DK164855B

DK164855B - Spergualin-beslaegtede forbindelser med en phenylengruppe, fremgangsmaade til fremstilling deraf samt en farmaceutisk sammensaetning

Info

Publication number: DK164855B
Application number: DK097485A
Authority: DK
Inventors: Hamao Umezawa; Tomio Takeuchi; Rinzo Nishizawa; Katsutoshi Takahashi; Teruya Nakamura; Yoshihisa Umeda
Original assignee: Microbial Chem Res Found
Priority date: 1984-03-02
Filing date: 1985-03-01
Publication date: 1992-08-31
Also published as: EP0153720A2; IE57975B1; EP0153720A3; DE3566114D1; HU193085B; KR850006932A; ZA851567B; GR850531B; ES540784A0; CA1242452A; HUT37117A; DK97485D0; AU3929685A; ES8701720A1; CN1004351B; DK164855C; AR241109A1; EP0153720B1; AU575912B2; PT80038A

Description

i

DK 164855 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte spergualin-beslægtede forbindelser, en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt en farmaceutisk sammensætning.

Opfindelsen angår spergualin-beslægtede forbindelser,

5 som er ejendommelige ved, at de har formlen X

(CH2) n-CXWH-RrCOMK- (CH2) ^NH (CH2) 3NH’2 H,NCNH-(CH,)tn m 10 2 || 2 m u;

NH

hvor R^ betyder en ligekædet eller forgrenet C^_4-alkylen-gruppe, der eventuelt er substitueret en eller flere gange med en hydroxymethylgruppe, X betyder et hydrogenatom eller 15 et halogenatom, m og n er ens eller forskellige og betyder hver især 0 eller et helt tal fra 1 til 5, samt fysiologisk acceptable salte deraf.

Opfindelsen angår endvidere en farmaceutisk sammensætning, som er ejendommelig ved det i den kendetegnende 20 del af krav 7 angivne.

Endelig angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne med formlen (I) samt fysiologisk accpetable salte deraf, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at beskyttelsesgrupperne på gængs måde fjernes fra 25 en forbindelse med formlen

X

(¾1 n~co!'!H-R1 '-CONH(CH2)4N(CH2)3R3 30 H2NiiNH-(CH2)rn R2 NH (II> hvor * betyder en ligekædet eller forgrenet C1_4-alkylen-gruppe, der eventuelt er substitueret en eller flere gange med en hydroxymethylgruppe, hvis hydroxylgrupper eventuelt 35 er beskyttet, R2 betyder en aminobeskyttende gruppe, R3 betyder en beskyttet aminogruppe, og X, m og n har de ovenfor 2

DK 164855 B

anførte betydninger, og om ønsket omdanner en forbindelse med den almene formel I til et fysiologisk acceptabelt salt deraf.

Spergualin er en forbindelse, der er isoleret fra et 5 filtrat af en kultur af en spergualin-frembringende mikroorganisme fra Bacillus-slægten. Den følgende formel viser spergualins struktur: H2NCNHiCH2)4CHCH2CONH-CHCO-NHCH2CH2CH2CH2SHCK2CH2CH2NH2 10 NH OH OH (III)

Spergualin er i stand til at inhibere væksten af grampositive og gramnegative mikroorganismer. Spergualin har vist sig at have betydelige terapeutiske og livsforlængende virk-15 ninger ved forsøg på at helbrede museleukæmi L-1210, museleukæmi EL-4 og Ehrlich’s carcinoma 180 (S-180). Spergualin betragtes derfor som et lovende anti-tumormiddel (jfr. japansk patentansøgning LOP nr. 48957/1982).

Ifølge Umezawa et al. har det desuden vist sig, at sper-20 gualin-derivater, såsom acylerede forbindelser i 15-stilling, har lignende virkninger (jfr. japansk patentansøgning LOP nr. 185254/1982 og 62152/1983).

Spergualin og kendte derivater deraf er imidlertid u-stabile i vandig opløsning.

25 Der har derfor været gennemført forskellige undersø gelser for at finde spergualin-beslægtede forbindelser, der er stabile og bevarer deres høje aktivitet i vandige opløsninger. Som et resultat heraf, har det vist sig, at forbindelserne med formlen (I) har en højere stabilitet end spergua-30 lin, samtidig med at de har bevaret deres høje aktivitet over for museleukæmi, jvf. forsøgsresultaterne side 20-21. Yderligere har forbindelserne med formlen (I) en relativt lav toksicitet og betragtes derfor som værende anvendelige som lægemidler, såsom til behandling af cancer.

35 Ri forbindelsen (I) betyder fortrinsvis methylen, ethylen, propylen, hydroxymethylmethylen, 1-hydroxymethyl-

O

3

DK 164855 B

ethylen, 2-hydroxymethvlethylen, 1,2-di(hydroxymethyl)ethy-len, 1-hydroxymethylpropylen, 2-hydroxymethylpropylen, 3-hy-droxymethylpropylen, 1,2-di(hydroxymethyl)propylen, 1,3-di-(hydroxymethyl)propylen, 2,3-di(hydroxymethyl)propylen eller 5 1,2,3-tri(hydroxymethyl)propylen. Såfremt X er et halogen atom, kan det betyde chlor, brom, fluor eller iod.

Methylengrupperne i formlen (I) kan være i ortho-, meta- eller para-stilling i forhold til hinanden.

I det følgende er anført en række specifikke eksemp-10 ler på spergualin-beslægtede forbindelser med formlen (I), hvor GP, GMP, GPro og TAD er forkortelserne for henholdsvis "guanidinophenyl", "guanidinomethylphenyl", "guanidinopro-pyl" og "triazadecan":

10-{N-[4-(3-GP)butanoyl]glycyl)-1,5,10-TAD 15 lo-}N-[4-(3-GP)butanoyl]-L-seryl} -1,5,10-TAD 10-{N-[4-(4-GP)butanoyl]glycyl}-l,5,10-TAD 10-{N-[4-(4-GP)butanoyl]-L-seryl}-l,5,10-TAD 10—{N—[4-(4-GP)butanoyl]-f3-alanyl)-l, 5,10-TAD 10-{N- [4- (4-GP)butanoyl] -γ-aminobutanoyl)-1,5,10-TAD 20 10-jN- [4- (2-chlor-4-GP)butanoyl]glycylj-l,5,10-TAD

10-{N- [4 - (2-chlor-4-GP)butanoyl] -L-seryl J.-1, 5,10-TAD 10- {N- [4- (2-chlor-4-GP) butanoyl] -β-alanyl}-!, 5,10-TAD 10-{N- [4- (2-chlor-4-GP) butanoyl] -γ-aminobutanoyl}-l, 5,10-TAD 10-{N-[4-(3-chlor-4-GP)butanoyl]-glycyl}-1,5,10-TAD 25 lo-{N-[4-(3-chlor-4-GP)butanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD

10-γΝ-[4-(3-chlor-4-GP)butanoyl]-β-alanyl}-1,5,10-TAD 10- {N- [ 4 - (3 -chlor-4 -GP) butanoyl ] -γ-aminobutanoyl j -1,5,10-TAD 10-}N-[3-(2-fluor-4-GP)butanoyl]glycylj-l,5,10-TAD 10-{N-[4-(2-fluor-4-GP)butanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD 30 io-{ N-[4-(3-fluor-4-GP)butanoyl]glycyl}-1,5,10-TAD

10-}N-[4-(3-fluor-4-GP)butanoyl]-L-seryl3-1,5,10-TAD 10-{N-[5-(3-GP)pentanoyl]glycylj-l,5,10-TAD 10-}N-[5-(3-GP)pentanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD 10-{N-[5-(4-GP)pentanoyl]glycyl}-1,5,10-TAD 35 10-{N-[5-(4-GP)pentanoyl]-L-seryl}-l,5,10-TAD

10—}N—[5-(2-chlor-4-GP)pentanoyl]glycylj-l,5,10-TAD

O

4

DK 164855 B

10-fN- [5-(2-chlor-4-GP)pentanoyl]-L-seryl·}-1,5,10-TAD 10-{N-[5-(3-chlor-4-GP)pentanoyl]glycyl}-1,5,10-TAD 10-{N-[5-(3-chlor-4-GP)pentanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD 10-(N-[6-(4-GP)hexanoyl]glycyl}-1,5,10-triazadecan 5 10-{N-[6-(4-GP)hexanoyl]-L-serylj-1,5,10-TAD

10—{N— [6- (2-chlor-4-GP)hexanoyl] glycylj -1,5,10-TAD 10-fN-[6-(2-chlor-4-GP)hexanoyl] -L-seryl}-l,5,10-TAD 10-jN-[6-(3-chlor-4-GP)hexanoyl]glycylj-1,5,10-TAD 10-4N- [6-(3-chlor-4-GP)hexanoyl]-L-serylj-1,5,10-TAD 10 10-·{N- [3- (3-GMP)propanoyl] glycylj -1,5,10-TAD

10-^N-[3-(3-GMP)propanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD 10--jN- [3 - (4-GMP) propanoyl] -glycylj -1,5,10-TAD 10-ίN-[3-(4-GMP)propanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD 10-|N-[3-(2-chlor-4-GMP)propanoyl]glycyl}-l,5,10-TAD 15 10—{n—[3-(2-chlor-4-GMP)propanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD

10—{n— [3-(3-chlor-4-GMP)propanoyl]glycylj -1,5,10-TAD 10-{N-[3-(3-chlor-4-GMP)propanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD 10-{N-[4-(4-GMP)butanoyl]glycyl}-1,5,10-TAD 10-{N-[4-(4-GMP)butanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD 20 io-{N-[4-(2-chlor-4-GMP)butanoyl]glycyl}-l,5,10-TAD

10-{N-[4-(2-chlor-4-GMP)butanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD 10-{N-[4-(3-chlor-4-GMP)butanoyl]glycylj-1,5,10-TAD 10-{N—[4-(3-chlor-4-GMP)butanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD 10-{N-[5-(2-GMP)pentanoyl]glycylj -1,5,10-TAD 25 io-{n-[5-(2-GMP)pentanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD 10-{N-[5-(4-GMP)pentanoyl]glycylj-1,5,10-TAD 10-{IS!— [5- (4-GMP) pentanoyl] -L-seryl] -1,5,10-TAD 10-{N-[5-(2-chlor-4-GMP)pentanoyl]-glycyl} -1,5,10-TAD 10-{N-[5-(2-chlor-4-GMP)pentanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD 30 10-{N-[5-(3-chlor-4-GMP)pentanoyl]glycylj -1,5,10-TAD

10—{N— [5- (3-chlor-4-GMP) pentanoyl] -L-seryl}-l, 5,10-TAD 10-f N-[3-(3-GPro)benzoyl]glycyl}-l,5,10-TAD 10-{N-[3-(3-GPro)benzoyl]-L-serylJ-1,5,10-TAD 10—(N-[4-(3-GPro)benzoyl]glycylj-1,5,10-TAD 35 10-{N-[4-(3-GPro)benzoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD

10-{N-[2-chlor-4-(3-GPro)benzoyl]glycylj-Ι,5,10-TAD

O

5

DK 164855 B

10-{N-[2~chlor-4-(3-GPro)benzoyl]-L-seryl)-1,5,10-TAD 10-{N-[3-chlor-4-(3-GPro)benzoyl]glycylj-1,5,10-TAD 10-{N-[3-chlor-4-(3-GPro)benzoyl] -L-serylJ-1,5,10-TAD 10-{N-[3-(4-(3-GPro) phenyl)propanoyl]glycyl}-1,5,10-TAD

5 10- |N-[3-(4- (3-GPro) phenyl)propanoyl]-L-seryl}-1,5,10-TAD

10-jN-[3-(2-chlor-4-(3-GPro)phenyl)propanoyl]glycyl}-l,5,10--TAD

10-{N-[3-(2-chlor-4-(3-GPro)phenyl)propanoyl]-L-seryl}--1,5,10-TAD

10 10- {n-[3-(3-chlor-4-(3-GPro)phenyl)propanoyl]glycyl}-1,5,10-

-TAD

10-{n-[3-(3-chlor-4-(3-GPro)phenyl)propanoyl]-L-seryl}--1,5,10-TAD.

