DK147437B - Fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin eller threoninb30estere af humaninsulin eller et salt eller kompleks deraf - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin eller threoninb30estere af humaninsulin eller et salt eller kompleks deraf Download PDFInfo
- Publication number
- DK147437B DK147437B DK054081AA DK54081A DK147437B DK 147437 B DK147437 B DK 147437B DK 054081A A DK054081A A DK 054081AA DK 54081 A DK54081 A DK 54081A DK 147437 B DK147437 B DK 147437B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- insulin
- thr
- human insulin
- ome
- water
- Prior art date
Links
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 title claims description 59
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 title claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 42
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims description 11
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Substances N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 163
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 65
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 60
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 60
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 60
- -1 L-threonine ester Chemical class 0.000 claims description 53
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 52
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 52
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 51
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 claims description 39
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Natural products C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 35
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 34
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 18
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 16
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 10
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical group 0.000 claims description 8
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 5
- 150000003588 threonines Chemical class 0.000 claims description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- 239000004472 Lysine Chemical group 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 99
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 25
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 23
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 18
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 16
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 16
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 16
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 229940113088 dimethylacetamide Drugs 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 9
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 8
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 101000993800 Sus scrofa Insulin Proteins 0.000 description 8
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 8
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 7
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000008551 L-threonines Chemical class 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 241000590035 Achromobacter lyticus Species 0.000 description 3
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 3
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 3
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical class CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012443 analytical study Methods 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- HHMSPIAOYISBOU-IYQBICMXSA-N insulin rabbit Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 HHMSPIAOYISBOU-IYQBICMXSA-N 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N (r)-(6-ethoxyquinolin-4-yl)-[(2s,4s,5r)-5-ethyl-1-azabicyclo[2.2.2]octan-2-yl]methanol;hydrochloride Chemical group Cl.C([C@H]([C@H](C1)CC)C2)CN1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OCC)C=C21 QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1,3-oxazole-4-carbaldehyde Chemical compound FC1=CC=CC(C=2OC=C(C=O)N=2)=C1 BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N XUUXCWCKKCZEAW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005982 diphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N hexamethylphosphoric triamide Chemical compound CN(C)P(=O)(N(C)C)N(C)C GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 description 2
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940087562 sodium acetate trihydrate Drugs 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- YZYKBQUWMPUVEN-UHFFFAOYSA-N zafuleptine Chemical compound OC(=O)CCCCCC(C(C)C)NCC1=CC=C(F)C=C1 YZYKBQUWMPUVEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 1
- HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholine Chemical compound CCN1CCOCC1 HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283081 Balaenoptera physalus Species 0.000 description 1
- 101000981881 Brevibacillus parabrevis ATP-dependent glycine adenylase Proteins 0.000 description 1
- 101000981889 Brevibacillus parabrevis Linear gramicidin-PCP reductase Proteins 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical group NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229960001040 ammonium chloride Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000004648 butanoic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N chloroacetone Chemical compound CC(=O)CCl BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N methyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound COC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O TVHCXXXXQNWQLP-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- XVDBWWRIXBMVJV-UHFFFAOYSA-N n-[bis(dimethylamino)phosphanyl]-n-methylmethanamine Chemical compound CN(C)P(N(C)C)N(C)C XVDBWWRIXBMVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N naproxen Chemical group C1=C([C@H](C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- XASPGLPXANLVTJ-RITPCOANSA-N tert-butyl (2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoate Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)OC(C)(C)C XASPGLPXANLVTJ-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Forklifts And Lifting Vehicles (AREA)
Description
- 1 - 147437
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde B3 0 til fremstilling af humaninsulin eller threonin estere af humaninsulin eller et salt eller kompleks deraf.
Til behandlingen af diabetes mellitus er der sæd-5 vanligvis anvendt insulinpræparater indeholdende svine- eller okseinsulin. Okse-, svine- og humaninsulin udviser mindre forskelle med hensyn til deres aminosyresammensætning, idet forskellen mellem human- og svineinsulin er begrænset til en enkelt aminosyre, idet B30-aminosyren i humaninsulin 10 er threonin, hvorimod den i svineinsulin er alanin. Man kan imidlertid hævde, at det ideelle insulinpræparat til behandling af mennesker er insulin, som har nøjagtig samme kemiske struktur som humaninsulin.
Den nødvendige mængde humanpankreaskirtler til 15 fremstilling af naturligt humaninsulin er ikke tilgængelig.
Syntetisk humaninsulin er fremstillet i lille skala med store omkostninger, jfr. Helv.Chim.Acta 5T_, 2617, og 60, 27. Semisyntetisk humaninsulin er fremstillet ud fra svineinsulin ad langsommelige veje, jfr. Hoppe-Seyler1 s 20 Z.Physiol.Chem. 357, 759.
USA-patentskrift nr. 3.276.961 påstås at angå en fremgangsmåde til fremstilling af semisyntetisk humaninsulin, hvor andre, animalske insuliner omsættes med threonin i nærværelse af et enzym såsom trypsin eller carboxypeptidase 25 A. Udbyttet af humaninsulin er imidlertid yderst ringe (hvis der i det hele taget er noget udbytte), idet fremgangsmåden udføres i vand, under hvilke betingelser trypsin medfører B22 go *3 spaltning af Arg -Gly -bindingen, jfr. J.Biol.Chem. 236, 743 .
30 En anden, kendt semisyntetisk fremgangsmåde til
fremstilling af humaninsulin omfatter følgende tre trin: I
B3 0 første trin spaltes svineinsulin til svine-des-(Ala )-insulin ved behandling med carboxypeptidase A, jfr. Hoppe-Seyler' s Z. Physiol.Chem. 359, 799. I andet trin underkastes 35 svine-des-(Ala )-insulin en trypsinkatalyseret kobling med Thr-OBu1", hvorved der dannes ThrB30-tert.butylester af humaninsulin. I tredie trin behandles den pågældende ester - 2- 147437 med trifluoreddikesyre, hvorved fås humaninsulin, jfr.
Nature 280, 412. Det første trin resulterer imidlertid i en delvis fjernelse af AsnA21, hvorved fås des-(AlaB20,AsnA21)- insulin. Dette derivat giver efter de to efterfølgende trin A21 5 anledning til forurening med des-(Asn )-insulin i det fremstillede semisyntetiske humaninsulin, hvilket er en forurening, som ikke let kan fjernes med kendte præparative me- A21 toder. Des-(Asn )-insulin udviser lav biologisk aktivitet (ca. 5%), jfr. Amer.J.Med. £0, 750.
10 Det har nu overraskende vist sig, at insulinfor bindelser, som er forskellige fra humaninsulin, f.eks. svi-neinsulin og visse urenheder deri, kan omdannes til humaninsulin ved en fremgangsmåde, ved hvilken insulinforbindelser- 133 0 ne i ét trin omdannes direkte til en threonin ester af 15 humaninsulin. Denne fremgangsmåde giver humaninsulin i væsentligt større udbytte end ved de kendte fremgangsmåder og uden biprodukter, som det er vanskeligt at fjerne.
Den foreliggende opfindelse bygger på den opdagelse, at aminosyren eller peptidkæden, som er bundet til car-B2 9 20 bonylgruppen, Lys , i insulinforbindelsen med den almene formel I i krav 1, i ét trin kan udskiftes med en threonin-ester. Den pågældende udskiftning betegnes her en transpep-tidering.
Insulinforbindelser med formlen I er insuliner og 25 insulinlignende forbindelser indeholdende human-des(Thr )-insulindelen, i hvilke B30-aminosyren i insulinet er alanin (i insulin fra f.eks. svin, hund, finhval og spermacethval) eller serin (kanin). Den heri anvendte betegnelse "insulinlignende forbindelser" omfatter proinsulin stammende fra en 30 hvilken som helst af ovennævnte arter og primater samt mellemprodukter fra omdannelsen af proinsulin til insulin. Som eksempler på sådanne mellemprodukter kan angives splitpro-insulin, desdipeptidproinsuliner, desnonapeptidproinsulin og diarginininsuliner, jfr. R. Chance: In Proceedings of the 35 Seventh Congress of IDF, Buenos Aires 1970, 292 - 305,
Editors: R.R. Rodrigues & J.V.-Owen, Excerpta Medica,
Amsterdam.
