NO852065L - Mikroorganisme og cellekultur - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører mikroorganisme og cellekultur.

Foreliggende oppfinnelse skriver seg delvis fra oppdagelsen

av DNA-sekvensen og den derav avledede aminosyresekvensen for menneskeplasminogenaktivator. Denne oppdagelse muliggjorde fremstillingen av menneskeplasminogenaktivator via anvendelsen av rekombinant DNA-teknologi, som igjen muliggjorde fremstillingen av materiale med tilfredsstillende kvalitet og i tilfredsstillende mengde"til å starte opp og utføre dyreforsøk og klinisk utprøving som er forutsetninger for godkjenning av markedsføring,uhindret av de begrensningene som nødvendigvis er knyttet til de isolasjonsmetodene som hittil har vært anvendt, og som omfatter fremstilling og ekstraksjon fra eksisterende cellekultur. Denne oppfinnelse er i alle henseende rettet mot disse tilknyttede oppfinnel-sesgjenstander.

Publikasjonene og det øvrige materiale som her er brukt for

å belyse bakgrunnen for oppfinnelsen, og i bestemte tilfeller for å gi ytterligere detaljer vedrørende dens utøvelse, er her innlemmet som henvisninger og for bekvemmelighets skyld, henvist til i nummerorden i den følgende tekst og ordnet tilsvarende i den tilføyede litteraturliste.

A. Aktivator for menneskevev- plasminogen.

Det fibrinolytiske systemet er i en dynamisk likevekt med koagulasjonssystemet og opprettholder derved et uskadd, åpent blodomløp. Koagulasjonssystemet avsetter fibrin som en grunn-masse som tjener til å gjenopprette en hemostatisk tilstand. Det fibrinolytiske systemet fjerner- fibrinnettverket etter at den hemostatiske tilstanden er oppnådd. Den fibrinolytiske prosess fås istand av det proteolytiske enzym plasmin som frembringes fra en plasmaproteinforløper,-plasminogen. Pias- 'minogen omdannes til plasmin gjennom aktivering med en aktivator.

For tiden er to aktivatorer kommersielt tilgjengelige, streptokinase og urokinase. Begge er ment for behandlingen av akutte blodåresykdommer slik som myocardialinfarkt, slag, blodpropp i lungene, trombose i dypereliggende vener, tiltetning i perifere arterier og andre venetromboser. Tilsammen er disse sykdommene ansvarlige for store helsefarer og risikoer.

Det underliggende etiologiske grunnlag for disse sykdommene skriver seg fra enten en delvis eller i alvorlige tilfeller total tiltetning av et blodkar med en blodlevring - trombe eller trombeblodpropp. Vanlig brukt antikoagulasjonsbehand-ling - slik som med heparin og coumarin - gjør ingenting for å fremme oppløsning av tromber eller trombeblodpropper. De trombolytiske midlene, som det tidligere er referert til, streptokinase og urokinase, har vært gjenstand for"praktisk og effektiv bruk. Begge har imidlertid alvorlige begrensnin-ger. Ingen av dem har en høy affinitet for fibrin, følgelig aktiverer begge sirkulerende og fibrin-bundet plasminogen forholdsvis ukritisk. Plasminet som dannes i sirkulerende blod, nøytraliseres heller hurtig og er tapt for nyttig trombolyse. Restplasmin vil bryte ned flere levringsfaktorproteiner, f.eks. fibrinogen, faktor V og faktor VIII, og derved forårsake en risiko for blødninger. Dertil er streptokinase svært antigent og pasienter med høye antistoffverdier reagerer lite effektivt på behandling og kan ikke holdes på en kontinuerlig behandling.- Urokinaseterapien er kostbar på grunn av at den medfører isolering fra menneskeurin eller vevkultur, og den er derfor ikke vanlig akseptert innen klinisk praksis. Urokinase har vært gjenstand for adskillige undersøkelser, se f.eks. litteraturhenvisningene 1-6.

Såkalte plasminogenaktivatorer er blitt isolert fra forskjellige menneskevev, f.eks. vev fra livmoren, blod, serum -

se generelt litteraturhenvisningene 7-11 og-fra cellekultur

, (litteraturhenv. 94). Det er også blitt beskrevet preparater av slike - se litt.henv. 12, 13. Se også litt.henv. 14-18. Plasminogenaktivatorene avledet fra disse kilder er blitt klassifisert i to hovedgrupper: urokinase-type plasminogenaktivatorer (u-PA) og vevstype plasminogenaktivatorer (t-PA) basert på forskjeller i deres immunologiske egenskaper.

(Forkortelsen t-PA og u-PA er de som ble foreslått ved det XXVIII møtet i the International Committee on Thrombosis and Hemostasis, Bergamo, Italia, 27.juli 1982).

Nylig er det blitt identifisert en melanoma-cellelinje fra menneske som utskiller t-PA. Karakterisering av denne melanoma-plasminogen-aktivatoren har vist åt den ikke lar seg skille hverken immunologisk eller med hensyn til aminosyre-sammensetning fra plasminogenaktivatoren isolert fra normalt menneskevev (litt.henv. 19,88).

Produktet ble isolert i forholdsvis ren form,karakterisert

og funnet å.være et høyaktivt fibrinolytisk middel (20).

Flere undersøkelser (f.eks. litt.henv. 95 til 98) som be-nyttet t-PA renset fra melanoma cellelinjen, har påvist dens høyere affinitet for fibrin, sammenlignet med plasminogenaktivatorer av urokinasetype. Nøyere undersøkelse av menneske-t-PA som et potensielt trombolytisk middel har imidlertid blitt hindret av dens ekstremt lave konsentrasjon i blod, vevekstrakter, karperfusater og cellekulturer.

Man følte at anvendelsen av rekombinant DNA og beslektede teknikker ville være en svært effektiv måte å tilveiebringe de nødvendige store mengder med plasminogenaktivator av menneskevev-type med høy kvalitet (tidligere referert til som menneskeplasminogenaktivator) , i det vesentlige fri for annet menneskeprotein. Slike materialer ville sannsynligvis opp-vise bioaktivitet som gir adgang til deres anvendelse klinisk i behandlingen av forskjellige tilstander og sykdommer i blodkarsystemet.

^Tilfredsstillende mengder med menneske t-PA fremstilles ved hjelp av cellekulturer, påfølgende rensinger under anvendelse av en sekundær kodende sekvens tjener imidlertid til å fremme produksjonsnivåene ytterligere. Den sekundære kodende sekvens omfatter dihydrofolatreduktase (DHFR) som påvirkes av en ytre kontrollparameter, slik som metotrexat, og tillater derved kontroll av ekspresjon ved hjelp av kontroll av metotrexat (MTX)-konsentrasjonen.

B. Rekombinant DNA- teknologi.

Rekombinant DNA-teknologi har utviklet seg til et visst raffinement. Molekylærbiologer er istand til å rekombinere forskjellige DNA-sekvenser med en viss ferdighet og derved skape nye DNA-enheter som er istand til å produsere rikelige mengder med eksogent proteinprodukt i transformerte mikrober og cellekulturer. Man kjenner de generelle hjelpemidler og fremgangsmåtene for sammenbinding in vitro av forskjellige fragmenter av DNA med jevne eller ujevne ender, som gir sterke ekspresjonshjelpemidler som kan brukes til å transformere bestemte organismer, og således styre organismenes fullgode syntese av ønsket eksogent produkt. På en indivi-duell produktbasis er imidlertid veien forblitt noe kronglete og vitenskapen har ikke nådd frem til et stadium, hvor regel-messige forutsigelser av vellykkede resultater kan gjøres.

De som spår vellykkede resultater uten det bærende eksperimen-telle grunnlag, gjør dette virkelig med betydelig risiko for at det ikke virker.

DNA-rekombinering av de vesentlige elementene, dvs. et opp-havssted for replikering, ett eller flere seleksjonskarakte-ristika for fenotype, en ekspresjonspromoter, heterologt gen-innskudd og resten av vektoren, utføres vanligvis utenfor vertcellen. Det resulterende rekombinante, reproduserbare ekspresjonshjelpemidlet, eller plasmidet, innføres i celler ved transformasjon og store mengder av det rekombinante hjelpe-midlet erholdes ved å dyrke transformanten. Der hvor genet er korrekt innført med hensyn til deler som- styrer transkrip- ;1

/Sjonen og translasjonen av det innkodede DNA-budskapet, kan det resulterende ekspresjonshjelpemiddel virkelig brukes til å fremstille polypeptidsekvensen som det. innførte genet koder for, en prosess som kalles for ekspresjon. Det oppnådde produktet kan erholdes om nødvendig ved å lyse vertcellen i mikrobielle systemer og utvinne produktet fra andre proteiner ved passende rensing.

I praksis kan bruken av rekombinant DNA-teknologi uttrykke helt heterologe polypeptider - såkalt direkteekspresjon - eller eventuelt uttrykke et heterologt polypeptid bundet til en del av aminosyresekvensen til et homologt' polypeptid.

I det sistnevnte tilfelle er det påtenkte bioaktive produkt noen ganger gjort bioinaktivt i det sammensmeltede, homologe/heterologe polypeptid, inntil det spaltes i et ekstracellulært miljø. Se litt.henv. 21 og 22.

På samme måte er teknikken med celle- eller vevkulturer for

å undersøke genetikk og cellefysiologi godt etablert. Det foreligger hjelpemidler og fremgangsmåter for å opprettholde permanente cellelinjer, fremstilt ved suksessive serieover-føringer fra isolater av normale celler. Til forskningsbruk oppbevares slike cellelinjer på en fast bærer i flytende medium eller ved dyrking i suspensjon som inneholder nødven-dige næringsstoffer. Oppskaleringer for fremstilling i store mengder synes bare å by på mekaniske problemer. For ytterligere bakgrunnsmateriale vises det til litt.henv. 23 og 24.

På samme måte er proteinbiokjemi et nyttig, virkelig nødven-dig tilbehør i bioteknologi. Celler som produserer detønskede protein, produserer også hundrevis av andre proteiner, endogene produkter fra cellens stoffskifte. Disse forurens-ende proteiner, såvel som andre forbindelser, ville dersom de ikke fjernes fra det ønskede protein, vise seg å være giftige dersom de administreres til et dyr eller menneske under den terapeutiske behandling med det ønskede proteinet. Følgelig kommer teknikken fra proteinbiokjemien til nytte, idet den gir anledning til utforming av separasjonsfremgangsmåter egnet /for det bestemte, aktuelle system, og gir et homogent produkt som er sikkert for den påtenkte bruk. Proteinbiokjemi be-krefter også identiteten til det ønskede, produktet, idet den karakteriserer det og sikrer at cellen har produsert det tro-fast uten endringer eller mutasjoner. Denne vitenskapsgren er også involvert i utformingen av biologiske analyser, sta-bilitetsundersøkelser og andre fremgangsmåter som er nødven-dige å anvende før vellykkede, kliniske undersøkelser og markedsføring kan finne sted.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den oppdagelse at rekombinant DNA-teknologi med hell kan brukes, til å fremstille "' aktivator for plasminogen fra menneskevev . (t-PA), fortrinns-vis i direkte virkende form, og i mengder som er tilstrekkelig til å starte opp og utføre dyreforsøk og klinisk utprøving som er forutsetninger for en godkjenning av markedsføring. Menneske t-PA-produktet er i alle sine former egnet for bruk ved den profylaktiske eller terapeutiske behandling av mennesker for forskjellige tilstander eller sykdommer i blodkarsystemet. Følgelig er den foreliggende oppfinnelse i et viktig aspekt rettet mot fremgangsmåter for behandling av uregelmessigheter i blodkarsystemet hos mennesker ved å bruke t-PA og mot passende farmasøytiske preparater derav.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre i det vesentlige

ren aktivator for menneskevevplasminogen. Produktet fremstilt ved genetisk oppbygde mikroorganismer eller cellekultur-systemer gir en mulighet til å fremstille aktivator for menneskevevplasminogen på en mye mer effektiv måte enn det har vært mulig, og det setter en istand til kommersiell benyttelse som hittil har vært begrenset. Dertil kan den her beskrevne aktivator for menneskevevplasminogen - avhengig av vertcellen - omfatte tilknyttet glykosilering i en større eller mindre utstrekning sammenlignet med naturlig materiale. I alle tilfeller vil t-PA være fritt for forurensningene som vanligvis er forbundet med den i dens ikke-rekombinante cellulære miljø.

