPMI-1640, unterschichtet mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin gezüchtet. Humane Keratinozyten wurden aus postnatalem Präputium isoliert und in Keratinozyten-Wachstumsmedium (Clonetics, San Diego, CA) gezüchtet. Alle Zellinien wurden in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO&sub2;- Atmosphäre bei 37ºC gehalten.
pSV2CAT (5,0 kB) wurde vorstehend beschrieben (Gorman, C. M. et al. (1982) Mol. Cell. Biol. 2: 1044). pCMVCAT (5,0 kB) wurde ebenfalls vorstehend beschrieben (Foecking M. K. und Hofstetter, H. (1986) Gene 45: 101). Plasmid- DNA wurde durch isopyknische Zentrifugation in CsCl/EtBr-Gradienten nach Gewinnen durch alkalische Lyse (Maniatis, T. et al. (1982) in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, Seiten 90-91) gereinigt.

Beispiel 10

Transiente Transfektion von adhärenten Zellen (BHK-21, HeLa-S3 NIH-3T3, PC12, Cos-7, Human-Keratinozyten, Human-Fibroblasten) mit kationischen Lipiden. Zur transienten Transfektion von pSV2CAT DNA oder pCMVCAT DNA wurden Zellen in 6-Vertiefungen-Gewebskulturschalen (35 mm Vertiefungen) gelegt und über Nacht zu ungefähr 60% Konfluenz inkubiert. Zu transfizierten Zellen in einer Vertiefung wurden 1-2 ug von pSV2CAT DNA oder pCMVCAT DNA in 100 ul Opti-MEM I verdünnt. Kationische Lipide wurden separat in einer weiteren 100 ul aliquoten Menge von Opti-MEM I verdünnt. Die zwei Lösungen wurden dann in einem Polystyrolröhrchen vermischt, 10-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, unter Bildung eines DNA-Liposomenkomplexes und durch Zugeben von 0,8 ml Opti-MEM I oder DMEM, das 5% fötales Rinderserum (FBS), 2 mM Gln, 0,1 mM NEAA und keine Antibiotika enthielt, auf 1 ml verdünnt. Die Zellen wurden einmal mit Opti-MEM I oder serumfreien DMEM gewaschen und der DNA-Liposomenkomplex wurde direkt zu den Zellen gegeben. Nach 6 Stunden Inkubation bei 37ºC wurden die Transfektionskomplexe entfernt, um 2 ml DMEM, das 10% FBS, 2 mM Gln, 0,2 mM NEAA, 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin enthielt, zu jeder Vertiefung gegeben. Bemerkung: Human- Keratinozyten wurden gezüchtet und in Keratinozyten-Wachstumsmedium transfiziert. Die Zellen wurden für weitere 48 Stunden inkubiert und in situ durch Gefrieren-Auftauen einmal oder zweimal in 300 ul 0,1M Tris-HCl, pH 7,8-8,0, das 0,1% Triton X-100 enthielt, lysiert. Zellysate wurden auf CAT-Aktivität untersucht.

Beispiel 11

Transiente Transfektion von Jurkat-Zellen mit kationischen Lipiden.

Zur transienten Kern-Expression von pSV2CAT oder pCMVCAT in Jurkat-Zellen wurden die Zellen in Opti-MEM I oder serumfreien RPMI 1640, das 2 mM Gln enthielt, gewaschen und in sechs-Vertiefungen-Platten mit einer Dichte von 3 · 106 Zellen pro Vertiefung in 0,8 ml Opti-MEM I oder RPMI 1640 geschichtet. Für jede Transfektion wurden 5 ug pSV2CAT DNA oder 2 ug pCMVCAT DNA in 100 ul Opti-MEM I verdünnt. Die Lipide wurden getrennt in einer weiteren aliquoten Menge von 100 ul Opti-MEM I verdünnt. Die zwei Lösungen wurden dann in einem Polystyrolröhrchen vermischt und 10-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der DNA-Liposomenkomplex wurde zu den Zellsuspensionen gegeben und 6 Stunden bei 37ºC inkubiert, wonach 4 ml Wachstumsmedium pro Vertiefung zugegeben wurden (RPMI-1640; 10% FBS). Phorbolmyristatacetat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) und Phytohämaglutinin (Sigma) wurden auch zu einer Endkonzentration von 50 ng/ml bzw. 1 ug/ml zugegeben, um die Zellen zu aktivieren. Die Zellen wurden bei ungefähr 48 Stunden nach Transfektion durch Zentrifugation geerntet. Zellysate wurden durch Resuspendieren von Zellpellets bei 0ºC in 0,1M Tris-HCl, pH 8,0, das 0,1% Triton X-100 enthielt und Gefrieren-Auftauen hergestellt. Zellysate wurden durch Zentrifugation geklärt und auf CAT-Aktivität untersucht.

