DE69426829T2

DE69426829T2 - Hydrophobe zubereitungen

Info

Publication number: DE69426829T2
Application number: DE69426829T
Authority: DE
Inventors: Christopher John Kirby; Roger Randal Charles New
Original assignee: Provalis UK Ltd
Current assignee: Provalis UK Ltd
Priority date: 1993-11-16
Filing date: 1994-11-14
Publication date: 2001-10-04
Anticipated expiration: 2014-11-15
Also published as: DK0729350T3; WO1995013795A1; PT729350E; EP0729350A1; SG48710A1; ES2154719T3; EP0729350B1; ZA949109B; CA2176577A1; AU689509B2; CN1137751A; JPH11514328A; DE69426829D1; ATE199494T1; GR3035757T3; GB9323588D0; AU8149694A; US6368619B1; NZ276143A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zubereitungen von Substanzen in hydrophoben Lösemitteln, in welchen sie normalerweise nicht löslich wären, und Verfahren zum Erhalten dieser Zubereitungen. Insbesondere betrifft die Erfindung Zubereitungen hydrophiler Spezies in hydrophoben Lösemitteln, wie Ölen.
Die Erfindung betrifft insbesondere hydrophile Makromoleküle, die normalerweise nicht in Ölen oder anderen hydrophoben Lösemitteln löslich wären.
Für viele Anwendungen, z. B. in den pharmazeutischen Wissenschaften, in der Nahrungsmitteltechnologie oder der Kosmetikindustrie, bereitet die Arbeit mit Proteinen und ähnlichen Makromolekülen Probleme, da ihre Hydrophilität und ihr hohes Maß an Polarität das Ausmaß begrenzen, in dem sie mit Lipidphasen in Wechselwirkung treten oder in diese eingegliedert werden können. Viele natürliche Systeme verwenden Lipidbarrieren (z. B. Haut, Zellmembrane) um den Zugang hydrophiler Moleküle zu inneren Räumen zu verhindern; die Möglichkeit, Proteine in lipiden Trägern zu dispergieren, würde einen neuen Weg zur Einfügung dieser Markomoleküle in biologische Systeme eröffnen, wobei das Lipidmedium, welches das Protein enthält, sich mit den hydrophoben Bestandteilen von Barrieren vereinen kann, anstatt von ihnen ausgeschlossen zu werden.
Ein weiterer Bereich, in dem die Lösung von Proteinen in Ölen einen Vorteil bieten könnte, ist die Verwendung von Enzymen in organischen Phasen. Enzymatische Synthesen gewinnen im Vergleich zu chemischen Prozessen aufgrund ihres viel geringeren Energiebedarfs, der größeren Substrat- und Produktspezifitäten, höheren Ausbeuten und der Tatsache, daß viele Reaktionen katalysiert werden, die durch chemische Mittel unmöglich sind, zunehmend an Bedeutung. Jüngste Erkenntnisse, daß Enzyme in organischen Umgebungen aktiv bleiben können, haben viel zusätzliche Möglichkeiten eröffnet. So können Reaktionen, die lipophile Substrate und Produkte beinhalten, effektiv katalysiert werden, und die Enzymstabilität ist häufig viel größer als in wäßrigen Umgebungen, so daß sie unter viel extremeren Bedingungen verwendet werden können, wie bei hoher Temperatur. Ein besonders wichtiger Aspekt ist, daß Reaktionen, welche hydrolytische Enzyme, wie Lipasen und Peptidasen beinhalten, in wasserarmen Milieus vorzugsweise in die umgekehrte Richtung verlaufen können, wodurch die Synthese eines großen Bereichs industriell wichtiger Verbindungen möglich ist. Eine weitere Anwendung ist bei einer komplexen Reaktionskette, in welcher die mehrfachen katalytischen Einheiten sehr nahe beieinander gehalten werden müssen. Dies kann zum Beispiel bei lichtinitiierten Redox-Reaktionen der Fall sein. Eine zusätzliche Möglichkeit ist die kontrollierte Produktion von Nanoteilchen in Ölphase unter Verwendung von Enzymen zur Herbeiführung einer Mineralisierung durch die Wirkung auf organometallische Substrate. Die Zubereitung einer stabilen Dispersion vorgeformter Nanoteilchen in Ölphase kann auch für die Durchführung gewisser oberflächenkatalysierter Reaktionen vorteilhaft sein.
Die Dispersion hydrophiler Substanzen in Ölphase anstelle wäßriger Medien bringt andere Vorteile hinsichtlich einer Erhöhung ihrer Stabilität in bezug auf eine temperaturbedingte Denaturierung, Hydrolyse, Lichtempfindlichkeit usw., mit sich. Es können Öle gewählt werden, die über einen größeren Temperaturbereich als wäßrige Lösungen fließfähig bleiben, oder die eine höhere Viskosität aufweisen, was einen höheren Schutz vor physikalischen Schäden zur Folge hat. In einem Mischphasensysteme kann die Maskierung von Proteinen in Öl beidseitig schädliche Wechselwirkungen - z. B. Oxidation - mit wasserlöslichen Verbindungen begrenzen.
Es gibt Beispiele für Formulierungen, die sowohl Makromoleküle als auch Öl enthalten, und ein solches Beispiel ist in EP-A-0366277 geoffenbart. Die Formulierung, die in diesem Dokument geoffenbart ist, ist eine Emulsion mit sowohl einer hydrophoben als auch einer hydrophilen Phase, wobei die hydrophobe Phase Chylomikra oder Chylomikron-bildende Lipide enthält. Das Makromolekül ist jedoch in der hydrophilen Phase und nicht in der hydrophoben Phase gelöst.
EP-A-0521994 betrifft ebenfalls eine Zusammensetzung, die für die orale Abgabe von Makromolekülen geeignet ist, die ein biologisch aktives Material in Verbindung mit Lecithin oder einer Verbindung umfaßt, die als Vorläufer für Lecithin in vivo wirken kann. Alle als Beispiel angeführten Zusammensetzungen sind Formulierungen, die eine hydrophile und eine lipophile Phase umfassen. Auch in diesem Dokument nach dem Stand der Technik ist das Makromolekül in der hydrophilen Phase und nicht in der lipophilen Phase gelöst.
Obwohl die obengenannten Formulierungen sowohl Makromoleküle als auch Öle enthalten, ist es wesentlich, daß in allen Fällen das Makromolekül in der hydrophilen Phase und nicht in der lipophilen Phase gelöst ist. Versuche, echte Lösungen von Makromolekülen in Ölen zu bilden, waren von begrenztem Erfolg.
Die vorliegende Erfindung betrifft die überraschende Entdeckung, daß, wenn eine hydrophile Spezies mit einem Amphiphil unter gewissen Bedingungen gemischt wird, die erhaltene Zusammensetzung in lipophilen Lösemitteln, wie Ölen, leicht löslich ist.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer im wesentlichen wasserfreien, einphasigen, hydrophoben Zubereitung bereitgestellt, welche eine hydrophile Spezies, in einem hydrophoben Lösemittel aufweist, wobei das Verfahren umfaßt:
(i) entweder
(a) das Vermischen der hydrophilen Spezies mit einem mizellenbildenden Amphiphil in einem hydrophilen Lösemittel, um eine mizelläre Lösung zu erhalten; oder
(b) das Vermischen der hydrophilen Spezies mit einer Dispersion aus kleinen, unilamellären Amphiphilvesikel in einem hydrophilen Lösemittel;
(ii) das Entfernen des hydrophilen Lösemittels, um eine Anordnung von Amphiphilmolekülen zu erhalten, deren hydrophile Kopfgruppen zu der hydrophilen Spezies ausgerichtet sind, und wobei keine chemische Wechselwirkung zwischen dem Amphiphil und der hydrophilen Spezies stattfindet; und
(iii) das Dispergieren der hydrophilen Spezies/Amphiphil-Anordnung in einem hydrophoben Lösemittel, vorausgesetzt, daß das hydrophobe Lösemittel kein langkettiges Triglycerid, wie SUPPOSIRE AMTM, ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "chemische Wechselwirkung" eine Wechselwirkung, wie eine kovalente oder ionische Bindung oder eine Wasserstoffbindung. Van der Waalssche Kräfte oder andere Wechselwirkungen dieser Größenordnung sollen nicht enthalten sein.
Es hat sich gezeigt, daß die Reihenfolge, in welcher die Bestandteile der Zubereitung gemischt werden, von besonderer Bedeutung ist. In einem Versuch, eine molekulare Dispersion herzustellen, wurde eine makromolekulare Verbindung (ein Beispiel einer hydrophilen Spezies) mit dem hydrophoben Lösemittel gemischt und dann Amphiphil zugegeben, während in einem anderen Verfahren eine makromolekulare Verbindung einer Mischung aus dem hydrophoben Lösemittel und dem Amphiphil zugesetzt wurde. Diese beiden Vorgangsweisen führten jedoch zur Herstellung einer körnigen Dispersion der makromolekularen Verbindung in dem Lösemittel und nicht zu einer echten molekularen Dispersion. Es stellte sich heraus, daß nur durch Zugabe der makromolekularen Verbindung zu dem Amphiphil in der Weise, daß ein Bereich entsteht, in welchem die hydrophilen Kopfgruppen des Amphiphils zu dem Makromolekül ausgerichtet sind, und anschließendes Auflösen dieser Anordnung in dem hydrophoben Lösemittel, eine einphasige Zubereitung erzeugt werden konnte.
In der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "hydrophile Spezies" jede Spezies, die im allgemeinen in wäßrigen Lösemitteln löslich, aber in hydrophoben Lösemitteln unlöslich ist. Der Bereich von hydrophilen Spezies zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist mannigfaltig, aber hydrophile Makromoleküle stellen ein Beispiel einer Spezies dar, die verwendet werden kann.
Eine Vielzahl von Makromolekülen ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Im allgemeinen ist die makromolekulare Verbindung hydrophil oder hat zumindest hydrophile Regionen, da es für gewöhnlich geringe Schwierigkeiten bereitet, ein hydrophobes Makromolekül in öligen Lösungen zu lösen. Zu Beispielen für geeignete Makromoleküle zählen Proteine und Glycoproteine, Oligo- und Polynukleinsäuren, zum Beispiel DNA und RNA, Polysaccharide und supramolekulare Anordnungen derselben, einschließlich, in einigen Fällen, ganze Zellen oder Organellen. Es kann auch praktisch sein, ein kleines Molekül, wie ein Vitamin, in Verbindung mit einem Makromolekül, insbesondere einem Polysaccharid, wie Cyclodextrin, gleichzeitig zu lösen. Kleine Moleküle, wie Vitamin B12, können auch chemisch mit Makromolekülen verbunden werden, und somit in den Zusammensetzungen enthalten sein.
Beispiele für bestimmte Proteine, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erfolgreich löslich gemacht werden können, umfassen Insulin, Calcitonin, Hämoglobin, Cytochrom C, Meerrettichperoxidase, Aprotinin, Pilztyrosinase, Erythropoetin, Somatotropin, Wachstumshormon, Wachstumshormfreisetzungsfaktor, Galanin, Urokinase, Faktor IX, Gewebeplasminogenaktivator, Superoxiddismutase, Katalase, Peroxidase, Ferritin, Interferon, Faktor VIII und Fragmente davon (alle der obengenannte Proteine können von jeder geeigneten Quelle stammen). Andere Makromoleküle, die verwendet werden können, sind FITC-markiertes Dextran und RNA-Extrakt von Torulahefe.
Es scheint, als gäbe es keine obere Grenze für das Molekulargewicht der makromolekularen Verbindung, da Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 1 000 000 durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung leicht löslich gemacht werden kann.
