JPH07112983B2 - 免疫原性複合物 - Google Patents

免疫原性複合物

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JPH07112983B2
JPH07112983B2 JP58195132A JP19513283A JPH07112983B2 JP H07112983 B2 JPH07112983 B2 JP H07112983B2 JP 58195132 A JP58195132 A JP 58195132A JP 19513283 A JP19513283 A JP 19513283A JP H07112983 B2 JPH07112983 B2 JP H07112983B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗原性蛋白質と、ウイルス、マイコプラズ
マ、バクテリア、寄生虫または動物細胞からのペプチド
とのあいだの免疫原性複合物つまりいわゆるイスコム
（iscom）に関する。本発明はまた、それらの製造方法
およびそれらを免疫刺激剤およびワクチンとして用いる
ことに関する。
死滅ウイルスたとへばインフレンザウイルスはすぐれた
抗原効果を有することが知られている。しかしそれら
は、かなりに精製したあとでさえも発熱的である。防禦
免疫性を誘導するに重要である成分を分けることにより
発熱効果を避けられたが、免疫原性はしばしば十分に強
くはなくなる。それで免疫反応を増加さすためには、分
離された抗原（サブユニツト）を含有するそれらのワク
チンに適当なアジユバントを導入せねばならない。他
方、有効なアジユバントは、これまで用いられた方式で
は、マイナスの副作用をおこす。アジユバント含有ワク
チンは、それで、発熱をおこす点では、全ウイルスを基
礎とするワクチンと同様に具合悪いのである。
免疫原性を増加さすために、リポゾームの表面に捕捉さ
れているかまたは結合されていた、デタージエントで取
り出された膜蛋白質が製造された（EPC願7940083,0）。
デタージヤントを除いた、リポゾーム中膜蛋白質はUSP4
148876に記載されている。デタージエント不含の単一ラ
メラのリポゾーム生成物中にアジユバントを添加するこ
とは、USP4196191に記載されている（その効果について
報告はない）。USP4117113は、ウイルス抗原を含有す
る、マイナスに荷電したリポゾームを記載している。イ
ンフルエンザ赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含
有するリポゾーム中にアジユバントとしてマイコバクテ
リアの細胞壁を加えると、よりすぐれた免疫反応を与え
る。ジフテリアトキソイドを含有するマイナスに帯電し
たリポゾームに死滅結核菌、百日咳菌およびサポニンの
ようなアジユバントを加えると、やはりよりよい免疫反
応が得られた（USP4053585）。しかし、上記した脂質含
有膜蛋白質生成物はすべて、長期保存、凍結乾燥または
不注意な扱いたとへば高温で不安定である。
デタージエント不含および脂質不含の蛋白質ミセルもま
たワクチンとして生産された。Semliki Forestウイルス
（SFV）の膜蛋白質のミセルがSFVに対する循環抗体の形
成を刺激しそしてSFVによる胎児感染に対してマウスを
保護する。他方、パラインフレンザ−３−ウイルスの膜
蛋白質は、ミセルに油アジユバントを混合しないと、羊
における抗体形成を刺激しないし、肺炎をおこすPI−３
−培養物の投与に対して保護しない。オイルアドジユバ
ントは、感染部位において、局所的反応の形で副作用を
おこすのがふつうである。（EPC願81102213.6）。
本発明の目的はこれらの欠点を避け、高い免疫原性を有
し、副作用のない貯蔵に安定な膜蛋白質複合物を提供す
ることである。このことは、蛋白質の疎水性領域と、ウ
イルス、マイコプラズマ細菌、動物細胞または寄生虫よ
りのペプチドとのあいだの脂質不含複合物を用いて達成
される。この複合物は、１種または１種より多くの配糖
体の添加で製造される。これらの新規複合物は、配糖体
無添加で生ずる相当する蛋白質ミセルとは別の電顕下で
の形態学的構造を有する。これらのミセルは放射状に配
列されたスパイクを有する緊密な中心コアを有するが、
本発明による複合物は、円状サブユニツトまたは球状構
造の部分より成立つ開放球状構造を有している（第２図
および第３図参照）。本発明の複合物およびその部分
は、また、相当するミセルよりより低い沈降定数（第１
図をみよ）を有し、そして、蛋白質またはペプチドの相
当する単量体形より高い沈降定数を有する。
配糖体を添加して製造した本発明による複合物は、配糖
体無添加で製造される相当する蛋白質ミセル、または蛋
白質分子と可溶化剤（単量体形）または脂質たとへばビ
ロソームに結合した蛋白質分子よりすぐれた免疫原性を
有する。それで膜蛋白質の投与量は、約1/10または以下
に減少させうる。
配糖体の疎水性領域と結合させる疎水性領域を有する蛋
白質またはペプチドは Ａ） エンベロープを有するウイルス、バクテリア、マ
イコプラズマ寄生虫または動物細胞よりの膜蛋白質また
は膜ペプチドに由来するかそれら自体である、親水性お
よび疎水性の基をする両親媒性の蛋白質またはペプチ
ド、またはハイブリドDNA技術で生ずるそのような蛋白
質またはペプチド、または合成で生ずるそのような分
子、 Ｂ） 親水性蛋白質またはペプチドに疎水性基を結合さ
せて生成させた両親媒性のもの。それらの蛋白質または
ペプチドは、ウイルス、バクテリア、マイコプラズマ、
寄生虫に由来しうるし、またはハイブリドDNA技術で合
成または採取しうる。
Ｃ） 親水性蛋白質の到達され得ない疎水性の部分を化
学的手段により到達しうるようにした両親媒性蛋白質ま
たはペプチド。それらの蛋白質は上記したような微生物
または細胞に由来しうるし、またはハイブリドDNA技術
で得られる、または、合成されたものでありうる。
複合物の調製 ａ） 全細胞に由来する膜蛋白質または膜ペプチドの調
製に関しては、複合物は原則的に３段階で調製する。動
物細胞または微生物またはそれらの断片を精製し；疎水
性の蛋白質を可溶化し可溶化剤を除き、同時に、免疫原
性の形状（免疫原性複合物）の、複合物とした望む抗原
を配糖体を用いて移す。
精製および分離 ウイルス、マイコプラズマ、細菌、寄生虫および動物細
胞を既知の方法（たとへば、“The Tools of Biochemis
try,"T.G.Cooper,John Wiley ＆ Sons（1977）New York
をみよ、これを本明細書の参照文献として引用する）、
たとへばゲル濾過または糖グラジエントを通しての遠心
またはpercolを通してのグラジエント遠心またはホロウ
フアバー フアイアライシス（hollow fiber fialysi
s）で濃縮しそして精製する。細菌では、たとへば超音
波またはフレンチプレス処理で細胞壁をまず融解または
破壊するのが有利である。たとへば、本明細書の参考文
献として引用する、Cota−Robles and Stein,CRC Handb
ook of Microbiology Vol II（1973）、833−844頁をみ
よ。
可溶化 精製された動物細胞または微生物またはそれらのフラグ
メントを、非イオン性、イオン性または両性のイオン性
のデタージエント没食子酸をベースとするデタージエン
トの過剰と混合する。適当な非イオン性デタージエント
の代表的な例は、脂肪族または芳香脂肪族の酸およびア
ルコールを用いたポリグリコールエステルおよびポリグ
リコールエーテルである。これらの例は、 CnH2n+1（OCH2CH2）xOHの一般式のアルキルポリオキシ
エチレンエーテル（CnExと略記）；アルキル基とポリオ
キシエチレン鎖とのあいだにフエニル環を含有するアル
キルフエニルポリオキシエチレンエーテル（CnPExと略
記）、たとへばTritonX−100＝３級−C8E9.6（ポリエチ
レンオキサイドのオクチルフエノールエーテル）、アシ
ルポリオキシエチレンエステル；アシルポリオキシエチ
レンソルビタンエステル（CnソルビタンExと略記）たと
えばTween20、Tween80、β−Ｄ−アルキルグルコシドた
とへばβ−Ｄ−オクチルグルコシドである。下記する配
糖体、特にサポニンも用いうる。しかし、これらは弱い
デタージエントで、他のデタージエントとあわせて用い
るべきである。適当なイオン性のデタージエントの代表
的な例としては、没食子酸デタージエントたとへばデソ
キシコレートおよびコレートがある。複合デタージエン
トたとへばタウロデオキシコレート、グリコデオキシコ
レートおよびグリココレートもまた用いうる。可能な両
性イオンデタージエントはリソレシチンおよび合成リソ
ホスホリピドである。上記のデタージエントの混合物も
用いうる。
アルコール、有機溶媒または小型の両媒性分子たとえば
