JPH0776204B2 - スパガリン類の精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗癌剤または免疫制御剤として有用なスパガリ
ン類またはグリオキシリルスペルミジンの新規な精製法
に関する。

〔従来の技術〕

スパガリンは、梅沢らにより見出された制癌活性を有す
る抗生物質であり（特開昭57-48957号）これをもとに多
くの誘導体や類縁化合物が発表されている（特開昭58-6
2152号、同59-42356号、同60-185758号、同62-48660
号）。また作用に関して、免疫抑制作用も見出されてい
る（特開昭61-129119号）。これらの化合物は、培養法
や、半合成法や、全合成法により製造される。

上記スパガリンおよびその誘導体もしくは類縁化合物
（以下これらをすべて含めて単にスパガリン類という）
のなかで、特に活性の高いスパガリンや15-デオキシス
パガリン等は、比較的不安定なため、それらの高純度品
を大量に製造することは極めて困難であつた。すなわ
ち、スパガリン類および中間体グリオキシリルスペルミ
ジンまたはそれらの誘導体は精製工程における加熱濃縮
操作によつて容易に分解する。例えばイオン交換樹脂お
よび／または多孔性合成吸着剤のカラムから、無機塩を
含む溶液でスパガリン類を溶出した場合、活性画分から
目的物の分解を抑えながら脱塩および／または濃縮する
工程に問題があつた。この脱塩および／または濃縮につ
いてはこれまで適当な手段がなかつたために已むおえず
濃縮乾固と有機溶媒抽出で行われていたが、この場合分
解防止のため少量ずつ低温下で濃縮操作を行わざるを得
ず、生産性は当然低下することになり、工業的製造法と
しては十分とはいえなかつた。更に従来の脱塩および／
または濃縮法は、その大量生産に適用できるものとは言
いがたく、効率的、経済的な方法が望まれていた。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は工業的に実施できる脱塩工程および／また濃縮
工程を組入れたスパガリン類またはグリオキシリルスペ
ルミジンの精製法を提供することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、スパガリン類またはグリオキシリ
ルスペルミジンを精製する方法において、その精製工程
に、電気透析工程および／または逆浸透析工程を組入れ
ることを特徴とするスパガリン類またはグリオキシリル
スペルミジンの精製法に関する。

本発明者らは、前述した如くカラムから無機塩溶液で溶
出して得られるスパガリン類と塩を含有する溶液、また
はスパガリン類の製造中間体（グリオキシリルスペルミ
ジン）と塩を含有する溶液より塩のみを除去する方法を
鋭意検討した結果、電気透析法を用いると、スパガリン
類または中間体の分解も少なく極めて効率よく脱塩でき
ることを見出した。また塩以外にも、酸または塩基も所
望に応じて除去できることを見出した。しかもスパガリ
ン類およびその中間体のようにアミンやアニジンなどの
陽電荷の官能基を有する低分子化合物であつても、極め
て高い回収率が得られることを見出した。更に本発明ら
は、スパガリン類またはその製造中間体を含有する溶液
を濃縮する方法を鋭意検討した結果、逆浸透法を用いる
と、スパガリン類または中間体の分解も少なく極めて効
率よく濃縮できることを見出した。しかもスパガリン類
およびその製造中間体のように低分子化合物であつて
も、極めて高い回収率が得られることを見出し本発明を
完成した。

本発明におけるスパガリン類としては、特に制限はない
が、例えば一般式 （式中R₁は、‐(CH₂)₄‐,-(CH₂)₆‐， を示し、R₂は‐(CH₂)₂‐,-CH（OH）CH₂‐または‐CE＝C
H-を示し、R₃は‐CH（OH）‐,CH（OCH₃）‐,-CH₂‐また
は‐CH(CH₂OH)‐を示す。更にはｘは水素、またはアミ
ノ酸、若しくはペプチドのカルボキシル基から水酸基を
除去した基を示す。）で示されるスパガリン類化合物、
およびその薬理学上許容される塩が挙げられる。