Zusätzlich zu den Makromolekülen ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Löslichmachen kleinerer organischer Moleküle nützlich. Zu Beispielen für kleine organische Moleküle zählen Glucose, Carboxyfluorescein und viele pharmazeutische Mittel, zum Beispiel Mittel gegen Krebs, aber natürlich kann das Verfahren gleichermaßen bei anderen kleinen organischen Molekülen angewendet werden, zum Beispiel Vitaminen oder pharmazeutisch oder biologisch aktiven Mitteln. Zusätzlich können auch Verbindungen wie Kalziumchlorid und Natriumphosphat unter Anwendung dieses Verfahrens löslich gemacht werden. Tatsächlich wäre die vorliegende Erfindung besonders für pharmazeutisch und biologisch aktive Mittel vorteilhaft, da die Verwendung nichtwäßriger Lösungen eine Änderung des Weges, über den das Molekül in den Körper eintritt, zuließe, um zum Beispiel die Bioverfügbarkeit zu erhöhen.
Eine andere Art von Spezies, die in den hydrophoben Zusammensetzungen der Erfindung enthalten sein kann, ist ein anorganisches Material, wie ein kleines anorganisches Molekül oder eine kolloidale Substanz, zum Beispiel ein kolloidales Metall. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht, daß einige der Eigenschaften eines kolloidalen Metalls, wie kolloidalen Goldes, Palladium, Platin oder Rhodium, selbst in hydrophoben Lösemitteln beibehalten werden, in welchen die Partikel unter normalen Umständen aggregierten. Dies könnte besonders für Katalysatoren von Reaktionen nützlich sein, die in organischen Lösemitteln ausgeführt werden.
Ein Verfahren, das jenem der vorliegenden Erfindung etwas ähnlich ist, ist von Okahata et al. (3. Chem. Soc. Chem. Commun., 1988, 1392-1394) offenbart. Es scheint jedoch, daß sich die Anordnung des Proteins, das von amphiphilen Molekülen umgeben ist, wie von den Autoren dieses Dokuments erzeugt, deutlich von jener unterscheidet, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird. Insbesondere behaupten die Autoren, daß die amphiphilen Moleküle mit dem Protein in dem flüssigen Medium durch Wasserstoffbindung oder mittels einer elektrostatischen Wechselwirkung reagierten, um einen festen Niederschlag zu bilden. Im Gegensatz dazu scheint es, daß in der vorliegenden Erfindung die hydrophile Spezies nicht mit den amphiphilen Molekülen in dem flüssigen Medium in chemische Wechselwirkung tritt.
Es gibt zahlreiche Amphiphile, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, und zwitterionische Amphiphile, wie Phospholipide, zählen zu jenen, die sich als besonders geeignet erwiesen haben. Phospholipide mit einer Phosphatidylcholin-Kopfgruppe wurden mit besonderem Erfolg verwendet und zu Beispielen für solche Phospholipide zählen Phosphatidylcholin (PC) selbst, Lyso-Phosphatidylcholin (Lyso-PC), Sphingomyelin, Derivate von jedem derselben, zum Beispiel Hexadecylphosphocholin oder amphiphile Polymere die Phosphorylcholin enthalten. In der vorliegenden Anmeldung werden die Begriffe Phosphatidylcholin (PC) und Lecithin austauschbar verwendet. Geeignete natürliche Lecithine können von jeder passenden Quelle abgeleitet werden, zum Beispiel Ei, und insbesondere Soja. In den meisten Fällen ist bevorzugt, ein Amphiphil auszuwählen, das dem gewählten hydrophoben Lösemittel chemisch ähnlich ist, und dies wird in der Folge ausführlicher besprochen.
Die Tatsache, daß die gegenwärtigen Erfinder festgestellt haben, daß zwitterionische Amphiphile, wie Phospholipide, besonders zur Verwendung in dem Verfahren geeignet sind, ist ein weiterer Hinweis auf die wesentlichen Unterschiede zwischen der vorliegenden Erfindung und dem Verfahren von Okahata et al.. Es ist signifikant, daß die Autoren dieses Dokuments nach dem Stand der Technik schlossen, daß anionische und zwitterionische Lipide zur Verwendung in ihrem Verfahren völlig ungeeignet sind, und feststellten, daß sie bei Verwendung dieser Lipide eine Nullausbeute ihres Komplexes erhielten.
Das hydrophobe Lösemittel der Wahl hängt von dem Zweck ab, für den die Zusammensetzung bestimmt ist, von der Art der Spezies, die löslich gemacht werden soll, und von dem Amphiphil. Zu geeigneten Lösemitteln zählen langkettige Fettsäuren, wobei ungesättigte Fettsäuren, wie Olein- und Linolsäure, bevorzugt sind, Alkohole, insbesondere mittelkettige Alkohole, wie Octanol, und verzweigte langkettige Alkohole, wie Phytol, Monoglyceride, wie Glycerolmonooleat (GMO), Diglyceride und Triglyceride, insbesondere mitteikettige Triglyceride und Mischungen davon.
Optimale Ergebnisse werden im allgemeinen erhalten, wenn das hydrophobe Lösemittel und das Amphiphil richtig abgestimmt sind. Zum Beispiel ist bei einem Lösemittel wie Oleinsäure Lyso-PC eine geeignetere Wahl des Amphiphils als PC, während das Gegenteil zutrifft, wenn das hydrophobe Lösemittel ein Triglycerid ist.
Zusätzlich hat es sich in einigen Fällen als Vorteil erwiesen, eine Menge des Amphiphils zu dem hydrophoben Lösemittel zuzugeben, bevor es mit der Anordnung von hydrophiler Spezies/Amphiphil in Kontakt gebracht wird. Dies garantiert, daß die Amphiphilmoleküle nicht wegen der hohen Affinität des Amphiphils für das hydrophobe Lösemittel aus ihren Positionen um die hydrophile Spezies gelöst werden.
Es ist besonders bevorzugt, daß die Zubereitungen der Erfindung optisch klar sind und dies kann durch Messung der Trübung bei sichtbaren Wellenlängen und in einigen Fällen durch Überprüfung auf Sedimentation über einen Zeitraum überwacht werden.
Eine hydrophile/amphiphile Anordnung, in welcher die hydrophilen Kopfgruppen eines Amphiphils zu einer hydrophilen Spezies ausgerichtet sind, wurde zuvor bereits hergestellt, aber es wurde niemals nahegelegt, daß diese Art von Zusammensetzung in lipophilen Lösemitteln löslich sein könnte.
Kirby et al., in Bio/Technology, November 1984, 979-984, und in Liposome Technology, Band I, S. 19-27, Gregoriadis, Ed., CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, USA, beschreiben ein Verfahren für die Herstellung von Liposomen, in welchen ein Phospholipid in destilliertem Wasser suspendiert wird, um kleine unilamelläre Vesikel oder multilamelläre Vesikel zu bilden, die mit dem einzuhüllenden Material gemischt und gefriergetrocknet werden. Die Mischung wird dann rehydriert, um Liposome zu erhalten.
Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung dieses Standes der Technik gab es weltweit großes Interesse an der Herstellung von Liposomen, aber die Vorstellung, eine einphasige hydrophobe Zubereitung eines Makromoleküls herzustellen, wurde scheinbar entweder niemals in Betracht gezogen oder als unmöglich oder von geringem Wert beiseite gelassen. Nach dem Stand der Technik gibt es gewiß keinen Hinweis, daß die Zwischenanordnungen für irgendeinen anderen Zweck verwendet werden könnten, als für die Herstellung von Liposomen. Selbst wenn eine einphasige hydrophobe Zubereitung eine gewünschte Zielsetzung war, wurde die Vorstellung der Zugabe eines hydrophoben anstelle eines hydrophilen Lösemittels wahrscheinlich nicht ernst genommen, da es ein starkes Vorurteil in der Technik gegen hydrophobe Zubereitungen von Makromolekülen gab.
Die Ausrichtung von Amphiphilmolekülen zu einer Anordnung, in welcher ihre hydrophilen Kopfgruppen den Komponenten einer hydrophilen Spezies gegenüberliegen, kann durch das in der Folge besprochene Verfahren erreicht werden.
In dem Verfahren der Erfindung, das einen ähnlichen Ausgangspunkt wie das Verfahren hat, das von Kirby et al.. supra, beschrieben ist, wird eine hydrophile Spezies mit einer Dispersion eines Amphiphils in einem hydrophilen Lösemittel gemischt, so daß die Amphiphilmoleküle eine Anordnung bilden, in welcher die hydrophilen Kopfgruppen nach außen zu der hydrophilen Phase weisen, welche die hydrophile Spezies enthält. Das hydrophile Lösemittel wird dann entfernt, um eine trockene Zusammensetzung zurückzulassen, in welcher die hydrophilen Kopfgruppen der Amphiphilmoleküle zu der hydrophilen Spezies ausgerichtet sind.
In dem Verfahren, das von Okahata et al. beschrieben ist, wurde auch eine Lösung eines Proteins mit einer Dispersion eines Amphiphils in Wasser gemischt. Es ist jedoch von Bedeutung, daß die Autoren dieser Schrift annahmen, daß es notwendig sei, einen Niederschlag zu erhalten, der dann in hydrophoben Lösemitteln löslich wäre. Da viele der bevorzugten Amphiphile der vorliegenden Erfindung keinen solchen Niederschlag bilden, schlossen Okahata et al., daß sie nicht von Nutzen wären. In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist kein Niederschlag erforderlich, und tatsächlich wird allgemein als unerwünscht erachtet, eine Niederschlagsbildung zu ermöglichen, da dies eine verringerte Ausbeute des benötigten Produkts zur Folge hat.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt, daß das hydrophile Lösemittel Wasser ist, obwohl andere polare Lösemittel verwendet werden können.
Die Form, welche die amphiphile Anordnung aufweist, können Mizellen oder kleine, unilamelläre Vesikel sein, deren Durchmesser im allgemeinen mit etwa 25 nm angenommen wird. Die angenommene Form hängt von dem verwendeten Amphiphil ab, wobei zum Beispiel Amphiphile wie Phosphatidylcholin (PC) zur Bildung kleiner unilamellärer Vesikel neigen, während Lyso-Phosphatidylcholin Mizellen bildet. In all diesen Strukturen weisen jedoch die hydrophoben Schwänze der Amphiphilmoleküle nach innen zu der Mitte der Struktur, während die hydrophilen Kopfgruppen nach außen zu dem Lösemittel zeigen, in welchem die hydrophile Spezies dispergiert ist.
Das Gewichtsverhältnis von Amphiphil: hydrophiler Spezies liegt im allgemeinen im Bereich von 1 : 1 bis 100 : 1, vorzugsweise von 2 : 1 bis 20 : 1 und insbesondere bei etwa 8 : 1 für PC und 4 : 1 für Lyso-PC.
Diese Verhältnisse sind nur bevorzugte Verhältnisse und es sollte insbesondere betont werden, daß die obere Grenze durch wirtschaftliche Überlegungen gesetzt ist, was bedeutet, daß die Verwendung einer möglichst geringen Amphiphilmenge bevorzugt ist. Die untere Grenze ist etwas kritischer und es ist wahrscheinlich, daß Verhältnisse von 2 : 1 oder weniger nur in Fällen verwendet werden, in welchen die hydrophile Spezies einen signifikanten hydrophoben Anteil aufweist oder außerordentlich groß ist.
Eine gute Durchführung wird erhalten, wenn das Lösemittel rasch entfernt wird, und eine praktische Methode für die Entfernung des Lösemittels ist die Lyophilisierung, wenn auch andere Methoden verwendet werden können.
