DK162057B - Fremgangsmaade til fremstilling af et immunogent kompleks - Google Patents

Description

DK 162057 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et immunogent kompleks indeholdende antigene proteiner eller peptider med hydrofobe regioner, hvilket kompleks har en åben sfærisk struktur 5 bestående af cirkulære underenheder eller dele af den sfæriske struktur, og hvilket kompleks sædvanligvis har lavere sedimentationskonstant end tilsvarende miceller og højere sedimentationskonstant end den tilsvarende monomere form af protein eller peptid, valgt 10 blandt amfipatiske proteiner eller peptider eller blandt sådanne indeholdende virus, bakterier, mycoplasma, parasitter eller dyreceller.

Der er velkendt, at døde virus, f.eks. influenza-virus, har en god antigen effekt. De er imidlertid 15 pyrogene selv efter en høj grad af rensning. Ved isolering af komponenter, som er vigtige for induktion af beskyttende immunitet, har man undgået den pyrogene effekt, men immunogeniciteten er ofte ikke tilstrækkelig stærk. Derfor må passende adjuvanser sættes til de 20 vacciner, som indeholder de isolerede antigener (subenheder) for at forstærke immunreaktionen. På den anden side forårsager effektive adjuvanSer ved de fremgangsmåder, som hidtil er anvendt, negative bivirkninger, Adjuvansholdig vaccine er derfor ikke 25 bedre end vaccine, baseret på hele virus, når det gælder den pyrogene effekt.

For at øge immunogeniciteten har man fremstillet detergentholdige membranproteiner, som inkorporeres i eller bindes til overfladen af liposomer (EPC-ansøgning 30 nr. 11549). Detergenfrie membranproteiner i liposomer beskrives i US P 4 148 876. Inkorporering af adjuvan&er i sådanne detergentfrie unilamilære liposomprodukter nævnes i US P 4 196 191 (uden at der redegøres for effekten). I US P 4 117 113 beskrives negativt ladede 35 liposomer indeholdende virusantigener. I sådanne liposomer indeholdende influenzahemagglutinin og neuraminidase medfør©: inkorporering af mykobakteriecel-levægge som adjuvans i liposomerne et bedre immun- 2 DK 1620576 respons, Bedre immunrespons er også opnået, når adjuvans.er, såsom dræbt Mycobacterium tuberculosis, Bordetella pertussis og saponiner inkorporeres i sådanne negativt ladede liposomer indeholdende difteritoxoid (US P 5 4 053 585J, Alle de ovennævnte lipidholdige membran- proteinprodukter er imidlertid ustabile ved længere tids lagring, frysetørring eller uforsigtig behandling, som f.eks. høj temperatur.

Man har ligeledes fremstillet detergent- og 10 lipidfrie proteinmiceller som vaccine. Man har vist at miceller af membranproteiner fra Semliki Forest virus (SFV) stimulerer til dannelse af cirkulerende antistoffer mod SFV og giver mus beskyttelse mod en dødelig infektion af SFV. På den anden side iszar sådanne membran-15 proteinmiceller af para influenza-3-virus ikke effektive til at stimulere antistofdannelsen hos lam eller til at beskytte mod en dosis af en Ρϊ.-3-s.tamme, som forårsager pneumoni, hvis micellerne ikke blev blandet med et olie-adjuvanS. Et olieadjuvanS giver for det meste bivirkninger 20 i form af lokale reaktioner omkring injektionsstedet (EPC-ansøgning 81102213.6).

Det tilsigtes med opfindelsen at undgå disse u-lemper og frembringe et lagerstabiit protein- eller peptidkompleks med høj immunogenicitet og uden bivirk-25 ninger. Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved, at man blander mindst én af ovennævnte komponenter med mindst ét solubiliserings-middel, hvorved der dannes et kompleks mellem amfipa-tiske antigene proteiner eller peptider og solubilise-30 ringsmidlet, hvorefter de amfipatiske antigene proteiner eller peptider separeres fra solubiliseringsmidlet i nærværelse af, eller separeres fra solubiliseringsmidlet og direkte overføres til, en opløsning indeholdende mindst én triterpensaponin med hydrofobe og hydro-35 file regioner i en koncentration på mindst den kritiske micellære koncentration (CMC).

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede komplekser har en anden morfologisk struktur ved

DK 162057 B

3 elektronmikroskopi end de tilsvarende proteinmiceller, som er fremstillet uden glycosidtilsætning, idet ordet "glycosid" her og i det følgende benyttes som fællesbetegnelse for den eller de triterpensaponiner, der in-5 korporeres ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Micellerne har en kompakt central kerne med radialt ordnede vedhæng, men komplekset fremstillet ifølge opfindelsen har en åben sfærisk struktur bestående af cirkulære underenheder eller dele af den sfæriske 10 struktur. Komplekset og delene deraf har endvidere i reglen en lavere sedimentationskonstant (se fig. 1) end de tilsvarende miceller og højere sedimentationskonstant end den tilsvarende monomere fom af protein eller peptid.

15 Komplekset fremstillet ifølge opfindelsen ved glycosidtilsætning har bedre immunogenaktivitet end de tilsvarende proteinmiceller, som fremstilles uden glycosidtilsætning, eller komplekser mellem proteinmolekyler og solubiliseringsmiddel (monomerformer) eller 20 proteinmolekyler bundet til lipider, f.eks. virosomer, og giver færre bivirkninger, end når proteinmicellerne blandes med glycosiderne eller andre adjuvanser. Således kan dosen af membranproteiner mindskes til ca.

1/10 eller mindre.

25 Der kan benyttes forskellige hensigtsmæssige udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen som angivet i krav 2-5.

De proteiner eller peptider med hydrofobe regioner, som kompleksbindes til hydrofobe regioner på glyco-30 siderne kan være følgende: A) amfipatiske proteiner eller peptider med hydrofile og hydrofobe grupper, som stammer fra eller udgøres af membranproteiner eller -peptider fra virus med cellevæg, mycoplasma, bakterier, parasitter eller dyreceller, 35 eller som udgøres af sådanne proteiner eller peptider fremstillet med hybrid-DNA-teknik, eller syntetisk fremstillede molekyler,

DK 162057B

4 B) hydrofile proteiner eller peptider, som er gjort amfipatiske gennem sammenkoblingned hydrofobe grupper. Disse proteiner eller peptider kan stamme fra virus, mycoplasma, bakterier, parasitter, være 5 syntetiserede eller frembringes ved hybrid-DNA-teknik, C) amfipatiske proteiner eller peptider, fremstillet ved at utilgængelige hydrofobe dele i hydrofile proteiner er gjort tilgængelige ad kemisk vej.

Disse proteiner kan stamme fra de ·. ovennævnte mikro- 10 organismer eller celler, eller de kan fremstilles ved hybrid-DNA-teknik, eller de kan være syntetiserede.

Fremstilling af komplekset, a) Fremstilling af membranproteiner eller -peptider 15 fra hele celler eller virus omfatter principielt tre trin: rensning eller isolering af dyreceller, mikroorganismer eller fragmenter deraf; solubilisering af hydrofobe proteiner samt fjernelse af solubiliseringsmidlet, idet et ønsket antigen samtidig ved hjælp af et glycosid over-20 føres til komplekset på immunogen form (immunogent kompleks).

Rensning og isolering.

Virus med membran , mycoplasma, bakterier, 25 parasitter og dyreceller opkoncentreres og renses på kendt vis (se The Tools of Biochemistry T.G. Cooper,

John Wiley & Sons (1977) New York), f.eks. ved gel-filtrering eller centrifugering over en sukkergradient eller gradientcentrifugering gennem Bercoll 30 eller ved hulfiberdialyse. Når det gælder bakterier kan det være nødvendigt eller fordelagtigt først at lysere eller nedbryde cellevæggene med f.eks. ultralydeller Franchpressebehandling (reference se Cota-Robles and Stein, CRC Handbook of Microbiology Vol.

35 II (1973) side 833-844).

DK 162057B

5

Solubilisering.