Spergualin-forbindelserne med formlen (I) danner sal-15 te med syrer. De saltdannende syrer kan være uorganiske eller organiske, når blot de er ikke-toksiske. Der kan anvendes vilkårlige ikke-toksiske uorganiske syrer, men der foretrækkes saltsyre, svovlsyre, salpetersyre og phosphorsyre. Selv om der ikke er nogen særlig begrænsning med hensyn til 20 de anvendte organiske syrer, foretrækkes der eddikesyre, pro-pionsyre, ravsyre, fumarsyre, maleinsyre, æblesyre, vinsyre, glutar syre, citronsyre, benzensulfonsyre, toluensulfonsyre, me-thansulfonsyre, ethansulfonsyre, propansulfonsyre, asparagin-syre og glutaminsyre.

25 De spergualin-beslægtede forbindelser med formlen (I) ifølge'opfindelsen kan fremstilles ud fra beskyttede spergualin-beslægtede forbindelser med formlen (II) ved at fjerne beskyttelsesgrupperne på kendt måde.

Symbolerne X, ni og n i formlen (II) i udgangsforbin-30 delsen har samme betydninger som anført i forbindelse med forbindelserne med formlen (I). Symbolet ' betyder en C^_^--alkylengruppe, der som substituent kan have en hydroxyme-thylgruppe, og om nødvendigt, kan hydroxylgruppen være beskyttet med en gængs beskyttelsesgruppe. Der kan anvendes 35 vilkårlige kendte beskyttelsesgrupper, jfr. f.eks. "Protein Chemistry I: Amino acids and peptides", udgivet af Shiro

O

6

DK 164855 B

Akabori, Takeo Kaneko og Kozo Narita, Kyoritsu Shuppan, 1969; "Peptide Synthesis", udgivet af Nobuo Izumiya, Maruzen, 1975; E. Schroder og K. Lubke: "The Peptides", Academic Press, New York, 1965; E. Wiisch: "Methoden der Organischen Chemie (Hou-5 ben, Weyl), Synthese von Peptiden", Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1974 og M. Bodanszky og M.A. Ondetti: "Peptide Synthesis", Interscience Publishers, New York, 1976. Der kan anvendes vilkårlige kendte aminobeskyttelsesgrupper som substituenten °9 som beskyttelsesgruppen på_ aminogruppen 10 · Gruppen R£ og den gruppe, der beskytter aminogruppen , kan være ens eller forskellige. Forskellige grupper kan anvendes i passende kombinationer. For at sikre håndteringen foretrækkes det imidlertid, at de to grupper er ens. Eksempler på amino- eller hydroxy-beskyttelsesgrupper er en even-15 tuelt substitueret C1_^-alkanoylgruppe, en phenyl-mono- eller dicarbonylgruppe, en eventuelt substitueret C1_5~alkylgruppe, en eventuelt substitueret phenylthio- eller C^__3~alkylthio-gruppe og en eventuelt substitueret phenylsulfonylgruppe. Eksempler på substituenter på disse gruppers alkyl- eller alk-20 oxygruppe er et halogenatom, en nitrogruppe og en substitueret eller usubstitueret phenylgruppe. Eksempler på substituenter på phenylgruppe er et halogenatom, en nitrogruppe, en C^_3-alkoxygruppe, en C^_3-alkylgruppe og en eventuelt substitueret phenylazogruppe. Den specifikke fremgangsmåde til 25 fjernelse af beskyttelsesgrupperne fra de beskyttede sper-gualinbeslægtede forbindelser med formlen (II) varierer med den anvendte type beskyttelsesgruppe, men der kan anvendes en vilkårlig kendt metode (jfr. f.eks. de ovenfor anførte referencer) .

30 Beskyttelsesgrupperne kan fjernes ved temperaturer, der ikke overstiger det anvendte opløsningsmiddels kogepunkt, og de varierer med typen af beskyttelsesgrupper eller typen af opløsningsmiddel. Temperaturen ligger alminde-

ligevis i området fra -50°C til 150°C, fortrinsvis i Område O O

det fra -40 C til 120 C. Egnede opløsningsmidler kan være uorganiske eller organiske. Eksempler på uorganiske opløs- 7

DK 164855 B

O

ningsmidler er vand, flydende ammoniak og flydende hydrogenfluorid. Eksempler på organiske opløsningsmidler er vandige opløsningsmidler, såsom C^_^-alkoholer, eddikesyre, dimethyl-formamid og dioxan såvel som lavere alkylestere af eddikesy-5 re. Disse opløsningsmidler kan anvendes i blandinger, om nødvendigt.

Afhængende af typen af beskyttelsesgrupper, der skal fjernes, bør den rigtige metode vælges blandt reduktion (f.eks. katalytisk reduktion eller reduktion med et alkalimetal og 10 ammoniak), hydrolyse, syresønderdeling og hydrazinsønderdeling. I den følgende tabel I er anført foretrukne beskyttelsesgrupper og foretrukne metoder til deres fjernelse.

I tabel I indikerer symbolet "+", om en specifik beskyttelsesgruppe kan fjernes, og en fremgangsmåde mærket "+" 15 skal anvendes til fjernelse af beskyttelsesgruppen. Symbolet indikerer, at en specifik beskyttelsesgruppe ikke kan fjernes med fremgangsmåden mærket . Symbolet viser, at en specifik beskyttelsesgruppe fjernes eller sønderdeles delvis, og fremgangsmåden mærket med dette symbol er ikke sær-20 lig egnet til fjernelse af den specielle beskyttelsesgruppe.

De beskyttelsesgrupper, der kan anvendes i den foreliggende opfindelse, er ikke begrænset til de i tabel I anførte, og der kan anvendes en vilkårlig af de grupper, der er nævnt i de ovenfor anførte referencer vedrørende peptid-25 kemi.

30 35

DK 164855 B

O

8

Tabel I

Beskyttelsesgrup- H2/Pd Na/NH3 HBr/AcOH HC1 AcOH

pefjemer _ 5 Opløsningsmiddel lavere alko- flydende eddike- ethylace- eddike- hold., dimethyl airmoniak syre tat, lave- syre fornamid, re alko- eddikesyre hol,eddi- syre, di- ______oxan__

Temperatur ST ~ 50 °C < -30°C 0 ~ 50°C 0°C - S3 0°C ~ kp.

10------

Tryk atm. til ? atm. atm. atm. atm.

100 kg/cnr c^ci^oco- + + + ± CCCH^OCO- - - + + ± (CgHjijC- + + ± + + cf,-@-so2- - + - - - 20 HCO- - - + — cg___j__:__- - CF,CO- - ± ± 25 3 CHg 0^)-0^000- + + + + R-(^-CH20C0- + + ' + + 30 %ν»ϋ- + ‘ ^’/CHOCO- - + CH2-CHf 35 (C^CHOCCK + + +__

Tabel I (fortsat)

O

9

DK 164855 B

Beskyttelsesgrup- H-./Pd Na/NH_ HBr/AcOH HC1 AcOH

pefjerner_ 5 Opløsningsmiddel lavere alko- flydende eddike- ethylace- eddikehol , dimethyl· anmoniak syre tat, lave- syre formamid, re alko- eddikesyre hol, eddike· syre, di- _______oxan__ 10 O-S" + + ^no2 (CHJ.CHOCO- - - I ± -> ά % · « t · 15 «-------- 20 25 30 35

DK 164855 B

Tabel I (fortsat) o 10

Beskyttelses- CF-.COOH NH-NH- NaOH NH.OH Flyd. HF CF_SO.,H

gruppef j emer _ _ 4_ ^ 0 I Opløsningsmid- trifluored- lavere vand,lavere /and,Have.- flydende trifluor 5 del dikesvre alkohol alkohol re alko- hydrogen- eddike hol fluorid syre, _______anisol

Temperatur 0°C ~ ST ST ~kp. 0 ~ 50°C 0 ~ 5°°C < 20°C ^

Ttyk atm. atm. atm. atm. atm. atm.

io cy^cHgOco- ± - + +

CiCH^OCO- + - - - + + (w3°- + 15------- CHj-^-SOg- - - - ± HCQ- - - - - — 20 i^V' N + + ± _______ CF^CO- - ± + +

CltO^VCH^OCO- +__=__=__=___+_ 25 ^0-ch2oco- ....

* ά CHOCO- - + 30 Ci^-CHf (CgH^CHOCO- + O-s- + + 35 ά_______ _____;__ (CHJjCHOCO- + o

Tabel I (fortsat) 11

DK 164855 B

Fork. H2/Pd Na/NH3 HBr/AcOH HC1 AcQH

Beskyttelses- H_ i nærvær metallisk hydrogen- hydrogen- eddike- gruppefjerner__ar Pd__Na__bramid__chlorid syre

Opløsningsmid- lavere al- flydende eddike sy- ethylace- eddikedel kohol, di- ammoniak re tat, lave- syre rre thyl form- re alkohol, amid, eddi- eddikesyre ___kesyre_____dioxart _

Temperatur ST~ 50°C < -30°C 0 ~ 50°C 0°C ~ SI 0°C ~ kp.

10-------

Tryk at-11· ~ p atm. atm. atm. atm.

100 kg/cnr CH^CO- - - 15 C.E-CO- ° -3 (phenol Isk)___[_ (CH^C- + + CH^iLCHj- + + ± - CH_-O)-S0o - + - (pnenollskj_______ ni - * ♦ 25 C.1LCH-0C0- + + + b ' phenol i sk)______ (CÆ)-C- + + +

633_i_ I_ I

30 35 12

DK 164855 B

o i

Tabel I (fortsat) ! i

Fork. CF3COOH NH2NH2 NaOH NH^OH flyd. HF CF3S03 j 5 Beskyttelses- trifluor- hydra- natrium- aimoni- flydende trifluor- i gruppef jemer eddikesy- zin hydroxid ak hydrogen- methan- i re fluorid sulfan- _______syre j

Opløsnings- trifluor- lavere vand, la- vand, flyd. hy- trifluor- ; middel eddikesy- alkohol vere al- lavere drogen- eddikesy- i __re___kohol__alkohol fluorid re.anisol · 10 Temperatur O'C - ST ST^kp. 0 - 50°C 0-50°C"^20eC ST :j 'Fryk atm. atm. atm. atm. atm. atm.

CH^CO- — + + + — — 15 CgHgCO- + (phenolisk)_______ (CH^)^C— + - — + + 20 CHgH^C^- — — - — + -f (phenolisk)_______ 25 Q-____~____ C6H5CH20C0- + + + _(phenolisk'_____J_ 30 35

O

13

DK 164855 B

Fremgangsmåden til isolering af de spergualin-beslæg-tede forbindelser med formlen (I) fra reaktionsblandingen, der er befriet for beskyttelsesgrupperne, varierer med den specifikke metode til fjernelse af beskyttelsesgrupperne.

5 Såfremt beskyttelsesgrupperne er fjernet ved katalytisk reduktion med palladiumsort, kan den spergualin-beslægtede forbindelse isoleres ved en fremgangsmåde, der omfatter frafiltrer ing af katalysatoren, koncentrering af filtratet under formindsket tryk og rensning af remanensen ved kendt metode 10 under anvendelse af "CM-Cephadex" _(Na+) og "Cephadex" LH-20 (jfr. T. Takeuchi et al., J. Antibiotics, 34, 1619 (1981)). Såfremt beskyttelsesgrupperne er fjernet med trifluoreddike-syre, består isoleringen i koncentrering af reaktionsblandingen under formindsket tryk og rensning af remanensen på 15 kendt måde som vist ovenfor.

Ved at anvende en af de ovenfor viste rensningsmetoder fås de spergualin-beslægtede forbindelser med formlen (I) som hydrochlorider. Såfremt der ønskes andre saltformer, kan der anvendes følgende fremgangsmåde: hydrochloridet oplø-20 ses i vand, den resulterende vandige opløsning passeres gennem en stærk basisk ionbytterharpiks, de fraktioner, der indeholder slutforbindelsen, forenes, den tilsvarende syre, en vandig opløsning indeholdende denne eller dens opløsning i et hydrofilt organisk opløsningsmiddel, såsom methanol, ethanol, 25 acetone, tetrahydrofuran eller dioxan, og den neutraliserede opløsning inddampes til tørhed under formindsket tryk. Eventuelt resterende organisk opløsningsmiddel bortdestilleres under formindsket tryk, og remanensen frysetørres. Alternativt sættes en vandig opløsning af sølvhydroxid eller sølv-30 oxid til hydrochloridsaltet af forbindelsen med formlen (I) til neutralisering af hydrochloridsyren, og efter frafiltre-ring af uopløseligt sølvchlorid, tilsættes en tilsvarende syre til dannelse af et salt, der derefter frysetørres.