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot' replikerbare DNA-

• 1 ,ekspres jonsh jelpemidler som koder for menneskevevplasminogenaktivator i uttrykkbar form, mot mikroorganismestammer eller cellekulturer som er transformert med disse, og mot mikrobe-eller cellekulturer av slike transformerte stammer eller kulturer som er istand til å produsere aktivator for menneskevev- . plasminogen. I ytterligere aspekter er foreliggende oppfinnelse rettet mot forskjellige fremgangsmåter som er nyttige for fremstilling av gensekvensene, DNA-ekspresjonshjelpemidlene, mikro-organismes tammene og cellekulturene, og mot bestemte utførelses-former derav. Videre er oppfinnelsen rettet mot fremstillingen av dyrkingskulturer av mikroorganismene og cellekulturene. Fig. 1 viser 10% SDS PAGE av 35S-merkede proteiner som er ut-fellbare med anti t-PA IgG ekstrahert fra melanoma-celler med og uten proteaseinhibitor. Fig. 2 viser elektroforese av de immunoutfelte translasjonsprodukter av mRNA-fraksjoner avledet fra melanomaceller. Fig. 3 viser hybridiseringssporet for 96 kolonier transformert med cDNA under anvendelse av den samlede mengde<32>P-merket 14-mer fremstilt som prøve basert på en 5 amino-syre-sekvens av menneske-t-PA. Fig. 4 er et restriksjonsendonukleasekart for hele menneske-t-PA cDNA. Fig. 5a, 5b og 5c viser nukleotidsekvensen og avledet aminosyresekvens for hele menneske-t-PA cDNA. Fig. 6 er en skjematisk fremstilling av konstrueringen av ekspresjonsplasmidet pARIPA<0>. Fig. 7 viser resultatene av. en analyse av fibrinolytisk aktivitet i celler transformert med pARIPA<0.>utført på en fibriri-plate. Fig. 8 er en HPLC-kurve for peptider fra oppspalting av

,menneske-t-PA med trypsin.

Fig. 9 viser konstrueringen av et plasmid som koder for direkte ekspresjon av fullstendig menneske-t-PA i E. coli. Fig. 10 viser resultatene av en analyse av fibrinolytisk aktivitet i menneske-t-PA fremstilt ved transformert E. coli som er transformert med pt-PAtrpl2, utført på en fibrinplate. Fig. 11 viser konstrueringen av DHFR (mutant eller vill type)/ t-PA som koder for plasmider egnet for transformering i celler i kulturer av pattedyrvev. -.<" Fig. 12 er et skjematisk diagram av aktivator for menneskevevplasminogen fremstilt ved fremgangsmåten eksemplifisert i E. 1 nedenunder.

A. Definisjoner.

Slik de her er brukt, betyr uttrykkene "aktivator for menneskevevplasminogen" eller "menneske-t-PA" eller "t-PA" aktivator for utvendig (vevtype) menneskeplasminogen fremstilt ved hjelp av mikrobielle systemer eller cellekultur-systemer i bioaktive former.omfattende en proteasedel og svarende til de aktivatorer for vevplasminogen som ellers er naturlige for menneskevev. Aktivatorproteinet for menneskevevplasminogen som her er fremstilt, er blitt definert ved hjelp av den bestemte sekvensrekkefølgen for DNA-gener og derav avledet aminosyrer. Det vil forstås at naturlige alleliske variasjoner forekommer og oppstår fra individ til individ. Disse variasjoner kan demonstreres ved hjelp av (en) aminosyre-forskjell(er) i den selvstendige sekvensen eller ved fjernelser, utbyttinger, innføringer, ombyttinger eller tilføyelser av (en) aminosyre(er) i sekvensen. Dertil vil lokaliseringen og graden av glykosilering avhenge av det gjenskapende ved de cellulære omgivelsene til verten.

Ved bruken av rekombinant DNA-teknologi foreligger det et

\

1

/potensiale for fremstillingen av forskjellige aktivator-derivater for menneskevevplasminogen, som er modifisert på forskjellige måter ved en eller flere aminosyreutbyttinger,

-fjerninger, -tilføyelser eller -omplasseringer, f.eks. ved hjelp av stedrettet mutagenese av det grunnleggende DNA. Fremstillingen av derivater som beholdt det vesentlige "kringle"-område og serinprotease-område som er generelt karakteristisk for den her beskrevne aktivator for menneskevevplasminogen, men som ellers er modifisert som beskrevet ovenfor, ville her være omfattet. Alle slike allele variasjoner og modifikasjoner som oppstår i derivater av aktivator for menneskevevplasminogen, er omfattet innenfor omfanget av oppfinnelsen, likesåvel som andre beslektede aktivatorer for utvendig (vevtype) menneskeplasminogen som ligner fysisk og

biologisk,5a lenge som den karakteristiske aktiviteten til aktivatoren for menneskevevplasminogen forblir upåvirket som sådan.

Aktivator for menneskevevplasminogen fremstilles 1) med metionin som sin første aminosyre (tilstede ved hjelp av codon-innskuddet for ATG-startsignal foran det strukturelle genet) eller 2) med sin normale første aminosyre der hvor metioninet spaltes~intra- eller ekstracellulært, eller 3) sammen med enten sitt signalpolypeptid eller et konju-gert protein som er forskjellig fra det vanlige signalpolypeptid, idet signalpolypeptidet eller konjugatet er spesifikt spaltbart i et intra- eller ekstracellulært miljø (se litt. henv. 21) eller 4) ved direkte ekspresjon i fullstendig form uten nødvendigheten av å spalte av noe fremmed, overflødig polypeptid. Den sistnevnte er særlig viktig der hvor en gitt vert ikke, eller ikke effektivt, kan fjerne et signalpeptid når ekspresjonshjelpemidlet er utformet for å uttrykke aktivatoren for vevplasminogen sammen med dens signalpeptid.

I alle tilfeller utvinnes og renses det således fremstilte menneske-t-PA i sine forskjellige former til et nivå som passer for dens bruk ved behandlingen av forskjellige tilstander eller sykdommer i blodåresystemet. .Videre har t-PA former som omfatter både proteinet med en kjede (1-kjede) og 2-kjede-proteinet. Det sistnevnte avledes proteolytisk fra 1-kjede-forbindelsen. Det antas at 2-kjede-proteinet er forbundet med fremstilt fibrin og at den proteolytiske omdannelse fra 1- til 2-kjedematerialet oppstår på stedet for omdannelsen av plasminogen til plasmin. Foreliggende oppfinnelse gir mulighet for administrering av 1-kjede-proteinet for in vivo omdannelse, slik som nettopp beskrevet, eller for administrering av 2-kjede-protein, som også er påvist å være aktiv. _ 2-kjede-proteinet kan fremstilles ved in vitro proteolytisk omdannelse etter at 1-kjedematerialet er fremstilt. Et såkalt "kringle"-område befinner-seg foran serin-protease-delen og antas å spille en. viktig rolle ved binding av den her fremstilte aktivator for vevplasminogen til en fibrinmasse; derav den iakttatte spesifikke aktivitet til den foreliggende aktivatoren for vevplasminogen mot følbare, vedvarende tromber. Aktivatoren for vevplasminogen fremstilles med den enzymatisk aktive delen som svarer til det naturlige materialet og uttrykket aktivator for menneskevevplasminogen angir produkter som omfatter en slik del alene eller sammen med ytterligere aminosyresekvenser opp til molekylet i full lengde.

For å oppsummere den foreliggende oppfinnelse har således menneske-t-PA en funksjonell definisjon: den er istand til å katalysere omdannelsen av plasminogen til plasmin, bindes til fibrin og klassifiseres som en t-PA basert på immunologiske egenskaper slik det er angitt ovenfor.

"I det vesentlige ren form" ble brukt for å beskrive tilstanden til menneske-t-PA fremstilt ved oppfinnelsen fri for protein eller annet materiale som vanligvis er forbundet med menneske-t-PA når den fremstilles ved hjelp av'ikke-rekombinante celler, dvs. i sine "naturlige" omgivelser.

"DHFR-protein" henviser til et protein som er istand til å utøve den aktivitet som er forbundet med dihydrofolat-reduk-tase (DHFR) og som derfor kreves fremstilt av celler som ar

1 .istand til å overleve på medium som mangler hypoxanthin, glycin og thymidin (-HGT-medium). • Vanligvis er celler uten DHFR-protein ute av stand til å vokse på dette medium, celler som inneholder DHFR-protein lykkes med å gjøre det.

"Celler som er følsomme for MTX" henviser til celler som -

er ute av stand til å vokse på medier som inneholder DHFR-inhibitoren methotrexate (MTX). Følgelig er "celler som er følsomme for MTX" celler som - med mindre de endres genetisk eller suppleres på annen måte.- vil mislykkes i å vokse under omgivelses- og mediumbetingelser egnet for celletypen, når MTX-konsentras jonen er 0,2 ug/ml eller mer ../■"'Noen celler, slik som bakterier, oppviser ikke MTX-følsomhet på grunn av at de ikke slipper MTX innenfor celleveggen, selvom de inneholder DHFR som ellers ville være følsomt for dette lege-midlet. Vanligvis vil celler som inneholder - som sitt DHFR-protein - villtype DHFR, være følsomme for methotrexate, dersom de med hensyn til MTX er permeable eller istand til opptak.

"Villtype DHFR" henviser til dihydrofolatreduktase som vanligvis finnes i den aktuelle bestemte organisme. Villtype DHFR er vanligvis følsom in vitro overfor lave konsentrasjoner av methotrexate.

"DHFR-protein med lav bindingsaffinitet for MTX" har en funksjonell definisjon. Dette er et DHFR-protein som - når det genereres innenfor cellene, vil tillate veksten av MTX-føl-somme celler i et medium som inneholder 0,2 ug/ml eller mer MTX. Det er anerkjent at en slik funksjonell definisjon av-henger av lettheten, hvormed organismen produserer "DHFR-protein med lav bindingsaffinitet for MTX", samt av proteinet som sådant. Slik den er brukt i sammenheng med foreliggende oppfinnelse, burde imidlertid en slik balanse mellom disse to mekanismer ikke medføre problemer. Oppfinnelsen virker ved å overføre evnen til å overleve disse nivåer av MTX og det er ikke avgjørende hvorvidt evnen til å gjøre dette led-sages av forøket ekspresjon i tillegg til de naturlige ege:n-

..skaper hos det fremstilte DHFR. Et høvelig DHFR-protein

som passer til denne definisjon er åpenbart i US-patent-søknad nr. 459.151, inngitt 19.januar 1983, som her innlemmes ved henvisning.

"Ekspresjonsvektor" omfatter vektorer som er istand til å uttrykke DNA-sekvenser inneholdt deri, hvor slike sekvenser på en virksom måte er knyttet til andre sekvenser som er istand til å bevirke deres ekspresjon. Det er underforstått - selvom det ikke alltid er uttrykkelig fastslått - at disse ekspresjonsvektorene må være replikerbare. i vertorganismene, enten som episomer eller som en integrert del av det kromosomale DNA. Det er klart at en mangel på replikerbarhet ville gjøre dem ikke virksomme på en effektiv måte. Alt i alt er "ekspresjonsvektor" gitt en funksjonell definisjon, og enhver DNA-sekvens som er istand til å bevirke ekspresjon av en bestemt DNA-kode innordnet deri, er omfattet av dette uttrykket slik det er anvendt for den bestemte sekvensen. Vanligvis er ekspresjonsvektorer med anvendbarhet innen rekombinante DNA-teknikker ofte i form av "plasmider" som henviser til ringformede, dobbeltkjedede DNA-løkker som i sin vektorform ikke er bundet til kromosomet. I den foreliggende beskrivelse er "plasmid" og "vektor" brukt av-vekslende ettersom plasmidet er den mest vanlig brukte form for vektor. Oppfinnelsen er imidlertid ment å omfatte slike andre former for ekspresjonsvektorer som tjener ekvivalente funksjoner og som siden blir kjent innen teknikken.

"Rekombinante vertceller" henviser til celler som er blitt transformert med vektorer konstruert ved å bruke rekombinante DNA-teknikker. Slik det her er definert, produseres t-PA

i slike mengder som oppnås ved hjelp av denne transformasjon, heller enn i slike mindre mengder, eller mer vanlig i slike mindre enn påvisbare mengder som kan bli produsert av den ikke-transformerte verten. t-PA fremstilt med slike celler kan henvises til som "rekombinant t-PA".

'B. Vertcellekulturer og - vektorer.

Vektorene og fremgangsmåtene som her er åpenbaret, er egnet

for bruk i vertceller over et vidt område av prokaryotiske og eukaryotiske organismer.