Beispiel 12

Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Assay. Zellysate wurden auf CAT-Aktivität, wie von Neumann et al. (1987) Bio Techniques 5: 444 beschrieben, unter Verwendung von [¹&sup4;C]-Butyryl-Co-Enzym A (New England Nuclear, Boston, MA), bewertet. Die Enzymreaktionen wurden 2 Stunden bei 37ºC inkubiert, mit 3,0 ml Econofluor überschichtet (New England Nuclear) und anschließend für weitere 2 Stunden inkubiert, unter Diffusion von acetyliertem Chloramphenicol in die Szintillationsflüssigkeit. Die CAT-Aktivität wurde durch Messen der Radioaktivität in einem Flüssig-Szintillationszähler bestimmt.

Beispiel 13

Ergebnisse. Die Ergebnisse werden in Tabellen 1-8 gezeigt. Die Spalte "% Protein" zeigt die relative Menge an Protein in der auf die CAT-Aktivität untersuchten Probe und stellt deshalb einen Weg zur Schätzung der Toxizität der getesteten Verbindungen bereit. Die Spalte "CAT-Aktivität" weist die relative Transfektionswirksamkeit der Lipidformulierung in den verschiedenen Zellinien aus. Die Kontrollprobe war eine unter ähnlichen Bedingungen wie jene, die transfiziert wurden, gezüchtete Zellkultur, jedoch ohne, daß DNA oder kationisches Lipid zugegeben wurden. Das Protein wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Bradford Protein Assay (BioRad Laboratories, Richmond, CA) gemessen.
Für BHK-21- (Tabelle 1), NIH-3T3- (Tabelle 2B), Keratinozyten- (Tabelle 3), PC12- (Tabelle 4), Jurkat- (Tabelle 5) und Cos-7- (Tabelle 6)-Zellen war Verbindung 8 stark wirksam auf DNA-Transfektion mit minimaler Toxizität. Fibroblasten (Tabelle 7) wurden ebenfalls erfolgreich mit Verbindung 8 transfiziert. Verbindungen 4 und 5 waren ebenfalls auf DNA-Transfektion in Keratinozyten wirksam (Tabelle 3) und Verbindung 3 hatte gute Aktivität in HeLa-S3-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Serum (Tabelle 8). Verbindungen 2 und 3 hatten ebenfalls gute Aktivität auf DNA-Transfektion in NIH-3T3-Zellen (Tabellen 2A und 2B). TABELLE 1 TRANSFEKTIONSERGEBNISSE MIT BHK-21-ZELLEN
Transfektionen erfolgten für 6 Stunden in Opti-MEM I mit 1 ug pSV2CAT DNA in 35 mm Vertiefungen. 3 ul von 300 ul Extrakt wurden auf CAT-Aktivität bewertet. TABELLE 2A NIH-3T3 (Maus-Fibroblasten Zellinie)
Transfektionen für 6 Stunden in Opti-MEM serumfreiem Medium mit 2 ug pSV2CAT DNA. TABELLE 2B NIH-3T3 (MAUS FIBROBLASTEN ZELLINIE)
DNA-Lipidkomplexe, hergestellt in OPTI-MEM. Transfektionen für 6 Stunden in DMEM mit 2 ug pCMVCAT DNA. TABELLE 3 NORMALE HUMAN-KERATINOZYTEN