De rensede dyreceller eller mikroorganismer eller fragmenter af disse blandes derefter med ikke-ioniske, ioniske eller amfoioniske detergenter eller 5 med detergenter på basis af en galdesyre, som anvendes i overskud. Typiske eksempler på egnede ikke-ioniske detergenter er polyglycolestere og -ethere af alifatiske eller aralylfatiske syrer eller alkoholerv Eksempler på disse er alkylpolyoxyethylenethere med 10 den almene formel cnH2n+l^OC^2CH2^xOH ^or^ortet C E , alkylphenylpolyoxyethylenethere indeholdende en

XI X

phenylring mellem alkylgruppen og polyoxyethylenkæden, forkortet C φ E , f.eks. Triton X-100 = tert, -n· x

Cg<|>Eg g (octylphenolether af polyethylenoxid) , acyl-15 polyoxyethylenestere, acylpolyoxyethylensobitanestere forkortet C sorbitan E„, f.eks, Tween 20, Tween 80,

ΓΧ X

β-D-alkylglucosider, f.eks. β-D-octylgrucosid. Også de nedenfor nævnte glycosider, især saponin, kan anvendes. Disse er dog svage detergenter og bør anvendes sammen 20 med andre detergenter. Typiske eksempler på egnede ioniske detergenter er galdesyre-detergenter, som f.eks. desoxycholat og cholat. Også konjugerede detergenter, som f.eks, taurodeoxycholat, glycodeoxycholat og glycocholat kan anvendes. Som amfoioniske 25 detergenter kan lysolecithih og syntetiske lyso-phospho-lider nævnes. Også blandinger af de ovennævnte detergenter kan anvendes.

Solubiliseringen kan også udføres med alkoholer, organiske opløsningsmidler eller små amfipatiske mole-* 30 kyler, såsom heptan-1,2,3-triol, hexan-l,2,3-triol, eddikesyre eller blandinger af disse indbyrdes eller med detergenter.

Solubiliseringsmidlet anvendes i overskud i forhold til mængden af lipid og hydrofobe proteiner.

35 Man blander hensigtsmæssigt celler eller mikroorganismer og solubiliseringsmiddel i forhold fra 1:3 til 1:10.

DK 162057B

6

Celler eller nikroorganismer og solubiliserings-middel blandes i en opløsning, der indeholder en puffer og eventuelt er saltholdig. Saltopløsningen molaritet ligger mellem 0,02 og 0,5 M, fortrinsvis mellem 0,05 5 og 0,25 M. 0,1-0,2M foretrækkes. Detergenten bør virke ca. 1 time ved stuetemperatur.

Som salt foretrækkes natriumchlorid, men også andre salte kan komme på tale, især alkalimetal-, jordalkalimetal- eller ammoniumsalte af stærke mineral-10 syrer og- organiske syrer såsom eddikesyre, tri- chloreddikesyre, myresyre eller oxalsyre. Alle puffere, som virker i pH'-intervallet fra 6,,5-9, er egnede.

Ved anvendelse af cholater og deoxycholater foretrækkes pH 8-9, og ved anvendelse af ikke ioniske detergenter 15 foretrækkes pH-7,4. Når organiske syrer anvendes til proteinsolubilisering, kan pufferen udelades.

Fremstilling af immuiiogent kompleks.

Når celler eller mikroorganismer solubiliseres, 20 dannes en blanding af solubiliseringsmiddel og celle- eller mikroorganismefragmenter (nedenfor benævnt fragmenter)'. Blandt fragmenterne genfindes ladede monomere antigene proteiner med hydrofobe regioner i komplekser sammen med solubiliseringsmidlet.

25 Det omhandlede hidtil ukendte immunogene kompleks fremstilles ved, at de ladede monomere antigene proteiner separeres fra solubiliseringsmidlet i nærværelse af, eller separeres fra solubiliseringsmidlet og direkte overføres til, en opløsning indeholdende mindst én tri-30 terpensaponin med hydrofobe og hydrofile regioner i en koncentration på mindst den kritiske micellære koncentration (CMC). De øvrige fragmenter fjernes inden, medens eller efter, fortrinsvis inden, komplekset ifølge opfindelsen fremstilles.

35 Komplekset ifølge opfindelsen kan fremstilles, enten .ved at solubiliseringsmidlet fjernes f.eks. ved dialyse, gelfiltrering eller chromatografi fra blandingen af solubiliseringsmiddel, ladede monomere

DK 162057 B

7 antigene proteiner, glycosid og evt. øvrige fragmenter, eller ved at de ladede, monomere antigene proteiner separeres fra den nævnte blanding f.eks. ved gradientcentrifugering, chromatografi eller elektroforese.

5 Det væsentlige ifølge opfindelsen er, at de monomere antigene proteiner separeres fra solubiliseringsmidlet under samtidig nærværelse af glycosidet eller efter separationen direkte overføres til glycosidet, af hvilket micelleformen bør forekomme. Når de monomere 10 antigene proteiner separeres fra solubiliseringsmidlet, således at de direkte kan bringes i kontakt med glycosidet, dannes det specielle kompleks ifølge opfindelsen. Det antages, at micelleformen af glycosidet udgør grobunden for dannelsen af komplekset, og at dette 15 dannes ved tiltrækning mellem hydrofobe regioner på glycosidmicellerne og hydrofobe regioner på membranproteinerne. Mængden af glycosid i komplekset varierer beroende på det anvendte glycosid og de kompleksbundne membranproteiner og ligger mellem 0,5 og 50 vægt%, især 20 mellem 0,5 og 25 vægt%, fortrinsvis mellem 0,5 og 15, ofte mellem 0,5 og 10 vægt%, specielt mellem 2 og 8 vægt%. Hvis de ladede antigene monomere proteiner separeres fra solubiliseringsmidlet i fravær af glycosider, dannes der derimod proteinmiceller af den 25 slags, som fremstilles ifølge EPC-ansøgning 81102231.6.

Det er hensigtsmæssigt at fjerne øvrige fragmenter ved gradientcentrifugering, idet sediroenta-tionskonstanten for de pågældende komponenter aftager i følgende rækkefølge: cellefragment, proteinkompleks 30 med solubiliseringsmiddel eller ifølge opfindelsen med glycosid, monomere proteiner og solubiliseringsmiddel.

Således kan øvrige fragmenter fjernes ved hjælp af gradientcentrifugering fra deres blanding med solubiliseringsmiddel og monomere proteiner, inden glyco-35 sidet tilsættes, og solubiliseringsmidlet fjernes f.eks. ved dialyse, gelfiltrering, chromatografi, eller de monomere proteiner separeres fra solubiliseringsmidlet f.eks. ved elektroforese, chromatografi

DK 162057B

8 eller gradientcentrifugering. Ved den sidstnævnte metode er det endog muligt at fjerne de øvrige fragmenter under samme· gradientcentrifugering, under hvilken komplekset dannes. Det er også muligt at 5 skille de øvrige cellekomponenter fra, efter komplekset er dannet i overensstemmelse med det ovenstående, f.eks. ved centrifugering, affinitetschromatografi eller gelfiltrering.

Glycosidet er, som det vil fremgå, en triterpen-10 saponin med hydrofobe og hydrofile regioner. Fortrinsvis anvendes de triterpensaponiner, som beskrives i R. Tsche-sche og Wulf, Chemie und Biologie der Saponine i Fort-schritte der Chemie organischer Naturstoffe udg. W.

Herz, H. Grisebach, G.W. Kirby vol. 30 (1973), såsom de 15 polære sure bisdesmosider, f.eks. saponinekstrakt fra Quillajabark Aralosid A, Chikusetsusaponin IV, Calendula-Glycosid C, Chikusetsusaponin V, Achyranthes-Saponin B, Calendula-Glycosid A, Aralosid B, Aralosid C, Putranjia-Saponin III, Bersamasaponosid, Putranjia-Saponin IV, 20 Trichosid A, Trichosid B, Saponasid A, Trichosid C,

Gyposid, Nutanosid, Dianthosid C, Saponasid D, fortrinsvis aescin fra Aesculus hippocastanum (Patt, T«, og W.

Winkler: Das Therapeutisch wirksamme Prinzip der Rosskastanie (Aesculus hippocastanumJ. Arzneimittel-25 forsch. 10(4), 273-275 (1960)) eller sapoalbin fra Gypsophilla struthium (Vochten, R., P. Joos og R.

Ruyssen: Physico-chemical-properties of sapoalbin and their relation to the foam stability. J. Pharm.

Belg. 42, 213-226 (1968), i særdeleshed sapo-30 ninekstrakt fra Quillaja saponaria Molina, først og fremmest DQ-ekstrakt som fremstilles ifølge K.

Dalsgaard: Saponin Adjuvants. Bull. Off. int. Epiz 77 (7-8), 1289-1295 (1972) og Quil A som fremstilles ifølge K. Dalsgaard: Saponin Adjuvants III, Archiv 35 fiir die Gesamte Virusforschung 44, 243-254 (1974).