Typiske eksempler på beskyttede spergualin-beslægte-35 de forbindelser med formlen (II) er anført i det følgende, o 14

DK 164855 B

diZ og diBOC er forkortelserne for henholdsvis "dibenzyloxy-carbonyl" og "di-tert.butoxycarbonyl":

10- {N- [ 4- (3-GP) butanoyl] glycy-1,5-diZ -1,5,10-TAD

10-{N-[4-(3-GP)butanoyl]glycy1]-1,5-diBOC-l,5,10-TAD 5 10-1N-[4-(3-GP)butanoyl]-O-benzyl-L-serylj-1,5-diZ-1,5,10-TAD

10-{N-[4-(3-GP)butanoyl]-0-tert.butyl-L-serylJ-1,5-diBOC--1,5,10-TAD

10-(N-[4-(4-GP)butanoyl]glycyl}-1,5-diZ-l,5,10-TAD

10-{n-[4-(4-GP)butanoyl]glycyl]-1,5-diBOC-l,5,10-TAD 1o 10-{N-[4-(4-GP)butanoyl]-0-benzyl-L-seryl3-1,5-diZ-1,5,10-TAD

10-{N-[4-(4-GP)butanoyl]-0-tert.butyl-L-seryl} -1,5-diBOC--1,5,10-TAD

10-{N-[4-(4-GP)butanoyl]-β-alanylj-1,5-diZ-l,5,10-TAD 10-{n-[4-(4-GP)butanoyl]-γ-aminobutanoylj-l,5-diZ-l,5,10-TAD 15 10-{n-[4-(2-chlor-4-GP)butanoyl]glycyl]-1,5-diZ-l,5,10-TAD

10-{N-[4-(2-chlor-4-GP)butanoyl]-O-benzyl-L-seryl]-1,5-diZ--1,5,10-TAD

10-{li—[4—(2—chlor—4—GP)butanoyl]-Y-aminobutanoyl3-l,5-diZ--1,5,10-TAD

20 10-{N-[4-(3-chlor-4-GP)butanoyl]-glycyl]-1,5-diZ-l,5,10-TAD

10-{N-[4-(3-chlor-4-GP)butanoyl]-O-benzyl-L-seryl]-1,5-diZ--1,5,10-TAD

10-{n-[4-(3-chlor-4-GP)butanoyl]-β-alanylj-1,5-diZ-Ι,5,10-TAD 10-{N-[4-(2-fluor-4-GP)butanoyl]-glycyl]-1,5-diZ-1,5,10-TAD 25 10-·{ν-[4- (2-fluor-4-GP)butanoyl] -0-benzyl-L-seryl3-l,5-diZ-

-1,5,10-TAD

10-{N-[4- (3-fluor-4-GP) butanoyl] -glycy 1]-1,5-diZ-l, 5,10-TAD 10- {N-[4-(3-fluor-4-GP)butanoyl]-0-benzyl-L-seryl}-l,5-diZ--1,5,10-TAD

30 10-^N-[5-(4-GP)pentanoyl]-O-benzyl-L-seryl]-1,5-diZ-Ι,5,10-TAD

10-|n-[5-(2-chlor-4-GP)pentanoyl]glycyl]-1,5-diZ-l,5,10-TAD 10— ^N—[5-(3-chlor-4-GP)pentanoyl]glycyl]-1,5-di Z-1,5,10-TAD 10-j N-[5-(3-chlor-4-GP)pentanoyl]-O-benzyl-L-seryl]-1,5-diZ -1,5,10-TAD

35 10-(n-[6-(4-GP)hexanoyl]glycyl]-1,5-diZ-l,5,10-TAD

O

15

DK 164855 B

10-^N-[6-(4-GP)hexanovl]-O-benzyl-L-seryl}-1,5-diZ-l,5,10-TAD 10-/N-[6-(3-chlor-4-GP)hexanoyl]-0-benzyl-L-seryl}-l,5-diZ--1,5,10-TAD

10-IN-[3-(3-GMP)propanoyl)-O-benzyl-L-seryl|-1,5-diZ-l,5,10-5 "TAD

10-{N-[3-(4-GMP)propanoyl)-O-benzyl-L-seryl} -1,5-diZ-l,5,10--TAD

10—IN-[3-(2-chlor-4-GMP)propanoyl]-glycy lj-1,5-diZ-l,5,10-TAD 10-{n-[3-(2-chlor-4-GMP)propanoyl] -O-benzyl-L-serylj -1,5-diZ-10 -1,5,10-TAD

10-/N-[3-(3-chlor-4-GMP)propanoyl] -glycy1}-l,5-diZ-l,5,10-TAD 10—(N-[3-(3-chlor-4- GMP)propanoyl]-O-benzyl-L-seryl}-1,5-diZ--1,5,10-TAD

10-fN-[4-(4-GMP)butanoyl]glycylj-l,5-diZ-l,5,10-TAD 15 10-{N-[4-(4-GMP)butanoyl]-O-benzyl-L-seryl} -1,5-diZ-l,5,10-TAD

10—|n—[4 —(3-chlor-4-GMP]butanoyl)-O-benzyl-L-seryl}-1,5-diZ--1,5,10-TAD

10-|N-[5- (2-GMP)pentanoyl]-O-benzyl-L-seryl} -1,5-diZ-l,5,10--TAD

2o 10-{N-[5-(4-GMP)pentanoyl]glycyl}-l,5-diZ-l,5,10-TAD

10-{N-[5-(2-chlor-4-GMP)pentanoyl]glycylj-l,5-diZ-l,5,10-TAD 10-fN-[5-(2-chlor-4-GMP)pentanoyl]-O-benzyl-L-seryl}-1,5-diZ--1,5,10-TAD

10— iN—[3-(3-GPro)benzoyl]glycyl}-1,5-diZ-l,5,10-TAD 25 10—{N- [3- (3-GPro) benzoyl] glycyl}-0-benzyl-L~seryl}-diZ-l ,5,10-

-TAD

10—(N—[4-(3-GPro)benzoyl]glycyl]-1,5-diZ-l,5,10-TAD 10-IN-[4-(3-(GPro)benzoyl]-O-benzyl-L-seryl}-1,5-diZ-1,5,10-TAD 10-{N-[2-chlor-4-(3-GPro) benzoyl]glycyl} -1,5-diZ-l,5,10-TAD 30 10-(N-[2-chlor-4-(3-GPro)benzoyl]-O-benzyl-L-seryl}-1,5-diZ-

-1,5,10-TAD

10-{N-[3-(4-(3-GPro) phenyl)propanoyl]glycyl}-1,5-diZ-1,5,10--TAD

10-IN-[3-(3-(4-GPro)phenyl)propanoyl]-O-benzyl-L-seryl}-1,5-35 -diZ-1,5,10-TAD

O

16

DK 164855 B

10-]N-[3-(2-chlor-4-(3-GPro) phenyl)propanoy1]glycyl}-1,5--diZ-1,5,10-TAD

10-{N-[3-(2-chlor-4-(3-GPro)phenyl)propanoyl]-O-benzyl-L--serylj -1,5-diZ-l, 5,10-TAD

5 10-{N-[3-(3-chlor-4-(3-GPro)phenyl)propanoyl]glycyl} -1,5-

-diZ-1,5,10-TAD

10-Ίν-[3-(3-chlor-4-(3-GPro)phenyl)propanoyl]-O-benzyl-L--serylj--1,5-diZ-l,5,10-TAD.

De beskyttede spergualin-beslægtede forbindelser med 10 formlen (II) , der anvendes som udgangsforbindelse til fremstilling af slutforbindelsen ifølge opfindelsen, er hidtil ukendte og kan fremstilles på følgende måde: først omsættes et 1,5-di-beskyttet-1,5,10-TAD med formlen 15 ^2 h2n(ch2)4n(ch2)3-r3 (IV) hvor R2 og R3 har samme betydning som anført ovenfor, med et reaktivt derivat af en N-beskyttet α-, β- eller γ-amino-20 syre med formlen r5-r6-cooh (V) hvor R^ betyder en aminobeskyttelsesgruppe, der er forskel-25 lig fra R2 og aminobeskyttelsesgruppen i R3, Rg betyder en α-,. β- eller γ-aminoalkylgruppe, der kan have en hydroxymethyl gruppe som substituent, og hvor hydroxylgruppen eventuelt kan være beskyttet, til dannelse af 10-(N-beskyttet ami-noacyl)-1,5-di-beskyttet-l,5,10-TAD med formlen 30 *2 R5-R6-CONH(CH2)4N(CH2)3R3 (VI) hvor R2, R3, Rg og Rg har samme betydning som anført ovenfor, 35 hvorefter beskyttelsesgruppen R^ fjernes fra forbindelsen

O

17

DK 164855 B

(VI) til dannelse af 10-aminoacyl-l,5-di-beskyttet-l,5,10--TAD med formlen *2 5 H2N-R1,-CONH(CH2)4N(CH2)3 (VII) hvor R·^', R2 R3 ^ar sarnme betydning som anført ovenfor, og den fremkomne forbindelse omsættes med et reaktivt derivat af cu-guanidinosyren, der indeholder en phenylengrup-10 pe og er repræsenteret ved formlen

X

(Y) V(CH2)n-C00H (A) H..NCNH(CH~) 15 2 |j 2 m

NH

hvor m, n og X har samme betydning som anført ovenfor, hvorved den beskyttede spergualin-beslægtede forbindelse med formlen (II) syntetiseres.

20 Forbindelsen med formlen (VII) kan kondenseres med forbindelsen med formlen (A) ved en vilkårlig gængs metode, der anvendes til dannelsen af en peptidbinding. Som eksempler til illustrering heraf skal nævnes syrechloridmetoden, carbodiimidmetoden, ved hvilken der anvendes dicyclohexyl-25 carbodiimid eller l-ethyl-8-(3-dimethylaminopropyl)carbodi-imid, azidmetoden, ved hvilken der anvendes hydrazid, blandet syreanhydridmetoden, ved hvilken der anvendes ethyl-chlorcarbonat eller isobutylchlorcarbonat, aktivestermeto-den, ved hvilken der anvendes en cyanomethylester, vinyl-30 ester, substitueret eller usubstitueret phenylester, thio-phenylester eller hydroxyravsyreimidoester, o-acylhydroxyl-aminderivatmetoden, ved hvilken der anvendes acetoxim eller cyclohexanonoxim, og N-acylforbinde 1 semetoden, ved hvilken der anvendes carbonyldiimidazol. Kondensationsopløsnings-35 midlet kan være et vilkårligt gængs opløsningsmiddel, som 18

DK 164855 B

O

anvendes til peptidbinding. Eksempler på opløsningsmidler er ethere, såsom diethylether, tetrahydrofuran og di-oxan, ketoner, såsom acetone og methylethylketon, halogenerede carbonhydrider, såsom methylenchlorid og chloroform, 5 amider, såsom dimethylformamid og dimethylacetamid, og ni-triler, såsom acetonitril. Eksempler på tu-guanidinosyre med formlen (A) er 4-(3- eller 4-GP)smørsyre, 4-(2- eller 3- chlor-4-GP)smørsyre, 4-(2- eller 3-fluor-4-GP)smørsyre, 5-(3- eller 4-GP)valeriansyre, 5-(2- eller 3-chlor-4-GP)- 10 valeriansyre, 6-(2- eller 3-chlor- eller fluor-4-GP)capron-syre, 3-(3- eller 4-GMP)propionsyre, 3-(2- eller 3-chlor-eller fluor-4-GMP)propionsyre, 4-(3- eller 4-GMP)smørsyre, 4- (2- eller 3-chlor- eller fluor-4-GMP)smørsyre, 5-(2-, 3- eller 4-GMP)valeriansyre, 5-(2- eller 3-chlor- eller 15 fluor-4-GMP)valeriansyre, 3- eller 4-(3-GPro)benzoesyre, 2- eller 3-chlor- eller fluor-(3-GPro)benzoesyre, 3—[3— eller 4-(3-GPro)phenyl]propionsyre og 3 — [2— eller 3-chlor-eller fluor-4-(3-GPro)phenyl]propionsyre. Disse uj-guani di -nosyrer syntetiseres ved behandling af en iv-aminosyre med 20 formlen

X

YQ^-<CH2>n-COOR7 (B) H~N (CH-) _ 25 2 2 m med et gængs guanidino-dannende middel til omdannelse af aminogruppen til en guanidinogruppe. Det resulterende produkt hydrolyseres derefter, såfremt R^ i formlen (B) betyder en lavere alkylgruppe. Nogle af ω-aminosyrerne med 30 formlen (B) er ligeledes hidtil ukendte forbindelser, og de kan syntetiseres ud fra forskellige udgangsforbindelser ved kombinering af kendte syntesemetoder.

