DE69524624T2

DE69524624T2 - Saponinzubereitungen und deren verwendung in iscoms

Info

Publication number: DE69524624T2
Application number: DE69524624T
Authority: DE
Inventors: Robert Coulter; Cooper Cox; Karin Lovgren-Bengtsson; Bror Morein; Bo Sundquist
Original assignee: Iscotec AB
Current assignee: Iscotec AB
Priority date: 1994-10-12
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 2002-05-16
Anticipated expiration: 2015-10-13
Also published as: NO971622L; NO971622D0; FI971498A7; ATE210463T1; FI971498A0; CA2201611C; AUPM873294A0; FI971498L; WO1996011711A1; NZ293882A; EP0785802A4; JPH10508301A; CA2201611A1; DE69524624D1; EP0785802A1; EP0785802B1; US6352697B1; ZA958600B

Description

Diese Erfindung betrifft Saponinpräparate, besonders Saponinpräparate, die auf definierten Zusammensetzungen von gereinigten Saponin-Fraktionen basieren, gewonnen aus der Rinde von Quillaja saponaria Molina. Die Erfindung erstreckt sich auch auf immunstimulierende Komplex (Iscom) -Matrizen, hergestellt unter Verwendung dieser Saponinpräparate, und ebenso auf immunogene Iscoms, worin Immunogene in eine Iscom-Matrix eingearbeitet oder mit dieser verbunden sind. Solche Immunogene werden normalerweise von Bakterien, Viren oder anderen Mikroorganismen stammende Proteine oder Peptide sein, aber sie können zusätzlich auch jedes andere Protein, jedes Peptid oder jeder chemische Anteil sein, die eine Immunantwort induzieren kann.
Die Saponinpräparate dieser Erfindung und Iscom-Matrizen, die unter deren Verwendung hergestellt werden, haben eine besondere Aktivität als Adjuvantien, das bedeutet als Produkte, die in einer spezifischen Steigerung der Immunogenität einer Impfstoff-Zusammensetzung resultieren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die adjuvanten Eigenschaften von Saponin sind seit langem bekannt, genauso wie seine Fähigkeit, Antikörpertiter gegen Immunogene zu erhöhen. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Saponin" auf eine Gruppe von oberflächenaktiven Glykosiden pflanzlichen Ursprungs, zusammengesetzt aus einer hydrophilen Region (normalerweise mehrere Zuckerketten) in Verbindung mit einer hydrophoben Region von entweder einer Steroid- oder Triterpenoid- Struktur. Obwohl Saponin von einer Anzahl verschiedener Quellen erhältlich ist, wurden Saponine mit nützlicher adjuvanter Aktivität vom südamerikanischen Baum Quillaja saponaria Molina abgeleitet. Saponin aus dieser Quelle wurde verwendet, um eine "homogene" Fraktion zu isolieren, bezeichnet als "Quil A" (Dalsgaard, 1974).
Akute Toxizität ist eine Hauptsorge sowohl für die tierärztliche als auch für die menschliche Verwendung von Quil A in Impfstoffpräparaten. Ein Weg, um die akute Toxizität von Quil A zu vermeiden, ist die Verwendung von Iscoms, eine Abkürzung für Immuno Stimulating COMplexes (Immunstimmulierende Komplexe). Dies ist in erster Linie, weil Quil A weniger toxisch ist, wenn es in Iscoms eingearbeitet ist, weil seine Verbindung mit Cholesterin in dem Iscom seine Affinität für Cholesterin in Zellmembranen und daher seine Effekte auf die Zell-Lyse reduziert. Zusätzlich wird eine geringere Menge an Quil A benötigt, um einen ähnlich hohen adjuvanten Effekt zu erzeugen. Iscoms sind kleine, käfigartige Strukturen, im Allgemeinen 30 bis 40 nm im Durchmesser, die ihre Struktur beim Gefriertrocknen behalten. Die endgültige Formulierung eines typischen immunogenen Iscoms mit einer optimalen Menge an immunogenem Protein ist ein Gewichtsverhältnis von Quil A, Cholesterin, Phosphatidylcholin und Protein (1 : 1 : 1 : 5). Solch ein typisches Iscom enthält schätzungsweise 5 bis 10 Gew.-% Quil A, 1 bis 5% Cholesterin und Phospholipide und das Restprotein. Peptide können in Iscons entweder direkt eingearbeitet sein oder durch chemische Kopplung an ein Trägerprotein (z. B. Influenza Hüllprotein) nach der Einarbeitung des Trägerproteins in die Iscoms eingearbeitet sein.
Als Adjuvans verleiht das Iscom viele Vorteile, einschließlich kräftiger immunstimulierender Effekte, geringer Toxizität, die Fähigkeit, sowohl zelluläre (einschließlich CTL) als auch humorale Antworten zu induzieren, und es ist preiswert sowohl bezüglich der Kosten für Reagenzien als auch der Kosten für die Herstellung. Aber Iscoms hatten in der Vergangenheit zwei bedeutende Nachteile; erstens war das Quil A, das bei ihrer Herstellung verwendet wurde, ein komplexes und schlecht definiertes Gemisch eines biologisch abgeleiteten Produkts und Unterschiede von Charge zu Charge mussten deswegen erwartet werden; und zweitens zeigten Iscoms noch immer eine Reaktion an der Injektionsstelle und eine niedrige, aber nachweisbare in vivo Toxizität.
Seit der Erkennung der adjuvanten Aktivität von Quil A (Dalsgaard, 1974) haben mehrere Gruppen dieses Material weiter fraktioniert in eine Anzahl von "gereinigten" Bestandteilen (Morein et al., Australian Patent Specification No. 632067; Kersten, 1990; Kensil, 1988; Kensil, 1991). Anschließend wurde gezeigt, dass diese Bestandteile variable Eigenschaften besitzen, besonders im Hinblick auf adjuvante Aktivität, hämolytische Aktivität und die Fähigkeit, Iscoms zu bilden. Die Verwendung von gereinigten Quil A-Bestandteilen verliehen ihrer Verwendung in einem humanen Impfstoff zwei mögliche Vorteile. Erstens konnte der gereinigte Bestandteil charakterisiert und folglich reproduzierbar hergestellt werden; und zweitens konnten die Bestandteile für einen optimalen Nutzen ausgewählt werden.
Die immunmodulatorischen Eigenschaften der Quil A-Saponine und die zusätzlichen Nutzen, die aus diesen Saponinen gezogen wurde, wenn sie in ein Iscom eingearbeitet werden, sind in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben, z. B. Cox und Coulter, 1992; Dalsgaard, 1974; Morein et al.; Australian Patent Specifications Nos. 558258, 589915, 590904 und 632067. In der Australian Patent Specification No. 632067 wird die Auftrennung einer Quil A Präparation in drei getrennte Fraktionen, bezeichnet als B4B, B3 und B2, beschrieben, zusammen mit HPLC-chromatographischen Verfahren für diese Fraktionierung. Sorgfältiger bestimmte und kontrollierbare Verfahren zur Fraktionierung von Quil A wurden nun erdacht, woraus sich drei größere Fraktionen mit steigendem Grad an hydrophoben Eigenschaften in dem verwendeten Reinigungssystem ergeben.
