DK165696B - Desulfatohirudiner og deres farmaceutisk acceptable salte, deres fremstilling, farmaceutisk praeparat indeholdende disse forbindelser og anvendelse af forbindelserne til fremstilling af farmaceutisk middel og som analytisk reagens - Google Patents
Desulfatohirudiner og deres farmaceutisk acceptable salte, deres fremstilling, farmaceutisk praeparat indeholdende disse forbindelser og anvendelse af forbindelserne til fremstilling af farmaceutisk middel og som analytisk reagens Download PDFInfo
- Publication number
- DK165696B DK165696B DK552684A DK552684A DK165696B DK 165696 B DK165696 B DK 165696B DK 552684 A DK552684 A DK 552684A DK 552684 A DK552684 A DK 552684A DK 165696 B DK165696 B DK 165696B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- gly
- glu
- cys
- asn
- hirudin
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 title claims description 30
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 title claims description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 claims abstract description 50
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 claims abstract description 50
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 claims description 21
- 102000009133 Arylsulfatases Human genes 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- XYWBJDRHGNULKG-OUMQNGNKSA-N desirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 XYWBJDRHGNULKG-OUMQNGNKSA-N 0.000 claims description 15
- 108010073652 desirudin Proteins 0.000 claims description 15
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 12
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 6
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 6
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 238000007171 acid catalysis Methods 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 7
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 14
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 14
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 12
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000237369 Helix pomatia Species 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- -1 hydrochloric acid Chemical class 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- GAPYKZAARZMMGP-UHFFFAOYSA-N pyridin-1-ium;acetate Chemical compound CC(O)=O.C1=CC=NC=C1 GAPYKZAARZMMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIQHWLTYGMYQQR-QMMMGPOBSA-N O(4')-sulfo-L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 CIQHWLTYGMYQQR-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000003739 carbamimidoyl group Chemical group C(N)(=N)* 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JBGHTSSFSSUKLR-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenyl hydrogen sulfate Chemical compound OS(=O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JBGHTSSFSSUKLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 1
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HVUMOYIDDBPOLL-XWVZOOPGSA-N Sorbitan monostearate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O HVUMOYIDDBPOLL-XWVZOOPGSA-N 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 102000005262 Sulfatase Human genes 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K aluminium tristearate Chemical compound [Al+3].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940063655 aluminum stearate Drugs 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000006326 desulfonation Effects 0.000 description 1
- 238000005869 desulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006477 desulfuration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023556 desulfurization Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012433 hydrogen halide Substances 0.000 description 1
- 229910000039 hydrogen halide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012053 oil suspension Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- NUVBSKCKDOMJSU-UHFFFAOYSA-N para-hydroxybenzoic acid ethyl ester Natural products CCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 NUVBSKCKDOMJSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000024715 positive regulation of secretion Effects 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940005657 pyrophosphoric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940100515 sorbitan Drugs 0.000 description 1
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 1
- 239000001587 sorbitan monostearate Substances 0.000 description 1
- 229940035048 sorbitan monostearate Drugs 0.000 description 1
- 235000011076 sorbitan monostearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 108091005994 sulfated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001180 sulfating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/26—Containing cys-cys disulfide bridge between nonadjacent cysteine residues
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
DK 165696 B
i
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte biologisk aktive polypeptider, som er afledt af hirudin, deres farmaceutisk acceptable salte samt fremgangsmåder til deres fremstilling, farmaceutiske præparater indeholdende disse forbindelser og 5 deres anvendelse til·fremstilling af et farmaceutisk præparat til at inhibere koagulering af menneskeblod eller pattedyrblod og som analytisk reagens til bestemmelse af thrombin.
Hirudin, hvoraf forbindelserne ifølge opfindelsen strukturelt er afledt, er et i naturen forekommende polypeptid, som dan-10 nes i organismen hos medicinske blodigler (Hirudo medicinalis), og som holder det blod, som iglen har optaget, i likoaguleret tilstand. Dets isolering, rensning, kemiske sammensætning samt brede biologiske og medicinske anvendelse som antikoagulations·*· middel er kendt og detaljeret beskrevet og sammenfattet i over-15 sigtsartikler, f.eks. af B.P. Walsmann og F. Markwardt, Pharma-zie 36/ 653-660 (1981). For nylig er hirudins fuldstændige aminosyresekvens blevet klarlagt, og dermed er der også blevet tilvejebragt det første teoretiske grundlag for forsøgs på syntetisk fremstilling af hirudin. Hirudins primærstruktur 20 svarer til formlen 10 H-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly- 20 -Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn- 3° -Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu- (a) 40 -Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val- 50 -Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser- 60 -Hi s-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-
S0*H
i 5
-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH
(Det er endnu ikke afklaret, hvilke specifikke cysteingrupper der er indbyrdes forbundet gennem disulfidbroer. Denne detalje ved strukturen har mindre betydning for synteseplanlægningen.) 25 Strukturen udmærker sig ved en karakteristisk ophobning af hydrofobe aminosyrer mod aminoenden og af polære aminosyrer 2
DK 165696B
mod carboxylenden i peptidet samt som et særligt kendetegn ved en kraftigt sur sulfatmonoestergruppe ved den phenoliske hydr-oxylgruppe i tyrosin-gruppen i stilling 63 svarende til delformlen
_ NH
5 H0-S02-0-./ \“CH2-iH eller [Tyr (SC>3H) 63]
^ ^ CO
Man har hidtil ikke haft nogen klar opfattelse af sulfatgruppens biologiske funktion i proteiner i almindelighed og i dette aktive stof i særdeleshed. Følgende hypoteser er blevet anført: 10 (1) en betydning for proteinets biologiske aktivitet, (2) en deltagelse i regulatoriske celleprocesser (på samme måde som det er kendt for den reversible phosphorylering), (3) en stimulering af sekretionen, dvs. sulfateringen tjener som markering for erkendelsen som sekretorisk protein: 15 alle hidtil kendte sulfaterede proteiner har sekretorisk virkning eller er transmembranale proteiner. Under alle omstændigheder er sulfatgruppen et af de mest markante strukturkendetegn ved hirudin.