ヘプタン−1,2,3−トリオール、ヘキサン−1,2,3−トリ
オール、酢酸、水溶性ペプチドおよび蛋白質またはそれ
らの混合物も、または、デタージエントとの混合物も可
溶化に用いうる。
脂質および疎水性蛋白質の量に比して過剰に可溶化剤を
用いる。細胞または微生物とデタージエントとを１対３
から１対10の重量比に混合するのが適当である。
細胞または微生物と可溶化剤とは、緩衝化された、でき
れば、塩溶液中で混合する。塩溶液のモル濃度は、0.02
から0.5Mのあいだ、なるべくは0.05から0.25Mのあいだ
とするが、0.1−0.2Mが有利である。デタージエントは
室温で約１時間作用さすべきである。
塩としては塩化ナトリウムが有利である。他の塩もまた
考えうる。特に、アルカリイオン、アルカリ土金属イオ
ンおよびアンモニウムイオンと強鉱酸および有機酸たと
へば酢酸、トリクロル酢酸、ギ酸およびシユウ酸との塩
がある。緩衝液として、pH6.5−９で緩衝作用のあるす
べての物質が適当である。コレートおよびデスオキシコ
レートを用いる時にはpH8−９が有利である。イオン性
でないデタージエントを用いる時には、pH7.4である。
免疫原性複合物の調製 細胞または微生物を可溶化すると、可溶化剤と細胞また
は微生物フラグメントの混合物を生ずる。フラグメント
のうちには、可溶化剤と複合物を形成した、疎水性の領
域を有する、帯電した単量体性抗原性蛋白質が存在す
る。本発明に準ずる新規免疫原性複合物は、１種または
１種より多くの配糖体の存在か、配糖体に直接に移すこ
とにより、帯電単量体性抗原性蛋白質を可溶化剤より分
けることにより生成させる。なほ、この配糖体は、疎水
性および親水性結合を有し、少なくとも、臨界ミセル濃
度で存在せねばならない。フラグメントの残りは、本発
明による複合物が形成されるより前にか、形成中、また
は形成後、なるべくは形成前に除去する。
本発明による複合物は、可溶化剤と、帯電単量体性抗原
性蛋白質と、そして存在するかも知れぬ他のフラグメン
トとの混合物より、たとへば透析、ゲル濾過またはクロ
マトグラフイーにより可溶化剤を除去するか、または、
グラジエント遠心、クロマトグラフイー、電気泳動のよ
うなもので、混合物より、帯電、単量体性抗原性蛋白質
を分離することにより製造しうる。本発明の不可欠の特
徴は、ミセル形として存在せねばならない配糖体の存在
で単量体性抗原性蛋白質を可溶化剤より分離するか、ま
たは、蛋白質を分けてからじかに配糖体に移すことであ
る。配糖体と直接的に接触するように、単量体性抗原性
蛋白質を可溶化剤より分ける時に、本発明に準ずる特殊
の複合物を生成する。配糖体のミセル形が複合物形成の
ためのベースになり、複合体のミセル上の疎水性領域と
膜蛋白質上の疎水性部分とのあいだの引合で複合物が生
成すると考えられる。複合物中の配糖体の量は、用いた
配糖体および複合物に結合した蛋白質の量で変動し、0.
5から50重量％、特に0.5から25重量％、なるべくは、0.
5から15重量％、しばしば0.5から10重量％とする。そし
て、特に、２から８重量％とする。荷電抗原性単量体性
蛋白質を、配糖体の存在しない状態で可溶化剤から分け
ると、EPC願81102213.6により生成するような型の蛋白
質ミセルを生ずる。
含有される成分の沈降定数は、細胞フラグメント、本発
明に準ずる可溶化剤との蛋白質複合物、単量体蛋白質そ
して可溶化剤の順で減少するので、他のフラグメントを
グラジエント遠心で分けるのが適当である。それで可溶
化剤と、単量体性蛋白質と、他のフラグメントとの混合
物より、グシコシドを添加するより前に他のフラグメン
トを除きそして可溶化剤はたとへば透析、ゲル濾過、ク
ロマトグラフイーで除くか、または、単量体性蛋白質
を、たとへば電気泳動、クロマトグラフイーまたはグラ
ジエント遠心で除く。後者の方法では、複合物が形成さ
れているので、同じグラジエント遠心のあいだに他のフ
ラグメントを除くこともできる。上記により複合物が形
成されたあとで、たとへば遠心、アフイニテイクロマト
グラフイー、分子ふるいまたはゲル濾過で他の細胞成分
を分けることもできる。
配糖体は疎水性および親水性の領域を有するいずれの配
糖体でもよい。なるべくは、W.Herz,H.Grisebach,G.W.K
irby刊、Fortschritte der Chemie Organischer Naturs
toffe,Vol.30（1973）所載のR.TschescheおよびWulfに
よるChemie und Biologie der Saponineに記載のサポニ
ン、特に極性の強いサポニン、主に、極性トリテルペン
サポニン、つまり極性酸性ビスデスモサイド（bisdesmo
sides）たとへば、Quillajabark Araloside Aよりのサ
ポニン抽出物、 Chikosetsusaponin IV,Calendula Glycoside C,Chikuse
tsusaponin V,Achyranthes−Saponin B,Calendula−Gly
coside A,Araloside B,Araloside C,Putranjia−Sapon
III,Bersamasaponoside,Putranjia−Saponin IV,Tricho
side A,Trichoside B,Saponaside A,Trichoside C,Gyps
oside,Nutanoside,Dianthoside C,Sapcnaside D,なるべ
くは、Aesculus hippocastanumよりのaescine（T.Patt
およびW.Winkler:Das therapeutisch wirksame Prinzip
der Rosskastanie（Aesculus hippocastanum）,Arznei
mittelforschung10（４）、273−275（1960）またはGyp
sophilla struthium（R.Vochten,P.JoosおよびR.Ruysse
n:Physicochemical properties of sapoalbin and thei
r relation to the foam stability,J.Pharm Belg42,21
3−226（1963）、特にQuillaja saponaria Molinaより
サポニン抽出物、主にK.Dalsgaard:Saponin Adjuvants,
Bull off Int Epiz77（７−８）,1289−1295（1972）に
より製造のDQ−抽出物、K.Dalsgaard:Saponin Adjuvant
s III,Archiv fr die Gesamte Virusforschung44,243
−254（1974）により製造されるQuil Aがある。また配
糖体の混合物も用いる。添加する配糖体の量は、それら
の臨界ミセル形成濃度（CMC）の少なくとも１から３
倍、なるべくは少なくとも５倍、特に少なくとも７から
12倍とする。この場合、配糖体は、膜蛋白質の単量体形
に結合しこれを捕捉とすると仮定される。なるべくは、
0.03重量％の臨界ミセル形成濃度を有するQuil Aを用い
る。それで、Quil Aの量は少なくとも0.02重量％、特に
0.05−0.5重量％、なるべくは0.2重量％とする。配糖体
についての上記引用を文献として引用する。
可溶化剤よりの荷電単量体性抗原性蛋白質の分離は、遠
心、透析電気泳動および種々のクロマトグラフ法で実施
した。
遠心法 上記のように製造したフラグメント化された細胞または
微生物と可溶化剤との混合物は、グラジエント遠心す
る。つまり、糖グラジエントまたはグリセロールのグラ
ジエントまたはメトライズアミドのグラジエントまたは
重金属塩たとへばCSCl（つまりグラジエント材料として
作用する、適当な密度、粘度を有する比較的に不活性の
物質）のグラジエント、たとへば糖のグラジエントでは
下記の濃度のような、配糖体含有グラジエントの存在す
る、可溶化剤含有、糖または塩の溶液の上部に重ねる。
グラジエント系は少なくとも100,000gで遠心する。糖と
しては、グルコースのような単糖類、乳糖、果糖、しよ
糖のような二糖類だけでなく、三糖類、四糖類およびグ
リセリンを用いうる。グラジエント中の糖濃度は、適当
には、最初の濃度（グラジエントの最上部）は、少なく
とも５、なるべくは15−25重量％とし、そして、最終濃
度（グラジエントの最下部）は少なくとも20、なるべく
は45−60重量％とする。グラジエントは、たとへば５−
25重量％糖含量の上層および20−60重量％糖含量の下層
より成立ちうる。しかし、いくつかの層が存在してもよ
く、その際は、個々の層のあいだの濃度差は相応して減
少させる。糖グラジエントには配糖体または配糖体の混
合物を含有させる。配糖体の量は、Quil Aの臨界ミセル
形成濃度の少なくとも１−３、なるべくは少なくとも７
−12倍で、少なくとも0.02、特に少なくとも0.05−0.
