DK142367B - 7-Acylamidocephalosporanderivater til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af 7-aminocephalosporansyre eller derivater deraf, samt fremgangsmåde til fremstilling deraf. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 1^-2367 (W) \fia/ DANMARK (5" "’, CI’ c 12 DpB35/oo §(21) Ansøgning nr. 4-1 5G/69 (22) Indleveret den 1· 8-Ug. 19^9 (24) Løbedag 1· aug. 19&9 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggelsesskriftet offentliggjort den · OKU. I you PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Pinomet begi»retiraden

2. aug. 1968, 37113/68, GB 18. Jul. 1969, 37113/68, GB

(71) GLAXO LABORATORIES LIMITED, Greenford, Middlesex, GB.

(72) Opfinder: Benjamin Harry Arnold, Two Pins, Collinswood Road, Farnham Common, Slough, Buckinghamshire, GB: Robert Anthony Fildes, Romanile,

Birch Tree Grove, Ley Hill, Chesham, Buckinghamshire, GB: David Arthur Gilbert, 29, Spring Lane, Farnham Royal, Slough, Buckinghamshire, GB, (74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Kontor for Industriel Eneret ved Svend Schønning.

(54) 7-Acylamidocephalosporanderivater til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af 7-aminocephalosporansyre eller derivater deraf, samt fremgangsmåde til fremstilling deraf.

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte 7-acylamidocephalosporanderivater til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af 7-aminocephalosporansyre eller derivater deraf med 3-sldekæde med formlen -CHjX/ hvor X er et hydrogenatom, en hydroxygruppe eller en acyloxygruppe med højst 3 kulstofatomer.

De i denne beskrivelse omtalte cephalosporinforbindel-ser er navngivet ud fra stoffet cepham, der har strukturen _ .8 W8 3

o^ "V

142367 2 (se J.A.C.S. 1962, 84, 3400 og J. Chem. Soc. 1965, 5031).

Cephem betegner den grundlæggende cepham-struktur med en enkelt dobbeltbinding.

Cephalosporin C, (3-acetoxymetyl-7-3-(D-5-amino-5-5 karboxypentanamido)-ceph-3-em-4-karboxylsyre) kan omdannes til 3~acetoxymetyl-73-aminoceph-3-em-4-karboxylsyre (7-amino-cephalosporansyre, 7-ACA) og derefter til 73-acylamido-analo-ger af cephalosporin C med modificeret antibakteriel virkning. N-Deacylering af cephalosporin C er vanskelig, formentlig på 10 grund af strukturen af D-5-amino-5-karboxypentanoyl-sidekæ- den. Skønt 7-ACA kan fremstilles ud fra cephalosporin C i godt udbytte ved hjælp af nitrosylklorid, er der behov for alternative fremgangsmåder der kan frembyde fordele.

Fra bl.a. fransk patentskrift nr. 1.394.820 og dets 15 tillæg nr. 89.317 er det kendt at omdanne cephalosporin C eller derivater deraf med anden 3-sidekæde til 7-ACA eller derivater deraf med 3-sidekæde som i udgangsmaterialet ved den såkaldte imidhalogenidmetode, der omtales senere i nærværende beskrivelse. Omdannelsen forudsætter isolation af ud-20 gangsforbindelsen, specielt cephalosporan C, fra det medium hvori den er dannet ved gæring, og det er en vanskelig proces fordi zwitterion-ladningen på 7-sidekæden gør cephalosporin C uegnet til opløsningsmiddelekstraktion. Desuden må man som regel, modificere det ekstraherede cephalosporin C, fx beskyt-25 te aminogruppen i 7-sidekæden og forestre 4-karboxylgruppen før første trin i iminohalogenidmetoden, der hyppigst er omsætning med fosforpentaklorid.

Det har nu overraskende vist sig at visse cephalospo-rinderivater med en særlig 7-sidekæde let kan isoleres fra 30 et gæringsmedium, let kan dannes i gæringsmediet ved oxydation af cephalosporin C og efter isolationen let kan omdannes til 7-aminocephalosporansyre med imidhalogenidmetoden; analoge forhold gælder for nogle analoger med den indledningsvis nævnte 3-sidekæde.

35 Den nævnte 7-sidekæde er en 4-karboxybutanamidogruppe, og 7-acylamidocephalosporinderivaterne ifølge opfindelsen er følgelig ejendommelige ved at de har den almene formel 3 142367 S.

HOOC- (CH2 )£ONH -/ N.

J-ν^-°Η2Χ

0 T

COOH

hvor X har den foran angivne betydning, eller udgøres af salte deraf.