- 3- 147437
Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er ejendommelig ved at en insulinforbindelse med den almene formel I og forskellig fra humaninsulin eller flere forbindelser med den almene formel I
5 R^d---A---21) I I ? (I)
(1---B---29)-R
hvor -(1---A---21)
I I
10 (1---B---29)- betegner human-des(Thr®^) insulindelen, hvori GlyA·*· er for- 1 B29 bundet med substituenten betegnet R , og Lys er forbundet 2 2 med substituenten betegnet R , R betegner en aminosyre eller en peptidkæde indeholdende højst 36 aminosyrer, og Rx 15 betegner hydrogen eller en gruppe med den almene formel 3 3 R -X-, hvor X betegner argmin eller lysin, og R betegner 2
en peptidkæde indeholdende højst 35 aminosyrer, eller R
3 sammen med R betegner en peptidkæde indeholdende højst 35 aminosyrer, med det forbehold, at antallet af aminosyrer, 1 2
20 som er til stede i R og R , er mindre end 37, eller et salt eller kompleks deraf, som kan omdannes dertil, transpeptideres med en L-threoninester med den almene formel II
Thr(R5)-OR4 (II) 4 5 hvor R betegner en carboxylbeskyttelsesgruppe, og R be- 25 tegner hydrogen eller en hydroxylbeskyttelsesgruppe, eller et salt deraf i en blanding af vand, et vandblandbart, organisk opløsningsmiddel og trypsin, hvorhos indholdet af vand i reaktionsblandingen er under 50% (rumfang/rumfang), og reaktionstemperaturen er under 50°C, og der eventuelt er en B3 0 30 syre til stede, hvorefter den resulterende threonin ester af humaninsulin om ønsket spaltes.
Selv om trypsin er bedst kendt for sine proteoly-tiske egenskaber, har fagfolk som nævnt fundet ud af, at trypsin er i stand til at katalysere koblingen af des- boa 35 (Ala )-insulin og en threonin-tert.butylester, jfr. Nature , 147437 - 4 - 280, 412. Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes trypsin imidlertid til at katalysere en transpeptidering.
Ifølge ovenstående angår Nature 280, 412, en meto-5 de til peptidkobling, hvorimod den foreliggende opfindelse angår en metode til transpeptidering af peptider. Hvis man ser bort fra det trin, hvor humaninsulinesteren hydrolyseres, skal der ifølge Nature 280, 412, anvendes to trin til fremstilling af humaninsulinesteren, nemlig et peptidspalt-10 ningstrin og et peptidkoblingstrin. Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse fås humaninsulinesteren direkte i ét trin, nemlig et transpeptideringstrin.
I Nature 280, 412, anføres det, at det er overra- B22 B23 skende, at der ikke sker nogen spaltning af Arg -Gly 15 bindingen i produktet. Det er kendt, at trypsin i vandigt medium spalter ved bade Arg -Gly og ved Lys -Ala , og man må følgelig på basis af Nature 280, 412, forvente, at B2 9 trypsin i det organiske medium heller ikke spalter Lys B3 0
Ala -bindingen. I Nature 280, 412, angives intet om, hvor* B29 B30 20 vidt der kan ske en spaltning af Lys -Ala -bindingen i det organiske medium. Det er følgelig særdeles overraskende, at man direkte på svineinsulin kan foretage transpeptideringen ifølge den foreliggende opfindelse.
I Biochem.Biophys.Res.Com. j)2, 396, er beskrevet 25 en metode til fremstilling af humaninsulin, hvilken metode stort set er identisk med den i Nature 280, 412, beskrevne, idet der dog som enzym anvendes Achromobacter lyticus-prote-ase. Ovennævnte betragtninger vedrørende Nature 280, 412, er følgelig analogt gældende for Biochem.Biophys.Res.Com. 92, 30 396.
Transpeptideringen ifølge den foreliggende opfindelse kan udføres ved at opløse insulinforbindelsen, en L-threoninester og trypsin i en blanding af vand og mindst ét vandblandbart, organisk opløsningsmiddel, eventuelt i 35 nærværelse af en syre.
_ 5 _ 147437
Foretrukne vandblandbare, organiske opløsningsmidler er polære opløsningsmidler. Som specifikke eksempler på sådanne opløsningsmidler kan angives methanol, ethanol, 2-propanol, 1,2-ethandiol, acetone, dioxan, tetrahydrofuran, 5 Ν,Ν-dimethylformamid, formamid, Ν,Ν-dimethylacetamid, N- methylpyrrolidon, hexamethylphosphortriamid og acetonitril.
Afhængigt af det anvendte, vandblandbare, organiske opløsningsmiddel, af den valgte reaktionstemperatur og af tilstedeværelsen af en syre i reaktionsblandingen er ind-10 holdet af vand i reaktionsblandingen fortrinsvis mellem 43 og 10% (rumfang/rumfang). Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er indholdet af vand i reaktionsblandingen mellem 43 og 10% (rumfang/rumfang), idet der herved fås et produkt med et re-15 lativt lavt indhold af urenheder.
En fordel ved at formindske mængden af vand i reaktionsblandingen er, at derved formindskes dannelsen af biprodukter. Ved at forøge mængden af syre i reaktionsblandingen er det på tilsvarende måde muligt at formindske dan-20 nelsen af biprodukt. Forøgelsen i udbytte er positivt kor- releret med en høj procentsats af organisk opløsningsmiddel.
Ved udøvelse af den foreliggende opfindelse er det ikke væsentligt, hvilken art trypsin der anvendes. Trypsin er et godt karakteriseret enzym, der kommercielt er tilgæn-25 geligt i høj renhed, især fra okse- og svinekilder. Der kan endvidere anvendes trypsin af mikrobiel oprindelse. Ved udøvelse af denne opfindelse er trypsinformen, f.eks. krystallinsk trypsin (opløselig form), immobiliseret trypsin eller endog trypsinderivater (så længe trypsinaktiviteten 30 bibeholdes), endvidere ikke væsentlig. Den heri anvendte betegnelse trypsin skal omfatte trypsiner af enhver oprindelse og alle trypsinformer, som har bibeholdt den transpeptiderende aktivitet, herunder proteaser med trypsinlignende specificitet, f.eks. Achromobacter lyticus-protease, jfr.
35 Agric.Biol.Chem. j42, 1443 .
_ 6_ 147437
Som eksempler på aktive trypsinderivater kan angives acetyleret trypsin, succinyleret trypsin, glutaraldehyd-behandlet trypsin og immobiliserede trypsinderivater.
Såfremt der anvendes et immobiliseret trypsin, 5 suspenderes det i mediet.
Til opnåelse af et egent puffersystem kan der tilsættes organiske eller uorganiske syrer såsom saltsyre, myresyre, eddikesyre, propionsyre og smørsyre og baser såsom pyridin, TRIS, N-methylmorpholin og N-ethylmorpholin. Orga-10 niske syrer foretrækkes. Omsætningen kan imidlertid udføres uden sådanne tilsætninger. Den tilsatte mængde syre er sædvanligvis mindre end ca. 10 ækvivalenter pr. ækvivalent L-threoninester. Mængden af syre er fortrinsvis mellem 0,5 og 5 ækvivalenter pr. ækvivalent L-threoninester. En fore-15 trukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse går ud på, at koncentrationen af L-threoninester i reaktionsblandingen overstiger 0,1 molær, og at reaktionsblandingen indeholder fra 0 til 10 ækvivalenter af en syre pr. ækvivalent L-threoninester.
20 Der kan tilsættes ioner, som stabiliserer trypsin, såsom kalciumioner.
Til opnåelse af en tilstrækkelig reaktionshastighed udføres enzymatiske reaktioner med trypsin sædvanligvis ved ca. 37°C. Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfin-25 delse kan udføres ved en temperatur i området mellem 50°C og reaktionsblandingens frysepunkt. For at undgå inaktivering af trypsin er det imidlertid fordelagtigt at udføre fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse ved en temperatur under stuetemperatur. I praksis foretrækkes reaktions-30 temperaturer over ca. 0°C. En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse går følgelig ud på, at reaktionstemperaturen er under 37°C, fortrinsvis under stuetemperatur, og over 0°C.