Vanligvis er selvfølgelig prokartyoter foretrukket til kloning

av DNA-sekvenser ved konstruering av vektorene som er nyttige for oppfinnelsen. F.eks. er E. coli K12 stamme 294 (ATCC nr. 31446) særlig nyttig. Andre mikrobielle stammer som kan brukes, omfatter E. coli-stammer, slik som E. coli B. og E. coli X1776 (ATTC nr. 31537). Disse eksempler er selvfølge-lig ment å være illustrerende og ikke begrensende.

Prokaryoter kan også brukes til ekspresjon. De ovenfor nevnte stammene, samt E. coli W2110 (F~, X~, prototrof, ATTC nr.27325), basiller slik som Bacillus subtilus og andre enterobakteriacea slik som Salmonella typhimurium"eller Serratia marcesans, og forskjellige pseudomonas arter kan brukes.

Vanligvis brukes plasmidvektorer som inneholder replicon- og kontroll-sekvenser som er avledet fra arter forenelige med vertcellen, i forbindelse med disse vertene. Vektoren bærer vanligvis et sted for replikering samt markørsekvenser som er istand til å gi fenotypseleksjon i transformerte celler. F.eks. transformeres E. coli vanligvis ved å bruke pBR 322, et plasmid avledet fra én E. coli-art (Bolivar et al., Gene 2: 95 (1977)). pBR 322 inneholder gener for ampicillin-og tetra-cyclin-resistens og tilveiebringer derved lettvinte midler for å identifisere transformerte celler. pBR 322-plasmidet eller et annet mikrobielt plasmid må også inneholde, eller endres til å inneholde, promotere som kan brukes av den mikrobielle organismen for å uttrykke dens egne proteiner. De promotere som er mest vanlig brukt ved rekombinant DNA-konstruksjon om-

fatter promotersystemene for 3-lactamase (penicillinase) og lactose (Chang et al, Nature 275: 615 (1978) ,Itakura, et al, Science, 198: 1056 (1977), Goeddel, et al, Nature 281: 544 (1979)) og promotersystem for tryptofan (trp) (Goeddel, et al, Nucleic

Acids Res., 8: 4057 (1980), EPO Appl.Publ.No. 0036776). Mens dette er de mest vanlig brukte, er det blitt oppdaget og anvendt andre mikrobielle promotere og detaljer vedrørende deres nukleotidfrekvenser er blitt publisert, hvilket gjør det mulig for en erfaren fagmann å binde dem sammen med plasmidvektorer på en funksjonell måte (Siebenlist et al, Cell 20: 269 (1980)).

I' tillegg til prokaryoter, kan det også anvendes eukaryotiske mikrober, slik som gjærkulturer. Saccharomyces cerevisiae eller vanlig bakergjær er den mest vanlig brukte blant eukaryotiske mikroorganismer, selvom en rekke andre stammer er allment tilgjengelige. For ekspresjon i Saccharomyces, brukes^f.eks. vanligvis plasmidet YRp7 (Stinchcomb et al, Nature, 282: 39 (1979) Kingsman et al, Gene,7:141 (1979), Tschemper et al, Gene, 10: 157 (1980). Dette plasmidet inneholder allerede trpl-genet som gir en seleksjonsmarkør for en mutantstamme av gjær som mangler evnen til å vokse i tryptofan, f.eks. ATCC nr. 44076 eller PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: .12 (1977)). Tilstede-værelsen av trpl-skaden som et kjennetegn for genomet i"gjær-vertcellen, gir derved et effektivt miljø for å påvise transformasjon ved dyrking i fravær av tryptofan.

Passende promotersekvenser i gjærvektorer omfatter promoteren for 3-fosfoglycerat-kinase (Hitzeman et al., J.Biol.Chem.,

255: 2073 (1980) eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al., J.Adv.Enzyme Reg., 7: 149 (1968), Holland et al., Biochemistry, 17: 4900 (1978), slik som enolase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, hexokinase, pyruvat-dekarboksylase, fosfo-fruktokinase, glukose-6-fosfat-isomerase, 3-fosfoglycerat-mutase, pyruvatkinase, triosefosfat-isomerase, fosfoglukose-isomerase og glukokinase. Ved konstruering av ekspresjons-plasmider er avslutningssekvenser forbundet med disse gener også bundet i uttrykket vektor 3' av den ønskede sekvens til så skaffe til veie polyadenylasjon av mRNA og avslutning.

Andre promotere som har ytterligere fordeler med transkrip-

sjon kontrollert av vekstbetingelser, er promoterområdene for alkohol-dehydrogenase 2, isocytochrome C, syrefosfatase,

nedbrytende enzymer forbundet med nitrogenmetabolisme og den ovenfor nevnte glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase,

samt enzymer ansvarlige for maltose og galactose-utnyttelse (Holland, ibid.). Enhver plasmidvektor som inneholder gjær-forenelig promoter, opphav for replikering og terminerings-sekvenser, er egnet.

I tillegg til mikroorganismer, kan det også brukes kulturer

av celler avledet fra flercellede organismer som verter.

I prinsippet er enhver slik cellekultur virksom, enten den stammer fra virveldyr eller virvelløse dyr. Det har imidlertid vært størst interesse for celler fra virveldyr, og for-mering av virveldyrceller i kultur (vevkultur) er blitt en rutinefremgangsmåte i de senere år (Tissue Culture, Academic Press, Kurse and Patterson, editors (1973)). Eksempler på slike vertcellelinjer er VERO- og HeLa-celler, eggstokk-cellelinjer fra kinesiske hamstere (CHO) og Wl38y BHK-, C0S-7-og MDCK-cellelinjer. Ekspresjonsvektorer for slike celler omfatter vanligvis (om nødvendig) et opphav for replikering,

en promoter beliggende foran genet som skal uttrykkes, sammen med eventuelle nødvendige ribosombindende steder, steder for sammenknytning av RNA, sted for polyadenylering og termine-ringssekvenser for-transkripsjon.

For bruk i pattedyrceller tilveiebringes ofte kontrollfunk-sjonene for ekspresjonsvektorene ved hjelp av viralt materiale. F.eks. er vanlig brukte promotere avledet fra polyoma, Adenovirus 2 og mest vanlig fra Simian Virus 40 (SV40). De tidlige og sene promotere til SV4 0-virus er særlig nyttige fordi begge erholdes lett fra viruset som et fragment som også inneholder SV4O-virusopphavet for replikering (Fiers et al., Nature, 273: 113(1978)), som her innlemmes som henvisning. Det kan også brukes mindre eller større SV40-fragmenter under forutsetning av at det deri er inkludert den omtrent 250 bp store sekvensen som strekker seg fra Hind III-stedet mot Bgl I-stedet lokalisert i det virale opphavet for replikering. Videre er det også mulig og ofte ønskelig å utnytte promoter-eller kontrollsekvenser som vanligvis er forbundet med \3en ønskede gensekvensen, forutsatt at slike kontrollsekvenser er forenelige med vertcellesystemene.

Et opphav for replikering kan tilveiebringes enten ved å konstruere vektoren slik at den omfatter et eksogent opphav , slik som kan avledes fra SV40 eller andre virale (f.eks. polyoma, adeno, VSV, BPV etc.) kilder, eller kan tilveiebringes ved hjelp av den kromosomale replikeringsmekanisme til vertcellen. Dersom vektoren integreres i vertcellekromosomet, er det sistnevnte ofte tilfredsstillende.

Ved utvelgelse av en foretrukket vertcelle for transfeksjon ved hjelp av vektorene ifølge oppfinnelsen som omfatter DNA-sekvenser som koder for både t-PA og DHFR-protein, er det passende å velge verten i henhold til typen DHFR-protein som anvendes. Dersom det anvendes villtype DHFR, er det foretrukket å velge en vertcelle som mangler DHFR, og således gi anledning til bruken av den DHF"R-kodede sekvensen som en markør for vellykket transfeksjon i selektivt- medium som mangler hypoxantin, glycin og tymidin. En passende vertcelle i.dette tilfelle er eggstokkcellelinje fra kinesisk hamster (CHO) som mangler DHFR-aktivitet, fremstilt og for-mert slik som beskrevet av Urlaub og Chasin, Proe.Nati.Acad. Sei. (USA) 77: 4216 (1980)," innlemmet her ved henvisning.

Dersom DHFR-protein med lav bindingsaf f initet til' MTX på den annen side brukes som kontrollsekvens, er det ikke nødvendig å bruke DHFR-resistente celler. Ettersom DHFR-mutanten er resistent mot metotrexat, kan det. anvendes MTX-holdige media som et middel for seleksjon under forutsetning av at vert-cellene selv er methotrexate-følsomme. De fleste eukaryote cellene som er istand til å absorbere MTX, synes å være methotrexate-f ølsomme. En slik nyttig cellelinje er en CHO-linje, CH0-K1 ATCC nr. CCL 61.

Eksempler som er gjengitt nedenunder beskriver bruken av

E. coli under anvendelse av trp promoter-systemet og ved bruk av CHO-celler som vertceller, og ekspresjonsvektorer som om fatter SV4O-opphavet for replikering som en promoter. Det ville imidlertid være godt innenfor en fagmanns ferdighet å bruke analoge teknikker til å konstruere ekspresjonsvektorer for ekspresjon av ønskede proteinfrekvenser i alternative prokaryote eller eukaryote vertcellekulturer.

C. Anvendte fremgangsmåter.

Dersom det brukes celler uten formidable celleveggbarrierer som vertceller, utføres transfeksjon ved hjelp av kalsiumfos-fatutfellingsmetoden beskrevet av Graham og Van der Eb, ' Virology, 52: 546 (1978). Det kan imidlertid også brukes andre fremgangsmåter for å innføre DNA i celler, slik som ved kjerneinjeksjon eller ved protoplastsammensmelting.

Dersom prokaryotceller eller celler som inneholder vesentlige celleveggoppbygninger anvendes, er den foretrukne fremgangsmåte for transfeksjon kalsiumbehandling under anvendelse av kalsiumklorid slik som beskrevet av Cohen, F.N. et al., Proe. Nati.Acad.Sei. (USA) 69: 2110 (1972).

Ved konstruksjon av passende vektorer som inneholder de ønskede kodende og-kontrollsekvenser anvendes standard sammen-bindingsteknikker. Isolerte plasmider eller DNA-fragmenter spaltes, skreddersyes og bindes sammen på nytt i den ønskede form for å danne de krevede plasmidene.

Spalting utføres ved å behandle med restriksjonsenzym (eller enzymer) i passende.buffer. Vanligvis brukes ca. 1 yg plasmid eller DNA-fragmenter med ca. 1 enhet enzym i ca. 20 ul bufferoppløsning. (Passende buffer- og substratmengder for bestemte restriksjonsenzymer er angitt av produsenten). Inkubasjonstider på ca. 1 time ved 37°C er anvendbare. Etter inkubering fjernes protein ved ekstraksjon med fenol og kloroform, og nukleinsyren utvinnes fra den vandig fraksjonen ved utfelling med etanol.

Dersom det kreves butte ender, behandles preparatet i 15 min.

15° med 10 enheter polymerase I (Klenow), ekstraheres med fenol-kloroform og utfelles med etanol.

Størrelseadskillelse av de spaltede fragmentene utføres ved

å bruke 6% polyacrylamidgel beskrevet av Goeddel, D., et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) innlemmet heri ved henvisning .

For sammenbinding behandles omtrent ekvimolare mengder av

de ønskede bestanddelene, passende skreddersydd i endene til å gi korrekt tilpasning, med ca. 10 enheter T4 DNA-ligase pr. 0,5 yg DNA. (Når det benyttes spaltede vektorer som bestand-" deler, kan det være nyttig å forhindre ny sammenbinding av den spaltede vektoren ved forbehandling med bakteriell alka-lisk fosfatase).

Til analyser for å bekrefte korrekte sekvenser i konstruerte plasmider, brukes sammenbindingsblandingene til å transformere E. coli K 12 stamme 294 (ATCC 31446), og vellykkede transformanter utvalgt ved hjelp av ampicillinresistens der dette er passende. Plasmider fra transformantene fremstilles, analyseres ved hjelp av restriksjon og/eller deles opp i sekvenser ved hjelp av fremgangsmåten til Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) eller ved hjelp av fremgangsmåten til Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499(1980).

Forsterking av DHFR-proteinkodende sekvenser bevirkes ved å dyrke vertcellekulturer i nærvær av omtrent 20-500.000 nM konsentrasjoner av methotrexate, en konkurrerende inhibitor for DHFR-aktivitet. Det effektive konsentrasjonsområdet er selvfølgelig svært avhengig av DHFR-genets natur, proteinet og vertens karakteristika. Det er klart at generelt defi-nerte øvre og nedre grenser ikke kan fastslås. Det kunne også brukes passende konsentrasjoner av andre folinsyreanaloger eller andre forbindelser. MTX selv^er imidlertid bekvem,

lett tilgjengelig og effektiv.

