JPS628054A - 固定化抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は特に固相法インムノアッセイ用固定化抗原とし
て好適な固定化抗原に関する。

（従来の技術） 抗原と抗体が特異的に結合して複合体が形成される反応
と抗原あるいは抗体に標識されたラジオアイソトープの
放射能を測定するか、あるいはそれらに結合された酩素
による１素反応速度を測定することによる高感度計測法
とを組合せた分析法はすなわちそれぞれラジオインムノ
アッセイ（ＲＩＡ）あるいはエンザイムインムノアッセ
イ（ＥＩＡ）と呼ばれてい暮分析法である。これら分析
法は生体内成分の微量定量法として生化学の研究分野お
よび臨床検査の分野で汎用されるものとなっている。

ＲＩＡとＥＩＡにおいては、いずれも、検体中に生成し
た抗原・抗体結合体と未結合の抗原あるいは抗体とを升
離する必要があり、分離操乍を容易にするために抗原あ
るいは抗体は一般に担体に固定化したもの（固定化抗原
あるいは抗体）が用いられる。

抗原あるいは抗体を担体に固定化する方法として、デキ
ストラン（架橋されたもの）、アガロースゲルあるいは
表面を有機官能基化したガラスピーズ、多孔性ガラス等
の担体にそれらを化学結合で結合する方法、プラスチッ
クスチューブ、シリコンゴム片上に物理的に吸＃させ結
合する方法、ポリアクリルアミドゲル中に包括する方法
［Ｃ１１ｎｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　％　ｖｏ
ｌ、１９、ＮＯ，１２，１８８９（１９７８）］　　な
どが知られている。

フィブロインは、従来、低分子量の酵素基質に対しては
透過性がありそのような基質に対応する酵素の担体とし
て用い得ること、該担体中で酵素活性は相当安定に保持
されることは知られている〔公開昭５２−５７８９２、
Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、４２（９）、
１６６１　（１９７８）　］。

しかしながら上記フブイロインを固定化抗原の担体とし
て適用する試みは未だなされていない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者等はフィブロインの抗原担体としての用途につ
いて研究を２行い、各種の抗原をそれが抗原抗体反応な
し得る状態において、強固且つ安定にフィブロイン中に
包括させ得ること、また担体のフィブロインに対する抗
体の非特異的吸着（インムノアセイあるいはアフィニフ
ィクロマトグラフィーにおいて分析妨害因子となる）は
これを容易に排除し得るものであることを見出し本発明
を完成したものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明は結晶化フィブロインを担体とする固定化抗原で
ある。

本発明のフィブロイン固定化抗原はフィブロイン水溶液
より結晶性フィブロインを再生するに際してフィブロイ
ン中に抗原を包括せしめることにより製造される。

上記のフィブロイン水溶液は常法により絹原料（生糸、
生糸屑、キキ、ビスあるいは屑まゆ等）により得られた
精製フィブロイン繊維を水酸化鋼−７ンモニア水溶液、
水酸化銅−エチレンジアミン水溶液、ロダン酸塩水溶液
、臭化リチウム水溶液、塩化カルシウム水溶゛液、硝酸
カルシウム水溶液あるいは硝酸マグネシウム水溶液等に
溶解し、それら溶液より塩類を透析脱塩して得られる。

本発明の固定化抗原は目的に応じてフィブロインの再生
法を変えフィルム状、粉末状、顆粒状あるいはｔ＆維状
等にすることができる。

インムノアッセイ用の固定化抗原の形態は固定化抗原−
抗体複合体と検体中の遊離の抗体との分離あるいはその
洗浄除去の操作を簡便、容易にするためフィルム状ある
いは支持体コーティング薄膜とすることが特に好ましい
。

フィルム状の固定化抗原は、好ましくはフィブロイン水
溶液（フィブロインの濃度は好ましくは２〜２０重量％
）に抗原を溶解し、ガラス板、テフロン板、アクリル板
等の平板上に該溶液を流延、乾燥し結晶化ブイプロイン
膜を再生しこれを剥離する方法、より好ましくは抗原を
均一に付着せしめた平板若しくは抗原を高濃度に含有す
るフィブロイン極薄膜を均一に併重せしめた平板上にフ
ィブロイン水溶液（フィブロインの濃度は好ましくは２
〜２０取量％）を流延、乾燥し、結晶化ブイプロイン膜
を再生せしめ、これを剥離する。ぎわば転写法的な方法
等により製造することができる。

上記の抗原付着平板は抗原水溶液あるいはフィブロイン
水溶液を添加した抗原水溶液（フィブロイン水溶液の添
加は抗原に対するフィブロインが好ましくは４０〜１０
直量％となる如く行われる）を平板上に流延、乾燥して
調製される。