Transfektionen für 5 Stunden (Verbindung 8) oder 6 Stunden (Verbindungen 3, 4 und 5) mit 2 ug pSV2CAT DNA in 35 mm Vertiefung. 50 ul von 300 ul auf CAT- Aktivität bewertet. TABELLE 4 TRANSFEKTIONSERGEBNISSE MIT PC12-ZELLEN (RATTEN-PHOECHROMOCYTOMA-ZELLINIE)
DNA-Lipidkomplexe wurden in OPTI-MEM hergestellt. PC12-Zellen (6 · 10&sup5; Zellen) wurden in DMEM mit 2 ug pCMVCAT DNA 6 Stunden transfiziert. TABELLE 5A TRANSFEKTIONSERGEBNISSE MIT JURKAT-ZELLEN (HUMAN T-LYMPHOMA-ZELLINIE) MIT pSV2CAT
Jurkat-Zellen (3 · 10&sup6; Zellen) wurden in OPTI-MEM mit 5 ug pSV2CAT DNA für 6 Stunden transfiziert. TABELLE 5B TRANSFEKTIONSERGEBNISSE MIT JURKAT-ZELLEN (HUMAN T-LYMPHOMA-ZELLINIE) MIT pCMVCAT
DNA-Lipidkomplexe wurden in OPTI-MEM hergestellt. Jurkat-Zellen (3 · 10&sup6; Zellen) wurden in RPMI-1640 mit 2 ug pCMVCAT DNA 6 Stunden transfiziert. TABELLE 6 COS-7 ZELLEN
DNA-Lipidkomplexe wurden in DMEM hergestellt. Cos-7 Zellen (1 · 10&sup5; Zellen) wurden in DMEM mit 1 ug pSV2CAT DNA 6 Stunden transfiziert. TABELLE 7 TRANSFEKTIONSERGEBNISSE MIT NORMALEN HUMAN-FIBROBLASTEN
Transfektion für 6 Stunden in OptiMEM I mit 2 u pSV2CAT DNA. 150 ul in 300 ul Extrakt bestimmt auf CAT-Aktivität. TABELLE 8 TRANSFEKTION VON HeLa-S3-ZELLEN DURCH VERBINDUNG 3
Transfektion für 6 Stunden mit 2 ug pSV2CAT DNA.

Claims

1. Verbindung mit der Struktur

worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ein C&sub1;&submin;&sub2;&sub3;-Alkylrest oder Alkenylrest oder

-Alkylrest oder Alkenylrest sind, Z&sub1; und Z&sub2; unabhängig voneinander H oder ein unverzweigter C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest sind, q eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist und X aus einem von X&sub1;-X&sub1;&sub6; ausgewählt ist; worin

X&sub1; -(CH&sub2;)nBr, (CH&sub2;)nCl, (CH&sub2;)nF oder (CH&sub2;)nI ist, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist,

X&sub2; -(CH&sub2;)nNH&sub2; ist, worin n eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist,

X&sub3; -NH-(CH&sub2;)m-NH&sub2; ist, worin m eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist,

X&sub4; -NH-(CH&sub2;)&sub3;-NH-(CH&sub2;)&sub4;-NH&sub2; ist,

X&sub5; -NH-(CH&sub2;)&sub3;-NH-(CH&sub2;)&sub4;-NH(CH&sub2;)&sub3;-NH&sub2; ist,

X&sub6;

ist,

X&sub7;

ist, oder

X&sub8;

ist, worin p eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, Y H oder andere Gruppen, die durch Amid- oder Alkylamino-Gruppen gebunden sind, ist,

X&sub9; ein Polyamin ist, beispielsweise Polylysin, Polyarginin, Polybrene, Histon oder Protamin,