D. Generell beskrivelse av foretrukne utføreIsesformer.

Aktivator for menneskevevplasminogen ble erholdt i henhold til det følgende skjema: 1. Menneskemelanomaceller som aktivt produserte aktivator for vevplasminogen, ble dyrket til de fløt sammen. 2. Cellepellets fra slike cellekulturer ble ekstrahert i nærvær av ribonuclease-inhibitorer for å isolere alt cytoplasmisk RNA. 3. En oligo-dT-kolonne isolerte alt messenger RNA (mRNA) i polyadenylert form. Denne mRNA ble størrelsesfraksjonert ved å bruke syre-urea agarosegelelektroforese. 4. Gelfraksjonen som inneholdt spesifikt RNA for vevplasminogenaktivator ble identifisert på følgende måte: RNA fra hver av gelfraksjonene ble oversatt i et reticulocytlysat in vitro system fra kanin, supplert med bukspyttkjertelmikrosomer fra hund. De resulterende transla-sjonsproduktene ble så immunoutfelt med spesifikt IgG-antistoff for menneskevevplasminogenaktivator. 5. Den passende RNA (21 til 24S) ble omdannet til tilsvarende enkj edet komplementært DNA(cDNA)

hvorfra det ble fremstilt dobbeltkjedet cDNA.

Etter påhenging av poly-dC ble den innført i en vektor, slik som et plasmid med en eller flere fenotypemarkører.

6. De således fremstilte vektorer ble brukt til å transformere bakterielle celler, hvilket ga en samling med klonet cDNA. En—blanding med radio- aktivt merkede syntetiske deoksyoligonucleotider som er komplementære til codoner for kjente aminosyresekvenser i t-PA, slik som f.eks. blandingen av 8 14-merer,

5'-dTC(^)CA(^)TA(^)TCCCA-3'

(komplementære til sekvenser som koder for den kjente - se ovenfor - aminosyresekvensen: tryptofan - glutaminsyre - tyrosin - cystein - aspartin-syre (W-E-Y-C-D) ble fremstilt og brukt til å sondere kolonisamlingen.

7. Fra de positive eDNA-klonene ble plasmid-DNA isolert og oppdelt. 8. Den oppdelte DNA ble så påhengt ender in vitro for innføring i et passende ekspresjonshjelpemiddel som ble brukt til å transformere en passende vertcelle, som fikk vokse i-en kultur og fremstille den ønskede aktivator for menneskevevplasminogen . 9. Den således fremstilte aktivator for menneskevevplasminogen har ca. 251 aminosyrer i sin enzymatiske serinprotease-del og en "kringle" inneholdende den forangående sekvensen som for tiden antas å være ansvarlig for fibrinbinding.

Det fullstendige proteinet, pluss dets signal-forløpersekvens består tilsammen av 56 2 aminosyrer.

Fremgangsmåten ovenfor er i seg selv vellykket til å fremstille ren t-PA. Fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen som anvender en ytterligere kodende sekvens som er følsom for methotrexate,

gir adgang til fremstilling i vertcellekulturer av antigent aktivt t-PA-protein i mengder større enn 0,1 pg/celle/dag.

Ved passende anvendelse av forsterkningsbetingelser kan det erholdes mengder som er større en 2 0 pg. Sagt med andre ord oppnås det genekspresjonsnivåer som resulterer i fremstilling av mer enn 9 x 10Plough-enheter, eller med passende forsterkning,mer enn 18 x 10 -4 Plough-enheter t-PA-aktivitet.

Ved denne siden av oppfinnelsen trekkes det fordeler av metho-. trexate som et legemiddel som - mens det vanligvis er dødelig for celler som er istand til å oppta det - lar celler vokse i nærvær av kontrollerte nivåer av MTX ved forsterkning av genet som koder for den DHFR-kodende sekvens (Schimke, Robert T. et al., Sience, 202: 1051 (1978), Biedler, J.L. et al., Cancer Res. 32: 153 (1972), Chang, S.E. et al., Cell, 7: 391 (1976))

Av betydning for denne siden ved oppfinnelsen er påvisningen av at forsterkning av genet for DHFR kan forårsake forsterkning av tilknyttede sekvenser som koder for andre proteiner. Dette synes å være tilfelle når det tilknyttede protein er hepatitis B overflate-antigen (HBsAG) (Christman, J. et al., Proe.Nati.Acad.Sei., 79: 1815 (1982)), E.coli-proteinet

XGPRT (Ringold, Gordon, et al., J.Molec. and Appl.Gen. 1: 16 5

(1981)), og en endogen sekvens fra en DHFR/SV4 0-plasmidkombina-sjon (Kaufman, R.F., et al, J. Molec.Biol., 159: 601 (1982)).

Andre mekanismer for å bekrefte methotrexate-resistens omfatter forminsking av bindingsaffiniteten til DHFR-proteinet, slik at det er mindre følsom for methotrexate (Flintoff, W.F. et al., Somat.Cell Qenet., 2: 245 (1976), men i dette tilfelle synes forsterkning likevel å oppstå.

Det kan forekomme at genene både for villtype DHFR og for

DHFR som er resistent mot MTX på grunn av dens egen forminskede bindingskapasitet, forsterkes ved nærværet av MTX. I prinsippet vedrører denne siden av oppfinnelsen derfor å bruke virkningen av DHFR-sekvensforsterkning på tilknyttede protein-kodede sekvenser for åtilveiebringe en kontrollmekanisme som gir forbedrede ekspresjonsnivåer for t-PA-sekvenser i nærvær av MTX, eller ved hjelp av en tidligere behandling av transformerte celler med MTX.

E. Eksempler.

De følgende eksemplene er ment å illustrere, men ikke å be-grense oppfinnelsen. I eksemplene ble det som vertcellekulturer brukt en E. coli-vertkultur og en CHO-cellelinje passende for typen av DHFR-proteinkodende sekvens som skulle innføres. Også andre eukaryot- og prokaryot-celler er imidlertid egnet for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

E.1. Ekspresjon av menneske- t- PA- genet i E. coli

E.l.A Tekst til tegningene

Fig. 1 er et autoradiogram av en 10% SDS-acrylamidgel som viser det immunoutfelte [ 35S]-metioninmerkede proteinet(ene) som utskilles fra menneskemelanomaceller iløpet av en 3 timers periode in vivo i nærvær av (felt b) eller fravær av (felt a) proteaseinhibitoren aprotinin. Etter immunologisk utfelling med spesifikt IgG for vevplasminogenaktivator, ble det observert tre bånd (felt a) med molekylvekter på omtrent 65.000, 63.000 og 35.000. I nærvær av proteaseinhibitoren kan det imidlertid ikke sees noen -art med molekylvekt 35.000. Ingen produkter utfelles immunologisk når preimmunserum brukes (felt c). Forflytningene og molekylvektene for "^C-merkede proteinstandarder er vist til venstre i felt a. Fig. 2 viser elektroforesen av de immunologisk utfelte trans-lasjonsproduktene av RNA-fraksjoner isolert fra en sur urea-agarosegel. Et hovedbånd ble funnet i fraksjonene med nummer 7 og 8 etter translasjon i nærvær av bukspyttkjertelmikrosomer fra hund, etterfulgt av immunologisk utfelling med spesifikt IgG for vevplasminogenaktivator. Dette "båndet har en molekylvekt på omtrent 63.000 dalton. Størrelsen på mRNA som for-flyttes i fraksjonene 7 og 8 er omtrent 21 til 24S. Posisjonene for ribosomale RNA-markører som ble bestemt etter elektroforese på RNA-ureagelen og synliggjort ved hjelp av etidium-bromidfarving, er sterkt avmerket over de bestemte gelfeltene. Fig. 3 viser hybridiseringssporet for 96 kolonier med<32>P-dTC(^)CA(Q)TA(£)TCCCA (W-E-Y-C-D)-prøve. 96 adskilte transformanter ble dyrket på en mikrotiterplate, replika-overført og dyrket på en nitrocellulosemembran. Koloniene ble så lyst, bakterielt DNA fiksert og filtrene ble hybridi-3 2

sert med P-14-mer (W-E-Y-C-D)-prøver. Filtrene ble vasket for å fjerne ikke-hybridisert prøve og eksponert mot røntgen-film. Dette autoradiogrammet er representativt for sporene som ble oppnådd med 48 adskilte filteré (4.600 uavhengige kolonier). Et eksempel på en positiv cDNA-klon for vevplasminogenaktivator på filter nr. 25 er merket som E10 (pil).

Fig. 4 er et restriksjonsendonucleasekart over den fullstendige cDNA for menneskevevplasminogenaktivator. Antallet og stør-relsen av fragmentene fremstilt ved restriksjonsendonuclease-spalting ble beregnet ved elektroforese gjennom 6% acrylamid-geler. Posisjonene for stedene ble bekreftet av nucleinsyre-sekvensen (gjengitt i fig. 5). Det kodende område til den største, åpne avlesningsrammen er innrammet og det skraverte område angir den antatte signalpeptidsekvensen, mens det stiplede område angir den antatte sekvensen for fullstendig vevplasminogenaktivator (527 aminosyrer). 5<1->enden av mRNA

er til venstre, mens 3'-enden er til høyre.

Fig. 5A, 5B og 5C illustrerer nucleotidsekvensen og den ut-ledede aminosyresekvensen til cDNA for menneskevevplasminogenaktivator i full lengde. De 35 aminosyrene (-35 til -1) som kommer foran den fullstendige sekvensen, er angitt som en uavbrutt sekvens. Det antas at denne 35-aminosyresekvensen består av en hydrofil "pro"-sekvens som kommer foran serin

(+1) i det fullstendige protein, med ca. 12 til 15 aminosyrer som igjen kommer etter et "vanlig", hydrofobt signal(strekker seg fra 5' til -35). Denne typen av pre-pro-struktur på utskilte proteiner er tidligere blitt beskrevet, f.eks. med pre-pro-albumin. Hvis man legger denne teorien til grunn, vil alle de utskilte vevplasminogenaktivatormolekylene starte med serinet (+1) som aminoenden. En annen teori går ut på at den hydrofile sekvensen kunne være involvert i"~~funksjonen til

aktivator for vevplasminogen på en måte som er analog med det som er observert hos plasminogen, hvor et peptid på 10.000 dalton kan spaltes fra aminoendedelen i naturlig plasminogen (Glu-plasminogen, navngitt etter aminoenderesten), hvilket gir et mindre molekyl med en ny aminoende, betegnet Lys-plasminogen. Lys-plasminogen aktiveres lettere til plasmin og har også en større affinitet for fibrin enn Glu-plasminogen. Det er påvist at plasmin katalyserer omdannelsen av Glu- til Lys-plasminogen. Denne type kontrollmekanisme resulterer i

en "positive feedback"-mekanisme. De første mengdene med plasmin som dannes, resulterer ved siden av nedbryting av fibrin, også i genereringen av plasminogenmolekylet • som lettere akti--veres og også bindes sterkere til substratet sitt, enn naturlig plasminogen. Resultatet er en hurtigere nedbryting av fibrin. Det hydrofile peptid til vevplasminogenaktivator kunne også være involvert i en lignende mekanisme, idet dets spalting resulterer i modifisert binding av enzymet til fibrin. Uansett ansees 35 aminosyresekvensen som en forløpersekvens for det fullstendige protein. Fig. 6 er et skjematisk diagram for oppbyggingen av et ekspresjonsplasmid pARIPA<0>for vevplasminogenaktivator. Ut-gangsplasmidet pPA25E10 ble først brutt ned med Pstl for å isolere et 376 bp-fragment som deretter ble brutt ned slik som vist i figuren. Fig. 7 viser resultatet av en fibrinplateanalyse for fibrinolytisk aktivitet i ekspresjonsproduktet erholdt via pARIPA<0>i transformerte celler.