支持体コーティング薄膜はガラス板、アクリル板等の平
板面上あるいは分析用試験管の内面を抗原含有フィブロ
イン水溶液（フィブロイン濃度は好ましくは０．１〜５
重量％）でコーティングし乾燥を行いそれら面上にフィ
ブロイン薄膜を再生せしめる方法により製造できる。

粉末、顆粒あるいは繊維状で用いることもでき、粉末あ
るいは顆粒形態のものは好ましくは抗原含有フィブロイ
ン水溶液（フィブロイン濃度は好ましくは２〜２０重量
％）を撹拌下の硫酸アンモニウム水溶液、酢酸ナトリウ
ム水溶液、硫酸ナトリウム水溶液に添加し固相フィブロ
インを析出させ分離、乾燥する方法、より好ましくはガ
ラスピーズあるいは細孔径の大きなシリカ担体等に抗原
含有フィブロイン水溶液（フィブロイン濃度は好ましく
は０．１〜５重量％）を含浸させ水を蒸発させてブイプ
ロイン膜を担体上に再生せしめる方法等により製造する
ことができる。繊維状形態のものは抗原含有フィブロイ
ン水溶液（フィブロイン濃度は好ましくは１５〜２０重
量％）を前記同様のフィブロイン凝固性無機塩水溶液中
に紡糸して製造することができる。

粉末、顆粒あるいは繊維状の固定化抗原は分析法に用い
るだけでなく、生体成分等の中から特定成分を分離、精
製するためのクロマトグラフィーいわゆるアフィニティ
クロマトグラフィー用担体として用いることもできる。

固定化抗原は通常水溶液中で使用されるので担体の再生
フィブロインは耐水性であることが要求される。このた
め本発明における再生フィブロインはその結晶化度が少
なくとも２０％以上、好ましくは８０％以上となる如く
再生処理が行なわれる。そのため、水分蒸発により固相
フィブロインを再生する場合、水分蒸発は好ましくは室
温〜６（ＩＣ，相対湿度６０％以上の雰囲気下に風乾し
て行われる。この場合、結晶化促進ないしは品質を安定
化するため、フィブロイン水溶液中に好ましくは２〜４
０重量％のエチルアルコール、エチレングリコール、グ
リセリン等のアルコール類あるいは好ましくは２〜２０
１景％の硫酸ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸アン
モニウム等の凝固性塩を添加する仁とが望ましい。析出
によりフィブロイン粉末あるいは顆粒を再生する場合に
おいては凝固性塩の８０％飽和以上の水溶液中に抗原を
溶解したフィブロイン水溶液を添加し、析出させる。

上記の再生処理法によりフィブロインの結晶化度を２０
％以上、８０〜５０％程度とすることができる。なお、
ここで結晶化度とは結晶性フィルムあるいは結晶性フィ
ブロイン粉末とフィブロイン水溶液を平板上４℃で風乾
して得たほぼ無定形とみなせるフィルムとに関するＣｕ
Ｋα線による第１図に示した如き広角Ｘ線回折チャート
（赤道方向の回折強度を記録して得られたチャート）に
おいて、２θ＝１５°と８０°の回折強度点を結んだ直
線上の回折強度曲線下の面積をそれぞれＡ、ＢとしてＡ
−Ｂ／Ａの百分率として定義されたものをいう。

本発明において固定化される抗原としては、ヒ′ト絨毛
性性腺刺激ホルモン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホル
モン、インシュリン等の蛋白ホルモン、α−フェトプロ
ティン、ハプトクロビン等の血清蛋白、大腸菌毒素、コ
レラトキシン、インフルエンザウイノエ風疹ウィルス、
ＨＢｓ抗原等のトキシン、ウィルスあるいはウィルス成
分、ステロイドホルモン、各種低分子量の薬物等を血清
蛋白に結合したものなどを挙げることができる。

抗原の使用量は目的により適宜選定することができるが
、抗原含有フィブロイン水溶液よりフィルム、粉末顆粒
、繊維を再生せしめる場合においては、通常、乾燥フィ
ブロインあたり０．１〜４０重量％、好ましくは０．５
〜８０重量％、特に好ましくは１〜２０重量％の抗原を
フィブロイン水溶液に添加して用いられる。転写法的に
抗原固定化フィルムを製造する場合においては、抗原は
基板上に通常０．２〜２０μｆ／ｄ１好ましくは０．５
〜１５μＩ／ｄ１特に好ましくは１〜１０μｆ／ｃ−と
なる如く付着させ用いられる。