I det følgende er anført en række eksempler på udgangsforbindelser med formlen (VII):

35 10-glycyl-l,5-diZ-l,5,10-TAD

o 19

DK 164855 B

10-glycyl-l,5-diBOC-l,5,10-TAD 10-(o-benzyl-L-seryl)-1,5-diZ-l,5,10-TAD 10-(o-tert.butyl-L-seryl)-1,5-diBOC-l,5,10-TAD ΙΟ-β-alany1-1,5-diZ-l,5,10-TAD 5 10-(3-alanyl-l,5-diBOC-l,5,10-TAD

10-γ-aminobutanoyl-1,5-diZ-l,5,10-TAD ΙΟ-γ-aminobutanoyl-l,5-diBOC-l,5,10-TAD.

Farmakologiske data; 10 Dataene for stabiliteten af forbindelserne ifølge opfindelsen i en vandig opløsning og for deres livsforlængende virkningsfuldhed over for museleukæmi L 1210 er vist i det følgende.

1. De her omhandlede forbindelsers stabilitet i vandig 15 opløsning.

(1) Forsøgsmetode.

Alle forbindelserne ifølge opfindelsen opløses i vand til en koncentration på 0,5 (w/w)%. Den vandige op-løsning opbevares ved 40 -1 C, og der udtages prøver med 20 nærmere angivne intervaller. Forbindelserne underkastes højtryksvæskechromatografi, og remanensen i procent beregnes for hver prøve ved at måle spidsarealforholdet.

(2) Forsøgsresultater.

Remanensen i procent for forbindelserne ifølge op-25 findelsen efter forløbet af et nærmere angivet tidsrum er vist i den følgende tabel II, hvor værdien for forsøgets begyndelse er angivet som 100%.

30 35 0 20

DK 164855 B

Tabel II

Remanens i procent for forbindelserne ifølge _opfindelsen i vandig opløsning_

Forbindelse Tid 5 r (eks. nr.) 0 12 24 48 72 120 168 1 100 99,8 99,6 99,8 99,5 99,6 99,5 2 100 99,7 99,9 99,8 99,9 100 .99,8 10 I ' 3 100 99,6 99,5 99,8 99,6 99,6 99,8 4 100 99,6 99,9 99,6 99,7 99,9 99,5 5 100 99,9 99,6 99,6 99,9 99,6 99,8 15 ' 6 100 99,5 99,8 99,7 99,7 .99,5 100 7 I 100 99,6 99,6 |l00 100 99,9 99,7 8 j 100 99,7 99,9 99,5 99,8 99,7 ' 99,8 · 20 9 100 99,8 99,8 99,7 100 99,5 99,6

Spergualin 100 94,6 90,8 84,6 78,5 69,9 65,1 25 2. De her omhandlede forbindelsers evne til in vitro at inhibere væksten af museleukæmi L 1210 celler.

(1) Forsøgsmetode.

Leukæmi L 1210 celler (1 x 10^/0,2 ml) transplanteres i bughulen på hunmus af stammen DBA/2. Fire dage se-30 nere udtages der en prøve af den abdominale væskeophobning, og denne centrifugeres, hvorved der fås de dyrkede L 1210 celler. Disse celler sættes til et RPMI 1640 substrat suppleret med føtalt kvægserum og 2-mercaptoethanol. Substratet fortyndes til dannelse af en suspension af L 1210 cel-35 ler med en slutkoncentration på 5 x 10^ celler/0,9 ml.

O

21

DK 164855 B

Forbindelserne ifølge opfindelsen opløses i det ovenfor anførte substrat, og der fremstilles en række opløsninger med slutkoncentrationer i området fra 0,062 til 100 pg/ml.

5 En portion (0,8 ml) af L 1210 cellesuspensionen blandes med 0,1 ml af forsøgsopløsningen i en petri-skål, og blandingen inkuberes i en C02-atmosfære i 48 timer ved 37°C. Celletallet bestemmes både før og efter inkuberin-gen, og der foretages en bestemmelse af koncentrationen 10 til inhibering af væksten af L 1210 celler med 50% af kontrollen (IC^q).

(2) Måleresultater.

I den følgende tabel III er vist evnen hos typiske eksempler på forbindelserne ifølge opfindelsen til at in-15 hibere væksten af museleukæmi L 1210 celler udtrykt som IC50*

Tabel III

Inhibering af væksten in vitro af muse-20 leukæmi L 1210 celler med forbindelser- _ne ifølge opfindelsen_

Forbindelse ^50 (eks. nr.) (yg/irJl) 4 1,1 25 7 0,92 8 0,97 30 3' De her omhandlede forbindelsers livsforlængende virk ning over for museleukæmi L 1210 samt deres toksicitet.

(1) Forsøgsmetode.

Leukæmiceller L 1210 (1 x 10^ celler/0,2 ml) transplanteres i bughulen på hunmus af stammen CDF 1-SLC (6 mus 35 pr. gruppe). To forbindelser ifølge opfindelsen fortyndes o 22

DK 164855 B

hver især med fysiologisk saltvand i forskellige koncentrationer, og idet forsøget indledes dagen efter transplantationen, indgives hver fortynding til musene i ni på hinanden følgende dage i en mængde på 0,1 ml/10 g le-5 gemsvægt/dag. Kontrolgruppen indgives kun fysiologisk saltvand.

Observationen af musene påbegyndes dagen efter transplantationen af L 1210 celler, og musene iagttages i 30 dage. Gennemsnittet af det antal dage, som hver mus 10 overlever, beregnes, således at man får det gennemsnitlige overlevelsestidsrum for hver behandlet gruppe. Dette gennemsnitstal divideres med gennemsnittet for kontrolgruppen, og resultatet multipliceres med 100, således at man får procent livsforlængelse (T/C). T/C-værdier 15 over 125 betragtes som værende effektive.

(2) Forsøgsresultater.

Den livsforlængende virkning (T/C) af typiske eksempler på forbindelserne ifølge opfindelsen over for museleukæmi L 1210 er anført i tabel IV.

20 25 30 35 o 23

DK 164855 B

Tabel IV

Livsforlængende virkning af forbindelser ifølge opfindelsen over for museleukæmi _L 1210_ 5

Forbindelse Dosis T/C

(eks.nr.)’ (mg/kg/dag) (%)

Kontrol 0,00 100 10 50.00 / 25.00 178 12,50 420 1 6,25 435 15 i 3.13 435 1.56 435 i 0,78 406 20 0,39 149 i------, j 50,00 15 25.00 435

» J

i i 12,50 435 25 2 6.25 435 3.13 435 1,5G 435 0.78 145

30 5 -HD

I 0,39 109 35 24

DK 164855 B

O

I det følgende er den foreliggende opfindelse beskrevet mere detaljeret ved hjælp af eksempler. Rf-værdierne for tyndtlagschromatografi (TLC), anført i de følgende eksempler-, er målt under anvendelse af følgende metode: 5 en silicagel 60 ^254 plade (tykkelse: 0,25 mm, fra Merck & Co.), fremkaldes ca. 8 cm med de anførte opløsningsmidler, og afstanden fra udgangspunktet og centrum for den plet, der hidrører fra den pågældende forbindelse, divideres med afstanden mellem udgangspunktet og den forreste ende af op-10 løsningsmidlet. Påvisningen foretages ved UV (2537 Å) med ninhydrin og Sakaguchi's reagens.

Eksempel 1 10-{N-[4-(4-GP-butanoyl]-L-seryl}-2,5,10-TAD trihydrochlo- 15 rid (forbindelse nr. 1)_ 4,06 g (4,89 mmol) 10-{N-[4-(4-GP-butanoyl]-0-ben-zyl-L-seryl3r-l/ 5,10-TAD hydrochlorid i form af en bleggul olie opløses i en blanding af 50 ml methanol og 30 ml eddikesyre. Opløsningen tilsættes 0,4 g palladiumsort, hvoref-20 ter den opvarmes til 55°C for at bevirke katalytisk reduktion i 6 timer ved atmosfærisk tryk. Efter omsætningen fra-filtreres katalysatoren, og filtratet koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 2,80 g olie. Denne olie opløses i 25 ml 60% (v/v) vandig methanolisk 0,3 M natrium-25 chloridopløsning, og opløsningen passeres gennem en søjle af 350 ml "CM-Cephadex" C-25 (Na+), der er ligevægtsindstillet med det samme opløsningsmiddel. Til eluering anvendes en gradientelueringsmetode mellem 2000 ml 60% vandig methanolisk 0,3 M natriumchloridopløsning og 2000 ml 60% (v/v) 30 vandig methanolisk 1,0 M natriumchloridopløsning. Fraktionerne indeholdende slutforbindelsen forenes og inddampes til tørhed under formindsket tryk. Remanensen tilsættes methanol, og det uopløselige natriumchlorid frafiltreres.

Den ønskede forbindelse renses fra det olieagtige produkt 35 på følgende måde: for at fjerne den resterende lille mængde

O

25

DK 164855 B

natriumchlorid opløses det olieagtige produkt i 5 ml methanol, og opløsningen passeres gennem en søjle fyldt med 100 ml "Cephadex" LH-20. Søjlen elueres med ethanol, og de fraktioner, der indeholder den ønskede forbindelse, 5 forenes og koncentreres under formindsket tryk. For at fjerne yderligere små mængder urenheder opløses det olieagtige produkt i 5 ml destilleret vand, og opløsningen passeres gennem en søjle fyldt med 80 ml "HP-20” (produkt fra Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.). Søjlen elueres 10 med destilleret vand, og de fraktioner, der indeholder den ønskede forbindelse, forenes og koncentreres under formindsket tryk. Det resulterende olieagtige produkt opløses i 5 ml destilleret vand og uopløseligt stof frafiltreres. Filtratet frysetørres, hvorved der fås 1,17 g af den ønske-15 de forbindelse (udbytte: 44,0%).

NMR (DMS0-dc) 0 $= 1,1-2,5 (b, 12H) , 2,5-3,4 (b, 8H) , 3,4-3,8 (bd, 3H) 4,0-4,5 (b, H), 6,8-7,7 (m, 8H), 7,7-8,8 (b, 5H) , 8,8-9,7 (b, 2H), 10,13 (bs, H) .

20 IR (KBr) V (cm"1) = 3290, 2940, 2320, 1635, 1510, 1450.

TLC (n-propanol : pyridin : vand : eddikesyre =6:4:3 : 2 v/v)

Rf = 0,34 25 [a]£9'5 - 13,8° (C = 1,17, H20) .

Eksempel 2 10—(n— [4 - (4-GP) butanoyl] glycyl jr-1,5,10-TAD trihydrochlorid (forbindelse nr. 2)_ 30 3,30 g (4,90 mmol) 10-ΊN-[4-(4-GP)butanoyl] glycylj·- -1,5-diZ-l,5,10-TAD i form af en bleggul olie opløses i 40 ml eddikesyre. Opløsningen tilsættes 0,3 g palladiumsort, og der opvarmes til 50°C for at bevirke katalytisk reduktion i 10 timer ved atmosfæretryk. Efter omsætningen frafiltreres kataly-35 satoren, og filtratet koncentreres under formindsket tryk til 26

DK 164855 B

O

dannelse af 2,10 g olie. Denne olie opløses i 10 ml destilleret vand, og opløsningen passeres gennem en søjle fyldt med 220 ml "CM Cephadex" C-25 (Na+). Søjlen elue-res ved gradientelueringsmetoden mellem 1100 ml destil-5 leret vand og 1100 ml vandig 1,0 M natriumchloridopløsning. De fraktioner, der indeholder den ønskede forbindelse, forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk. Det tørre faste produkt tilsættes methanol, og det uopløselige natriumchlorid frafiltreres.