— (

Fig. 8 er en HPLC-kurve for peptider fra vevplasminogenaktivator (ifølge oppfinnelsen) nedbrutt med trypsin (Absorbans ved 210 nm). Pilen viser toppen som svarer til peptidet som brukes til å utforme nucleotidprøve brukt til kolonisamlingen. Peptidet som er representert ved denne toppen, ble funnet å

ha hele sekvensen: L-T-W-E-Y-C-D-V-P-S-C-S-T-C-G-L. De andre hovedtoppene ble på lignende måte sekvensbestemt og funnet å bekrefte den korrekte aminosekvensen til ak-tivator for menneske-

vevplasminogen. En-bokstav-koden for peptidet som refererer til aminosyrebetegnelser, er som følger:

Fig. 9 viser oppbygningen av et plasmid som koder for den direkte ekspresjon av fullstendig aktivator "for menneskevevplasminogen i E. coli. 50 ug plasmid pPA17 ble brutt ned med Sau3AI, HincII og Hhal og gjort til gjenstand for elektroforese på en 6% polyacrylamidgel. Det ble utvunnet ca.

0,5 ug av 55 bp Sau3AI-HhaI-fragmentet.- På samme måte ble omtrent 3 ug av 263 bp Hhal-Narl-fragmentet renset fra 80 yg av klon pPA25E10 ved først å isolere et 300 bp Pstl-Narl-fragment og deretter bryte ned dette fragmentet med Hhal. Alle nedbrytninger ble utført ved 37° i 1 time og reaksjons-produktene oppløst og elektroeluert fra 6% polyacrylamidgel. De to angitte deoksyoligonucleotidene 5' dAATTCATGTCTTATCAAGT (I) og 5' GATCACTTGATAAGACATG (II) ble syntetisert ved hjelp av den faste fase fosfotriestermetoden (51). 100 pmol av oligonucleotid-II ble fosforylert i en 30 yl reaksjonsløs-ning inneholdende 60 mM Tris (pH 8), 10 mM MgCl-, 15 mM 3-mercatoetanol og 50 yCi [y P]ATP (Amersham 5.000 Ci mmol -1 ).

12 enheter T4-polynucleotidkinase ble tilsatt og reaksjonen fikk fortsette ved 37° i 15 min. En yl 10 mM ATP og 12 enheter T4-kinase ble så tilsatt og reaksjonen fikk fortsette i ytterligere 3 0 min. Etter fenol/CHCl^-ekstraksjon ble den fosforylerte oligomer-II og 5'-hydroksyl-oligomeren I blandet med 0,5 yg av det eluerte 55 bp Sau3AI-HhaI-fragment og 2 yg av 263 bp Hhal-Narl-f ragmentet og utfelt^med etanol.- Disse

fragmentene ble bundet sammen ved værelsetemperatur i 4 timer i 60 ul med 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM di-thiothreitol, 0,5 mM ATP og 1000 enheter, med T4 DNA-ligase. Blandingen ble brutt ned i ån time med 48 enheter Narl, 20 enheter EcoRI og 4 0 enheter Bglll (for å eliminere poly-merisasjon gjennom sammenbinding av cohesive Sau3AI-ender) og utsatt for elektroforese på en 6% gel. Det 338 bp store produktet (omtrent 0,1 ug) ble utvunnet ved elektroeluering. Det gjenværende av de t-PA-kodende sekvenser (aminosyrer 111-528) ble isolert på et 1645 bp-fragment ved nedbryting av plasmid pPA25E10 med Narl ogBglll. Plasmidet pLeIFAtrpl03 er et derivat av plasmidet pLeIFA25 (52) , hvor det EcoRI-stedet som ligger lengst borte fra LelFA-genet er blitt fjernet (53). 3 yg pLéIFAtrpl03 ble brutt ned med 20 enheter EcoRI og 20 enheter Bglll i 90 min. ved 37°C, utsatt for elektroforese på en 6% polyacrylamid-gel og det store 4.200 bp) vektorfragmentet ble utvunnet ved elektroeluering. For slutt-konstruksjonen ble 80 ng EcoRI-Bglll pLeIFAtrpl03 bundet sammen med 100 ng av 1645 bp Narl-Bglll-fragmentet og 20 ng av 338 bp EcoRI-Narl-fragmentet i 10 timer ved værelsetemperatur. Denne sammenbindingsblandingen ble brukt til å transformere E. coli K-12 stamme 294. Plasmid-DNA ble fremstilt fra 38 av disse transformantene og brutt ned med EcoRI. Tre av disse plasmidene inneholdt deønskede 600 bp og 472 bp EcoRI-fragmentene. DNA-sekvensanalyse bekreftet at ett av disse plasmidene (pt-PAtrpl2) hadde den ønskede nucleotidsekvensen ved sammenknytningspunktene mellom trp-promoteren, syntetisk DNA og cDNA. Fig. 10 viser resultatet av en fihrinplateanalyse for fibrinolytisk aktivitet hos et vevplasminogenaktivator-ekspresjonspro-dukt ifølge oppfinnelsen. En kultur av E. coli W3110/pt-PAtrpl2 i Luria dyrkningsmedium som inneholdt 5 yg ml ^ tetracyklin, som hadde stått over natten, ble fortynnet 1:100 i M9-medium inneholdende 0,2% glukose," 0,5% casaminosyrer og 5 yg ml ^ tetracyklin. Cellene ble dyrket ved 37° inntil en A550P^ 0,2 og indolacrylsyre ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 20 yg/ml. Prøver ble samlet opp^ved sentrifugering 8 -1

ved A52Q= 0,5-0,6 (-2x10 celler ml ) og umiddelbart ned-frosset. Cellepelletene ble suspendert i 6M guanidinhydroklo-rid ved 5x10 -celler/ml, lydbehandlet i 10 sek., inkubert ved 24° i 30 min. og deretter dialysert i 4 timer mot 25 mM Tris-HC1 pH 8,0, 250 mM NaCL, 0,25 mM EDTA og 0,01 % Tween 80. Etter dialyse ble prøvene sentrifugert ved 13.000 x g i 2 min. og 10 yl av supernatantene ble analysert med hensyn på aktivitet av aktivator for vevplasminogen. Idet man fulgt fremgangsmåten til Granelli-Piperno og Reich (97) , ble platene inkubert i 3,5 timer ved 37°C og lysesoner målt. Kvantifisering ble oppnådd ved å sammenligne med fortynninger av en renset oppløsning av aktivator for melanomavevplasminogen.

E.I.B. Kilde for mRNA for vevplasminogenaktivator

Det ble brukt menneskemelanomaceller (Bowes). Melanoma-cellene ble dyrket inntil sammenflyting av monolag i 100 ml Earles Minimal Essential Media supplert med natriumbikarbo-nat (0,12 %.sluttkonsentrasjon), 2mM glutamin og 10% varme-inaktivert serum fra kalvefoster. For å bekrefte at melanoma-cellene aktivt produserte menneskevevplasminogenaktivator, ble menneskemelanomaceller dyrket til sammenflyting i en mikrotiterplate med 24 brønner. Enten i nærvær eller fravær av 0,33 yM av proteaseinhibitoren aprotinin ble cellene vasket én gang med fosfatbufret saltvannsoppløsning og 0,3 ml av et serum- og metioninfritt medium ble tilsatt. 75 yCi [<3>^S]-metionin ble tilsatt og cellene ble merket ved 37° i 3 timer. Ved slutten av den 3 timer lange merkingsperioden, ble mediene fjernet- fra cellene og behandlet, enten med spesifikt IgG for vevplasminogenaktivator eller med pre-immunserum for immunologisk utfelling (54). De immunologisk utfelte produkter ble vist frem ved hjelp av elektroforese på en 10% SDS-acrylamidgel. Plategelen ble fiksert, tørket og utsatt for fluorografi.

E.1.C. Isolering av messenger- RNA og størrelsefraksjonering.

Alt RNA fra melanomacellekulturer ble ekstrahert i det vesentlige slik som rapportert av Ward et al. (55). Celler ble pelletert ved sentrifugering og deretter resuspendert i lOmM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1,5 mM MgCl2. Celler ble lyst ved tilsetning av NP-40 (1% sluttkonsentrasjon) og celle-kjerner ble pelletert ved sentrifugering. Supernatanten inneholdt den totale mengde RNA.som ble ytterligere renset ved flere fenol- og kloroformekstraksjoner. Den vandige fase ble gjort 0,2 M i NaCl og deretter ble alt RNA utfelt ved tilsetningen av to volumdeler etanol. Oligo-dT.cellulosekromato-grafering ble anvendt for å rense mRNA ut fra preparatene som inneholder alt RNA (51). Typiske utbytter fra 10 g av dyrkede melanomaceller var 5-10 mg totalt innhold av RNA og 50-200 ug poly(A) pluss mRNA.

Fraksjonering av polyA<+>mRNA (2'00 yg) (56) ble utført ved elektroforese gjennom urea-agarosegeler. Plateagarosegelen (57,58) var satt sammen av 1,75% agarose, 0,025 M natrium-sitrat, pH 3,8 og 6M urea. Elektroforese ble utført i 7 timer ved 25 milliamp. og 4°C. Gelen ble så fraksjonert med et barberblad. De enkelte stykkene ble smeltet ved 70° og ekstrahert to ganger med fénol og én gang med kloroform. Fraksjoner ble så etanolutfelt og deretter analysert ved

in vitro translasjon i et reticulocytlysatsystem fra kanin, Bethesda Research Lab. (59,60) supplert med mikrosomer fra hundebukspyttkjertel på følgende måte: Translasjoner ble ut-ført ved å bruke 25 yCi av [ 35S]-metionin og 500 nanogram av hver RNA fra gelstykker i et sluttvolum på 30 yl' inneholdende 25 mM HEPES, 48,3 mM kaliumklorid, 10 mM creatinfos-fat, 50 mM av hver av 19 aminosyrer, 1,1 mM magnesiumklorid, 16,6 mM EDTA, 0,16 mM dithiothreitol, 8,3 mM hemin, 16,6 yg/ ml creatinkinase, 0,33 mM kalsiumklorid, 0,66 mM EGTA, 23,3 mM natriumklorid.

Inkuberinger ble utført ved 30°C i 90 minutter. Mikrosomale membraner fremstilt fra grove mikrosomer fra hundebukspytt kjertel ble idet man brukte EDTA for å fjerne ribosomer (61), behandlet med nuclease slik som beskrevet (62) og var tilstede i translasjonsblandingen i en sluttkonsentrasjon på 7 A260enheter pr. ml. Translasjonsprodukter eller immunologisk utfelte translasjonsprodukter ble analysert ved elektroforese på 10% polyacrylamidgel i natriumdodecylsulfat slik som tidligere beskrevet (63). De ufarvede plategelene ble fiksert, tørket og utsatt for fluorografi (64).

De resulterende translasjonsprodukter fra hver gelfraksjon ble immunologisk utfelt ved hjelp av spesifikt IgG for kanin anti-menneskevevplasminogenaktivator. Det ble funnet et hovedbånd for immunologisk utfélt polypeptid i translasjonen av RNA-fraksjonsnumrene 7 og 8 (forflytning på 21 til 24S) med en molekylvekt på omtrent 63.000 dalton. Dette båndet ble ikke funnet da preimmun IgG ble brukt til immunologisk utfelling, hvilket tyder på at disse polypeptidene var spesifikke for vevplasminogenaktivator.

E.1.D. Fremstilling av en kolonisamling som inneholder "

sekvenser av aktivator for vevplasminogen.

5 yg av gelfraksjonert mRNA (gelstykke 7 mRNA) ble brukt til fremstillingen av dobbeltkjedet cDNA ved hjelp av standardfremgangsmåter (52, 65, 66). cDNA ble størrelsefraksjonert på en 6% polyacrylamidgel. cDNA som var større enn 350 basepar i lengde (125 ng) ble elektroeluert. 30 ng cDNA ble forlenget med deoksy (C)-rester ved å bruke ende-deoksynucleotidyl-transferase (67) og ringsluttet med 300 ng av plasmidet pBR322 (68) som på lignende måte var blitt påhengt deoksy(G)-rester i Pst I-stedet (67). Den ringsluttede blanding ble så transformert inn i E:coli K12 stamme 294 (ATCC nr. 31446).

Det ble erholdt omtrent "4.600 transformanter.

E. 1. E. Fremstilling av DNA- prøve.

Renset aktivator for menneskevevplasminogen ble erholdt

ifølge fremgangsmåten i litteraturhenvisningene (19, 20).

Molekylet ble så undersøkt for å lokalisere områder som er best egnet for å lage syntetiske prøver, på følgende måte: For å gjøre proteinet mottagelig for nedbryting med trypsin, ble det redusert og karboksymetylert. En 2 mg stor prøve av vevplasminogenaktivator ble først dialysert mot 0,01% Tween 80 over natten ved værelsetemperatur. Det lyof.iliserte protein ble så oppløst i 12 ml 0,56 M Tris-HCl-buffer (pH 8,6), 8 molar urea og 5 mM EDTA. Disulfidbindingene ble redusert ved tilsetningen av 0,1 ml £-merkaptoetanol. Denne omsetning ble utført under nitrogen i 2 timer ved 45°C. De reduserte disulfider ble alkylert til karboksymetylderivåtet ved tilsetning av 1,0 ml 1,4 M jodeddiksyre i IN NaOH. Etter 20 min. ved værelsetemperatur ble reaksjonen stanset ved dialyse mot 0,01% Tween 80 i 18 timer ved værelsetemperatur og lyofilisert.