5、なるべくは少なくとも0.2重量％とする。この配糖体
含有グラジエント中で、可溶化剤は分離され、可溶化剤
と蛋白質とのあいだの複合物は蛋白質と配糖体とのあい
だの複合物に転換される。
糖グラジエントの頂部には、可溶化剤または可溶化剤の
混合物を含有する、糖または重金属塩の溶液の層を存在
させる。脂質はこの層の中に残存する。この層中の可溶
化剤の濃度は、用いた、微生物または細胞と可溶化剤と
の混合物中での濃度より低いかまたは同じとし、適当に
は、0.12から３重量％まで、なるべくは0.75から1.5重
量％とする。１重量％が有利である。糖または塩濃度は
グラジエントの上層中の濃度と同じかまたは低くしう
る。
少なくとも16時間、少なくとも100,000gで、20℃でなる
べくは20時間遠心したあと、蛋白質性の分画を集め緩衝
液（0.5Mから0.001M）なるべくは0.005M Tris−HCl,0.0
1M NaCl,pH7.4または0.2M酢酸アンモニウム、pH7.0に対
して透析し、そして、本明細書の文献として引用するTh
e Tools of Biochemistry,T.G.Cooper編、John Wiley
＆ Sons（New York1974）記載のような方法で、たとへ
ば、凍結乾燥、真空透析および超濾過で濃縮する。遠心
中にすべての成分が沈降し、その際、蛋白質と可溶化剤
との複合物より可溶化剤の結合がゆるみ、単量体性蛋白
質は配糖体に移されそれと複合物を形成する。つぎの透
析で糖を除く。
複合物は場合により、たとへば、25から60重量％の糖、
なるべくは10から40重量％のしよ糖を含有する糖グラジ
エントとによるグラジエント遠心で遊離配糖体よりさら
に精製しうる。
透析法 上記のように細胞または微生物を精製したのち、そし
て、上記の重量比に可溶化剤と混合したのち、上記した
緩衝液中の細胞と可溶化剤との混合物は、別様には、Qu
il Aの臨界ミセル形成濃度（CMC）の少なくとも１か
ら、なるべくは７から12倍の、0.05−２重量、なるべく
は0.2重量％の配糖体と混合し、0.5−0.001M、なるべく
は0.005M Tris−HCl,0.01M NaCl,pH7.4、特に0.2M酢酸
アンモニウム緩衝液、pH7.0に対して透析しうる。その
結果、配糖体の存在で可溶化剤を分離する。生成した膜
蛋白質複合物は、上記の遠心法の所に記載したようにし
て、配糖体添加物は除いて、沈降グラジエント遠心で分
離しうる。このようにして他のフラグメントおよび遊離
グリコシドより分ける。
細胞および微生物と可溶化剤とを緩衝液中に含有する混
合物はまたグラジエント遠心しうる。たとへば、５−60
重量％上記緩衝液中糖グラジエント、なるべくは10−20
重量％しよ糖グラジエント上に重層し、少なくとも150,
000gで少なくとも20分、なるべくは250,000gで30分遠心
しうる。そのようにして他のフラグメントも、可溶化剤
と蛋白質との複合物より分けられる。
頂部分画と称する蛋白質性の上層液を抽出し、Quil Aの
CMCの少なくとも１−３倍、なるべくは少なくとも７−1
2倍、つまり0.05−0.5重量％、なるべくは0.2重量％の
配糖体を加え、0.5から0.001M、特に0.005Mの緩衝液に
対し透析する。特に、0.005M Tris−HCl,0.01M HCl,pH
7.4、なるべくは0.2M酢酸アンモニウムを用いる。可溶
化剤は配糖体の存在で除去する。上記遠心法の項の方法
で沈降グラジエント遠心してさらに精製しうる。５−60
重量％なるべくは19から40重量％の糖グラジエントで遠
心してさらに精製する。
電気泳動法 別様には、フラグメント化微生物または細胞と可溶化剤
との混合物、または、混合物を緩衝液中５−60重量％、
なるべくは10−20重量％糖グラジエントでグラジエント
遠心して得られる蛋白質性頂部液（他のフラグメントお
よび遊離可溶化剤が除かれている）を可溶化剤より電気
泳動で分け、Quil AのCMCの少なくとも１から３、なる
べくは少なくとも７−12倍、0.05−0.5重量％、なるべ
くは0.2重量％の配糖体を含有する溶液に移す。このよ
うにして、荷電単量体性抗原性蛋白質を可溶化剤より分
ける。電気泳動による分離のためには、可溶剤−緩衝液
溶液は、電気泳動を妨害し過度の高温を発するような過
剰の添加塩を含有しないのが適当である。たとへば担体
を用いるかまたは用いないゾーン電気泳動および担体を
用いるか用いないイソタコホレーシスを用いうる。担体
としては、ポリアクリルアミド、寒天、シリカゲル、で
んぷん、セルロース、ポリ塩化ビニル、イオン交換体、
セライトのような担体を用いうる。遠心法の、The Tool
s of Biochemistry引用文献に記載のように複合物を分
離し濃縮しうる。遠心法の所に記載のグラジエント遠心
でも精製しうる。
種々の荷電または重量の疎水性膜蛋白質が出発材料中に
存在するなら、電気泳動または遠心でそれらを相互に分
け、それらの複合物を分けうる。これの条件で種々の膜
蛋白質の複合物を分けそして濃縮しうる。
クロマトグラフ法 可溶化蛋白質は、望むなら、細胞フラグメントより精製
したあとで、クロマトグラフ法で可溶化剤より分けう
る。抗原構造は、たとへばセルロース、アガロース、デ
キストラン、アクリルアミドおよびガラスより成立ちう
る、不溶性の基体（マトリツクス）に吸着される。マト
リツクス構造には種々のリガンドを結合させる。すると
分離に用いうるような特異的構造となる。用いた可溶化
剤がマトリツクス中を吸着されないで通過すると同時
に、ふつう、抗原構造が吸着される。ついで抗原を脱着
する。脱着段階で可溶化剤、塩および緩衝物質の交換が
おこりうる。可溶化剤は配糖体でおき代えられ、複合物
を生成する。
イオン交換クロマトグラフイーにおいては、ジエチルア
ミノエタノール（DEAE）のような荷電液体分子をマトリ
ツクスに結合させ陽イオン交換体に用いる。カルボキシ
ルメチル（CM）またはリン酸塩（Ｐ）基をマトリツクス
に結合させ陰イオン交換体に用いる。抗原構造と可溶化
剤とのあいだの正味の荷電の差を用いて、これらの分子
を分ける。一般的に荷電は可溶化剤になく蛋白質にあ
る。Ｋ−またはNaClのような塩のグラジエントや可溶化
剤の存在（濃度については上記可溶化の項をみよ）でリ
ン酸緩衝液でpHを調節して溶出する。溶出液に可溶化剤
に代えて配糖体を加えるならば、溶出において蛋白質を
精製し、可溶化剤を交換しまたは複合物を生成させう
る。ついで塩を透析で除く。
ゲル濾過では、抗原構造より小さい可溶化剤を用いたあ
とからでてくるようにする。イムノアフイニテイークロ
マトグラフイーによると、抗体は、上記のマトリツクス
に非可逆的に結合させ得、そのあと、抗体に独特の親和
性および特異性を抗原の精製に用いる。可溶化剤の抗体
への親和性はない。溶出は温和な変性によりおこなう。
たとへば、可溶化剤または配糖体の存在でpHを約４に減
少させる。
レクチンクロマトグラフイーではレクチンを用いる。レ
クチンは特異的な糖基と可逆的に反応しうる１群の蛋白
質で、たとへば糖蛋白質を結合しうる。レクチンをリガ
ンドとしてたとへばSepharose（Pharmacia,Uppsala）に
結合さすか、適当なマトリツクスに結合させた市販品を
用いる。デタージエント（可溶化剤）は固定レクチンに
親和性を有しない。吸着された抗原は、メチル化糖たと
へばメチルマンノシド、メチルグルコシドまたはＮ−ア
セチルグリコサミンを、可溶化剤または配糖体の存在で
緩衝剤塩溶液中に溶解したものを用いて容易に脱着しう
る。
コバレントクロマトグラフイーでは、チオール基をコバ
レント結合に用いて抗原構造をマトリツクスに結合させ
る。抗原中のチオール基は、適当なマトリツクスに結合
させた活性化チオ基に、チオ−ジスルフアイド交換によ
り結合する。この結合は可逆的で、可溶化剤を洗つて除
いたあと、チオールを有する抗原構造を、メルカプトエ
タノールまたはジチオトリエタノールでジスルフアイド
結合を還元することにより、可溶化剤または配糖体の存