In Arbeiten, die zur vorliegenden Erfindung führen, wurde nun gezeigt, dass Saponine, abstammend von Quillaja saponaria, getrennt werden können in Fraktionen mit sich unterscheidenden chemischen und biologischen Eigenschaften, einschließlich die wichtigen biologischen Eigenschaften der adjuvanten Aktivität, der hämolytischen Aktivität, der Fähigkeit, Iscoms zu bilden und der in vivo Toxizität, und dass einzelne Zusammensetzungen aus diesen Fraktionen präpariert werden können, um neue Saponinpräparate zu bilden, die fähig sind, gute Iscoms zu bilden, optimale adjuvante Aktivität aber minimale hämolytische und toxische Aktivität besitzen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der gegenwärtigen Erfindung wird ein Saponinpräparat bereitgestellt, umfassend Saponine von. Quillaja saponaria, wobei das Präparat von 50 bis 90 Gew.-% der Fraktion A von Quil A (wie hierin definiert) und von 50% bis 10 Gew.-% der Fraktion C von Quil A (wie hierin definiert) umfasst.
Bevorzugt umfasst das Saponinpräparat von 50% bis 70 Gew.-% der Fraktion A und von 50% bis 30 Gew.-% der Fraktion C. Ein besonders bevorzugtes Präparat umfasst etwa 70 Gew.-% der Fraktion A und etwa 30 Gew.-% der Fraktion C.
Der Begriff "Quil A" wird überall in dieser Beschreibung und in den Ansprüchen als eine generische Beschreibung einer halbgereinigten Saponin- Fraktion von Quillaja saponaria verwendet.
Das Saponinpräparat kann, wenn gewünscht, geringe Mengen (beispielsweise bis zu 40 Gew.-%) an anderen adjuvanten Stoffe mit gewünschten immunmodulatorischen Eigenschaften, einschließlich geringe Mengen der Fraktion B von Quil A oder von anderen Saponinen einschließen. Beispiele für andere Saponine oder andere adjuvante Stoffe, die für eine Einbeziehung in dieses Präparat geeignet sind, sind in der Australian Patent Specification No. 632067 beschrieben, angegliedert hierin als Quellennachweis.
Wie oben beschrieben, ist es bekannt, dass, um eine immunstimulierende Komplex (Iscom)-Matrix herzustellen, Quil A, ein Sterol so wie Cholesterin und optional ein Lipid so wie Phosphatidylcholin im Reaktionsgemisch inbegriffen sein muss.
In Übereinstimmung mit einem anderen Aspekt der gegenwärtigen Erfindung wird eine immunstimulierende Komplex (Iscom) Matrix bereitgestellt, umfassend ein Saponinpräparat, ein Sterol und optional ein Lipid, worin das Saponinpräparat von 50 bis 90 Gew.-% der Fraktion A von Quil A (wie hierin definiert) und von 50% bis 10 Gew.-% der Fraktion C von Quil A (wie hierin definiert) umfasst.
Bevorzugt ist in einer solchen Iscom-Matrix das Sterol Cholesterin und das Lipid (das optional vorhanden ist) ein Phospholipid so wie Phosphatidylcholin.
In noch einem anderen Aspekt stellt diese Erfindung einen immunogenen Iscom bereit, der eine Iscom-Matrix wie oben beschrieben umfasst, wobei mindestens ein Immunogen in die Iscom-Matrix eingearbeitet oder mit der Iscom- Matrix verbunden ist.
Eine Iscom-Matrix oder ein immunogener Iscom in Übereinstimmung mit der gegenwärtigen Erfindung kann durch Techniken hergestellt werden, die Fachleuten gut bekannt sind und die ausführlich in den Veröffentlichungen Cox und Coulter, 1992 und Morein et al., Australien Patent Specifications Nos. 558258, 589915, 590904 und 632067 beschrieben sind, deren Offenlegungen hierin als Quellennachweis angegliedert sind.
Das Immunogen, welches in die Iscom-Matrix eingearbeitet ist oder mit dieser verbunden ist in Übereinstimmung mit dieser Erfindung kann jeder chemische Bestandteil sein, der eine Immunantwort induzieren kann in einem Individuum so wie (aber nicht beschränkt auf) ein Mensch oder ein anderes Tier, einschließlich aber nicht beschränkt auf eine humorale und/oder zell-vermittelte Immunantwort gegen Bakterien, Viren oder andere Mikroorganismen.
Das spezielle Immunogen kann ein Protein oder Peptid, ein Polysaccharid, ein Lipopolysaccharid oder ein Lipopeptid sein; oder es kann eine Kombination von jeden von diesen sein. Besonders kann das spezifische Immunogen ein natives Protein oder Proteinfragment, oder ein synthetisches Protein oder Proteinfragment oder Peptid einschließen, es kann ein Glykoprotein, ein Glykopeptid, ein Lipoprotein, ein Lipopeptid, ein Nukleoprotein, ein Nukleopeptid einschließen; es kann ein Peptid-Peptid-Konjugat einschließen, es kann ein rekombinantes Nukleinsäure-Expressionsprodukt einschließen. Beispiele für solche Immunogene schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf solche, die imstande sind, eine Immunantwort gegen virale oder bakterielle Hepatitis, Influenza, Diphtherie, Tetanus, Keuchhusten, Masern, Mumps, Rubella, Polio, Pneumokokken, Herpes, Respiratorisches Syncytialvirus, Hämophilia Influenza, Clamydien, Varicella-Zooster-Virus, Tollwut oder humanes Immundefizienzvirus hervorzurufen.
Die gegenwärtige Erfindung erstreckt sich auch auf eine Impfstoff- Zusammensetzung umfassend als den aktiven Bestandteil derselben entweder (i) einen immunogenen Iscom wie oben allgemein beschrieben oder (ii) eine Iscom- Matrix wie oben allgemein beschrieben und mindestens ein Immunogen zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptabeln Trägern und/oder Verdünnungsmitteln.
Die Formulierung von solchen Impfstoffzusammenseazungen ist Fachleuten gut bekannt. Geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger und/oder Verdünnungsmittel schließen jedes und alle konventionelle Lösungsmittel, Dispersionsmittel, Füllstoffe, feste Träger, wässrige Lösungen, Beschichtungen, antibakterielle und antimykotische Agenzien, isotonische und absorptionsverzögernde Agenzien und dergleichen ein. Die Verwendung solcher Mittel und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Fachgebiet gut bekannt und ist beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA beschrieben. Ausgenommen insofern, als irgendein konventionelles Mittel oder Agens unvereinbar ist mit dem aktiven Bestandteil, wird deren Verwendung in pharmazeutischen Zusammensetzungen in der gegenwärtigen Erfindung erwogen. Ergänzende aktive Bestandteile können auch in die Zusammensetzung hineingearbeitet werden.
Es ist besonders vorteilhaft, Zusammensetzungen in einer Dosis-Einheit- Form zu formulieren, um eine Erleichterung der Verabreichung und eine Einheitlichkeit der Dosierung zu erreichen. Eine Dosis-Einheit-Form wie hierin verwendet, bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, geeignet als Einheitsdosierungen für Gebiete der menschlichen Behandlung; jede Einheit enthält eine vorbestimmte Quantität eines aktiven Bestandteils, berechnet, um den gewünschten therapeutischen Effekt in Verbindung mit dem benötigten pharmazeutischen Träger und/oder Verdünnungsmittel zu erzeugen. Die Spezifikationen für die neue Dosis-Einheit-Form der Erfindung sind vorgeschrieben durch und direkt abhängig von (a) den eindeutigen charakteristischen Merkmalen der aktiven Bestandteile und dem speziellen therapeutischen Effekt, der erzielt werden soll und (b) den Beschränkungen die dem Fachgebiet der Mischung solch eines aktiven Bestandteils für die spezielle Behandlung eigen sind.