（発明の効果） 本発明の固定化抗原は以上の記載からも明らかなように
極めて簡単な方法で製造でき、以下ｖ！廁例によって明
らかにする如く抗原の担体に対する固定は強固であり、
強力な洗浄に対しては勿論、摩擦による脱落に対しても
抵抗性があり保存安定性も極めて優れており、ＲＩＡ％
ＥＩＡ分析あるいはアフィニティクロマトグラフィー用
の固定化抗原として優れた性質を持つ。

以下、本発明の固定化抗原の製法、その特性を実施例に
よって明らかにする。

実施例１ 囚　フィブロイン水溶液の調製 生糸１００ｆを１．０重量％のマルセル石けん水溶液５
１中に浸漬し、９０℃で８時間精練し、続いて０．６重
量％のマルセル石けん８１中に浸漬し、更に８時間精練
を行いセリシン等を実質的に除去したフィブロイン原料
７１Ｆを傳だ。

駆動下のニーダ−中に水５０ｆ、エチルアルコール７５
ｇおよび塩化カルシウム１００ｊＦを加え、７６゛Ｃに
昇温後、上記のフィブロイン原料５ＯＮを投入し、該原
料が完全に溶解した１時間後に７５゛Ｃの水２００１を
添加、希釈しフィブロイン溶解液を得た。この溶解液を
浴却後ホローファイバー型の透析器に注入し流水により
透析脱塩し５．５重量％のフィブロイン水溶液（塩化カ
ルシウム残留ｆｉは０．０８道量％’）　８８０　ｍｌ
を得、ロータリーエバポレーターで濃縮し、次いでその
一部を水で希釈して、フィブロイン濃度をそれぞれ１０
重量％および１８重量％に調整した溶液を得た。

（Ｂ）　　ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）固定
化フィルムと対称フィルムの調製 乾燥語中に設置された水平台上にガムテープで１０ＣＭ
四方が仕切られたガラス板を置き、１０００：ＵのｈＣ
Ｇを含む水溶液８　ｍｌを仕切内に流延し、１６゛ｃで
１０時間乾燥した８次いで上記のフィブロイン水溶液（
濃度は１０重量％のもの）１５ｆにグリセリン０．４５
ｇｍを添加混合した溶液を仕切り内暑こ流延し、１５“
Ｃで１０時間乾燥した。形成されたフィルムを剥離し、
厚さ１２０、ψｍの柔軟なフィルムを得た。その結晶化
度は８６％であまた。

ガラス板にあらかじめｈＣＧを付着させることなく上記
同様にして厚さ１２０．Ｈｍ１結晶化度８７％のフィル
ムを辱な。

（Ｃ１ｈＣＧの有効固定化量と対称フィブロイン薄膜に
対する抗体の非特異的吸着量の測定Ｉ　Ｘ　０．５　ａ
ｍに裁断した上記ｈＣＧ固定化フィルム片を生理食塩水
で充分に洗浄した後、ペルオキシダーゼを標識しｈマウ
ス抗ｈＣＧ抗体を５μｆ含む牛血清アルブ、ｔン０．１
市量％含有生理食塩水０．５ｍｌ中に浸漬し４℃で２４
時間放置した。このフィルム片を生理食塩水で充分洗浄
した後、０−フエ・ニレンジアミン４．６５ｍＭ、過酸
化水素４．４ｍＭを含むｐＨ５，５のクエン酸１１！衝
液４　ｎｔｌ中に浸漬し５分間壁とう後８．４規定の硫
酸２　Ｗｌｌを添加し反応を停止させ反応液の４９２　
ｎｍの吸光度を測定した。吸光度は１．０２４であり、
一方対称フイブロインフィルムを上記同様に９＆理、反
応させた場合の吸光度は０．０１８であり、これよりフ
ィルム上に固定化された有効ｈＣＧは約０．　Ｉ　Ｉｔ
Ｊ／ｃ−ｊ　（有効固定化２ｘ１％）、非特異的吸着に
よる見かけｈＣＧ固定化率は０．００１２　ＩＵ／ｄと
計算された。

（Ｄ）　　固定化ｈＣＧの固定化強度の測定ポリ塩化ビ
ニルフィルム（厚さ１２０μｍ　）をＩＸｏ、５ａＩＩ
に裁断し、ｈＣＧ　１０１Ｕ／ｍｌのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）中に４℃で２４時間浸漬した。