具体的に示すと、例えば次の化合物を挙げることができ
る。

（１）Ｎ−〔４−（３−アミノプロピル）アミノブチ
ル〕−２−（７−グアニジノヘプタンアミド）−２−ヒ
ドロキシエタンアミド（15−デオキシスパガリン） （２）Ｎ−〔４−（３−アミノプロピル）アミノブチ
ル〕−２−（７−グアニジノヘプタンアミド）−２−メ
トキシエタンアミド （３）Ｎ−〔４−（３−アミノプロピル）アミノブチ
ル〕−２−（９−グアニジノノナンアミド）−２−ヒド
ロキシエタンアミド （４）Ｎ−〔４−（３−アミノプロピル）アミノブチ
ル〕−２−（７−グアニジノヘプタンアミド）エタンア
ミド （５）Ｎ−〔４−（３−アミノプロピル）アミノブチ
ル〕−２−（７−グアニジノヘプタンアミド）−（Ｓ）
‐２−ヒドロキシメチルエタンアミド （６）Ｎ−〔４−（３−アミノプロピル）アミノブチ
ル〕−２−〔４−（ｐ−グアニジノフエニル）ブタンア
ミド〕−エタンアミド （７）Ｎ−〔４−（３−アミノプロピル）アミノブチ
ル〕−２−〔４−（ｐ−グアニジノフエニル）ブタンア
ミド〕−（Ｓ）‐２−ヒドロキシメチルエタンアミド （８）Ｎ−〔４−（３−アミノプロピル）アミノブチ
ル〕−２−〔３−（ｐ−グアニジノメチルフエニル）プ
ロパンアミド〕−（Ｓ）‐２−ヒドロキシメチルエタン
アミド （９）Ｎ−〔４−（３−アミノプロピル）アミノブチ
ル〕−２−〔３−（ｐ−グアニジノフエニル）ペンタン
アミド〕−（Ｓ）‐２−ヒドロキシメチルエタンアミド （10）Ｎ−〔4-（３−アミノプロピル）アミノブチル〕
−２−（７−グアニジノヘプタ−２−エンアミド）−２
−メトキシエタンアミド （11）Ｎ−〔４−（３−アミノプロピル）アミノブチ
ル〕−２−（９−グアニジノノナ−２−エンアミド）−
２−ヒドロキシエタンアミド （12）スパガリン （13）Ｎ−〔〔４−〔３−（（D,L,DL）−フエニルグリ
シル）アミノプロピル〕アミノブチル〕〕−２−（７−
グアニジノヘプタンアミド）−（Ｓ）−２−ヒドロキシ
メチルエタンアミド （14）Ｎ−〔〔４−〔３−（（Ｌ）−ロイシル−（Ｌ）
−ロイシル）アミノプロピル〕アミノブチル〕〕−２−
（７−グアニジノヘプタンアミド）−（Ｓ）−２−ヒド
ロキシメチルエタンアミド 等があり、第１表に示す構造を有する。

本発明のスパガリン類の製造中間体には、例えばグリオ
キシルスペルミジン およびその誘導体を挙げることができる。

上述したスパガリン類またはその製造中間体は例えば前
述した特開昭58-62152号、同第59-42356号，同60-18575
8号および同62-48660号等に記載された方法で製造でき
る。これらの方法で製造された生成物含有液は通常不純
物もしくは副生成物を除くため、イオン交換樹脂および
／または多孔性合成吸着剤のカラムを用いて、無機塩例
えば塩化ナトリウム等を含む溶液で溶出して精製してい
る。

スパガリン類および／またはその製造中間体を含有する
溶液中でのこれらの物質の濃度は、一般的に0.1〜10重
量％であり、またその時の塩の濃度は0.1〜10重量％で
あるが、特に限定するものではなく、このような濃度の
溶液は、上述した如くスパガリン類の製造工程において
各種イオン交換樹脂や多孔性合成吸着剤のカラムからの
溶出液として得られる。このとき用いられるイオン交換
樹脂としては、陽イオン交換樹脂が用いられ、例えば、
CM−セフアデツクス、ダイヤイオンSKシリーズ、ダイヤ
イオンWKシリーズ、などがあげられる。また合成吸着剤
としては、ダイヤイオンHPシリーズ、セパビーズSPシリ
ーズ等が挙げられる。