In noch einem anderen Aspekt erstreckt sich die gegenwärtige Erfindung auf ein Verfahren, um eine Immunantwort in einem Individuum auszulösen oder zu induzieren, das die Verabreichung einer immunologisch effektiven Menge einer Impfstoffzusammensetzung an ein Individuum umfasst, wie oben allgemein beschrieben.
Wie zuvor erwähnt kann das Individuum ein Mensch oder anderes Tier sein einschließlich ein Tier eines Viehbestands (z. B. Schaf, Kuh oder Pferd), ein Laborversuchstier (z. B. Maus, Ratte, Kaninchen oder Meerschweinchen), ein Tier als Gefährte (z. B. Hund oder Katze) oder ein wildes Tier.
Eine immunologisch effektive Menge bedeutet die Menge, die nötig ist, um bezüglich eines besonderen Zustands, der behandelt wird, zumindest teilweise die gewünschte Immunantwort zu erzielen, oder den Beginn zu verzögern, die Progression zu hemmen, oder insgesamt den Beginn oder die Progression anzuhalten. Diese Menge variiert abhängig vom Gesundheitszustand und vom physischen Zustand des zu behandelnden Individuums, der taxonomischen Gruppe des zu behandelnden Individuums, der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren, dem Grad des erwünschen Schutzes, der Formulierung des Impfstoffs, der Einschätzung der medizinischen Situation und anderen wichtigen Faktoren. Es wird erwartet, dass die Menge in einen relativ breiten Bereich fällt, der durch übliche Versuche bestimmt werden kann.
Überall in der Beschreibung und in den folgenden Ansprüchen, außer, wenn es der Zusammenhang anders erfordert, wird das Wort "umfassen" oder Abänderungen, so wie "umfasst" oder "umfassend" so verstanden, dass es einen Einschluss eines genannten Ganzen oder eine Gruppe von Ganzen bedeutet, aber nicht den Ausschluss irgendeines anderen Ganzen oder einer Gruppe von Ganzen.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Reinigung eines rohen wässrigen Quil A-Extrakts in die Fraktionen A, B und C von Quil A ist ausführlich im hierin nachfolgenden Beispiel 1 beschrieben. Es sollte verstanden werden, dass das Reinigungsverfahren nur durch Beispiele eingeschlossen ist, und dass Fraktionen, die funktionell ähnlich oder gleich sind wie die Fraktionen A, B und C sind, durch verschiedene andere chromatographische Verfahren präpariert werden können.
Zum Zweck der Identifizierung der Fraktionen A, B und C, auf die hierin Bezug genommen wird, kann ein Verweis auf das Reinigungsverfahren von Beispiel 1 gemacht werden. In allgemeinen Worten werden in diesem Verfahren Fraktionen A, B und C aus der lipophilen Fraktion präpariert, die bei der chromatographischen Trennung des rohen wässrigen Quil A-Extrakts und Elution mit 70% Acetonitril in Wasser erhalten wird, um die lipophile Fraktion rückzugewinnen. Diese lipophile Fraktion wird dann durch halbpräparative HPLC mit Elution unter Verwendung eines Gradienten von 25% bis 60% Acetonitril in saurem Wasser getrennt. Die Fraktion, auf die hierin als "Fraktion A" oder "QH- A" Bezug genommen wird, ist oder entspricht der Fraktion, die ungefähr bei 39% Acetonitril eluiert wird. Die Fraktion, auf die hierin als "Fraktion B" oder "QH-B" bezuggenommen wird, ist oder entspricht der Fraktion, die ungefähr bei 47% Acetonitril eluiert wird. Die Fraktion, auf die hierin als "Fraktion C" oder "QH-C" bezuggenommen wird, ist oder entspricht der Fraktion, die ungefähr bei 49% Acetonitril eluiert wird.
Wenn sie wie hierin beschrieben präpariert werden, stellen Fraktion A, B und C von Quil A jeweils Gruppen oder Familien von chemisch nahe verwandten. Molekülen mit definierbaren Eigenschaften dar. Die chromatographischen Bedingungen, unter denen sie erhalten werden, sind solche, dass die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge hinsichtlich Elutionsprofil und biologischer Aktivität hochbeständig ist.
Fraktionen A, B und C, wie oben beschrieben, wurden bezüglich ihrer adjuvanten Aktivität, hämolytischen Aktivität und Fähigkeit, Iscoms zu bilden, untersucht und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst: Tabelle 1 Eigenschaften der Fraktionen A, B und C von Quil A
Überraschenderweise wurde nun herausgefunden, dass besondere Kombinationen der Fraktionen A und C, ganz besonders Kombinationen von 50 bis 90 Gew.-% der Fraktion A mit von 50 bis 10 Gew.-% der Fraktion C (mit 0% der Fraktion B), zu einem Saponinpräparat führen, das die erwünschten Eigenschaften von A (gute Iscom-Bildung und geringe hämolytische Aktivität) und den Vorteilen von C (gute adjuvante Aktivität) besitzt. In einem besonders bevorzugten Saponinpräparat dieser Erfindung wurde herausgefunden, dass ein Verhältnis von 7 Teile A: 0 Teile B: 3 Teile C (= 7,0,3; oder QH703) sehr gute adjuvante Aktivität, eine leichte Iscom-Bildung bereitstellt, jedoch eine viel geringere hämolytische Aktivität besitzt, als von den Fraktionen der Bestandteile erwartet werden würde. Es muss aber verstanden werden, dass die gegenwärtige Erfindung sich auf andere Saponinpräparate erstreckt, die von 5 Teile A: 0 Teile B: 5 Teile C (= 5,0,5; oder QH505) bis zu 9 Teile A: 0 Teile B: 1 Teil C (= 9,0,1; oder QH901) reichen.
Die folgenden Beispiele beschreiben ein Verfahren zur Reinigung von A, B und C und vergleichen reines A (10,0,0) reines B (0,10,0) reines C (0,0,10) und die Mischung QH703 (7,0,3) hinsichtlich der adjuvanten Aktivität, der hämolytischen Aktivität, Leichtigkeit der Iscom-Bildung und Induktion von IL-1, einem Marker für immunmodulierende Aktivität. Ea sind auch Daten aufgenommen, die das präklinische Sicherheitsprofil des Saponinpräparats dieser Erfindung und einer Iscom-Matrix, die daraus hergestellt wird, zeigen, sowohl als auch die klinische Sicherheit dieser Iscom-Matrix. Die umfassende Folgerung aus diesen Daten ist, dass ein Gemisch aus A und C, ungefähr im Verhältnis 7 : 3 (= 7,0,3; oder QH703), ein optimales Verhältnis der gereinigten Saponine darstellt, um daraus Iscorn-Matrizen oder immunogene Iscoms zu bilden.
Weitere charakteristische Eigenschaften der gegenwärtigen Erfindung sind ausführlicher in dem folgenden Beispiel(en) beschrieben.
In den begleitenden Zeichnungen:
Fig. 1 zeigt die Präparation der Fraktionen A, B und C durch HPLC;
Fig. 2 bis 4 zeigen Elutionsprofile von Sucrosegradienten bei der Präparation einer Iscom-Matrix; und
Fig. 5 zeigt Plasma-IL-1-Spiegel in Mäusen, nachdem ihnen verschiedene Mengen und Zusammensetzungen von Quil A und Fraktionen davon verabreicht wurden.