Det resulterende lyofiliserte, karboksymetylerte protein ble pånytt oppløst i 3 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 7,5). Trypsin (TPCK) ble tilsatt (1:50) og nedbrutt ved 37°C. Aliquoter (0,1 ml) ble tatt ut etter 3, 6 og 12 timer. En annen tilsetning av trypsin ble gjort etter 12 timer. Reaksjonen ble stanset etter 24 timer ved å fryse ned prøven inntil den kunne injiseres på HPLC. Utviklingen av nedbrytingen ble bestemt ved hjelp av SDS-gel på aliquotene. Alle gel var blanke, med unntak av et svakt bånd på 3 timers aliquoten. Dette indikerte at den 24 timer lange nedbrytingen var fullstendig og at ingen store peptider var tilbake.

En prøve (ca. 0,5 ml) ble injisert i en Altex C-8 5 ym ultra-kuler-kolonne med høy oppløsning i to omganger. Det ble grad-vis frembragt en acetonitril-gradient (1% til 5% på 5 min.,

5% til 35% på 100 min., 35-50% på 30 min.). I den ene av de to preparative kjøringene ble eluenten overvåket ved to bølge-

lengder (210 nm og 280 nm). Forholdet mellom absorbsjonene ved de to bølgelengdene ble brukt til å angi de tryptofan-holdige peptidene.

Peptidtoppene som mest sannsynlig inneholdt tryptofan, eller

de som ble antatt nyttige av andre grunner, ble først sekvensbestemt. Dette muliggjorde bestemmelsen av sekvensen rundt det meste av tryptofanene. Etter sekvensbestemmelse av ca. 25 av de beste, mulige peptidtoppene, ble alle sekvensdata som kunne sammenlignes, samlet for å få en foreløbig modell av primærstrukturen for vevplasminogenaktivator. Ut fra disse data og modeller ble flere mulige prøver lokalisert.

E.1. F . Identifikasjon av bakterielle kloner som inneholder

cDNA- sekvenser for vevplasminogenaktivator.

Koloniene ble hver for seg inoculert i brønner i mikrotiterpla-ter inneholdende LB (93) +5 ug/ml tetracyklin og lagret ved

-20°C etter tilsetning av DMSO til 7%. To kopier av kolonisamlingen ble dyrket opp på nitrocellulosefilteret og DNA

fra hver koloni fiksert til filtreret ved hjelp av Grunstein Hogness-fremgangsmåten (69).

Den<32>P-merkede - TC(^)CA(^)TA(£)TCCCA-prøven ble fremstilt (fra den syntetiske oligomeren) (W-E-Y-C-D)-samlingen av 14-merer slik som beskrevet ovenfor. Filteret som inneholdt 4.600 transformanter ble forhybridisert i 2 timer ved værelsetemperatur i 50 mM natriumfosfat pH 6,8, 5X SSC (80),

150 ug/ml lydbølgebehandlet sperm-DNA fra laks, 5X Denhardfs oppløsning (85), 10% formamid og deretter hybridisert med 50X 10^ tellinger pr. minutt av den merkede prøven i den samme oppløsningen. Etter inkubering over natten ved værelsetemperatur, ble filtrene vasket tre ganger ved værelsetemperatur i 6X SSC, 0,1% SDS i 30 minutter, en gang i 2X SSC og deretter eksponert mot Kodak XR-5 røntgenfilm med Dupont Lightning Plus-forsterkningsrastere i 16 timer.

Plasmid-DNA ble isolert ved en hurtigmetode (71) fra alle - koloniene som oppviste en positiv hybridiseringsreaksjon. cDNA-innskuddene fra disse klonene ble så sekvensbestemt etter subkloning av fragmenter inn i M13-vektoren mp 7 (73)

og ved Maxam Gilbert kjemisk fremgangsmåte (74). Fig. 3 viser filter nr. 25 som oppviser hybridiseringssporet for en positiv klon av aktivator for vevplasminogen. cDNA- - innskuddet i klon 25E10 ble påvist å være den DNA som koder for aktivator for vevplasminogen, ved sammenligning av dens aminosyresekvens med peptidsekvens (se ovenfor) erholdt fra renset aktivator for vevplasminogen, og ved dens ekspre-sjonsprodukt fremstilt i E. coli slik som beskrevet i nærmere detalj nedenunder. Klon 25E10 var 2304 bp lang med den lengste åpne avlesningsramme kodende for et protein med 508 aminosyrer (Molekylvekt 56.756) og inneholdende et 772 bp 3' ikke-oversatt område. Denne cDNA-klon manglet de kodende sekvenser i N-enden.

E.I.G. D irekte ekspresjon av en menneskevevplasminogen-aktivatorklon i E. coli.

Under henvisning til fig. 6 ble 50 yg pPA25E10 (se ovenfor) brutt ned med Pst I og 376 bp fragmentet ble isolert ved elektroforese på en 6% polyakrylamidgel. Omtrent 3 yg av dette fragmentet ble isolert fra gelen ved elektroeluering, brutt ned med 30 enheter Ddel i én time ved 37°, fenol- og kloroformekstrahert og utfelt med etanol, De resulterende Dde I utstikkende endene ble utvidet til butte ender ved å tilsette 5 enheter DNA polymerase I (Klenow-fragment) og 0,1 mM hver av dATP, dCTP, dGTP, dTTP til reaksjonsblandingen og inkubering ved 4°C i 8 timer. Etter ekstraksjon med fenol og kloroform, ble DNA brutt ned med 15 enheter Nar I

i 2 timer og reaksjonsblandingen gjort til gjenstand for elektroforese på en 6% polyacrylamidgel. Omtrent 0,5<y>g av det ønskede 125 bp butt-ende Nar I-fragmentet ble utvunnet. Dette fragmentet koder for aminosyrer med nr. 69 til 110 i det fullstendige aktivatorproteinet for vevplasminogen.

For isolering av det 1645 bp Nar I - Bgl II-fragmentet, ble '30 yg pPA25E10 brutt ned med 30 enheter Nar I og 35 enheter Bgl II i 2 timer ved 37° og reaksjonsblandingen ble gjort til gjenstand for elektroforese på en 6% polyacrylamidgel. Omtrent 6 yg av det ønskede 1645 bp Nar I-BglII-fragmentet ble utvunnet.

Plasmidet pARlSRC er et derivat av plasmidet pSRCexl6 (79) hvor Eco Rl-stedet som ligger nært trp-promoteren og fjernt fra SRC-genet, er blitt fjernet ved utbedring med DNA-polymerase I (28), og det selv-utfyllende oligodeoksynucleotid AATTATGAATTCAT syntetisert ved fosfotriester-metoden (75) ble innført i det gjenværende Eco Rl-stedet umiddelbart grensende opp til Xba I-stedet. 20 yg av pARlSRC ble fullstendig nedbrutt med Eco RI, fenol- og kloroform-ekstrahert og utfelt med etanol. Plasmidet ble så brutt ned med 100 enheter nuclease Sl ved 16°C i 30 min. i 25 mM natriumacetat (pH 4,6), 1 mM ZnC±2 og 0,3 M NaCl for å lage en butt ende ved sekvensen ATG. Etter fenol- og kloroformékstraksjon og etanolutfelling, ble DNA brutt ned med Bam Hl, utsatt for elektroforese på 6% polyacrylamidgel og det store (4.300 bp) vektorfragmentet utvunnet ved elektroeluering.

Ekspresjonsplasmidetble samlet opp ved å binde sammen 0,2 yg vektor, 0,06 yg av 125 bp butt-ende- NarI-fragmentet og 0,6 yg av 1645 bp Narl-Bgl II-fragmentet med 10 enheter DNA ligase i 7 timer ved værelsetemperatur, og brukt til å transformere E. coli stamme 294 (ATCC nr. 31446) til ampicillinresistens. Plasmid-DNA ble fremstilt fra 26 av koloniene og brutt ned med Xbal og Eco RI. Tolv av disse plasmidene inneholdt de ønskede 415 bp Xba I-Eco RI og 472 bp Eco RI-fragmentene. DNA-sekvensanalyse bekreftet at flere av disse plasmidene hadde et ATG-oppstartingskodon korrekt plassert ved starten for aminosyre nr. 69 (serin).~ Ett av disse plasmidene, pARIPA<0>ble under-søkt og fremstilte den ønskede aktivator for vevplasminogen (fig. 7).

<1>E.1.H. cDNA for vevplasminogenaktivator i full lengde.

a) Fremstilling av en kolonisamling inneholdende N-ende-sekvenser for vevplasminogenaktivator.

0,4 yg av det syntetiske oligonucleotidet 5' TTCTGAGCACAGGGCG

3' ble brukt for å få 7,5 yg mRNA fra gelfraksjon nr. 8 (se nedenunder) til å fremstille dobbeltkjedet cDNA ved hjelp av standardfremgangsmåte (65, 66). Den fremstilte cDNA ble størrelsesfraksjonert på en 6% acrylamidgel. En størrelses-fraksjon større enn 300 bp (36 ng) ble elektroeluert. 5 ng cDNA ble forlenget med deoksy (C)-rester ved å- bruke ende-deoksycytidyltransferase (67) og ringsluttet med 50.ng av plasmidet pBR3 2 2 (68) som på lignende måte var blitt påhengt deoksy(G)-rester i Pst I-stedet (67). Den ringsluttede blanding ble så transformert inn i E. coli K12 stamme 294. Det ble erholdt omtrent 1.500 transformanter. b) "Southern"-hybridisering av menneskegenos-DNA.

Ettersom oppstartingsreaksjonen for cDNA var blitt utført under

anvendelse av et syntetisk fragment som hybridiserte 13 bp fra N-enden av klon pPA25E10, var det ikke tilgjengelig noe passende restriksjonsfragment i dette 29 bp store område (som omfatter 16-mer sekvensen) til screening av cDNA-klonene. Derfor var det nødvendig å isolere en genomklon for menneskevevplasminogenaktivator for å identifisere oppstarter-forlengede cDNA-kloner som inneholder N-ende kodende sekvenser for vevplasminogenaktivator.

Første trinnet i denne fremgangsmåten omfatter å fastslå det faktum at bare et enkelt homologt gen for vevplasminogenaktivator er tilstede i genom-DNA fra mennesker. For å påvise dette ble det utført en "southern"-hybridisering. Ved denne fremgangsmåte (77) ble 5 yg menneskelymfocyt-DNA med høy molekylvekt (fremstilt slik som i 80) brutt fullstendig ned med forskjellige restriksjonsendonucleaser, utsatt for elektroforese på 1,0% agarosegel (81) og oppsugd i et nitrocellulosefilter (77).