Også blandinger af glycosider kan anvendes. Mængden af anvendt glycosid bør være mindst 1-3 gange større $nd den kritiske micelledannelseskoncentration (CMC)

DK 162057 B

9 for det pågældende glycosid, fortrinsvis mindst 5, især mindst 7-12 gange denne. Det antages at glycosidet i så fald kan opfange og bindes til de monomere former af membranproteinerne. Fortrinsvis anvendes Quil A, 5 som har en kritisk micelledannelseskocentration på 0,03 vægt%. Mængden af Quil A bør derfor være mindst 0,03 vægt%, i særdeleshed 0,05-0,5 vægt%, fortrinsvis 0,2 vægt%.

Separationen af de ladede monomere antigene 10 proteiner fra solubiliseringsmidlet er udført ved centrifugering, dialyse, elektroforese og forskellige chromatografiske metoder.

Centrifugeringsmetoden, 15 Den ifølge det ovenstående fremstillede blanding af fragmenterede celler eller mikroorganismer og solubiliseringsmiddel gradientcentrifugeres og lægges i et lag, f.eks. over en sukker- eller saltopløsning, indeholdende solubiliseringsmiddel, under hvilken der 20 foreligger en opløsning, som indeholder glycosidet, og har en koncentrationsgradient, såsom en sukkergradient, en gradient af glycerol, metrizeamid eller et tungmetalsalt, f.eks, CsCi (dvs. relativt inerte stoffer, som har passende massefylder og viskositeter 25 til at virke som gradientmateriale), f.eks. med de nedenstående for en sukkergradient angivne koncentrationer.

Gradientsystemet centrifugeres ved mindst 100.000 g. Som sukker kan monosaccharider, disaccharider såsom lactose, maltose og saccharose, men også trioser, tetro-30 ser samt glycerol anvendes. Fortrinsvis anvendes saccharose. Begyndelseskoncentrationen af sukker (øverst) i opløsningen med sukkergradienten er hensigtsmæssigt mere end 5, fortrinsvis 15-25 vægt% og slutkoncentrationen er mindst 20, fortrinsvis 25-60 vægt% (nederst i opløsningen).

35 Gradientopløsningen kan f.eks. bestå af et øvre lag med 5-25 vægt% sukkerindhold og et nedre lag med 20-60 vægt% sukkerindhold-. Der kan imidlertid også foreligge flere lag, hvorved koncentrationsforskellene mellem de enkelte lag sænkes

DK 162057B

10 tilsvarende«. Opløsnigen roed sukkergradienten indeholder et glycosid eller en blanding af glycosider. Glycosid-mængden bør være mindst 1-3 gange, fortrinsvis mindst 7-12 gange større end CMC, for Quil A mindst 0,02, 5 især mindst 0,05-0,5, fortrinsvis mindst mindst 0,2 vægt%.

I denne glycosidholdige gradient skilles solubiliserings-midlet fra, og komplekset mellem dette og proteinet omdannes til et protein-glycosidkompieks.

Ovenpå sukkergradientopløsningen foreligger et 10 lag af en sukker- eller tungmetalopløsning, - som indeholder et solubiliseringsmiddel eller en blanding af solubiliseringsmidler. Lipiderne forbliver i dette lag. Koncentrationen af solubiliseringsmidlet i dette lag er mindre end* eller den samme som i den påsatte blanding 15 af mikroorganismer eller celler og solubiliseringsmiddel og ligger hensigtsmæssigt mellem 0,12 og 3 vægt%, fortrinsvis mellem 0,75 og 1,5 vægt%, hvor 1% foretrækks.

Sukker·?· og saltkoncentrationen kan være den samme eller mindre end koncentrationen i det øvre lag af den glyco-20 sidholdige gradientopløsning nedenfor.

Efter centrifugering ved mindst 100 000 g i mindst 16 timer, fortrinsvis i mere end 20 timer ved 20°C, opsamles de proteinholdige fraktioner, som dialyseres mod en puffer (0,5 M til 0,001 M) fortrinsvis 25 0,005 M Tris-HCl, 0,01 M NaCl, pH 7,4 eller 0,2 M

ammoniumacetatpuffer, pH 7,0, og opkoncentreres, f.eks. som beskrevet i The Tools of Biochemistry af T.G.

Cooper edit. John Wiley & Sons (New York 1974), f.eks. ved lyofilisering, vakuumdialyse og ultrafiltrering.

30 under centrifugeringen sedimenterer alle bestanddele, hvorved solubiliseringsmidlet spaltes fra komplekset deraf med proteinet, og de monomere proteiner overføres til glycosidet og danner kompleks med dette. Ved den efterfølgende dialyse fjernes sukkeret. Komplekset kan 35 eventuelt renses yderligere, f.eks for frit glycosid ved gradientcentrifugering, f.eks. ved hjælp af en sukkergradientopløsning indeholdende 25-60 vægt% sukker, fortrinsvis 10-40 vægt% saccharose.

DK 162057 B

11

Dialysemetoden.

Efter rensningen af cellerne eller mikroorganis-merne som beskrevet ovenfor og efter de er blandet med solubiliseringsmiddel, kan blandingen af celler og 5 solubiliseringsmiddel i den ovenfor angivne puffer alternativt direkte blandes med mere end 1-3 gange, fortrinsvis mere end 7-12 gange CMC, for Quil A 0,05-2 vægt% glycosid, fortrinsvis 0,2 vægt% glycosid, og dialyseres mod en puffer såsom 0,5-0,001 M, for-10 trinsvis 0,005 M Tris-HCl, 0,01 M NaCi, pH 7,4, især 0,2 M ammoniumacetatpuffer, pH 7,0. Herved fjernes solubiliseringsmidlet i nærværelse af glycosidet.

Derefter kan det fremstillede membranproteinkompleks isoleres ved hjælp af sedimentationsgradientcentri-15 fugering, som beskrevet tidligere, dog undlades glycosidtilsætningen, og isoleres fra de øvrige fragmenter og frit glycosid.

Blandinger af celler eller mikroorganismer og solubiliseringsmiddel i puffer kan‘endog gradi-20 entcéntrifugéres-og f.eks. læggos i lag på en 5-60 vægt%'s sukkergradient i ovenstående puffer, fortrinsvis en 10-20 vægt%'s sukkergradient og centrifugeres ved mindst 150 000 g i mindst 20 minutter, fortrinsvis i 30 minutter ved 250 000 g. Herved 25 separeres øvrige fragmenter fra solubiliseringsmiddel-proteinkomplekset.

Den proteinholdige ovenstående væske, benævnt topfraktionen, udvindes og glycosidet tilsættes i en mængde på mere end 1-3 gange, fortrinsvis mere 30 end 7-12 gange CMC, for Quil A 0,05-0,5 vægt%, fortrinsvis 0,2 vægt%, og dialyseres mod en puffer: 0,5-0,001 M, især 0,005 M Tris-CHl, 0,01 M HCl, pH 7,4, fortrinsvis 0,2 M ammoniumacetat. Herved fjernes solubiliseringsmidlet i nærværelse af glycosidet.

35 Yderligere rensning kan udføres ved hjælp af sedimentationsgradientcentrifugering (se det foregående), f.eks.

i en sukkergradientopløsning indeholdende 5-60 vægt% sukker, fortrinsvis 19-40 vægt% sukker.

DK 162057 B

12

Elektroforesemetoden, ‘ Alternativt kan blandingen af fragmenterede mikroorganismer eller celler og solubiliseringsmiddel eller den proteinholdige ovenstående væske (fri for øvrige 5 fragmenter og frit solubiliseringsmiddel), som fremstilles, når denne blanding gradientcentrifugeres .. f . eks . ved hjælp af en 5-60 vægt%, fortrinsvis 10-20 vægt%, sukkergradient i en puffer, separeres elektroforetisk fra solubiliseringsmiddel 10 og overføres til en opløsning indeholdende mindst 1-3, fortrinsvis mindst 7-12 gange CMC, for Quil A 0,05-0,5 vægt% glycosider, fortrinsvis 0,2 vægt% glycosider. Herved adskilles de ladede monomere antigene proteiner fra solubiliseringsmidlet. Ved adskillelse ved hjælp af 15 elektroforese er det hensigtsmæssigt at solubiliserings-middel'-pufferopløsningen ikke indeholder ekstra tilsat salt, som kan virke forstyrrende på elektroforesen og forårsage for høj_temperatur, Man kan f.eks. anvende zoneelektroforese eller isotachoforese med eller 20 uden bærere. Sædvanlige bærematerialer såsom poly-acrylamid, agar, silicagel, stivelse, cellulose, poly-vinylchlorid, ionbyttere eller cefit kan anvendes.

Isolering og opkoncentrering af komplekset udføres som tidligere beskrevet. Yderligere rensning ved hjælp af 25 gradientcentrifugering kan udføres som beskrevet ovenfor.