In einigen Fällen kann es nützlich sein, daß Salze in der hydrophilen Lösung enthalten sind, insbesondere wenn die hydrophile Spezies eine makromolekulare Verbindung, wie ein großes Protein, ist. Da die Gegenwart großer Mengen anorganischer Salze dazu neigt, die Bildung von Kristallen und somit einer trüben Lösung herbeizuführen, ist jedoch bevorzugt, daß organische Salze anstelle anorganischer Salze, wie Natriumchlorid, verwendet werden. Ammoniumacetat ist für diesen Zweck besonders geeignet, da es den zusätzlichen Vorteil hat, daß es leicht durch Gefriertrocknung entfernt wird.
Eine alternative Methode zur Bildung der Anordnung, die besonders zur Verwendung mit kleinen hydrophilen Spezies geeignet sein könnte, ist das Einschließen der hydrophilen Spezies in geschlossene Lipidvesikel, wie kleine unilamelläre Vesikel ("small unilamellar vesicles" - SUVs), die in einem hydrophilen Lösemittel dispergiert sind, und das anschließende Entfernen des Lösemittels.
Das Produkt des Verfahrens der Erfindung ist neu, da es die Herstellung von einphasigen hydrophoben Zubereitungen ermöglicht, die eine hydrophile Spezies umfassen, die normalerweise nicht in einem hydrophoben Lösemittel löslich wäre. Daher wird in einem dritten Aspekt der Erfindung eine einphasige, hydrophobe Zubereitung bereitgestellt, welche eine hydrophile Spezies in einem hydrophoben Lösemittel umfaßt, die durch das Verfahren der Erfindung erhältlich ist.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung auch eine einphasige, hydrophobe Zubereitung bereit, die eine hydrophile Spezies und ein Amphiphil in einem hydrophoben Lösemittel umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten der hydrophilen Spezies von Amphiphilmolekülen umgeben sind, wobei die hydrophilen Kopfgruppen der Amphiphilmoleküle zu der hydrophilen Spezies ausgerichtet sind.
Bevorzugte hydrophile Spezies, Amphiphile und hydrophobe Lösemittel sind wie für das soeben beschriebene Verfahren spezifiziert.
Es kann auch wünschenswert sein, andere Bestandteile in die einphasige, hydrophobe Zubereitung zusätzlich zu der hydrophilen Spezies einzufügen. Dies ist oft besonders zweckdienlich, wenn die hydrophile Spezies ein Makromolekül ist und in diesem Fall kann die Zubereitung zum Beispiel Salze der Gallensäure, Vitamine oder andere kleine Moleküle enthalten, die an die Makromoleküle binden oder auf andere Weise mit diesen vereint sind.
Obwohl einige Makromolekül/Amphiphil-Anordnungen von Kirby et al., supra, geoffenbart wurden, waren alle geoffenbarten Anordnungen Zwischenprodukte bei der Bildung von Liposomen und es gab, wie zuvor besprochen wurde, früher kein Interesse an nicht-liposomalen oder hydrophoben Zusammensetzungen, die diese Art von Gebilde umfassen. Daher sind die Anordnungen der vorliegenden Erfindung neu, in welchen das Amphiphil jenes ist, welches keine kleinen unilamellären Vesikel bildet und von dem somit keine Liposombildung erwartet wird.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Anordnung von Amphiphilmolekülen und hydrophiler Spezies bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophilen Kopfgruppen der Amphiphilmoleküle zu der hydrophilen Spezies gerichtet sind, und wobei keine chemische Wechselwirkung zwischen dem Amphiphil und der hydrophilen Spezies stattfindet, vorausgesetzt, das Amphiphil ist jenes, das nicht imstande ist, Liposome zu bilden, wenn der Anordnung Wasser zugegeben wird.
Ein Beispiel für ein Amphiphil, das nicht imstande ist, Liposome zu bilden, ist Lyso- Lecithin. In den meisten wäßrigen Milieus bildet dieses Amphiphil eher Mizellen als kleine unilamelläre Vesikel, und es ist daher zur Verwendung in der Herstellung von Liposomen ungeeignet. Es ist jedoch in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung äußerst nützlich, insbesondere, wenn es in Verbindung mit einem kompatiblen hydrophoben Lösemittel, wie Oleinsäure, verwendet wird.
Ein Vorteil der Zubereitungen der vorliegenden Erfindung ist, daß sie im wesentlichen wasserfrei und daher gegenüber einer Hydrolyse stabil sind. Sie sind auch beim Gefrieren-Auftauen stabil und haben bei hohen Temperaturen eine höhere Stabilität, wahrscheinlich, weil Wasser vorhanden sein muß, damit sich das Protein auffaltet und denaturiert wird. Dies bedeutet, daß bei ihnen eine viel längere Haltbarkeit erwartet werden kann, als bei wäßrigen Zubereitungen der hydrophilen Spezies.
Die Lösemittel der vorliegenden Erfindung sind äußerst vielseitig und haben viele Anwendungsmöglichkeiten. Sie können entweder alleine verwendet werden oder können mit einer wäßrigen Phase zur Bildung einer Emulsion oder ähnlichen zweiphasigen Zusammensetzung kombiniert werden, die einen weiteren Aspekt der Erfindung darstellt.
In diesem Aspekt der Erfindung wird eine zweiphasige Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend eine hydrophile Phase und eine hydrophobe Phase, wobei die hydrophobe Phase eine Zubereitung aus einer hydrophilen Spezies in einem lipophilen Lösemittel umfaßt, die durch ein hierin beschriebenes Verfahren erhältlich ist.
Im allgemeinen ist bei dieser Art von Zusammensetzung die hydrophobe Phase in der hydrophilen Phase dispergiert.
Es ist überraschend, daß eine stabile zweiphasige Zusammensetzung dieser Art gebildet werden kann, da zu erwarten wäre, daß die hydrophile Spezies nicht in der hydrophoben Phase bliebe, und statt dessen zu der hydrophilen Phase ginge. Es wurde jedoch nachgewiesen, daß dies in vielen Fällen nicht erfolgt und daß die hydrophile Spezies tatsächlich in Verbindung mit der dispergierten hydrophoben Phase bleibt und in freier Lösung nicht vorhanden ist. Es ist möglich, daß dies ein Ergebnis von etwas Restwasser oder anderen hydrophilen Substanzen ist, die an die hydrophile Kopfgruppe des Amphiphilmoleküls gebunden bleiben. Ein Vorteil davon ist, daß eine osmotische Leckage der hydrophilen Spezies kein Problem in den Zusammensetzungen der Erfindung darstellt, wie dies bei einigen bekannten Systemen der Fall ist, insbesondere bei liposomalen Systemen.
Die zweiphasigen Zusammensetzungen können Emulsionen sein, die entweder vorübergehend oder stabil sein können, abhängig von dem Zweck, für den sie benötigt werden. Die durchschnittliche Größe der Emulsionspartikel hängt von der genauen Art sowohl der hydrophoben als auch der wäßrigen Phase ab. Sie kann jedoch im Bereich von 2 um liegen.
Die Dispersion der hydrophoben Zubereitung in der wäßrigen Phase kann durch Mischen, zum Beispiel entweder durch heftiges Verwirbeln über einen kurzen Zeitraum, zum Beispiel etwa 10 bis 60 Sekunden, für gewöhnlich etwa 15 Sekunden, oder durch sanftes Mischen über mehrere Stunden, zum Beispiel unter Verwendung eines Rotationsschwingschüttlers, erreicht werden.
Emulsionen, welche die hydrophoben Zubereitungen der Erfindung enthalten, können auch bei der Zubereitung von Mikrokapseln verwendet werden. Wenn die Emulsion aus einer gelatinehaltigen, wäßrigen Phase gebildet wird, kann die Gelatine durch bekannte Verfahren durch Koazervierung aus der Lösung ausgefällt werden, und bildet einen Film um die Tröpfchen der hydrophilhaltigen hydrophoben Phase. Bei Entfernung der hydrophilen Phase bleiben Mikrokapseln zurück. Diese Technologie ist in der Wissenschaft bekannt, hat sich aber als besonders nützlich in Kombination mit den Zubereitungen der vorliegenden Erfindung erwiesen.
Eine Möglichkeit zur Verwendung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist die orale Abgabe an Säugetiere, einschließlich Menschen, von Substanzen, die unter normalen Umständen in lipophilen Lösemitteln nicht löslich wären. Dies kann für die Abgabe von diätetischen Ergänzungen, wie Vitaminen, oder für die Abgabe von biologisch aktiven Substanzen, insbesondere Proteinen oder Glycoproteinen, einschließlich Insulin und Wachstumshormonen, von Nutzen sein.
In einer weiteren Anwendung ist es möglich, Nahrungsstoffe, wie Vitamine, einzukapseln oder in Mikrokapseln einzuschließen, zum Beispiel durch die zuvor beschriebenen Verfahren, die dann nicht nur als Nahrungsergänzungen für den Menschen sondern auch in der Landwirtschaft und Aquakultur verwendet werden können, wobei ein Beispiel für letztgenannte die Herstellung eines Nährstoffs für die Kultur von Shrimpslarven ist.
Zusätzlich finden die Zusammensetzungen Anwendung bei der Zubereitung von pharmazeutischen oder anderen Formulierungen für die parenterale Verabreichung, wie auch von Formulierungen für die topische oder ophthalmische Verwendung. Für diese Anwendung ist es häufig bevorzugt, eine Emulsion aus der Öllösung und einer wäßrigen Phase, wie zuvor beschrieben, zu verwenden.
Viele therapeutische und prophylaktische Behandlungen sind für eine anhaltende oder verzögerte Freisetzung gedacht oder beinhalten ein Zweikomponentensystem, das zum Beispiel eine Komponente für die sofortige Freisetzung gemeinsam mit einer Komponente für die verzögerte oder anhaltende Freisetzung enthält. Wegen ihrer hohen Stabilität sind die Zubereitungen der vorliegenden Erfindung besonders für die Formulierung eines Makromoleküls geeignet, das für die anhaltende oder verzögerte Freisetzung bestimmt ist.
Die längere Haltbarkeit der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist ein besonderer Vorteil im pharmazeutischen Bereich.
Die Hydrophil-in-Öl-Zubereitungen können in den pharmazeutischen oder verwandten Industrien zur Geschmacksüberdeckung Anwendung finden. Dies ist ein besonderes Problem in der pharmazeutischen Industrie, da viele Medikamente einen unangenehmen Geschmack haben und daher bei Patienten, insbesondere Kindern, unbeliebt sind.
Eine weitere Verwendung ist in der Kosmetikindustrie, wo ebenfalls hydrophobe Zubereitungen von hydrophilen Verbindungen sehr leicht in eine kosmetische Formulierung eingearbeitet werden können. Beispiele für Makromoleküle, die auf diese Weise verwendet werden können, umfassen jene mit einer gewissen befeuchtenden oder enzymatischen Wirkung. Die Erfindung kann auch für das Einarbeiten von Proteinen, wie Kollagen, in dermatologische Cremes und Lotionen verwendet werden.
Schließlich hat die Erfindung zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten in dem Bereich der chemischen und biologischen Synthese, zum Beispiel in der nichtwäßrigen enzymatischen Synthese.
Die Erfindung wird nun mit Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher beschrieben.