10 Produktet renses ved de samme fremgangsmåder som anvendt i eksempel 1, og der fås 0,89 g af den ønskede forbindelse (udbytte: 35,3%).

NMR (DMSO-dg) 6 = 1,1-2,5 (b, 12H), 2,5-3,3 (b, 8H), 3,5-3,9 (bd, 2H) 15 6,9-7,7 (m, 8H), 7,7-8,3 (b, 3H), 8,3-10,0 (b, 5H).

IR (KBr) V(cm-1) = 3290, 2940, 2320, 1640, 1540, 1455.

TLC (n-propanol : pyridin : vand : eddikesyre =6:4:3 : 2 v/v) 20 Rf = 0,26.

Eksempel 3 10—{n— [3- (4-GP) propanoyl]L-seryl3r-l,5,10-TAD trihydrochlo- rid (forbindelse nr. 3)_ 25 2,60 g (3,27 mmol) l0-{N-[3-(4-GMP)propanoyl]-0-ben- zyl-L-serylJ-ljS-diZ-l,5,10-TAD i form af en bleggul olie opløses i en blanding af 40 ml methanol og 30 ml eddikesyre. Opløsningen tilsættes 0,20 g palladiumsort, og der opvarmes til 55°C for at bevirke katalytisk reduktion i 5 timer ved 30 atmosfærisk tryk. Efter omsætningen frafiltreres katalysatoren, og filtratet koncentreres under formindsket tryk til dannelse af 1,8 g olieagtigt produkt. Denne olie opløses i 10 ml destilleret vand, og ooløsningen passeres gennem en søjle fyldt med 220 ml "CM-Cephadex" C-25 (Na+). Eluerin-35 gen gennemføres ved anvendelse af gradientelueringsmetoden

O

27

DK 164855 B

mellem 1100 ml destilleret vand og 1100 ml vandig 1,2 M natriumchloridopløsning. De fraktioner, der indeholder den ønskede forbindelse, forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk. Det tørre faste stof tilsæt-5 tes methanol, og det uopløselige natriumchlorid frafil-treres.

Produktet renses på samme måde som beskrevet i eksempel 2, og der fås 0,84 g af slutforbindelsen (udbytte 47,2%) .

10 NMR (DMSO-dg) é>= 1,1-2,4 (b, 6H) , 2,4-3,4 (b, 12 H) , 3,4-3,9 (bd, 3H), 4,0-4,6 (bd, 3H), 6,8-7,7 (b, 4H), 7,2 (s, 4H), 7,7-8,7 (b, 6H), 8,7-9,7 (b, 2H).

IR (KBr) 15 cm"1) = 3310, 2940, 2320, 1640, 1535, 1450.

TLC (n-propanol : pyridin : vand : eddikesyre -6:4 : 3 : 2 (v/v)

Rf = 0,25 [a]£9'5 -24,8° (C = 1,0, H20).

20

Eksempel 4 10-{N-[4-(3-GPro)benzoyl]L-seryl}-l,5,10-TAD trihydrochlo- rid (forbindelse nr. 4)_ 2,00 g (2,52 mmol) 10-{N-[4-(3-GPro)-0-benzoyl]-0-25 -benzyl-L-servl}-l,5,10-TAD i form af en olie opløses i en blanding af 4 ml methanol og 20 ml eddikesyre. Opløsningen tilsættes 0,3 g palladiumsort, hvorpå der opvarmes til 50°C og gennemføres en katalytisk reduktion i 6 timer ved atmosfæretryk. Efter omsætningen frafiltreres katalysatoren, og 30 filtratet koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 2,60 g olie. Denne olie opløses i 10 ml destilleret vand, og opløsningen passeres gennem en søjle fyldt med 300 ml "CM Cephadex" C-25 (Na+). Eluering gennemføres ved anvendelse af gradientelueringsmetoden mellem 1100 ml de-35 stilleret vand og 1100 ml vandig 1,3 M natriumchloridopløs- o 28

DK 164855 B

ning. De fraktioner, der indeholder den Ønskede forbindelse, forenes og koncentreres til tørhed under formindsket tryk. Remanensen tilsættes methanol, og det uopløselige natriumchlorid frafiltreres. Det resulterende pro-5 dukt renses ved samme fremgangsmåder som anvendt i eksempel 1, og der fås 0,642 g af den ønskede forbindelse (udbytte : 49,9%).

NMR (DMSO-dg) 6= 1,2-2,4 (b, 8H) , 2,6-3,4 (b, 12H) , 3,4-4,2 (bd, 3H) , 10 4,2-4,7 (b, IH), 7,1-7,5 (b, 4H), 7,33 (s, 2H, J = 8 Hz), 7,7-8,8 (b, 6H), 7,90 (s, 2H, J = 8 Hz), 8.8- 9,7 (b, 2H).

IR (KBr) ^(cnf1) = 3300, 3150, 2950, 1640, 1535, 1500, 1460, 15 1290, 1060.

TLC (n-propanol : pyridin : vand : eddikesyre =6:4:3 : 2 (v/v).

Rf = 0,31 [a]^9'5 + 24,4° (C = 0,97, H20).

20

Eksempel 5 10-{n-[3-(3-GMP)propanoyl]L-seryl^-l,5,10-TAD trihydrochlo- rid (forbindelse nr. 5)_ 1,61 g (2,03 mmol) 10-^N-[3- (3-GMP)propanoyl] -0-ben-25 zyl-L-seryl}-l,5-diZ-l,5,10-TAD i form af en bleggul olie behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 3, og den ønskede forbindelse fås i en mængde på 0,54 g (48,2%).

NMR (DMSO-dg) 1,1-2,3 (b, 6H) , 2,3-3,4 (b, 12H) , 3,4-3,8 30 (bd, 3H), 4,0-4,6 (bd, 3H), 6,8-7,8 (m, 8H) , 7.8- 8,8 (b, 6H) , 8,8-9,7 (b, 2H).

IR (KBr) V(cm_1) = 3240, 2320, 1630, 1530, 1450.

TLC (n-propanol : pyridin : vand : eddikesyre =6:4 35 : 3 : 2 v/v) .

O

29

DK 164855 B

Rf = 0,30 [a]£9'5 - 22,0° (C = 1,0, H20).

Eksempel 6 5 10-^N-[5-(4-GP)pentanoyl]-L-serylj-l,5,10-TAD trihydro- chlorid (forbindelse nr. 6)_ 2,42 g (3,00 mmol) l0-{N-[5-(4-GP)pentanoyl]-0--benzyl-L-serylJ’-1,5,10-TAD i form af en bleggul olie behandles som beskrevet i eksempel 3, og den ønskede for-10 bindelse fås i en mængde på 0,69 g (41,1%).

NMR (DMSO-dg) 6= 1,1-2,5 (b, 14H), 2,5-3,3 (b, 8H), 3,4-3,7 (bd, 3H), 4,0-4,4 (b, H), 6,8-7,7 (m, 8H) , 7,7-8,7 (b, 5H), 8,7-9,7 (b, 2H), 10,05 (bs, H) .

15 IR (KBr) V(cm-1) = 3300, 2940, 2330, 1640, 1510, 1450.

TLC (n-propanol : pyridin : vand : eddikesyre =6:4 : 3 : 2 v/v)

Rf = 0,31 20 [ex]*9'5 - 13,9° (C = 1,07, H20).

Eksempel 7 10-{N[4-(3-GPro) benzoyl]-glycyl} -1,5,10-TAD trihydrochlo- rid (forbindelse nr. 7)_ 25 1,34 g (1,99 mmol) 10—[N-[4-(3-GPro)belzoyl] glycyl^- -1,5-diZ-l, 5,10-TAD i form af en olie opløses i 5 ml eddikesyre. Under afkøling tilsættes opløsningen 10 ml 25% opløsning af hydrogenbromid i eddikesyre. Efter omsætning i 30 minutter ved stuetemperatur under omrøring tilsættes 30 der tør ethylether, og det udfældende olieagtige produkt vaskes efterfulgt af dekantering af supernatanten. Denne procedure gentages yderligere to gange, og olielaget tørres under formindsket tryk, hvorved der fås 1,64 g olieag tigt produkt. Dette olieagtige produkt behandles derpå 35 som beskrevet i eksempel 2, hvorved der fås 0,427 g af den 0 30

DK 164855 B

ønskede forbindelse (udbytte: 39%).

NMR (DMSO-dg) 6= 1,1-2,4 (b, 8H) , 2,5-3,4 (b, 12H) , 3,7-4,0 (bd, 2H), 7,1-7,5 (b, 4H), 7,33 (d, 2H, 5 J = 8 Hz), 7,7-8,5 (b, 8H), 7,90 (d, 2H, J = 8 Hz), 8,5-8,9 (b, IH), 8,9-9,6 (b, 2H).

IR (KBr)

Vicm-1) = 3270, 2950, 2930, 1640, 1540, 1500, 1460, 1300.

10 TLC (n-propanol : pyridin : vand : eddikesyre =6:4 : 3 : 2 v/v)

Rf = 0,33.

Eksempel 8 15 10-{N-[5-(2-GMP)pentanoyl]-L-seryl}-l,5,10-TAD trihydro- chlorid (forbindelse nr. 8)____ 2,78 g (3,38 mmol) 10-{N-[5-(2-GMP)pentanoyl)-0--benzyl-L-serylJ-l,5-diZ-l,5,10-TAD i form af en bleggul olie behandles som beskrevet i eksempel 3, og den ønskede 20 forbindelse fås i en mængde på 0,81 g (udbytte: 41,1%).

NMR (DMSO-dg) b= 1,1-2,5 (b, 14H) , 2,5-3,4 (b, 8H) , 3,4-3,8 (bd, 3H), 4,0-4,6 (bd,3H), 6,8-7,7 (m, 8H), 7,7-8,8 (b, 6H) , 8,8-9,6 (b, 2H).

25 IR (KBr) 9(cm"1) = 3280, 2930, 2320, 1640, 1540, 1450.

TLC (n-propanol : pyridin : vand : eddikesyre =6:4 : 3 : 2 v/v)

Rf = 0,50 30 [a]19'5 - 13,9° (C = 1,02, H20).

35

O

31

DK 164855 B

Eksempel 9

10-^N-[3-(2-chlor-4-GMP)propanoyl]-L-seryl)-1,5,10-TAD

trihydrochlorid (forbindelse nr. 9)_ 1,60 g (1,86 mmol) 10-{N-[3-(2-chlor-4-GMP)propa-5 noyl]-0-benzyl-L-seryl]r-lf 5-diZ-1,5,10-TAD 1/3 phosphat i form af en olie blandes med 20 ml trifluoreddikesyre-opløsning af 3,00 g trifluormethansulfonsyre og 2,48 g thioanisol under afkøling med is, og der dannes en opløsning. Opløsningen får lov at reagere i 2 timer under om-10 røring ved stuetemperatur. Efter omsætningen tilsættes der 100 ml tør ether, og den udskilte olie vaskes efterfulgt af dekantering af supernatanten. Denne procedure gentages yderligere to gange, og det olieagtige lag koncentreres under formindsket tryk. Remanensen tilsættes 15 100 ml destilleret vand, og uopløseligt stof frafiltre- res. Filtratet passeres direkte gennem en søjle pakket med 300 ml "CM Cephadex" C-25 (Na+) . Søjlen behandles derefter som beskrevet i eksempel 3, og den ønskede forbindelse fås i en mængde på 0,528 g (udbytte: 49,0%).

20 NMR (DMSO-dg) &= 1,2-2,3 (b, 6H), 2,5-3,3 (b, 12H), 3,3-3,7 (bd, 3H), 4,1-4,6 (bd, 3H), 7,1-7,7 (m, 7H) , 7,7-8,6 (b, 6H), 8,6-9,5 (b, 2H).

IR (KBr) 25 V(cm-1) = 3300, 3150, 3050, 2950, 1645, 1540, 1450, 1050.

TLC (n-propanol : pyridin : vand : eddikesyre =6:4 : 3 : 2 v/v)

Rf = 0,35 30 [a]*9,0 “ 26/1° <c = 1/1/ H2°).

35

O

32

DK 164855 B

Referenceeksempel 1

Fremstilling af 10-{n-[4-(4-GP)butanoyl]-O-benzyl-L-se-ryl}-l,5-diZ-l,5,10-TAD hydrochlorid_ (1) 10- (N-tert.butoxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl)-1,5-diZ- 5 -1,5,10-TAD.