Afhængigt af reaktionstemperaturen, af den tilsat-35 te mængde trypsin og af andre reaktionsbetingelser er reaktionstiden sædvanligvis mellem flere timer og flere dage.
_7 . 147437 Vægtforholdet mellem trypsin og insulinforbindelsen i reaktionsblandingen er sædvanligvis over ca. 1:200, fortrinsvis over ca. 1:50, og under ca. 1:1.
rjo A
De threonin estere af humaninsulin, der fås ved 5 transpeptideringen, kan angives ved den almene formel III
(Thr(R5)-OR4)B30-h-In (III) hvor h-In betegner human-des-(ThrB30)insulindelen, og R4 og 5 R har ovenstående betydning.
Anvendelige L-threoninestere med formel II er så- 4 10 danne, i hvilke R er en carboxylbeskyttelsesgruppe, der kan B3 0 fjernes fra threonin esteren af humaninsulin (formel III) under betingelser, der ikke medfører væsentlig, irreversibel ændring i insulinmolekylet. Som eksempler på sådanne car- boxylbeskyttelsesgrupper kan angives lavere alkyl, f.eks.
15 methyl, ethyl og tert.butyl, substitueret benzyl såsom p- methoxybenzyl og 2,4,6-trimethylbenzyl og diphenylmethyl, og fi £ grupper med den almene formel -CH2CH2S02R , hvor R betegner lavere alkyl såsom methyl, ethyl, propyl og n-butyl. Egnede hydroxylbeskyttelsesgrupper R5 er sådanne, der kan fjernes B3 π 20 fra threonin esteren af humaninsulin (formel III) under betingelser, der ikke medfører væsentlig, irreversibel ændring i insulinmolekylet. Som et eksempel på en sådan gruppe 5 (R ) kan angives tert.butyl.
Lavere alkylgrupper indeholder mindre end 7 car-25 bonatomer, fortrinsvis mindre end 5 carbonatomer.
Yderligere, sædvanligt anvendte beskyttelsesgrupper er beskrevet af Wunsch: Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Vol. XV/1, editor: Eugen Muller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974.
30 Nogle L-threoninestere (formel II) er kendte for bindelser, og de resterende L-threoninestere (formel II) kan fremstilles analogt med fremstillingen af kendte forbindelser.
- 8- 147437 L-threoninesterne med formel II kan være de frie baser eller egnede organiske eller uorganiske salte deraf, fortrinsvis acetater, propionater, butyrater og hydrohaloge-nider såsom hydrochlorider.
5 Det er ønskeligt at anvende reaktanterne, dvs.
insulinforbindelsen og L-threoninesteren (formel II), i høje koncentrationer. Det molære forhold mellem L-threoninesteren og insulinforbindelsen er fortrinsvis over ca. 5:1.
Det er ønskeligt, at koncentrationen af L-threo-10 ninesteren (formel II) i reaktionsblandingen overstiger 0,1 molær.
Humaninsulin kan fås ud fra threonin estere af humaninsulin (formel III) ved fjernelse af beskyttelsesgrup- 4 5
pen R og en eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgruppe R
15 på kendt måde eller på i og for sig kendt måde. Såfremt R4
C
er methyl, ethyl eller en gruppe med formlen -C^C^SC^R , hvor R^ har ovennævnte betydning, kan den pågældende beskyttelsesgruppe fjernes under milde, basiske betingelser i et vandigt medium, fortrinsvis ved en pH-værdi på mellem ca. 8 20 og ca. 12, f.eks. ved ca. 9,5. Som basen kan anvendes ammoniak, triethylamin eller hydroxyder af alkalimetaller såsom natriumhydroxyd. Såfremt R4 er tert.butyl, substitueret ben-zyl såsom p-methoxybenzyl eller 2,4,6-trimethylbenzyl eller diphenylmethyl, kan den pågældende gruppe fjernes ved acido-25 lyse, fortrinsvis med trifluoreddikesyre. Trifluoreddike-syren kan være ikke-vandig eller kan indeholde noget vand, eller den kan være fortyndet med et organisk opløsningsmiddel såsom dichlormethan. såfremt RD er tert.butyl, kan den pågældende gruppe fjernes ved acidolyse, jfr. ovenfor.
30 Foretrukne threonin estere af humaninsulin med 5 formel III er forbindelser, hvor R er hydrogen, og disse kan fremstilles ud fra L-threoninestere med formel II, hvor R^ er hydrogen.
_ 9 - 147437
Ved transpeptideringen ifølge den foreliggende opfindelse omdannes en hvilken som helst af ovennævnte insu-linforbindelser således til threonin estere af humaninsulin (formel III), som derefter kan spaltes til dannelse af 5 humaninsulin.
En yderligere fordel ved den foreliggende opfindelse er det forhold, at insulinlignende forbindelser, som er til stede i råt insulin og i nogle kommercielle insulinpræparater, og som er dækket af formel I, ved transpeptide-10 ringen ifølge den foreliggende opfindelse omdannes til B3 g threonin estere af humaninsulin, hvilke forbindelser derefter kan spaltes under dannelse af humaninsulin. Eksempler på insulinlignende forbindelser med formel I fremgår af det følgende: 1 2 15 Svinediargmxnmsulin (R er hydrogen, og R er 2 3 -Ala-Arg-Arg), svineproinsulin (R er sammen med R -Ala-
Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-
Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-
Pro-Pro-Gln-Lys-, hvor den terminale alanyl er knyttet til B2 9 2 3 20 Lys ), hundeproinsulin (R er sammen med R -Ala-Arg-Arg-
Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly-Gly-Leu-Gln-
Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ala-Leu-Gln-Lys-, hvor den terminale B2 9 2 alanyl er knyttet til Lys ), svinesplitproinsulin (R er -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu- 25 Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu, og R3 er Ala-
Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys-), svinedesdipeptidproinsulin 1 2 (R er hydrogen, og R er -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln), humanproinsulin 2 3 30 (R er sammen med R -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-
Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-
Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-, hvor den B2 9 terminale threonyl er knyttet til Lys ) og abeproinsulin 2 3 (R er sammen med R -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln- 35 Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-
Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-, hvor den B2 9 terminale threonyl er knyttet til Lys ).
- 10- 147437 I alle disse urenheder, der er dækket af formel I, 1 3 udskiftes R -substituenten betegnet R -X- således med hydrogen.
Idet svineinsulin er relativt let tilgængeligt, 5 anvendes der som udgangsmateriale ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen svineinsulin. En foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse går ud på at omsætte råt svineinsulin indeholdende insulinlignende forbindelser eller et salt eller kompleks 10 deraf med en L-threoninester (formel II) eller et salt deraf under ovennævnte betingelser, hvorefter beskyttelsesgruppen 4 5
R og en eventuelt tilstedeværende beskyttelsesgruppe R
fjernes. Ved denne metode omdannes svineinsulin samt insulinlignende forbindelser deri til humaninsulin.
15 Som eksempler på et kompleks eller et salt af en insulinforbindelse (formel I) kan angives et zinkkompleks eller zinksalt.
Når reaktionsbetingelserne vælges ifølge ovenstående forklaring og under hensyntagen til de resultater, der 20 er opnået i de følgende eksempler, er det muligt at få et 333 0 udbytte af threonin ester af humaninsulin, der er over 60% og endog over 80% og under visse foretrukne betingelser over 90%. Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden i-følge den foreliggende opfindelse er indholdet af vand i re-25 aktionsblandingen mellem 43 og 20% (rumfang/rumfang). En yderligere foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden i-følge den foreliggende opfindelse går ud på, at insulinforbindelsen er svineinsulin, at L-threoninesteren er Thr-OMe eller Thr-OBu*', at det vandblandbare, organiske opløsnings-30 middel er Ν,Ν-dimethylformamid eller N,N-dimethylacetamid, at reaktionstemperaturen er ca. 37°C, at indholdet af vand i reaktionsblandingen er mellem 41 og 43%, at vægtforholdet mellem trypsin og insulinforbindelsen er ca. 1:8, at molforholdet mellem L-threoninesteren og insulinforbindelsen er 35 ca. 120:1, og at der er tilsat mellem 1,2 og 1,5 ækvivalenter eddikesyre pr. ækvivalent L-threoninester.