Det ble fremstilt en<32>P-merket DNA-prøve (76) fra 5'-enden

av cDNA-innskuddet i cDNA-klonen pPA25ElO (et 230 bp HPA II-RSA I-fragment) og prøven ble hybridisert (82) med nitrocellulosefilter. 35 x 10 tellinger pr. minutt av prøven ble hybridisert i 4 0 timer og deretter vasket slik som beskrevet (82). To endonuclease-nedbrytningsspor gir bare et enkelt hybridiserende DNA-fragment : Bgl II (5,7 Kbp) og Pvu II (4,2 Kbp). To hybridiserende DNA-fragmenter ble

funnet ved hjelp av Hine II (5,1 Kbp og 4,3 Kbp). Tilsammen antyder disse data nærværet av bare ett enkelt vevplasminogen-aktivatorgen i menneskegenomet, og at dette genet inneholder minst en mellomliggende sekvens.

c) Screening av menneske-X-fag-samlingen etter gener for vevplasminogenaktivator. Strategien som brukes for å identifisere X-fag rekombinanter som bærer gener for vevplasminogenaktivator, besto i å påvise nucleotidhomologi med hjelp av en radioaktiv prøve fremstilt fra klonen pPA25E10 for vevplasminogenaktivator. En million rekombinant X-fag ble platet ut på DP 5 0 Sup F i en tetthet på 10.000 pfu/15cm plate, og det ble fremstilt nitrocellulosefilter-replikaer for hver plate ved hjelp av fremgangsmåten 32 til Benton og Davis (78). Det ble fremstilt en P-merket DNA-prøve ved hjelp av standardfremgangsmåter (83) fra et 230 bp Hpa II - Rsa I-fragment beliggende 34 bp fra 5'-enden i klonen p25E10. Hvert nitrocellulosefilter ble forhybridisert ved 42° i 2 timer i 50 mM natriumfosfat (pH 6,5), 5X SSC (77), 0,05 mg/ml lydbølgebehandlet sperm-DNA fra laks, 5X Denhardfs oppløsning (84), 50% formamid og deretter hybridisert med 50 x 10 tellinger pr. minutt av den merkede prøven i den samme oppløsning som inneholder 10% natriumdextransulfat (85). Etter inkubering-over natten ved 42°C ble filtrene vasket fire ganger ved 50° i 0,2 X SSC, 0,1% SDS i 30 min.,

én gang i 2 x SSC ved værelsetemperatur og deretter eksponert mot Kodak XR-5-røntgenfilm med Dupont Cronex-forsterkningsrastere over natten. Det ble ialt erholdt 19 kloner som hybridiserte med prøven. Fag-DNA ble fremstilt slik som tid-

ligere beskrevet (86) fra 6 rekombinanter. A-klon C ble valgt ut for fremstilling av et Pvu II-fragment til koloni-screening. 3 0 yg DNA ble brutt ned med Pvu II i én time ved 37° og utsatt for elektroforese på 1,0% agarosegel. Et 4,2 kilobasepar stort fragment som tidligere er påvist å inneholde aktivatorsekvenser for vevplasminogen, ble elektroelu-

32

ert og renset. En P-merket prøve ble fremstilt ved hjelp av standardfremgangsmåter (83) for kolonihybridiseringer slik som beskrevet nedenunder.

d) Screening av kolonisamling etter 5'-sekvenser for vevplasminogenaktivator. -;-

Koloniene ble overført fra plater og dyrket på nitrocellu-lose filtere og DNA fra hver koloni ble fiksert på filteret ved hjelp av Grunstein-Hogness-fremgangsmåten (69). En 32

P-merket prøve ble laget ved hjelp av oppstarting med kalve-thymus (83) av et 4,2 kbp"stort Pvu II-fragment fra en isolert vevplasminogenaktivator-A.-genomklon. Filtere som inneholdt de 1.500 transformantene ble hybridisert med 112 x 10 cpm av P-genom Pvu II-fragmentet.

Hybridisering foregikk i 16 timer ved å bruke betingelser beskrevet av Fritsch et al. (82) . Filtere ble grundig vasket og deretter eksponert mot Kodak XR-5 røntgenfilm med Dupont Lightning-Plus-forsterkningsrastere i 16-48 timer. Atten kolonier hybridiserte klart med den genomiske prøven. Plasmid-DNA ble isolert fra hver av koloniene, og ble bundet til nitro-cellulosefiltere og hybridisert med<32>P-merkede syntetiske oligonucleotid (16-mer) som ble brukt til den opprinnelige oppstartingsreaksjonen. Av de 18 klonene, ble 7 hybridisert med den kinasebehandlede 16-meren. Etter subkloning av fragmenter inn i ml3 vektoren mp (73) og sekvensanalyse, ble 1 klon (pPA17) påvist å inneholde det korrekte 5' -N-endeområdet for vevplasminogenaktivator,- en signal-styringssekvens og et 84 bp 5' ikke-oversatt område. Fra de to klonene pPA25ElO og pPA17 ble den fullstendige nucleotidsekvensen (fig. 5) og restriksjonsmønsteret (fig. 4)—for en vevplasmino-

genaktivatorklon i full lengde bestemt.

Det naturlige vevplasminogenaktivatormolekylet har mulig-

het for å bli stabilisert av 17 disulfidbroer basert på homologi med andre serinproteaser. Der er 4 potensielle N-glykosyleringssteder, 3 lokalisert i "kringle"-områdene

ved asn^^, asn-^g^, asn]_34 0<3 et potensielt sted i området for den lette kjeden, ved asn^g. Variasjoner i strukturen til oligosakkaridligandene kan være ansvarlig for de forskjellige molekylformene (typer med molekylvekt på 65.000

og 63.000).

E.1.I. Direkte ekspresjon i E. coli av cDNA- klon for

vevplasminogenaktivator i full lengde.

En rekonstruksjon av hele den kodende sekvensen var mulig ved

å anvende det felles-Hhal-restriksjonsendonucleasestedet som deles av begge delklonene pPA17 og pPA25E10. Et 55 bp Sau3AI-Hha I-restriksjonsfragment svarende til aminosyrene 5-23 ble isolert fra plasmidet pPA17. Sau3AI-restriksjonsstedet var beliggende ved kodon fire i den antatt fullstendige kodende sekvensen og ble brukt til å fjerne det kodende område for signalpeptidet. Et 263 bp Hhal-Narl-fragment (kodende for aminosyrene 24-110) ble også isolert fra plasmid pPA25E10.

Det ble utformet to syntetiske deoksyoligonucleotider som utbedrer kodonene for aminosyrene 1-4, innlemmer et ATG-opp-startingskodon for oversettelse og lager en EcoRI-sammen-hengende ende. Disse tre fragmenter ble så bundet sammen for å danne et 338 bp fragment som koder for aminosyrene 1-110. Dette fragmentet og et 1645 bp Narl-Bgl II-fragment fra pPA25E10 ble så bundet sammen mellom EcoRI og Bgl II-stedene i plasmidet pLeIFAtrpl03 (53) hvorved man fikk ekspresjonsplasmidet pt-PAtrpl2. Det klonede t-PA-genet transkriberes under kontroll av et 300 bp.fragment fra E. coli trp-operonet som inneholder trp-promoteren, operatoren og Shine-Dalgarno-sekvensen for trp-styrerpeptidet, men mangler ATG oppstartings-kodonet for styrerpeptidet (52).

E. coli K12 stamme W3110 (ATCC nr. 27325) som inneholder plasmidet pt-PAtrpl2, ble dyrket og ekstraktet ble fremstilt for analyse av fibrinolytisk aktivitet. En fremgangsmåte brukt til å måle vevplasminogenaktivatoraktivitet er fibrinplateanalyse (87). Denne måler mengden plasmindannelse-ved å måle utstrekningen av plasminnedbryting av fibrin i en agaroseplate som inneholder plasminogen og fibrin. Plasmin gir en klar lysesone i fibrinplaten og arealet av denne sone kan sammenlignes med mengden aktivator for vevplasminogen i prøven. Når ekstrakter fra pt-PAtrpl2-kloner undersøkes med hensyn på vevplasminogenaktivatoraktivitet ved å bruke fibrin-plateanalysen, er en klar lysesone tydelig. Denne fibrinolytiske aktivitet inhiberes av anti t-PA IgG, men ikke av pre-immun IgG eller anti-urokinase-IgG, og det fåes ingen aktivitet i en ekstrakt fremstilt fra celler som inneholder som en kontroll leukocytinterferon-plasmidet pLelFAtrpl03. Ved å bruke en standardkurve for renset t-PA slik som vist, er det, mulig å beregne at det erholdes omtrent 20 enheter ekstrahert aktivitet pr. 10 g celler (for renset t-PA, 90.000 plog-enheter = 1 mg) (fig. 10).

E.I.J. Sekvensanalyser.

Sekvensanalyser ble basert på Edman-nedbrytningen (83b). Prøven ble innført i skålen på Beckman 890B eller 890C sek-TM

vensanalyseapparat med roterende skål. Polybren (poly-N,N,N^N^-tetrametyl-N-trimetylenhexametylen-diammoniumdiacetat) ble brukt som en bærer i skålen (63 C). Sekvensanalyseapparatet ble modifisert med en kald felle og noen programendrin-ger for å redusere bakgrunnstopper. Reagensene var Beckman's sekvensgrad 0,1 molar Quadrol-buffer, fenylisothiocyanat og heptafluorsmørsyre.

De samlede Edman-periodene ble manuelt omdannet til 2-anilin-5-thiazolinon-derivater. 1-klorbutan ble tørket under nitrogen. Deretter ble 1,0 N HCl i vann tilsatt til 2-anilin-5-thiazolinon og oppvarmet til 70°C i 10 minutter for å omdanne det til 3-fenyl-2-thiohydantoinet (PTH-derivat). PTH-amino- syreresten ble deretter oppløst i 50% acetonitril og vann og injisert i en omvendt fase høytrykksvæskekromatograf. Hver PTH-aminosyre ble så identifisert ved sammenligning med til-bakeholdelsestidene for en standardblanding av PTH-aminosyrer som ble innført i omdannelsesglasset og behandlet på samme måte som en periode på sekvensanalyseapparatet.

E.I.K. Analyser for påvisning av ekspresjon av aktivator

for vevplasminogen.

1. Direkte analyse av plasmindannelse.

a) Teori.

En følsom analyse for vevplasminogenaktivator kan erholdes

ved å studere omdannelsen av plasminogen til plasmin, som katalyseres med aktivator for vevplasminogen. Plasmin er et enzym for hvilket det finnes kromogene substratanalyser. Disse analysene er basert på den proteolytiske avspaltning

av tripeptid fra en kromofor gruppe. Avspaltingshastigheten står i direkte forhold til både spesifisiteten og konsen-trasjonen av proteasen som undersøkes. Grunnlaget for undersøkelsen er bestemmelsen av mengde plasmin dannet etter inkubering av oppløsningen som inneholder aktivator for vevplasminogen, med en oppløsning av plasminogen. Jo større mengde aktivator, jo større dannet plasmin. Plasmin måles ved å undersøke dets spalting av kromogent substrat S2251 (levert fra Kabi Group, Inc., Greenwich, CT).

b) Fremgangsmåte.

En alikvot av prøven blandes med 0,10 ml 0,7 mg/ml plasminogen (i 0,05 M Tris.HCl, pH 7,4, som inneholder 0,012 M NaCl) og volumet justeres til 0,15 ml. Blandingen inkuberes ved 37°C i 10 minutter, 0,35 ml-S2251 (1,0 mM oppløsning i buffer nevnt ovenfor) tilsettes og omsetningen får fortsette i 30 min. ved 37°C. Iseddik (25 yl) tilsettes for å avslutte omsetningen. Prøvene sentrifugeres og absorbansen ved 405 nm måles. Kvantifisering av mengden aktivitet- erholdes ved sam menligning med en standard-urokinaseoppløsning. Analyse-betingelsene for påvisning av aktivator for vevplasminogen i full lengde ble modifisert ved tilsetningen av fibrinogen (0,2 mg) til oppløsningen. Fibrinogen gir en stimulering av den observerte aktiviteten av vevplasminogenaktivator og resulterer derved i noe forhøyet aktivitetsnivå. Aktivitet ble målt i Plough-enheter, hvor 90.OOOPlough-enheter tilsvarer aktiviteten av 1 mg renset aktivator for vevplasminogen.

2. Indirekte analyse av plasmindannelse.

a) Teori..-/-"

En følsom analyse for vevplasminogenaktivatoraktivitet er

utviklet (87). Analysen er basert på bestemmelse av plasmindannelse ved å måle utstrekningen av plasminnedbrytning av fibrin på en agarplate som inneholder fibrin og plasminogen. Plasmin gir en klar lysesone i fibrinplate. Arealet av denne lysesone kan sammenlignes med mengden aktivator for vevplasminogen i prøven.

b) Fremgangsmåte.

Ifølge fremgangsmåten til Granelli-Piperno og Reich (87) ble

platene inkubert i 3,5 timer ved 37°C og lysesoner ble målt. Kvantitisering ble erholdt ved å sammenligne med en standard-urokinaseoppløsning.

E.l.L. Bestemmelse av aktivitet av aktivator for vevplasminogen;

1. Bakterievekst og fremstilling av prøve.

En koloni E. coli som inneholder plasmidet (pARIPA<0>) ble inoculert i et prøverør med 5 ml LB-vekstmedia som inneholder 20 ug/ml ampicillin. Cellene ble dyrket over natten ved 37°C. En alikvot av denne kulturen ble fortynnet 1:100 i 300 ml M9-media som inneholdt 20 ug/ml ampicillin."Cellene ble dyrket i en rysteflaske ved 3 7°C i 4 timer, hvorved man fikk en absorbans ved 550 nm på 0,419. Den tryptofananaloge indolacrylsyre ble tilsatt inntil en konsentrasjon på 30 ug/ml. Cellene ble inkubert i 90 min., hvorved man fikk en absorbans ved 550 nm på 0,628. Cellene ble høstet ved sentrifugering og på nytt suspendert i 0,8 ml 0,01 M Tris, pH 8,0, inneholdende 0,01 M EDTA. Den resulterende suspensjon ble hurtig omrørt ved værelsetemperatur i 18 timer. Prøven ble sentrifugert og supernatanten analysert med hensyn på aktivitet av aktivator for vevplasminogen.