I 50 ml ethylacetat opløses 4,76 g (11,5 mmol) 1,5--diZ-1,5,10-TAD, og under isafkøling tilsættes der 1,04 g (10,3 mmol) triethylamin. Derpå tilsættes der 5,87 g (ca.

15 mmol) N-tert.butoxycarbonyl-O-benzyl-L-serin-N-hydroxy-10 succinimidester, og blandingen får lov at reagere natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen tilsættes 50 ml ethylacetat, og den resulterende ethylacetatopløsning vaskes successivt med 5% vandig natriumhydrogencar-bonatopløsning, 0,1 N saltsyre og mættet vandig natrium-15 chlorid. Ethylacetatlaget tørres over vandfrit natriumsulfat, og tørremidlet frafiltreres. Ved koncentrering af filtratet under formindsket tryk fås den ønskede forbindelse i en mængde på 8,34 g (udbytte: kvantitativt).

TLC (chloroform: methanol = 9:1 v/v) .

20 Rf = 0,80.

(2) 10-(O-benzyl-L-seryl)-1,5-diZ-l,5,10-TAD.

8,00 g (11,5 mmol) 10-(N-tert.butoxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl) -1,5-diZ-l,5,10-TAD opløses i 8,0 ml trifluor-eddikesyre, og den resulterende opløsning får lov at rea-25 gere i 3 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk, og det resulterende olie-agtige produkt opløses i 200 ml ethylacetat. Opløsningen vaskes successivt med 5% natriumhydrogencarbonatopløsning og destilleret vand. Ethylacetatlaget tørres med vandfrit 30 natriumsulfat, og tørremidlet frafiltreres. Ved koncentrering af filtratet under formindsket tryk fås en olie af den ønskede forbindelse i en mængde på 6,82 g (udbytte: kvantitativt).

TLC (chloroform : methanol = 9:1 v/v).

35 Rf = 0,50.

O

33

DK 164855 B

(3) 10-N-[4-(4-GP)butanoyl]-O-benzyl-L-seryl)-1,5~diZ--1,5,10-TAD hydrochlorid.

1,26 g (4,89 mmol) 4-(4-GP)smørsyrehydrochlorid i form af brune krystaller opløses i 20 ml dimethylformamid.

5 Den resulterende opløsning tilsættes 0,68 g (5,87 mmol) N--hydroxysuccinimid og 1,20 g (5,87 mmol) N,N'-dicyclohexyl-carbodiimid, og blandingen får lov at reagere natten over ved stuetemperatur. Det udfældede N,N'-dicyclohexylurin-stof frafiltreres, og filtratet anvendes direkte i den føl-10 gende omsætning. 3,54 g (6,00 mmol) 10-(O-benzyl-L-seryl)--l,5-diZ-l,5,lO-TAD i form af en bleggul olie opløses i 30 mol dimethylformamid. Opløsningen tilsættes 0,61 g (6,00 mmol) triethylamin under afkøling med is efterfulgt af tilsætning af en dimethylformamidopløsning af den tidligere 15 fremstillede 4-(4-GP)smørsyrehydrochlorid N-hydroxysuccin-imidester. Den resulterende blanding får lov at reagere natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk, og den olieagtige remanens opløses i en blanding af 150 ml ethylacetat og 150 ml chlo-20 roform. Opløsningen vaskes successivt med 5% vandig natrium-carbonatopløsning, 0,5 N saltsyre og mættet vandig natrium-chlorid. Det organiske lag tørres over vandfrit natriumsulfat, og tørremidlet frafiltreres. Filtratet koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås en bleggul olie af 25 den ønskede forbindelse i en mængde på 4,10 g (udbytte: kvantitativt) .

NMR (DMSO-dg) S= 1,1-2,8 (b, 12H), 2,8-3,8 (b, 10H), 4,2-4,8 (bs, 3H), 5,02 (s, 2H), 5,06 (s, 2H), 7,3 (s, 15H), 30 7,7-10,1 (b, 12H) TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =6 : 1,5 : 0,25 v/v)

Rf = 0,16.

4-(4-GP)smørsyrehydrochloridet fremstilles på føl-35 gende måde: 34

DK 164855 B

O

1,60 g (8,93 mmol) 4-(4-aminophenyl)smørsyre som brune krystaller opløses i 40 ml tetrahydrofuran. Den resulterende opløsning tilsættes 2,70 g (13,4 mmol) 1-amidi-no-3,5-dimethylpyrazolnitrat og 2,19 g (17,0 mmol) N,N-di-5 isopropylethylamin, og blandingen får lov at reagere natten over under tilbagesvaling. De udfældede krystaller skilles fra ved filtrering, og filtratet vaskes successivt med acetone, methanol og tetrahydrofuran og tørres. De tørrede brune krystaller suspenderes i 10 ml destilleret vand, og 10 der tilsættes saltsyre, indtil krystallerne er helt opløst. Derefter koncentreres opløsningen til tørhed under formindsket tryk. Remanensen vaskes to gange med hver især ether og acetone. Der fås brune krystaller i en mængde på 1,54 g (udbytte: 67,0%). Smp.: 157-160°C.

15 NMR ^0 + DC1, extern TMS) b = 2,1-2,6 (m, 2H) , 2,6-3,3 (m, 4H) , 7,5-7,9 (m, 4H) , IR (KBr) V(cm_1) = 3370, 3170, 2330, 1730, 1680, 1660, 1620, 1600, 1575, 1510, 1240, 1220.

20

Referenceeksempel· 2

Fremstilling af 10-{N-[4-(4-GP)butanoyl]glycyl}-l,5-diZ- -1,5,10-TAD_ (1) 10-(Ν,Ν-phthalylglycyl)-l,5-diZ-l,5,10-TAD.

25 I 200 ml tetrahydrofuran opløses 12,4 g (30,0 mmol) 1,5-diZ-l,5,10-TAD. Opløsningen tilsættes under afkøling med is 4,90 g (35,0 mmol) triethylamin efterfulgt af tilsætning af 10,6 g (35,0 mmol) ester af phthalylglycin og N-hy-droxysuccinimid. Den resulterende blanding får lov at rea-30 gere natten over ved stuetemperatur.

Reaktionsblandingen inddampes til tørhed under formindsket tryk, og remanensen opløses i 1200 ml ethylacetat. Ethylacetatopløsningen vaskes successivt med 5% vandig na-triumhydrogenchloridopløsning, 0,5 N saltsyre og mættet 35 vandig natriumchlorid. Ethylacetatlaget tørres over vand- o 35

DK 164855 B

frit natriumsulfat, og tørremidlet skilles fra ved filtrering. Filtratet koncentreres under formindsket tryk, og remanensen krystalliseres ved tilsætning af ethylace-tat og ethylether. Krystallerne udvindes ved filtrering 5 og tørres, hvorved der fås 14,6 g af den ønskede forbindelse (udbytte: 81,0%). Smp.: 102-104°C.

TLC (chloroform : methanol : eddikesyre = 95 : 5 : 3 v/v).

Rf = 0,4.

10 (2) 10-glycyl-l,5-diZ-l,5,10-TAD:

Til 14,4 g (24,0 mmol) 10-(N,N-phthalylglycyl--l,5-diZ-l,5,10-TAD sættes 370 ml ethanol og 6,00 g (120 mmol) hydrazinhydrat og blandingen tilbagesvales i 2 timer. Efter omsætningen skilles uopløseligt stof fra 15 ved filtrering, og filtratet koncentreres under formindsket tryk. Den resulterende olie opløses i 300 ml ethyl-acetat, og opløsningen vaskes successivt med 5% vandig natrium-hydrogencarbonatopløsning og destilleret vand. Ethylace-tatlaget tørres over vandfrit natriumsulfat. Efter fra-20 filtrering af tørremidlet koncentreres filtratet under formindsket tryk, hvorved der fås en olie af den ønskede forbindelse i en mængde på 12,5 g (udbytte: kvantitativt).

TLC (chloroform : methanol : eddikesyre = 95 : 5 : 3 v/v) .

25 Rf = 0,10.

(3) 10—{N— 14 —(4-GP)butanoyl]glycyl}-!,5-diZ-l,5,10-TAD: 1,56 g (6,05 mmol) 4-(4-GP)smørsyrehydrochlorid som brune krystaller opløses i 20 ml dimethylformamid.

Den resulterende opløsning tilsættes 0,84 g (7,26 mmol) 30 N-hydroxysuccinimid og 1,50 g (7,26 mmol) N,N'-dicyclo- hexylcarbodiimid, og blandingen får derefter lov at reagere natten over ved stuetemperatur. Det udfældede Ν,Ν'-di-cyclohexylurinstof skilles fra ved filtrering, og filtratet anvendes direkte i den næste omsætning.

35 2,59 g (5,5 mmol) 10-glycyl-l,5-diZ-l,5,10-TAD som 36

DK 164855 B

O

en bleggul olie opløses i 30 ml dimethylformamid. Den resulterende opløsning tilsættes under afkøling med is 0,61 g (6,05 mmol) triethylamin efterfulgt af tilsætning af en dimethylformamidopløsning af den tidligere frem-5 stillede 4-(4-GP)smørsyrehydrochlorid N-hydroxysuccinimid-ester, og blandingen får lov at reagere natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk, og den olieagtige remanens opløses i en blanding af 300 ml ethylacetat og 60 ml ethanol. Opløsningen va-10 skes successivt med 5% phosphorsyre, 5% vandig opløsning af natriumcarbonat og mættet vandig natriumchlorid. En olie, der udfælder under vaskningen, opløses ved tilsætning af en lille smule ethanol. Det organiske lag tørres over vandfrit natriumsulfat, og tørremidlet skilles fra ved 15 filtrering. Derpå koncentreres filtratet under formindsket tryk, og der fås en bleggul olie af den ønskede forbindelse i en mængde på 3,30 g (udbytte: 89,1%).

NMR (CDC13) is = 1,1-2,8 (b, 12H) , 2,8-4,1 (b, 10H) , 5,04 (s, 4H) , 20 4,8-8,1 (b, 11), 7,3 (s, 10H).

TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =6 : 3,5 : 1 v/v)

Rf = 0,59.

25 Referenceeksempel 3

Fremstilling af 10-^N-[3-(4-GMP)propanoyl]-O-benzyl-L-se- rylJ-l,5-diZ-l,5,10-TÅD_ 1,00 g (4,52 mmol) 3-(4-GMP)propionsyre som bleggule krystaller sættes i 4 eller 5 små portioner til 3 ml thio-30 nylchlorid under afkøling med is. Derefter får blandingen lov at reagere i 15 minutter under afkøling med is, og reaktionsblandingen koncentreres til tørhed under formindsket tryk.

I 10 ml dimethylformamid opløses 2,00 g (3,38 mmol) 35 io-(0-benzy1-L-seryl)-1,5-diZ-l,5,10-TAD. Den resulterende

O

37

DK 164855 B

opløsning tilsættes 0,92 g (9,04 mmol) triethylamin efterfulgt af tilsætning af 4 ral dimethylformamidopløsning af det tidligere fremstillede 3-(4-GP)propionsyrechloridhydro-chlorid. Blandingen får lov at reagere i 30 minutter under 5 afkøling med is. Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk, og den olieagtige remanens opløses i en blanding af 300 ml ethylacetat og 50 ml ethanol. Opløsningen vaskes successivt med 5% phosphorsyre, 5% vandig opløsning af na-triumcarbonat og mættet vandig natriumchlorid. Et olieagtigt 10 produkt, der udfælder under vaskningen, opløses ved tilsætning af en lille smule ethanol. Det organiske lag tørres over vandfrit natriumsulfat, og tørremidlet skilles fra ved filtrering. Derefter koncentreres filtratet under formindsket tryk, hvorved der fås 2,67 g af den ønskede forbindel-15 se som en bleggul olie (udbytte: kvantitativt).

NMR (CDC13) S= 1,0-2,0 (b, 6H), 2,0-3,9 (b, 14H), 4,0-4,8 (bd, 5H) , 5,0 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 5,1-8,3 (b, 11H) , 7,2 (2, 15H) .

20 TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =6 : 1,5 : 0,25 v/v)

Rf = 0,27.

3-(4-GMP)propionsyren fremstilles på følgende måde: (1) Methyl-3-(4-aminomethylphenyl)propionat.