在で溶出しうる。
ハイドロフオビツククロマトグラフイー この方法は、オクチル、フエニル型の固定化ハイドロフ
オビツクリガンドと、抗原構造のハイドロフオビツク表
面との相互作用を用いる。別様には、この技術は、混合
物より可溶化剤を結合させ、同時非吸着抗原構造を採取
し、例４（透析法）により連続処理する方法でもありう
る。別の条件では、抗原構造をリガンドに結合させ得、
可溶化剤のリガンドへの親和性をなくして、ついで透析
法を用いうる。高イオン強度たとへば硫酸アンモニウム
で固定し、水またはエチレングリコールを用いて低イオ
ン強度で溶出しうる。
それでこの複合物は細菌よりの膜蛋白質を含有し得、細
胞材料を上記方法で処理するより前にまず細胞壁を破壊
するのが有利である。ハイドロフオビツク蛋白質を生成
させうる細菌の例としては、Escherichia Staphylococc
i,Haemophilusに属するもの、たとへば、H.influenzae,
BordetellaたとへばB.pertussis,VibrioたとへばV.chol
er ae,SalmonellaたとへばS.typhi,S.paratyphiがあ
る。なるべくは、Coli中の結合因子たとへばpili K88お
よびたとへばサルモネラ中のporin蛋白質または、B.per
tussisおよびNeisseria meningitidisの外膜蛋白質とす
る。
エンベロープを有する用いうるウイルスの例としては、
OrthomyxoviridaeたとへばインフルエンザA,B,C,Paramy
oviridae特に、はしかウイルス、流行性耳下腺炎ウイル
ス、パラインフルエンザ1,2,3および４ウイルス、イヌ
ジステンバーウイルス、リンダペストウイルス、Rhabdo
viridae特に狂犬病ウイルス、Retrovididae特に、ねこ
白血球ウイルス、ウシ白血球ウイルス、Herpesvirida
e、特にPseudorabies,Coronaviridae,Togaviridae,たと
へばEEE,WEE,VEE（イースターン、ウエスターンおよび
ベネズエラウマ脳炎）、黄熱病ウイルス特に、ウシウイ
ルス性下痢ウイルスおよびヨーロツパブタ発熱性ウイル
ス、Arenaviridae,Poxvididae,Bunyaviridae,Iridoviri
dae,特に、アフリカブタ熱ウイルスおよび未分類ウイル
スとして、ヒト肝炎β−ウイルスおよびMarburg/Ebola
ウイルスがある。
本発明に準じて用いうる寄生虫の例として、原虫には、
ToxoplasmaたとへばToxoplasma gondii,Plasmodiumたと
へばPlasmodium uivax,malariae,falciparium,ovale,Te
ileria parvumおよびFilaroidae,なるべくはParafilari
aおよびOn chocerca,Entamoeba histolytica,種々の型
のアナプラズマ、SchistosomaたとへばSchistosoma hae
matobium,mansoi,japonicum,およびTrypanosomaたとへ
ばTrypanosoma gambiense,bruseiまたはcongolesiがあ
る。
ｂ） 非ハイドロフオビツク蛋白質またはペプチドより
出発しハイドロフオビツクの基をそれらに結合さすこと
も可能である。非ハイドロフオビツク蛋白質は、エンベ
ロープを有するかまたは有しないウイルス、細菌、マイ
コプラズマ、寄生虫より由来しうる。非エンブロープウ
イルスで、非ハイドロフオビツク蛋白質を有するもの
に、Picornaviridae,たとへば口てい病ウイルス、ポリ
オウイルス、Adenoviridae,Parvoviridae,たとへば、ね
こペストウイルス、およびブタパルボウイルス、Reovir
idaeたとへばRotavirusがある。マイコプラズマの例に
は、M.pneumoniae,mycoides,bovis,suis,orale,salvari
um,hominisおよびfermentansがある。
これらの蛋白質またはペプチド例ａ）のように精製しう
る。
非ハイドロフオビツク蛋白質に結合させうるハイドロフ
オビツク基は、1,2,3,4,5,6,7および８炭素原子数の、
なるべくは6,7および８炭素原子数の、直鎖、枝分れ、
飽和または不飽和の脂肪族鎖;Trp,Ile,Phe,Pro,Tyr,Le
u,Var,特にTyrから選択した、1,2,3,4,または５個、な
るべくは2,3,4個のアミノ酸の小型ペプチドコリン酸、
コレステロール誘導体たとへば、コリン酸、ウルソデソ
キシコリン酸である。
これらの疎水性の基は、非ハイドロフオビツクの蛋白質
に結合させうる基に連結しておらねばならぬ。それらの
基はたとへばカルボキシル基、アミノ基、ジスルフアイ
ド基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基およびアルデ
ヒド基のようなカルボニル基である。
結合させうる疎水性基として、メタン、エタン、プロパ
ン、ブタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタンのカルボキ
シル、アルデヒド、アミノ、ヒドロキシルおよびジスル
フアイド誘導体とシスチン、アスパラギン酸、グルタミ
ン酸、リジンを含有するペプチドとのあいだ、なるべく
はオクタナールとTyr・Tyr−Tyr−Cys（−Aspまたは−G
lu）とする。結合させうる基を有する疎水性基は、たと
へば上記したような可溶化剤および洗浄剤または塩酸、
酢酸、67％容量％酢酸、カセイソーダ、アンモニヤを用
いて水に溶解せねばならぬ。ついで、物質が沈殿せぬよ
う中性の方向に調整する。なほ、疎水性基を結合させよ
うとする蛋白質を変性さすpHとしてはならない。
疎水性分子は、非疎水性蛋白質に、10:1から0.1:1なる
べくは1:1に添加する。
結合分子として、カルボキシル基を有する疎水性基は、
水溶性のカルボジイミドまたは複合無水物を経由して蛋
白質に結合させうる。第１の場合、カルボジイミドでpH
5でカルボキシル基を活性化し、リン酸塩含量の高い緩
衝液（pH8）に溶解した蛋白質と混合する。第２の場合
は、ジオキサンまたはアセトニトリル中トリエチルアミ
ンの存在でカルボキシ化合物とイソブチルクロルホルメ
ートとを反応させ、生ずる無水物をpH8から９において
蛋白質に添加する。カルボキシル基をヒドラジンを用い
てヒドラジドに変え、これを、蛋白質中の過ヨー素酸酸
化糖単位中アルデヒドおよびケトンとヒドラゾン結合と
する。
亜硝酸を用いてアミノ基を低温条件でジアゾニウム塩に
変え、これをTyr,HisおよびLysとアゾ結合させる。
コハク酸無水物でヒドロキシル基をヘミサクシネート誘
導体に変え、これをカルボキシル基に結合させうる。
アルデヒド基は蛋白質中のアミノ酸と反応させてシツフ
塩基となしうる。
いくつかのカツプリングのための基および方法は、Jour
nal of Immunological Methods,59（1983）129−143、2
89−299、Methods in Enzymology Vol93 280−33およ
びAnalytical Biochemistry116,402−407（1981）に記
載されておいて、これらを本発明明細書の参考文献に引
用する。
受け入れた疎水性基を有するそのように製造された蛋白
質またはペプチドついで、ａ）におけるように配糖体と
結合させ複合物となしうる。しかし、ここで細胞フラグ
メント除去のための精製段階は省略しうる。
ｃ） 疎水性基が閉じこめられている親水性蛋白質より
出発し、蛋白質をおだやかに撹乱て、疎水性が露出され
るようにしてもよい。たとへば約2.5の低いpH、3Mの尿
素または70℃を超える高温などある。これらの蛋白質
は、IgG,IgM,IgA,IgDおよびIgEのような免疫グロブリン
およびポリオウイルス蛋白質のようなある種のウイルス