BEISPIEL 1

Lachs-Calcitonin wurde in einer Ölphase wie folgt löslich gemacht. Alle Chemikalien, die in diesem und anderen Beispielen verwendet wurden, waren von analytischer oder chemischer Güte.
Gereinigtes Ei-Phosphatidylcholin, aufgelöst in Chloroform/Methanol, 2 : 1 (v/v), wurde zur Bildung eines Trockenfilms rotationsverdampft, und destilliertes Wasser wurde zugegeben, um eine Lipidkonzentration von 100 mg/ml zu erhalten. Nach gründlichem Spülen mit Stickstoff wurde das Lipid durch heftiges Verwirbeln dispergiert, wonach eine Sondenbeschallung über einen Gesamtzeitraum von fünf Minuten folgte, bis eine opaleszente Dispersion kleiner unilamellärer Vesikel (SUV) erhalten wurde. Während des Beschallungsschrittes wurde das Gefäß in ein Eissuspensionsbad getaucht, und die Beschallung wurde in 30 Sekunden Stößen, die von 30 Sekunden Kühlintervallen unterbrochen waren, ausgeführt. Die Suspension von SUVs wurde bei 1000 · g 10 Minuten zentrifugiert, um aggregiertes Lipid zu pelletieren, und der Überstand wurde dekantiert und zweifach in destilliertem Wasser verdünnt, um eine Konzentration von 50 mg Lipid pro ml zu erhalten.
Eine Lösung von Lachs-Calcitonin wurde durch Auflösen von 5 mg Protein auf 1 ml destilliertem Wasser hergestellt, um eine klare Lösung zu erhalten. Gleiche Volumina (0,5 ml) Proteinlösung und Lipiddispersion wurden gemeinsam in ein 10 ml Reagenzglas mit rundem Boden zugegeben und gut gemischt. Die erhaltene Mischung wurde in flüssigem Stickstoff Roll-Schicht-gefrostet und über Nacht unter einem Vakuum von weniger als 0,1 mbar und einer Kondensatortemperatur von - 45ºC lyophilisiert.
Am folgenden Tag wurden 300 mg Oleinsäure BP dem Lyophilisat zugegeben und sanft gemischt, um den gesamten trockenen Feststoff mit dem Öl in Kontakt zu bringen. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von etwa ein bis zwei Stunden bei gelegentlichem Mischen stehengelassen, in welcher Zeit der gesamte Feststoff in dem Öl aufgenommen wurde, um eine einzige klare Lipidphase zu bilden, die optisch transparent war.

BEISPIEL 2

Soja-Phosphatidylcholin SUVs mit einer Konzentration von 100 mg/ml wurden durch Verwirbeln von trockenem Lipid in destilliertem Wasser und anschließende Beschallung, wie in Beispiel 1, hergestellt. Eine wäßrige Lösung aus Lachs-Calcitonin wurde mit 10 mg/ml hergestellt, und eine Teilmenge von 0,8 g wurde in ein Reagenzglas überführt. 1 g SUVs wurde zugegeben und der Inhalt Roll-Schicht-gefrostet und über Nacht gefriergetrocknet. 1,2 g 95% Oleinsäure wurde dem Lyophilisat zugegeben und die Dispersion wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Calcitonin-Zubereitung, die 6,7 mg Proteinlg Oleinsäure enthielt, war vollständig klar.

BEISPIEL 3

Ein aprotininhaltiges Lyophilisat wurde unter denselben Bedingungen, wie zuvor für Lachs-Calcitonin in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt und dann gemeinsam mit Phosphorpentoxid unter Bedingungen, unter welchen zu erwarten ist, daß im wesentlichen das gesamte Wasser, sei es gebunden oder frei, entfernt wird, 5 Tage bei 4ºC in einem Exsikkator gelagert. Die anschließende Dispersion in Oleinsäure war nicht beeinträchtigt, da die Zugabe von 300 mg Oleinsäure eine optisch klare Ölphase ergab.