_ n _ 147437
Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse har derfor følgende fordele i sammenligning med den kendte teknik: a) Den enzymatiske hydrolyse til fjernelse af DO Λ 5 Ala , f.eks. med carboxypeptidase A, er udeladt.
b) Isoleringen af et mellemprodukt såsom svine-B3 0 des-(Ala )-insulin er unødvendig.
A21 c) Forurening med des(Asn )-insulinderivater undgås.
10 d) Proinsulin og andre insulinlignende urenheder, som er til stede i råt svineinsulin, omdannes ved fremgangs- B3 0 måden ifølge denne opfindelse - via threonin esteren af humaninsulin - til humaninsulin, hvorved udbyttet forøges.
e) Antigene insulinlignende forbindelser, jfr.
15 britisk patentskrift nr. 1.285.023, omdannes til humaninsulin.
En foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af humaninsulin er følgende: 1) Det til transpeptideringen anvendte udgangsma-20 teriale er råt svineinsulin, f.eks. krystallinsk insulin, der er fremstillet under anvendelse af en citratpuffer, jfr.
USA-patentskrift nr. 2.626.228.
2) Hvis der er trypsinaktivitet tilbage efter transpeptideringen, foretrækkes det at fjerne det, f.eks.
25 under betingelser, ved hvilke trypsin er inaktivt, f.eks. i surt medium ved en pH-værdi på under 3. Trypsin kan fjernes ved separation efter molekylvægt, f.eks. ved gelfiltrering på "Sephadex G-50" eller "Bio-gel P-30" i 1 M eddikesyre, jfr. Nature 280, 412.
30 3) Andre urenheder såsom uomsat svineinsulin kan fjernes under anvendelse af anion- og/eller kationbytter- chromatografering, jfr. nedenstående eksempler 1 og 2.
B30 4) Derefter spaltes threonin esteren af humaninsulin, og humaninsulin isoleres, f.eks. krystalliseres, på i 35 og for sig kendt måde.
-12- 147437 På denne måde kan der fås humaninsulin med en acceptabel farmaceutisk renhed, og humaninsulinet kan om ønskes renses yderligere.
Anvendte forkortelser er i overensstemmelse med de 5 regler, der blev godkendt (1974) af IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, jfr. Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2nd ed., Maryland 1975. Nærmere præciseret er betydningen af de heri anvendte forkortelser følgen- 10 de: Ala er alanin, Arg er arginin, Asn er asparagin, Asp er asparaginsyre, Gin er glutamin, Glu er glutaminsyre, Gly er glycin, Leu er leucin, Lys er lysin, Pro er prolin, Ser er serin, Thr er threonin, og Val er valin. Bu*" er tert.butyl, og Me er methyl.
15 Sephadex og Bio-gel er varemærker.
Analytiske undersøgelser:
Omdannelsen af svineinsulin og svineproinsulin til humaninsulinestere kan anskueliggøres ved DISC-PAGE-elektro-forese i 7,5%'s polyacrylamidgel i en puffer bestående af 20 0,375 M TRIS, 0,06 M HC1 og 8 M urinstof. Pufferens pH-værdi er 8,7. Estere med formel III vandrer med en hastighed, der er 75% af svineinsulins hastighed. Svineproinsulin, som vandrer med 55% af svineinsulins hastighed, omdannes ved fremgangsmåden ifølge denne opfindelse til det samme produkt.
25 Identifikationen af omdannelsesproduktet som forbindelser med formel III skyldes følgende kriterier: a) Den elektroforetiske vandring af humaninsulinestere med formel III i forhold til svineinsulin svarer til tabet af én negativ ladning.
30 b) Aminosyresammensætningen af de farvede protein bånd i gelen repræsenterende forbindelser med formel III er identisk med humaninsulins aminosyresammensætning, dvs. 3 mol threonin og 1 mol alanin pr. mol insulin, og sammensæt - 15 - 147437 ningen af svineinsulin er 2 mol threonin og 2 mol alanin pr. mol insulin. Teknikken til analysering af aminosyresammen-sætninger af proteinbånd i polyacrylamidgeler er beskrevet i Eur.J.Biochem. 2!i, 147.
5 c) Beviset for, at det inkorporerede threonin er placeret som C-terminal aminosyre i B-kæden, kan fås ved oxidativ sulfitolyse af S-S-broerne i insulin i 6 M guani-dinhydrochlorid efterfulgt af adskillelse af A- og B-kæder ved ionbytterchromatografering på "SP Sephadex". Ved fordøj -10 else af B-kæde-S-sulfonatet med carboxypeptidase A frigøres kun den C-terminale aminosyre. Teknikken er beskrevet af Markussen i Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide, Tokushima, 12 - 14 juli, 1978 (udgiver:
Baba, Kaneko og Yaniahara) Int.Congress Series No. 468, 15 Excerpta Medica, Amsterdam-Oxford. Analysen udføres efter, at estergruppen er spaltet fra forbindelser med formel III.
De 3 analyser beviser klart, at der er sket omdannelse til humaninsulin.
Omdannelsen af svineinsulin og svineproinsulin til 20 humaninsulinestere kan følges kvantitativt ved HPLC (high pressure liquid chromatography) på omvendt fase. Der anvendes en 4 x 300 mm '^Bondapak C^g-kolonne" (Waters Ass.), og elu-eringen udføres med en puffer indeholdende 0,2 M ammoniumsulfat (som er indstillet på en pH-vaerdi på 3,5 med svovlsyre) 25 og indeholdende 26 - 50% acetonitril. Den optimale acetoni-
trilkoncentration afhænger af, hvilken ester med formel III
<. 4 man ønsker at separere fra svineinsulin. Såfremt R er methyl, og er hydrogen, opnås separation i 26% (rumfang/ B30 rumfang) acetonitril. Svineinsulin og (Thr-OMe) -h-ln (Me 30 er methyl) eluerer efter henholdsvis 4,5 og 5,9 kolonnerumfang som klart separerede symmetriske toppe. Før påføringen på HPLC-kolonnen udfældes proteinerne i reaktionsblandingen ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Bundfaldet opsamles ved centrifugering, tørres i vakuum og opløses i 0,02 M svovl-35 syre.
- 14 - 147437
Fremgangsmåden til fremstilling af humaninsulinestere og humaninsulin belyses nærmere ved følgende eksempler, som illustrerer nogle foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
5 μBondapak er et varemærke.
Eksempel 1 200 g rå svineinsulin, som er krystalliseret én gang, opløses i 1,8 ml 3,33 M eddikesyre. Der tilsættes 2 ml af en 2 M opløsning af Thr-OMe (Me er methyl) i N,N-dimethylaceta- 10 mid og 20 mg trypsin opløst i 0,2 ml vand. Efter henstand i 18 timer ved 37°C udfældes proteinerne ved tilsætning af 40 ml acetone, og bundfaldet isoleres ved centrifugering. Super- natanten kasseres. Analyse af bundfaldet ved HPLC under anvendelse af 26% acetonitril (jfr. Analytiske undersøgelser) B30 15 viser en 60%'s omdannelse af svineinsulin til (Thr-OMe) h-In. Bundfaldet opløses i 8 ml friskt afioniseret 8 M urinstof, pH-værdien indstilles på 8,0 med 1 M ammoniak, opløsningen føres på en 2,5 x 25 cm kolonne, som er fyldt med "QAE A-25 Sephadex", der er equilibreret med en 0,1 M ammonium-20 chloridpuffer, som indeholder 60% (rumfang/rumfang) ethanol, og pH-værdien deraf indstilles på 8,0 med ammoniak. Elue-ringen udføres med den samme puffer, og der opsamles fraktio-ner på 15 ml. (Thr-OMe) -h-In findes i fraktionerne nr. 26 - 46, og ikke-omsat svineinsulin i fraktionerne nr. 90 - 120.