蛋白質でありうる。免疫グロブリンは、アンチジオチピ
ツク（antidiotypic）抗体に用いうる。得られる蛋白質
はｂ）におけるように蛋白質として精製し、ｃ）におけ
るように配糖体に結合させて複合物とする。なほ細胞フ
ラグメントを除く段階は略する。
本発明に準ずる免疫原性複合物は、ヒトおよび動物にお
いて特異的な免疫の刺激に用いうる。それらは、細菌、
ウイルス、マイコプラズマおよび寄生虫による病気に対
するワクチンおよび種々の動物細胞に由来する膜蛋白質
に対する、研究のための抗体生産に用いうる。
種々の細菌またはウイルスに由来する両親媒性蛋白質の
混合物を用いて、いくつかの病気に対してワクチンとも
なしうる。
本発明は、場合によつては、ふつうの添加物および充填
剤を加えた、なるべくは、T,N溶液（例１）のような、
イソコムの緩衝溶液の形の、本発明に準ずるイソコムを
含有するヒトや家畜用組成物とする。
つぎに、非限定的実施例で本発明をよりくわしく記載す
る。
例１ Umeaで分離されたパラインフルエンザ−３−ウイルス30
重量％しよ糖中、100,000gで４℃で１時間遠心し精製し
た。底部の層を、0.05M Tris−HCl,pH7.4および0.1M Na
Cl（TN）中約10mg/mlの濃度に溶解した。同じ緩衝液（T
M）中１−5mg/mlのPI−３−ウイルスを、TN緩衝液中約1
05カウント／分3H−標識ウイルスとあわせて、２重量％
（最終濃度）Triton X−100を用いて可溶化した。（A.L
uukkonen,C.Gamberg,B.Renkonen（1979）Virology76 5
6−59頁、本明細書中の文献に引用する）。約200μの
容量の試料を、TN中１％Triton X−100含有15％しよ糖
の300μおよび0.2％（重量）Quil A含有20から50重量
％までのTN中12mlしよ糖グラジエント上に重ねた。遠心
したあと、500μ宛の分画を下部から集め、試料（20
−50μ）の放射活性を測定した。放射活性のある蛋白
質分画を集め0.005m Tris−HCl,0.01M NaCl,pH7.4中で
透析し、100mlフラスコに入れ、Edwards凍結乾燥装置中
で18時間透析した。この調製物の沈降係数は24Sであつ
た。
この複合物は、10−14重量％しよ糖グラジエント中で遠
心してさらに精製した。
例２ ウマインフルエンザウイルス（Solvalla,Solvalla,スト
ツクホルムで分離）を用い、例１の操作を反復した。こ
の実験を配糖体無添加で実施した（EPC願81102213.6の
原則による）。そしてそのように得られた蛋白質ミセル
および配糖体を用いて生成した蛋白質複合物は、10−40
重量％の糖グラジエントでプラス４℃で４時間280,000g
で遠心した。結果は第１図に示す。これはチログロブリ
ンの沈降係数を標準にしている（矢印は16S）。蛋白質
ミセルの沈降係数は30Sで、配糖体蛋白質のミセルは19S
である。（ウイルス糖蛋白質は、ガラクトースオキシダ
ーゼ−3H−水素化ホウ素法で標識した）。
例３ 例１の方法は、パラインフルエンザ−３−ウイルスに代
えてはしかウイルスを用いて反復した。得られた複合物
は電顕で、第２図の特徴的構造を示した。
例４ Bilthoven（オランド）より得た狂犬病ウイルスをSepha
cryl S300上にゲル重層して精製した。TN中2mg/mlの濃
度に再懸濁させた。ウイルスの1mgを100mMのオクチル−
β−Ｄ−グルコシドを用いて可溶化し、20℃で45分イン
キユベートした。試料は50重量％のシヨ糖溶液上に重層
し、プラス４℃で45分250,000gで遠心した。上層の溶液
を取り出しQuil Aを0.2重量％に添加した。
試料はセルロースホースに入れ、1000ml容量の0.15Mの
酢酸アンモニウム緩衝液中プラス20℃で透析した。この
溶液は72時間のあいだかくはんし、その間溶液は３度交
換した。透析した材料は狂犬病ウイルスの複合物を含有
した。10−40重量％糖溶液中プラス４℃で280,000gで４
時間遠心して、材料の１部を精製した。電顕像は、第３
図の構造を示す。
例５ 例４の方法を反復した。はしかウイルスを用いた。複合
物は、例３で得られた複合物と同じ構造を示した。
例６ しよ糖グラジエント遠心を用いてパラインフルエンザ−
３−ウイルス（Ｕ−23）を精製した。精製ウイルスは10
mg/mlに、0.02Mバービトン緩衝液、pH8.0、0.24Mグルコ
ース（BG）に溶解精製した。BG−緩衝液中１−5mg/ml P
I−３−ウイルスを、BG緩衝液中約105 3H−カウント／
分標識ウイルス（上記Luukkonen等、1977による）と共
に、２％Triton X−100を用いて可溶化した。1mlの試料
を、pH8.0、0.02Mバービトン緩衝液および0.02重量％の
Quil A含有１％アガロースゲル上に重層した。アガロー
スゲルは85mm2表面積、25mmの高さのチユーブに入れ
た。チユーブの上方部分および下方部分はそれぞれ、pH
8.0、0.02Mバービトン緩衝液の電気泳動緩衝液に接続し
た。上方を陰極に、下方を陽極に接続した。5V/cmで４
時間泳動させた。ゲルの陽極側で試料を集めて放射活性
を測定した。pH7.0、0.15M酢酸アンモニウム緩衝液中で
透析した。凍結乾燥した。
この調製物は約20Sの沈降係数（例２と同様に測定）で
あつた。
この複合物は10−40重量％しよ糖グラジエントで精製し
た。
例７ Toxoplasma gondii（Tage Waller,Statens Veterinrm
edicinska Anstalt）を木綿を通し濾過し、４℃で20
分、100,000gで30重量しよ糖中で遠心して精製した。こ
のものは、0.05Mトリス−HCl、pH7.4および0.1M NaCl
（TN）中約5mg/mlに溶解した。本明細書の参考文献とし
て引用する、“An investigation of the antigenic st
ructure of Toxoplasma gondii"により、約105カウント
／分の3H標識トキソプラズマ（Luukkonen等、1977）（T
N−緩衝液中）とあわせて、1mgのToxoplasma gondii
を、５％オクチル−β−Ｄ−グルコシドおよび５％サポ
ニン中で可溶化した。約200μ容量の試料は、TN中１
％Triton X−100含有15％しよ糖の300μおよび0.2重
量％Quil A含有20から50重量％のTN中12mlしよ糖グラジ
エント上に重層させた。約18時間、20℃で150,000gで遠
心した。遠心後はグラジエントは500μ宛の分画毎に
集め（20−50μ）の試料の放射活性をみた。２つの放
射活性ピークを検出した。それぞれのピーク中の分画を
あわせ、例１のように透析し濃縮した。Quil Aとの複合
物は、同じ寄生虫より得た蛋白質ミセルより低い沈降係
数を示した。
例８ プラスミドpili K88を有するバクテリヤE.coliを、３
度、機械的に振り等電点で沈降させた。この材料は例１
記載のように処理した。得られた複合物は第２図および
第３図に示す特徴的構造を有した。
例９ ポリン（porin）蛋白質を有するSalmonellaを用い例８
の方法を反復した。第２および３図に示す特徴的構造を
有する複合物を得た。
例10 ネコ白血球ウイルスで感染されたネコよりエピテル（ep
itel）腎細胞を採取した。例１のように処理した。第２
および第３図に示す特徴的構造の複合物を得た。
例11 牛白血球ウイルスで転換したエピテル腎細胞を例１の方
法で処理した。第２および第３図に示す特徴的構造の複
合物を得た。
例12 例１の方法でパラインフルエンザ−３−ウイルスＵ−23
を精製し、蛋白質複合物を調製した。ただし、20から50
重量％TN中しよ糖グラジエントは、Quil A以外のサポニ
ンを含有した。２種の市販サポニンを試験した。Merck
“Weiss",rein51400023およびSc,Lickhardt“S"Schucha