Forbindelserne med formel I kan let omdannes til 7-ACA 5 ved fx imidhalogenidmetoden. Den består i at omsætte 7β- acylamidoforbindelsen med et middel som antages at danne et imidhalogenid, fx fosforpentaklorid, PCl^; reaktionsproduktet omdannes derpå ved omsætning med en alkohol til et produkt der menes at være en iminoæter, og denne spaltes, fx 10 ved hydrolyse, til den ønskede 7-aminoforbindelse. Imidhalogenidmetoden er beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.041.985, de belgiske patentskrifter nr. 718.824 og 719.712 og nederlandsk offentliggørelsesskrift nr. 68 12 413.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstil-15 ling af 7-acylamidocephalosporinderivaterne med formel I,

hvor X har den angivne betydning, eller salte deraf, og denne fremgangsmåde er ifølge opfindelsen ejendommelig ved at man underkaster en cephalosporinforbindelse med den almene formel II

~OOCt S

, ]>CH(CHJ ^CONH ---/ \ 20 H3N 1 11

/—V>CH2X

COOH

eller et salt deraf, hvor X har den foran angivne betydning, indvirkning af en fungal D-aminosyreoxydase under fravær af katalase eller inhibering af eventuelt i D-aminosyreoxydasen tilstedeværende katalase og derpå isolerer den dannede for-25 bindelse.

Den fungale D-aminosyre-oxydase kan fx stamme fra arter af Aspergillus, fx A. flavus, A. parasiticus, A. fla- 142367 4 vus-oryzae eller A. ustus; eller fra arter af Penicillium, fx P. chrysogenum eller P. roquefort!; eller fra arter af Neurospora. Som en anden mulighed kan D-aminosyreoxydasen stamme fra en gærart. En meget hensigtsmæssig kilde til fun-5 gal D-aminosyreoxydase er ifølge opfindelsen gærsvampen Tri-gonopsis variabilis, idet dette enzym giver højt udbytte. Foretrukne oxydaser stammer foruden fra Trigonopsis variabilis også fra Aspergillus flavus-oryzae. Egnede stammer af organismer kan fås fra kendte kultursamlinger, således fra 10 Commonwealth Mycological Institute, Kew, Richmond, Surrey,

England^de egnede stammer A. ustus IMI16045, A. flavus IMI52104, A. parasiticus IMI 15957 og A. flavus-oryzae IMI 44242; fra Centraal Bureau voor Schimmelcultur, Baarn, Holland, kan fås Trigonopsis variabilis.

15 Selv om det ikke er nødvendigt at inducere dannelse af D-aminosyreoxydase i svampecellerne har det til forøgelse af enzymudbyttet vist sig hensigtsmæssigt at gøre det. Indu-ceringen kan hensigtsmæssigt ifølge opfindelsen være sket ved tilsætning af D-formen eller DL-racematet af en alminde-20 lig aminosyre, fortrinsvis alanin, til gæringen i udsædstadiet. Den type og mængde aminosyre der skal til for at bevirke fremkaldelsen af D-aminosyreoxydasen i specifikke fungale celler kan bestemmes ved forudgående prøver og eksperimenter. Dannelse af D-aminosyreoxydase kan således induceres hos 25 Aspergillus flavus og parasiticus ved hjælp af DL-valin og DL-alanin; sidstnævnte er særlig effektiv ved en koncentration på 0,20% (vægt/rumfang). Endvidere har det vist sig at metio-nin effektivt fremmer dannelse af D-aminosyreoxydase hos Trigonopsis variabilis.

30 D-Aminosyreoxydasen må frigøres fra cellerne før bru gen, da de hele celler almindeligvis er inaktive. Det kan ske enten ved dannelse af et "pulver" eller ved dannelse af cellefrie ekstrakter.

Ved fremstillingen af "pulver" filtreres cellerne fra 35 kulturmediet og der fremstilles en våd cellesuspension. Denne kan om ønsket lagres. Suspensionen kan behandles med passende opløsningsmidler såsom acetone til udvirkning af spræng- 5 142367 ning af cellevæggene, efterfulgt af frafiltrering af de faste stoffer, vask af de faste stoffer og tørring. Dannelsen af "pulvere" udføres på denne måde normalt med acetone, men det er ikke væsentligt, blot at det anvendte opløsningsmiddel 5 medfører sprængning af cellevæggen og ikke denaturerer enzymet. Yderligere rensning af acetonepulvere opnås ved formaling.