25 Fraktionerne nr. 26 - 46 forenes, ethanolet afdampes i vaku- B3 0 um, og (Thr-OMe) -h-In krystalliseres i citratpuffer som beskrevet af Schlichtkrull et al., Handbuch der inneren Medizin, 7/2A, 96, Berlin, Heidelberg, New York 1975. Udbyttet er 95 mg krystaller med samme rombiske form som svinein-30 sulin, der er krystalliseret på analog måde. Aminosyresammen-sætningen viser sig at være identisk med humaninsulins aminosyre sammensætning. Yderligere analytiske undersøgelser, der - 15 - 147437 er beskrevet i ovenstående afsnit: "Analytiske undersøgel- B3 q ser", viser, at det resulterende produkt er (Thr-OMe) -h- m.
Eksempel 2 5 100 mg svineinsulin, som opfylder de renhedskriteri er, der er angivet i britisk patentskrift nr. 1.285.023, opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes derefter 1 ml af en 2 M opløsning af threoninmethylester i N,N-dimethylformamid og 12 mg TPCK-behandlet (TPCK er tosyl-10 phenylalaninchlormethylketon) trypsin, som er opløst i 0,1 ml vand. Efter inkubering i 24 timer ved 37°C standses reaktionen ved tilsætning af 4 ml 1 M fosforsyre. Den vundne (Thr-B3 0 OMe) -h-In separeres fra ikke-omsat svineinsulin ved ion-
bytterchromatografering på en 2,5 x 25 cm's kolonne af "SP
15 Sephadex" med en eluent indeholdende 0,09 M natriumchlorid og 0,02 M natriumdihydrogenfosphat (pH-værdi af puffer: 5,5) i B3 0 60% ethanol. Fraktioner indeholdende (Thr-OMe) -h-In opsamles, ethanolet fjernes i vakuum, og produktet krystalliseres på analog måde som beskrevet i eksempel 1. Udbyttet er 50 mg 20 (Thr-OMe)B30-h-In.
Eksempel 3 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddi-kesyre og omdannes til (Thr-OMe) h-In og renses på analog måde som beskrevet for svineinsulin i eksempel 1. Omdannelsen 25 af proinsulin til (Thr-OMe}B3^-h-In viser sig at være 73% ved . HPLC-analyse af acetonebundfaldet. Udbyttet af krystallinsk tao λ (Thr-OMe) -h-In er 54 mg.
Eksempel 4 - 16 - 147497 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 2,77 M eddikesyre i vand og omsættes på analog måde som beskrevet i eksempel 2. Efter afslutning af omsætningen udfældes proteinerne 5 ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Analyse ved DISC PAGE viser en omdannelse til (Thr-OMe) -h-In på 70%.
Eksempel 5 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N-methylpyrrolidon.
10 Omsætningen udføres på analog måde som beskrevet i eksempel B3 0 4, og omdannelsen til (Thr-OMe) -h-In er 20%.
Eksempel 6 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 2,77 M eddikesyre i vand, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i HMPA (hexa- 15 methylfosfortriamid). Omsætningen udføres på analog måde som B3 0 beskrevet i eksempel 4. Omdannelsen til (Thr-OMe) -h-In er 80%.
Eksempel 7 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddike-20 syre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylaceta-mid. Omsætningen udføres på analog måde som beskrevet i DO Λ eksempel 4. Omdannelsen til (Thr-OMe) -h-In er 80%.
Eksempel 8 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddike-25 syre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylaceta-mid. Derefter tilsættes 200 U (units = enheder) trypsinakti-vitet (bestemt med substratet BAEE) immobiliseret på 1 g. glasperler, og efter inkubering ved 37°C i 24 timer frafil- _ 17 . 147437 treres det til glasset bundne trypsin. Efter afslutning af omsætningen udfældes proteinerne ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Analyse ved DISC PAGE viser en omdannelse til (Thr-OMe)B30-h-In på 40%.
5 Eksempel 9 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethylaceta-mid. Derefter tilsættes 300 U trypsin aktivitet (målt med substratet BAEE), der er immobiliseret på 200 mg CNBr-aktive-10 ret "Sephadex G-150". Efter incubering ved 37°C i 24 timer frafiltreres det til "Sephadex" bundne trypsin. Efter afslutning af omsætningen udfældes proteinerne ved tilsætning af 10 rumfang acetone. Analyse ved DISC PAGE viser en omdannelse til (Thr-OMe)B30-h-In på 70%.
15 Eksempel 10
Den i eksempel 7 angivne fremgangsmåde gentages med det forbehold, at den anvendte ester er 2 M Thr-OBu (Bu er tert.butyl) i Ν,Ν-dimethylacetamid. Omdannelsen til (Thr-OBut)B30-h-In er 80%.
20 Eksempel 11
Den i eksempel 8 angivne fremgangsmåde gentages med det forbehold, at den anvendte ester er 2 M Thr-OBu1" i N,N- t B3 0 dimethylacetamid. Omdannelsen til (Thr-OBu ) -h-In er 30%. Eksempel 12 25 Den i eksempel 9 angivne fremgangsmåde gentages med det forbehold, at den anvendte ester er 2 M Thr-OBu*· i Ν,Ν-dimethylacetamid. Omdannelsen til (Thr-OBu*·) B3^-h-In er 70%.
_ 18 . 147437
Eksempel 13 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethyl-acetamid. Omsætningen udføres på analog måde som beskrevet i con 5 eksempel 4. Omdannelsen til (Thr-OMe) -h-In er 80%.
Eksempel 14 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethyl-acetamid. Blandingen behandles med immobiliseret trypsin på 10 analog måde som beskrevet i eksempel 8. Omdannelsen til (Thr-OMe)B30-h-In er 40%.
Eksempel 15 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i N,N-dimethyl-15 acetamid. Blandingen behandles med immobiliseret trypsin på analog måde som beskrevet i eksempel 9. Omdannelsen til
Dl n (Thr-OMe) -h-In er 70%.
Eksempel 16 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddi-20 kesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OBut i N,N-dimethyl- acetamid. Omsætningen udføres på analog måde som beskrevet i eksempel 4. Omdannelsen til (Thr-OBu*")B3^-h-In er 80%.
Eksempel 17 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddi-25 kesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OBu1* i N,N-dimethyl- acetamid. Blandingen behandles med trypsin, der er immobiliseret på glasperler, på analog måde som beskrevet i eksempel 8. Omdannelsen til (Thr-OBut)B3^-h-In er 40%.
_19- 147437
Eksempel 18 100 mg svineproinsulin opløses i 0,9 ml 3,33 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OBu1" i N,N-dimethyl-acetamid. Blandingen behandles med trypsin, der er immobili-5 seret til CNBr-aktiveret "Sephadex G-150", på analog måde som beskrevet i eksempel 9. Omdannelsen til (Thr-OBu*")B3^-h-In er 70%.
Eksempel 19 100 mg svineinsulin opløses i 0,5 ml 6 M eddikesyre, 10 og der tilsættes 1 ml 1 M Thr-OTmb (Tmb er 2,4,6-trimethyl- benzyl) i Ν,Ν-dimethylacetamid. Der tilsættes yderligere 0,5 ml Ν,Ν-dimethylacetamid og 5 mg TPCK-behandlet trypsin i 0,1 ml vand. Reaktionsblandingen opbevares ved 32°C i 44 timer.
Efter afslutning af omsætningen udfældes proteinerne ved 15 tilsætning af 10 rumfang acetone. Analyse ved DISC PAGE viser B30 o en omdannelse til (Thr-OTmb) -h-In på 50%.
Eksempel 20 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i dioxan. Omsætningen udfø-20 res på analog måde som beskrevet i eksempel 4, og omdannelsen til (Thr-OMe)03°-h-In er 10%.
Eksempel 21 100 mg svineinsulin opløses i 0,9 ml 3 M eddikesyre, og der tilsættes 1 ml 2 M Thr-OMe i acetonitril. Omsætningen 25 udføres på analog måde som beskrevet i eksempel 4, og omdan- R? Ω nelsen til (Thr-OMe) -h-In er 10%.