BEISPIEL 1

Reinigung eines Quil A-Rohextrakts in die Fraktionen A, B und C.

Eine Lösung (0,5 ml) eines rohen Quillaja Rindenextrakts in Wasser (0,5 g/ml) wird auf einer Sep-Pak-Säule (Waters Associtates, MA) vorbehandelt.
Die Vorbehandlung bezieht Waschen der beladenen Sep-Pak-Säule mit 10% Acetonitril in saurem Wasser ein, um hydrophile Substanzen zu entfernen. Lipophile Substanzen einschließlich QH-A, QH-B und QH-C werden dann mit 70% Acetonitril in Wasser eluiert.
Die lipophile Fraktion aus der Sep-Pak-Säule wird dann durch eine halbpräparative HPLC-Säule (CT-sil, C8, 10 · 250 mm, ChromTech, Schweden) getrennt. Die Probe wird durch die Säule über einen Gradienten von 25% bis 60% Acetonitril in saurem Wasser eluiert. Drei Fraktionen werden während der Trennung aus der HPLC-Säule gesammelt. Die Rückstände dieser drei Fraktionen nach der Verdunstung beinhalten QH-A, QH-B und QH-C.
Die Fraktionen, bezeichnet als QH-A, QH-B und QH-C wurden bei ungefähr 39, 47 beziehungsweise 49% Acetonitril eluiert. Das genaue Elutionsprofil und die Bedingungen sind in Fig. 1 gezeigt.

BEISPIEL 2

Bildung von Iscoms mit gereinigtem QH-A, QH-B und QH-C, entweder alleine oder in Kombination.