Biologisk set hører hirudin med K^-værdien på ca. 6 x 10 ^ M 20 til de mest virksomme thrombin-inhibitorer. Det har en ganske specifik virkning mod thrombin og inhiberer ingen af de andre mange blodkoagulationsproteinaser. I modsætning til heparin har hirudin direkte inhiberende virkning på thrombin og virker ikke gennem antithrombin III, som det er tilfældet med heparin. 25 Den eneste farmakologisk erkendelige virkning af renset hirudin er inhiberingen af blodkoaguleringen eller profylaksen af thrombose. Ved intravenøs indgift til hunde er der selv ved usædvanligt høje doser ikke konstateret nogen virkning på hjertefrekvensen, åndedrættet, blodtrykket, thrombocyttallet, 30 fibrinogen og hæmoglobin. Ved forsøg med rotter, svin og hunde er det påvist, at hirudin er virksomt ved eksperimentel 3
DK 165696B
thrombosis (fremkaldt enten ved stasis eller ved injektion af thrombin), ved endotoxin-chok samt ved DIC (dissemineret intravasal koagulation). Ved direkte sammenligningsforsøg med heparin har hirudin vist sig at være heparin overlegent, 5 uanset hvor sammenligningsforsøgene er blevet gennemført.
Selv om hirudin har været kendt i lang tid, har det endnu ikk$ opnået den brede terapeutiske anvendelse, som man med rette kunne forvente som følge af dets udmærkede biologiske egenskaber. Dets almene udbredelse i medicinen hindres nem-10 lig som følge af en tungtvejende ulempe, som skyldes dets yderst begrænsede tilgængelighed. Hidtil har det kun været muligt at fremstille hirudinpræparater ud fra dyrt og svært tilgængeligt naturmateriale, nemlig de medicinske blodigler, ved kostbare isolerings- og rensningsfremgangsmåder. Den re-15 lativtlange sekvens på 65 aminosyrer giver næppe håb om et praktisk resultat af en syntetisk fremstilling ved hjælp af den klassiske peptidsyntese. Den alternative, biosyntetiske metode, der kunne udvikles ved syntese af et egnet poly-nucleotid og inkorporering deraf i den genetiske kode i 20 en produktionsmikroorganisme i overensstemmelse med de almene gensplejsningsmetoder, synes heller ikke at kunne føre til et resultat. Det måtte forventes, at den nødvendige' indføring af den O-sulfonerede tyrosingruppe ved en direkte biosyntese ville frembyde næsten uovervindelige vanskeligheder.
25 Det har nu overraskende vist sig, at i modsætning til de ovenfor anførte teoretiske betragtninger bibeholdes de gunstige biologiske egenskaber ved hirudin også i det tilfælde, hvor den karakteristiske sulfatmonoestergruppe fjernes fra den 6 3 phenoliske hydroxylgruppe i [Tyr ]-resten. De dannede ned- 30 brydningsprodukter, desulfatohirudiner med formlerne I og II, 6 3 er bortset fra fraværelsen af sulfatestergruppen i Tyr karakteriseret ved alle hirudins øvrige strukturkendetegn, idet der i tilfælde af desulfatohirudin med formlen I, som forestiller det egentlige desulfatohirudin i ordets snævreste be-35 tydning, foreligger den uforkortede aminosyresekvens, medens der i det analoge, med hensyn til virkning ligeværdige hexa- 4
DK 165696B
contatripeptid, der betegnes som desulfatohirudin med formlen II, desuden mangler de to C-terminale aminosyrer Leu og Glu. Overraskende er disse forbindelser imidlertid kvalitativt og kvantitativt mindst lige så gode som hirudin,hvad angår bio-5 logisk virkning, især hvad angår antikoagulativ virkning.
Denne erkendelse har stor betydning med hensyn til mulighederne for en konventionel bioteknologisk syntese af dette peptid: medens tilstedeværelsen af den usædvanlige hydroxy-sulfonylgruppe i hirudin i praksis udelukker denne forbindel-10 ses direkte biosyntese, er der som følge af denne gruppes fraværelse ved desulfatohirudin væsentligt gunstigere strukturelle forudsætninger for en bioteknisk syntese med godt resultat. Ved samme biologiske virkning er desulfatohirudin således hirudin klart overlegeifc i teknisk-økonomisk henseende på grund 15 af den væsentligt bedre tilgængelighed ad bioteknologisk vej.
Ifølge opfindelsen kan desulfatohirudinerne med formlerne I og II fremstilles på i og for sig kendt måde. De kan således eksempelvis fremstilles ved, at man i hexacontapentapeptidet hirudin med den ovenfor anførte formélr. A frigør den som svovl-20 syre-monoester tilstedeværende phenoliske hydroxylgruppe i tyrosinresten i stilling 63.
Frigørelsen af denne gruppe svarende til reaktionsskemaet HO - S02 - 0 - Pept -HO - Pept (hvori Pept betyder den resterende del af hirudin) kan gennemføres på i og for sig kendt måde f.eks. ved hydrolyse, idet 25 der kan anvendes såvel kemiske som biologiske metoder til dette formål.
Ved en kemisk frigørelse gennemføres omsætningen fortrinsvis under de generelle betingelser for syrekatalyseret hydrolyse, såsom under indvirkning af en fortyndet saltsyreopløsning, 30 f.eks. en ca. 2 til ca. 4 N vandig saltsyreopløsning, fordelagtigt i trifluoreddikesyre som reaktionsmedium, eller med vand-
DK 165696B
5.
holdig trifluoreddikesyre alene som reaktions- og opløsningsmiddel. For at formindske faren for hydrolytisk spaltning af peptidbindinger mest muligt anbefales det at arbejde under milde reaktionsbetingelser, f.eks. ved temperaturer, som 5 ikke overstiger stuetemperatur, og at følge hydrolysereaktionens forløb analytisk, f.eks. ved tyndtlagskromatografi.