rdt,Munichである。（純粋な形状なサポニン。製造者は
製品の型を明らかにしない。薄層クロマトグラフイーで
Quil Aと異なる）。生ずる複合物の沈降定数は24Sで、
例３の複合物と同じ構造を示す。
例13 5mgのはしかウイルスを例３のように可溶化し、DEAEセ
ルロース型の陰イオン交換体で処理した。イオン交換体
は20mlのカラムとし、0.5重量％のオクチル−β−Ｄ−
グルコシド含有、pH7.2の0.01Mリン酸塩緩衝液と平衡さ
せた。試料はイオン交換体に施し、未吸着分は、0.5重
量％オクチル−β−Ｄ−グルコシド含有、pH7.2、0.01M
リン酸塩緩衝液の５倍容量で洗い流した。はしか膜蛋白
質の同定された分画を同定し合併しQuil Aを0.1重量％
まで加え、0.05M酢酸アンモニウム、pH7.0に対し透析し
た。特徴的構造（図１および２）を有する複合物を生成
した。
例14 London School of Tropical Medicine and Hygine（Eng
land）より受け取つた肝炎Ｂウイルスの22nm粒子をTN中
に1mg/mlに再懸濁させた。22nm粒子の0.3mg蛋白質をTri
ton X−100、0.5M NaClの２容量％で可溶化し、37℃で1
6時間インキユベートした。ついで例１の操作を反復し
た。生成複合物は20Sの沈降定数を示した。電顕で第４
図の構造の複合物を示した。この構造は第１図の構造と
は異なる。
例15 牛下痢ウイルス（B DV）3mgをTNに溶解しTriton X−100
を１容量％まで加え可溶化した。混合物は室温で２時間
かくはんした。可溶化したウイルスはSepharose4Bに固
定化したレクチンLentilより成立つレクチンカラムに処
した。カラムはTNで平衡させ、カラムにウイルスを導入
したあと、0.1容量％Triton X−100を含有するTNの５カ
ラム容量倍で洗い、ついで10カラム容量倍のTNで洗つ
た。ウイルスエンベロープ蛋白質を、0.2Mメチルα−Ｄ
−マンノシド、0.5重量％オクチル−β−Ｄ−グルコシ
ド（TN中）の緩衝液で溶出脱着させた。ウイルスをエン
ベロープする蛋白質含有分画を集めQuil Aを0.1重量％
まで加えた。＋４℃で３日間pH7.0の0.05M酢酸アンモニ
ウムに対し透析した。そのあいだ１リツトルの緩衝液は
３度変えた。
最終生成物は凍結乾燥した。電顕は第４図の複合物構造
を示した。この調製物の沈降定数は20Sであつた。
例16 ポリオウイルスをホルマリンで殺し既知の方法たとへば
超遠心、そにつぐ、Sepharose（pharmacia,Uppsala）ゲ
ルクロマトグラフイーで精製した。最後に塩化セシウム
中でデンシテイ遠心に処した。
たとへば２％SDS（ナトリウムドデシルスルフエート）
のような可溶化剤含有TNのような緩衝液中で90℃で２分
間加熱し可溶化した。ウイルス蛋白質は0.1％SDSを含有
する13％ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動で分け
た。ゲル中の蛋白質は、Co massie Blue R250で着色さ
せ同定した。VP3は約26000ダルトンの分子量のウイルス
蛋白質のひとつである。このウイルス蛋白質の帯をゲル
より切り出し、逆電気泳動で抽出した。
抽出物は、２％Triton X−100可溶化剤を含有するTNに
溶解した。この混合物は、例１の遠心法で蛋白質複合物
（iscomer）とした。電顕は、第３図に示す特徴的構造
を示した。
例17 ホルマリンで殺した精製ポリオウイルスを0.1MのMgCl2
を含有する67容量％の酢酸に溶解した。ウイルスはつい
で100,000gで２時間超遠心に処した。ウイルス蛋白質の
み含有する上清を、0.1重量％Quil Aの存在で、0.01M T
ris,0.14M NaCl,pH7.4に対し透析した。生成複合物は例
３の製造のものと同じ構造を示した。
例18 凍結脱水した形状のNeisseria meningitidisの外膜蛋白
質を、National Institute of Health,（オランダ）よ
り受け取つた。２％（重量）のオクチル−β−Ｄ−グル
コシドおよび0.1重量％のQuil Aを含有するTNに溶解
し、例４のように処理した。生ずる複合物は例２のよう
に測定して、沈降定数20Sであつた。
例19 0,1,2,3および４個のチロシンを末端に結合させ合成し
た、疎水性アミノ酸を有するペプチド、口てい病ペプチ
ド144−169、O.Kaufbehren,VP Iを用いた。ペプチドは
極少量の67容量％酢酸に溶解し、25％アンモニヤで中和
し、Ag dest（２％最終濃度とする）と共に0.5M酢酸ア
ンモニウムの濃度まで希釈した。0.1％の配糖体を加
え、混合物は、0.05M酢酸アンモニウム、pH7に対し透析
した（透析チユーブSpectra por 6 MWCO 1,000）。
２週間の間隔をおき、マウスを、50μｇ量で２度ワクチ
ン処理した。
生成複合物の電顕像（第５図）は、20−40nmの長さで10
nmの巾の球状の電子を通さない粒子を示した。他の大き
さのものもある。第5a図は３個のチロシンに結合したペ
プチドの電顕像で、第5b図は４個のチロシンに結合した
ペプチドの像である。
例20 既知の方法（Van den Branden,J.L.de Coen,L.Kanarek
およびRuyschaert（1981）およびMolecular Immunology
18,pp621−631（1981））で精製するか、硫酸アンモニ
ウム沈殿で濃縮した（J.E.Conradie,M.Govender,L.Viss
er,Journal of Immunological Methods Vol 59 pp.289
−299,1983、本明細書の参照文献として引用）マウスよ
りのIgGを、冷蔵室中で0.15Mリン酸塩（PC緩衝液、pH
2）の１リツトルに対して透析した。ついで２％のデタ
ージエント（たとへば）オクチル−β−Ｄ−グルコシ
ド）を加えた。デタージエントの臨界ミセル濃度（CM
C）が低いならば、透析を始めるより前にデタージエン
トを交換すべきである。混合物はPC pH7に対し透析し
た。１時間後に0.05％の最終濃度までQuil Aを加えた。
冷蔵室中で24時間pH7のPCに対し透析を続けた。
複合物の形成は、Beckman SW−60ローター中で40000rpm
で3.3時間５から30％しよ糖勾配で遠心することにより
示された。複合物はELISA法によりグラジエント中に検
出された。
実験１ 本発明に準じQuil Aを用いて生産された膜蛋白質複合物
と配糖体無添加で生産された相当する膜蛋白質ミセルと
の免疫原性についての比較 25頭のマウス（BALB C,Bomhollgard,Denmark,約20g）を
５群に分け、各群は、３週の間隔で２度、緩衝液のみ
（PBS）、例１に従い、100μPBS中インフルエンザの
膜蛋白質およびQuil Aより製造の複合物の0.1μg,0.5μ
g,および５μg,EPC願81102213.6により製造の配糖体な
しの膜蛋白質ミセルの５μｇで免疫した。
実験終了まで毎週血清を採取した。ELISA法で血清中の
免疫反応を測定した。この方法は、Voller,Bidwellおよ
びBartlett 1980,Enzyme−linked Immunosorbent Assa
y,pp359−371,Manual of Clinical Immunology,America
n Society for Microbiology,Washingtonに記載されて
いる。
結果は第６図に示す。明らかに、Quil Aを用いて製造し
た抗原複合物は、Quil Aを加えない相当する蛋白質ミセ
ルよりより良い免疫反応を示す。Quil Aを用いて製造し
た蛋白質膜複合物は、配糖体無添加の蛋白質ミセルの５
μｇより高い免疫反応をおこさせる。
実験２ 本発明に準じQuil Aを用いて製造した膜蛋白質複合物
と、アジユバント添加物としての配糖体と混合した相当