Untereinheiten von Iscoms ergeben sich aus der Wechselwirkung von Quillaja-Saponinen und Cholesterin. Phospholipide werden dann in die Zusammenstellung der Untereinheiten in die Iscom-Matrix-Struktur einbezogen. Ein typisches Reaktionsgemisch für die Präparation von Iscom-Matrix ist 5 mg/ml Quil A und 1 mg/ml jeweils von Cholesterin und Phospholipid. Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die optimalen Reaktionsbedingungen für verschiedene Quil A-Fraktionen zu bestimmen. Die Annahme hinter diesen Experimenten ist, das je stabiler die Wechselwirkung zwischen Quil A und Cholesterin/Phospholipid ist, desto besser geeignet wird die Struktur sein, um Immunogene ohne Zerstörung und einem begleitenden Anstieg der hämolytischen Aktivität einzuarbeiten.

MATERIALIEN

Cholesterin und ³H-Cholesterin (4211 cpm/ug) 10 mg/ml (Gew./Vol.) (w/v) in 20% MEGA-10 (Gew./Gew.) (w/w) in H&sub2;O
Phosphatidylcholin und ³H-Phosphatidylcholin 10 mg/ml (Gew./Vol.) (w/v) in 20% MEGA-10 (Gew./Gew.) (w/w) in H&sub2;O
QH-A und QH-C 100 mg/ml (Gew./Gew.) (w/w) in H&sub2;O
PBS
Dialysenschlauch, MW-Trennung 12-14000

Verfahren

Reaktionsgemische wurden wie in den Tabellen 2 und 3 gezeigt, angesetzt und für 2 Stunden bei Flaumtemperatur inkubiert, vor einer extensiven Dialyse gegen PBS bei Raumtemperatur.
Alle Proben wurden dann einer Sucrosegradienten-Zentrifugation unterzogen, 10-50% (Gew./Gew.) (w/w) Sucrose, 200000 · g (Raver), 10ºC, 18 Stunden, 11,4 ml Röhrchen (Rotor TST 41,14 gleichwertig mit SW-40).
Die Sucrosegradienten-Profile für die Experimente 1 beziehungsweise 3 sind in den Fig. 2 bis 4 gezeigt.
Die Folgerungen aus diesen Experimenten sind unten zusammengefasst.

Experiment 1a-d

Das Verhältnis von Cholesterin : QH-A, das eine homogene Präparation der Matrix ergibt, ist 1c, d.h. dasjenige, das mit einem Ausgangsverhältnis von CHOL : QHA = 1 : 4 (vor der Dialyse) hergestellt wurde, was ein Verhältnis von 1 : 2 im isolierten Endprodukt ergibt. Die Gemische mit einem höheren Verhältnis von CHOL (1a-b) erzeugten opaleszierende-leicht opaleszierende Präparationen, in denen nicht das ganze Cholesterin vom OH gebunden ist. Die Präparation mit einem geringerem CHOL : OHA Verhältnis (1d) verursachten keine homogene Präparation der Matrix, diese Präparation enthielt viele kleine Fragmente (oberer Peak).

Experiment 2a-d

Das Verhältnis von Cholesterin : QH-C, das eine homogene Präparation der Matrix ergibt, ist 2b, d.h. dasjenige, das mit einem Ausgangsverhältnis von CHOL : QHC = 1 : 2 (vor der Dialyse) hergestellt wurde, was ein Verhältnis von 1 : 1,4 im isolierten Endprodukt ergibt. Das Gemisch mit einem höheren Verhältnis von CHOL (2a-) erzeugte opaleszierende Präparationen, in denen nicht das ganze Cholesterin vom QH verbraucht ist. Die Präparation mit geringeren CHOL : QHC- Verhältnissen (2c-d) verursachten keine homogenen Präparationen, Präparation 2c enthielt einige kleine Fragmente (oberer Peak) und Präparation 2d enthielt eine beträchtliche Menge an Fragmenten:

Experiment 3a-d

In diesem Experiment wurden dieselben Mengen von QH-A und Cholesterin wie in Experiment 1 a-d gemischt, aber PC wurde auch eingeschlossen in Mengen, gleich wie die von CHOL. QH-Doppelgemische mit entweder markiertem CHOL oder markiertem PC (³H) wurden hergestellt. Wie in den Fig. 3a-d gezeigt, ist das ideale Verhältnis von CHOL : QHA nicht beeinflusst, trotzdem sollte das Ausgangsverhältnis im Gemisch 1 : 4 (3c) sein, aber PC hilft, den Komplex zusammenzuhalten in Experiment 3d verglichen mit 1d.
Von dem oben genannten können zwei Folgerungen gezogen werden.
i) Das Verhältnis von Lipid und Cholesterin zu OH ist optimal bei 1 : 4 bis 1 : 5.
ii) Das Gemisch von QH-A und QH-C, das am genauesten die Verhältnisse von Cholesterin zu QH ausgleicht, so dass weder Cholesterin noch QH im Überschuss in QH703 vorliegt. Beispielsweise ist dann, wenn ein 1 : 5 Verhältnis verwendet wird, das CHOL : QH-A-Verhältnis 1 : 3 : 5 und CHOL : QH-C ist 1 : 1 : 5, beides sehr dicht an den optimalen Verhältnissen, wie in den Experimenten 1 und 2 bestimmt. Tabelle 2: Inkubationsverhältnisse, um eine Iscom-Matrix für die Experimente 1 und 2 vorzubereiten. Tabelle 3: Inkubationsverhältnisse, um eine Iscom-Matrix für Experiment 3 vorzubereiten.

BEISPIEL 3

Immunogenitäts- und Effizienzuntersuchungen an Influenzavirus-Iscoms gebildet aus QH-A, QH-B, QH-C und QH703.

Ziel: Bestimmung der relativen Effizienz von verschiedenen Kombinationen von 'Quil A menschlich' (QH)-Bestandteile A, B und C in Iscoms.

Experimentelle Bedingungen

1. Quil A-Bestandteile A, B und C, bereitgestellt in Pulverform.
2. Iscoms wurden aus QH-Bestandteilen A, B, und C hergestellt in den folgenden Formulierungen; (a) 10 : 0 : 0, (b) 0 : 10 : 0, (c) 0 : 0 : 10 oder (d) 7 : 0 : 3.