Ved fremstilling af cellefrie ekstrakter behandles den våde cellesuspension først for at bevirke sprængning af 10 cellevæggene, fx ved behandling med et opløsningsmiddel såsom acetone, ved skiftevis frysning og optøning, ved autolyse, ved nedbrydning med papain, ved sprængning ved overlydsbehandling eller ved homogenisering. Cellerester fjernes derefter fra det resulterende materiale, fx ved centrifugering, 15 og efterlader en remanensekstrakt indeholdende D-aminosyreoxy-dase og katalase. Yderligere koncentration og rensning af ekstrakten kan ske ved fx gelfiltrering, som det er tilfældet med Aspergillus-ekstrakter, eller fraktionering med ammoniumsulfat, hvilket har vist sig at være mest tilfreds-20 stillende til opnåelse af D-aminosyreoxydase fra Trigonopsis-ekstrakter.

Virkningen af D-aminosyreoxydase kan bedst bestemmes spektrofotometrisk ved bestemmelse af dannelseshastigheden af hydrogenperoxyd med anvendelse af hydrogendonoren o-25 dianisidin som indikator. I nærværelse af peroxydase oxyderes o-dianisidin af hydrogenperoxyd til dannelse af et brunt farvestof.

Ved omsætningen méd D-aminosyre-oxydasen, skal som nævnt katalase være fraværende eller inhiberes. Det er almin-30 deligvis ikke nødvendigt at rense D-aminooxydasen for alle spor af katalase, da virkningen deraf kan inhiberes. Egnede katalaseinhibitorer er ascorbinsyre, 3-amino-l,2,3-triazol og uorganiske azider. Natriumazid er især foretrukket. Na-triumazidkoncentrationen kan være så lav som 1 mM ved anven-35 delse af D-aminosyreoxydase-ekstrakter, men ved anvendelse af acetonepulvere kan op til 100 mM eller endog mere være ønskeligt.

142367 6

Enzymsystemets reaktion med forbindelsen med den almene formel II kan udføres ved pH 6-9 og fortrinsvis ca. 8. Temperaturer mellem omgivelsernes og 50°C kan anvendes, den optimale temperatur er ca. 33°C. Der må ikke anvendes pH og 5 temperatur som resulterer i en deaktivering af enzymet. En enzymkoncentration på ikke under 20 enheder (som nedenfor defineret) pr. mg cephalosporin-udgangsmateriale kan anvendes. Ved denne koncentration kan en reaktionstid på mindst 3 timer være nødvendig. Med højere enzymkoncentration, fx 10 40-60 enheder/mg, er kortere reaktionstider såsom 2 timer mulige. Oxydationshastigheden af forbindelser med den almene formel II er ligefrem proportionel med koncentrationen af forbindelsen med den almene formel II i det enzymatiske oxydationssystem. Omrøring sammen med gasgennemstrømning, 15 enten med luft eller oxygen, er ønskeligt. En gasgennemstrømningshastighed på 1 rumfang gas/rumfang system pr. minut giver gode resultater.

Cephalosporin C er som nævnt vanskeligt at ekstrahere fra gæringsvæsken på grund af dets amfotere struktur og 20 hydrofile natur. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udføres in situ, før eller efter fjernelse af myceliet, i en cephalosporin C-gæringsvæske under passende betingelser, hvorved der dannes forbindelsen med den almene formel I, hvor X er acetoxy. Processen udføres fortrinsvis efter at 25 proteiner er frafiltreret. Derefter kan den resulterende forbindelse I vindes ved opløsningsmiddelekstraktion eller ved absorption i en kolonne af ionbytter.

Omdannelse af cephalosporin C til 3-acetoxymetyl-7-3-(4-karboxybutanamido)-ceph-3-em-4-karboxylsyre i en afprote-30 iniseret cephalosporinvæske kræver et betydeligt overskud af enzym sammenlignet med hvad der er nødvendigt når der begyndes med allerede isoleret cephalosporin C; det skyldes tilstedeværelsen af oxydaseinhibitorer i væsken.

Forbindelsen med den almene formel I, hvor X er en 35 acetatgruppe kan let ekstraheres fra den vandige opløsning hvori den er fremstillet, fx ved syrning til pH 1,5 eller lavere og ekstraktion med et passende organisk opløsningsmiddel såsom ætylacetat eller n-butanol. Flere ekstraktioner 142367 7 med ætylacetat vil give i det væsentlige fuldstændig ekstraktion, men nyttevirkningen kan øges ved at mætte eller i det væsentlige mætte den vandige fase med et opløseligt uorganisk salt, fx natriumklorid. Denne fremgangsmåde er imidlertid 5 ikke særlig velegnet til ekstraktion af forbindelserne fra gæringsvæsken.

Ved isoleringen af produkterne fra både gæringsvæsker og simple vandige opløsninger har det ifølge opfindelsen vist sig at en kombination af ionbytning og opløsningsmiddel-10 ekstraktion giver særlig gode udbytter og renhed. Egnede ionbyttere er de flydende aminanionbyttere med høj molekyl- (r) vægt, der sælges under navnene "Amberlite" ^ LAl, LA2 og LA3; LAl og LA2 er sekundære aminer, LA3 en primær amin. Foretrukne opløsningsmidler til brug i forbindelse med de flydende 15 ionbyttere er n-butanol og butylacetat.