Fortrinsvis gennemføres hydrolysen dog på biologisk måde, især ved anvendelse af specifikke enzymer, arylsulfataser, som under milde betingelser spalter de phenoliske sulfatester-10 grupper til frie phenoliske grupper. Den biologiske frigørelse af den sulfaterede hydroxylgruppe kan gennemføres ved hjælp af et egnet enzympræparat med beriget aktivt stof eller et isoleret enzym, eller man kan anvende et egnet enzymsystem in situ, dvs. som det umiddelbart foreligger i etlevende eller 15 dødt biologisk materiale, f.eks. en voksende eller hvilende mikroorganisme, en cellekultur, et cellehomogenisat eller et autolysat. En af de største fordele ved den biologiske hydrolyse er dens høje selektivitet, som udelukkende fremkalder den ønskede spaltning af monosulfatesterbindingen uden at 20 angribe de øvrige funktionelle grupper, først og fremmest peptidbindingerne, i det følsomme udgangsmateriale. Forbindelserne ifølge opfindelsen fremstilles fortrinsvis ved, at man behandler hirudin i en vandig, fortrinsvis pufret opløsning eller suspension med et individuelt arylsulfatase-præparat, 25 f.eks. arylsulfatasen fra Helix pomatia, ved en for enzymprocesser almindelig temperatur, som f.eks. fra ca. 20 til ca. 45°C, fortrinsvis fra 25-30°C. Der arbejdes fortrinsvis i et svagt surt medium, dvs. ved en pH-værdi fra ca. 4 til ca. 7, især fra ca. 5 til ca. 6, som indstilles med en puffer, såsom 30 en ca. 0,03 til ca. 0,3 molær opløsning af et salt af en organisk carboxylsyre med et alkalimetal eller med en organisk base, f.eks. med natriumacetat eller især med pyridinacetat (med pH-værdien ca. 5,4). Forholdet mellem anvendt enzym og substrat (hirudin) afhænger sædvanligvis af det pågældende 35 præparats aktivitet og ligger sædvanligvis fra ca. 1:2 til ca. 1:100, især fra ca. 1:5 til ca. 1:20. Det er fordelagtigt 6
DK 165696B
at anvende enzympræparater med størst mulig renhedsgrad og aktivitet. Da arylsulfataserne katalyserer ikke blot fra-spaltningen, men også indføringen af sulfatgruppen og fremkalder en ligevægtsindstilling mellem udgangsforbindelserne 5 og slutforbindelserne, er det fordelagtigt for hvert enzympræparat ved forforsøg at bestemme den optimale koncentration, mængdeforholdet til substratet og det tidsrum, som medgår til desulfatiseringen. I reglen er reaktionen imidlertid afsluttet allerede efter nogle minutter. Reaktionsproduktets kvali-10 tet forringes ikke ved længere tids kontakt (op til ca. 4 timer) med aktivt enzym (f.eks. ved henstand af reaktionsblandingen) .
Forløbet af den enzymatiske desulfatisering kan følges bioanalytisk på udtagne prøver. I praksis går man eksempelvis 15 frem på den måde, at man ved kortvarig opvarmning (ca. 3 minutter) af prøven til ca. 100°C ødelægger enzymaktiviteten og behandler substratet med en carboxypeptidase Y. (Carboxy-peptidase Y nedbryder peptidkæden fra carboxysiden, idet amino-syrerne fraspaltes efter hinanden ved spaltning af de pågæl-20 dende amidbindinger.) Sædvanligvis er nedbrydningen af peptidkæden efter ca. 15 minutter forløbet så langt, at den på- 6 *5 gældende sulfatiserede og/eller frie 63-aminosyre (Tyr ) er fuldstændigt fraspaltet og således tilgængelig for bestemmelse i en konventionel aminosyreanalysator.
25 Desulfatohirudinet med formlen II dannes ved fraspaltning af de to C-terminale aminosyrekomponenter Leu og Gin i løbet af hydrolysen af hirudin. Adskillelsen af den derved dannede blanding kan eksempelvis gennemføres ved præparativ HPLC-kro-matografi. Desulfatohirudinet med formlen II har samme biolo-30 giske egenskaber som desulfatohirudinet med formlen I.
Desulfatohirudinerne ifølge opfindelsen kan ikke blot forekomme på fri form, men også i form af deres salte. Da de i flere aminosyrerester indeholder frie aminogrupper eller amidinogrup-per, kan forbindelserne ifølge opfindelsen foreligge i form 35 af syreadditionssalte. Som syreadditionssalte anvendes især 7
DK 165696B
fysiologisk acceptable salte med gængse terapeutisk anvendelige syrer. Som uorganiske syrer kan anvendes hydrogenhalogenid-syrerne, såsom hydrogenchloridsyre, men også svovlsyre og phos-phorsyre eller pyrophosphorsyre. Som organiske syrer anvendes 5 i første række arensulfonsyrer, såsom benzen- eller p-toluen-sulfonsyre eller lavalkansulfonsyrer, såsom methansulfonsyre, samt carboxylsyrer, såsom eddikesyre, mælkesyre, palmitinsyre og stearinsyre, æblesyre, vinsyre, ascorbinsyre og citronsyre.
Da desulfatohirudinerne imidlertid også indeholder frie carb-10 oxylgrupper i flere aminosyrerester, som giver hele peptidet sur karakter, kan de også foreligge som salte, f.eks. som natrium-, kalium-, calcium- eller magnesiumsalt, eller som ammoniumsalt, af ledt af ammoniak eller en fysiologisk acceptabel, organisk, nitrogenholdig base. Da de imidlertid indeholder 15 såvel frie carboxylgrupper som frie aminogrupper (og amidino-grupper), kan de også foreligge som indre salt.
Afhængigt af arbejdsmåden fås forbindelserne ifølge opfindelsen på fri form eller i form af syreadditionssalte, indre salte eller salte med baser. Fra syreadditionssaltene kan de frie 20 forbindelser udvindes på i og for sig kendt måde. De frie forbindelser kan igen omdannes til terapeutisk anvendelige syreadditionssalte ved omsætning med syrer, f.eks. med sådanne, som danner de ovenfor anførte salte, og inddampning eller lyofilisering. De indre salte kan udvindes ved indstilling 25 af pH-værdien på et passende neutralpunkt.
Opfindelsen angår ligeledes farmaceutiske præparater, som indeholder mindst én af forbindelserne ifølge opfindelsen eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, eventuelt sammen med et farmaceutisk bærestof og/eller hjælpestoffer.