Präparation einer Iscom-Matrix und Protein-Iscoms

Die folgenden Lösungen werden zubereitet:
20% (Gew./Gew.) (w/w) Mega 10 in destilliertem Wasser 10 mg/ml Cholesterin zusammen mit 10 mg/ml Ei-PC in 20% Mega-10 100 mg/ml QH703 in pH 6,2 Phosphat-gepufferter Salzlösung
Wo Protein-Iscoms hergestellt werden, sollte das Protein, das eingearbeitet wird, bei etwa 0,75 mg/ml sein.

Verfahren:

Zu 0,8 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4 (im Fall einer Iscom-Matrix) oder 0,8 ml von 0,75 mg/ml Protein in PBS, pH 7,4 (im Fall von Protein-Iscoms).
Zugeben von 80 ul von Cholesterin/Ei-PC in Mega-10, mischen.
Zugeben von 40 ul von 100 mg/ml QH703, mischen.
Rühren über Nacht bei Raumtemperatur (22-24ºC).
Dialyse gegen PBS, pH 7,4 für 4 Stunden bei Raumtemperatur, gefolgt von 4 Stunden gegen pH 6,2 PBS.
Schließlich Dialyse gegen pH 6,2 PBS bei 4ºC.
3. Impfstoffe wurden hergestellt unter Verwendung von 0,1 ug oder 1,0 ug Influenzavirus HA pro Dosis und 6 ug oder 15 pg von QH pro Dosis. Der verwendete Stamm war ein virulenter Maus-Stamm von A/PR/8/34.
4. Die Mäuse waren 6-8 Wochen alt, 15 pro Gruppe, für alle Gruppen wurden Balb/C-Mäuse verwendet.
5. Die Mäuse erhielten eine 0,1 ml Dosis, subkutan in den Rücken. Sie wurden gewogen zum Zeitpunkt 0 und 3 und 7 Tage nach der primären Immunisierung.
6. Allen Mäusen wurde 4 Wochen nach der primären Immunisierung Blut entnommen.
7. Die Mäuse der Gruppen 1a-21a (5 Mäuse/Gruppe) erhielten zu diesem Zeitpunkt (nach 4 Wochen) einen Booster und ihnen wurde 7-10 Tage später Blut entnommen.
8. Die Gruppen 1-21 wurden nach 5 Wochen durch Aerosol-Herausforderung herausgefordert. Die Gruppen 1a-21a wurden nicht herausgefordert.
9. Primäre und sekundäre Blutentnahmen wurden bezüglich einer Antikörper- Antwort gegen das ganze Virus untersucht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Es kann gesehen werden, dass Influenzavirus HA, die in Iscoms, die aus reinem QH-A = 10,0,0 (Gruppen 1 bis 4) eingearbeitet sind, im Allgemeinen weniger immunogen waren als solche, die aus einem Gemisch von 7 Teilen QH-A und 3 Teilen QH-C = 7,0,3 (Gruppen 13- 16) hergestellt wurden. Primäre Titer für Gruppe 4 waren bedeutend niedriger (p< ,01) als die für Gruppe 16. Diese Iscom-Prärarationan waren auch weniger schützend wie gezeigt, bei weniger als 100% Schutz bei anschließender Herausforderung. Ein bedeutender Gewichtsverlust wurde auch gezeigt bei Überlebenden der Gruppe 1; wobei das Ausmaß des Gewichtsverlusts ist ein weiterer Indikator für das Maß an Schutz, der durch Impfung gewährt wird.
Ähnlich dazu waren die primären Titer der Gruppen 14 und 16 bedeutend höher als diese der Gruppen 10 beziehungsweise 12. QH703 mit 6 ug/Dosis war auch mindestens so effektiv wie ganze Quil A mit 10 ug/Dosis (Vergleich der Gruppen 13 und 17).
Zusammenfassend zeigen diese Experimente, dass die Verwendung von QH703 zumindest dieselbe Immunogenität und Effizienz erlaubt, wie durch die toxischeren Fraktionen von Quil A gezeigt, aber mit einer viel geringeren Höhe an toxischen Bestandteilen. Tabelle 4: Ergebnisse von Immunogenität und Wirksamkeit von QH-Iscoms in Mäusen QH-ISCOM
(a) 15 Mäuse/Gruppe;
(b) 5 Mäuse/Gruppe;
(c) 10 Mäuse, herausgefordert/Gruppe. KONTROLLEN
(d) 15 Mäuse/Gruppe
(e) 5 Mäuse/Gruppe;
(f) 10 Mäuse, herausgefordert/Gruppe.

BEISPIEL 4

Immunogenitäts-Untersuchungen an Influenzavirus-Protein-Iscoms gebildet aus QH703.

In diesem Experiment wurde Schafen, 10 pro Gruppe, zweimal durch tiefe intramuskuläre Injektion eine Dosis verabreicht, im Abstand von 4 Wochen mit gespaltenem Virus (B/Pariama), Virus-Iscoms oder gespaltenem Virus und Iscom- Matrix. Alle Iscom-Impfstoffe enthielten 60 ug/Dosis QH703. Den Tieren wurde unmittelbar vor der zweiten Impfstoffdosis und nochmals eine Woche nach der zweiten Dosis Blut entnommen. Die Seren wurden untersucht durch EIA auf Antikörper gegen das Virus. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5: Immunogenität von QH703 Influenza-Iscoms in Schafen

BEISPIEL 5

Immunogenität von QH703 DT-LHRH-Iscoms in Katzen.

Katzen wurde zweimal im Abstand von 4 Wochen eine Dosis von 5 mg eines Konjugats aus einem Diphterie-Toxoid, an das das Decapeptid LHRH in einem Peptid- zu Protein-Molekül-Verhältnis von 20 : 1 gekoppelt war, verabreicht. Eine Gruppe von 7 Katzen erhielt das Konjugat alleine, die andere Gruppe von 7 Katzen erhielt ein mit 100 ug QH703 Iscom-Matrix gemischtes Konjugat. Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt für die Schätzung der Antikörper gegen das LHRH-Peptid, wie gemessen durch EIA. Es kann gesehen werden, dass die QH703 Iscom-Matrix einen bedeutenden adjuvanten Effekt (p< ,01) besitzt, der den mittleren Titer sechsfach anhebt. TABELLE 6: Immunogenität einer QH703 Iscom-Matrix mit DT-LHRH-Konjugat in Katzen.