する膜蛋白質ミセルとの免疫効果および副作用について
の比較 The National Veterinary Institute,Sweedenよりの30
頭のモルモツトを用いた。１群６頭５群に分け、インフ
ルエンザウイルス（カルチヤーSolvalla）よりの蛋白質
ミセル（Ｐ）および表１に従い配糖体Quil A（GP）を用
い生産の同じインフルエンザウイルスよりの膜蛋白質複
合物（例２で製造）で免疫した。ワクチン未処理対照と
して６頭を用いた。GP複合物からは、しよ糖グラジエン
ト遠心で遊離配糖体を除いた。表１に結果を示す。ｐ−
ミセルもGP−複合物もほとんど副作用なく、GP複合物は
明らかに、ｐ−ミセルより高い抗体反応を与えた。10μ
ｇの遊離配糖体とｐ−ミセルとの混合物は副作用が温和
であつたがアジユバント効果はない。100μｇの遊離グ
リコシドの添加で、発赤、はれの形で強い局所的副作用
をみた。ｐ−ミセルワクチンよりは高い抗体反応を与え
た。
表１ ４週の間隔で２度ワクチン処理したあと、赤血球凝集阻
害（HI）で測定したモルモツト血清中のインフルエンザ
ウイルスへの免疫反応 ｐ＝インフルエンザウイルスペプロマーより成立つ蛋白
質ミセル（ＨおよびＮ）の１μｇ ｐ＋10＝１μｇ蛋白質ミセル＋10μｇ遊離配糖体 ｐ＋100＝１μｇ蛋白質ミセル＋100μｇ遊離配糖体 GP＝配糖体を用いて製造した蛋白質複の１μｇ（遊離配
糖体含量＜0.1μｇ） − 反応なし ＋ わづかな発赤 ＋＋ 中程度の発赤 ＋＋＋ 強い発赤およびネクローゼ なお、ワクチン未処理のモルモツトのタイターは２（６
頭） 実験３ 例１により製造し10−40％しよ糖勾配でさらに精製した
膜蛋白質複合物の免疫原効果をみた。この調製物の、Qu
il Aの溶解反応にもとづいて測定した遊離Quil Aの量は
0.02重量％以下であつた。溶解反応は牛赤血球について
調べた。血球はアガロースゲル中0.05％濃度とした。ア
ガロースゲルは電気泳動システム中においた。ここでQu
il Aは陽極へと移動し血球を溶解する。溶解域はロケツ
トの形状で配糖体の量はロケツトの長さに比例し、Coom
asie Brilliant Blueを用いる蛋白質染色で可視化され
る。この方法で、0.02％またはそれ以上の配糖体濃度を
測定しうる。（Sundquist等,Biochemical and Biophysi
cal Research Communications Vol.114,pp699−704,198
3）。
沈降速度の分析で、追加して精製した材料は非精製材料
と同じ沈降定数を示した。電顕で同じ形態を示した（第
２図および第３図）。マウスをワクチン処理すると、抗
体反応の刺激について、両者は同じ活性を示した。ひと
つの実験で、Quil A−添加で調製し、２度のグラジエン
ト遠心で精製したインフルエンザウイルスの複合物の１
μｇまたは0.1μｇは、精製を加えてない対応する材料
と同様に有効であつた。上記の結果は、遊離Quil Aが証
明できなくても安定で免疫原として有効であることを示
す。
実験４ 肝炎Ｂ（HB）抗原を有する３種のワクチンを、それぞ
れ、５μg HB抗原量で、４頭のマウスで調べた。３種の
ワクチンは、例14により製造のiscomes,相当する市販ワ
クチンでインタクトの22nm粒子を有するもの、もうひと
つは、相当するHB蛋白質がEPC願81102213.6に準じ製造
のミセルの形で存在する実験ワクチンである。抗体反応
はELISA法で測定した。
表２に示すように、iscome処理マウスは、インタクト22
nm粒子含有およびミセルのHBより、強い抗体反応を与え
た。
実験５ 病原性の狂犬病株（CVS）iscomの試験的感染でワクチン
処理実験を行なつた。例４に準じ製造の狂犬病ウイルス
よりのエンベロープ蛋白質を含有し、マウスについて防
禦免疫をおこすかをみた。表３に示す投与量で、１度マ
ウスをワクチン処理した。14日間おいてから、マウスに
病原性のCVS株でLD50の40倍の投与量で試験感染させ
た。
表３ワクチン投与量（μｇ） 生存数／全動物数 4.2 18/19 0.84 15/18 0.17 10/20 …… 0/20 表は、iscomワクチンが防禦的免疫をおこしていること
を示す。
本発明に準ずる新規抗原複合物は、凍結乾燥した形状と
しても、水性懸濁液としても貯蔵しうる。投与には、適
当な溶媒、たとへば生理食塩水中に溶液とするのが有利
である。なるべくは、pH7.2−7.6の0.1M NaCl溶液を用
いる。pHは0.05M Tris−HClで調整する。他の緩衝液も
用いうる。
本発明に準ずる新規蛋白質複合物は、配糖体なして製造
した、アジユバントと混合してない蛋白質ミセルの約10
倍そしてしばしばそれ以上の強い免疫原効果を示す。対
応する蛋白質ミセルが同じ蛋白質量で同じ免疫原効果を
有すべきならば、大量の配糖体または他のアジユバント
との混合が必要となり、それだけに副作用も大となるで
あろう。
本発明に準ずる蛋白質複合物はなんらのアジユバントと
混合しなくてもよく、副作用は最小限におさえられる。
さらに、リポソームに結合させた抗原蛋白質に比して、
本発明の新規複合物は安定である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、明細書例２記載のように、ウマインフルエン
ザウイルスの蛋白質ミセルおよび本発明による蛋白質複
合体の糖グラジエントでの遠心結果を示す。 第２図は、明細書例３記載の本発明による複合物の電顕
図である。 第３図は、明細書例４記載の本発明による複合物の電顕
図である。 第４図は、明細書例14記載の本発明による複合物の電顕
図を示す。 第5A図及び第5B図は、明細書例19記載の本発明による複
合物の電顕図を示す。 第６図は、明細書実験１に記載の、本発明による膜蛋白
質複合物と配糖体無添加で製造された膜蛋白質ミセルの
免疫原性を比較して示す。

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】疎水性領域を有する抗原性の蛋白質または
    ペプチドおよび少なくとも一つのサポニンを含有する免
    疫原性複合物であり、この複合物は円状サブユニットま
    たは球状構造の部分よりなる開放球状構造を有し（第２
    図および第３図参照）そしてリポソームを含有していな
    い、免疫原性複合物。
  2. 【請求項２】該複合体は相当する蛋白質またはペプチド
    のミセルよりも低い沈降定数を有し、かつまた蛋白質ま
    たはペプチドの相当する単量体形よりも高い沈降定数を
    有するものである、特許請求の範囲第１項に記載の免疫
    原性複合物。
  3. 【請求項３】遊離のサポニンを実質的に含有していない
    ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項〜第２項のい
    ずれか一項に記載の免疫原性複合物。
  4. 【請求項４】上記疎水性領域を有する蛋白質またはペプ
    チドが、 Ａ）エンベロープを有するウイルス、バクテリア、マイ
    コプラズマ、寄生体または動物細胞よりの膜蛋白質また
    は膜ペプチド、あるいはこれらの膜蛋白質またはペプチ
    ドに由来する、親水性基と疎水性基とを有する両親媒性
    の蛋白質またはペプチド、あるいはハイブリドDNA技術
    で生成される、そのような蛋白質またはペプチド、ある
    いは合成により生成された分子； Ｂ）ウイルス、バクテリア、マイコプラズマ、寄生体に
    由来するかまたは合成されたものであるか、またはハイ
    ブリドDNA技術により得られたものであることができる
    蛋白質またはペプチドに疎水性基をカプリングさせるこ
    とによって両親媒性とされた親水性蛋白質またはペプチ
    ド； Ｃ）親水性蛋白質の得がたい疎水性部分が化学的手段に
    よって、得られるようにされた両親媒性の蛋白質または