本発明によればこの溶出液を更に脱塩および／または濃
縮するに当つて電気透析工程および／または逆透析工程
を行うのである。

本発明で使用する電気透析法の原理は、スルホン酸基や
カルボキシル基等の陰電荷をもつ陽イオン交換膜と、第
４アンモニウム塩基やアミノ基などの陽電荷をもつ陰イ
オン交換膜とを交互に並べて、直流電流を通ずる。電気
透析の駆動力は、両端にある電極によつて与えられる電
位差であり、膜の有する電荷が被処理物質イオンの動き
を阻止したり通過させたりする役目を果している。すな
わち、陽イオン交換膜は、膜内にマイナスの電荷が固定
されており、陽イオンは膜内を透過できるが、陰イオン
はマイナス電荷と反発して透過できない。これとは逆
に、プラスの電荷が膜内に固定されているのが陰イオン
膜で、陰イオンは膜内を透過するが、陽イオンは透過し
ない。これらのイオン交換膜は、それぞれの反対の電荷
をもつイオンに対して選択性を持つものである。例えば
塩化ナトリウムを電気透析にかけると交換膜を通してナ
トリウムイオンは陰電極に、塩素イオンは陽電極に移動
し、脱塩が進行することになる。

本発明の目的とするスパガリン類およびその製造中間体
の精製工程に使用する電気透析法に利用できるイオン交
換膜は、上記機能に加えて、次の条件が必要とされる。
すなわち、スパガリン類およびその製造中間体のように
分子量が比較的小さく（約1000以下）、アミノ基、グア
ニジノ基などのカチオン性官能基を有している物質の透
過を阻止し、除去したい塩の解離イオンのみを選択透過
するものでなければならない。

このような性能をもつイオン交換膜は、選択透過性膜と
呼ばれ、最近では、同符号イオン間で選択透過性を有す
る種々の方式のイオン交換膜が開発されている。イオン
選択透過性を付与する方式としてはいろいろな提案がな
されている。大別すると、１）架橋度の高い、ち密な構
造にする、２）表面に反対電荷を導入する等がある。す
なわち、膜の有する細孔のサイズを調節することによつ
て、被処理物質の分子量の差によりその透過性を制御す
ることができる。あるいは、交換膜の表面に膜母体とは
反対電荷の薄層をつけることにより、１価イオンと２価
イオンの選択ができる。更に、この薄層が、電荷をもつ
低分子量有機物の回収率を上げる働きをする。

本発明のスパガリン類およびその製造中間体の精製工程
に利用できるイオン交換膜はよく知られており、例えば
株式会社フジ・テクノシステム昭和59年８月発行「最新
の膜処理技術とその反応」第216頁に示されているもの
がある、これらを第２表に示すが、これらの中から適宜
選択使用することができる。特に上記原理に基づいて、
表面処理を施して選択性を向上させた交換膜が好まし
い。何故ならスパガリン類またはその製造中間体の有す
るアミノ基若しくはグアニジノ基の陽電荷により、一般
的にこれらの化合物が膜に吸着したり、外液に漏出する
現象が起こり、脱塩効果が低下したり回収率が低下する
ことがあるからこれを防ぐためである。特に好ましい交
換膜の組合せとして、例えば旭化成社製のアシプレック
スカートリッジAG-110を挙げることができるが、特これ
に限定するものではなく、更に本発明の目的を達成する
ためにこれらの交換膜を基本にして、性能向上、修飾、
改造した製品を利用することができる。

このような電気透析を実施するには、市販されている各
種電気透析装置を利用することができる。例えば旭化成
（株）のAC-110系のイオン交換膜を装着した電気透析装
置は、最もこのましい成績が得られ、スパガリン類また
はその製造中間体の外液への漏出損失を極力抑えて無機
塩を除去することが判つた。装置の脱塩能力は一般に交
換膜の面積で決定されるが、本発明においても規模に応
じて適切な面積の交換膜を装着した装置を使用できる。