Et system der har været anvendt med særlig fordel ved ekstraktioner fra afproteiniseret cephalosporin-gæringsvæske er "Amberlite" ®LAl i n-butanol, efterfulgt af tilbageekstraktion med natriumbikarbonatopløsning og ekstraktion med 20 ætylacetat. pH af væsken nedsættes fortrinsvis til under 6 og mest hensigtsmæssigt til 3-5 før ekstraktionen.

Den faste anionbytterharpiks "Amberlite" ^yXAD2, som er en makroretikulær tværbundet polystyrenpolymer, kan også anvendes til at ekstrahere forbindelser med den almene for-25 mel I, hvor X er en acetatgruppe, fra urensede eller afpro-teiniserede cephalosporin-gæringsvæsker. Et hensigtsmæssigt opløsningsmiddel til eluering af den absorberede forbindelse fra harpiksen kan bestemmes ved indledende forsøg. I tilfælde af 3-acetoxymety 1-7-(3- (4-karboxybutanamido) -ceph-3-em-4-kar-30 boxylsyre er et hensigtsmæssigt opløsningsmiddel acetone.

Forbindelser med den almene formel I, hvor X er en hydroxygruppe eller et hydrogenatom, kan vindes fra de vandige medier, i hvilke de er blevet fremstillet, ved den allerede beskrevne fremgangsmåde.

35 Mellemproduktet og fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det følgende belyses ved nogle forsøg og eksempler, efterfulgt af to eksempler på omdannelse af mellemproduktet til 7-ACA.

8 142367

Indledende forsøg

Aspergillus flavus-oryzae og Trigonopsis variabilis.

I de indledende forsøg dyrkedes begge kulturer i 250 ml rysteflasker indeholdende 50 ml medium. Aspergillus 5 dyrkedes i næringsmedium (2% majsstøbevand og 2% glukose i vand med pH indstillet til 5,0), indeholdende 0,2% alanin ved 27°C og høstedes efter 48 timers forløb. Trigonopsis dyrkedes i mediet indeholdende metionin beskrevet af Senthe-shanmuganathan og Nickerson, 1962, J. Gen. Microbiol. 27, 10 465, ved 27°C og høstedes efter 72 timers forløb.

Fremstilling af celler.

Fugtige cellesuspensioner. Cellerne frafiltreredes på nr. 1 Whatman filtrerpapir, vaskedes to gange med destilleret vand og lagredes ved -10°C. En passende mængde optøedes om nødven-15 digt og suspenderedes i en 0,01M puffer ved pH 8,1 (natrium-pyrofosfat eller ætanolamin).

Fremstilling af acetonepulver.

Acetonepulver. Cellesuspensionen sattes under omrøring til 10 rumfang acetone (vægt/rumfang). Suspensionen blandedes 20 grundigt og filtreredes derefter gennem nr. 1 Whatman papir og tørredes med lidt æter.

Fremstilling af cellefrie ekstrakter.

Overlydssønderdeling. Suspensionen af fugtige celler behandledes med lyd ved 4°C ved 20 Kc/sek i en 60 watts overlydssønder-25 deler.

Homogenisering. Suspensionen af fugtige celler afkøledes til omkring 15°C og passeredes derefter gennen en "A.P.V. Manton Gaulin Laboratory and Submicron Disperser" (type 15M-8BA SMD).

Efter hver gennemgang gennem maskinen afkøledes homogenatet i 30 et isbad.

Ekstrakterne fremstillet ved disse fremgangsmåder een- i trifugeredes ved 38.000 G i 15 minutter til fjernelse af cel- ; lerester.

i ) i 142367 9

Rensning af aminosyreoxydase (AAO).

Rensning af aminosyreoxydase fra Aspergillus ved gelfiltrering.__________________

En ekstrakt fra Aspergillus frysetørredes, suspende-5 redes igen i 0,001 M natriumpyrofosfat-puffer pH 8,1 (1/10 af det oprindelige rumfang) og klaredes ved centrifugering ved 38.000 G i 15 minutter.

10 ml koncentreret ekstrakt sattes på en kolonne (100 x 2,5 cm) af Bio-gel P.2 eller P.100 og fremkaldtes med 10 en hastighed på 50 ral/t med 0,002 M natriumpyrofosfat-puffer pH 8,1. Eluatet, der kontrolleredes med en LBK Uvicord ved 260 nm, opsamledes i 10 ml fraktioner.