    ペプチドであり、この蛋白質は前記の微生物または細胞
    由来のものであるか、またはハイブリドDNA技術によっ
    て得られるものであるか、または合成されたものであ
    る、 であることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第３項
    のいずれか一項に記載の免疫原性複合物。
  5. 【請求項５】該蛋白質およびペプチドがウイルス、マイ
    コプラズマ、バクテリア、寄生体および動物細胞由来の
    両親媒性蛋白質および非疎水性蛋白質よりなる群から選
    ばれ、この非疎水性蛋白質は、疎水性基をカプリングさ
    せることにより疎水性にされており、この疎水性基は炭
    素原子１〜８個を有する脂肪族基、アミノ酸１〜５個を
    有する小さいペプチド、コリン酸およびコレステロール
    誘導体よりなる群から選ばれる基である、特許請求の範
    囲第４項に記載の免疫原性複合物。
  6. 【請求項６】Orthomyxoviridae,Paramyxoviridae,Retro
    viridae,Rabdoviridae,Coronnaviridae,Togaviridae,He
    rpesviridae,Bunyaviridaeおよび肝炎Ｂウイルスよりな
    る群からの膜蛋白質、トキソプラズマ、Picornavirida
    e,Parvoviridae,およびReoviridaeよりの膜蛋白質を選
    択し、かつまたサポニンをQuillaja saponaria Molina,
    Aesculus hippocastanumまたはGypophilla struthiumよ
    りの配糖体抽出物のようなサポニン望ましくはQuillaja
    saponaria Molina,aescin,sapoalbinからの配糖体抽出
    物から選択することによって得られる、特許請求の範囲
    第４項に記載の免疫原性複合物。
  7. 【請求項７】免疫刺激剤、特にワクチンとして用いるた
    めの特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか一項に記
    載の免疫原性複合物。
  8. 【請求項８】添加物または充填剤と混合されていてもよ
    い、疎水性領域を有する抗原性の蛋白質またはペプチド
    および少なくとも一つのサポニンを含有する免疫原性複
    合物であり、この複合物は円状サブユニットまたは球状
    構造の部分よりなる開放球状構造を有し（第２図および
    第３図参照）そしてリポソームを含有していない、免疫
    原性複合物を含有するヒトおよび獣医用ワクチン。
  9. 【請求項９】疎水性領域を有する抗原性の蛋白質または
    ペプチドおよび少なくとも一つのサポニンを含有する免
    疫原性複合物であり、この複合物は円状サブユニットま
    たは球状構造の部分よりなる開放球状構造を有し（第２
    図および第３図参照）そしてリポソームを含有していな
    い、免疫原性複合物の製造方法であって、疎水性領域を
    有する蛋白質またはペプチドを１種または１種より多く
    の可溶化剤と混合し、それにより荷電を有する単量体系
    抗原性蛋白質またはペプチドと可溶化剤とのあいだに複
    合物を形成させ、そのあとで、少なくとも臨界ミセル形
    成濃度とした、疎水性領域および親水性領域を有するサ
    ポニンの１種または１種より多くを含むサポニン溶液の
    存在の下で、荷電単量体系抗原性の蛋白質またはペプチ
    ドを可溶化剤から分離するか、または、それらを可溶化
    剤から分離して直接に上記サポニン溶液に移し、それに
    より、蛋白質複合物を形成させ、それを分離し、精製す
    ることを特徴とする、上記免疫原性複合物の製造方法。
  10. 【請求項１０】ウイルス、マイコプラズマ、バクテリ
    ア、寄生体、動物細胞、あるいは疎水性ペプチドまたは
    蛋白質を、イオン性、非イオン性、両性イオン性または
    没食子酸デタージエント、アルコール、小形両親媒性分
    子、水溶性のペプチドまたは蛋白質あるいはそれらの混
    合物と、緩衝化されている、できれば塩類溶液中で混合
    し、この混合物を、配糖体を含有する一つのグラジエン
    ト上に存在している、可溶化剤含有溶液上におき、少な
    くとも100,000gで遠心し、蛋白質性分画を単離し、緩衝
    溶液に対して透析し、そのあとで、得られる蛋白質複合
    物を、できれば、凍結乾燥、真空透析または超遠心など
    で濃縮し、または、グラジエント遠心でさらに精製する
    ことを特徴とする、特許請求の範囲第９項に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】ウイルス、マイコプラズマ、バクテリ
    ア、寄生体、動物細胞、あるいは疎水性のペプチドまた
    は蛋白質を、イオン性、非イオン性、両性イオン性また
    は没食子酸デタージエント、アルコール、小形両親媒性
    分子、あるいはそれらの混合物と、緩衝されている、で
    きれば塩類溶液中で混合し、この混合物をサポニンと反
    応させ、好ましくは酢酸アンモニウム緩衝液に対し透析
    するか、またはグラジエント上に直接的に積重ね、次い
    で少なくとも100,000gで遠心分離し、そのあとで、蛋白
    質含有頂部分画を集め、サポニンと反応させ、緩衝液、
    望ましくは酢酸アンモニウムで透析し、その後、得られ
    る蛋白質複合物をできれば、凍結乾燥、真空透析または
    超遠心などで濃縮し、またはグラジエント遠心でさらに
    精製することを特徴とする、特許請求の範囲第９項に記
    載の方法。
  12. 【請求項１２】ウイルス、マイコプラズマ、バクテリ
    ア、寄生体、動物細胞、あるいは疎水性のペプチドまた
    は蛋白質を、イオン性、非イオン性、両性イオン性また
    は没食子酸デタージエント、アルコール、小形両親媒性
    分子、あるいはそれらの混合物と、緩衝されている、で
    きれば塩類溶液中で混合し、この混合物、あるいは微生
    物、動物細胞、蛋白質、またはペプチドと可溶化剤との
    緩衝されている塩類溶液中での混合物をグラジエントを
    通して遠心した場合に得られた蛋白質性頂部分画を、電
    気泳動により可溶化剤から分離し、サポニンを含有する
    溶液中に集め、そのあとで得られる蛋白質複合物を、で
    きれば、凍結乾燥、真空透析または超遠心などで濃縮
    し、またはグラジエント遠心でさらに精製することを特
    徴とする、特許請求の範囲第９項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】ウイルス、マイコプラズマ、バクテリ
    ア、寄生体、動物細胞、あるいは疎水性ペプチドまたは
    蛋白質を、イオン性、非イオン性、両性イオン性または
    没食子酸デタージエント、アルコール、小形両親媒性分
    子、あるいはそれらの混合物と緩衝されている、できれ
    ば塩類溶液中で混合し、この混合物、あるいは微生物、
    動物細胞、蛋白質、またはペプチドと可溶化剤との緩衝
    されている塩類溶液中での混合物がグラジエントを通し
    て遠心された場合に、得られた蛋白質性頂部分画を、ク
    ロマトグラフィにより可溶化剤から分離し、サポニンを
    含有する溶液中に集め、そのあとで、得られる蛋白質複
    合物をできれば、凍結乾燥、真空透析または超遠心など
    で濃縮し、またはグラジエント遠心でさらに精製するこ
    とを特徴とする、特許請求の範囲第９項に記載の方法。
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