Eksempel 22 - 20 - 147437 B3 0 250 mg krystallinsk (Thr-OMe) -h-In, som er fremstillet som beskrevet i eksempel 1-9, 13 - 15, 20 eller 21, dispergeres i 25 ml vand og opløses ved tilsætning af 1 N 5 natriumhydroxydopløsning til en pH-værdi på 10,0. pH-værdien holdes konstant ved 10,0 i 24 timer ved 25°C. Det dannede humaninsulin krystalliseres ved tilsætning af 2 g natrium-chlorid, 350 mg natriumacetattrihydrat og 2,5 mg zinkacetat-dihydrat efterfulgt af tilsætning af 1 N saltsyre til opnå-10 else af en pH-værdi på 5,52. De romboedriske krystaller isoleres ved centrifugering efter opbevaring i 24 timer ved 4°C, vaskes med 3 ml vand, isoleres ved centrifugering og tørres i vakuum. Udbytte: 220 mg humaninsulin.
Eksempel 23 B3 0 15 100 mg (Thr-OTmb) -h-In, som er fremstillet som beskrevet i eksempel 19, opløses i 1 ml iskoldt trifluoreddi-kesyre, og opløsningen opbevares i 2 timer ved 0°C. Det dannede humaninsulin udfældes ved tilsætning af 10 ml tetrahy-drofuran og 0,97 ml 1,03 M saltsyre i tetrahydrofuran. Det 20 dannede bundfald isoleres ved centrifugering, vaskes med 10 ml tetrahydrofuran, isoleres ved centrifugering og tørres i vakuum. Bundfaldet opløses i 10 ml vand, og opløsningens pH-værdi indstilles på 2,5 med 1 N natriumhydroxydopløsning. Humaninsulinet udfældes ved tilsætning af 1,5 g natrium-25 chlorid og isoleres ved centrifugering. Bundfaldet opløses i 10 ml vand, og humaninsulinet udfældes ved tilsætning af 0,8 g natriumchlorid, 3,7 mg zinkacetatdihydrat og 0,14 g natriumacetattrihydrat efterfulgt af tilsætning af 1 N natriumhydroxydopløsning til opnåelse af en pH-værdi på 5,52. Bundfal-30 det isoleres ved centrifugering efter henstand i 24 timer ved 4°C, vaskes med 0,9 ml vand, isoleres ved centrifugering og tørres i vakuum. Udbytte: 90 mg humaninsulin.
Eksempel 24 - 21 - ί47437 100 mg svineinsulin opløses i 0,5 ml 10 M eddikesyre, og der tilsættes 1,3 ml 1,54 M Thr-OMe i N,N-dimethylaceta-mid. Blandingen afkøles til 12°C. Der tilsættes 10 mg trypsdn 5 opløst i 0,2 ml 0,05 M kalciumacetat. Efter 48 timer ved 12°C udfældes proteinerne ved tilsætning af 20 ml acetone. Omdan-
Don nelsen af svineinsulin til (Thr-OMe) -h-In er 97% ved HPLC. Eksempel 25
20 mg svineinsulin opløses i en blanding af 0,08 ml 10 10 M eddikesyre og 0,14 ml vand. Der tilsættes 0,2 ml 2 M
Thr-OMe i Ν,Ν-dimethylacetamid, og blandingen afkøles til -10°C. Der tilsættes 2 mg trypsin opløst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat. Efter 72 timer ved -10°C udfældes proteinerne ved tilsætning af 5 ml acetone. Omdannelsen af svineinsulin
Don 15 til (Thr-OMe) -h-In er 64% ved HPLC.
Eksempel 26 20 mg svineinsulin dispergeres i 0,1 ml vand. Ved tilsætning af 0,6 ml 2 M Thr-OMe i Ν,Ν-dimethylacetamid går insulinet i opløsning. Blandingen afkøles til 7°C. Der til-20 sættes 2 mg trypsin opløst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat.
Efter 24 timer ved 7°C udfældes proteinerne ved tilsætning af
Bog 5 ml acetone. Omdannelsen af svineinsulin til (Thr-OMe) h-In er 62% ved HPLC.
Eksempel 27 25 20 mg svineinsulin opløses i 0,135 ml 4,45 M propion- syre. Der tilsættes 0,24 ml 1,67 M Thr-OMe i Ν,Ν-dimethylacetamid. Der tilsættes 2 mg trypsin i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat, og blandingen opbevares ved 37°C i 24 timer. Prote- - 22 - 147437 inerne udfældes ved tilsætning af 10 rumfang 2-propanol. Om- B3 0 dannelsen af svineinsulin til (Thr-OMe) -h-In er 75% ved HPLC.
Eksempel 28 5 20 mg svineinsulin dispergeres i 0,1 ml vand. Der tilsættes 0,4 ml 2 M Thr-OMe i Ν,Ν-dimethylacetamid efterfulgt af 0,04 ml 10 N saltsyre, hvorved insulinet går i opløsning. Der tilsættes 2 mg trypsin opløst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat, og blandingen opbevares ved 37°C i 4 timer.
10 HPLC-anlyse viser en 46%'s omdannelse af svineinsulin til (Thr-OMe)B30-h-In.
Eksempel 29 20 mg svineinsulin opløses i 0,175 ml 0,57 M eddikesyre. Der tilsættes 0,2 ml 2 M Thr-OMe i Ν,Ν-dimethylacetamid 15 efterfulgt af tilsætning af 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat.
Der tilsættes 10 mg af et råt præparat af Achromobacter lyticus-protease, og blandingen opbevares i 22 timer ved 37°C. Proteinerne udfældes ved tilsætning af 10 rumfang ace- B3 η tone. Omdannelsen af svineinsulin til (Thr-OMe) -h-In er 20 12% ved HPLC.
Eksempel 30 20 mg svineinsulin dispergeres i 0,1 ml 0,5 M eddikesyre. Ved tilsætning af 0,2 ml 0,1 M Thr-OMe i Ν,Ν-dimethylacetamid opløses insulinet. Blandingen afkøles til 12°C, og 25 der tilsættes 2 mg trypsin i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat.
Efter 24 timer ved 12°C viser HPLC-analysen en 42%'s omdan- B3 0 nelse af svineinsulin til (Thr-OMe) -h-In.
.23 - 147437
Eksempel 31 2 mg kanininsulin opløses i 0,135 ml 4,45 M eddikesyre. Der tilsættes 0,24 ml 1,67 M Thr-OMe i N,N-dimethyl-acetamid efterfulgt af tilsætning af 1,25 mg trypsin i 0,025 5 ml 0,05 M kalciumacetat. Blandingen opbevares ved 37°C i 4 timer. Analyse ved HPLC viser en 88%'s omdannelse af kanin- B30 insulin til (Thr-OMe) -h-In. Kanininsulin eluerer før svineinsulin fra HPLC-kolonnen, idet forholdet mellem elue- B3 q ringsrumfanget for kanininsulin og (Thr-OMe) -h-In er 0,72.
10 Eksempel 32 B31 B32 2 mg svinediarginininsulin (Arg -Arg -insulin) opløses i 0,135 ml 4,45 M eddikesyre. Der tilsættes 0,24 ml 1,67 M Thr-OMe i Ν,Ν-dimethylacetamid efterfulgt af tilsætning af 1,25 mg trypsin i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat.
15 Blandingen opbevares ved 37°C i 4 timer. HPLC-analyse viser B3 π en 91%'s omdannelse af diarginininsulin til (Thr-OMe) -h-
In. Diarginininsulin eluerer før svineinsulin fra HPLC-kolon- nen, idet forholdet mellem elueringsrumfanget for diarginin- B3 0 insulin og (Thr-OMe) -h-In er 0,50.
20 Eksempel 33 2 mg "svinemellemprodukter" (dvs. blanding af desdi- peptid-(Lys0 -Arg J)proinsulin og desdipeptid-(Arg 32
Arg )proinsulin) omsættes på analog måde som beskrevet i eksempel 32. HPLC-analyse viser 88% (Thr-OMe)B^-h-In.