Rensning af aminosyreoxydase fra Trigonopsis ved (NH^JSO^- fraktionering.__ 15 400 ml ekstrakt fra Trigonopsis mættedes 30% med (NH^)ved 4°C. Opløsningen blandedes omhyggeligt med undgåelse af skumning, og efterlodes derpå til henstand i 30 minutter. Suspensionen centrifugeredes ved 23.000 G i 30 minutter ved 4°C. Den ovenstående væske mættedes 50% med 20 (NH^^SO^, omrØttes i 5 minutter og henstod i yderligere 30 minutter. Bundfaldet opsamledes ved centrifugering ved 38.000 G i 30 minutter og gensuspenderedes i 0,1M natriumpy-rofosfatpuffer.

Bestemmelse af D-aminosyreoxydaseaktiviteten.

25 Aminosyreoxydase (AAO) bestemtes spektrofotometrisk ved at følge dannelseshastighed for hydrogenperoxyd ·

Metoden er baseret på de koblede reaktioner vist i ligning 1 og 2.

I AAO) (1) aminosyre + H2O + O 2-—— v α-ketosyre + NH^ + H202 (POD)

30 (2) H202 + DH2 -> 2 H20 + D

Hydrogenperoxyd i nærværelse af peroxydase (POD) oxyderer hydrogendono o-dianisidin (DH^) til et brunt farvestof.

142367 10

Prøven udførtes ved 37°C i en glaskuvette med en 1 cm lysgang og dannelsen af det brune farvestof fulgtes ved 420 nm. Reaktionsblandingen bestod af 1,0 ml 0,1M natriumpyro-fosfatpuffer pH 8,1, 0,5 ml o-dianisidinopløsning (0,04% o-5 dianisidin HC1 i vand), 0,3 ml substrat (1% natriumcephalo-sporin i natriumpyrofosfatpuffer pH 8,1), 0,01 ml peroxydase (10 mg/ml vandig opløsning) og tilstrækkeligt vand til volumenet til sidst bliver 2,8 ml.

Reaktionen starter ved tilsætning af 0,2 ml enzymopløs-10 ning til reaktionsblandingen. Sammenligningskuvetten indeholdt 2,8 ml vand og 0,2 ml enzymopløsning.

Den lineære stigning i optisk tæthed ved 420 nm i de første 5 minutter anvendtes til måling af AAO-aktiviteten.

En enzymaktivitetsenhed defineres som den mængde enzym 15 som ved 37°C pH 8,1 frembringer en ændring i den optiske tæthed på 0,001/minut.

Horisontal papirelektroforese.

Prøver på 10 μΐ sattes på strimler af Whatman 3MM kro-matografipapir (2 cm x 35 cm) og elektroforeredes mod anoden 20 i 2 timer ved 500 volt i 0,01M fosfatpuffer pH 7,0. Papiret tørredes ved omgivelsernes temperatur. Forbindelserne lokaliseredes ved undersøgelse under ultraviolet lys. Absorptionszonerne klippedes ud og gennemblødtes i 5%s natriumbikarbonat (5 ml) i op til 60 minutter. Absorptionen af opløsningen af-25 læstes ved 257 nm og anvendtes til udregning af mængden af tilstedeværende cephalosporinforbindelse.

Tyndlagskromatografi (TLC)

Prøver å 5 yl anbragtes på en TLC-plade af cellulose og fremkaldtes med 70%s propanol. Forbindelserne lokalisere-30 des ved undersøgelse af pladen under ultraviolet lys.

"Amberlite" ®ΪΑ1, LA2 og LA3.

15%s (rumfang/rumfang) opløsninger af de flydende aminer i.n-butanol fremstilledes og mættedes med vand. Opløsningsmidlet regenereredes ved udrystning 3 gange med 4N na-35 triumhydroxyd mættet med n-butanol og vask med vand mættet 142367 11 med n-butanol indtil vaskeopløsningerne var neutrale."Amberli- p te LAl kan også genvindes ved destillation under ret tryk, kpt. 210°C/10 mm Hg.

"Amberlite" ®XAD2.

5 20 g og 100 g kolonner af "Amberlite" ®XAD2 fremstil ledes ved at suspendere harpiksen i acetone, med henstand i 15-30 minutter, derefter vask med vand i en mængde svarende til 20 gange rumfanget af stofmængden i kolonnen.

Dinitrofenylhydrazin (D.N.P.) prøve af aminosyreoxydase.

10 Enzymaktiviteten måltes ved at følge dannelsen af 3- acetoxymety 1-7-(3- (5-karboxy- 5-oxopentanamido) -ceph-3-em-4-karboxylsyre kolometrisk som dets fenylhydrazonderivat.