BEISPIEL 6

IL-1-Induktion durch verschiedene Gemische aus Quillaja-Saponinen.

Präparationen von Quil A, QH-C und Gemischen aus QH-A und QH-C in den Verhältnissen 7 : 3 (= QH703), 5 : 5 (= QH505) und 3 : 7 (= QH307) wurden verwendet, um Iscom-Matrizen gemäß dem Standardverfahren herzustellen (siehe Beispiel 3). Diese Iscoms wurden Mäusen subkutan verabreicht in Dosen, zwischen 1 bis 20 ug pro Maus. Plasma-Proben wurden 8 Stunden später entnommen und mit EIA auf IL-1 untersucht. Die Ergebnisse in Fig. 5 zeigen, dass QH703 bedeutende Unterschiede zeigte gegenüber den anderen Präparationen hinsichtlich seiner Fähigkeit, die IL-1-Produktion zu induzieren. Diese Antwort wird als nützlicher Marker erachtet für die potentielle immunmodulatorische Aktivität der Iscoms, die aus diesen verschiedenen Bestandteilen und Gemischen hergestellt wurden.

BEISPIEL 7

Hämolytische Aktivität von Quil A und verschiedenen QH-Fraktionen und Gemischen.

Analysenprotokoll

Menschliches Blut (20 ml) wird in einem Lithium-Heparinblut- Sammelröhrchen gesammelt, zweimal in einer Glucosecitrat-Lösung gewaschen durch Zentrifugation bei 3000g, 4ºC für 15 Minuten, dann werden die roten Blutzellen in einer Glucosecitrat-Lösung resuspendiert.
Saponin-Lösungen für die Prüfung werden durch wiederholte Verdünnung von 300 ug/ml in einem 96-well Mikrotiter-Tablett verdünnt. In jedes dieser Wells wird ausreichend viel einer Suspension von roten Blutzellen zugegeben, so dass, wenn eine vollständige Hämolyse vorkommen sollte, die Extinktion bei 405 nm in einem EIA-Plattenlesegerät etwa 1,0 sein würde.
Saponin-Lösungen und rote Zellen werden sanft gemischt, für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, dann werden die Platten bei 1000g, 4ºC für 2 Minuten zentrifugiert, dann wird die Extinktion bei 405 nm in einem EIA-Plattenlesegerät gemessen. Ergebnisse werden ausgedrückt als die Konzentration des Saponinpräparats, das erforderlich ist, um eine 50%ige Hämolyse zu erhalten. Je höher die erforderliche Konzentration ist, desto weniger hämolytisch ist die Präparation.
Eine Zahl verschiedener Proben von QH-A, QH-B, QH-C und QH703 wurden auf ihren hämolytischen Titer in Lösung untersucht und repräsentative Proben wurden verwendet, um Influenza-Iscoms und Iscom-Matrix herzustellen, die der Reihe nach auf hämolytische Aktivität untersucht wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Es kann gesehen werden, dass QH703 in Lösung die hämolytische Aktivität besitzt, die von einem Gemisch von QH-A und QH-C in diesen Verhältnissen erwartet werden würde. Die Reihenfolge der Aktivität von der höchsten zur niedrigsten QH-B > QH-C > QH703 > QH-A.
Aber wenn diese Saponine verwendet werden, uni Iscoms herzustellen, ist der Grad, in dem sich die hämolytische Aktivität vermindert, variabel zwischen von 10fach für QH-B und QH-C und 40fach für QH-A und QH703. Deshalb wird gezeigt, dass die Verwendung von QH703 in Iscoms ein optimaler Weg ist, um adjuvante aktive Mengen an QH-C einzuarbeiten, während die hämolytische Aktivität dieses Saponins minimiert wird. TABELLE 7: Hämolytische Aktivität von verschiedenen Saponinen in Lösungen und als Iscoms

BEISPIEL 8

Präklinische Sicherheit von QH703.

QH703 sowohl als Iscom-Matrix als auch als immunogene Iscoms hergestellt aus QH703 wurden einer präklinischen Toxizitäts- und Sicherheitsuntersuchung unterzogen, um ihre Sicherheit vor dem Beginn von klinischen Studien in Menschen nachzuweisen. Iscom-Matrix und Influenza- Iscoms wurden durch das Verfahren von Beispiel 3 hergestellt.
Die folgenden Mutagenitäts-Untersuchungen wurden unter Verwendung von QH703 durchgeführt:
Ames Test
Chromosomen-Abberations-Untersuchung unter Verwendung kultivierter
Säugetierzellen
Mikronukleus-Test im Knochenmark von CD-1 Mäusen
Maus-Lymphom-Mutations-Test.
Die Folgenden toxikologischen Untersuchungen wurden durchgeführt:

Einzeldosis:

QH703 intramuskulär in Ratten
Iscom-Matrix, hergestellt aus QH703 intramuskulär in Ratten
Pyrogenizität von Influenza-Iscoms hergestellt von QH703 in Kaninchen.

Wiederholungs-Dosis-Untersuchungen:

QH703 intramuskulär in Ratten, täglich für 14 Tage
Iscom-Matrix, hergestellt aus QH703 intramuskulär in Ratten, täglich über 14 Tage
Iscom-Matrix, hergestellt aus QH703, örtliche Toleranz in Kaninchen, 6 Dosen in zweiwöchigen Intervallen.
Influenza-Iscoms, hergestellt aus QH703, örtliche Toleranz in Kaninchen, 6 Dosen in zweiwöchigen Intervallen.
Die Folgerungen aus diesen Mutagenitäts-Untersuchungen mit QH703 waren, dass QH703 nicht in Betracht gezogen wird, mutagene Effekte in den verwendeten Testsystemen zu erzeugen und dass es unwahrscheinlich ist, mutagene Effekte im Menschen zu erzeugen.
Die Folgerungen aus den Einzeldosis-Toxikologie-Untersuchungen waren, dass es schwer war, die Höhe des "nicht toxischen Effekts" ("No Toxic Effekt Level") in diesen Untersuchungen klar zu erstellen, da QH703 und Iscom-Matrix, hergestellt aus QH703, begrenzte unspezifische Letalität in hohen Dosen (10 mg kg&supmin;¹ beziehungsweise 1,4 mg kg&supmin;¹) zeigen. Diese Dosierungen stellen mehr als die tausendfache Dosis dar, die als maximale therapeutische Dosis angenommen wird.
Die Sicherheit von QH703 und Iscom-Matrix, hergestellt aus QH703, wurde in anderen Untersuchungen in Ratten und Kaninchen bestätigt. Bei hohen Dosierungen konnten die beobachteten Effekte teilweise zur immunologischen (adjuvanten) Aktivität des Testmaterials beitragen.
Es wurde gezeigt, dass Influenza-Iscom-Impfstoffe in Kaninchen in den örtlichen Toleranzuntersuchungen für die ganzen 6 Dosen, bei Dosierungen von 100 ug der Iscom-Matrix (gemessen als QH703) pro Dosis gut toleriert wurden.
Pyrogenizitäts-Untersuchungen mit einer einzelnen 100 ug Dosis eines Influenza-Iscom-Impfstoffs (gemessen als QH703) in Kaninchen haben gezeigt, dass der Impfstoff nicht pyrogen ist.

BEISPIEL 9

Klinische Sicherheit einer Iscom-Matrix hergestellt aus QH703 in Menschen.

Gesunde männliche und weibliche Freiwillige im Alter zwischen 18 und 45 Jahren, die den Einschluss-/Ausschlusskriterien der Studie genügten, wurden je intramuskulär mit 0,5 ml injiziert, enthaltend eine der folgenden Präparationen in einer Placebo-kontrollierten Einzelblindstudie;
(i) Placebo (Verdünnungsmittel)
(ii) 25 ug einer Iscom-Matrix hergestellt aus QH703
(iii) 50 ug einer Iscom-Matrix hergestellt aus QH703
(iv) 100 ug einer Iscom-Matrix hergestellt aus QH703
(v) 200 ug einer Iscom-Matrix hergestellt aus QH703.
Eine Iscom-Matrix wurde hergestellt aus QH703 durch das Verfahren von Beispiel 3. Die Folgerungen aus der Untersuchung waren, dass alle vier Dosierungshöhen der Iscom-Matrix, hergestellt aus QH703, in gesunden männlichen und weiblichen Freiwilligen gut toleriert wurden.
Fachleute werden schätzen, dass Abweichungen und Veränderungen an der Erfindung, die hier allgemein beschrieben ist, durchgeführt werden können, andere als diese, die konkret beschrieben sind, ohne abzuweichen vom Geist und Bereich der Erfindung. Es sollte verstanden werden, dass sich diese Erfindung erstreckt und alle solche Abweichungen und Veränderungen einschließt.

QUELLENNACHWEIS:

Cox, J. C. and Coulter, NR. (1992), "Advances in Adjuvant Technology and Application", in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology, Chapter 4, Ed. Yong, W. K. CRC Press.
Dalsgaard, K. (1974), Arch. Gesamte Virusforsch, 44, 243.
Kensil, C. A. et al. (1988), International Patent Application No. PCT/US88/01842.
Kensil, C. A. et al. (1991), J. Immunot, 146, 431.
Kersten, G. F. A. et al. (1990). "Aspects of Iscoms. Analytical, Pharmaceutical and Adjuvant Properties"; Thesis, Universität Utrecht.

Claims

1. Saponinpräparat, das Saponine von Quillaja saponaria enthält, wobei das Präparat 50-90 Gew.-% der Fraktion A von Quil A (gemäß der hierin angegebenen Definition) und 50-10 Gew.-% der Fraktion C von Quil A (gemäß der hierin angegebenen Definition) umfasst.

2. Saponinpräparat gemäß Anspruch 1, das 50-70 Gew.-% der Fraktion A und 50-30 Gew.-% der Fraktion C umfasst.

3. Saponinpräparat gemäß Anspruch 1, das etwa 70 Gew.-% der Fraktion A und etwa 30 Gew.-% der Fraktion C umfasst.

4. Immunstimulierender Komplex-Matrix (Iscom-Matrix), die ein Saponinpräparat gemäß einem der Ansprüche 1-3, ein Sterin und optional ein Lipid umfasst.

5. Iscom-Matrix gemäß Anspruch 4, wobei das Sterin Cholesterin ist.

6. Iscom-Matrix gemäß Anspruch 4, wobei das ggf. vorhandene Lipid ein Phospholipid, wie Phosphatidylcholin, ist.

7. Immunogener immunstimulierender Komplex, der eine Iscom-Matrix gemäß einem der Ansprüche 4-6 umfasst, wobei mindestens ein Immunogen in die Iscom-Matrix eingearbeitet oder mit dieser verbunden ist.

8. Impfstoffzusammensetzung, die als Wirkungskomponente derselben entweder (i) eine Iscom-Matrix gemäß einem der Ansprüche 4-6 und mindestens ein Immunogen oder (ii) einen immunogenen immunstimulierenden Komplex gemäß Anspruch 7 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln umfasst.

9. Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 8 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen Körpers oder Tierkörpers im Rahmen einer Therapie.

10. Verwendung einer Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 8 bei der Herstellung eines Medikaments zum Auslösen oder Induzieren einer Immunantwort.

11. Verfahren zur Herstellung einer immunstimulierender Komplex-Matrix (Iscom-Matrix), das das Vermischen eines Saponinpräparats gemäß Anspruch 1, eines Sterins und optional eines Lipids umfasst.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Sterin Cholesterin ist.

13. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das ggf. vorhandene Lipid ein Phospholipid ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das ggf. vorhandene Lipid Phosphatidylcholin ist.

15. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen immunstimulierenden Komplexes, das das Herstellen einer Iscom- Matrix nach dem Verfahren gemäß Anspruch 11 und das Einarbeiten von mindestens einem Immunogen in die Iscom-Matrix oder das Verbinden von mindestens einem Immunogen mit der Iscom-Matrix umfasst.