30 Disse præparater kan især anvendes ved de ovenfor anførte indikationer, og de kan eksempelvis indgives parenteralt, såsom intravenøst, intrakutant, intramuskulært eller subkutant, oralt eller topisk. Doseringen afhænger i første række af den specifikke indgiftsform og af formålet med terapien 35 eller profylaksen. Størrelsen af de enkelte doser samt ind- 8
DK 165696B
giftsskemaet kan bedst fastlægges ud fra en individuel bedømmelse af det pågældende sygdomstilfælde. De nødvendige metoder til bestemmelse af relevante blodfaktorer er velkendt for fagmanden. I almindelige tilfælde ligger den terapeutisk virksom-5 me mængde af forbindelserne ifølge opfindelsen ved injektion i dosisområdet fra ca. 0,005 til ca. 0,1 mg/kg legemsvægt, fortrinsvis i området fra ca. 0,01 til 0,05 : .mg/kg legemsvægt. Indgiften foretages ved intravenøs, intramuskulær eller subkutan injektion. I overensstemmelse hermed indeholder far-10 maceutiske præparater til parenteral indgift i enkeltdosisform fra ca. 0,4 til ca. 7,5 mg af forbindelsen ifølge opfindelsen pr. dosis afhængigt af applikationsmåden. Foruden det aktive stof indeholder disse farmaceutiske præparater sædvanligvis også en puffer, f.eks. en phosphatpuffer, som 15 skal holde pH-værdien mellem ca. 3,5 og 7, og desuden na- triunchlorid, mannitol eller sorbitol til opnåelse af isotoni.
De kan foreligge på frysetørret eller opløst form, idet opløsninger med fordel kan indeholde et antibakterielt konserveringsmiddel, f.eks. 0,2-0,3% 4-hydroxybenzoesyre-methyl-20 ester eller -ethylester.
Et præparat til topisk anvendelse kan foreligge som vandig opløsning, lotion eller gel, olieopløsning eller oliesuspension eller fedtholdig salve eller især emulsionssalve. Et præparat i form af en vandig opløsning fremstilles eksempelvis ved, at 25 man opløser det aktive stof ifølge opfindelsen eller et terapeutisk anvendeligt salt deraf i en vandig pufferopløsning med en pH-værdi på 4-6,5 og eventuelt tilsætter et andet aktivt stof, f.eks. et antiinflammatorikum, og/eller et polymert klæbemiddel, f.eks. polyvinylpyrrolidon, og/eller et konserve-30 ringsmiddel. Koncentrationen af det aktive stof ligger fra ca. 0,08 til ca. 1,5 mg, fortrinsvis fra ca. 0,25 til ca. 1,0 mg, i ca. 10 ml opløsning eller 10 g gel.
En indgiftsform på oliebasis til topisk anvendelse fremstilles eksempelvis ved at suspendere det aktive stof eller et terapeu-35 tisk anvendeligt salt deraf i en olie, eventuelt linder tilsætning af kvældemidler, såsom aluminiumstearat, og/eller grænse- 9
DK 165696B
fladeaktive stoffer (tensider), hvis HLB-værdi ("hydrofil-lipofil-balance") er mindre end 10, såsom fedtsyremonoestere af polyvalente alkoholer, f.eks. glycerolmonostearat, sorbitanmonolaurat, sorbitanmonostearat eller sorbitanmono-5 o'leat. En fedtholdig salve fremstilles eksempelvis ved at suspendere det aktive stof eller et salt deraf i et fedtgrundlag, som kan udstryges, eventuelt under tilsætning af et tensid med en HLB-værdi under 10. En emuisionssalve fremstilles ved udrivning af en vandig opløsning af det aktive 10 stof eller et salt deraf i et blødt, udstrygeligt fedtgrundlag under tilsætning af et tensid, hvis HLB-værdi er mindre end 10. Alle disse topiske indgiftsformer kan også indeholde konserveringsmidler. Koncentrationen af det aktive stof ligger fra ca. 0,08 til ca. 1,5 mg, fortrinsvis fra 0,25 til 1,0 mg, 15 i ca. 10 g grundmasse.
Opfindelsen angår også anvendelsen af de ovenfor definerede desulfatohirudiner eller deres farmaceutisk acceptable salte til fremstilling af et farmaceutisk middel til hæmning af koaguleringen af menneskeblod eller pattedyrblod.
20 Foruden de ovenfor beskrevne og dermed analoge farmaceutiske præparater, som er bestemt til direkte medicinsk anvendelse på det menneskelige legeme eller et pattedyrs legeme, omhandler den foreliggende opfindelse også farmaceutiske præparater til medicinsk anvendelse uden for det levende menneskelige le-25 gerne eller et levende pattedyrs legeme. Sådanne præparater anvender man i første række som koagulationshæmmende tilsætning til blod, som uden for legemet underkastes en cirkulation eller behandling (f.eks. dialyse i kunstige nyrer), konservering eller modificering (f.eks. hæmoseparation). Med hensyn til sam-30 mensætning ligner sådanne præparater, såsom forrådsopløsninger eller præparater på enkeltdosisform, de ovenfor beskrevne injektionspræparater. Imidlertid beregnes indholdet af aktivt stof eller koncentrationen på rumfanget af det blod, som skal behandles, eller nøjagtigere på grundlag af dets thrombin-35 indhold. Man skal i denne forbindelse være opmærksom på, at de aktive stoffer ifølge opfindelsen (på fri form) 10
DK 165696B
(a) fuldstændigtdeaktiverer en ca. femdobbelt vægtmængde thrombin, (b) også i større mængder er fysiologisk harmløs og (c) selv i høje koncentrationer meget hurtigt udskilles fra 5 det cirkulerende blod, således at der ikke er nogen fare for overdosering, også f.eks. ved transfusion. Afhængigt af det særlige formål udgør en egnet dosis fra ca. 0,01 til ca. 1,0 mg aktivt stof pr. liter blod, idet man uden fare kan gå langt over den øvre grænse.
10 Den foreliggende opfindelse omfatter også den bioanalytiske anvendelse af forbindelserne ifølge opfindelsen og deres salte til bestemmelse af thrombin samt præparater til dette formål, som indeholder de aktive stoffer, f.eks. blandinger af faste stoffer og først og fremmest opløsninger, især vandige opløs-15 ninger. Disse kan foruden en nøjagtig mængde eller koncentration af de aktive stoffer ifølge opfindelsen (også i form af et salt) hensigtsmæssigt også indeholde indifferente hjælpestoffer, f.eks. de ovenfor i forbindelse med injektionspræparater anførte, som eksempelvis kan have en stabiliserende og/eller 20 konserverende virkning. Disse præparater anvendes ved bioanalyser på kendt måde analogt med hirudin-præparaterne, eksempelvis til bestemmelse af thrombin.