BEISPIEL 4

Soja-Phosphatidylcholin SUVs mit 100 mg/ml in destilliertem Wasser wurden wie in Beispiel 2 hergestellt. Lachs-Calcitoninlösung mit 20 mg/ml wurde durch Auflösen von 31,8 mg in 1,59 g mit destilliertem Wasser hergestellt, und 0,67 g der klaren Lösung (13,4 mg Protein) wurde mit 1,0 g SUVs (100 mg PC) in einem Reagenzglas gemischt. Die Mischung wurde Roll-Schicht-gefrostet, gefriergetrocknet und dann in Oleinsäure wie in Beispiel 1 dispergiert (aber unter Verwendung von 200 mg Oleinsäure). Die erhaltene klare Ölphase enthielt 42,7 mg Calcitonin/g.

BEISPIEL 5

Ei-PC SUVs mit einer Konzentration von 100 mg PC/ml wurden wie in Beispiel 1 hergestellt. Eine Insulinlösung bei 10 mg/ml wurde hergestellt durch die Zubereitung einer wäßrigen Suspension bei einer geringfügig höheren Konzentration, Zugabe von Eisessig bei einer Rate von 20 mg/g verwendetem Insulin, und anschließende Zugabe von ausreichend Wasser, um die gewünschte Insulinkonzentration zu erhalten. Nach dem Mischen und Stehenlassen über 15 Minuten bildete sich eine klare Lösung. Zu 1,25 ml SUVs in einem Reagenzglas wurden 1,25 ml Insulinlösung zugegeben und die Mischung wurde Roll- Schicht-gefrostet und über Nacht gefriergetrocknet. Am folgenden Tag wurden 0,252 g Oleinsäure zugegeben und das Röhrchen gewirbelt, um das Lyophilisat vollständig zu "befeuchten". Die Zubereitung wurde über Nacht stehengelassen, so daß eine vollständige Dispersion erfolgte, wonach sie das Aussehen einer gelben, optisch klaren Dispersion hatte, die eine starke Opaleszenz aufwies. Nach 7 Wochen Lagerung unter Stickstoff in einem versiegelten Röhrchen bei Raumtemperatur gab es keine sichtbare Veränderung im Aussehen (z. B. Sedimentation) der DPLC-Zubereitung.

BEISPIEL 6

SUVs wurden wie in Beispiel 2 unter Verwendung von 100 mg Soja-Phosphatidylcholin pro g hergestellt, und eine Insulinlösung wurde wie in Beispiel 2 zubereitet. 50 mg SUVs (5 mg PC) und 47 mg Insulinlösung (0,47 mg Protein) wurden einer kleinen Glasampulle zugegeben, gefroren, gefriergetrocknet und in 100 mg Diolein dispergiert. Die anfängliche granuläre Dispersion wurde nach 2 Stunden klar.

BEISPIEL 7

95% reines Ei-Phosphatidylcholin, das in trockener Form bereitgestellt wurde, wurde direkt in destilliertem Wasser durch Verwirbeln aufgelöst, um eine Suspension multilamellärer Vesikel mit einer Phospholipidkonzentration von 100 mg/g zu erhalten. Das Material wurde dreimal bei einem Druck von 20 000 psi durch eine EmulsiFlexTM Vorrichtung nach den Anweisungen des Herstellers extrudiert. Die erhaltene opaleszente Dispersion wurde mit destilliertem Wasser auf 50 mg/ml verdünnt, mit Stickstoff gespült und bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert. 30 mg Lachs-Calcitonin wurden gemeinsam mit 30 mg Aprotinin in 6 ml destilliertem Wasser aufgelöst und dann mit 39,6 ml der wie oben zubereiteten Phospholipiddispersion gemischt. Die Mischung wurde in Teilmengen passender Größe abgegeben, Roll-Schicht-gefrostet, gefriergetrocknet und dann wurden insgesamt 47,52 g Glycerol-Monooleat BP (durch Erwärmen auf 40ºC geschmolzen) zugegeben, wobei wie in Beispiel 1 beschrieben gemischt wurde, um eine optisch klare, opaleszente Dispersion von DPLC zu erhalten.

BEISPIEL 8

Synthetisches Dipalmitylphosphatidylcholin wurde in einer Lösemittelmischung von Chloroform/Methanol, 2 : 1 (v/v) aufgelöst und dann zur Bildung eines Dünnfilms rotationsverdampft. Das getrocknete Lipid wurde in destilliertem Wasser bei einer Konzentration von 30 mg/ml dispergiert und beschallt, um eine opaleszente Dispersion von SUVs zu bilden. Das Verfahren war im allgemeinen ähnlich Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß die Temperatur bei etwa 45ºC gehalten wurde, d. h., über der Übergangstemperatur des Lipids. Eine Lösung aus Insulin bei 10 mg/ml wurde wie in Beispiel 4 hergestellt, und 0,14 ml Teilmengen (1,4 mg Protein) wurden gemeinsam mit 0,5 g Teilmengen SUVs (15 mg DPPC) in kleine Röhrchen überführt. Die Mischungen wurden Roll-Schicht-gefrostet und gefriergetrocknet und die erhaltenen Lyophilisate wurden in 300 mg Oleinsäure dispergiert, um klare "Lösungen" von Protein zu erhalten. Vergleichende Experimente zeigten, daß es nicht notwendig ist, über der Übergangstemperatur zu arbeiten, wenn die Lyophilisate dispergiert werden.

BEISPIEL 9

Eine mizelläre Lösung von Ei-Lysophosphatidylcholin in Wasser wurde mit einer Konzentration von 36 mg/ml hergestellt, und 0,137 ml in ein kleines Röhrchen überführt. Eine Lösung aus Insulin mit 10 mg/ml wurde wie in Beispiel 4 hergestellt und 0,137 ml wurden in das obengenannte Röhrchen überführt. Der Inhalt des Röhrchens wurde Roll-Schichtgefrostet, gefriergetrocknet und dann mit 0,3 g Oleinsäure gemischt, um eine klare Dispersion herzustellen, die 4,6 mg Insulin/g Oleinsäure enthielt, mit einer Extinktion von 0,023 bei 600 nm.

BEISPIEL 10

Soja-Phosphatidylcholin SUVs mit 100 mg/ml wurden wie in Beispiel 2 hergestellt und eine Insulinlösung, die 10 mg/ml enthielt, wurde wie in Beispiel 4 hergestellt. In jedes von 5 Röhrchen wurde 0,1 ml Insulinlösung (1 mg Protein) und 0,3 mg SUVs (30 mg PC) zugegeben und die Mischungen wurden Roll-Schicht-gefrostet und über Nacht gefriergetrocknet. Die erhaltenen Lyophilisate wurden jeweils in 300 mg in einem von einer Reihe von fraktioniertem Kokosnußöl, nämlich Miglyol 810, 812, 818, 829 und 840, dispergiert (das Wort Miglyol ist eine Schutzmarke). Alle Zubereitungen mit Ausnahme jener, der Miglyol 829 zugegeben worden war, dispergierten rasch zur Bildung opaleszenter "Lösungen", während die letztgenannte ein dickes, undurchsichtiges Gel bildete. Die Dispersionen wurden beim Stehen klarer, so daß am folgenden Tag Miglyol 812, 818 und 849 vollständig klar und Miglyol 810 leicht opaleszent waren. Miglyol 829 blieb ein trübes Gel.

BEISPIEL 11

Soja-Phosphatidylcholin SUVs wurden wie in Beispiel 2 hergestellt, und eine Lachs- Calcitoninlösung wurde mit 10 mg/ml hergestellt. 100 ul Calcitoninlösung (1 mg Protein) und 300 mg SLTVs (30 mg PC) wurden jedem von 6 kleinen Reagenzgläsern zugegeben und der Inhalt wurde Roll-Schicht gefrostet und gefriergetrocknet. Jedem von 5 der Lyophilisate wurden 300 mg Miglyol 810, 812, 818, 829 oder 840 zugegeben, während 300 mg mittelkettiges Triglycerid- (MCT) Öl dem sechsten zugegeben wurde. Nach dem Mischen waren alle Zubereitungen opaleszent oder trüb, wurden aber beim Stehen klarer. Bis zum folgenden Morgen waren die Dispersionen in Miglyol 810 und 840 trüb, jene in MCT-Öl und Miglyol 812 waren opaleszent und jene in Miglyol 818 und 829 waren vollständig klar. Bei sanfter Erwärmung wurden die opaleszenten und trüben Dispersionen klar, nahmen aber ihre frühere Form wieder an, nachdem sie über Nacht bei Raumtemperatur gestanden waren.

BEISPIEL 12

Eine wäßrige Lösung von Candida cylindericae Lipase mit 10 mg/g wurde gemeinsam mit einer Zubereitung von Soja-Phosphatidylcholin SUVs mit 100 mg/ml (siehe Beispiel 2) hergestellt. 50 ul Teilmengen einer Lipaselösung (0,5 mg Protein) wurden mehreren kleinen Reagenzgläsern zugegeben und jedem wurden 100 ul SUVs (10 mg PC) zugegeben. Die Mischungen wurden sofort gefroren, gefriergetrocknet, mit Stickstoff gespült und dann mit Parafilm vor dem Lagern im Gefrierschrank versiegelt. Eines der Lyophilisate wurde aufgetaut und mit 0,44 g Linolsäure gemischt, wobei sich nach 30 Minuten eine vollständige klare Dispersion aus DPLC bildete. 0,1 g Cholesterol wurde in dem Öl aufgelöst und das Röhrchen mit Stickstoff gespült, mit Parafilm versiegelt und in einen 37ºC Inkubator überführt. Nach 2 Tagen wurde die Mischung durch Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie analysiert und zeigte, zusätzlich zu den anfänglichen Reaktanten, einen Fleck mit identischem Rf-Wert zu einem Standard von Cholesterollinoleat. Dies zeigt, daß das Enzym, das innerhalb der Ölphase löslich gemacht wurde, katalytisch aktiv ist. Diese synthetische Veresterungsreaktion steht im Gegensatz zu den normalen hydrolytischen Prozessen, die für gewöhnlich mit der Lipasewirkung verbunden sind.