X&sub1;&sub0; ein Anzeigemolekül ist, beispielsweise

Fluorescein, Biotin, Folsäure oder PPD,

X&sub1;&sub1; ein Polysaccharid oder substituiertes Polysaccharid ist,

X&sub1;&sub2; ein Protein ist,

X&sub1;&sub3; ein Antikörper ist,

X&sub1;&sub4; eine Amin- oder Halogen-reaktive Gruppe ist,

X&sub1;&sub5; -(CH&sub2;)r-SH ist, worin r eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist, und

X&sub1;&sub6; -(CH&sub2;)s-S-S-(CH&sub2;)t-NH&sub2; ist, worin s eine ganze Zahl von 0 bis 6 und t eine ganze Zahl von 2 bis 6 sind.

2. Verbindung mit der Struktur

-Alkylrest oder Alkenylrest sind, Z&sub1; und Z&sub2; unabhängig voneinander H oder ein unverzweigter C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest sind, q eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist und X aus einem von X&sub1;-X&sub8;, X&sub1;&sub5; oder X&sub1;&sub6; ausgewählt ist.

3. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub2; ist.

4. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub2; ist und n 2 ist.

5. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub2; ist, n 1 ist, R&sub1; und R&sub2; C&sub1;&sub8;-Alkenylgruppen sind und Z&sub1; und Z&sub2; Methylgruppen sind.

6. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub1; ist.

7. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub1; ist, welches (CH&sub2;)nBr ist und n 1 ist.

8. Verbindung nach Anspruch 2, worin X (CH&sub2;)nBr ist, n 1 ist, R&sub1; und R&sub2;C&sub1;&sub8;- Alkenylgruppen sind und Z&sub1; und Z&sub2; Methylgruppen sind.

9. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub3; ist.

10. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub3;, q 2 und m 3 sind.

11. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub3;, q 2, m 3, Z&sub1; und Z&sub2; Methylgruppen und R&sub1; und R&sub2; C&sub1;&sub8;-Alkenylgruppen sind.

12. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub5; ist.

13. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub5; und q 2 sind.

14. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub5;, q 2, Z&sub1; und Z&sub2; Methylgruppen und R&sub1; und R&sub2; C&sub1;&sub8;-Alkenylgruppen sind.

15. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub6; ist.

16. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub6; und q 2 sind.

17. Verbindung nach Anspruch 2, worin X X&sub6;, q 2, Z&sub1; und Z&sub2; Methylgruppen und R&sub1; und R&sub2; C&sub1;&sub8;-Alkenylgruppen sind.

18. Lipidaggregat, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 17.

19. Verfahren zum Konjugieren eines kationischen Lipids an eine Substanz, umfassend das Umsetzen dieser Substanz mit einem kationischen Lipid, das eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 ist, und wobei die Substanz eine freie Aminogruppe oder eine Amino-reaktive Gruppe aufweist.

20. Verfahren zum Konjugieren eines kationischen Lipids an eine Substanz mit einer reaktiven Gruppe, welches das Umsetzen eines Vernetzungsreagenz mit dem Lipid und der Substanz umfaßt, wodurch ein Konjugat gebildet wird, wobei das kationische Lipid eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 ist.

21. Verfahren zum Transfizieren einer Zelle, umfassend das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Lipidaggregat, umfassend DNA und eine kationische Lipidzusammensetzung, welche eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 umfaßt.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei X X&sub6; ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei X X&sub6; und q 2 sind.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die Substanz ein Phospholipid ist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die Substanz ein Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) ist.

26. Kit zur Herstellung eines Lipidaggregats, umfassend ein kationisches Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 17 und ein Phospholipid.

27. Kit zum Herstellen eines Lipidaggregats, umfassend ein kationisches Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 17 und Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE).

28. Lipidaggregat, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 und weiter umfassend ein Phospholipid.

29. Lipidaggregat, umfassend die Verbindung von Anspruch 15 und weiter umfassend ein Phospholipid.

30. Lipidaggregat nach Anspruch 15, wobei das Phospholipid Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) ist.