I den foreliggende beskrivelse og i kravene anvendes forkortelserne for aminosyrer og aminosyrerester i overensstemmel-25 se med de almindeligt anerkendte nomenklaturregler, og de refererer til α-aminosyrer og deres rester af den naturligt forekommende L-række.
Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler.
Eksempel 1.
30 Materiale: Hirudin, aktivitet 630 IE/mg
Den biologiske aktivitet bestemmes over den hæmmende virkning i forhold til thrombin, hvis enzymatiske aktivitet igen bestemmes over for det chromogene substrat Chromozym TH (et produkt
DK 165696 B
11 fra firmaet Boehringer, Mannheim, Vesttyskland, til thrombin-eller hirudin-bestemmelse) ifølge kendt forskrift, som er vedlagt testpræparatet.
Arylsulfatase (ARS) fra Helix pomatia (et produkt fra firmaet 5 Boehringer, Mannheim, Vesttyskland), 5 E/mg.
Den enzymatiske aktivitet bestemmes ifølge den kendte fremgangsmåde af Leon et al., Biochem. J. 75, 612-617, ved hjælp af det chromogene substrat p-nitrophenolsulfat (1,8 mmol/1 i blanding).
10 Desulfatering (1) Forforsøg (til bestemmelse af den optimale ARS-koncentra-tion).
(a) Der fremstilles følgende lageropløsninger: (A) Hirudin-opløsning med en koncentration på 2 mg/ml fremstil- 15 let ved opløsning af hirudin i opløsning (C).
(B) Arylsulfatase-opløsning med en koncentration på 1,25 mg/ml fremstilles ved blanding af 25 dele af den i handelen forekommende suspension med 100 dele af opløsning (C).
(C) Pufferopløsning: 0,1 M vandig pyridinacetatopløsning, 20 pH-værdi 5,4.
(b) Fremstilling:
Ved blanding af nedenstående komponenter fremstilles en serie prøver. Hver prøve indeholder 15 yl af opløsning A (svarende til 30 yg hirudin) og 10 yl af opløsning B (svarende til 12,5 25 yg arylsulfatase) eller en opløsning, hvori koncentrationen af enzymet indstilles på 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 eller 1/32 af den oprindelige koncentration ved fortynding af opløsning B med pufferopløsningen C. Prøverne, som hver har et rumfang på 25 yl, inkuberes i 60 minutter ved 25°C, hvorpå de op-30 varmes i tre minutter til 100°C til denaturering af sulfatasen og afkøles hurtigt. Indholdet af frit og sulfateret tyrosin (ifølge den nedenfor beskrevne metode) analyseres.
12
DK 165696B
(2) Præparativ fremgangsmåde 15 rumfangsdele af opløsning A blandes med 10 rumfangsdele af en fortynding af opløsning B, hvis optimale mindste koncentration er bestemt ved forforsøg, og indstilles ved fortynding 5 af forrådsopløsningen B med pufferopløsningen C. Blandingen inkuberes ved 25°C i fra ca. 30 til ca. 60 minutter, hvorefter den opvarmes kortvarigt til 100°C (f.eks. under betingelserne ved en såkaldt "flash-sterilisation"), hvorefter den straks afkøles for at denaturere desulfoneringsenzymet. Reaktions-20 blandingen adskilles, eventuelt efter inddampning i vakuum ved eller under stuetemperatur, pa en søjle af "Sephadex" G 50 eller G 75, "CM-Sephadex"®, "Wofatit"® CP, "Amberlite"® IRC eller en anden ækvivalent kationbytter. Alt efter behov gentages denne adskillelse, indtil man får desulfatohirudin 15 . med ønsket renhed (bestemt f.eks. ved hjælp af hæmningstesten med thrombin og/eller aminosyreanalyse, se nedenfor). Produktet fås i fast form ved lyofilisering af de tilsvarende opløsninger (eluater). ' Det rene produkt må ifølge aminosyreanalysen (efter C-terminal proteolyse) ikke indeholde tyrosin-O-sulfat 20 og skal i hæmningsaktivitetstesten overfor thrombin (f.eks. ved hjælp af chromozym TH, se ovenfor) udvise samme fuldstændige aktivitet som hirudin.
Analytisk kontrol af desulfatiseringen
Den analytiske kontrol af desulfatiseringen gennemføres ved, 25 at man trinvis nedbryder hirudin (som udgangsmateriale), prøver fra des ulf aterings fremgangsmåden samt desulfatohirudin med formlen I (som slutprodukt) fra carboxylenden med carboxy-peptidase Y og foretager kvantitativ bestemmelse af de fraspaltede aminosyrerester ved hjælp af en konventionel amino-3 0 syreanalysator.
(a) Der fremstilles følgende lageropløsninger: (Aa) Hirudinopløsning med en koncentration på 0,806 mg/ml fremstilles ved opløsning af 0,250 vægtdele hirudin i 310 rumfangsdele pufferopløsning Ca (se nedenfor).
DK 165696 B
13 (Ba) CPY-opløsning med en koncentration på 2 mg/ml fremstilles ved opløsning af 2 vægtdele carboxypeptidase Y (CPY) i 1000 rumfangsdele pufferopløsning Ca.
(Ca) Pufferopløsning: 0,1 M vandig pyridinacetatopløsning, 5 pH-værdi 5,4.
(b) Metode:
Til 275 yl af opløsning Aa svarende til 222 yg hirudin sættes 8 yl af opløsning Ba svarende til 16 yg CPY, dvs. i et forhold til hirudin på 1:4 (vægt/vægt) eller 1:125 (mol/mol), 10 og blandingen inkuberes i 30 minutter ved 25°C. Fra blandingen udtages en prøve på 30 yl, som tilsættes 5 yl trifluor-eddikesyre, hvorpå prøven centrifugeres til fjernelse af CPY-bundfaldet. Supernatantopløsningen inddampes, og de i remanensen tilbageblevne aminosyrer optages i en til amino-15 syreanalyse bestemt pufferopløsning og bestemmes kvantitativt ved hjælp af en konventionel aminosyreanalysator. På samme måde foretages også analyse af desulfatohirudin I, (Resultatet kan også udtrykkes som molforholdet mellem aminosyrerne, især mellem tyrosin-0-sulfatet eller frit tyrosin til hirudin.) ' 20 (Til kontrolprøverne underkastes såvel hirudin som CPY hver især samme prøvningsmetode.) På samme måde sættes til prøver af 25 yl fra desulterings-forforsøget efter ødelæggelse af ARS-aktiviteten ved kortvarig opvarmning 2 yg CPY (i form af opløsning Ba), og der inkuberes 25 i 30 minutter ved 25°C. Efter tilsætning af 5 yl trifluoreddi-kesyre , centrifugering og lyofilisering af supernatanten foretages kvantitativ bestemmelse af de frigjorte aminosyrer i en analysator. - (Der arbejdes med følgende kontrolblandinger: (1) hirudin, (2) CPY, (3) ARS, (4) hirudin + CPY, (5) 30 hirudin + ARS, (6) CPY + ARS.) 14
DK 165696B
Eksempel 2.