BEISPIEL 13

Soja-Phosphatidylcholin SUVs mit 100 mg/ml wurden wie in Beispiel 2 hergestellt. Zwei 0,15 ml Teilmengen (15 mg PC) wurden in kleine Reagenzgläser eingebracht und 0,33 g einer wäßrigen Lösung aus Pilztyrosinase mit 3 mg/ml wurde jedem zugegeben. Der Inhalt wurde Roll-Schicht-gefrostet und gefriergetrocknet. Einem Lyophilisat wurde 0,3 g Oleinsäure zugegeben, und dem anderen 0,3 g MCT-Öl, wonach die Röhrchen durch Verwirbeln gemischt wurden. Die MCT-Zubereitung bildete nach 45 Minuten eine klare braune Dispersion, während jene der Oleinsäure 2 Stunden brauchte.
Die Dispersionen wurden gegen 2 getrennte Substrate für das Enzym, Catechol und Tyrosin, getestet, und die Ergebnisse wurden mit jenen verglichen, die mit einer wäßrigen Lösung aus freiem Enzym erhalten wurden. Jede Reaktion wurde in Gegenwart von Prolin ausgeführt. Bei Verwendung eines freien Enzyms wurde jedes Substrat allmählich zu einem stark gefärbten Pigment umgewandelt. In Gegenwart der DPLC-Dispersionen trat die Pigmentbildung jedoch bei Catechol, nicht aber bei Tyrosin auf. Die Farbstärke war bei der Oleinsäurezubereitung geringer als bei MCT-Öl, wahrscheinlich aufgrund einer Auswirkung des schwachen pH auf die Enzymaktivität. Dasselbe Muster der Substratumwandlung wurde beobachtet, wenn die Ölphasen vorübergehend innerhalb der wäßrigen Phase durch Verwirbeln emulgiert wurden. Bei Ausführung der Emulgierung in Gegenwart von Triton X100 TM trat die Pigmentbildung jedoch bei beiden Substraten auf.
Die vorgeschlagene Erklärung für das beobachtete Verhalten ist, daß Catechol imstande ist, sich in das Öl abzutrennen und Zugang zu dem eingekapselten Enzym zu erlangen, während Tyrosin auf die wäßrige Phase begrenzt ist. Das Chinonprodukt der Enzymwirkung auf Catechol kann sich dann zurück in die wäßrige Phase trennen und mit Prolin in Wechselwirkung treten, um ein gefärbtes Produkt zu bilden. Dieses Experiment zeigt, daß das Enzym in einer aktiven Form innerhalb des Öls eingekapselt ist, und nicht während der Dispersion in die wäßrige Phase freigesetzt wird. Wenn jedoch ein oberflächenaktives Mittel, wie Triton X100TM zugegeben wird, wird das Enzym freigesetzt und kann frei auf jedes Substrat wirken.

BEISPIEL 14

Kolloidales Gold, mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 30 nm, wurde hergestellt und durch die Zugabe von Rinderalbumin auf 0,001% stabilisiert. 0,2 g weinrotes Goldsol wurde gemeinsam mit 0,2 g Ei-Phosphatidylcholin SUVs mit einer Konzentration von 100 mg/ml, wie in Beispiel 1 hergestellt, in ein kleines Röhrchen gewogen. Die Mischung wurde Roll-Schicht-gefrostet, gefriergetrocknet und dann mit 0,3 g Oleinsäure gemischt. Nach etwa 2 Stunden bei gelegentlichem Schütteln hatte sich die Di persion vollständig geklärt und bildete eine rote Ölphase, die dem ursprünglichen wäßrigen Goldsol ziemlich ähnlich sah.

BEISPIEL 15

1 mg des Peptidantibiotikums Nisin wurde mit 0,2 g derselben Ei-Phosphatidylcholin SUYs vermischt, die für Beispiel 14 verwendet wurden, und auf gleiche Weise behandelt. Es bildete sich innerhalb von 2 Stunden eine kristallklare Dispersion.

BEISPIEL 16

Tyrosinase wurde wie in Beispiel 13 beschrieben in Oleinsäure eingearbeitet. Ein Teil (auf das Gewicht bezogen) dieser Dispersion wurde zu vier Teilen 20% wäßriger Gelatine zugegeben, die auf 50ºC erwärmt war, rasch durch Verwirbeln vermischt und dann in einen kleinen Becher überführt, wo mit dem Mischen unter Verwendung eines magnetischen Rührers fortgefahren wurde. Zwei Teile von 20% wäßrigem Natriumsulfat wurden gleichmäßig zugetropft und die Mischung wurde dann in 40 Teile von 7% wäßriger Gelatine bei 15ºC gegossen, während letztgenannte magnetisch gerührt wurde. Mit dem Mischen wurde eine weitere Minute fortgefahren und dann wurde ein Teil der erhaltenen Gelatine-Mikrokapseln unter Verwendung von Catechol und Tyrosin als Substrat auf Enzymaktivität getestet. Wie in Beispiel 13 ersichtlich ist, trat eine Farbbildung bei Catechol, aber nicht bei Tyrosin auf, was darauf hinweist, daß die Enzym/Lipid-Komplexe während der Mikroeinkapselung des Öls innerhalb der Ölphase intakt geblieben waren.

BEISPIEL 17

10 mg Cytochrom C, Hämoglobin und FITC-Dextran wurden jeweils in 1 ml destilliertem Wasser aufgelöst. 4,4 mg RNA (aus Torulahefe extrahiert) wurden in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufgelöst. 2 · 50 ul jeder dieser Lösungen wurden in frische Glasröhrchen eingebracht, und jeweils einem dieser Sätze von Lösungen wurden 250 ul SUVs, die wie in Beispiel 1 hergestellt worden waren, bei einer Konzentration von 40 mg/ml Eigelb-Lecithin (PC) zugegeben.
Beide Sätze von Röhrchen wurden wie zuvor Roll-Schicht-gefrostet und über Nacht lyophilisiert. Am folgenden Tag wurden 300 ul Oleinsäure jedem der Röhrchen zugegeben. Die Proben wurden bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Verwirbeln eine Stunde stehengelassen, bis eine vollständige Dispersion erreicht war. Die Öle wurden über Nacht stehengelassen. Die Trübung der ohne PC zubereiteten Proben war stärker als jener, die PC enthielten.
Am folgenden Tag hatten sich in den Proben, die ohne PC hergestellt worden waren, Sedimente abgesetzt. Ohne eine der Proben zu stören, wurden die oberen 150 ul jeder Probe entnommen und die Extinktion sowohl des entfernten Materials als auch des zurückgebliebenen Materials nach dem Mischen gemessen; ein Vergleich der beiden Ablesungen ermöglichte die Berechnung der Sedimentation in Prozent für Proben mit und ohne PC (Fehler in den Messungen ± 5%). Die erhaltenen Werte sind in der Folge aufgelistet.

BEISPIEL 18

Verfahren wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß Proteinlösungen aus Ferritin oder Meerrettichperoxidase (HRPO) mit einer Konzentration von 10 mg/ml in Ammoniumacetat (10 mg/ml) bestanden, und die SUVs aus Eigelb-Phosphatidylcholin bei einer Konzentration von 50 mg/ml in Ammoniumacetat (ebenfalls 10 mg/ml) bestanden. Nach dem Lyophilisieren und Dispergieren in Oleinsäure wurden optisch klare Lösungen erhalten (obwohl die Ferritinlösung eine gewisse Opaleszenz zeigte und stark gefärbt war).
Die HRPO-Lösung wurde in zwei gleiche Teile geteilt und ein Teil wurde fünf Gefrier-Auftau-Zyklen unterzogen, indem wiederholt auf +4ºC gekühlt wurde, wobei die Oleinsäure sich jedesmal verfestigte, bevor sie wieder auf Raumtemperatur gebracht wurde. Es wurde kein Unterschied in der optischen Klarheit zwischen den gefrorenen-getauten Proben und den unberührt gelassenen Proben beobachtet.

BEISPIEL 21

Verfahren wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß Proteinlösungen aus Meerrettichperoxidase (HRPO) mit einer Konzentration von 10 mg/ml in destilliertem Wasser bestanden, und die SUVs aus Eigelb-Phosphatidylcholin bestanden und unter Verwendung des EmulsiflexTM-Verfahrens, das in Beispiel 7 beschrieben ist, bei einer Konzentration von 50 mg/ml hergestellt wurden. Nach dem Lyophilisieren wurde das feste Material entweder in Fhytol oder Glycerol-Monooleat dispergiert. In jedem Fall wurden optisch klare Lösungen erhalten.

BEISPIEL 22

Weizenkeim-tRNA wurde in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von 5 mg/ml aufgelöst, und 50 ul Teilmengen der Lösung wurden mit 100 ul oder 50 ul SUVs gemischt, die aus Soja-PC mit einer Konzentration von 50 mg/ml in destilliertem Wasser bestanden. Die Verhältnisse von PC zu tRNA betrugen 20 : 1 bzw. 10:I. Die Mischungen wurden bei -20ºC gefroren und lyophilisiert, um einen trockenen weißen Kuchen zu erhalten. Die Zugabe von 100 ul Oleinsäure, auf welche ein sanftes Mischen auf einem Rotationsschwingschüttler folgte, ergab eine optisch klare Lösung für das 20 : 1 PC : RNA Verhältnis, im Gegensatz zu 10 : 1 RC : RNA, oder tRNA in Abwesenheit von PC, die trübe Suspensionen ergaben, die optisch undurchsichtig waren, wie durch OD-Ablesungen bei 650 nm gezeigt wurde.