Hvis der i udgangsmaterialet foreligger hydrofobe membranproteiner med forskellige ladninger eller vægt, kan man ved elektroforesen eller centrifugerings-30 metoden adskille disse fra hinanden og fremstille separate komplekser. Ved disse fremgangsmåder kan mån således separere og opkoncentrere komplekser af forskellige membranproteiner.

35 Chromatografiske metoder.

De solubiliserede proteiner kan eventuelt efter rensning fra cellefragment separeres fra solubiliseringsmidlet ved hjælp af chromatografiske metoder,

DK 162057 B

13 ved hvilke den antigene struktur adsorberes til et uopløseligt bæremateriale (matrix)/ som f.eks. kan bestå af cellulose, agarose, dextran, acrylamid eller glas. Forskellige ligander kobles til matrixen, som 5 derved opnår specifikke egenskaber, hvilket udnyttes under separationen. Sædvanligvis adsorberes det antigene stof, samtidig med at det anvendte solubiliserings-middel passerer uadsorberet gennem matrixen. Derefter sker en deadsorption af antigenet. Under deadsorptions-10 trinnet kan der ske en udveksling af solubiliserings- middel, salt og puffermateriale, hvorved solubiliserings-midlet kan erstattes af glycosidet og komplekset kan fremstilles.

Ved ionbytterchromatografi kobles ladede ligand-15 molekyler, som f.eks. diethylaminoethyl (DEAE), carboxy-methyl (CM) eller phosphatgrupper (P), til matrixen og anvendes henholdsvis til kation- og anionbyttere.

Ved anvendelse af forskelle i nettoladninger mellem de antigene stoffer og solubiliseringsmidlet forårsages 20 en separering af disse molekyler, I almindelighed er solubiliseringsmidlet uladet og proteinet ladet.

Eluering sker med en saltgradient, f.eks.. KC1·' eller NaCl, eller under pH-justering med phosphatpuffer, i nærværelse af et solubiliseringsmiddel (koncentration 25 og eksempel se under solubilisering ovenfor). Ved elueringen kan proteinerne renses, solubiliseringsmidlet kan ombyttes, eller komplekset kan dannes, hvis glycosidet tilsættes elueringsmidlet i stedet for solubiliseringsmidlet. Saltene fjernes senere ved hjælp 30 af dialyse.

Ved gelfiltrering udnyttes at solubiliseringsmidlet har mindre molekylstørrelse end de antigene stoffer og kommer ud i senere fraktioner.

Ved immunoaffinitets-chromatografi kan anti-35 stoffer irreversibelt bindes til den ovennævnte matrix, hvorefter den enestående specificitet og affinitet hos antistofferne udnyttes til oprensning af et ønsket antigen, Solubiliseringsmidlet har ikke affinitet til anti- 14

DK 162057B

stoffer. Elueringen sker ved mild denaturering, f,eks, ved pH-sænkning til ca. 4 og i nærværelse af solubili-seringsmiddel eller glycosid.

Ved lectin-chromatografi udnyttes ledt i ner , 5 der er en gruppe proteiner, som har evnen til at reagere reversibelt med specifikke sukkergrupper, hvilket gør det muligt for dem at binde f.eks. glycoproteiner. Lectinet kobles som ligand f.eks. til Sepharose (Pharmacia, Uppsala} eller indkøbes kommercielt 10 koblet til en passende matrix. Detergenter (solubiliser ingsmiddel} har ikke affinitet til den immobili-serede lectin. Det adsorberede antigene stof de-adsorberes sædvanligvis ved tilsætning af methyleret sukker, som f.eks. methylmannosid, methlyglucosid 15 og N-acetylgluoøsamin opløst i en pufferholdig saltopløsning i nærværelse af solubiliseringsmiddel eller glycosid.

Ved kovalent chromatografi bindes et antigen indeholdende en thiolgruppe ved en kovalent binding til en matrix. Thiolgruppen i antigenet bindes selektivt til en aktiveret thiolgruppe koblet til en passende matrix ved thio-disulfid udveksling. Denne binding er reversibel og det thiolbærenié' antigen kan, efter solubiliser ingsmidlet er skyllet bort, elueres ved reduktion

O C

af disulfidbindingen ved hjælp af mercaptoethanol eller dithiotriethol i nærværelse af solubiliseringsmiddel eller glycosid.

Hydrofob chromatografi. Denne teknik udnytter interaktionen mellem en immobiliseret hydrofob ligand/ f.eks. octyl eller phenyl, og hydrofobe arealer på antigenet. Denne teknik kan alternativt være en metode til at binde solubiliseringsmidlet fra blandingen til liganden, samtidig med at antigenet uadsorberet kan genvindes til forsat oparbejdning ifølge eksempel

O C

4 (dialysemetoden). Under andre betingelser kan antigenet bindes til liganden, medens solubiliseringsmidlet ikke har affinitet til liganden, hvorfor man fortsætter ifølge dialysemetoden. Man immobili-

DK 162057 B

15 serer ved høj ionstyrke med f.eks. ammonium-sulfat og eluerer ved lav ionstyrke med vand eller ethylenglycol.

Når komplekset indeholder membranproteiner fra 5 bakterier, er det fordelagtigt først at nedbryde cellevæggene, inden cellematerialet behandles ifølge ovenstående fremgangsmåde. Eksempler på bakterier, fra hvilke hydrofobe proteiner kan fremstilles, er f.eks. Escherichia, Staphylococci, Haemaophilus, f.eks.

10 H. influenzae, Bordetella, f.eks. B. pertussis,

Vibrio, f.eks. V. Cholerae, Salmonella, f.eks. S.

Typhi, S, paratyphi, fortrinsvis adherensfaktor hos Coli f.eks, pili K 88 og pbxinprotein hos f.eks. Salmonella eller ydre membranproteiner fra B. pertussis 15 og Neisseria meningitidis.

Eksempler på anvendelige virus med membran... er Orthomyxoviridae, såsom influenza A, B, C, Para-myxoviridae, især mæslingevirus, fåresygevirus, parainfluenza 1, 2, 3 og 4-virus, hundesygevirus, og 20 rinderspestvirus, Rhabdoviridae, især rabiesvirus, Retroviridae,især felint leukæmivirus og bovint leukæmivirus, Herpesviridae,især Pseudorabies, Corona-viridae, Togaviridae, såsom EEE, WEE, VEE (eastern, western and Venezuela equine encephalitis), gul-feber-25 virus, specielt bovint virusdiarrévirus, og europæisk svinpestvirus Arenaviridae Poxviridae, Bunyaviridae, Iridioviridae, specielt afrikansk svinepestvirus samt blandt uklassificerede virus human hepatitis B-virus og Marburg/Ebola-virus.

30 Eksempler på parasitter, som kan anvendes ifølge opfindelsen, er Protozoa, såsom Toxoplasma, f.eks. Toxoplasma gondii, Plasmodium f.eks. Plasmodium vivax, malariae, falciparium,

Telleria parvum, ovale, samt Filaroidae, fortrinsvis 35 Parafilaria og Onchocerca, Entamoeba histolytica, anaplasma af forskellige arter, Schistosoma, såsom Schistosoma haematobium, mansoni, japonicum, og Trypanosoma,f.eks. Trypanosoma gambiense, T. brusei eller congolesi.

DK 162057B

16 b) Det er også muligt at gå ud fra hydrofobe ikke-membranproteiner eller fra ikke-hydrofobe proteiner eller peptider. Ikke-hydrofobe proteiner eller peptider kan gøres hydrofobe ved at koble hydrofobe grupper 5 til dem. De ovennævnte proteiner kan stamme fra virus med eller uden. membran ·, bakterier, myko-plasma eller parasitter. Eksemplér på virus uden -membran indeholdende ikke hydrofobe proteiner er Picornaviridae f.eks. mund- og klovsygevirus, 10 poliovirus, Adenoviridae, Parvoviridae,f.eks.

kattepestvirus og svineparvovirus, Reoviridae (anses også for at have hydrofobe proteiner), f.eks.

Rotavirus. Eksempler på Mycoplasma er M. pneumoniae, mycoides, bovis, suis, hyorinos, orale, salivarium, 15 hominis og termentans.

Disse proteiner eller peptider renses som beskrevet under a) rensning og isolering.

De hydrofobe grupper, som kan kobles til de ikke-hydrofobe proteiner,er ligekædede, forgrenede, 20 mættede eller umættede alifatiske kæder med 1-8 carbon-atomer, helst 6-8 carbonatomer, små peptider med 1-5 aminosyrer,fortrinsvis 2-4 aminosyrer, valgt blandt Trp, Ile, Phe, Pro, Tyr, Leu, Var, især Tyr, cholesterolderivater, såsom cholinsyre og ursodeoxy-25 cholinsyre.