Materiale
Hirudin: 1,5 mg hirudin (renset ved hjælp af HPLC).
Arylsulfatase (fra Helix pomatia): Suspension fra firmaet 5 Boehringer: 5 mg/ml = 5 E/mg. Arylsulfatasen (ARS) afsaltes inden forsøget på en PD 10-søjle. 100 yl suspension sættes til 2,5 ml puffer (0,1 M ammoniumacetat, pH-værdi 5,5), blandingen sættes til PD 10-søjlen, og der elueres med 3 ml puffer. Ekstinktionen for den eluerede opløsning er E2g0 = 0,139, 10 og 100 ul deraf svarer til 16 yg ARS.
Metode
Hirudin opløses i en mængde på 2 yg/yl puffer (0,1 M ammoniumacetat, pH-værdi 5,5) . Til 20 yg hirudin (ca. 10 yl) sættes 100 yl af ARS-opløsningen i puffer.
15 Vægtforholdet mellem enzym (ARS) og substrat (hirudin) = 1:1,25.
Der foretages behandling af en blanding i præparativ målestok i 22 timer ved 25°C. Omsætningen følges ved hjælp af HPLC-ana-lyse, idet der anvendes 2,7 yg inhibitor pr. bestemmelse.
20 Det viser sig, at hirudin efter 6 timers forløb for 90%'s vedkommende er desulfatiseret til desulfatohirudin med formlen (I). Efter 22 timers forløb findes desulfatohirudin med formlen (I) i blanding med desulfatohirudin med formlen (II) (I:II =55:45). Denne blanding kan adskilles under anvendelse 25 af den i eksempel 1 anførte kroma tograf er in gs fremgangsmåde.
Den protein-kemiske karakterisering af slutprodukterne gennemføres ved hjælp af dansylchloridmetoden (N-terminal bestemmelse) , ved nedbrydning med carboxypeptidase Y (C-termi-nal bestemmelse) og ved aminosyreanalyse i henholdsvis 24 og 30 48 timer.
Claims (8)
1. Desulfatohirudiner, kendetegnet ved, at de har formlen 10 H-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly- 20 -Gln-Asn-Leu-Cys-Leu-Cys-Glu-Gly-S er-Asn- 30 -Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu- (I) 40 -Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val- 50 -Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser- 60 -His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro- -Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH 5 og formlen 10 H-Val-Val-Tyr-Thr-Asp-Cys-Thr-Glu-Ser-Gly« 20 -Gin-As η-Leu-Cy s-Leu-Cys-Glu-Gly-Ser-Asn- 30 -Val-Cys-Gly-Gln-Gly-Asn-Lys-Cys-Ile-Leu- (II) 40 -Gly-Ser-Asp-Gly-Glu-Lys-Asn-Gln-Cys-Val- 50 -Thr-Gly-Glu-Gly-Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser- 60 -His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro- -Glu-Glu-Tyr-OH hvori resterne -CYS- parvis er sammenknyttet på samme måde som i hirudin ved hjælp af disulfid-broer, og deres farmaceutisk acceptable salte.
2. Desulfatohirudiner og deres salte ifølge krav 1, som kan fremstilles ved hydrolytisk desulfatering af hirudin.
3. Fremgangsmåde til fremstilling af desulfatohirudiner eller salte deraf ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man i hirudin hydrolytisk fraspalter sulfatmonoestergrup-15 pen fra den phenoliske hydroxylgruppe i tyrosinresten i stilling 63. DK 165696 B 16
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at man gennemfører den hydrolytiske fraspaltning med en arylsulfatase.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet 5 ved, at man gennemfører den hydrolytiske fraspaltning under sur katalyse.
6. Farmaceutisk middel, kendetegnet ved, at det indeholder mindst ét desulfatohirudin eller et farmakologisk acceptabelt salt deraf ifølge krav 1λeventuelt sammen med 10 mindst ét farmaceutisk bærestof eller hjælpemateriale.
7. Anvendelse af desulfatohirudiner ifølge krav 1 eller farmakologisk acceptable salte deraf til fremstilling af farmaceutisk middel til hæmning af koaguleringen af menneskeblod eller pattedyrblod.