25 4,30 g (22,97 mmol) 3-(4-cyanophenyl)propenoat i form af hvide krystaller opløses i 350 ml ammoniakmættet methanol. Efter tilsætning af 3 g Raney-nikkel, hydrogeneres blandingen ved stuetemperatur i 2 timer ved 60 atm. Efter omsætningen skilles katalysatoren fra ved filtrering, og filtratet 30 koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås en olie i en mængde på 4,02 g (udbytte: 90,54%).

NMR (CDC13) & = 2,4-3,2 (m, 6H) , 3,63 (s, 3H) , 3,8-4,7 (b, 2H) , 7,16 (s, 4H) 35 TLC (chloroform : methanol = 10 : 1 v/v)

Rf = 0,16.

O

38

DK 164855 B

(2) 3-(4-GMP)propionsyre.

3,70 g (19,14 mmol) methyl-3-(4-aminomethylphenyl)-propionat i form af en olie opløses i 150 ml tetrahydrofu-ran. Opløsningen tilsættes 5,80 g (28,71 mmol) 1-amidino-5 -3,5-dimethylpyrazolnitrat og 4,70 g (36,37 mmol) N,N-diiso- propylethylamin, og blandingen får derefter lov til at reagere natten over under tilbagesvaling. Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås et olieagtigt produkt. Denne olie tilsættes 70 ml 5% saltsyre, 10 og blandingen får lov at reagere under tilbagesvaling i 3 timer. Reaktionsblandingen filtreres, og filtratet afkøles med is. Derpå tilsættes filtratet 10%’s vandig natriumhydroxidopløsning for at indstille blandingens pH-værdi til 6,4. Blandingen omrøres forsigtigt i 30 minutter under køling 15 med is. De udfældede krystaller udvindes ved filtrering og vaskes først med destilleret vand, derpå med tetrahydrofuran. Efter tørring af remanensen fås bleggule krystaller af den ønskede forbindelse i en mængde på 2,85 g (udbytte: 67,4%).

Smp.: ^ 300°C.

20 NMR + °C1, extern TMS) & = 3,0-3,6 (m, 4H), 4,84 (s, 2H) , 7,7 (s, 4H) .

IR (KBr) V(cm-1) = 3350, 3060, 2330, 1675, 1610, 1550, 1460, 1405, 1150 25 TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =4:4:2 v/v) Rf = 0,60.

Referenceeksempel 4

Fremstilling af 10-{n-[4-(3-GPro)benzoyl] -O-benzyl-L-serylJ^- 30 -1,5-diZ-l,5,10-TAD_ 0,85 g (3,84 mmol) 4-(3-GPro)benzoesyre opløses i 8,0 ml thionylchlorid. Efter tilsætning af en katalytisk mængde tør pyridin, reagerer blandingen under omrøring i 6 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen koncentre-35 res under formindsket tryk og overføres til en ekssikator,

O

39

DK 164855 B

hvor blandingen tørres under formindsket tryk i nærværelse af partikelformigt natriumhydroxid. Det resulterende 4-(3-GPro) benzoesyrechloridhydrochlorid opløses i 6 ml tørret dimethylformamid. Den resulterende opløsning sættes 5 dråbevis til 15 ml tør tetrahydrofuranopløsning af 1,90 g (3,18 mmol) 10-(O-benzyl-L-seryl)-1,5-diZ-l,5,10-TAD og 1,16 g (11,5 mmol) triethylamin under afkøling med is. Efter omrøring af blandingen i 1 time under afkøling med is tilsættes der flere dråber destilleret vand, og blandingen •ίο koncentreres under formindsket tryk. Den olieagtige remanens opløses i 300 ml ethylacetat, og den resulterende opløsning vaskes successivt med 10% vandig opløsning af na-triumcarbonat, 5% vandig opløsning af phosphorsyre, 10% vandig opløsning af natriumcarbonat og mættet vandig na-15 triumchlorid. En olie, der udfælder under vaskningen, opløses ved tilsætning af en lille smule ethanol. Derefter tørres det organiske lag over vandfrit natriumsulfat og koncentreres til tørhed under formindsket tryk, hvorved der fås 2,20 g af den ønskede forbindelse som en olie (udbytte: 20 87,1%).

NMR (CDC13) £= 1,3-2,1 (b, 8H), 2,5-4,1 (b, 12H), 4,5 (s, 2H) , 5.02 (s, 2H), 5,05 (s, 2H) , 6,9-8,9 (b, 11H), 7.3 (s, 15H) 25 TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =6 : 1,5 : 0,25 v/v)

Rf = 0,32.

4-(3-GPro)benzoesyre fremstilles på følgende måde: 4,00 g (20,7 mmol) methyl-4-(3-aminopropyl)benzoat 30 opløses i 150 ml tetrahydrofuran. Den resulterende opløsning tilsættes 6,25 g (31,0 mmol) l-amidino-3,5-dimethyl-pyrazolnitrat og 5,08 g (39,3 mmol) N,N-diisopropylethyl-amin, og blandingen opvarmes under tilbagesvaling natten over.

35 Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket 0 40

DK 164855 B

tryk, hvorved der fås et olieagtigt produkt.

Derefter tilsættes denne olie 100 ml 6 N HC1, og blandingen opvarmes under tilbagesvaling i 4 timer. Reaktionsblandingen vaskes to gange med 50 ml ethylacetat, og 5 det vandige lags pH-værdi indstilles til 6,0 med 20% vandig natriumhydroxidopløsning. Efter afkøling udvindes de udfældede krystaller ved filtrering, hvorved der fås den ønskede forbindelse i en mængde på 2,53 g (udbytte: 55,1%).

Smp.: 285-289°C.

10 NMR (DMSO-dg + DC1, extern TMS) 6 = 2,0-2,7 (m, 2H) , 3,1-3,5 (m, 2H) , 3,5-4,0 (m, 2H) , 7,9 (d, 2H, J = 8 Hz), 8,4 (d, 2H, J = 8 Hz).

Referenceeksempel 5 15 Fremstilling af 10-{N-[3-(3-GMP)propanoyl]-O-benzyl-L- -seryl}-!,5-diZ-l,5,10-TAD_ 0,55 g (2,49 mmol) 3-(3-GMP)propionsyre i form af bleggule krystaller og 1,20 g (2,03 mmol) 10-(O-benzyl-L--seryl)-1,5-diZ-l,5,10-TAD i form af en bleggul olie be-20 handles som beskrevet i referenceeksempel 3, hvorved der fås 1,63 g af slutforbindelsen som en bleggul olie (udbytte: kvantitativt).

NMR (CDCI3) 5 = 1,1-2,1 (b, 6H), 2,1-3,9 (b, 14H), 3,9-4,7 (bd, 5H) 25 5,0 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 6,3-8,5 (b, 11H), 7,2 (s, 15H) TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =6 : 1,5 : 0,25 v/v)

Rf = 0,42.

30 Methyl-3-(3-aminomethylphenyl)propionatet fremstilles på følgende måde: 4,3 g (22,97 mmol) methyl-3-(3-cyanophenyl)propenoat i form af hvide krystaller behandles som beskrevet i referenceeksempel 3(1), og der fås 4,40 g af den ønskede for-35 bindelse som en olie (udbytte: kvantitativt).

O

41

DK 164855 B

NMR (CDC13) 6 = 2,3-3,2 (m, 6H), 3,67 (s, 3H), 4,2-6,5 (b, 2H), 6,7-7,5 (m, 4H) TLC (chloroform : methanol = 10 : 1 v/v) 5 Rf = 0,24.

(2) 3-(3-GMP)propionsyre.

4,40 g (22,77 mmol) methyl-3-(m-aminomethylphenyl)-propionat i form af en olie behandles som beskrevet i referenceeksempel 3(2), og der fås 2,1 g af den ønskede forbin-10 delse som bleggule krystaller (udbytte: 41,7%). Snip.: 273--276°C.

NMR (D20 + DC1, extern TMS) 8= 2,8-3,5 (m, 4H) , 4,8 (s, 2H) , 7,3-7,9 (m, 4H) IR (KBr) 15 V* (cm"’1) = 3340, 3100, 2330, 1645, 1535, 1400, 1330 TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =4 :4:2 v/v) Rf = 0,5.

Referenceeksempel 6 20 Fremstilling af 10-{n-[5-(4-GP)pentanoyl]-O-benzyl-L-se- ryl}-l,5-diZ-l,5,10-TAD_ 0,80 g (3,40 mmol) 5-(4-GP)pentansyre i form af bleggule krystaller og 1,80 g (3,05 mmol) 10-(O-benzyl-L-seryl)--l,5-diZ-l,5,10-TAD i form af en bleggul olie behandles som 25 beskrevet i referenceeksempel 3, og der fås 2,42 g af den ønskede forbindelse som en bleggul olie (udbytte: kvantitativt) .

NMR (CDC13) 6=0,9-2,8 (b, 14H) , 2,8-3,9 (b, 10H) , 4,47 (bs, 3H) , 30 5,03 (s, 2H), 5,06 (s, 2H), 5,0-7,9 (b, 11H), 7,3 (s, 15H) TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =6 : 1,5 : 0,25 v/v).

5-(4-GP)pentansyre fremstilles på følgende måde: 35 7,42 g (35,80 mmol) methyl-5-(4-aminophenyl)pentansy-

DK 164855B

42

O

re i form af en olie behandles som beskrevet i referenceeksempel 3, og der fås bleggule krystaller af den ønskede forbindelse i en mængde på 3,72 g (udbytte: 44,1%). Smp.: 254-256°C.

5 NMR (D20 + DC1, extern TMS) 8 = 1/7-2,4 (m, 4H) , 2,5-3,4 (m, 4H) , 7,5-8,0 (m, 4H) .

IR (KBr) s) (cm-1) = 3330, 2940, 2330, 1680, 1630, 1570, 1515, 1400, 1305, 1265.

10 TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =4:4 : 2 v/v)

Rf = 0,50.

Referenceeksempel 7 15 10-/N- [ 4 - (3-GP) benzoyl]glycylV-1,5-diZ-1,5,10-ΤΛΡ 0,66 g (2,98 mmol) 4-(3-GPro)benzoesyre opløses i 6,0 ml thionylchlorid. Efter tilsætning af en katalytisk mængde tør pyridin reagerer blandingen i 4 timer ved stuetemperatur under omrøring. Reaktionsblandingen koncentre-20 res under formindsket tryk og overføres til en ekssikator, hvor blandingen inddampes til tørhed under formindsket tryk i nærværelse af partikelformigt natriumhydroxid.

Det resulterende syrechloridhydrochlorid opløses i 4 ml tør dimethylformamid, og opløsningen sættes dråbevis 25 til 10 ml tør tetrahydrofuranopløsning af 1,27 g (2,70 mmol) 10-glycyl-l,5-diZ-l,5,10-TAD og 0,46 g (4,5 mmol) triethyl-amin under afkøling med is.

Blandingen behandles derefter som beskrevet i referenceeksempel 4, hvorved der fås en olie af den ønskede 30 forbindelse i en mængde på 1,46 g (udbytte: 80,3%).

NMR (DMSO-dJ 6 8 = 1,1-2,1 (b, 8H) , 2,1-3,5 (b, 12H) , 3,7-4,0 (b, 2H) , 5,01 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 6,8-8,9 (b, 11H), 7,30 (s, 10H) 35 TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =6 : 1,5 : 0,25 v/v)

Rf = 0,34.

O

43

Referenceeksempel 8

Fremstilling af 10-{N-[5-(2-GMP)pentanoylj-O-bensyl-L-se- ryl}-l,5-diZ-l,5,10-TAD_ 1,20 g (4,81 mmol) 5-(2-GMP)pentansyre i form af 5 bleggule krystaller og 2,00 g (3,38 mmol) 10-(O-benzyl-L--seryl)-l,5-diZ-l,5,10-TAD i form af en bleggul olie behandles som beskrevet i referenceeksempel 3, hvorved der fås en bleggul olie af den ønskede forbindelse i en mængde på 2,90 g (udbytte: kvantitativt).

10 NMR (CDC13) 6 = 1,1-2,8 (b, 14H) , 2,8-4,0 (b, 10H) , 4,2-4,7 (b, 5H), 5,0 (s, 2H), 5,04 (s, 2H), 5,0-8,8 (b, 11H) , 7,2 (s, 15H) TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =6 : 1,5 15 · 0,25 v/v)

Rf = 0,30.