Disse hydrofobe grupper skal være bundet til grupper, såsom carboxy-, amino-, disulfid-, hydroxyl-, sulfhydryl- eller carbonylgrupper, f.eks. aldehydgrupper, som kan kobles til det ikke hydrofobe 30 protein.

Som sådanne grupper, med evne til at danne binding til det ikke-hydrofobe protein, vælges fortrinsvis carboxy-, aldehyd-, amino-, hydroxy-, eller disulfidderivater af methan, ethan, propan, butan, 35 pentan, hexan, heptan, octan samt peptider indeholdende Cys, Asp, Glu, Lys, fortinsvis octanal eller Tyr-Tyr-Tyr-Cys, -Asp eller -Glu. De hydrofobe grupper indeholdende de grupper, der er i stand til at danne

DK 162057 B

17 bindinger til ikke-hydrofobe proteiner, må opløses i vand ved hjælp af f.eks. de ovennævnte solubiliserings-midler og detergenter eller saltsyre, eddikesyre, iseddikesyre, base eller ammoniak, beroende på hvilket 5 stof, der skal opløses. Derefter justeres pH til det neutrale punkt uden der sker en udfældning af fast stof, idet man er opmærksom på, at man ikke får en pH-værdi, som denaturerer det protein, som den hydrofobe gruppe skal kobles til.

1 o Det hydrofobe molekyle sættes til det ikke- hydrofobe protein i et molforhold på 10:1 til 0,1:1 fortrinsvis 1:1,

Hydrofobe grupper indeholdende en carboxygruppe som koblingsmolekyle kan bindes til proteinet via 15 vandopløselige carbodiimider eller sammensatte an- hydrider. 1 det første tilfælde aktiveres carboxygruppen ved pH 5 med carbodiimid og blandes med proteinet opløst i en puffer med pH 8 og højt phosphatindhold. I det sidste tilfælde omsættes carboxyforbindelsen med iso-20 butylchlorformi at i nærværelse af triethylamin i dioxan eller acetonitril, og det. dannede anhydrid sættes til proteinet ved pH 8-9. Det er også muligt ved hjælp af hydrazin at omdanne carboxygruppen til hydrazid, som med aldehyder og ketoner i periodatoxyderede sukker-25 enheder i proteinet giver hydrazonforbindelser.

Aminogrupperne kan med salpetersyrling ved lav temperatur omdannes til diazoniumsalte, som giver azoforbindelser med Tyr, His og Lys.

Hydroxygrupperne kan med ravsyreanhydrid om-30 dannes til hemisuccinatderivater, som kan kobles ligesom carboxygrupper.

Aldehydgrupper kan omsættes med aminogrupper i proteinet til Schiffske baser.

Flere koblingsgrupper og -metoder er beskrevet i Journal of Immunological Methods, 59 (1983) 129 -35 143, 289 - 299, Methods in Enzymology vol, 93 side 280-333 og Analytical Biochemistry 116, 402 - 407 (1981) .

18

DK 1-62057 B

De således fremstillede proteiner eller pep-. tider, som indeholder hydrofobe grupper, kompleksbindes dernæst med glycosidet, som beskrevet under a), hvor man dog kan undlade de rensningstrin, hvor celle-5 fragmenter fjernes.

c) Man kan også gå ud fra hydrofile proteiner, som har indesluttede hydrofobe grupper, der kan gøres tilgængelige ved at denaturere proteinerne mildt, f.eks. ved lavt pH ca. 2,5, med 3M urinstof eller ved høj 10 temperatur over 70°C. Sådanne proteiner kan være immunoglobuliner, såsom Tg G, Ig M, Ig A, Ig D og Ig E. Immunoglobulinerne kan anvendes som anti-idiotypiske antistoffer. Proteinerne oprenses som proteinerne under b) og kompleksbindes dernæst til 15 glycosidet som beskrevet under a), hvor man undlader at udføre de rensningstrin, der tjener til at fjerne celle-fragmenter .

De immunogene komplekser fremstillet ifølge opfindelsen kan anvendes til specifik immunstimulering hos mennesker 20 eller dyr. De kan således anvendes som vaccine mod sygdomme, der er forårsagede af bakterier, mykoplasma, virus eller parasitter, samt i forskningsmæssigt øjemed til fremstilling af ønskede antistoffer mod membran-proteiner fra forskellige dyreceller.

25 Også blandinger af amfipatiske proteiner eller 1 peptider fra forskellige bakterier eller virus kan anvendes, når man vil fremstille vaccine mod flere forskellige sygdomme.

På basis af opfindelsen kan der tilvejebringes 30 human-eller veterinærmedicinske sammensætninger, som indeholder et iscom fremstillet ifølge opfindelsen eventuelt sammen med sædvanlige tilsætnings- eller fyldstoffer, fortrinsvis i form af en pufferopløsning af iscomet, f.eks. en TN-opløsning (se eksempel 1).

35 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de følgende udførelseseksempler under hen- · visning til tegningen, hvorpå

DK 162057B

19 fig. 1 er en grafisk afbildning af sedimentationskoefficienten for dels et proteinkompleks fremstillet ifølge opfindelsen,dels tilsvarende proteinmiceller uden glycosidtilsætning (eksempel 2), 5 fig. 2, 3, 4 og 5A og Bviser strukturen set i elektronmikroskop af forskellige proteinkomplekser fremstillet ifølge opfindelsen (hhv. eksempel 3, 4, 14 og 19), og fig. 6 er en grafisk afbildning af immunorespon-10 set af dels et antigenkompleks fremstillet ifølge opfindelsen, dels tilsvarende, proteinmiceller uden glycosidtilsætning (eksperiment 1).

Eksempel 1 15 Parainfluenza-3-virus U23, isoleret i Umeå, blev renset ved hjælp af centrifugering i 30 vægt% saccharose ved 100 000 g i en time ved 4°C. Bundfaldet blev opløst til en koncentration på ca. 10 mg/ml i 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4 og 0,1 M NaCl (TN), 1-5 mg/ml PI-3-virus 1 samme 20 puffer (TN) blev solubiliseret med 2 vægt% (slufc- 5 koncentration) Triton X-100 sammen med ca. 10 counts/ 3 minut H-mærkede virus (Luukkonen, A., C. Gamberg, E.

Renkonen (1979), Virology 76 side 55-59) i TN-puffer, Et prøvevolumen på ca, 200 ijI blev lagt i 25 et lag på en fase bestående af 300 yl TN-opløsning indeholdende 15% saccharose og 1% Triton X-100 og på en fase bestående af 12 ml TN-opløsning indeholdende 0,2 vægt% Quil A og en saccharosegradient, der gik fra 20-50 vægt%. Centrifugeringen blev udført ved 250 000 g 30 i 22 timer ved 20°C. Efter centrifugeringen blev fraktioner af 500 yl opsamlet fra den nederste fase, og prøver (20-50 yl) blev målt for radioaktivitet. De radioaktive proteinfraktioner blev hældt sammen og dialyseret mod 0,005 M Tris-HCl, 0,01 M NaCl, pH 7,4, 35 doseret i 10 ml flasker og opkoncentreret ved lyofili-sering i 18 timer i et Edwards frysetørringsapparat.

Det tilvirkede stof havde en sedimentationskoefficient på 24 S.

DK 162057 B

20

Yderligere rensning af komplekset blev udført ved centrifugering af komplekset ved hjælp af en 10-40 vægt%'s saccharosegradient.

5 Eksempel 2

Fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev gentaget, men med anvendelse af hesteinfluenza-virus (Solvalla, isoleret fra Solvalla, Stockholm). Forsøget blev gentaget uden tilsætning af glycosid (dvs. i princip ifølge 10 EPC-offentliggørelsesskrift nr. -37..931),og de således fremstillede proteinmiceller og de med glycosid fremstillede proteinkomplekser blev udsat for sedimentations-gradientcentrifugering gennem en 10-40 vægt% sukkeropløsning ved 280 000 g i 4 timer ved 4°C. Resultatet 15 fremgår af fig. 1, som også viser sedimentations-koefficienten for tyroglobulin som standard. (19 S ved pilen). Det fremgår at sedimentationskoefficienten for proteinmicellerne er 30 S og for glycosid-protein- micellerne 19 S. (Virusglycoproteinet blev mærket med 3 20 galaetoseoxidase- H-borhydrid-methoden) .

Eksempel 3

Fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev gentaget med mæslingevirus i stedet for paraiiif luenza-3-virus.

25 Der blev fremstillet et kompleks, som ved elektronmikroskopering udviste den karakteristiske struktur, som fremgår af fig. 2.