25 Eksempel 34 1 mg svineinsulin opløses i 0,1 ml 2 M eddikesyre.
Der tilsættes 0,2 ml 2 M Thr-OMe i Ν,Ν-dimethylacetamid, og blandingen afkøles til -18°C. Der tilsættes 2 mg trypsin op- - 24 - 147437 løst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat, og blandingen opbevares i 120 timer ved -18°C. HPLC-analyse viser, at omdannelsen til (Thr-OMe)B3°-h-In er 83%.
Eksempel 35 5 Den i eksempel 34 angivne fremgangsmåde gentages med det forbehold, at omsætningen udføres ved 50°C i 4 timer.
B30 HPLC-analyse viser, at omdannelsen til (Thr-OMe) -h-In er 23%.
Eksempel 36 10 20 mg svineinsulin opløses i 0,1 ml 3 M eddikesyre.
Der tilsættes 0,3 ml 0,33 M Thr-0(CH2)2-S02-CH3,CH3C00H (threonin-2-(methylsulfonyl)ethylesterhydroacetat) i N,N-dimethylacetamid. Blandingen afkøles til 12°C, og der tilsættes 2 mg trypsin i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat. HPLC viser 15 efter 24 timer ved 12°C en 77%'s omdannelse til (Thr- 0(CH_)--SO^-CH.,)B3^-h-In. Produktet eluerer omtrentligt ved ^ ^ ^ ^ B30 positionen for (Thr-OMe) -h-In.
Eksempel 37 20 mg svineinsulin opløses i 0,1 ml 10 M eddikesyre.
20 Der tilsættes 0,2 ml 2 M Thr-OEt (Et er ethyl) i N,N-
dimethylacetamid, og blandingen afkøles til 12°C. Der tilsættes 2 mg trypsin i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat. HPLC
viser efter 24 timer ved 12°C en 75%'s omdannelse til (Thr-Ή3 0 OEt) -h-In. Produktet eluerer i en position lige efter 25 (Thr-OMe)B30-h-In.
Eksempel 38 20 mg svineinsulin opløses i 0,1 ml 6 M eddikesyre.
Der tilsættes 0,3 ml 0,67 M Thr (Bufc)-OBu*1 i N,N-dimethyl-acetamid. Blandingen afkøles til 12°C, og der tilsættes 2 mg 147437 “ 25 - trypsin i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat. Efter 24 timer ved 12°C er omdannelsen til (Thr(Bu^)-OBu*")B3^-h-In 77%. Produktet elueres fra HPLC-kolonnen under anvendelse af en gradient i acetonitril fra 27% til 40%.
5 Eksempel 39 20 mg svineinsulin opløses i 0,1 ml 4 M eddikesyre.
Der tilsættes 0,2 ml 1,5 M Thr-OMe opløst i tetrahydrofuran, og blandingen afkøles til 12°C. Der tilsættes 2 mg trypsin opløst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat. Efter 4 timer ved 10 12°C viser HPLC-analyse en omdannelse til (Thr-OMe)B3^-h-In på 75%.
Eksempel 40 20 mg svineinsulin opløses i 0,1 ml 4 M eddikesyre.
Der tilsættes 0,8 ml 2 M Thr-OMe opløst i 1,2-ethandiol, og 15 blandingen afkøles til 12°C. Der tilsættes 2 mg trypsin opløst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat. Efter 4 timer ved 12°C
B3 0 viser HPLC-analyse en omdannelse til (Thr-OMe) -h-In på 48%.
Eksempel 41 20 20 mg svineinsulin opløses i 0,1 ml 4 M eddikesyre.
Der tilsættes 0,2 ml 2 M Thr-OMe opløst i ethanol, og blandingen afkøles til 12°C. Der tilsættes 2 mg trypsin opløst i 0,025 ml 0,05 M kalciumacetat, og omsætningen udføres i 4 timer ved 12°C. HPLC-analyse viser en 46%'s omdannelse til 25 (Thr-OMe)B30-h-In.
Claims (8)
1 B29 20 bundet med substituenten betegnet R , og Lys er forbundet 2 2 med substituenten betegnet R , R betegner en aminosyre eller en peptidkæde indeholdende højst 36 aminosyrer, og R1 betegner hydrogen eller en gruppe med den almene formel 3 3 R -X-, hvor X betegner arginin eller lysin, og R betegner . . 2 25 en peptidkæde indeholdende højst 35 aminosyrer, eller R 3 sammen med R betegner en peptidkæde indeholdende højst 35 aminosyrer, med det forbehold, at antallet af aminosyrer, . 1 2 som er til stede i R og R , er mindre end 37, eller et salt eller kompleks deraf, som kan omdannes dertil, transpeptide-30 res med en L-threoninester med den almene formel II - 27 - 147437 Thr(R5)-OR4 (II) 4 5 hvor R betegner en carboxylbeskyttelsesgruppe, og R betegner hydrogen eller en hydroxylbeskyttelsesgruppe, eller et salt deraf i en blanding af vand, et vandblandbart, orga-5 nisk opløsningsmiddel og trypsin, hvorhos indholdet af vand i reaktionsblandingen er under 50% (rumfang/rumfang), og reaktionstemperaturen er under 50°C, og der eventuelt er en B30 syre til stede, hvorefter den resulterende threonin ester af humaninsulin om ønsket spaltes.
1. Fremgangsmåde til fremstilling af humaninsulin B30 eller threonin estere af humaninsulin eller et salt eller 10 kompleks deraf, kendetegnet ved, at en insulinforbindelse med den almene formel I og forskellig fra humaninsulin eller flere forbindelser med den almene formel I R1-(1---A---21) I I n (I) 15 (1---B---29)-R hvor -(1---A---21) I I (1---B---29)- betegner human-des(ThrB30)insulindelen, hvori GlyA1 er for-
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at koncentrationen af L-threoninester i reaktionsblandingen overstiger 0,1 molær, og at reaktionsblandingen indeholder fra 0 til 10 ækvivalenter af en syre pr. ækvivalent L-threoninester .
3. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegent ved, at insulinforbindelsen er af svineoprindelse.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der som insulinforbindelse anvendes relativt råt insulin.
5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at reaktionstemperaturen er under 37°C, fortrinsvis under stuetemperatur, og over 0°C.
6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de 25 foregående krav, kendetegnet ved, at indholdet af vand i reaktionsblandingen er mellem 43 og 10% (rumfang/rumfang).
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at indholdet af vand i reaktionsblandingen er mellem 43 og 20% (rumfang/rumfang).