Acetonepulver i 5 ml 0,1M pyrofosfatpuffer pH 8,1 indeholdende 1250 enheder katalase (sigmaenheder) og 0,05 mg 15 flavein-adenindinucleotid blandedes og inkuberedes ved 33°C

med 5 ml 6%s cephalosporin C opløsning tidligere indstillet på pH 7,9 med 0,1N natriumhydroxyd. Prøver a 1 ml udtoges ved 0 minutter og efter 15 minutters inkubation, blandedes grundigt med 2 ml 0,35%s 2,4-dinitrofenylhydrazin i 2N HCl, 20 hvorefter der ekstraheredes med 8 ml ætylacetat. 6 ml af ætyl-acetatlaget tilbageekstraheredes med 5 ml 0,4m natriumbikar-bonat-natriumkarbonat-puffer og den gule farve af 2,4-dini-trofenylhydrazon måltes ved 370 nm.

Den dannede mængde dinitrofenylhydrazon beregnedes 25 ved hjælp af en kalibreringskurve der var fremstillet med renset 2,4~dinitrofenylhydrazon:l enzymenhed er defineret som den mængde der frembringer 1 ymol 3-acetoxymety 1-7-(3-(5-karboxy-5-oxopentanamido)-ceph-3-em-4-karboxylsyre pr. minut under de benyttede standardbetingelser.

30 En sigmaenhed katalase er defineret som den mængde ka talase som kan sønderdele 1 ymol hydrogenperoxyd pr. minut ved pH 7,0 og 25°C, mens peroxydkoncentrationen falder fra 10,3 til 9,2 ymol pr. ml reaktanter.

142367 12

Eksempel 1 5 mg/ml cephalosporin C, 100 mM natriumazid og en frysetørret cellefri ekstrakt (vundet ved overlydssønderdeling) af et aminosyreoxydasepræparat vundet fra Aspergillus flavus-5 oryzae (40 enheder pr. mg cephalosporin C) inkuberedes ved 30°C i 10 ml 0,1M natriumpyrofosfatpuffer pH 8,1. Prøver af 10 yl blev taget med 30 minutters interval og undersøgtes ved elektroforese på papir.

Processen gentoges med aminosyreoxydase, der var del-10 vis renset ved gelfiltrering.

Elektroforesepapirerne undersøgtes under ultraviolet lys. Elektroforesepapirerne fra forsøgene, hvor der anvendtes urenset aminosyreoxydasepræparat (frysetørret cellefri ekstrakt) viste en zone med det ønskede produkt, 3-acetoxymetyl-15 7β-(4-karboxybutanamido)-ceph-3-em-4-karboxylsyre, i inkube- ringsprøven der blev taget efter 30 minutters forløb; den øgede i styrke og var kraftigst i de prøver der blev taget efter 2 og 2 1/2 times forløb. Inkubering i yderligere 4 timer øgede hverken størrelsen eller styrken af zonen.

20 Elektroforeseresultaterne for fremgangsmåden ved anven delse af delvist renset aminosyreoxydase viste at cephalosporin C-zonen forsvandt fuldstændigt efter 2,5-3 timers inkubering og at zonen svarende til det ønskede produkt nåede en maksimumintensitet omkring samme tid.

25 Eksempel 2

To 100 ml systemer indeholdende 5 mg/ml cephalosporin C, 10 mM natriumazid og aminosyreoxydase (60 enheder/mg cephalosporin C), vundet ved homogenisering af celler af Trigo-nopsis variabilis, inkuberedes ved 33°C. Det ene system omrør-30 tes forsigtigt, det andet omrørtes og gennemluftedes med et drejekors ved omkring 100 ml luft/min.

Resultaterne på tyndlagskromatografipladerne viste, at al cephalosporin C i det gennemluftede system var blevet oxyderet efter 2 timers inkubering, idet 75% af oxydationsproduk-35 tet var 3-acetoxymetyl-73-(4-karboxybutanamido)-ceph-3-em-4- karboxylsyre.

U 2367 13

Det ikke gennemluftede system viste kun svag oxydation af cephalosporin C, selv efter 4 timers inkubering.

Eksempel 3 3-Acetoxymety1-7β-(4-karboxybutanamido)-ceph-3-em-4-karboxyl- 5 syre fra cephalosporin C gæringsvæske._ 300 ml af et syrnet filtrat af cephalosporin C gæringsvæske indstilledes til pH 8,1 med 10 N natriumhydroxyd og be- 5 handledes med 32,5 mg ImM natriumaizd, der tilsattes 4 x 10 enheder Trigonopsis variabilis enzympraeparat vundet ved homo-10 genisering og ammoniumsulfatfraktionering og pH indstilledes igen til 8,1. Blandingen inkuberedes derefter ved 33°C og om-rørtes (150 omrøringer/min), under gennemluftning med fugtig luft i en mængde på 1 rumfang/rumfang/min. Skumningen kontrolleredes med "M.S. antifoam R.D." silikone-antiskumningsmid-15 del. Prøver fjernedes med en times mellemrum til undersøgelse og reaktionen afsluttedes efter 4 timer. Prøver ved kvantitativ papirelektroforese viste, at 95% af det tilstedeværende cephalosporin C var omdannet til 3-acetoxymetyl-70-(4-karboxybutanamido)-ceph-3-em-4-karboxylsyre.