Eksempel 4 30 Rabiesvirus, tilvirkede ved RIV, Bilthoven, efter den metode, der er beskrevet af Van Wezel et al. (Develop. Biol. Standard (1978), 41, 159-168), koncentrer edes til 2 mg/ml i TN. Et mg virus blev gjort opløseligt med 100 mM octyl-8-D-glucosid og inkuberet i 35 45 minutter ved 20°C. Prøven blev lagt i et lag over en 50 vægt%'s sukkeropløsning og blev centrifugeret ved 250 000 g i 45 minutter ved 4°C. Den øverste fase blev opsamlet og Quil A blev tilsat til en koncentration på

DK 162057 B

21 O,2 vægt%.

Prøven sluttes inde i en celluloseslange og dialyseres ved 20°C i 72 timer under konstant om-røring/mod 1000 ml 0,15 M ammoniumacetatpuffer, som udskiftes 3 gange under dialysen. Det dialyserede 5 materiale indeholder rabiesviruskomplekset. En del af materialet renses yderligere ved centrifugering i en 10-40 vægt% sukkeropløsning ved 280 000 g i 4 timer ved o 4 C. Ved elektronmikroskopering ses den struktur, som fremgår af fig. 3.

10

Eksempel 5

Fremgangsmåden ifølge eksempel 4 gentages med mæslingevirus. Det opnåede kompleks udviste samme struktur, som det ifølge eksempel 3 fremstillede kompleks.

15

Eksempel 6

Parainfluenza-3-virus (U-23) blev renset ved saccharosegradientcentrifugering og opløst til en koncentration på 10 mg/ml i 0,02 M barbitonpuffer, pH 20 8,0, 0,24 M glucose (BG). 1-5 mg/ml Pi-3-virus i BG- puffer blev gjort opløselig med 2% Triton-X-100 sammen 5 3 med ca. 10 H-counts/minut-mærkede virus (ifølge ref. Luukkonen et al, 1977) i BG-puffer. Et prøvevoilumen på 1 ml blev anbragt i et lag over en 1%'s agarosegel 25 indeholdende 0,02 M barbitonpuffer, pH 8,0, og 0,02 vægt% Quil A. Agarosegelen fandtes indelukket i et rør med en ydre overflade på 85 mm og en højde på 25 mm. Overdelen og underdelen af røret blev begge tilsluttet til elektroforesepuffer indeholdende 0,02 30 M barbitonpuffer, pH 8,0. Den øvre beholder blev sluttet til en negativ elektrode,og den nedre beholder blev sluttet til en positiv elektrode. Elektroforesen blev gennemført ved 5 V/cm i 4 timer. Prøven blev opsamlet på anodesiden af gelen, og den blev analyseret med 35 hensyn til radioaktivitet. Prøven blev dialyseret mod 0,15 M ammoniumacetatpuffer, pH 7,0 og opkoncentreret ved lyofilisering.

Det fremstillede stof havde en sedimentations-

DK 162057 B

22 koefficient på ca. 20 S, målt på samme måde som i eksempel 2.

Yderligere rensning af komplekset blev udført ved centrifugering af komplekset gennem en 10-40 vægt%'s 5 saceharosegradient.

Eksempel 7

Toxoplasma gondii (fået fra Tage Waller, Statens veterinærmedicinske anstalt) blev renset ved filtrering 10 gennem bomuld· og ved centrifugering i 30 vægt% saccharose ved 100 000 g i 20 minutter ved 4°C. Det rensede materiale blev opløst til en koncentration på ca. 5 mg/ml i 0,05 M Tris-HCl, pH 7,4 og 0,1 M NaCl (TN). 1 mg Toxoplasma gondii blev solubiliseret i 5% 15 octyl-p-D-glucosid og 5% saponin ifølge "An investigation of the antigenic structure of Toxoplasma gondii",

Parasite Immunology 1981, 3, 235 - 248, sammen med ca.

10 counts/minut °H-mærket toxoplasma (Luukkonen et al., 1977) i TN-puffer. Et prøvevolumen på ca. 200 iil blev 20 anbragt i et lag over 300 ill 15% saccharose indeholdende 1% Triton X-100 i TN og over 12 ml TN-opløsning indeholdende en saccharosegradient fra 20-50 vægt% og 0,2 vægt% Quil A. Centrifugering blev udført ved 250 000 g i 18 timer ved 20°C, Efter centrifugeringen blev gradi-25 entopløsningen udtaget i fraktioner på 500 -μΙ, og prøver på 20-50 yl blev målt for radioaktivitet. To forskellige radioaktive toppe kunne detekteres. Fraktionerne indenfor de respektive toppe blev slået sammen (hver top for sig), dialyseret og opkoncentreret ved frysetørring som angivet 30 i eksempel 1. Komplekset med Quil A havde en lavere sedimentationskoefficient end proteinmiceller fremstillet fra samme parasit.

Eksempel 8 E. coli bakterier med plasmid pili K 88 blev 35 vibreret mekanisk og udfaldet 3 gange ved det isoelektriske punkt. Derefter blev materialet behandlet på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Man fremstillede komplekser med de$ karakteristiske struktur, som vises i fig. 2 og 3.

DK 162057B

23

Eksempel 9

Fremgangsmåden ifølge eksempel 8 blev gentaget med Salmonella, som indeholdt porinprotein. Man fremstillede komplekser med den karakteristiske struktur, som 5 vises i fig. 2 og 3.

Eksempel 10

Nyreepitelceller fra katte, som var inficerede med felint leukæmivirus, blev behandlet ved fremgangs-10 måden ifølge eksempel 1. Man fremstillede komplekser med den karakteristiske struktur, som fremgår af fig. 2 og 3.

Eksempel 11 15 Nyreepitelceller, som var omdannet med bovint leukæmivirus, blev behandlet ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1. Man fremstillede komplekser med den karakteristiske struktur, som fremgår af fig. 2 og 3.

20 Eksempel .12

Parainfluenza-3-virus U 23 blev renset og proteinkomplekser blev fremstillet ifølge fremgangsmåden i eksempel 1, men med den forskel, at saccharosegradien-ten i TN fra 20 til 50 vægt% indeholder andre saponiner 25 end Quil A. To kommercielt tilgængelige saponiner, Merck "Weiss”, rein 5140023 og Sc, Lickardt "S", Schuchardt,

Munchen blev testet . (Saponiner på ren form. Fabrikanten vil ikke opgive produkternes art. De adskiller sig ved tyndtlagschromatografi fra Quil A). Der blev frem-30 stillet komplekser, som havde sedimentationskoefficienter på 24 S og udviste samme struktur som det ifølge eksempel 3 fremstillede kompleks.

Eksempel 13 35 5 mg mæslingevirus blev gjort opløselig ifølge fremgangsmåden i eksempel 3 og blev anbragt på en anion-bytter af typen DEAE cellulose. Ionbytteren blev opbevaret i en kolonne med et volumen på 20 ml og reagerede 24

DK 162057B

til en ligevægt med 0,01 M phosphatpuffer, pH 7,2, 0,5 vægt% octyl-p-D-glucosid. Prøvematerialet blev tilført til ionbytteren,og ikke adsorberet materiale blev bort-vasket ved gennemskylning med 5' søjlevolumener 0,01 M 5 phosphatpuffer, pH 7,2, 0,5 vægt% octyl-|3-D-glucosid, hvorefter adsorberet materiale blev elueret ved at sætte en opløsning indeholdende 0,01 M phosphat, pH 7,2, 0,5 vægt% octyl-p-^D-glucosid og med en saltgradient fra 0 til 0,5 M NaCl til kolonnen. De fraktioner, hvori 10 mæslingemembranproteiner blev identificeret, blev slået sammen og tilsat Quil A til 0,1 vægt%, og de blev dialyseret mod 0,05 M ammoniumacetat, pH 7,0. Man fremstillede komplekser med den karakteristiske struktur, som fremgår af fig. 2 og 3.

15

Eksempel 14 22 nm partikler fra Hepatitis B-virus, der er fået fra London School of Tropical Medicine and Hygiene (England), blev resuspenderet til en koncentration på 20 1 mg/ml i TN. 0,3 mg protein fra 22 nm partikler blev gjort opløseligt med 2 vol% Triton X-100, 0/5 M NaCl og blev inkuberet i 16 timer ved 37°C. Herefter blev der fortsat ved en gentagelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 1. Det fremstillede kompleks havde en sedimen-25 tationskoefficient på 20 S. Der blev fremstillet et kompleks som ved elektronmikroskopisk undersøgelse udviste en struktur, som fremgår af fig. 4. Denne struktur afviger fra den i fig. 2 angivne struktur, ved at den består af dele af denne struktur.

