DK160251B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af substituerede anthra(1,9-cd)pyrazol-6(2h)-oner - Google Patents

Description

i

DK 160251 B

• Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte substituerede anthra-[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-oner med den i krav 1 anførte almene formel I eller farmaceutisk acceptable salte 5 heraf, hvilke forbindelser udviser antibiotisk og antifungal virkning, antileukæmisk virkning og antitumorvirkning.

Adskillige 2,5- og 2,7-disubstituerede anthra-[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-oner er beskrevet i den tilgænge-10 lige litteratur. Se f.eks. J. Chem. Soc., 1630 (1952), og J. Chem. Soc., 1894 (1954). I disse og flere andre referencer er der ikke beskrevet noget nyttig anvendelighed for disse forbindelser, medens der i CH-patent-skrift nr. 191.142, GB-patentskrift nr. 470.475 og US-15 patentskrift nr. 2.518.150 kun er beskrevet anvendelighed som farvestoffer eller udgangsforbindelser herfor.

De omhandlede hidtil ukendte forbindelser har den almene formel I

N-N-Z

20 NRY 0 25 hvori R betegner H eller alkyl med fra 1 til 6 carbon-atomer* Y betegner H, alkyl med fra 1 til 6 carbonatomer , der kan være substitueret med en gruppe OR^, 30 hvori R^ betegner H eller alkyl med fra 1 til 6 carbon-atomer, eller ANR2R3» hvori A er alkylen med fra 2 til 8 carbonatomer, og R2 og R3 kan være ens eller forskellige og hver betegner H, alkyl med fra 1 til 6 carbonatomer, der kan være substitueret med OH eller en gruppe 35 NRaRa, hvori Ra'erne kan være ens eller forskellige og hver betegner H eller alkyl med fra 1 til 3 carbonatomer, der kan være substitueret med OH, eller R2 og R^ tilsammen kan være ethylen eller kan danne 2

DK 160251 B

-(CH2)n -(CH2)m^ hvori n og m kan være ens eller forskellige og er én, 5 to eller tre, forudsat at summen af n og m er et helt tal fra tre til seks, og B er en direkte binding, O, S eller N-R^, hvori R^ betegner H eller alkyl med fra 1 til 6 carbonatomer; R og Y tilsammen kan være ethylen eller kan danne 10 -(CH,)n

S

-(CH2 )111^ hvori n, m og B har de ovennævnte betydninger; Z betegner H, alkyl med fra 1 til 6 carbonatomer, der kan være 15 substitueret med en gruppe N(R1)2, SR^ eller OR^, hvori R^1 erne kan være ens eller forskellige og har den ovennævnte betydning, eller DNR2R3, hvori D er alkylen med fra 2 til 8 carbonatomer, der kan være substitueret med en OH-gruppe, og R2 og R^ har de ovennævnte betydninger; 20 med følgende forbehold, 1) når Z er H, danner R og Y tilsammen ikke en piperidinring, og 2) når Z er CH^, danner R og Y tilsammen ikke en piperidinring eller en morpholinring, eller er farmaceutisk acceptable salte heraf.

25 Som eksempler på de omhandlede forbindelser med formlen I kan der nævnes: 2-[2-(diethylamino)ethyl]-7-[[2-[(2-hydroxyethyl)amino]-ethyl]amino]anthra[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-on, 2-[2-(diethylamino)ethyl-7-[[2-(diethylamino)ethyl]-30 amino]anthra[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-on, 2-[2-[(2-hydroxyethyl)amino]ethylJ-7-[[2-[(2-hydroxyethyl) amino]ethyl]amino]anthra[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-on, og de farmaceutisk acceptable salte heraf.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendomme-35 lig ved, at man omsætter en forbindelse med den almene formel II

3

DK 160251 B

N-N-Z

006 5 Cl o med en amin med formlen HNRY, i hvilke formler Y, Z og R har de ovennævnte betydninger.

Som eksempler på udgangsforbindelserne med form-10 len II kan der nævnes: 7-chlor-2-[2-(diethylamino)ethyl]anthra[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-on, 7-chlor-2-[2-[(2-hydroxyethyl) amino]ethyl]anthra[1,9-cd]-pyrazol-6(2H)-on 15 og de farmaceutisk acceptable salte heraf.

Udgangsforbindelserne med formlen II kan fremstilles ved omsætning af en passende substitueret hydrazin, NI^NHZ, hvori Z har den ovennævnte betydning, med Γ,5-dichlor-9,10-anthracendion. Denne omsætning kan ud-20 føres i et vilkårligt af flere forskellige reaktionsindifferente opløsningsmidler ved blanding af tilnærmelsesvis ækvimolære mængder af 1,5-dichlor-9,1O-anthracen-dion og det ønskede hydrazin i det valgte opløsningsmiddel ved forhøjet temperatur. Ved anvendelse af en kata-25 lysator, såsem kaliumfluorid, eller et ringe molært overskud af hydrazinreaktanten kan man forbedre et bestemt udbytte. Eksempler på egnede opløsningsmidler er Ν,Ν-dimethylformamid, dimethylsulf-oxid, pyridin, acetonitril, cellosolverne og lignende.

Pyridin er det foretrukne opløsningsmiddel, og passende 30 reaktionstemperaturer ligger fra ca. 30 til 85°C. Almindeligvis lader man reaktionen forløbe i ca. 6 til ca. 24 timer, efter hvilket tidsrum reaktionen er i det væsentlige fuldendt. Fuldendelsen af en bestemt reaktion kan måles ved kendte metoder, som f.eks. tyndtlagschroma-35 tografi. Man vil almindeligvis observere, at stigende reaktionstemperatur vil formindske den til fuldendelse af reaktionen nødvendige tid. Det rette valg af reak-tionsvariablerne er et fagmandsspørgsmål. Reaktions- 4

DK 160251 B

produkterne isoleres og renses ved sædvanlige procedurer. F.eks. kan reaktionsblandingen koncentreres ved afdampning af opløsningsmidlet, og remanensen kan fordeles mellem vand og et passende, med vand ikke bland-5 bart organisk opløsningsmiddel, såsom chloroform, benzen, dichlormethan og lignende. Opløsningsmidlet j kan derefter afdampes, og remanensen kan chromatografe-res, f.eks. på silicagel. Valget af det rette chromato-graferingsopløsningsmiddel er et fagmandsspørgsmål.

10 Efter chromatografering kan produktet om ønsket omkrystalliseres. Syreadditionssalte kan også fremstilles ved sædvanlige fremgangsmåder. F.eks. kan et hydrochlorid-salt fremstilles ved opløsning af den frie base i et passende opløsningsmiddel, såsom 2-propanol, og behand-15 ling af denne opløsning med en opløsning af hydrogen-chlorid i 2-propanol. Syreadditionssaltene kan igen omdannes til den pågældende frie base ved behandling med en fortyndet opløsning af f.eks. natriumhydroxid eller kaliumcarbonat.

20 Omsætningen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udføres i et vilkårligt af flere forskellige reaktionsindifferente opløsningsmidler ved blanding af tilnærmelsesvis ækvimolære mængder af forbindelse II og den ønskede amin i det valgte opløsningsmiddel ved forhøjet temperatur. Ved anvendel-25 se af et ringe molært overskud af aminreaktanten, en indifferent atmosfære og en katalysator, såsom vandfrit cuprochlorid, kan man forbedre et bestemt udbytte. Anvendelsen af disse variationer til en bestemt reaktion er valgfri og er et fagmandsspørgsmål. Eksempler på 30 egnede opløsningsmidler er N,N"-dimethylformamid, di-methylsulfoxid, pyridin, acetonitril, cellosolverne og lignende. Passende reaktionstemperaturer ligger fra ca. 85 til 130°C. Man har observeret, at denne reaktion forløber særlig effektivt i tilbagesvalende pyridin.

35 Almindeligvis lader man reaktionen forløbe i ca. 6 til ca. 24 timer, efter hvilket tidsrum den er i det væsentlige fuldendt. Fuldendelsen af en bestemt reaktion kan måles ved kendte metoder, som f.eks. tyndtlags- 5

DK 160251 B

chromatografi. Man vil almindeligvis observere, at stigende reaktionstemperatur vil nedsætte den til fuldendelse af reaktionen nødvendige tid. Det rette valg af reaktionsvariablene er et fagmandsspørgsmål.

5 Reaktionsprodukterne isoleres og renses ved sædvanlige procedurer, som er i det væsentlige de samme som de for forbindelse II ovenfor beskrevne. Ligeledes kan der fremstilles syreadditionssalte af forbindelse I ved sædvanlige fremgangsmåder, såsom den ovenfor for 10 forbindelse II beskrevne.

Som det ved fremstilling af udgangsforbindelserne II benyttede hydrazin NH?NHZ kan der bl.a. anvendes det hidtil ukendte hydrazin, 2-[(hydrazinoethyl)amino]etha-nol, N^NHCE^Cf^NHCi^C^OH. Dette hidtil ukendte hydrazin T5 kan fremstilles ved flere forskellige fremgangsmåder, der anses for ækvivalente for så vidt angår opfindelsen.

Én sådan fremgangsmåde indebærer omsætning af hydrazin og N-(2-hydroxyethyl)aziridin i et vandigt medium ved tilbagesvalingstemperatur. Det således fremstillede 20 hidtil ukendte 2-[(hydrazinoethyl)amino]ethanol isoleres ved sædvanlige metoder som en klar væske, der har kp. 120°C ved 0,035 mmHg. Det hidtil ukendte 2-[(hydrazinoethyl ) amino]ethanol danner syreadditionssalte med organiske og uorganiske syrer, såsom saltsyre, hydro-25 genbromidsyre, sulfonsyre, phosphonsyre, methansulfon-syre, eddikesyre, benzoesyre og lignende. For såvidt angår opfindelsen anses sådanne salte for ækvivalente med den frie baseform af det hidtil ukendte hydrazin.

Forbindelsen 1,5-dichlor-9,1O-anthracendion, der anvendes til fremstilling af udgangsforbindelserne II, kan fås i handelen eller kan fremstilles ved kendte fremgangsmåder, se f.eks. Beilstein 1_, 787.

6

DK 160251 B

De omhandlede forbindelser danner farmaceutisk acceptable salte med både organiske og uorganiske syrer. Eksempler på egnede syrer til saltdannelse er saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre, eddikesyre,

5 citronsyre, oxalsyre, malonsyre, salicylsyre, æblesyre, fumarsyre, ravsyre, ascorbinsyre, maleinsyre, methan-sulfonsyre, isethionsyre, mælkesyre, gluconsyre, glucu-ronsyre, sulfaminsyre, benzoesyre, vinsyre, pamoesyre J

og lignende. Saltene fremstilles ved at bringe den 10 frie baseform i kontakt med en ækvivalent mængde af den ønskede syre på konventionel måde. Den frie baseform kan gendannes ved behandling af saltformen med en base.

F.eks. kan der benyttes fortyndede vandige baseopløsninger. Fortyndede vandige natriumhydroxid-, kaliumcarbo-15 nat-, ammoniak- og natriumhydrogencarbonatopløsninger er egnede til dette formål. De frie baseformer adskiller sig i nogen grad fra deres respektive saltformer med hensyn til visse fysiske egenskaber, såsom opløselighed i polære opløsningsmidler, men saltene er i øvrigt æk-20 vivalente med deres respektive frie baseformer for såvidt angår opfindelsen.

De omhandlede forbindelser kan eksistere i såvel ikke-solvatiserede som solvatiserede former, herunder hydratiserede former. Almindeligvis er de solvatiserede 25 former med farmaceutisk acceptable opløsningsmidler, såsom vand, ethanol og lignende, ækvivalente med de ikke-solvatiserede former for såvidt angår opfindelsen.

Udtrykket halogen skal omfatte fluor, chlor, brom og iod.

30 De ved opfindelsen i betragtning kommende alkyl- og alkoxygrupper omfatter, med mindre andet er angivet, både lige og forgrenede car bo nkæder med fra 1 til 6 carbonatomer. Typiske eksempler på sådanne grup-35 per er methyl, ethyl, isopropyl, butyl, pentyl, 3-me-thylpentyl, methoxy, ethoxy, i-propoxy, t-butoxy, 7

DK 160251 B

n-hexoxy, 3-methylpentoxy og lignende.

De ved opfindelsen i betragtning kommende alkylen-grupper omfatter, med mindre andet er angivet, både lige og forgrenede carbonkæder med fra 2 til 8 _ 5 carbonatomer. Typiske eksempler på sådanne grupper er ethylen, n-propylen, n-butylen, n-heptalen, i-isopro-pylen, 3-ethyl-l,5-pentalen, 3-propyl-l,6-hexalen og lignende. De ifølge opfindelsen foretrukne alkylen-grupper har følgende strukturformler: 1 o ch3 ch3 ch3 ch3 c2h5 -(CH2)“2-li; “CH-CH2-; -CH2-CH-; -CH—CH-; -CH-CH2~; c2h5 ch3 ch3 ch3 -CH2-CH-; -CH-CH2-CH2-; -CH2-CH-CH2-; -CH2-CH2-CH- 15

Visse ved opfindelsen i betragtning kommende substituenter, såsom alkyl- eller alkylensubstituenter, er defineret som eventuelt substitueret med yderligere substituenter, f.eks. NE^. Det er klart for fagmanden, 20 at visse kombinationer af sådanne substituenter mest sandsynligt er ustabile, og disse skal ikke medregnes indenfor definitionernes rammer. F.eks. kan en a-amino-alkyl- eller-alkylengruppe med den almene formel =N-CH-NH2 ikke forventes at være stabil, medens den til-25 svarende dialkylerede substituent =N-CH-N(Alk)^ må forventes at være stabil og skal betragtes som omfattet af definitionerne. Det er et fagmandsspørgsmål at erkende disse og andre sådanne substituenter, der muligvis er ustabile.

De omhandlede forbindelser er hidtil ukendte kemiske stoffer af værdi som farmakologiske midler til behandling af bakterielle og fungale infektioner hos varmblodede dyr og mennesker. De kan også anvendes som antiseptiske midler, såsom til anvendelse ved 8

DK 160251 B

sterilisering af laboratorieglasudstyr osv.

Sammenfattende kan det anføres, at de omhandlede forbindelser med formlen I finder anvendelse til behandling af mikrobielle infektioner hos mammalia-individer, 5 til behandling af leukæmi hos mammalia-individer og til behandling af faste tumorer hos mammalia-individer, idet man administrerer en tilstrækkelig mængde af en forbindelse med formlen I eller et farmaceutisk acceptabelt salt heraf i kombination med en farmaceutisk acceptabel 10 bærer til et mammalia-individ, der har behov herfor.

Den antibakterielle og antifungale virkning af repræsentative forbindelser blandt de omhandlede blev fastslået ved den nedenfor beskrevne screeningsprocedure.

15 1. Fremstilling af podematerialer (A) Bakterier og'gær:

Bakterie- og gæsisolater holdes i vækst i agar-skråkulturer eller i flydende medier, herefter betegnet som podestofmedier. Kulturerne overføres 20 med regelmæssige mellemrum til sådanne medier.

(Se tabellen hvad angår de tilsvarende podestof-medier for hver kultur). Organismerne overføres almindeligvis til agar-skråkulturer eller flydende podestofmedier og inkuberes natten over (18 til 20 25 timer): 37°C for bakterieisolaterne og 28°C for de fungale kulturer.

Mikrobecellerne fra de natten over inkuberede agar-skråkulturer skrabes derefter af og suspenderes i saltopløsning (0,85% NaCl). Mikrobekoncen-trationerne indstilles til en lystransmission på 20-35%, Junior Coleman Spectrophotometer (555 Μ).

For organismerne, der holdes i vækst i flydende medier, fortynder man simpelthen en delmængde af kultursuspensionen med saltopløsning til en lys-trasmission på 20-35%.

Den ovennævnte mikrobesuspension tjener som podestof for prøvepladerne. Der anvendes således 0,16 til 10 ml (se tabellen hvad angår den nøjagtige 9

DK 160251 B

mængde) til podning af 100 ml af smeltet-agar-prøvemediet.

(B) Mycelie-fungi:

Penicillium avellaneum dyrkes i 6 dage ved 5 28°C på et agarmedium. Dette sker for at muliggøre sporedannelse hos kulturen. Organismen høstes derefter ved, at man skraber cellerne af agaroverfladen (mycelier og sporer) og suspenderer dem i saltopløsning indeholdende 0,05% Tween ® 80.

10 Suspensionen indstilles til en lystransmission på 20%. 1 ml af denne suspension anvendes til podning af 100 ml af smeltet-agar-prøvemediet.

2. Fremstilling af prøveplader.

Rustfri stålrammer, 12,3 x 25,3 cm (indre 15 mål), og glasplader, 15,3 x 31,7 cm, anvendes til at fremstille prøvebakkerne. Rammerne fastgøres til pladerne ved hjælp af klæbebånd ved hver ende, og de indre kanter tætnes med 2% agar. Man fordeler 25 ml podet prøvemedium jævnt på hver bakke og lader 20 det størkne. Man tildækker bakkerne, vender bunden i vejret på dem og nedkøler dem, indtil de skal anvendes.

3. Anbringelse af papirskiver med prøvestoffer.

De forbindelser eller prøvestoffer, der skal afprøves, opløses i passende opløsningsmidler, f.eks.

25 alkoholer, dimethylsulfoxid eller Ν,Ν-dimethylformamid. Prøvestofferne opløses almindeligvis således, ft at slutkoncentrationen af opløsningsmidlet er <10%. Forbindelserne afprøves ved forskellige koncentrationer: 3000, 1000, 500, 100 og 10 yg/ml. Papirskiver 30 (12,7 mm i diameter) anbringes på agarbakkerne med en pincet, og derefter afpipetteres der 0,08 ml af den opløste forbindelse på hver skive under anvendelse af en 0,2 ml pipette. (* Hvis forbindelsen ikke forbliver i opløsning ved <10% alkohol, anvendes 35 der alkohol af fuld styrke. Dog lufttørres de imprægnerede skiver, før de lægges på de podede agar-plader) .

10

DK 160251 B

4. Fortolkning af resultaterne.

Agarbakkerne med de derpå anbragte papirskiver inkuberes natten over (18 til 20 timer) ved 37°C for bakteriekulturerne og 28°C for gærsvampene.

5 Bakken med Penicillium avellaneum inkuberes i mindst 20 til 24 timer, da det er en langsommere voksende organisme. Aktive forbindelser viser en hæmningszone omkring skiven. Diameteren af zonen måles i j mm. Zonediameteren for aktive forbindelser ligger j 10 i området fra et minimum på 13,5 mm til så meget som 60 mm. Størrelsen af zonediameteren er almindeligvis et udtryk for aktiviteten af forbindelsen: jo større zonen er, desto større er aktiviteten.

^ ^ Tabel I I lpodestof-1 Prøve-

Kultur iNummer I Podestofmedium I mængde I medium _I_I___|ml/i00 ml_ I I Kalveinfusions- . ,

Aerobacter I 0126 \ broth I 1 iMycin-Agar

20 aerogenes II I I

Escherichia J04863 lAM-08 Agar I 1 |AM-08

coll II I I

_I I_I_I_

Bacillus 104555 lAM-08 Broth I 0,5 JAM-08

25 subtilis II II

-Ί-1--i-1--

Streptococcus 105045 |Folsyre-prøve- \ 2 IAM-09

faecal is \ 1 broth j I

30 Penicillium IM2988 lAH-25 Agar | 1 |AM-25

avellaneum II I I

5. Kulturmedier.

Sammensætningen af de forskellige kultur-35 medier, med undtagelse af de i handelen gående medier, er anført nedenfor. Det kommercielle færdiglavede kalveinfusionsmedium fås fra Difco Labora- 11

DK 160251 B

‘ tories, Detroit, Michigan, USA. Der tilsættes 1,5% agar til disse medier til anvendelse som agarplader.

AM-08 % 5 Glucose 0,2

Natriumglutamat 1,04 KH2P04 0,03

Na2HP04 0,07

Salte nr. la 1 ml 10 Salte nr. 2k 10 ml H20 (destilleret) aSalte nr. 1 % bSalte nr. 2 %

MgS04 1,0 MnS04 1,0 15 CaCl2 5,0 ZnSC>4.7H20 1,0

NaCl 5,0 FeS04.7H20 1,0

CuS04.5H20 0,01 HjO (destilleret) H20 (destilleret) 20 AM-09 K2HP04 3,9 g

Dextrose 25 g

Na-citrat *2 H20 34,4 g

Casein-hydrolysat 6,2 g 25 Asparagin 375 mg L-tryptophan 125 mg

Cystein 312,5 mg

Glutathion 3,1 rag

Thiamin-HCl 250 g 30 Riboflavin 625 g

Ca-pantothenat 500 g

Nicotinsyre 500 g p-aminobenzoesyre 625 g

Biotin 12,5 g 35 pyridoxin-HCl 2,5 g

Folsyre 500 g

NaCl 12,5 g

MgS04 250 g 12

DK 160251 B

FeS04 12,5 g

MnS04-H20 125 g

Tween ©80 62,5 mg H20 (destilleret) 1000 ml 5 AM-25 %

Na2HP04.H20 0,35 KH2P04 0,05 Gærekstrakt (Difco) 0,5 10 Dextrose lf0

Destilleret vand

Foruden deres nyttige anvendelighed som antibiotiske og antifungale midler udviser visse af de 15 omhandlede forbindelser antileukæmisk virkning in vivo, når de afprøves ved følgende procedure.

In-vivo-lymfocytisk-leukæmi P388 prøven udføres af United States National Cancer Institute. De anvendte dyr er enten hanlige eller hunlige CD2F^ mus. Der. an-20 vendes seks til syv dyr pr. prøvegruppe. Tumortransplantat ionen sker ved intraperitoneal injektion af fortyndet ascitesvæske, som indeholder celler af lym-focytisk leukæmi P388. Prøveforbindelserne administreres intraperitonealt i to enkeltdoser med fire dages mellemrum 25 mellem doser ved forskellige dosisniveauer efter tumorindpodningen. Dyrene vejes, og antallet af overlevende dyr registreres på et regelmæssigt basis i 30 dage.

Der beregnes et overlevelsestidsforhold for behandlede (T)/kontrol (C) dyr. Kriteriet for effektivitet er, 30 at T/C X 100 > 125%. Den positive kontrolforbindelse ved denne prøve er l,4-dihydroxy-5,8-[bis[[2-[(2-hy-droxyethyl)amino]-ethyl]amino]-9,10-anthracendion, der indgives i doser i området fra 12,0 til 0,075 mg/kg.

Se Cancer Chemotherapy Reports, Part 3, 3^, 1 (1972) med 35 hensyn til en omfattende redegørelse for protokollen.

Foruden deres nyttige anvendelighed som antibiotiske og antifungale midler og som antileukæmiske midler udviser visse af de omhandlede forbindelser 13

DK 160251 B

in-vitro-virkning mod faste tumorer, når de afprøves ved følgende procedure.

HCT-8 (human colon-adenocarcinoma) celler tryp-siniseres under anvendelse af trypsin-EDTA. En enkelt-5 cellesuspension opnås ved at passere cellerne gennem 3 en 26 gauge nål med en 20 cm sprøjte. Der fremstilles en cellesuspension under anvendelse af RPMI 1640 vækstmedium (fås fra Gibco Laboratories) + 10% kalvefoster-serum + 50 yg/ml garamycin med en cellekoncentration 10 på ca. 30000 celler/ml. Cellesuspensionen dispenseres i Linbro-plader med 24 brønde, 1 ml/brønd. Pladerne inkuberes i ca. 48 timer ved 37°C i en 5% CC^-atmos-fære. På dette tidspunkt tilsættes prøveforbindelserne i den rette koncentration. 5 μΐ af 200 yg/ml stamop-15 løsningen sættes til hver brønd ved en primær prøve.

10 yl af den rette fortynding sættes til hver brønd til en titreringsprøve. Pladerne reinkuberes i yderligere 60 til 65 timer ved 37°C i en 5% COj-atmosfære.

Prøven aflæses ved lysering af cellerne under anven-20 delse af en blanding af kationisk overfladeaktivt middel, iseddike og natriumchlorid. 2 ml af den lyserede cellesuspension fra hver brønd sættes til 8 ml fortyndingsmiddel. Hver prøve aflæses med en Coulter-tæl-ler (ZBI model). Aktiviteten af hvert prøvestof måles 25 som en procentdel af kontrolværdierne, og dataene rapporteres som IDj.q, dvs. den molære mængde medikament, der kræves til dræbning af 50% af tumorcellerne.

Under anvendelse af denne procedure opnåedes der følgende resultater for repræsentative forbindel-30 ser blandt de omhandlede.

14

DK 160251 B

N-N-Z

NRY O

I I

Z | NRY I ID50 Molær _!_j_ 1 1 7 10 (CH2)2NEt2j NH(CH2)2NEt2 | 2,2x10“/

•2HC1 I I

1 1 p {CH2)2NEt2j NH[CH2)2NH(CH2)20H | 9,3 x 10“8 «2HC1 1 1 15 Når de omhandlede forbindelser anvendes som anti biotiske og antifungale midler, kan de tilberedes og administreres i mange forskellige topiske, orale og parenterale doseringsformer. Det vil være klart for fagmanden, at de følgende doseringsformer som den ak-20 tive komponent kan omfatte enten en forbindelse med formlen I eller et farmaceutisk acceptabelt salt af en sådan forbindelse eller en blanding af sådanne forbindelser pg/eller salte.

Til fremstilling af farmaceutiske præparater 25 ud fra de omhandlede forbindelser kan indifferente, farmaceutisk acceptable bærere være enten faste eller flydende. Af præparater i fast form kan der nævnes pulvere, tabletter, dispergerbare granulater, kapsler, cachetter og suppositorier. En fast bærer kan være 30 ét eller flere stoffer, der også kan virke som fortyndingsmidler, smagsstoffer, opløseliggørende midler, smøremidler, suspensionsmidler, bindemidler eller tab-letdesintegreringsmidler, og det kan også være et indkapslende materiale. I pulvere er bæreren et fin-35 delt fast stof, som foreligger i blanding med den findelte aktive forbindelse. I tabletten er den aktive forbindelse blandet med en bærer med de nødvendige bindende egenskaber i passende mængdeforhold og kompri 15

DK 160251 B

meret til den ønskede form og størrelse. Pulverne og tabletterne indeholder fortrinsvis fra 5 eller 10 til ca. 70% af den aktive bestanddel. Egnede faste bærere er magnesiumcarbonat, magnesiumstearat, talkum, sukker, 5 lactose, pectin, dextrin, stivelse, gelatine, traga-canth, methylcellulose, natriumcarboxymethylcellulose, en lavtsmeltende voks, kakaosmør og lignende. Udtrykket "præparat" skal indbefatte formuleringen af den aktive forbindelse med indkapslende materiale som bærer til 10 opnåelse af en kapsel, hvori den aktive komponent (med eller uden andre bærere) er omgivet af bæreren, som således optræder i tilknytning til den. På tilsvarende måde er cachetter indbefattet. Tabletter, pulvere, cachetter og kapsler kan anvendes som faste doserings-15 former, der er egnede til oral administrering.

Præparater i flydende form indbefatter opløsninger, suspensioner og emulsioner. Som eksempel kan der nævnes vandige eller vand-propylenglycol-opløsninger til parenteral injektion. Flydende præparater kan også 20 formuleres i opløsning i vandig polyethylenglycolop-løsning. Vandige opløsninger, der er egnede til oral anvendelse, kan fremstilles ved opløsning af den aktive komponent i vand og tilsætning af passende farvestoffer, smagsstoffer, stabiliseringsmidler og fortykkelses-25 midler, som det nu ønskes. Vandige suspensioner, der er egnede til oral anvendelse, kan fremstilles ved at dispergere den findelte aktive komponent i vand med et viskost materiale, dvs. naturlige eller syntetiske gummier, harpikser, methylcellulose, natriumcarboxy-30 methylcellulose og andre velkendte suspensionsmidler.

Af topiske præparater kan der nævnes pudrings-pulvere, cremer, lotioner, geler og sprays. Disse forskellige topiske præparater kan formuleres ved hjælp af velkendte metoder. Se f.eks. Remington's Pharma-35 ceutical Sciences, kapitel 43, 14. udgave 1970, Mack Publishing Co., Easton Pennsylvania 18042, USA.

Det farmaceutiske præparat er fortrinsvis i enhedsdosisform. I denne form underopdeles præparatet

DK 160251B

16 ' i enhedsdoser, der indeholder passende mængder af den aktive komponent. Enhedsdosisformen kan være et emballeret præparat, idet emballagen indeholder adskilte mængder præparat, f.eks. emballerede tabletter, 5 kapsler og pulvere i medicinglas eller ampuller. En-hedsdosisformen kan også være en kapsel, cachet eller tablet i sig selv, eller det kan være et passende antal af enhver af disse i emballeret form.

Mængden af aktiv forbindelse i en præparat-10 enhedsdosis kan varieres eller reguleres fra 50 mg til 500 mg alt efter den bestemte anvendelse og styrken af den aktive bestanddel.

Til terapeutisk anvendelse som antibiotiske og antifungale midler administreres de omhandlede for-15 bindeiser med formlen I i en begyndelsesdosis på ca.

0,1 mg til ca. 50 mg pr. kg. Et dosisområde fra ca. 0,5 mg til ca. 10 mg pr. kg foretrækkes. Doserne kan imidlertid varieres afhængigt af patientens behov, alvorligheden af den tilstand, der behandles, og den forbindelse, der anvendes. Besterrmelsen 20 af den rette dosis til en bestemt situation er et fagmandsspørgs-mål. Almindeligvis startes behandlingen med lavere doser, som er mindre end den optimale dosis af forbindelsen. Derefter forøges dosen i små spring, indtil man når den optimale virkning under de pågældende 25 omstændigheder. Af bekvemmelighedsgrunde kan den totale daglige dosis om ønsket opdeles og administreres i portioner i løbet af dagen.

De aktive forbindelser kan også administreres parenteralt eller intraperitonealt. Opløsninger af 30 den aktive forbindelse som en fri base eller et farmaceutisk acceptabelt salt kan tilberedes i vand, der hensigtsmæssigt er blandet med et overfladeaktivt stof, såsom hydroxypropylcellulose. Dispersioner kan også fremstilles i glycerol, flydende polyethylenglycoler 35 og blandinger heraf og i olier. Under sædvanlige oplagrings- og anvendelsesbetingelser indeholder disse præparater et konserveringsmiddel til forhindring af væksten af mikroorganismer.

17

DK 160251 B

De farmaceutiske former, der er egnede til injektionsanvendelse, indbefatter sterile vandige opløsninger eller dispersioner og sterile pulvere til fremstilling af sterile injektionsopløsninger eller 5 -dispersioner på bestilling. I alle tilfælde må formen være steril og må være flydende i en sådan grad, at den let kan administreres gennem en sprøjte. Den må være stabil under fremstillings- og oplagringsbetingelserne og må beskyttes mod den kontarainerende virkning 10 af mikroorganismer, såsom bakterier og fungi. Bæreren kan være et opløsningsmiddel eller dispersionsmedium, der f.eks. indeholder vand, ethanol, polyol (f.eks. glycerol, propylenglycol og flydende polyethylenglycol og lignende), passende blandinger heraf og vegetabil-15 ske olier. Den rette fluiditet kan f.eks. opretholdes ved anvendelse af et overtræk, såsom lecithin, ved opretholdelse af den krævede partikelstørrelse i tilfælde af en dispersion og ved anvendelse af overfladeaktive stoffer. Forhindringen af virkningen af mikro-20 organismer kan opnås ved hjælp af forskellige anti-bakterielle og antifungale midler, f.eks. parabener, chlorbutanol, phenol, sorbinsyre, thimerosal og lignende. I mange tilfælde vil det være hensigtsmæssigt at inkorporere isotoniske midler, f.eks. sukkerarter eller ^ natriumchlorid. Protraheret absorption af injektionspræparaterne kan opnås ved i præparaterne at anvende absorptionsforsinkende midler, f.eks. aluminiummono-stearat og gelatine.

Sterile injektionsopløsninger fremstilles ved at 30 inkorporere den aktive forbindelse i den nødvendige mængde i det pågældende opløsningsmiddel med forskellige af de øvrige ovenfor opremsede bestanddele efter behov, efterfulgt af sterilisering ved filtrering.

Almindeligvis fremstilles dispersioner ved at inkor-35 porere de forskellige steriliserede aktive bestanddele i en steril bærer, der indeholder det grundlæggende dispersionsmedium og de øvrige krævede bestanddele blandt de ovenfor opremsede, I tilfælde af sterile 18

DK 160251 B

pulvere til fremstilling af sterile injektionsopløsninger er de foretrukne fremstillingsmetoder vakuumtørring og frysetørringsmetoden, hvorved der opnås et pulver af den aktive bestanddel plus enhver yderlige-5 re ønsket bestanddel ud fra en i forvejen sterilfiltreret opløsning deraf.

Som anvendt heri omfatter "farmaceutisk acceptabel bærer" ethvert og alle opløsningsmidler, dispersionsmedier, overtræksmidler, antibakterielle og 10 antifungale midler, isotoniske og absorptionsforsinkende midler og lignende. Anvendelsen af sådanne medier og midler til farmaceutisk aktive stoffer er velkendt på området. Bortset fra de tilfælde, hvor konventionelle medier eller midler er uforligelige med den 15 aktive bestanddel, skal deres anvendelse i de terapeutiske præparater tages i betragtning. Supplerende aktive bestanddele kan også inkorporeres i præparaterne.

Det er særlig fordelagtigt at formulere parente-20 rale præparater i enhedsdosisform for at lette administreringen og opnå ensartede doser. Enhedsdosisform som anvendt heri refererer til fysisk adskilte enheder, der er egnede som enhedsdoser til de mammalia-indivi-der, der skal behandles, idet hver enhed indeholder 25 en forudbestemt mængde aktivt materiale, beregnet til at frembringe den ønskede terapeutiske virkning sammen med den nødvendige farmaceutiske bærer. Specifikationen · for de på opfindelsen baserede enhedsdosisformer dikteres af og af hasnger direkte af (a) det 30 aktive materiales unikke egenskaber og den særlige terapeutiske virkning, der skal opnås, og (b) den naturlige begrænsning med hensyn til at sammensætte et sådant aktivt materiale til sygdomsbehandling af levende individer med en sygdomstilstand, ved hvilken 35 sundhedstilstanden svækkes, som nærmere beskrevet heri.

Den væsentlige aktive bestanddel sammensættes med henblik på bekvem og effektiv administrering i 19

DK 160251 B

effektive mængder med en egnet farmaceutisk acceptabel bærer til en enhedsdosisform som beskrevet ovenfor.

En enhedsdosisform kan f.eks. indeholde den væsentlige aktive forbindelse i mængder i området fra ca. 0,1 til 5 ca. 500 mg, idet fra ca. 0,5 til ca. 250 mg foretrækkes. Udtrykt i mængdeforhold er den aktive forbindelse almindeligvis til stede i fra ca. 0,1 til ca. 500 mg/ml af bærer. I tilfælde af præparater, der indeholder supplerende aktive bestanddele, bestemmes doserne under 10 hensyn til den sædvanlige dose og administreringsmåden for de nævnte bestanddele. De daglige parenterale doser for mammalia-individer, der skal behandles, ligger i området fra 0,1 mg/kg til 100 mg/kg. Den foretrukne daglige dosis ligger i området fra 0,3 mg/kg til 10 15 mg/kg.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1 20 2-[2-(Diethylamino)ethyl ]-7-[[2[(2-hydroxyethyl)amino]-ethyl]amino]anthra[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-on.

Ved omsætning af 2,5 g (7 mmol) 7-chlor-2-[2-(diethylamino)ethyl]anthra[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-on, 7 ml (70 mmol) 2- (2-aminoethylamino) ethanol og 20 ml 25 pyridin i 20 timer under tilbagesvaling og derefter afkøling og koncentrering og derpå triturering af den faste remanens med koldt 2-propanol opnås 1,6 g af et fast stof, smp. 104-107°C efter omkrystallisation af toluen. Ved opløsning i varmt 2-propanol og derefter 30 behandling med overskud af hydrogenchlorid i 2-propanol opnås 1,6 g af det tørrede produkt som et salt med 2,0 ækvivalenter hydrogenchlorid og solvatiseret med 1,1 ækvivalent vand, smp. 212-216°C (dekomponering).

7-Chlor-2- [2- (diethylamino) ethyl] anthra [1,9-cd]-35 pyrazol-6(2H)-on fremstilles som følger:

En blanding af 13,85 g (50 mmol) 1,5-dichlor- 9,10-anthracendion, 13,1 g (100 mmol) (2-diethylamino-ethyl)hydrazin og 100 ml pyridin omrøres ved 50°C i

DK 160251B

20 5 timer, behandles med yderligere 10 ml af udgangshydrazinen, omrøres ved 35°C i 48 timer, afkøles, filtreres og koncentreres. Ved triturering af remanensen med 2-propanol:ethanol opnås 8 g af et fast pulver, 5 smp. 129-132°C. Ved opløsning af en 0,9 g prøve i varmt methanol og derefter saltdannelse som beskrevet 1 det foregående afsnit opnås 0,8 g af det tørrede produkt som et salt med 1,0 ækvivalent hydrogenchlorid, smp. 272-275°C (dekomponering).

10

Eksempel 2 2- [2- (Diethylamino) ethyl] -7- [ [2- (diethylamino)ethyl] -amino]anthra[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-on.

Ved omsætning af en blanding af 2,1 g (6 mmol) 15 7-chlor-2- [2- (diethylamino)ethyl]anthra[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-on, 5 ml (36 mmol Ν,Ν-diethylethylendiamin og 20 ml pyridin i 28 timer under tilbagesvaling og derefter oparbejdning og saltdannelse som beskrevet i eksempel 1 opnås 1,9 g af det tørrede produkt som et 20 salt med 2,0 ækvivalenter hydrogenchlorid og solvatiseret med 0,2 ækvivalenter vand, smp. 292-294°C (dekompone-ring).

Eksempel 3 25 2-[2-[(2-Hydroxyethyl)amino]ethyl]-7-[[2-[(2-hydroxy-ethyl) amino] ethyl] amino]anthra[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-on.

En blanding af 1,9 g (5 mmol) 7-chlor-2-[2-[(2-hydroxyethyl)amino]ethyl]anthra[1,9-cd]pyrazol-6(2H)-on, 2,0 ml (20 mmol) 2-(2-aminoethylamino)etha-30 nol og 20 ml pyridin opvarmes under tilbagesvaling i 72 timer. Blandingen afkøles, koncentreres og chroma-tograferes på silicagel med 0,5% triethylamin i di-chlormethan, idet der anvendes gradienteluering med 2 til 10% methanol, til opnåelse af produktet. Ved 35 saltdannelse som beskrevet i eksempel 1 opnås 500 mg af produktet som et salt med 2,0 ækvivalenter hydrogenchlorid og solvatiseret med 0,4 ækvivalenter vand, smp. 285-287°C (dekomponering).

21

DK 160251 B

7-Chlor-2-[2-[(2-hydroxyethyl)amino]ethyl]-anthra[l,9-cd]pyrazol-6(2H)-on fremstilles som følger:

En blanding af 11,1 g (40 mmol) 1,5-dichlor- 9,10-anthracendion, 13,1 g (110 mmol) 2-[(hydrazino-5 ethyl)amino]ethanol, 4 g vandfrit kaliumhydrogencarbonat, 1 g vandfrit kaliumfluorid og 110 ml dimethyl-sulfoxid omrøres ved 70°C natten over. Blandingen afkøles, og det faste stof opsamles ved filtrering og vaskes med vand og derefter grundigt med acetonitril 10 til opnåelse af en remanens, som krystalliseres af 2-propanol til opnåelse af 2,6 g produkt. Hydrochlorid-saltet fremstilles som beskrevet i eksempel 1, smp.

272-273°C (dekomponering).

Claims (1)

15 CIO med en amin med formlen HNRY, i hvilke formler Y, Z og R har de ovennævnte betydninger.