次いで充分水洗した後、（Ｃ）と同様な操作で吸着ｈＣ
Ｇ量を測定したところ吸光度が１．２４２で約０、１２
１Ｕ／ｄであった。（Ｃ）で使用したｈｃｃ固定化フィ
ブロインフィルムと対照として上記のｈＣＧ固定化ポリ
塩化ビニルフィルムとを０．　Ｉ　Ｍグリシン−塩酸緩
衝液（ｐＨ２，２）中に５分浸漬したもの、及び荷重１
　ｋｌｉ／ｃｄでろ紙間を８回擦過したものについて、
（０と同様にｈＣＧ固定化量を測定（７たところ、本発
明のｈＣＧ固定化フィブロインフィルムでは両者共固定
化量の減少はほとんど認められなかったが、対照のポリ
塩化ビニルフィルムの場合にはグリシン−塩酸緩衝液で
約５０％、ろ紙擦過では約８０％のｈＣＧが脱落した。

実施例２ 実施例１（Ｂ）におけると同様にして、第１表に示す抗
原をそれぞれアクリル板上に６μｆ／ｃｄの割合となる
ように付着させた（ただし乾燥は１０’０１０時間の風
乾）１次にその上に実施例１（Ａｌで得たフィブロイン
水溶液（ａ度は１８重量％のもの）にグリセリン４Ｍ量
％を添加混合した溶液を流延し、１５℃で１０時間乾燥
後、形成されたフィルムを剥離し水で充分洗浄し、第１
表に示す抗原固定化フィルムを得た。有効固定化抗原量
は対応するマウスの抗体にペルオキシダーゼを標識した
ものを用いて実施例１（Ｃ）におけると同様にして測定
した。

第　　１　　表 実施例８ ヒトアルブミン、ヒトＩｇＧをそれぞれ２ｍｌ。

２％フィブロイン水溶液（フィブロインに対して８０％
のグリセリンを含有）８００ｍｇに溶解し、表面をサン
ドペーパーで粗面化したポリエステルフィルム（厚さ２
００μｍ）に均一に塗布した。

（計算上フィブロイン皮膜が２μｍの厚さになるように
塗布した） 次いで２５℃で８時間乾燥した後、実施例１（ｃ）にお
けると同様にしてそれぞれの抗原に対する抗体のペルオ
キシダーゼｌ１ｌｓ物を用いて固定化抗原量を測定した
ところヒトアルブ（ンで０．０６μｇ、４−ヒトＩｇＧ
で０．０８μｆ／ｄであった。

実施例４ ′ｉＮ施例２で得たヒト−α−フェトプロティン固定化
フィブロインフィルムを０．７Ｘ１．２ｃｍに裁断し、
一端を２ｍＸ１０３のポリエステルフィルム（厚さ１５
０μｍ）に接着して取り扱い易くした。

外径１８ｍｍ、長さ９０１のガラ”ス製試験管に抗ヒト
−α−フェトプロティン抗体（免疫動物マウス、モノク
ローナル抗体）をθ〜８２０ｎノ／ｍｌ含有する０、１
％牛血清アルブミン生理食塩液０．５　ｍｌを入れ、そ
れぞれに上記のフィルムを浸漬し、２５“Ｃで２時間反
応させた。次にフィルムを水洗した後、１μｆ７ｔｎｌ
の抗マウスＩｇＧ抗体（免疫動物、家兎、抗血／ｌｌＩ
ｇＧ留分）の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識物を含有
する０、１％牛血清アルブミン生理食塩液０．５　ｍｌ
を入れ、２６°Ｃで１時間反応した。

フィルムを、取り出し、水洗した後、別に準備したガラ
ス試ｔ４Ｉｔｆに入れ、０−フェニレンジアミン１９．
１ｍＭ、　　過酸化水素２．４５　ｍＭのクエン酸−リ
ン酸２−ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）　０．５　ｍ
ｌづつを加え、室温で暗所で８０分間反応させ、ＩＮ硫
酸２ｍｌで酵素反応を停止させ、この反応液についてＡ
ｂｓ　４９２を測定し、標準曲線を得た。

結果を第２図に示したが抗ヒト−α−フェトプロティン
抗体５　ｎｇ／ｍｅの測定が可能であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はフィブロインの結晶化度を測定するためのＸ線
広角回折チャートの一例を示すものであ？）　、（ａ）
はフィブロインフィルムの、また（ｂ）は無定形フィブ
ロインフィルム（対照）の回折強度曲線である。第２図
は抗ＡＦＰ抗体の標準曲線を表わしたものである。 第１図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）結晶化フィブロインで固定化してなる固定化抗原
2. （２）フィブロインが少なくとも２０％以上の結晶化度
   を有するものである特許請求の範囲第１項に記載の固定
   化抗原
3. （３）固定化抗原がフィルム状のものである特許請求の
   範囲第１項に記載の固定化抗原