30

Eksempel 15 3 mg bovint diarrévirus (B DV) opløst i TN, blev solubiliseret ved tilsætning af Triton X-100 til 1 vol%. Blandingen blev omrørt i 2 timer ved stuetempe-35 ratur. Virus,·solubiliseret på denne måde, blev tilført til en lectinkolonne, bestående af lectinen Lentil immo-. biliseret på eller i Sepharose 4 B (Pharmacia, Uppsala). Kolonnen bringes til ligevægt med TN, og efter virus-

DK 162057 B

25 materialet er tilført kolonnen, vaskes den med 5 søjlevolumener TN indeholdende 0,1 vol% Triton X-100 og derefter med 10 søjlevolumener TN. Proteiner fra virussens membran deadsorberes ved at føre en elueringspuffer 5 bestående af 0,2 M methyl-a-D-mannosid og 0,5 vægt% oc-tyl-p-D-glucosid opløst i TN gennem kolonnen. Fraktionerne indeholdende proteiner fra virussens membran opsamles og tilføres Quil A til 0,1 vægt%. Blandingen dialyseres mod 0,05 M ammoniumacetat pH 7,0 ved 4°C i 10 3 døgn med 3 pufferudskiftninger på 1 liter.

Slutproduktet lyofiliseres, og ved elektronmikroskopering fremstår (komplekser) strukturer, som udgøres af dele af komplekset i fig. 4. Det fremstillede stof havde en sedimentationskoefficient på 20 S.

15

Eksempel 16

Poliovirus dræbes med formalin og renses ved hjælp af kendt metodik, f.eks. ved ultrafiltrering fulgt af gelchromatografi i Sepharose (Pharmacia, Uppsala,sve-20 rige) og til sidst af en massefyldecentrifugering i caesium-chlorid.

Virussen solubiliseres i en passende puffer, f.eks. TN, som indeholder et solubiliseringsmiddel, f.eks. 2% SDS (natriumdodecylsulfat), som opvarmes til 25 90°C i 2 minutter. Virusproteinerne separeres ved elek-troforese i en 13% polyacrylamidgel indeholdende 0,1% SDS. Proteinerne i gelen identificeres efter farvning med Coomassie Blue R 250. VP-3 er et af virusproteinerne med en molekylvægt på ca. 26.000 dalton . Dette virus-30 proteinbånd skæres ud af gelen og ekstraheres fra gelen ved transversal elektroforese.

Det ekstraherede materiale opløses i TN indeholdende solubiliseringsmidlet 2% Triton X-100. Denne blanding anvendes dernæst til fremstilling af protein-35 komplekser (iscomer) ifølge centrifugeringsmetoden, se eksempel 1. Ved en elektronmikroskopisk undersøgelse udviser præparatet den karakteristiske struktur, som fremgår af fig. 3.

26 ·

DK 16.2057 B

Eksempel 17

Renset, dræbt poliovirus, produceret ved RIV, Bilthoven, · opløses i 67 vol% eddikesyre indeholdende 0,1 M MgC^. Virusmaterialet ultracentrifugeres derefter i 1 time 5 ved 100.000 g, og supernatanten, som kun indeholder virusproteiner, udtages og dialyseres i nærværelse af 0,1 vægt% Quil A mod 0,01 M Tris, 0,14 M NaCl, pH 7,4.

Det opnåede kompleks udviste sammen struktur, som det ifølge eksempel 3 fremstillede kompleks.

10

Eksempel 18

Ydre membranproteiner fra Neisseria meningitidis, scm man fik på frysetørret form fra National Institute of Health, Holland, blev opløst i TN indeholdende 2 vægt% 15 octyl-3-D-glucosid og 0,1 vægt% Quil A og behandlet ved samme fremgangsmåde som i eksempel 4. Man opnåede et kompleks med en sedimentationskoéfficient på 20 S målt på samme måde som i eksempel 2.

20 Eksempel 19

Peptider med hydrofobe aminosyrer. Mund- og klov-syge-peptid 144-159 0 Kaufbenren. VP-1 syntetiseret med 0,1,2,3 eller 4 tyrosingrupper, der er koblede til den ene ende (kommercielt fremstillede), anvendes. Peptidet 25 opløses i en minimal mængde 67 vol% eddikesyre, neutraliseres med 25% ammoniak og sættes til 0,5 M ammoniumacetat med Aq. dest. (detergent til 2% slutkoncentration).

0,1% Glycosid tilsættes, og blandingen dialyseres mod 0,05 M ammoniumacetat, pH 7. (Dialyseslange Spectra Por 30 6 MWCO 1.000).

Mus blev vaccineret to gange med 50 ug med 2 ugers mellemrum.

Peptid/antal Tyr ELISA-værdi (antistoffer) 2. . udtagelse .._ 35 0 0,005 1 0,217 2 0,311 3 0,347 _4_0,346_

DK 162057B

27

At komplekset er dannet, kan vises ved elektronmikroskopi (se fig. 5), hvor man har observeret en sfærisk, elektrontæt partikel med længden 20-40 nm og bredden 10 nm. Andre størrelser er også forekommet.

5 I fig. 5A vises EM-billedet af peptidet koblet til tre tyrosingrupper, og i fig. 5B vises EM-billedet af peptidet koblet til fire tyrosingrupper.

Eksempel 20 10 IgG fra mus renset ved kendte metoder (Van den

Branden, M. de Coen, JL, Kanarek, L and Ruyschaert (1981) and Molecular Immunology 1£, side 621-631 (1981)) eller opkoncentreret i ammoniumsulfatopløsning (Conradie J.E., Govender M., Visser L., Journal of Immunological 15 Methods, vol. 59, side 289-299, 1983) dialyseres natten over i kølerum mod 1 liter 0,15 M phosphateitratpuffer (PC), pH 2. Derefter tilsættes 2% detergent (f. eks. octyl-β-D-glucosid). Hvis der anvendes en detergent, som har en lav kritisk micellær koncentration (CMC), 20 bør detergenten udskiftes inden dialysen startes. Blandingen dialyseres mod PC pH 7. Efter 1 time tilsættes Quil A til en slutkoncentration på 0,05%, og dialysen fortsættes mod. PC pH 7 i et døgn i kølerum.

Dannelse af komplekset påvises ved centrifuge-25 ring gennem en 5-30%'s saccharosegradient i 3,3 timer ved 40.000 rpm i en Beckman SW-60 rotor. Komplekset de-tekteres i gradienten ved hjælp af ELISA-teknik.

Eksperiment 1 3 0 Sammenligning mellem den immunogene effekt af.

membranproteinkomplekser fremstillet med Quil A -ifølge opfindelsen og de tilsvarende membranproteinmiceller fremstillet uden glycosidtilsætning.

25 mus (BALB C, Bomhollgard, Danmark, vægt ca.

35 20 g) blev opdelt i 5 grupper, og musene indenfor grupperne blev immuniseret 2 gange med 3 ugers mellemrum henholdsvis med ren pufferopløsning (PBS), 0,1 yg, 0,5 yg og 5 yg af komplekset fremstillet ud fra membran-

DK 162057B

28 proteiner fra influenzavirus og Quil A i 100 μΐ PBS, ifølge eksempel 1 og med 5 ug membranproteinmiceller uden glycosid, fremstillet ifølge EPC-ansøgning 81102213.6.

Der blev indsamlet serum fra musene hver 5 uge indtil forsøgets afslutning. Immunresponset blev målt i serum ved hjælp af ELISA-teknik. Voller, Bidwell og Bartlett 1980 Enzyme-linked Immunosorbent Assay side 359-371. I Manual of Clinical Immunology, American Society for Microbiology, Washington.

10 Resultatet vises i fig. 6. Det fremgår at det med Quil A fremstillede antigenkompleks giver et bedre immunrespons end de tilsvarende proteinmiceller uden tilsætning af Quil A. 0,1 yg af det med Quil A fremstillede proteinmembrankompleks inducerer et stærkere immun-15 renspons end 5 yg af proteinmicellerne uden tilsætning af glycosidet.

Eksperiment 2

Sammenligning mellem immunogen effekt og bi-20 virkninger hos membranproteinkomplekser fremstillet med Quil A ifølge opfindelsen og hos tilsvarende membranproteinmiceller blandet med glycosidet som adjuvans.