除去できる塩としては例えば、塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、塩化リチウム、塩化カルシウム、塩化マグネシ
ウム、臭化カリウム、臭化ナトリウム、臭化リチウム、
臭化カルシウム、臭化マグネシウム、酢酸カリウム、酢
酸ナトリウム、酢酸リチウム、酢酸カルシウム、酢酸マ
グネシウム、ギ酸カリウム、ギ酸ナトリウム、ギ酸リチ
ウム、ギ酸カルシウム、ギ酸マグネシウム、炭酸カリウ
ム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸カルシウム、
炭酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウ
ム、リン酸リチウム、リン酸カルシウム、リン酸マグネ
シウム、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸リチウ
ム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウムなどを挙げるこ
とができる。

除去できる酸または塩基としては、塩酸、臭化水素、酢
酸、ギ酸、炭酸、リン酸、硫酸など、また水酸化カリウ
ム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネ
シウム、水酸化カルシウムなどを挙げることができる。

本発明で使用する逆浸透法の原理は、溶媒（一般に水）
は通すが溶質は通さない半透膜を用いて、溶液に浸透圧
に抗した圧力を加えることにより、溶媒が通常の浸透と
は逆方向に進む現象、即ち逆浸透を応用して、溶媒と溶
質の分離を行うものである。従つて逆浸透法の駆動力は
圧力差である。

この半透膜は、逆浸透膜とも呼ばれ、一般に天然高分子
の酢酸セルロースまたは合成高分子からなる。合成高分
子の膜素材としては、ポリエーテル−アミド、ポリエー
テル−尿素、芳香族ポリアミド、スルホン化ポリフルフ
リルアルコール、ポリベンズイミダゾール、ポリピペラ
ジンアミド、スルホン化ポリスルホン、スルホン化フエ
ニレンオキシド、ポリエチレンイミン−トルエンジイソ
シアネート、ポリエチレンイミン−酸クロリド、ポリア
ミドカルボン酸、ポリベンズイミダゾロン、ポリイミ
ド、ポリエーテル、変性ポリアクリロニトリル、ポリエ
チレンイミン縮合体等が広く用いられている。これらの
半透膜は、平膜、スパイラル、チユーブ、中空糸形式の
逆浸透モジユールとして商品化さている。逆浸透モジユ
ールの性能は、溶質の排除率、溶媒（水）の浸過量で評
価される。本発明では、低分子量有機化合物の濃縮に適
した排除率の高い、しかも比較的低い圧力下でも透水量
の多いモジユールが好ましい。現在市販されている高排
除性の逆浸透膜モジユールを第３表に示す。

本発明の目的とするスパガリン類およびその製造中間体
の濃縮工程に用いる逆浸透膜は、これらの市販品から適
宜選択して使用することができる。これらの逆浸透膜の
中で、特に好ましいものとしては、PEC-1000（東レ社
製）、Hollosep（東洋紡社製）、NTR-7100シリーズ（日
東電工社製）などを挙げることができる。

このような逆浸透法により、スパガリン類およびその製
造中間体を濃縮するには、上記のような逆浸透膜モジユ
ールを組入れた市販の各種逆浸透装置を利用することが
できる。装置は本発明の目的を達成するものであれば制
限はない。装置の濃縮能力は一般に逆浸透膜の有効面積
で決まるため、本発明においても規模に応じて適切な面
積の膜モジユールを装着した装置を使用できる。

濃縮しようとするこれらの溶出液に無機塩を含む場合は
脱塩処理を行つて、無機塩による浸透圧を下げた後、逆
浸透装置による濃縮工程にかけるのが好ましい。脱塩処
理としては、先述した電気透析法が最も好ましい。かく
してスパガリン類またはスパガリン製造中間体の精製に
おいて、電気透析法による脱塩工程および逆浸透法によ
る濃縮工程を目的に応じて、単独にあるいは直列に組合
わせて使用することができる。