5-(2-GMP)pentansyre fremstilles på følgende måde: (1) Methyl-5-(2-cyanophenyl)pentanoat.

15,2 g (71,4 mmol) methyl-5-(2-cyanophenyl)-2,4-20 -pentadienoat opløses i 600 ml methanol. Efter tilsætning af 0,6 g palladiumsort underkastes opløsningen en katalytisk reduktion i 6 timer ved stuetemperatur og atmosfæretryk. Efter omsætningen skilles katalysatoren fra ved filtrering, og filtratet koncentreres under formindsket tryk, 25 hvorved der fås et olieagtigt produkt i en mængde på 16,47 g (udbytte: kvantitativt).

NMR (CDC13) £= 1,4-2,1 (m, 4H) , 2,1-2,6 (m, 2H), 2,6-3,2 (m, 2H) , 3,7 (s, 3H), 7,0-7,7 (m, 4H).

30 (2) Methyl-5-(2-aminomethylphenyl)pentanoat.

15,5 g (71,4 mmol) methyl-5-(2-cyanophenyl)pentanoat i form af en olie behandles som beskrevet i referenceeksempel 3(1), og der fås 14,7 g af den ønskede forbindelse som en bleggul olie. (Udbytte: 92,9%).

35 NMR (CDC13)

O

44

DK 164855 B

£> = 1,35 (s, 2H) , 1,3-2,0 (m, 4H) , 2,1-2,9 (m, 4H) , 3,63 (s, 3H), 3,85 (s, 2H), 7,0-7,5 (m, 4H) TLC (chloroform : methanol = 10 : 1 v/v)

Rf = 0,26.

5 (3) 5-(2-GMP)pentansyre.

8,00 g (36,1 mmol) methyl-5-(2-aminomethylphenyl)-pentanoat anvendes som beskrevet i referenceeksempel 3(2), hvorved der fås 6,41 g bleggule krystaller (udbytte: 71,2%) . Smp.: 275-277°C.

10 NMR (D2DC1, extern TMS) b= 1,7-2,4 (m, 4H) , 2,6-3,3 (m, 4H) , 4,8 (s, 2H) , 7,5-7,9 (m, 4H).

IR (KBr) V (cm-1) = 3350, 3020, 2950, 2320, 1675, 1620, 1540, 15 1445, 1395, 1145.

TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =6:3 : 0,5 v/v)

Rf = 0,24.

20 Referenceeksempel 9

Fremstilling af 10-{N-[3-(2-chlor-4-GMP)propanoyl]-0-ben- zyl-L-seryl}-l,5-diZ-l,5,10-TAD 1/3 phosphat_ 0,767 g (3,00 mmol) 3-(2-chlor-4-GMP)propionat opløses i 8,0 ml thionylchlorid under afkøling. Efter omsæt-25 ning i 30 minutter under omrøring koncentreres opløsningen under formindsket tryk og overføres til en ekssikator, hvor den tørres under formindsket tryk i nærværelse af partikelformet natriumhydroxid. Det resulterende 3-(2-chlor--4-GMP)propionsyrechloridhydrochlorid opløses i 10 ml tør 30 dimethylformamid, og opløsningen sættes dråbevis til 15 ml tør dimethylformamidopløsning af 1,61 g (2,73 mmol) 10-(0--benzyl-L-seryl)-l,5-diZ-l,5,10-TAD og 0,91 g triethylamin under afkøling med is. Efter omsætning i 1 time under omrøring og afkøling med is, sættes der flere dråber destil-35 leret vand til reaktionsblandingen, som derpå koncentreres

O

45

DK 164855 B

under formindsket tryk. En olieagtig remanens opløses i en blanding af 300 ml ethylacetat og en lille smule ethanol. Opløsningen vaskes successivt med 5% vandig natrium-carbonatopløsning, 5% vandig phosphorsyreopløsning og 5 vandig natriumchlorid. En olie, der udfælder under vask-ningen, opløses ved tilsætning af en lille smule ethanol.

Derpå tørres det organiske lag over vandfrit natriumsulfat og koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 1,97 g af den ønskede forbindelse som en olie (udbyt-10 te: 83,8%) .

NMR (DMS0-d6) = 1,0-2,0 (b, 6H) , 2,2-3,5 (b, 12H), 3,5-3,8 (bd, 2H) , 4,3-4,8 (bm, 5H), 5,02 (s, 2H), 5,05 (s, 2H), 6,8-8,8 (b, 11H), 7,10 (s, 5H), 7,30 (s, 10H).

15 TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =6 : 1,5 : 0,25 v/v)

Rf = 0,21.

3-(2-chlor-4-GMP)propionsyre fremstilles på følgende måde: 20 (1) Methyl-3-(2-chlor-4-acetylaminomethylphenyl)propionat.

5,00 g (21,25 mmol) methyl-3-(4-acetylaminomethyl-phenyl)propionat sættes til 85 ml sulfurylchloridopløsning af vandfrit aluminiumchlorid (14,2 g, 106 mmol) ved -25°C.

Derpå hæves blandingens temperatur gradvis til 5°C, ved 25 hvilken temperatur blandingen får lov at reagere under omrøring i 24 timer.

Derefter hældes reaktionsblandingen over en stor portion is, og det resulterende uopløselige stof ekstrahe-res med chloroform (ca. 1000 ml) . Chloroformlaget vaskes 30 successivt med destilleret vand, 5% vandig natriumcarbo-natopløsning, 5% vandig phosphorsyreopløsning og destilleret vand og tørres over vandfrit magnesiumsulfat. Ved koncentrering af det tørrede produkt under formindsket tryk fås der en brun olie i en mængde på 6,0 g. Denne olie un-35 derkastes søjlechromatografi på silicagel (Wako Gel C-200,

O

46

DK 164855 B

300 g) og elueres med en toluenethylacetatblanding (1:1 v/v). De fraktioner, der indeholder den ønskede forbindelse, forenes og koncentreres til tørhed, hvorved der fås 1,93 g af den ønskede forbindelse (udbytte: 33,7%).

5 Smp.: 91-93°C.

NMR (CDC13, 400 M Hz) S = 2,03 (s, 3H), 2,63 (t, 2H, J = 7,7 Hz), 3,04 (t, 2H, J = 7,7 Hz), 3,67 (s, 3H), 4,37 (d, 2H, J = 5,9 Hz), 5,85 (bs, IH), 7,10 (d, IH, 10 J = 7,8 Hz), 7,20 (d, IH, J = 7,8 Hz), 7,26 (s, IH).

(2) 3-(2-chlor-4-aminomethylphenyl)propionsyrehydrochlo-rid.

En blanding af 20 ml 2 N saltsyre og 10 ml dioxan 15 sættes til 1,10 g (4,08 mmol) methyl-3-(2-chlor-4-acetyl-aminornethylpheny1)propionat, og blandingen opvarmes under tilbagesvaling i 8 timer. Reaktionsblandingen koncentreres derefter til tørhed under formindsket tryk, hvorpå der fås 1,05 g af den ønskede forbindelse som et hvidt 20 fast stof (udbytte: kvantitativt). Smp.: 191-194°C.

NMR (D20, extern TMS) <b= 2,9-3,7 (m, 4H) , 4,60 (s, 2H) , 7,6-8,1 (m, 3H) TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =6:3 : 0,5 (v/v) 25 Rf = 0,20.

(3) 3-(2-chlor-4-GMP)propionsyre.

1,00 g (4,00 mmol) 3-(2-chlor-4-aminomethylphenyl)-propionsyrehydrochlorid opløses i 40 ml methanol. Opløsningen tilsættes 1,03 g (5,12 mmol) l-amidino-3,5-dimethyl-30 pyrazolnitrat og 1,10 g (8,51 mmol) N,N-diisopropylethyl-amin, og blandingen opvarmes natten over ved 80°C under omrøring. Reaktionsblandingen koncentreres derefter under formindsket tryk, og remanensen opløses i 100 ml destilleret vand. Opløsningen vaskes to gange med 50 ml chloroform, og 35 det vandige lag indstilles til en pH-værdi på 6,1 med 1 N

O

47

DK 164855 B

saltsyre. Derefter koncentreres det vandige lag under formindsket tryk.

Remanensen suspenderes i 50 ml acetone, og suspensionen vaskes og filtreres. Filtratet suspenderes i vand, 5 og de resterende krystaller udvindes ved filtrering, hvorved der fås 0,75 g af den ønskede forbindelse som hvide krystaller (udbytte: 73,3%). Smp.: 260-264°C.

NMR (D20 + DC1, extern TMS) é = 2,8-3,7 (m, 4H), 4,82 (s, 2H), 7,5-7,9 (m, 3H) 10 TLC (chloroform : methanol : 17% ammoniakvand =6:3 : 0,5 v/v)

Rf = 0,06.

15 20 25 30 35

Claims

48 DK 164855 B PATENTKRAV :

1. Spergualin-beslægtet forbindelse, kendetegnet ved, at den har formlen

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X betyder hydrogen, fluor eller chlor, m er 0 el- 20 ler et helt tal fra 1 til 3, og n er O eller et helt tal fra 1 til 4.

3. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R1 betyder ligekædet C-^-alkylen, der kan være 25 substitueret højst tre gange med hydroxymethyl.

4. Forbindelse ifølge krav 3, kendetegnet ved, at R·^ betyder methylen, ethylen, propylen, hydroxyme-thylmethylen, 1-hydroxymethylethylen, 2-hydrox^methylethylen, 30 1,2-di(hydroxymethyl)ethylen, 1-hydroxymethylpropylen, 2-hy- droxymethylpropylen, 3-hydroxymethylpropylen, 1,2-di(hydroxymethyl )propylen, 1,3-di(hydroxymethyl)propylen, 1,2--di(hydroxymethyl)propylen, 1,3-di(hydroxymethylpropylen, 2,3-di(hydroxymethyl) propylen eller 1,2,3-di(hydroxymethyl)-35 propylen. 49 DK 164855 B

5. Forbindelse ifølge krav 3,kendetegnet ved, at R^ betyder methylen eller hydroxymethylmethylen.

5 X (CH2)n-CONH-R1-CONH-(CH2)4NH (CH2) 3NH2 H.NCNH-(CH_) " 2. ii 2 m (I) 10 nh hvor betyder en ligekædet eller forgrenet C1_4-alkylen-gruppe, der eventuelt er substitueret en eller flere gange med en hydroxymethylgruppe, X betyder et hydrogenatom eller et halogenatom, m og n er ens eller forskellige og betyder 15 hver især 0 eller et helt tal fra 1 til 5, samt fysiologisk acceptable salte deraf.

6. Forbindelse ifølge krav 1 til brug som lægemid- 5 del.

7. Farmaceutisk sammensætning, kendetegnet ved, at den som aktiv bestanddel indeholder en forbindelse ifølge krav 1 sammen med et farmaceutisk acceptabelt bære- 10 stof.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af en spergualin-beslaegtet forbindelse med formlen X ^Q^)- (CH2) ^CONH-^-CONH- (CH2) ^NH (CH2) 3NH2 H2yH-<CH2>m (I) NH 20 hvor betyder en ligekædet eller forgrenet C2_4-alkylen-gruppe, der eventuelt er substitueret en eller flere gange med en hydroxymethylgruppe, X betyder et hydrogenatom eller et halogenatom, m og n er ens eller forskellige og betyder hver især 0 eller et helt tal fra 1 til 5, samt fysiologisk 25 acceptable salte deraf, kendetegnet ved, at beskyttelsesgrupperne på gængs måde fjernes fra en forbindelse med formlen X 30 ^p^)- (CH2) n-C0NH-R* 1~C0NH (CH2) 4N (CH2) ^ H,NCNH-(CH.) R2 2 || 2 m NH (II) hvor Ri1 betyder en ligekædet eller forgrenet C1_4-alkylen-35 gruppe, der eventuelt er substitueret en eller flere gange med en hydroxymethylgruppe, hvis hydroxylgrupper eventuelt 50 DK 164855 B er beskyttet, R3 betyder en aminobeskyttende gruppe, R3 betyder en beskyttet aminogruppe, og X, m og n har de ovenfor anførte betydninger, og om ønsket omdanner en forbindelse med den almene formel I til et fysiologisk acceptabelt salt 5 deraf.