8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at insulinforbindelsen er svineinsulin, at L-threoninesteren er Thr-OMe eller Thr-OBu*", at det vandblandbare, organiske opløsningsmiddel er Ν,Ν-dimethylformamid eller Ν,Ν-dimethylacetamid, at reak- 35 tionstemperaturen er ca. 37°C, at indholdet af vand i reaktionsblandingen er mellem 41 og 43%, at vægtforholdet mellem
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK54081A DK147437C (da) | 1980-02-11 | 1981-02-09 | Fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin eller threoninb30estere af humaninsulin eller et salt eller kompleks deraf |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK57480 | 1980-02-11 | ||
| DK57480A DK147109C (da) | 1980-02-11 | 1980-02-11 | Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere eller et salt eller kompleks deraf |
| DK54081 | 1981-02-09 | ||
| DK54081A DK147437C (da) | 1980-02-11 | 1981-02-09 | Fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin eller threoninb30estere af humaninsulin eller et salt eller kompleks deraf |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK54081A DK54081A (da) | 1981-08-12 |
| DK147437B true DK147437B (da) | 1984-08-06 |
| DK147437C DK147437C (da) | 1986-12-08 |
Family
ID=8095095
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK147437D DK147437A (en) | 1980-02-11 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DK57480A DK147109C (da) | 1980-02-11 | 1980-02-11 | Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere eller et salt eller kompleks deraf |
| DK54081A DK147437C (da) | 1980-02-11 | 1981-02-09 | Fremgangsmaade til fremstilling af humaninsulin eller threoninb30estere af humaninsulin eller et salt eller kompleks deraf |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK147437D DK147437A (en) | 1980-02-11 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DK57480A DK147109C (da) | 1980-02-11 | 1980-02-11 | Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller humane insulinestere eller et salt eller kompleks deraf |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS56135452A (da) |
| AR (1) | AR231277A1 (da) |
| AU (1) | AU541528B2 (da) |
| BE (1) | BE887480A (da) |
| CA (1) | CA1162868A (da) |
| CH (1) | CH655949A5 (da) |
| DE (1) | DE3104949C2 (da) |
| DK (3) | DK147109C (da) |
| ES (1) | ES8205858A1 (da) |
| FI (1) | FI77876C (da) |
| GB (1) | GB2069502B (da) |
| GR (1) | GR73844B (da) |
| IT (1) | IT1195038B (da) |
| NL (1) | NL178797C (da) |
| NO (1) | NO156247C (da) |
| NZ (1) | NZ196224A (da) |
| PT (1) | PT72485B (da) |
| SE (2) | SE451143B (da) |
| ZA (1) | ZA81898B (da) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986005496A1 (en) * | 1985-03-15 | 1986-09-25 | Nordisk Gentofte A/S | Novel insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK147437A (en) | 1980-02-11 | 1900-01-01 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
| EP0088117B1 (en) * | 1981-09-15 | 1986-09-24 | Nordisk Insulinlaboratorium | Process for preparing human insulin or b-30 esters thereof |
| DK149824C (da) * | 1982-01-22 | 1987-03-16 | Carlsberg Biotechnology Ltd | Fremgangsmaade til enzymatisk udskiftning af b-30 aminosyrer i insuliner |
| WO1983002772A1 (en) * | 1982-02-08 | 1983-08-18 | Robin Ewart Offord | An improved method for preparing human insulin from non-human insulin |
| DE3209184A1 (de) * | 1982-03-13 | 1983-09-15 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen |
| NL8201650A (nl) * | 1982-04-21 | 1983-11-16 | Akzo Nv | Semisynthetische bereiding van humane insuline. |
| EP0092829B1 (en) * | 1982-04-23 | 1990-11-07 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Process for semi-synthesis of human insulin and alkaline protease for use therein |
| DK55183D0 (da) * | 1983-02-09 | 1983-02-09 | Nordisk Insulinlab | Fremgangsmade til fremstilling af human insulin |
| DE3334407A1 (de) * | 1983-09-23 | 1985-04-04 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | In position b 30 modifizierte insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| US5157021A (en) * | 1985-03-15 | 1992-10-20 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives |
| SE449472B (sv) * | 1985-10-15 | 1987-05-04 | Mth Gruppen Ab | Utrustning vid facklager |
| DE3880346T2 (de) * | 1987-02-25 | 1993-07-29 | Novonordisk As | Insulinderivate. |
| DK134189D0 (da) * | 1989-03-20 | 1989-03-20 | Nordisk Gentofte | Insulinforbindelser |
| FI96503C (fi) * | 1994-08-26 | 1996-07-10 | Hymatic Ltd Oy | Menetelmä ja laitteisto maston ohjaamiseksi |
| CA2553392A1 (en) | 2004-01-16 | 2005-08-11 | Biodel Inc | Sublingual drug delivery device |
| US20080090753A1 (en) | 2004-03-12 | 2008-04-17 | Biodel, Inc. | Rapid Acting Injectable Insulin Compositions |
| US8084420B2 (en) | 2005-09-29 | 2011-12-27 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
| US7713929B2 (en) | 2006-04-12 | 2010-05-11 | Biodel Inc. | Rapid acting and long acting insulin combination formulations |
| JP2009533471A (ja) | 2006-04-12 | 2009-09-17 | バイオデル， インコーポレイテッド | 即効型および長時間作用型組合せインスリン製剤 |
| US9060927B2 (en) | 2009-03-03 | 2015-06-23 | Biodel Inc. | Insulin formulations for rapid uptake |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO153061C (no) * | 1979-04-13 | 1986-01-08 | Shionogi & Co | Fremgangsmaate for fremstilling av et b30-threonininsulin |
| DK147437A (en) | 1980-02-11 | 1900-01-01 | Process for preparing human insulin or threonine B30 esters of human insulin, or a salt or complex thereof | |
| DE3101382A1 (de) * | 1981-01-17 | 1982-09-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von humanisulin oder dessen derivaten aus schweineinsulin oder dessen derivaten" |
-
0
- DK DK147437D patent/DK147437A/da unknown
-
1980
- 1980-02-11 DK DK57480A patent/DK147109C/da not_active IP Right Cessation
-
1981
- 1981-02-09 ES ES499238A patent/ES8205858A1/es not_active Expired
- 1981-02-09 DK DK54081A patent/DK147437C/da not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 AR AR284258A patent/AR231277A1/es active
- 1981-02-10 FI FI810385A patent/FI77876C/fi not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 NO NO810443A patent/NO156247C/no unknown
- 1981-02-10 CA CA000370483A patent/CA1162868A/en not_active Expired
- 1981-02-10 SE SE8100928A patent/SE451143B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 IT IT19620/81A patent/IT1195038B/it active
- 1981-02-10 SE SE8100926A patent/SE427025B/sv not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 PT PT72485A patent/PT72485B/pt not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 NZ NZ196224A patent/NZ196224A/en unknown
- 1981-02-10 NL NLAANVRAGE8100624,A patent/NL178797C/xx not_active IP Right Cessation
- 1981-02-10 GB GB8104114A patent/GB2069502B/en not_active Expired
- 1981-02-10 JP JP1758081A patent/JPS56135452A/ja active Granted
- 1981-02-11 ZA ZA00810898A patent/ZA81898B/xx unknown
- 1981-02-11 CH CH910/81A patent/CH655949A5/de not_active IP Right Cessation
- 1981-02-11 AU AU67180/81A patent/AU541528B2/en not_active Ceased
- 1981-02-11 BE BE6/47396A patent/BE887480A/fr not_active IP Right Cessation
- 1981-02-11 DE DE3104949A patent/DE3104949C2/de not_active Expired
- 1981-02-11 GR GR64097A patent/GR73844B/el unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986005496A1 (en) * | 1985-03-15 | 1986-09-25 | Nordisk Gentofte A/S | Novel insulin derivatives and pharmaceutical preparations containing these derivatives |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI77876B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin eller en treoninb30-ester av humaninsulin eller ett salt eller komplex daerav. | |
| IE50892B1 (en) | Process for preparing insulin esters | |
| US7790677B2 (en) | Insulin production methods and pro-insulin constructs | |
| KR100574580B1 (ko) | 정확하게 결합된 시스틴 브릿지를 갖는 인슐린 또는 인슐린유도체를 수득하는 방법 | |
| FI79860B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin des-pheb1-humaninsulin eller derivat daerav ur svininsulin, des-pheb1-svininsulin eller derivat daerav. | |
| RU2376379C2 (ru) | Способ получения инсулиновых соединений | |
| Svendsen et al. | Isolation and characterization of the folate-binding protein from cow's milk | |
| JPH02131594A (ja) | デ‐ｂ３０‐インシュリンおよびデ‐ｂ３０‐インシュリン誘導体の製造方法 | |
| FI79853C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. | |
| NO153061B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et b30-threonininsulin | |
| CA1195273A (en) | Process for converting preproinsulin analogs into insulin | |
| WO2012115638A1 (en) | Glargine proinsulin compositions and methods of producing glargine insulin analogs therefrom | |
| EP0037255B1 (en) | Process for producing an insulin precursor | |
| DK149457B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af humant insulin eller b30-estere deraf | |
| US20160024168A1 (en) | Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs | |
| EP0087238A1 (en) | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin | |
| WO2012115637A1 (en) | Aspart proinsulin compositions and methods of producing aspart insulin analogs | |
| NO163531B (no) | Beskyttet b30-thr(r1)(r2)-insulin egnet for fremstilling av et b30-threonininsulin. | |
| LU83197A1 (de) | Verfahren zur herstellung von threonin b30-estern menschlichen insulins sowie threonin b30-ester menschlichen insulins | |
| WO2012115641A1 (en) | Lis-pro proinsulin compositions and methods of producing lis-pro insulin analogs therefrom |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |