DK161992B - Fremgangsmaade til fremstilling af et immunreaktivt, poroest baerermateriale - Google Patents

Description

i

DK 161992 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et immunreaktivt, porøst bærermateriale ved anbringelse af henholdsvis en opløsning af en første partner i en immunreaktion og en med denne præcipiterende anden partner i en immunreak-5 tion, inkubation af det med opløsningerne gennemvædede bærermateriale til immunpræcipitation, eventuelt vask og efterfølgende tørring af det imprægnerede bærermater i a 1e.

Immunreaktive, porøse bærermaterialer spiller en vigtig rolle i forskellige grene af teknikken. Den slags materialer er f.eks. nødvendige til analytiske og præparative fremgangsmå-10 der, ved hvilke en partner i en immunreaktion anvendes fik-seret til en uopløselig matrix. Fikseringen af partneren i immunreaktionen til den uopløselige bærer kan foregå ved hjælp af kemiske eller fysiske kræfter. Således har man i lang tid kendt metoder til fremstilling af covalente bindinger 15 mellem et fast bærermateriale og et kemisk stof, der skulle bindes dertil, såsom især også biologisk aktive proteiner.

En ulempe ved disse metoder består generelt i, at de bevirker en kemisk forandring af det biologisk aktive materiale, som i mange tilfælde også medfører en forandring af den biolo-20 giske aktivitet. En yderligere kendt metode er indeslutningspolymerisationen af den slags biologisk aktive stoffer. Her forbliver molekylet som sådant ganske vist i reglen uforandret og bibeholder derfor også uændret dets biologiske virkning. Tilgængeligheden af den anden, i en flydende fase fore-25 liggende partner i immunreaktionen, er imidlertid begrænset drastisk. Derfor blev der i mange tilfælde grebet tilbage til den tredje kendte fremgangsmåde, som undgår ulemperne ved den covalente binding og indeslutningspolymerisationen, nemlig den adsorptive fiksering til et egnet bærermateriale.

30 Denne metode har imidlertid til gengæld den ulempe, at bin dingen til den faste bærer er væsentligt svagere end ved begge de førstnævnte metoder, og at der i reglen kun kunne opnås en acceptabel bindingsstabilitet på bestemte plastoverflader.

Der fremkom specielle problemer, hvad angår vedhæftningsstyr-35 ken ved en adsorptiv binding, ved hvilken der altså skal und gås såvel en covalent fiksering som en indeslutningspolymerisation, når der skal anvendes porøse bærermaterialer. Fra

2 DK 161992 B

US patentskrift nr. 3.888.629 kendes en metode, der løser dette vedhæftningsstyrkeproblem, · idet fikseringen gennemføres i det porøse bærermateriale ved at lade en immunreaktion forløbe mellem begge partnere i en immunreaktion, altså mellem antistof og antigen eller hapten. Man imprægnerer hertil det porøse bærermateriale, enten med en opløsning af den første 5 o partner i immunreaktionen og derpå med en opløsning af den anden partner i immunreaktionen således, at selve immunreaktionen kan forløbe i det porøse bærermateriale under permanent fiksering af det ønskede immunreaktive stof uden kemisk forandring eller ulemper med hensyn til dets tilgængelighed for andre reaktionspartnere (PCT-WO 82/02601). I en anden kendt metode blandes begge opløsningerne af de pågældende partnere af immunreaktionen først hurtigt, og derpå imprægneres det porøse bærermateriale straks dermed (US patentskrift nr. 3.888.629).

15

Denne metode til binding af et immunreaktivt stof på et porøst bærermateriale løser ganske vist de ovenfor beskrevne problemer, men udviser imidlertid en anden ulempe, nemlig en uensartet fordeling af det fikserede, immunreaktive stof 20 på bærermaterialet. Denne ulempe er især graverende, når dette immunreaktive, porøse bærermateriale f.eks. skal anvendes til kvantitative analyseformål for haptener eller proteiner i lave koncentrationer. Kravet til stabilitet af antigen-anti-^ stof-netværket samt til lave ligevægtsdissociationskoncen trationer af de immunreaktive partnere fra immunkomplekserne i forhold til koncentrationen af de haptener og proteiner, der skal bestemmes, lader sig kun opnå, når det anvendte antistof besidder en høj affinitet over for det pågældende antigen. Erfaringsmæssigt sætter præcipitatdannelsen spontant 30 ind ved blanding af den slags immunreaktive partnere. Ved fremstillingen af tekniske mængder af et immunadsorptionsmiddel ved imprægnering af et porøst bærermateriale med kort forinden sammenblandede opløsninger af de immunreaktive partnere sker der som ventet tidsmæssigt og rumligt ukontroller-3 5 bar præcipitatdannelse på bærermaterialet.

3

DK 161992 B

Den kvantitative dosering af immunsorptionsmidlet foregår hensigtsmæssigt ved udskæring af en bestemt papirflade af et immunreaktivt papir, ved udvælgelse af et bestemt antal småkugler af et kugleformigt, porøst bærermateriale eller ved afvejning af en bestemt mængde af det immunreaktive bærer-5 materiale. Ved uensartet fordeling af det fikserede, immunreaktive stof kommer en sådan enkel doseringsmetode imidlertid ikke i betragtning.

En yderligere ulempe ved den kendte immunpræcipitationstek-10 nik består i, at den nødvendiggør meget højt rensede antigener, hvilket nødvendiggør en forrensning ved immunsorption og dermed en med store omkostninger forbundet fremstillingsmåde.

15 Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe porøse, immunreaktive bærermaterialer på enkel måde, hvilke bærermaterialer udviser en overlegen homogenitet med hensyn til fordelingen af den immunreaktive bestanddel, og som kan fremstilles let og enkelt og især ikke kræver en med omkost-20 ninger forbundet forrensning til fremstillingen.

Formålet opnås ifølge opfindelsen ved en fremgangsmåde til fremstilling af et immunreaktivt, porøst bærermateriale ved anbringelse af henholdsvis en opløsning af en første partner 25 i en immunreaktion og en med denne præcipiterende anden part ner i en immunreaktion, inkubation af det med opløsningerne gennemvædede bærermateriale til immunpræcipitation og tørring af det imprægnerede bærermateriale, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man fremstiller en opløsning af begge 30 partnere i immunreaktionen, som indeholder en inhibitor for immunpræcipitationen, imprægnerer bærermaterialet med denne opløsning og derefter udløser immunpræcipitationen ved fjernelse af inhibitoren eller ophævelse af inhiberingsvirkningen.

35 Et væsentligt træk ved opfindelsen er anvendelsen af en im- munpræcipitationsinhibitor, der er reversibelt virksom og som taber sin hæmmende virkning ved enkel fjernelse eller kemisk forandring. I nærværelse af inhibitoren kan partnerne i den til præcipitationen førende immunreaktion fordele sig fuldstændigt homogent, og på grund af den meget langsomt 4

DK 161992 B

indsættende fældning opnås en fuldstændig ensartet dækning af bærermaterialet med det pågældende ønskede immunreaktive stof, som også i højtekniske anlæg fører til fuldstændigt ensartede og reproducerbare resultater.

5 I modsætning til den kendte fremgangsmåde til sekventiel anbringelse af antigen og antistof (heterogen fremgangsmåde), sådan som det er beskrevet i eksempel 4, gennemvædes der ved den "homogene" fremgangsmåde ifølge opfindelsen med en homo-10 gen opløsning af antigen og antistof. Herved skelnes mellem to udførelsesformer: ved "1-trinsfremgangsmåden" fjernes inhibitoren, der er indeholdt i imprægneringsopløsningen, under fremstillingen fra opløsningen eller gøres uvirksom. Ved "2-trinsfremgangsmåden" far imprægneres, den porøse bærer først 15 med et virksomt stof, der ophæver inhibitorens virkning ved den efterfølgende gennemvædning med de immunreaktive komponenter.

En mulighed for fjernelse af inhibitoren er et vasketrin før 20 tørringen, og inhibitorens virkning i det porøse bærermateriale kan ligeledes ophæves ved tilsætninger til vaskeopløsningen.

Vasketrinnet er imidlertid ikke noget nødvendigt trin i frem-25 gangsmåden, og præcipitationen kan således f.eks. udløses ved afdampning af en flygtig inhibitor.

Som inhibitorer for immunpræcipitationen anvendes inden for opfindelsens rammer fortrinsvis sådanne stoffer, der ved im-30 munosorptive oprensninger anvendes som desorptionsmidler.

Der foretrækkes hertil især syrer, baser eller kaotrope ioner fra Hofmeister-rækken (lyotrope række), sådan som de f.eks.

er beskrevet i "Structure and Stability of Biological Macro- molecules", 1969, Marcel Dekker,- Inc., New York, side 427 35 samt bestemte organiske forbindelser eller opløsningsmidler, såsom acetonitril, urinstof eller glycerol.

DK 161992B

5

Blandt de inden for rammerne af fremgangsmåden ifølge opfindelsen egnede syrer kommer såvel flygtige som ikke-flygtige syrer i betragtning. Flygtige syrer kan efter imprægnering af bærermaterialet let fjernes for at ophæve den hæmmende 5 virkning, f.eks. ved opvarmning, vakuum eller lignende. For ikke-flygtige syrers vedkommende kan der opnås en analog effekt ved anvendelse af et salt af en flygtig syre, som skilles fra den ikke-flygtige syre under frigørelse af den flygtige syre. Foretrukne eksempler er eddikesyre, propionsyre 10 og saltsyre for flygtige syrer. Der kan ligeledes anvendes flygtige og ikke-flygtige baser som f.eks. ammoniak og t-phos-phat.

Desuden egner sig som inhibitorer organiske forbindelser, der reversibelt kan påvirke såvel protein- som vandstrukturen, og f.eks. er beskrevet i "J. F. Brandts, Conformatial Transitions of Proteins in Water", indeholdt i "Structure and Stability of Biological Macromolecules", 1969, Marcel

Dekker, Inc., New York, side 213-290. Der foretrækkes især 2 o glycerol og urinstof.

Som inhibitorer kommer desuden kaotrope ioner på tale, såsom thiocyanater og jodider. Eksempler på andre egnede ioner er: fluorider, bromider, perchlorater, guanidin og sulfater.

25 Deres fjernelse for at ophæve præcipitationshæmningen kan foregå ved ekstraktion, f.eks. med organiske opløsningsmidler eller blandinger af organiske opløsningsmidler (f.eks. estere) eller blandinger af organiske opløsningsmidler og vand, f.eks. vand/alkoholblandinger, eventuelt ved tilsætning 30 af ionophorer og lignende. Som regel er det herved tilstrækkeligt med en forandring af ionstyrken for at opnå den ønskede effekt, men der kan også foregå en fuldstændig fjernelse af inhibitoren. Også en tilsætning af kompleksdannere, såsom EDTA kommer på tale, f.eks; til fjernelse af hæmmende 35 metalsalte såsom MgC^·

De molære koncentrationer af de til præcipitationen førende immunreaktive partnere kan varieres inden for brede inter- 6

DK 161992 B

valler. De anvendes i opfindelsen fortrinsvis således, at den partner, hvis immunreaktivitet skal udnyttes i det færdige bærermateriale, ikke foreligger i overskud. Særligt foretrukket anvendes de til præcipitationen førende partne-® re i forholdet det Heidelbergerske maximum. Dvs. at begge reaktionspartnerne anvendes i det for præcipitationen gunstigste forhold. Dette forhold kan let fastlægges i forvejen ved uklarhedsforsøg. En tilsvarende uklarhedskurve findes f.eks. i "Methods in Immunology and Immunochemistry", bind 10 III, Academic Press 1971, kapitel 13, side 10. Ved konstruktionen af en sådan kurve afsættes den uklarhed, der opnås ved konstant mængde af den ene af reaktionspartnerne med stigende mængder af den anden reaktionspartner. Uklarhedsmaksimummet er det Heidelbergerske maximum.

15

For at opnå en højst mulig stabilitet af det bærerfikserede immunreaktive stof, skal en af partnerne i immunpræcipita-tionen fortrinsvis være et præcipiterende antistof med højst mulig affinitet over for antigenet.

20

Partnerne i immunpræcipitationen er inden for rammerne af fremgangsmåden ifølge opfindelsen på den ene side et antigen, f.eks. et hapten eller et protein og på den anden side et antistof. Antigenet kan naturligvis selv ligeledes være et 2 5 antistof. I et sådant tilfælde, hvor altså den immunreaktive bestanddel, der skal præcipiteres, selv er et antistof, kan dette også anvendes som Fab-, Fab'- eller (Fab'^“fragment, og altså såvel et monoklont som et polyklont antistof.

Det præcipiterende anti-antistof, der så anvendes til fæld-30 ningen, må udvælges svarende hertil. Anti-antistoffet selv kan så være et polyklont eller monoklont eller et (Fab')2~ fragment deraf. Drejer det sig for anti-antistoffets vedkommende om et monoklont antistof eller et fragment deraf, så bør disse hensigtsmæssigt genkende to forskellige epito-35 per på antigenet. Der kan imidlertid også anvendes monoklone antistoffer eller deres (Fab1)2_fragmenter, som kun genkender én epitop (hvilket er hyppigere), når denne epitop 7

DK 161992 B

er til stede på antigenet mindst to gange. Der kan også anvendes blandinger af monoklone antistoffer som anti-antistof-fraktion for immunpræcipitationen.

5 Som immunreaktivt stof, der skal præcipiteres, kan der fortrinsvis også anvendes et protein, hvortil et hapten eller antigen er koblet. I dette tilfælde anvendes hensigtsmæssigt et præcipiterende antistof som anden partner i immunreaktionen, hvilket antistof er rettet mod proteinet. I en yderligere 10 udførelsesform kan der være koblet et hapten eller antigen til det præcipiterende antistof. Derved kan den anden partner i immunreaktionen være umarkeret eller være koblet med det samme eller et andet hapten eller antistof. Alternativt er det protein, der skal præcipiteres, selv et specifikt antistof, 15 der præcipiteres af et anti-antistof.

Som allerede nævnt ovenfor er det en speciel fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, at man mindst kan anvende én partner i immunreaktionen i urenset form. I modsætning til 20 de kendte immunpræcipitationsmetoder, ved hvilke præcipita-tionen sætter ind øjeblikkeligt efter sammenføringen af immunreaktionspartnerne, kan præcipitationshastigheden ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen foregå så kontrolleret i suspension eller i det porøse bærermateriale, at der ikke op-2 5 træder nogen medrivningseffekter af fremmede stoffer, og at de sidstnævnte ikke skal fjernes i forvejen, men derimod enkelt kan udvaskes efter immunpræcipitationen. Et sådant vasketrin foretrækkes, da små præcipitatpartikler, mindre stabile immunkomplekser og adsorptivt bundne antigener kan fjer-30 nes herved. Til vask egner sig puffere med høj ionstyrke, detergenter, organiske opløsningsmidler og lignende samt præcipi tatstabiliserende tilsætninger (carbohydrater og proteiner) .

Når der skal gives afkald på en forrensning af komponenterne i immunpræcipitationsrensningen, er det hensigtsmæssigt først at blande de opløsninger, der indeholder det pågældende anti- 35 8

DK 161992 B

gen og det pågældende antistof, i det optimale (Heidelberger)-forhold, at vaske det udfældede præcipitat og genopløse ved tilsætning af inhibitoren for immunpræcipitationen, fortrinsvis ved syretilsætning. Der opnås således en blanding af 5 partnerne i immunpræcipitationsreaktionen, der kan påføres direkte på det porøse bærermateriale.

Naturligvis er det inden for opfindelsens rammer også muligt i forvejen at oprense partnerne i immunreaktionen hver for 10 sig over immunadsorptionsmidler på sædvanlig måde, derpå elu-ere med en inhibitor og enten anvende eluaterne direkte til fremgangsmåden ifølge opfindelsen eller først fremstille stabile lagringsformer af reaktionspartnerne ved lyofilisering. Inhiberingen af immunpræcipitationen samt nedsættelsen af 15 fældningshastigheden i bærermaterialet efter ophævelse af inhiberingsvirkningen kan understøttes ved fysiske metoder, som f.eks. temperaturnedsættelse eller viskositetsforøgelse.

Som bærer kommer inden for opfindelsens rammer sædvanlige Λ Λ faste bærere for immunreaktive stoffer i betragtning. Et sådant bærermateriale, der hyppigt også betegnes matrix, kan f.eks. bestå af glas, plast, papir, porøst metal og lignende, forudsat at bærermaterialet er tilstrækkeligt fuldt af sammenhængende væskegennemtrængelige hulrum. Naturlige, kunstige, 2 5 organiske eller uorganiske polymerer egner sig. Ligeledes kommer fiberagtige, svampeagtige eller sintrede stoffer i betragtning. Som bærermaterialer kan der anvendes fladeformede, partikelformede eller andre tredimensionale, porøse emner. Der anvendes fortrinsvis fladeformede, porøse bærere 3 0 såsom papir, plastfolier, glasfibermåtter og lignende. Da fremgangsmåden ifølge opfindelsen giver en fuldstændig homogen fordeling af det immunreaktive stof i denne pladeformede matrix, kan en dosering foregå enklest mulig på grundlag af fladeenhederne. Den slags immunreaktive, fladeformede bærer-3 5 materialer egner sig især til anvendelse som fast fase i de heterogene immunoanalyser.

9

DK 161992 B

Anvendelsen af et ifølge opfindelsen fremstillet immunreaktivt bærermateriale inden for rammerne af en heterogen enzymimmuno-analyse kan f.eks. foregå således, at hapten (H) eller protein (P), som er indeholdt i en prøve, såsom i en pufferop-5 løsning, serum, plasma, urin, kultursupernatant med mere, tilsættes et markeret bindemiddel (B). Som bindemiddel kommer blandt andet antistoffer, Fab”-fragmenter eller Fab-frag-menter samt ligander på tale, der reagerer specifikt med haptenet eller proteinet. Som markering af bindemidlet kan der 10 f.eks. anvendes et enzym, fluorescensmarkører eller radioaktive isotoper, og i de efterfølgende eksempler blev Ø-galactosi-dase valgt. Mængden af det tilsatte bindemiddel kan molmæssigt foreligge såvel i overskud som i underskud i forhold til det i prøven tilstedeværende hapten eller protein.

15

Denne blanding inkuberes i et konstant tidsrum, mens komplekserne H-B, henholdsvis P-B, dannes. Efter udløbet af dette tidsrum foreligger der i reaktionsblandingen tre arter, nemlig komplekset bestående af hapten/protein og bindemiddel

O A

(H-B, P-B), resterende frit hapten/protein (H/P) og resterende frit bindemiddel (B).

Adskillelsen af disse arter foregår i et andet trin ved hjælp af immunosorption. Dertil påføres blandingen på den ifølge 2 5 opfindelsen fremstillede faste immunpræcipitationsfase, der i bundet form indeholder det hapten, der skal påvises, eller antistoffet mod det protein, der skal bestemmes.

- I haptenforsøget binder nu det frie bindemiddel, men ikke 30 det med hapten mættede bindemiddel, til den faste fase. Følgelig indeholder supernatanten, henholdsvis eluatet af den faste fase det med haptenet i prøven mættede bindemiddel. Den kvantitative bestemmelse af haptenet foregår nu ved markering af bindemidlet, i de foreliggende eksempler 35 ved bestemmelse af Ø-galactosidasen ved hjælp af o-nitro-phenyl-Ø-D-galactosid eller chlorphenolrødt-Ø-D-galactosid.

10

DK 161992 B

- I proteinforsøget binder komplekset af protein og bindemiddel, men ikke det frie bindemiddel til den faste fase, og resterne af det frie bindemiddel fjernes ved vask fra det ifølge opfindelsen fremstillede immunosorptionsmiddel. Den 5 kvantitative påvisning af proteinet foregår ved hjælp af det markerede bindemiddel, i det følgende eksempler ved bestemmelse af β-galactosidacen ved hjælp af o-nitrophe-nyl-j3-D-galactosid eller chlorphenolrødt-|3-D-galactosid.

10 En anden anvendelse er kompetitive immunforsøg. Anvendelsen af det ifølge opfindelsen fremstillede immunreaktive bærermateriale kan foregå således, at analytten (hapten eller protein), som er indeholdt i prøven, tilsættes en konstant mængde markeret analyt. Markeringen kan f.eks. være et enzym, 15 en fluorescensmarkør, en radioaktiv isotop med mere. Denne blanding sættes på matrixen. På matrixen er der immobili-seret et antistof, der er rettet mod analytten. Blandingen inkuberes på matrixen i et bestemt tidsrum. I løbet af dette tidsrum konkurrerer såvel uforandret analyt som markeret 2 0 analyt om bindingsstederne på matrixen. Jo mere analyt, der er til stede i prøven, desto mindre markeret analyt bindes af matrixen og omvendt. Ved slutningen af inkubationsfasen fjernes væsken fra den porøse matrix, f.eks. ved centrifugering. Derpå bestemmes mængden af markeret analyt enten i 25 den frie fase eller mængden af den til matrixen bundne, markerede analyt.

En yderligere anvendelse af de ifølge opfindelsen, fremstillede bærermaterialer kan foregå ved, at analytten (hapten 30 eller protein) tilsættes en konstant mængde markeret antistof, der er rettet mod analytten. Mulige arter til markering af antistoffet blev beskrevet ovenfor. Denne blanding inkuberes enten i et bestemt tidsrum og sættes derpå på det porøse bærermateriale eller sættes alternativt straks efter 35 blanding på det porøse bærermateriale. Når analytten er et, hapten indeholder bærermaterialet det hapten, der skal påvises eller et derivat deraf i fikseret form, og såfremt ana- 11

DK 161992 B

lytten er et protein, indeholder bærermaterialet det protein, der skal påvises, eller et derivat deraf,ligeledes i fikseret form. Såfremt den første blanding inkuberes før anbringelse på bærermaterialet, så binder markeret antistof til endnu 5 frie bindingssteder i det porøse bærermateriale. Såfremt blandingen straks sættes på bærermaterialet, så konkurrerer analytten fra prøven og den på bærermaterialet fikserede ana-lyt om bindingsstederne på det markerede antistof. Ved slutningen af inkubationsfasen fjernes væsken fra det porøse bæ-10 rermateriale, og mængden af markeret antistof bestemmes enten i den flydende fase eller på det porøse bærermateriale.

På tegningen viser 15 fig. 1 en kalibreringskurve for digoxinimmunpræcipitatmatrixer opnået ifølge eksempel 3, fig. 2 en tilsvarende kalibreringskurve for matrixer fremstillet ifølge kendt teknik (eksempel 4), 20 fig. 3 en tilsvarende kalibreringskurve for matrixer præpareret ifølge kendt teknik (eksempel 5), fig. 4 en kalibreringskurve for DPH-immunpræcipitatmatrixer 25 opnået ifølge eksempel 6, fig. 5 en kalibreringskurve for TSH-immunpræcipitatmatrixer opnået ifølge eksempel 7, 30 fig. 6 en kalibreringskurve for TSH-immunpræcipitatmatrixer opnået ifølge eksempel 8, og fig. 7 en sammenligning mellem stabiliteten hos imprægneringsopløsninger ved forskellige pH-værdier opnået ifølge 35 eksempel 9.

12

DK 161992 B

De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere.

Udvinding af de i forsøget anvendte stoffer og forsøgsgennemførelse.

5 A) Fremstilling af polyhaptener (PH):

Fremstillingen af PH er teknikkens standpunkt. Således kan der f.eks. vindes et digoxin- eller diphenyl-hydan-toin-PH via reaktive, usymmetriske dicarboxylsyreestere/ak-tiverede haptenestere og deres binding til et bærerprotein.

Fremstillingen af T3- og T4-PH kan f.eks. foregå ved direkte kopling af N^-grupperne fra hormon og protein ved l5 hjælp af bis-imidater (EU-A publikation 0078952) eller via carbodiimidreaktionen (Aherne et al., Brit. J. Clin. Pharm. 3, 56 (1976)) eller den "blandede anhydrid"-reaktion (Erlanger et al.. Methods in Immunology and Immuno-chemistry, ed. Williams and Chase, Acad. Press (New York 20 1967) side 149 ff). Alternativt kan NH2~funktionen fra T3 eller T4 beskyttes i et første trin med acetyl-, tri-fluoracetyl-, t-butoxycarbonyl- eller benzyloxycarbonyl-gruppen. Derpå omdannes carboxylfunktionen til en aktiveret ester, f.eks. N-hydroxysuccinimidester, N-hydroxy-25 phthalimidester eller N-hydroxybenztriazolester. Et ek sempel på således aktiveret T4 er beskrevet i EU-A publikation 0108400, eksempel 3. Omsætning med bærerproteinet giver PH.

30 Udvælgelsen af bærerproteinerne er ikke underkastet nogen begrænsninger, såfremt der blot står et passende "fældende" antistof til rådighed eller dette kan fremstilles.

Såfremt der foregik en immunsorptiv oprensning af antigen 35 og antistof, anvendtes som bærer "Affinitatsadsorbers,

Glutardialdehyd aktiviert" fra Boehringer Mannheim (Best. nr. 665525). Til de nedenfor beskrevne eksempler blev der efter producentens forskrift til antigenoprensningen

DK 161992B

13 til bæreren bundet et fåre-antistof mod kanin-IgG eller et specifikt antistof mod haptenet, og til antistofoprens-ningen bundet kanin-IgG til bæreren. Gennemførelsen af immunosorptionen foregik som beskrevet i arbejdsanvis-ningen til affinitetsadsorptionsmidlet.

B) Fremstilling af bindemidlet (eksempel digoxin):

Udvinding af antiserum, rettet mod digoxin.

10

Fremstillingen af immunogenet, nemlig human serumalbumin, konjugeret med digoxin, foregik som udførligt beskrevet af V.P. Butler jr. og J.P. Chen, Proc. Nat. Acad. Sci. US 51, 71-78 (1967) samt af T. W. Smith, V.P. Butler og E. Haber, Biochemistry 9, 331-337 (1970). Får blev immuniseret med dette immunogen og det tilsvarende antiserum blev udvundet.

Fremstilling af bindemidlet.

20

Antiserum, rettet mod digoxin, blev oprenset via ammo-niumsulfatfældning og passage over DEAE-cellulose til IgG-fraktionen. Papainspaltningen blev gennemført efter R.Ri Porter, Biochem. J. 73, 119-126 (1959).

25

Fab-fragmenterne blev skilt fra de ikke fordøjede IgG- molekyler og Fc-fragmenterne ved hjælp af gelfiltrering over Sephadex G 100 og ionbytningskromatografi over DEAE- cellulose efter litteraturforskrift (K. Malinowski og W. Manski i "Methods in Enzymology", J. J. Langone og 30 H. van Vunakis eds., Academic Press, bind 73 (1981) side 418-459). Den resulterende Fab-fraktion blev renset kromatografisk og koblet til β-galactosidase efter forskriften af T. Kitiwaga i "Enzyme Immunoassay; Ishikawa, T.

Kawai, Κ. Miyai, eds., Igaku Shoin, Tokyo/New York (1981) 35 side 81-89.

C) Fremstilling af fåreantistoffet mod kanin- henholdsvis muse-IgG/Fcy.

14

DK 161992 B

Kaninslagteserum henholdsvis museserum blev underkastet en ammoniumsulfatfældning. Efter passage over DEAE-cel-lulose og papainspaltning og gel- og ionbytningskromatografi (se B) opnås Fc-fragmenterne fra kanin- henholdsvis muse-IgG som immunogener.

5

Oparbejdningen af fåreantiserumet foregår som beskrevet under B) (immunosorption se A)).

D) Forsøgsgennemførelse (eksempel digoxin): 10

Digoxin-standarder i human serum (udtaget fra Elisa-ana- lysesættet fra Boehringer Mannheim, Best. nr. 199656) blev fortyndet 1:7,5 med 0,9 % NaCl-opløsning. Til 200 μΐ fortyndet standard blev sat 200 μΐ bindemiddel (20 15 mU/ml, bestemt med ortho-nitrophenyl-/3-D-galactosid.)., fremstillet som beskrevet under B) og inkuberet i PBS ved pH-værdi 7,2 (phosphatpufret saltopløsning) ved 37°C.

» 2 Derpå sættes 50 μΐ af blandingen pa 1 cm af det flade- 20 formede, immunreaktive bærermateriale. Man inkuberer i yderligere 5 minutter ved 37°C og centrifugerer i 1 minut med en Eppendorf-centrifuge.

Enzymaktiviteten af digoxin-bindemiddel-komplekset i den frie fase kan nu måles kinetisk ved tilsætning af chlor-phenolrødt-Ø-C-galactosid (fremstillet ifølge DE patentskrift nr. 3345748) ved 578 nm.

I eksemplerne er vist forløbet af "stigende" kalibrerings-30 kurver, hvor digoxinkoncentrationen i det ufortyndede serum (X-aksen) er afsat mod den målte optiske tæthed ved 578 nm (Y-aksen).

Alternativt kan den overskydende, dvs. den til den faste 35 fase bundne mængde bindemiddel bestemmes som ovenfor og afsættes mod den pågældende digoxinkoncentration, hvorved man opnår en "faldende" kalibreringskurve.

Eksempel 1

15 DK 161992 B

Fremstilling af T3-(trijodthyronin)-immunpræcipitattnatrix.

Som antigen anvendtes: polyhapten, bestående af kanin-IgG og dertil bundet T3 (molforhold IgG:T3 = 1:3). Antigenet g blev oprenset immunsorptivt over en anti-T3-søjle (se A)).

Som antistof anvendtes: polyklont antistof, rettet mod Fc-delen af kanin-IgG. Antistoffet blev oprenset immunsorptivt over en kanin-IgG-søjle (se A)).

10

Som matrix anvendtes: blandingsmatrix af celluld og polyester (Firma Kalff, Euskirchen, Tyskland) eller af linters, celluld og polyamid (Firma Binzer, Hatzfeld, Eder, Tyskland).

jg Antigen og antistof optages hver for sig i 1 mM eddikesyre (hver c = 1 mg/ml) og henstår 1 time ved stuetemperatur. Opløsningerne blandes derpå i forholdet 1:3 (antigen/anti-stof-forholdet svarer derpå til Heidelberger maximumet) og fortyndes med det nidobbelte volumen af en opløsning af 250 2Q mM eddikesyre og 5 mM natriumacetat.

Matrixen trækkes gennem imprægneringsopløsningen, udpresses og tørres i 60 minutter ved 30°C i et cirkulationstørreskab.

Der vaskes i 1 time aftagende* kromatografisk med PBS-puffer pH-værdi 6,0 og tørres i 30 minutter ved 30°C i cirkulations-tørreskab.

Forholdet mellem måleintervallet (standard 5 ng T3/ml - standard 0) og standard 0 andrager 11,8 (se tabel 1).

30

Tabel 1

Sammenligning af T3-immunpræcipitatmatrix fremstillet efter forskellige fremgangsmåder.

35

Fremgangsmåde Eksempel Måleinterval/standard 0 homogen 2-trins 2 12,0 homogen 1-trins 1 11,8 heterogen 2-trins analogt med 4 1,6 suspension analogt med 5 0,19

Eksempel 2 16

DK 161992 B

Fremstilling af T3-immunpræcipitatmatrix (Homogen 2-trins-fremgangsmåde).

5

Antigen, antistof og matrixer de samme som i eksempel 1. matrixen imprægneres med 50 mM NaCl og tørres derpå i 30 minutter ved 50°C i cirkulationstørreskab.

Antigen og antistof optages hver. for sig i 1 mM eddikesyre 1 o (hver c = 1 mg/ml) og henstår i 1 time ved stuetemperatur.

De to opløsninger blandes i forholdet 1:3 og fortyndes med det nidobbelte volumen 50 mM eddiksyre.

* (tysk:absteigend) 15 Opløsningen doseres på matrixen (væskemætning af matrixen), og den imprægnerede matrix tørres, i 6Q minutter ved 30°C i cirkulationstørreskab.

Der vaskes i 1 time aftagende kromatografisk med PBS-puffer 20 med- pH-værdi 6,0 og tørres· i 30· minutter- ved 30°C i cirku lationstørreskab .

Forholdet mellem måleintervallet (standard 5 ng T3/ml - standard 0) og standard 0 andrager 12,0 (se tabel 1).

25

Eksempel 3

Fremstilling af digoxin-immunpræcipitatmatrixen.

(Homogen 1-trins-fremgangsmåde).

30

Som antigen anvendtes: polyhapten, bestående af kanin-IgG og dertil bundet digoxin (IgG:digoxin 1:3 til 1:4). Antigenet blev oprenset immunsorptivt over en anti-kanin-Fcy-søj-le (se A)).

35

Som antistof anvendtes det samme polyklone antistof som i eksempel 1.

Som matrix anvendtes en blandingsmatrix af celluld og polyester (Firm Kalff, Euskirchen, Tyskland).

DK 161992B

17

Antigen og antistof optages hver for sig i 100 mM eddikesyre i koncentrationerne 1 mg/ml henholdsvis 3,5 mg/ml, og de to opløsninger blandes i forholdet 1:1. Imprægneringsopløsningen fortyndes derpå med det firedobbelte volumen 200 mM natrium-citratpuffer, pH-værdi 3,0.

5

Matrixen trækkes gennem denne imprægneringsopløsning, afpresses, tørres i 10 minutter ved 75°C med cirkulationsluft og eftervaskes som i eksempel 1 og tørres som tidligere.

10 Den i fig. 1 viste kalibreringskurve opnåedes med således fremstillede digoxinimmunpræcipitatmatrixer. Der anvendtes standarderne 0, 0,3, 0,75, 1,75, 3 og 5 ng digoxin/ml. Forholdet mellem måleintervallet (standard 5 ng digoxin/ml - standard 0) og standard 0 andrager 4,9.

15

Eksempel 3a

Fremstilling af digoxinimmunpræcipitatmatrix (uden vasketrin).

2.0. Antigen (200 mg/1) og antistof (700 mg/1) optages hver for sig i 50 mM eddikesyre. Efter 15 til 30 minutters forløb ved stuetemperatur blandes de to opløsninger i forholdet 1:1.

I et efterfølgende trin fortyndes denne opløsning med samme volumen 50 mM eddikesyre plus 40 mM NaCl. Matrixen imprægneres 25 dermed og tørres i 10 minutter ved 75°C.

Disse matrixer anvendes direkte i forsøget. Den dermed opnåede kalibreringskurve svarer til kalibreringskurven i fig. 1.

30 Eksempel 4 (sammenligning)

Fremstilling af digoxinimmunpræcipitat matrix. (Heterogen 2-trins-fremgangsmåde).

35 Antigen, antistof og matrix er de samme som i eksempel 3.

Antigen og antistof optages hver for sig i 1 mM eddikesyre (c = 5 mg/ml henholdsvis 17,5 mg/ml). Man lader disse henstå i 30 minutter ved stuetemperatur, og derpå fortyndes antigenopløsningen med det halvtredsdobbelte volumen PBS-puffer

DK 161992 B

pH-værdi 6,0 og imprægneres på matrixen hvorpå der tørres i 10 minutter ved 75°C i cirkulationstørreskab. Den tørre matrix imprægneres derpå med antistofopløsningen, som blev fortyndet med den ovenstående puffer 50 gange, og der tørres i 10 minutter ved 75°C. Efter vask af matrixen med samme puf-5 fere tørres i 10 minutter ved 75°C.

Der opnås den i fig. 2 viste krumme kalibreringskurve, hvor forholdet mellem måleintervallet (standard 5ng digoxin/ml - standard 0) og standard 0 andrager 1,6.

1 o (Alternativt kan der imprægneres med først antistoffet og derpå antigenet).

Eksempel 5 (sammenligning) 1 ^

Fremstilling af digoxinimmunpræcipitatnatrix (Suspensionsfremgangsmåde) .

Antigen, antistof og matrix er de samme som i eksempel 3. Antigen og antistof optages hver for sig i 100 mM eddikesyre 2 0 (c = 1 mg/ml henholdsvis c = 3,5 mg/ml), og man lader disse henstå i 15 minutter ved stuetemperatur. 1 del antigenopløsning, 1 del antistofopløsning og 1,5 dele 100 mM kalium-phosphatpuffer, pH-værdi 7,6, blandes. Man lader blandingen henstå 1 time ved stuetemperatur. Den dannede suspension 2 5 fracentrifugeres, supernatanten smides bort, og bundfaldet gensuspenderes i det nidobbelte volumen PBS-puffer, pH-værdi 6,0 (homogeniseres). Suspensionen imprægneres således på matrixen, at matrixen er mættet med væske. Derpå tørres i 10 minutter ved 75°C i cirkulationstørreskab. Efter 1 times 3 Π vask med PBS-puffer ved pH-værdi 6,0 tørres påny i 10 minutter ved 75°C.

Der opnås en krum kalibreringskurve (se fig. 3). Forholdet mellem måleintervallet (standard 5 ng digoxin/ml - standard 35 0) og standard 0 andrager 0,19.

Eksempel 6

Fremstilling af diphenylhydantoin (DPH)-iraraunpræcipitalmatrix (homogen 1-trins-fremgangsmåde med præcipitatvask).

19

DK 161992 B

Som antigen anvendtes: polyhapten, bestående af kanin-IgG og dertil bundet diphenylhydantoin.

Som antistof anvendtes: polyklont antistof, rettet mod Fc- delen af kanin-IgG.

5

Som matrix anvendtes en blandingsmatrix af celluld og polyester (Firma Kalff, Euskirchen, Tyskland).

Antigen og antistof (begge ikke immunsorptivt oprenset) op-10 tages hver for sig i 100 mM eddikesyre (c = 1 mg/ml henholdsvis c = 20 mg/ml). Man lader disse henstå i 15 minutter ved stuetemperatur.

En del antigenopløsning, 2 dele antistofopløsning og 2 dele 15 100 mM kaliumphosphatpuffer, pH-værdi 7,6, blandes, og man lader suspensionen henstå 1 time ved stuetemperatur. Præ-cipitatet fracentrifugeres, supernatanten smides bort og prae-cipitatet gensuspenderes i det nidobbelte volumen 100 mM kaliumphosphatpuff er . Dette centrifugerings/vasketrin gentages 20 3 gange, og derpå vaskes præcipitatet saltfrit på samme måde endnu 2 gange med destilleret vand.

Præcipitatet optages i 100 mM eddikesyre (c = 5 mg/ml). Man lader den klare antigen/antistofopløsning henstå i 15 minut-2 5 ter ved stuetemperatur og fortynder derpå med det firedobbelte volumen 200 mM natriumcitratpuffer, pH-værdi 3,0.

Matrixen trækkes gennem denne imprægneringsopløsning, afpresses, tørres i 10 minutter ved 75°C og eftervaskes som i ek-30 sempel 1 og tørres som før.

Den i fig. 4 viste kalibreringskurve opnåedes med således fremstillede DPH-immunpræcipitatmatrix . Der anvendtes standarderne 0, 2,5, 5, 10, 20 og 30 \xq DPH/ml. Forholdet mellem 35 måleintervallet (standard 30 μg DPH/ml - standard 0) og standard 0 andrager 18,2.

20

DK 161992 B

Eksempel 7

Fremstilling af TSH-immunpræcipitat matrix(homogen 1-trins- fremgangsmåde med præcipitatvask).

5

Som antigen anvendtes: monoklont antistof, rettet mod humant TSH. Antistoffet (fra ascites) blev oprenset ved ammonium-sulfatfældning og kromatografi på DEAE-cellulose.

10 Som antistof anvendtes: polyklont antistof, rettet mod Fc-delen af muse-IgG. Antistoffet blev oprenset ved ammonium-sulfatfældning og kromatografi på DEAE-cellulose.

Som matrix anvendtes et blandings matrix af celluld og polyester 15 (Firma Kalff, Euskirchen, Tyskland).

Antigen og antistof optages hver i 100 mM kaliumphosphatpuf-fer, pH-værdi 6,0, 0,9% NaCl (c = 1 mg/ml henholdsvis c = 17 mg/ml). De to opløsninger blandes, og suspensionen lades Λ Λ henstå i 30 minutter ved stuetemperatur. Præcipitatet fracentrifugeres, supernatanten smides bort, og præcipitatet gensuspenderes i det nidobbelte volumen af den ovennævnte puffer. Dette centrifugerings/vasketrin gentages 5 gange, og derpå vaskes præcipitatet saltfrit på samme måde endnu 25 2 gange med destilleret vand.

Præcipitatet optages i 50 mM eddikesyre (c = 5 mg/ml), og den klare antigen/antistofopløsning henstår i 15 minutter ved stuetemperatur og fortyndes derpå med det firedobbelte 30 .

volumen 20 mM natriumacetatopløsning.

Matrixen trækkes gennem denne imprægneringsopløsning, afpresses og tørres derpå i 30 minutter ved 37°C i cirkulationstørreskab. Der vaskes i 1 time aftagende kromatografisk med 35 phosphatpuffer, pH-værdi 6,0, og tørres i 30 minutter ved 37°C.

21

DK 161992 B

Den i fig. 5 viste kalibreringskurve opnåedes med således fremstillede TSH-immunpræcipitat matrix. Der anvendes standarderne 0, 2, 6, 12, 24 og 48 μϋ TSH/ml.

5 Eksempel 8

Fremstilling af TSH-immunpræcipitatmatrix. (Homogen 2-trins-fremgangsmåde med præcipitatvask).

Der anvendtes det vaskede præcipitat fra eksempel 7.

Der anvendtes samme matrix som i eksempel 7. Den tørre matrix blev derpå imprægneret med 50 mM NaCl og tørret (10 minutter ved 75°C).

15

Præcipitatet blev optaget i lidt 500 mM eddikesyre (netop så meget, at præcipitatet opløses), og derpå fortyndes med 5 mM eddikesyre til c = 1 mg/ml. Opløsningen doseres på matrisen (væskemætning af matrixen. Der tørres i 30 minutter ved 20 30°C i cirkulationstørreskab. Derpå vaskes matrixen . kromato grafisk med natriumacetat og derpå med phosphatpuffer, pH-værdi 6,0, og tørres ved 37°C.

Den i fig. 6 viste kalibreringskurve opnåedes med således 25 fremstillede TSH-immunpræcipitatmatrix, og der anvendtes stan darderne 0, 2, 6, 12, 24 og 48 μϋ TSH/ml.

Eksempel 9 30

Sammenligning af stabiliteterne af imprægneringsopløsningerne.

Antigen og antistof er de samme som i eksempel 1. Antigen og antistof opløses separat i en opløsning af inhibitoren, 0,1 M NaCl og 0,5 % RSA. De to opløsninger indstilles med 35 0,2 N HC1 (eddikesyre og propionsyre giver sammenlignelige resultater) på pH-værdi 6,0, pH-værdi 4,0 eller pH-værdi 2,0. Derpå blandes opløsningerne af antigen og antistof med hver 22

DK 161992 B

gang samme pH-værdi,og det tidsmæssige forløb af præcipitat- dannelsen følges. Fig. 7 viser, at ved pH-værdi 6,0 udfælder immunpræcipitat straks efter blanding af antigen og antistof, ved pH-værdi 4,0 sker der en ringere, efter 1 times forløb 5 endnu ikke afsluttet præcipitatdannelse, og ved pH-værdi 2,0 sker der ikke mere præcipitatdannelse.

Eksempel 10 10 Fremstilling af T4-(trijodthyronin)-immunpræcipitatmatrix.(u~ den vasketrin).

Som antigen anvendtes: polyhapten, bestående af kanin-IgG

og dertil bundet T4 (molforhold IgG;T4 = 1:3). Antigenet 15 blev oprenset immunsorptivt over en anti-T4-søjle (se A)).

Som antistof anvendtes: polyklont antistof, rettet mod Fc-delen af kanin-IgG. Antistoffet blev oprenset immunsorptivt over en kanin-IgG-søjle (se A)).

20

Som matrix anvendtes: blandingsvlies af celluld og polyester (Firma Kalff, Euskirchen, Tyskland) eller af linters, celluld og polyamid (Firma Binzer, Hatzfeld, Eder, Tyskland).

25 .

Fremstilling af matrixen.

Antigen (400 mg/ml) og antistof (1400 mg/ml) optages hver for sig i 50 mM eddikesyre plus 0,5 % NaCl. Efter 15 til 30 minutters forløb blandes de to opløsninger i forholdet 1:1, 30 . .

og matrixen imprægneres dermed. Efter tørring (10 minutter ved 75°C) imprægneres matrix-med PBS og tørres (10 minutter ved 75°C).

Eksempel 10a 35 --

Fremstilling af T4-immunpræcipitatmatrix (med vasketrin). Antigen (2 mg/ml) og antistof (7 mg/ml) opløses hver for sig

Claims (16)

15 Antigen (2 mg/ml) og antistof (7 mg/ml) opløses hver for sig i destilleret vand. Begge opløsninger fortyndes med 50 mM NH^OH i forholdet 1+4. Lige store volumener af de fortyndede opløsninger blandes med hinanden. Dermed imprægneres matrix. Disse matrixer tørres i 10 minutter ved 75°C og anvendes 20 direkte i forsøget. De med matrixer ifølge eksemplerne 10, 10a og 10b opnåede kalibreringskurver svarer til kalibreringskurverne for de forudgående eksempler. 25 Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et immunreaktivt, porøst 30 bærermateriale ved anbringelse af henholdsvis en opløsning af en første partner i en immunreaktion og en med denne præ-cipiterende anden partner i en immunreaktion, inkubation af det med opløsningerne gennemvædede bærermateriale til immun-præcipitation, eventuelt vask og efterfølgende tørring af 35 det imprægnerede bærermateriale, kendetegnet ved, at man fremstiller en opløsning af begge partnere i immunreaktionen, som indeholder en inhibitor for immunpræcipita-tionen, imprægnerer bærermaterialet med denne opløsning og derefter udløser immunpræcipitationen ved fjernelse af inhibitoren eller ophævelse af inhiberingsvirkningen. DK 161992B

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man som partner i immunreaktionen anvender et protein og et mod dette protein rettet antistof eller et fragment deraf.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, 5 at man anvender et protein, hvortil er koblet et hapten eller antigen.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at man anvender et mod proteinet rettet antistof 10 eller et fragment deraf, hvortil er koblet et hapten eller antigen.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2-4, kendetegnet ved, at man som protein anvender et specifikt antistof. 15

6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man som inhibitor anvender en syre eller en base. 2Q 7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at man anvender en flygtig syre eller base og efter imprægneringen af bærermaterialet afdamper denne.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, 25 at man som inhibitor anvender en ikke-flygtig syre eller base og anvender et bærermateriale, der er imprægneret med et salt af en flygtig syre eller base.

9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kende- 20 tegnet ved, at man som inhibitor anvender glycerol eller urinstof og ekstraherer dette efter imprægnering af bærermaterialet med en blanding af mindst et organisk opløsningsmiddel og vand.

10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kende-tegnet ved, at man som inhibitor anvender et metalsalt og ophæver dettes inhiberende virkning i bærermaterialet ved hjælp af kompleksdannere. DK 161992 B

11. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at man som inhibitor anvender en kaotrop ion fra Hofmeister-serien.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at man som inhibitor anvender et thiocyanat.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at man som inhibitor anvender et alkalijodid. 10

14. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man anvender partnerne i immunreaktionen i forholdet det Heidelbergerske maximum.

15. Fremgangsmåde ifølge ethvert·af de foregående krav, kendetegnet ved, at man anvender mindst en partner i immunreaktionen i urenset form.

16. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, 20 kendetegnet ved, at man ud fra partnerne i immun reaktionen først fremstiller et suspensionspræcipitat, som efter vask opløses ved tilsætning af inhibitor og derpå anvendes til imprægnering af den porøse bærer. 30 35