8. Anvendelse af desulfatohirudiner ifølge krav 1 eller salte deraf som reagens til analytisk bestemmelse af thrombin.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3342139 | 1983-11-22 | ||
| DE19833342139 DE3342139A1 (de) | 1983-11-22 | 1983-11-22 | Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK552684D0 DK552684D0 (da) | 1984-11-21 |
| DK552684A DK552684A (da) | 1985-05-23 |
| DK165696B true DK165696B (da) | 1993-01-04 |
| DK165696C DK165696C (da) | 1993-05-24 |
Family
ID=6214920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK552684A DK165696C (da) | 1983-11-22 | 1984-11-21 | Desulfatohirudiner og deres farmaceutisk acceptable salte, deres fremstilling, farmaceutisk praeparat indeholdende disse forbindelser og anvendelse af forbindelserne til fremstilling af farmaceutisk middel og som analytisk reagens |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US4654302A (da) |
| EP (1) | EP0142860B1 (da) |
| JP (1) | JP2551551B2 (da) |
| AT (1) | ATE56021T1 (da) |
| AU (1) | AU578050B2 (da) |
| CA (1) | CA1239606A (da) |
| CY (1) | CY1737A (da) |
| DD (1) | DD232498A5 (da) |
| DE (3) | DE3342139A1 (da) |
| DK (1) | DK165696C (da) |
| HK (1) | HK121293A (da) |
| IE (1) | IE57885B1 (da) |
| IL (1) | IL73570A (da) |
| LU (1) | LU90192I2 (da) |
| MX (1) | MX9203370A (da) |
| NL (1) | NL970045I2 (da) |
| NZ (1) | NZ210275A (da) |
| PH (1) | PH23831A (da) |
| ZA (1) | ZA849068B (da) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3342139A1 (de) * | 1983-11-22 | 1985-05-30 | Ciba-Geigy Ag, Basel | Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel |
| US5705355A (en) * | 1984-03-27 | 1998-01-06 | Transgene, S.A. | Hirudin, pharmaceutical compositions comprising it and their use |
| FR2562088B1 (fr) * | 1984-03-27 | 1987-11-13 | Transgene Sa | Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine |
| DE3438296A1 (de) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
| ATE64956T1 (de) * | 1984-06-14 | 1991-07-15 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur herstellung von thrombininhibitoren. |
| DE3429430A1 (de) * | 1984-08-10 | 1986-02-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3445532A1 (de) * | 1984-12-13 | 1986-06-19 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Hirudin-pa, desulfatohirudine-pa, verfahren zur herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| DE3506992A1 (de) * | 1985-02-27 | 1986-08-28 | Plantorgan Werk Heinrich G.E. Christensen, KG, 2903 Bad Zwischenahn | Modifizierte hirudine, verfahren zu deren herstellung und pharmazeutische mittel, die diese wirkstoffe enthalten |
| JPS6229997A (ja) * | 1985-04-08 | 1987-02-07 | Sankyo Co Ltd | Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法 |
| DE3738541A1 (de) * | 1987-11-13 | 1989-05-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin |
| DE3689525D1 (de) * | 1985-07-17 | 1994-02-24 | Hoechst Ag | Neue Polypeptide mit blutgerinnungshemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung bzw. Gewinnung, deren Verwendung und diese enthaltende Mittel. |
| MY101203A (en) * | 1985-12-12 | 1991-08-17 | Ucp Gen Pharma Ag | Production of thrombin iinhibitors. |
| US5789540A (en) * | 1987-01-23 | 1998-08-04 | Merrell Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
| US6005071A (en) * | 1987-01-23 | 1999-12-21 | Merrell Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
| US5192745A (en) * | 1987-05-21 | 1993-03-09 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Cyclic anticoagulant peptides |
| US5236898A (en) * | 1987-05-21 | 1993-08-17 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Cyclic anticoagulant peptides |
| US5256559A (en) * | 1988-03-04 | 1993-10-26 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
| EP0333356A3 (en) * | 1988-03-04 | 1990-12-19 | Biogen, Inc. | Hirudin peptides |
| AU614121B2 (en) * | 1988-05-04 | 1991-08-22 | Novartis Ag | Improvements in the production of polypeptides |
| US4971953A (en) * | 1988-05-10 | 1990-11-20 | Merrell Dow Pharmaceuticals | Anticoagulant peptide alcohols |
| EP0347376B1 (en) * | 1988-06-11 | 1994-03-23 | Ciba-Geigy Ag | Novel polypeptides with an anticoagulant activity |
| US5268296A (en) * | 1988-06-11 | 1993-12-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18 |
| US5167960A (en) * | 1988-08-03 | 1992-12-01 | New England Deaconess Hospital Corporation | Hirudin-coated biocompatible substance |
| US5112615A (en) * | 1988-08-03 | 1992-05-12 | New England Deaconess Hospital Corporation | Soluble hirudin conjugates |
| GB8822147D0 (en) * | 1988-09-21 | 1988-10-26 | Ciba Geigy Ag | Pharmaceutically active combination |
| HUT55799A (en) * | 1988-09-29 | 1991-06-28 | Biogen Inc | Process for producing hirudine-like peptides |
| US4994367A (en) * | 1988-10-07 | 1991-02-19 | East Carolina University | Extended shelf life platelet preparations and process for preparing the same |
| DE3835815A1 (de) * | 1988-10-21 | 1990-04-26 | Hoechst Ag | Neue isohirudine |
| WO1990006128A1 (en) * | 1988-12-05 | 1990-06-14 | Biogen, Inc. | Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation |
| US4861865A (en) * | 1989-01-23 | 1989-08-29 | Washington University | Novel antithrombin peptide |
| US5179196A (en) * | 1989-05-04 | 1993-01-12 | Sri International | Purification of proteins employing ctap-iii fusions |
| US6239101B1 (en) * | 1989-07-05 | 2001-05-29 | Oklahoma Medical Research Foundation | Thrombin binding polypeptides |
| US5192747A (en) * | 1989-10-03 | 1993-03-09 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Anticoagulant peptides |
| AU641215B2 (en) * | 1990-02-13 | 1993-09-16 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Stabilized sulfonate, sulfate, phosphonate and phosphate derivatives of hirudin |
| US5118790A (en) * | 1990-07-24 | 1992-06-02 | Sri International | Analogs of hirudin |
| US5837808A (en) * | 1991-08-20 | 1998-11-17 | Baxter International Inc. | Analogs of hirudin |
| DE4209110A1 (de) * | 1991-11-26 | 1993-05-27 | Basf Ag | Neue thrombininhibitorische proteine aus landblutegeln |
| DE4140381A1 (de) * | 1991-12-07 | 1993-06-09 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet |
| GB9401447D0 (en) * | 1994-01-26 | 1994-03-23 | Ciba Geigy Ag | Pharmaceutical compositions |
| DE4404168A1 (de) * | 1994-02-10 | 1995-08-17 | Hoechst Ag | Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung |
| DE19607239A1 (de) | 1996-02-27 | 1997-08-28 | Behringwerke Ag | Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend Hirudin und Verfahren zu deren Herstellung |
| KR20000070338A (ko) * | 1997-01-20 | 2000-11-25 | 나가시마 카쭈시게, 노미야마 아키히코 | 펩티드의 안정화 방법 및 당해 방법을 이용한 펩티드 함유 동결건조 의약조성물 |
| DE19755682A1 (de) * | 1997-12-15 | 1999-06-17 | Knoll Ag | Verfahren zur Ermittlung eines Dosierungschemas für Thrombininhibitoren |
| DE10149678A1 (de) | 2001-10-09 | 2009-03-12 | Novel Science International Gmbh | Organische Verbindungen mit biologischer Wirkung als Thrombinhemmer und ihre Verwendung |
| DE10301255A1 (de) | 2003-01-15 | 2004-07-29 | Cpi Creative Pharma International Gmbh | Organische Verbindungen mit biologischer Wirkung als Thrombinhemmer und ihre Verwendung |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3342139A1 (de) * | 1983-11-22 | 1985-05-30 | Ciba-Geigy Ag, Basel | Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel |
| DE3438296A1 (de) * | 1984-04-18 | 1985-11-07 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel |
-
1983
- 1983-11-22 DE DE19833342139 patent/DE3342139A1/de not_active Withdrawn
-
1984
- 1984-11-20 CA CA000468216A patent/CA1239606A/en not_active Expired
- 1984-11-20 EP EP84114038A patent/EP0142860B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-20 DE DE1997175096 patent/DE19775096I2/de active Active
- 1984-11-20 DD DD84269667A patent/DD232498A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-11-20 DE DE8484114038T patent/DE3483085D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-20 AT AT84114038T patent/ATE56021T1/de active
- 1984-11-20 IL IL73570A patent/IL73570A/xx not_active IP Right Cessation
- 1984-11-21 IE IE2979/84A patent/IE57885B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-11-21 JP JP59244681A patent/JP2551551B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-21 DK DK552684A patent/DK165696C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-11-21 US US06/673,952 patent/US4654302A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-11-21 NZ NZ210275A patent/NZ210275A/xx unknown
- 1984-11-21 AU AU35759/84A patent/AU578050B2/en not_active Expired
- 1984-11-21 ZA ZA849068A patent/ZA849068B/xx unknown
-
1986
- 1986-11-13 US US06/929,710 patent/US4745177A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-20 PH PH31466A patent/PH23831A/en unknown
-
1988
- 1988-01-19 US US07/145,023 patent/US4801576A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-06-25 MX MX9203370A patent/MX9203370A/es unknown
-
1993
- 1993-11-04 HK HK1212/93A patent/HK121293A/xx not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-10-20 CY CY173795A patent/CY1737A/xx unknown
-
1997
- 1997-12-19 NL NL970045C patent/NL970045I2/nl unknown
- 1997-12-31 LU LU90192C patent/LU90192I2/fr unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK552684D0 (da) | 1984-11-21 |
| DK552684A (da) | 1985-05-23 |
| NL970045I2 (nl) | 1998-08-03 |
| DK165696C (da) | 1993-05-24 |
| DD232498A5 (de) | 1986-01-29 |
| CY1737A (en) | 1995-10-20 |
| EP0142860A2 (de) | 1985-05-29 |
| HK121293A (en) | 1993-11-12 |
| DE3342139A1 (de) | 1985-05-30 |
| NL970045I1 (nl) | 1998-03-02 |
| US4801576A (en) | 1989-01-31 |
| PH23831A (en) | 1989-11-23 |
| IE842979L (en) | 1985-05-22 |
| JP2551551B2 (ja) | 1996-11-06 |
| IE57885B1 (en) | 1993-05-05 |
| DE3483085D1 (de) | 1990-10-04 |
| MX9203370A (es) | 1992-09-01 |
| US4654302A (en) | 1987-03-31 |
| US4745177A (en) | 1988-05-17 |
| DE19775096I2 (de) | 2002-07-04 |
| CA1239606A (en) | 1988-07-26 |
| AU3575984A (en) | 1985-05-30 |
| AU578050B2 (en) | 1988-10-13 |
| JPS60136597A (ja) | 1985-07-20 |
| ZA849068B (en) | 1985-07-31 |
| LU90192I2 (fr) | 1998-03-02 |
| IL73570A0 (en) | 1985-02-28 |
| IL73570A (en) | 1988-05-31 |
| EP0142860A3 (en) | 1987-03-11 |
| NZ210275A (en) | 1988-08-30 |
| EP0142860B1 (de) | 1990-08-29 |
| ATE56021T1 (de) | 1990-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK165696B (da) | Desulfatohirudiner og deres farmaceutisk acceptable salte, deres fremstilling, farmaceutisk praeparat indeholdende disse forbindelser og anvendelse af forbindelserne til fremstilling af farmaceutisk middel og som analytisk reagens | |
| CA1299126C (en) | Hirudin-pa and its derivatives | |
| DK173509B1 (da) | Polypeptider med blodkoaguleringshæmmende virkning, deres fremstilling eller udvinding samt midler med indhold deraf | |
| Markwardt | Past, present and future of hirudin | |
| US5514409A (en) | Methods for coating invasive devices with inhibitors of thrombin | |
| DE69719359T2 (de) | Cyklische peptide, die an den urokinase-type plasminogen aktivator rezeptor binden | |
| DE68920915T2 (de) | Extraktion und Reinigung einer Antigerinnungssubstanz aus den südamerikanischen Blutegeln Haementeria ghilianii. | |
| KR0127754B1 (ko) | 항응고제 | |
| US4636489A (en) | Modified protease inhibitors, process for their preparation, and pharmaceutical compositions prepared therefrom | |
| EP0372670A2 (en) | Hirudin peptides for inhibiting platelet aggregation | |
| Ohno et al. | Purification and characterization of active component and active fragment of colicin E3 | |
| RU2050160C1 (ru) | Полипептид, полученный из ткани или секрета пиявок hirudinaria manillensis, специфически ингибирующий тромбин | |
| Huisman et al. | Amino-acid composition of four different kinds of human haemoglobin | |
| US5817309A (en) | Antidote for hirudin and synthetic thrombin inhibitors and method of use | |
| CZ287794B6 (en) | Purified polypeptide, process of its preparation and use, extract and pharmaceutical preparation in which it is comprised | |
| Markwardt | The comeback of hirudin as an antithrombotic agent | |
| EP0404055B1 (en) | Ghilanten: antimetastatic principle from the south american leech, haementeria ghilianii | |
| EP0677107B1 (de) | Thrombininhibitor aus speichel von protostomiern | |
| DK175408B1 (da) | Isohirudiner, fremgangsmåde til deres fremstilling, pharmaceutisk middel samt fremgangsmåde til dets fremstilling | |
| DE4136087A1 (de) | Neues thrombininhibitorisches protein aus zecken | |
| EP0641858A1 (en) | Serum calcium depressing factor | |
| KR20020081601A (ko) | Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ 억제 단백질 및 그의 제조방법 | |
| CS217193B1 (cs) | Způsob výroby antilipemicky účinného přípravku |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| CTFF | Application for supplementary protection certificate (spc) filed |
Free format text: CA 1997 00045, 971120 |
|
| PUP | Patent expired |