20 Eksempel 4

Ekstraktion og rensning af 3-acetoxymetyl-73-(4-karboxybutan- amido)-ceph-3-em-4-karboxylsyre.__

Ved fremgangsmåden i første afsnit af eksempel 2 med gennemluftning omdannedes cephalosporin C i opløsning til 25 3-acetoxymetyl-78-(4-karboxybutanamido)-ceph-3-em-4-karboxyl- syre. 450 ml af opløsningen indstilledes til pH 2,3 med svovlsyre og ekstraheredes 4 gange med 150 ml 15% rumfang/rum-fang "Amberlite" ®LA1 i n-butanol ved omrøring i 6 minutter med pH-meter ved pH 4,0 + 0,3, idet der anvendtes svovlsyre 30 til at indstille pH. Opløsningsmiddelekstrakterne tilbageeks- traheredes med 6 x 75 ml 1M natriumbikarbonat. De samlede vandige ekstrakter vaskedes med 2 x 200 ml ætylacetat, syrnedes med svovlsyre og ekstraheredes med ætylacetat (1 x 150 ml og 5 x 100 ml). De forenede opløsningsmiddelekstrakter vaskedes 142367 14 med 3 x 20 ml mættet natriumklorid, tørredes og koncentreredes under reduceret tryk til 15 ml. Tilsætning af 300 ml petroleum gav et klistret bundfald, som opløstes i acetone og destilleredes til tørhed efterladende 0,897 g hvidt glas.

5 Ved direkte ultraviolet prøve viste det sig, at dette faste stof var 89,5% rent (79%s ekstraktion).

Eksempel 5

Ekstraktion og rensning af 3-acetoxymetyl-7(3-(4-karboxybutan-amido)-ceph-3-em-4-karboxylsyre fra gæringsvæske ved anven- 10 delse af "Amberlite" ®LA1._ _ 100 ml cephalosporin C afproteiniseret gæringsvæske indeholdende 0,05 g 3-acetoxymety 1-7(3- (4-karboxybutanamido)-ceph-3-em-4-karboxylsyre syrnedes til pH 2,0 med svovlsyre og ekstraheredes to gange med 60 ml 15% rumfang/rumfang "Am-15 berlite" ®LA1 i n-butanol. pH indstilledes til 2,0 før den anden ekstraktion. Opløsningsmiddelekstrakterne forenedes, vaskedes med 10 ml vand, og ekstraheredes med 3 x 20 ml 1M natriumbikarbonat. De forenede vandige ekstrakter vaskedes med 2 x 20 ml ætylacetat, syrnedes med svovlsyre og ekstrahe-20 redes med 3 x 25 ml ætylacetat.Efter vask med 10 ml vand og 2 x 15 ml mættet natriumklorid og tørring, omrørtes ætylace-tatekstrakten i 3 minutter med 0,5 g S.S. No. 5 trækul, filtreredes og destilleredes under reduceret tryk til 10 ml. Behandling af de koncentrerede ekstrakter med 250 ml petrole-25 um gav et klistret bundfald, som opløstes i acetone og destilleredes til tørhed under reduceret tryk, hvorved der efterlodes 0,493 g hvidt glas. Ved direkte ultraviolet prøve viste 1% det sig, at dette faste stof har E. ° = 185, λ = 260 nm.

lem max (Renhed = 80,5%, 70,5%s ekstraktion).

30 Eksempel 6

Ekstraktion og rensning af 3-acetoxymety1-7β-(4-karboxybutanamido) -ceph-3-em-4-karboxylsyre fra gæringsvæske ved anvendel- se af "Amberlite" ®XAD2 .__ 100 ml cephalosporin C afproteiniseret gæringsvæske in- 15 1423B7 deholdende 0,397 g 3-acetoxymetyl-7|3- (4-karboxybutanaraido) -ceph-3-em-4-karboxylsyre indstilledes til pH 8,2 med 4N natriumhydroxyd. Et tungt bundfald som dannedes, fjernedes ved centrifugering og den ovenstående væske passeredes gennem 5 en "Amberlite" ®XAD2-kolonne på 20 g ved 2-3 ml/min. Det forenede filtrat og vaskevæske indstilledes til pH 2,7 med svovlsyre og passeredes gennem en anden kolonne af "Amber-lite" ® XAD2 på 20 g med 1-2 ml/min. Efter vask med vand elueredes den anden kolonne med 120 ml acetone. Acetonen de-10 stilleredes fra eluatet under reduceret tryk og den vandige remanens frysetørredes til dannelse af 0,595 g af et blegt brunfarvet fast stof. Ved direkte ultraviolet prøve viste det sig at dette faste stof var 65% rent.