BEISPIEL 23

Aprotinin wurde in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst. Hexadecylphosphocholin (HDPoC) wurde in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von 100 mg/ml gelöst. Zu Teilmengen von 100 ul Aprotininlösung wurden Volumina von HDPoC im Bereich von 0 durchgehend bis 10, 20, 30, 40 bis 50 ul zugegeben. Die Mischungen wurden bei -20ºC gefroren und über Nacht lyophilisiert. Am folgenden Tag wurden 100 ul Oleinsäure jeder Probe zugegeben und eine Stunde heim Raumtemperatur auf einem Rotationsschwingschüttler geschüttelt. Optisch klare Lösungen wurden bei Lipid : Protein-Verhältnissen von 4 : 1 und 5 : 1 erhalten, wie die OD-Ablesungen bei 650 nm zeigten.

BEISPIEL 24

4 mg Peroxidase wurden in 4 ml destilliertem Wasser aufgelöst, und 100 ul Teilmengen wurden in 2 ml Glasampullen mit Schraubverschluß eingebracht. 100 ul beschallte DMPC (Dimyristoylphosphatidylcholin, 100 mg/ml in destilliertem Wasser) wurden jeder Ampulle zugegeben, gut gemischt und lyophilisiert.
Als die Mischung vollständig trocken war, wurde der Protein/Lipid-Komplex durch Zugabe von 100 ul tertiärem Butanol, entweder alleine oder OPD (ortho-Phenyldiamin) in Lösung zu einer Konzentration von 3 mg/10 ml enthaltend, dispergiert. Kontrollen wurden durch Zugabe von t-Butanol ± OPD zu Röhrchen hergestellt, die entweder leer waren oder DMPC in Abwesenheit von Enzym enthielten. Von jeder Kombination wurden Duplikate hergestellt, und einem Satz von Röhrchen wurden 10 ul Cumolhydroxidsubstrat unter Mischen zugegeben. Nach dem Stehenlassen bei Raumtemperatur über eine halbe Stunde wurde die optische Dichte jeder Probe bei 450 nm in einem Mikroplattenlesegerät abgelesen. Die nach Hintergrundssubtraktion erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle dargestellt.

BEISPIEL 25

Octylglucosid wurde in destilliertem Wasser aufgelöst und in Vertiefungen einer Mikroplatte eingebracht, um die folgenden Mengen Amphiphil pro Vertiefung zu erhalten:- 0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 5, 7,5 und 10 mg. Aprotinin wurde in destilliertem Wasser zu einer Konzentration von 5 mg/ml aufgelöst, und 100 ul wurden in jede der obengenannten Vertiefungen eingebracht, die 0,5 mg Protein enthielten. Die Platte wurde gut gemischt, bei -20ºC eingefroren und über Nacht lyophilisiert. Am folgenden Tag wurden jeder Vertiefung 100 ul Oleinsäure zugegeben. Die Platte wurde bei Raumtemperatur geschüttelt und es wurden optische Dichtemessungen bei 550 nm in Intervallen mit einem Plattenlesegerät vorgenommen. Ein geringer Extinktionswert zeigt einen geringen Streuungswert an und entspricht einer effektiven Dispersion von Protein in Öl.
Unter Anwendung der zuvor beschriebenen Methode wird die Wirkung der Zugabe von Octylglucosid, das als Amphiphil wirkt, in der Unterstützung der Dispersion von Aprotinin in Oleinsäure demonstriert. Die Ergebnisse, die im Sinne einer optischen Dichte als Funktion der Octylglucosidkonzentration (bei konstanter Proteinkonzentration) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe von Oleinsäure angegeben sind, sind in der Tabelle und der beiliegenden Graphik angeführt.

BEISPIEL 26

10 mg Melanin wurde zu 1 ml destilliertem Wasser zugegeben und nach Erhöhung des pH mit Ammoniumhydroxidlösung aufgelöst. 50 ul dieser konzentrierten Lösung wurden 20-fach durch Zugabe von 950 ul destilliertem Wasser verdünnt. Zu zwei Reihen von sieben Vertiefungen einer Mikroplatte wurden 0, 12,5, 25, 37,5 und 50 ul der verdünnten Lösung und 12,5 und 25 ul der konzentrierten Lösung zugegeben. Jeder Vertiefung einer Reihe wurden 100 ul einer Soja-Phosphatidylcholindispersion zugegeben, die durch Beschallung über zehn Minuten unter Kühlung mit einer Konzentration von 100 mg/ml hergestellt worden war. Die andere Reihe blieb unberührt. Die Platte wurde gut gemischt, bei -20ºC eingefroren und über Nacht lyophilisiert. Am folgenden Tag wurden 100 ul M818 zu den Vertiefungen in der Reihe zugegeben, die den Melainin/Lipid-Komplex enthielten, und 100 ul destilliertes Wasser wurde den Vertiefungen in der Reihe zugegeben, die nur Melanin enthielten. Sobald alle Lösungen, die eine rotbraune Farbe aufwiesen, vollständig klar wurden, wurden die optischen Dichten bei 600 nm für alle Melaninkonzentrationen gemessen. Aus der Tabelle und der beiliegenden Graphik geht hervor, daß dem Beer-Lambert'schen Gesetz über diesen Konzentrationsbereich gefolgt wird (d. h., die Reaktionskurve ist linear), und daß das Verhalten von Melanin für Öl- und wäßrige Lösungen identisch ist. Melanin, das in M818 durch Beschallung in Abwesenheit von Phosphatidylcholin dispergiert wurde, ergab eine schwarze Dispersion; die nach einer Zentrifugation sedimentierte und einen klaren Überstand ergab. Es wurden keine derartigen Änderungen nach der Zentrifugation des in M818 dispergierten Melanin/Lipid-Komplexes beobachtet.

BEISPIEL 27

Eine Dispersion aus Soja-Phosphatidylcholin wurde durch Sondenbeschallung über zehn Minuten mit einer Konzentration von 100 mg/ml in destilliertem Wasser bei Kühlung hergestellt. Ein Milliliter dieser Suspension wurde in ein Glasgefäß eingebracht und 660 ul einer Lösung aus Neomycinsulphat (5 mg/ml in destilliertem Wasser) zugefügt. Nach dem Mischen wurde der Inhalt des Röhrchens in flüssigem Stickstoff Roll-Schicht-gefrostet und über Nacht lyophilisiert. Am folgenden Tag wurde 1 g Miglyol 818 zugegeben, das Gefäß mit Stickstoff gespült, gut versiegelt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Eine optisch klare Lösung wurde erhalten.

BEISPIEL 28

Es wurde dasselbe Verfahren wie in Beispiel 27 angewendet, mit der Ausnahme, daß anstelle von Neomycinsulphat Vasopressin verwendet wurde.

BEISPIEL 29

Es wurde dasselbe Verfahren wie in Beispiel 27 angewendet, mit der Ausnahme, daß anstelle von Neomycinsulphat 5-Fluoruracil verwendet wurde.

BEISPIEL 30

Es wurde dasselbe Verfahren wie in Beispiel 27 angewendet, mit der Ausnahme, daß anstelle von Neomycinsulphat 5-Fluodesoxyuridin verwendet wurde.

BEISPIEL 31

0,55 ml Ribonukleaselösung (enthaltend 10 mg RNAse/ml) wurde mit 1,6 ml Soja- PC SUV gemischt, die wie in Beispiel 2 hergestellt wurden, in flüssigem Stickstoff Roll- Schicht-gefrostet und über Nacht gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wurde mit 1,6 g Miglyol 818 gemischt, verwirbelt und stehengelassen. Nach mehreren Stunden bildete sich eine klare Dispersion.

Beispiel 32

Zu 32 ug Plasmid-DNA in 40 ul wäßriger Lösung wurden 40 ul 0,2 mM Sperminlösung zugegeben; die Zubereitung wurde gemischt und 15 Minuten stehengelassen, so daß eine DNA-Kondensation eintrat. Soja-PC SUVs wurden wie in Beispiel 2 hergestellt, enthielten aber 50 mg PC/g, und 40 ul wurden der DNA/Sperminmischung zugegeben. Die Zubereitung wurde eingefroren, über Nacht gefriergetrocknet und 100 ul Miglyol 8I8 wurden dem erhaltenen Lyophilisat zugegeben. Die Zubereitung dispergierte über einen Zeitraum von 1 Stunde, um eine klare Dispersion zu erhalten.

BEISPIEL 33

Zwei Reihen von 3 kleinen Reagenzgläsern wurden errichtet. Jedem Glas in der ersten Reihe wurden 57 ul einer Lösung zugegeben, die 10 mg Insulin/ml enthielt und wie in Beispiel 5 hergestellt worden war. Jedem Glas in der zweiten Reihe wurden 0,2 ml 0,267 mM Carboxyfluorescein (CF) zugegeben. Soja-PC SUV, die 100 mg PC/ml enthielten, wurden wie in Beispiel 2 hergestellt, und 0,2 ml wurden jedem Glas zugegeben. Der Inhalt des Glases wurde vermischt, Roll-Schicht-gefrostet und über Nacht gefriergetrocknet. Schmelzen der Triglyceride mit hohem Schmelzpunkt, Tripalmitin (TP), Triheptadecanoin (TH) und Tristearin (TS), die jeweils 2% (w/w) Oleinsäure enthielten, wurden durch Zugabe der richtigen Bestandteile, Erwärmen auf 78ºC bis zum Eintreten der Verflüssigung und anschließendes kurzes Verwirbeln hergestellt. Die Lyophilisate wurden in einem Ofen auf dieselbe Temperatur erwärmt. Zu den Gläsern 1, 2 und 3 der insulinhaltigen Lyophilisate wurden 150 mg der TP-, TH bzw. TS-haltigen Schmelzen zugegeben. Zu den Gläsern 1, 2 und 3 der CF-haltigen Lyophilisate wurden 100 mg der Schmelzen in derselben Reihenfolge zugegeben. Nach jeder Zugabe wurden die Gläser verschlossen, kurz verwirbelt und dann in den Ofen zurückgestellt. Nach mehreren Minuten waren alle CF-Dispersionen vollständig klar. Die Insulinzubereitungen klärten sich über einen Zeitraum von 1 bis 2 Stunden und bildeten nahezu klare Dispersionen.

BEISPIEL 34

Eine Reihe von Lyophilisaten wurde hergestellt, von welchen jedes 0,3 mg Glucose (abgeleitet von einer Lösung, die 1,5 mg/ml enthielt) und 6 mg Soja-PC (abgeleitet von SUV, die wie in Beispiel 2 hergestellt worden waren) enthielt. Zu 3 Lyophilisaten wurden 300 mg Octanol, Oleinsäure bzw. Miglyol 818 zugegeben. Die Octanolzubereitung dispergierte in wenigen Minuten und die Oleinsäure- und Miglyolzubereitungen über 2 bis 3 Stunden, um eine klare Dispersion zu bilden.

BEISPIEL 35

Lyophilisate wurden hergestellt, die von 0,8 ml 25 mM Kalziumchlorid gemeinsam mit 0,8 ml Soja-PC SUV (hergestellt wie in Beispiel 2) abgeleitet waren. Einem wurden 500 mg Miglyol 818 zugegeben und dem anderen 500 mg Oleinsäure. Die Oleinsäurezubereitung bildete nach mehreren Stunden eine vollständig klare Dispersion, und die Miglyolzubereitung, nachdem sie über Nacht gestanden war.

BEISPIEL 36

Getrennten kleinen Glasampullen wurde 1 mg Aprotinin und 1 mg Insulin, jeweils in Form von 100 ul einer Lösung, die 10 nig/ml enthielt, zugegeben. Die Insulinlösung wurde wie in Beispiel 5 hergestellt. Jeder Ampulle wurden dann 0,2 ml AOT (geliefert als 10% (w/v) Lösung in Wasser) zugegeben. Die Mischungen wurden Roll-Schicht-gefrostet, über Nacht lyophilisiert, und jeder 200 mg Octanol zugegeben. Die Aprotininzubereitung klärte sich rasch, aber nach 24 Stunden hatte sich eine opaleszente Dispersion gebildet. Die Insulinzubereitung dispergierte langsamer, war aber klar, nachdem sie über Nacht gestanden war.

BEISPIEL 37

20 ul Lipaselösung, die 0,8 mg Mucor mehii Lipase enthielt, wurde jeder von 2 kleinen Glasampullen zugegeben. Einer Ampulle wurden 89 gl einer mizellären Lösung zugegeben, die 36 mg LysoPC/ml enthielt, und der anderen 96 ul Soja-PC SUV, die wie in Beispiel 2 hergestellt worden waren. Der Inhalt jeder Ampulle wurde gemischt, in flüssigem Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Jedem Lyophilisat wurden 500 mg Linolsäure zugegeben, die 88 mg Cholesterollg und 1 mg α-Tocopherollg enthielt. Die Ampullen wurden mit Stickstoff gespült, versiegelt und zu einem Walzenmischer für 2 Stunden überführt, wonach sich jeweils eine klare Dispersion gebildet hatte. Die Ampullen wurden dann über Nacht bei 50ºC in einem Heizblock inkubiert. Die Mischungen, gemeinsam mit geeigneten Kontrollen, wurden durch Dünnschichtchromatographie analysiert, und es zeigte sich, daß in jeder Zubereitung Cholesterollinoleat biosynthetisiert war.
Es ist daher offensichtlich, daß die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Einarbeiten einer hydrophilen Spezies in eine lipophile Lösung sowie ein vielseitiges Produkt, das viele verschiedene Anwendungsformen hat, bereitstellt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer im wesentlichen wasserfreien, einphasigen, hydrophoben Zubereitung, welcher eine hydrophile Spezies, in einem hydrophoben Lösemittel aufweist, wobei das Verfahren umfaßt:

(i) entweder

(a) das Vermischen der hydrophilen Spezies mit einem mizellenbildenden Amphiphil in einem hydrophilen Lösemittel, um eine mizelläre Lösung zu erhalten; oder

(b) das Vermischen der hydrophilen Spezies mit einer Dispersion aus kleinen, unilamellären Amphiphilvesikel in einem hydrophilen Lösemittel;

(ii) das Entfernen des hydrophilen Lösemittels, um eine Anordnung von Amphiphilmolekülen zu erhalten, deren hydrophile Kopfgruppen zu der hydrophilen Spezies ausgerichtet sind, und wobei keine chemische Wechselwirkung zwischen dem Amphiphil und der hydrophilen Spezies stattfindet; und

(iii) das Dispergieren der hydrophilen Spezies/Amphiphil-Anordnung in einem hydrophoben Lösemittel, vorausgesetzt, daß das hydrophobe Lösemittel kein langkettiges Triglycerid, wie SUPPOSIRE AMTM, ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hydrophile Spezies ein Makromolekül, ein kleines organisches oder anorganisches Molekül oder eine kolloidale Substanz umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Makromolekül ein Protein, Glycoprotein, eine Oligo- oder Polynukleinsäure, ein Polysaccharid oder eine supramolekulare Anordnung davon umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Protein Insulin, Calcitonin, Hämoglobin, Cytochrom C, Meerrettichperoxidase, Aprotinin, Pilztyrosinase, Erythropoetin, Somatotropin, Wachstumshormon, Wachstumshormonfreisetzungsfaktor, Galanin, Urokinase, Faktor IX, Gewebeplasminogenaktivator, Superoxiddismutase, Katalase, Peroxidase, Ferritin, Interferon, Faktor VIII oder Fragmente davon ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Amphiphil ein Phospholipid ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Phospholipid eine Phosphatidylcholin- Kopfgruppe hat.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Phospholipid Phosphatidylcholin (PC), Lyso-Phosphatidylcholin (Lyso-PC), Sphingomyelin, ein Derivat eines der obengenannten, wie Hexadecylphosphatidylcholin oder ein Amphiphilpolymer ist, das Phosphatidylcholin enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das hydrophobe Lösemittel eine langkettige Fetsäure, einen mittelkettigen Alkohol, einen verzweigten langkettigen Alkohol, ein Monoglycerid, Diglycerid oder ein mittelkettiges Triglycerid umfaßt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Amphiphil PC umfaßt und das hydrophobe Lösemittel ein Triglycerid ist, oder wobei das Amphiphil Lyso-PC umfaßt und das hydrophobe Lösemittel Oleinsäure ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das hydrophile Lösemittel Wasser ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Gewichtsverhältnis von Amphiphil zu hydrophiler Spezies 1 : 1 bis 100 : 1 beträgt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das hydrophile Lösemittel durch Lyophilisation entfernt wird.

13. Im wesentlichen wasserfreie, einphasige, hydrophobe Zubereitung einer makromolekularen, hydrophilen Spezies in einem hydrophoben Lösemittel, die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 erhältlich ist.

14. Im wesentlichen wasserfreie, einphasige, hydrophobe Zubereitung, umfassend eine makromolekulare, hydrophile Spezies und ein Amphiphil in einem hydrophoben Lösemittel, dadurch gekennzeichnet, daß die Amphiphilmoleküle um die Komponenten der makromolekularen, hydrophilen Spezies angeordnet sind, wobei die hydrophilen Kopfgruppen der Amphiphilmoleküle zu der makromolekularen, hydrophilen Spezies gerichtet sind, wobei die Komponenten der makromolekularen, hydrophilen Spezies nicht mit Wasser assoziiert sind, und daß keine chemische Wechselwirkung zwischen den Amphiphilmolekülen und der makromolekularen, hydrophilen Spezies besteht; vorausgesetzt, daß das hydrophobe Lösemittel kein langkettiges Triglycerid, wie SUPPOSIRE AMTM, ist.

15. Zubereitung nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, welcher weitere kleine Moleküle aufweist.

16. Zubereitung nach Anspruch 15, wobei die kleinen Moleküle Salze der Gallensäure, pharmazeutische Mittel oder Vitamine, in Verbindung mit hydrophilen Spezies sind.

17. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung aus hydrophiler Spezies/Amphiphil, die nicht imstande ist, Liposome zu bilden, wenn der Anordnung Wasser zugegeben wird, wobei das Verfahren das Vermischen der hydrophilen Spezies mit einem Amphiphil in einem hydrophilen Lösemittel umfaßt, wobei das Amphiphil Mizellen in dem hydrophilen Lösemittel bildet, und wobei die Mischung eine mizelläre Lösung ergibt, sowie das Entfernen des hydrophilen Lösemittels.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das hydrophile Lösemittel Wasser ist.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, wobei das Gewichtsverhältnis von Amphiphil zur hydrophilen Spezies 1 : 1 bis 100 : 1 beträgt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei das hydrophile Lösemittel durch Lyophilisation entfernt wird.

21. Anordnung aus hydrophiler Spezies/Amphiphil, die durch eine Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20 erhältlich ist.

22. Zweiphasige Zusammensetzung, umfassend eine hydrophile Phase und eine hydrophobe Phase, wobei die hydrophobe Phase eine Zubereitung nach einem der Ansprüche 13 bis 16 umfaßt.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei die hydrophobe Phase in einer kontinuierlichen hydrophilen Phase dispergiert ist.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 22 oder Anspruch 23, die eine Emulsion ist.