〔実施例〕

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本
発明は下記の実施例に制限されるものではない。

実施例１ グリオキシリルスペルミジン２塩基塩5gを含有する1M N
aCl溶液500mlを、有効膜面積400cm²の交換膜（アシプレ
ツクスカートリツジAC-110-400:旭化成社製）を装着し
た電気透析装置（マイクロアシライザーＧ−3:旭化成社
製）に通液し、外液には400mlの水道水を使用して電気
透析を行つた。サンプル溶液中の塩濃度は、溶液の電導
度（ms/cm）でモニターした。また同時に、サンプル濃
度の定量を、高速液体クロマトグラフイーを用いて行つ
た。試験結果を第４表と第１図に示す。脱塩は、約60分
で終了した。サンプル溶液を回収し、減圧濃縮してグリ
オキシリルスペルミジン２塩酸塩4.95gを得た（回収率:
99％）。

実施例２ 15−デオキシスパガリン３塩酸塩5gを含有する1M NaCl
溶液500mlを、有効膜面積400cm²の交換膜（カートリツ
ジAC-110-400:旭化成社製）を装着した電気透析装置
（マイクロアシライザーＧ−3:旭化成社製）に通液し、
外液には400mlの水道水を使用して電気透析を行つた。
サンプル溶液中の塩濃度は、溶液の電導度（ms/cm）で
モニターした。また同時に、サンプル濃度の定量を、高
速液体クロマトグラフイーを用いて行つた。脱塩は、約
60分で終了した。サンプル溶液を回収し、減圧濃縮して
15−デオキシスパガリン３塩酸塩4.7gを得た（回収率:9
4％）。

実施例３ グリオキシリルスペルミジン２塩酸塩600gを含有する60
lの水溶液をHOLLOSEP HR5155（東洋紡社製）を装着した
逆浸透装置により、圧力55Kg/cm²にて処理した。運転時
間37分間で透過液50lを得た。その透過液中にはグリオ
キシリルスペルミジンは検出されなかつた。濃縮液と洗
浄液をあわせて11.5lを回収した（濃縮率5.2倍、グリオ
キシリルスペルミジンの回収率98.3％）。経時的に測定
した透過液量、圧力、およびグリオキシリルスペルミジ
ン２塩酸塩の回収率を第５表に示す。

実施例４ 15−デオキシスパガリン３塩酸塩300gを含有する30lの
水溶液をHOLLOSEP HR5155（東洋紡社製）を装着した逆
浸透装置により、圧力55Kg/cm²にて処理した。運転時間
18分で透過液25lを得た。その透過液中には15−デオキ
シスパガリンは検出されなかつた。濃縮液と洗浄液をあ
わせて7lを回収した（濃縮率4.3倍、15−デオキシスパ
ガリンの回収率99％）。

実施例５ 15−デオキシスパガリン３塩酸塩5gを含有する1M NaCl
溶液500mlを、有効膜面積400cm²の交換膜（カートリツ
ジAC-110-400:旭化成社製）を装着した電気透析装置
（マイクロアシライザーＧ−3:旭化成社製）に通液し、
外液には400mlの水道水を使用して電気透析を行つた。
サンプル溶液（400ml）を回収し、NF-70NANOFILM（Film
Tech社製）の平膜（膜直径76mm）を装着した逆浸透ろ
過器を用い、N₂ガスで15Kg/cm²に加圧しろ過した。加圧
時間70分で透過液320mlを得た。濃縮液80mlを回収した
（濃縮率５倍、15−デオキシスパガリンの回収率93.5
％）。

〔発明の効果〕

本発明の電気透析による脱塩工程および／または逆浸透
法による濃縮工程を組入れたスパガリン類の精製法は、
医薬品として要求される高純度品を大量に製造する上
で、極めて効率的で経済的な手段を提供するものであ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の電気透析法による脱塩工程の試験結
果であり、横軸は時間、縦軸は電導度および回収率を示
すグラフである。

フロントページの続き (72)発明者 宮崎 恵子 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 黒目 徹 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 才野 哲之 埼玉県与野市八王子５―11 14―101

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】スパガリン類またはグリオキシリルスペル
   ミジンを精製する方法において、その精製工程に、電気
   透析工程および／または逆浸透工程を組入れることを特
   徴とするスパガリン類またはグリオキシリルスペルミジ
   ンの精製法。