30 Marsvin af avl fra Statens Veterinær Medicinske Anstalt (Sverige ) indgik i forsøget. De blev for-25 delt på 5 grupper af 6 dyr og vaccineret henholdsvis med proteinmiceller (P) fra influenzavirus (stamme Sol-valla) og membranproteinkomplekser fra samme influenzavirus fremstillet med glycosid Quil A (GP) ifølge tabel I. Fremstilling ifølge eksempel 2. 6 Marsvin indgik som 30 livaccinerede kontrolindivider. GP-Komplekset var renset for frit glycosid ved saccharosegradientcentrifugering. Resultaterne fremgår af tabel I. P-Micellerne giver.ligesom GP-komplekset minimale reaktioner, og GP-komplekset giver tydeligt højere antistofrespons end P-micellerne.

35 En blanding af 10 yg frit glycosid med P-miceller forårsager milde reaktioner, men der ses ingen adjuvanseffekt. Tilsætning af 100 yg frit glycosid giver stærke lokale reaktioner i form af rødmen og opsvulmning og

DK 162057B

29 et højere antistofrespons end P-micellevaccinen, uden fri Quil A.

Tabel I

5 Immunresponset mod influenzavirus i marsvineserum målt ved hjælp af hemagglutinationsinhibitions (HI)-test efter to vaccinationer med 4 ugers mellemrum. Serummet er udtaget 10 dage efter den anden vaccination.

P = 1 yg proteinmicelle bestående af influenzavirus-10 peplomerer (H og N).

P + 10 = 1 yg proteinmiceller + 10 yg frit glycQsid.

P + 100 = 1 yg proteinmiceller + 100 yg frit glycosid.

GP = 1 yg proteinkompleks fremstillet med glycosid indeholdende mindre end 0,1 yg frit glycosid.

15 - ingen reaktion + svag rødmen ++ let rødmen +++ stærk rødmen og nekroser.

P P + 10 P + 100 GB

20 n HI-titer rlog/1) M ± SD 6 dyr 7,9+2,3 7,5±1,5 10,3+3,1 9,7±0,6

Lokal reaktion - + +++ 1) ikke vaccinerende marsvin havde tittere på 2 ;(6 dyr) .

25 Eksperiment 3

Membranproteinkomplekser fremstillet ifølge eksempel 1 og renset yderligere ved centrifugering gennem en 10-40%'s saccharosegradient blev testede for immunogen effekt. Denne præparation indeholder ikke påvise-30 lige mængder fri Quil A (< 0,02 vægt%) analyseret ved en metode baseret på Quil A's 1-ytiske aktivitet.. Den lytiske aktivitet blev undersøgt på bovine, røde blodlegemer. Blodlegemerne var inkorporerede i en agarose-gel ved en koncentration på 0,05%. Agarosegelen blev 35 placeret i et elektroforetisk system, hvor Quil A bevæger sig mod anoden og lyserer blodcellerne. Den lyserede zone har form som en raket, og glycosidmængden er proportional med længden af raketten, som blev gjort synlig

DK 162057 B

30 ved proteinfarvning med Coomasie Brilliant Blue. Ved denne metode kan koncentrationer på 0,02% glycosid eller mere bestemmes (Sundqvist et al. Biochemical and Biophysical research communications, vol. 114, side 699-704, 5 1983).

Ved sedimentationshastighedsanalyse har det yderligere rensede materiale samme sedimentationskoefficient som det ikke rensede materiale. Ved elektronmikroskopering iagttoges partikler med sairme morfologi (se fig.

10 2 og 3). Ved vaccination af mus var materialet ligeså aktivt som ikke renset materiale til stimulering af antistofrespons. I et eksperiment var henholdsvis 1 yg og 0,1 yg influenzavirusproteinkompleks fremstillet med Quil A tilsætning og renset ved to gradientcentrifuge-15 ringer ifølge det ovenstående ligeså effektive som de tilsvarende ikke yderligere rensede materialer. Ovenstående resultat viser , at komplekserne er stabile og effektivt immunogene uden påviselige mængder af fri Quil A.

20 Eksperiment 4

Tre forskellige vacciner med Hepatidis Bs (HBs) antigen blev hver testet på 4 mus med doser på 5 yg HBs antigen. De tre vacciner var iscomer fremstillede ifølge eksempel 14, intakte 22 nm partikler, som svarer til 25 en kommercielt tilgængelig vaccine og en eksperimentel vaccine, hvor tilsvarende HBs proteiner forelå på micelleform og var fremstillede ifølge EPC-ansøgning 81102213.6. Antistofresponset blev vurderet ved hjælp af ELISA-metodik.

30

Tabel II

Antistofrespons i museserum mod HBs antigen målt ved ELISA.

Iscomer 22 nm partikler miceller .35 1,343 0,603 0,569 1,788 0,598 0,240 1,841 0,888 0,273 1,884 0,892 ELISA extinktionsværdier aflæst ved 495 nm.

DK 162057 B

31

Det fremgår af tabel II, at mus immuniserede med iscomer responderede med betydelig højere antistof-tittere end HBs vacciner indeholdende intakte 22 nm partikler eller miceller.

5

Eksperiment 5 I et vaccinationsforsøg med testinfektioner af en patogen rabiesstamme (CVS) ér iscomer-f indeholdende membranproteiner fra rabiesvirus fremstillet ifølge 10 eksempel 4 blevet testet på mus. Musene blev vaccineret en gang med en dosis ifølge tabel III. Musene blev 14 dage senere testinficerede med den musepatogene CVS-stamr me med en dosis, der var 40 gange så stor som LD50.

15 Tabel III

Vaccinationsdosis (yg) Overlevende/totalt antal dyr 4,2 18/19 0,84 15/18 0,17 10/20 20 — 0/20

Af tabellen fremgår det, at iscomvaccinen foranlediger beskyttende immunitet.

De hidtil ukendte antigene komplekser ifølge opfindelsen kan lagres som lyofiliserede præparater eller 25 som vandige suspensioner. Til indgivelse foreligger de hensigtsmæssigt i et opløsningsmiddel, som f.eks. fysiologisk natriumchloridopløsning. Fortrinsvis anvendes 0,1 M NaCl-opløsning, pH 7,2-7,6. pH-Værdien justeres med 0,05 M Tris-HCl. Andre puffere kan imidlertid også 30 anvendes.

De hidtil ukendte proteinkomplekser ifølge opfindelsen har en stærkere immunogen effekt - ca.. 10 ofte mere end 10 gange stærkere - end proteinmiceller, som fremstilles uden glycosid, og som ikke blandes med nogen 35 adjuvans. Hvis de tilsvarende proteinmiceller. skal opnå " samme immunogene effekt ved samme proteindosis, skal de blandes med en så stor mængde glycosid eller andet adjuvans, at bivirkningerne bliver alt for store.

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et immuno-gent kompleks indeholdende antigene proteiner eller pep-10 tider med hydrofobe regioner, hvilket kompleks har en åben sfærisk struktur bestående af cirkulære underen-heder eller dele af den sfæriske struktur, og hvilket kompleks sædvanligvis har lavere sedimentationskonstant end tilsvarende miceller og højere sedimentationskon-15 stant end den tilsvarende monomere form af protein eller peptid, valgt blandt amfipatiske proteiner eller peptider eller blandt sådanne indeholdende virus, bakterier, mycoplasma, parasitter eller dyreceller, kendetegnet ved, at man blander mindst én af 20 ovennævnte komponenter med mindst ét solubiliserings-middel, hvorved der dannes et kompleks mellem amfipatiske antigene proteiner eller peptider og solubiliser ingsmidlet, hvorefter de amfipatiske antigene proteiner eller peptider separeres fra solubiliseringsmid-25 let i nærværelse af, eller separeres fra solubiliserings-midlet og direkte overføres til, en opløsning indeholdende mindst én triterpensaponin med hydrofobe og hydrofile regioner i en koncentration på mindst den kritiske micellære koncentration (CMC).

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at man anvender triterpensaponiner valgt fra gruppen Quillaja saponaria Molina.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man anvender peptider valgt 35 fra gruppen bestående af amfipatiske peptider og ikke-hydrofobe peptider, hvilke ikke-hydrofobe peptider er gjort hydrofobe ved kobling til hydrofobe grupper. DK 162057B eller amfipatiske peptider indeholdende ikke-tilgænge-lige hydrofobe grupper, som er gjort tilgængelige ved svag denaturering.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-5 n e t ved, at man anvender membranproteiner valgt fra gruppen bestående af Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rabdoviridae, Togaviridae, Herpesviridae og hepatit-B- virus, membranproteiner fra toxoplasma og Picornaviri-dae.

5. Fremgangsmåde til fremstilling af et immuno- kompleks ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man anvender en opløsning indeholdende solubilise-ringsmiddel og sukker, hvor sukkeret har en koncentration, der ikke er højere end koncentrationen i den 15 øvre del af den triterpensaponinholdige sukkergradient, og koncentrationen af solubiliseringsmidlet holdes på 0,25 til 3 vægt%.