Eksempel 7 15 Omdannelse af en forbindelse ifølge opfindelsen til 7-ACÅ En suspension af 772 mg (0,002 mol) 3-acetoxymetyl-7&-(4'-karboxybutanamido)-ceph-3-em-4-karboxylsyre i 7 ml metylendiklorid opløseliggjordesved tilsætning af 0,55 ml (0,0039 mol) triætylamin, og derefter sattes 0,515 ml 20 (0,0045 mol) trimetylklorsilan til den resulterende opløsning.

Reaktionsblandingen omrørtes i to timer, der tilsattes 1,92 ml (0,025 mol) pyridin og efter afkøling til -10°C tilsattes dråbevis en opløsning af 1,246 g (0,006 mol) fosforpentaklo-rid i 12 ml metylendiklorid. Suspensionen omrørtes ved -10°C 25 i 35 minutter, der tilsattes dråbevis 5 ml iskold metanol og opløsningen omrørtes ved 0°C i yderligere 3 timer før den udhældtes i 2 ml vand. pH-Værdien reguleredes til 3,5 med 6N-natriumhydroxyd og efter at tofasesystemet havde henstået ved 0°C i 16 timer isoleredes 0,033 g (6%) af 3-acetoxymetyl-7&-30 amino-ceph-3-em-4-karbOi.'ylsyre (7-ACA) ved filtrering, [a]^ = +85,9° (c = 0,99 i 0,2N, pH 7,0 fosfatpuffer), λ 261 nm (e= ΤΠαΧ· 6.900), pH 6 fosfatpuffer. Elektroforese ved pH 1,9 viste at prøven var identisk med autentisk materiale.

Eksempel 8 142367 16

Omdannelse af en forbindelse Ifølge opfindelsen til 7-ACA.

0,515 ml (0,0045 mol) trimetylklorsilan sattes til en opløsning af 777 mg (0,002 mol) 3-acetoxymetyl-73-(4'-kar-5 boxybutanamido)-ceph-3-em-4-karboxylsyre i 7 ml kloroform indeholdende 0,55 ml (0,0039 mol) triætylamin og efter omrøring ved stuetemperatur i 2 timer tilsattes 0,64 ml (0,008 mol) pyridin, hvorefter opløsningen afkøledes til -10°C og behandledes med en opløsning af 456 mg (0,0022 mol) fosfor-10 pentaklorid i 10 ml kloroform i løbet af 2 minutter. Reaktionsblandingen omrørtes ved 0°C i 30 minutter, der tilsattes 5 ml iskold metanol dråbevis ved -10°C og opløsningen omrørtes ved 0°C i yderligere 3 tmer før den udhældtes i 2 ml vand. pH reguleredes til 3,5 med 6N natriumhydroxyd og efter at 15 tofasesystemet havde henstået ved 0°C i 16 timer isoleredes ved filtrering 0,105 g, 20%, af den udfældede 3-acetoxymetyl-78-aminoceph-3-em-4-karboxylsyre (7-ACA). [<x]p° = +92,7° (c = 1,11, 0,2M, pH 7,0 fosfatpuffer), λ 262 nm (ε = rosx · 6.80.0) i pH 6 fosfatpuffer. Elektroforese ved pH 1,9 viste at 20 prøven vår identisk med autentisk materiale.

Claims (2)

142367 17 1. 7-Acylamidocephalosporinderivater til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af 7-aminocephalosporansyre eller derivater deraf med 3-sidekæde med formlen -CH^X, hvor 5. er et hydrogenatom, en hydroxygruppe eller en acyloxygrup-pe med højst 3 kulstofatomer, kendetegnet ved at de har den almene formel Hooc- (ch2) 3conh—-r v s— o" ; ch7x COOH hvor X har den ovenfor angivne betydning, eller udgøres af 10 salte deraf.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af de i krav 1 angivne 7-acylamidocephalosporinderivater med den almene formel I, hvor X har den angivne betydning, eller salte deraf, kendetegnet ved at man under aerobe betingelser under- 15 kaster en cephalosporinforbindelse med den almene formel “OOC. S o T ch2x COOH eller et salt deraf, i hvilken formel X har den i krav 1 anførte betydning, indvirkning af en fungal D-aminosyreoxydase under fravær af katalase eller inhibering af eventuelt i D-aminosyreoxydasen 20 tilstedeværende katalase og derpå isolerer den dannede forbindelse.