For ekspresjon av pt-PAtrpl2,se: den detaljerte beskrivelse under beskrivelsen av fig. 10.

2. Aktivitetsbestemmelse.

Tabellene 1 og 2 viser resultatene av aktiveringen av plasminogen med de respektive E. coli-ekstraktene når disse ble analysert. En aktivitet genereres som er avhengig"av nærværet av plasminogen (tabell 1). Denne aktivitet påvirkes ikke av pre-immunserum fra en kanin, men inhiberes markert av anti-serum som ble frembragt mot renset aktivator for vevplasminogen avledet fra melanomacelle (88).(Tabellene 1 og 2). Dette demonstrerer at E.coli-ekstraktene produserer en plasminogen-aktiverende aktivitet som inhiberes av antistoffer mot aktivatoren for vevplasminogen. Fig. 7 viser resultatet av en fibrinplateanalyse for fibrinolytisk aktivitet. En standardmengde urokinase ble tilsatt midtraden i konsentrasjoner, fra venstre til høyre, på 0,24, 0,14, 0,10, 0,05 og 0,02 Plough-enheter. Bunnraden er prøver av naturlige aktivator for vevplasminogen, med de samme mengder enzym i hver brønn. Brønnene inneholder fra venstre til høyre aktivator for vevplasminogen, aktivator for antiplasminogen pluss pre-immunserum og aktivator for vevplasminogen pluss antistoffer mot aktivator for vevplasminogen. Brønnene i topp-raden inneholder hver 8 yl av de rekombinante ekstraktene av aktivator for vevplasminogen fra E. coli Den første brønnen inneholder ekstraktet alene, i den andre brønnen er pre-immunserum tilsatt og i den tredje brønnen er antistopper mot aktivatoren for vevplasminogen tilsatt. Det er åpenbart at pre-immun-serumet ikke påvirker naturlig eller rekombinant aktivator for vevplasminogen, og at antistoffer mot aktivator for vevplasminogen inhiberer aktiviteten av de naturlige såvel som E. coli-ekstraktene. Basert på urokinasestandardene inneholder ekstraktene litt mindre enn 2,5 Plough-enheter/ml. Dette er gunstig sammenlignet med verdien erholdt i Tabell 1 på 1,3 Plough-enheter/ml. Tabellene 1 og 2 viser resultatene av analyser utført slik som beskrevet ovenfor i E.I.K.I.b:

'Fig. 10 viser resultatene av en fibrinplateanalyse utført med ekstrakter fra 10 liter dyrkningskulturer av E.coli som inneholder et plasmid som uttrykker aktivator for vevplasminogen. Den fibrinolytiske aktiviteten for ekstraktet som inneholder aktivatoren for vevplasminogen er i fig. 10 representert ved brønn A. Denne fibrinolytiske aktivitet inhiberes av anti-t-PA IgG (brønn C), men ikke av preimmun IgG (brønn B) eller antiurokinase-IgG (brønn D), og et ekstrakt fremstilt fra celler som inneholder som en kontroll leukocytinterferonplas-midet pLeIFAtrpl03 (brønn H), oppviser ingen aktivitet.

E.2. Fremstilling av tPA ved å bruke DHFR- protein med en lav bindingsaf f initet " til MTX.

E.2.A. Vektorkonstruksjon.

Sekvensen som koder for aktivatpr for menneskevevplasminogen (t-PA) innføres i et ekspresjonsplasmid som inneholder en mutant DHFR med lav bindingsaffinitet til MTX, beskrevet i US-patentsøknad nr. 459.151, inngitt 19.januar 1983, og som er innlemmet ved henvisning, ved hjelp av den følgende fremgangsmåte (se fig. 11): Tre fragmenter fra overlappende t-PA-plasmider, pPA25E10, pPAl7 og pARIPA<0>(se ovenfor) ble fremstilt på følgende måte: Plasmid pPA17 ble brutt opp med Dde I, utfylt ved å bruke Klenow DNA-polymerase I og oppkuttet med Pst I; hvoretter det omtrent 200 bp store fragmentet som inneholder den således gene-rerte 5'-ende t-PA-sekvensen, ble isolert. Det andre t-PA-fragmentet ble erholdt ved å bryte opp pARIPA<0>med Pst I og Nar I og isolere fragmentet med ca. 310 bp. Det tredje t-PA-fragmentet ble erholdt ved å bryte opp pPA25E10 med Nar I og Bgl II og isolere fragmentet med ca. 1645 bp som inneholder i tillegg til mye av den t-PA-kodende region, noen 3' ikke-oversatte sekvenser.

Plasmid pE342 som uttrykker HBV overflateantigen (også referert til som pHBs348-E) er blitt beskrevet av Levinson et al., patentsøknad nr. 326.980 inngitt 3. desember 1981, som innlemmes her ved henvisningen. (Kort sagt ble opphavet for Simian virus SV40 isolert ved å bryte opp SV40 DNA med Hindlll og omdanne Hindlll-endene til EcoRI-ender ved tilsetning av en omdanner (AGCTGAATTC). Denne DNA ble kuttet med PvuII og Rl-sammenknyttere ble tilsatt. Etter oppbryting med EcoRI

ble fragmentet med 348 bp som spenner over opphavet, isolert ved hjelp av polyacrylamidgel-elektroforese og elektroeluering, og klonet i pBR322. Ekspresjonsplasmid pHBs348-E ble bygd opp ved å klone fragmentet med 1986 bp som resulterte fra EcoRI og Bglll-oppbryting av HBV (Animal Virus Genetics,

(Ch.5) Acad.Press, N.Y. (1980)) (som spenner over genet som koder for HBsAG) inn i plasmidet pML (Lusky et al., Nature, 293:. 79 (1981)) ved posisjonene for EcoRI og BamHI. (pML er et derivat av pBR3 22 som har en eliminerende utslettings-sekvens som virker inhiberende på plasmidreplikering i ape-celler). Det resulterende plasmid (pRI-Bgl) ble så gjort lineært med EcoRI og fragmentet med 348 bp som representerer SV4 0-opphavsområdet ble innført i EcoRI-posisjonen til pRI-Bgl. Opphavsfragmentet kan innføres i begge retninger. Ettersom dette fragmentet koder for både den tidlige og den sene SV40-promoteren i tillegg til opphavet for replikering, kunne HBV-gen uttrykkes under kontroll av den ene eller den andre promoteren avhengig av denne orientering (pHBS348-E utgjør HBs uttrykt under kontroll av den tidlige promoter). pE34 2 modi-fiseres ved delvis oppbryting med EcoRI, utfylling i spaltings-posisjonene ved å bruke Klenow DNA-polymerase I og på nytt å binde plasmidet sammen, derved fjernes EcoRI posisjonen som kommer foran SV40-opphavet i pE34 2. Det resulterende plasmid, betegnet pE342ARl, brytes opp med EcoRI, utfylles ved å bruke Klenow DNA-polymerase I og kuttes med Barn HI. Etter elektroforese på acrylamidgel, elektroeiueres fragmentet med ca. 3500 bp, fenol-kloroform-ekstraheres og utfelles med etanol slik som ovenfor.

Den således fremstilte p342E3500 bp vektor og i ovenfor beskrevne tPA-fragmentene som omfatter ca. 2160 bp, ble bundet sammen ved å bruke standardteknikker. Et plasmid som innehol-

Samtidig forsterkning av DHFR og t-PA-sekvenser analyseres

ved å isolere DNA fra sammenflytende monolag av forsterkede kolonier på følgende måte: Sammenflytende monolag i 15 0 mm plater vaskes med 50 ml steril PBS og lyses ved tilsetningen av 5 ml 0,1% SDS, 0,4 M CaCl2, 0,1 M EDTA, pH 8. Etter 5-10 min. fjernes blandingen, fenolekstraheres, kloroformekstra-heres og utfelles med etanol. DNA resuspenderes i 1 ml

(pr. 150 mm plate) 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA (TE), RNase tilsatt til 0,1 mg/ml og oppløsningen inkuberes i 30 min. ved 37°. SDS tilsettes så inntil-0,1% og pronase (Sigma) tilsettes inntil 0,5 mg/ml. Etter 3-16 timers inkubering ved 37° ekstraheres oppløsningen på nytt med fenol, ekstraheres med kloroform og utfelles med etanol. DNA-pelleten-resuspenderes i 0,5 ml vann og brytes opp med restriksjonsenzymer. Omtrent 5-10 yg oppbrutt DNA utsettes for elektroforese på en agarosegel(1% i Tris-acetatbuffer (40 mM Tris, 1 mM EDTA,

ført til pH 8,2 med eddiksyre)); Crouse, et al., J.Biol.

Chem. 257: 7887 (1982). Etter at bromfenol blå med farve-stoff hadde forflyttet seg 2/3 av veien på gelen, fjernes gelen og farves med ethidiumbromid. Etter synliggjøring av DNA med ultrafiolett lys overføres DNA fra gelen til nitrocellulose-filtret i henhold til fremgangsmåtene til Southern (J.Moi.

Biol. 98: 503 (1975). Filtrene ble så hybridisert med en i rette øyeblikk oversatt prøve fremstilt fra SacII-fragmentet av pEHER med 1700 bp (fremstilt og hybridisert slik som beskrevet ovenfor), eller fra Bglll-fragmentet av pETPER med omtrent 197 0 bp.

E.3. Fremstilling av t- PA i konjunksjon med vill type D HFR- protein.

E.3.A. Konstruksjon av vektor.

På en måte som er analog med den som ble brukt ved konstruk-sjonen av pETPER, ble et plasmid som inneholder DNA-sekven-

sen som koder for villtype DHFR, pETPFR, konstruert. Konstruk-sjonen var som beskrevet i Eks. Cl.A med unntak av at i stedet for plasmid pEHER som en kilde for DHFR-proteingensekvensen, ble

plasmidet pE342 .HBV.E400 . D22 beskrevet i Genentech Dok. nr. 100/92 satt inn. Plasmidet pE342.HBV.E400.D22 er det samme som pEHER.med unntak av en enkelt bp-forskjell mellom vill type og mutant DHFR. Følgelig er det resulterende plasmid pETPFR analogt på alle måter med pETPER, med unntak av at DNA-sekvensen som koder for villtype DHFR er erstattet med den for mutanten.

E.3.B. Ekspresjon av t- PA- sekvens.

pETPFR ble brukt til å transfisere DHFR-manglende CHO-celler (Urlaub og Chasin (se ovenfor) under anvendelse av kalsium-fosfatutfellingsmetoden til Graham og van der Eb. 21 kolonier som fremkom på det selektive mediet (-HGT) ble analysert ved bestemmelse av plasmindannelse slik denne ble fastsatt ved nedbrytingen av fibrin på en agarplate som inneholder fibrin-og plasminogen, beskrevet av Granelli-Piperno, et al., J.Exp.Med., 148: 223 (1978).

Fire av de beste positive klonene ble så analysert kvantitativt med hensyn til plasmindannelse på en pr. cellebasis i henhold til metoden angitt i D.2.C.

Ved slik kvantitativ bestemmelse ble det funnet at de fire undersøkte klonene oppviste den samme eller sammenlignbar t-PA-sekresjon i mediet, bestemt som enheter pr. celle pr. dag. Subkloner ble fremstilt ved å overføre inocula fra to av klonene til separate plater som inneholdt -HGT-medium. To av de resulterende subklonene, 18B og 1 ble brukt til ytterligere analyser.

E.3.C. Nivåer for forsterkning og t- PA-f remstilling.

De ovenfor nevnte subkloner ble platet ut med 2 x 10^-celler pr. 100 mm plater i 50 nM MTX for å fremme forsterkning. De celler som overlevde, ga - da de ble analysert slik som beskrevet ovenfor - i alle tilfeller ca. 10 ganger den ikke- forsterkede mengde aktivitet av aktivator for vevplasminogen. To av disse klonene ble valgt ut for videre undersøkelse og ble betegnet 1-15 og 18B-9.

Subklon 1-15 ble ytterligere forsterket ved å så 2 x 10^ celler på 100 mm plater som inneholdt 500 nM MTX. Analyse av de således forsterkede cellene ga en ytterligere økning (på ca. 3 ganger) av t-PA produksjonen; da de ble analysert kvantitativt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge C.l.C, var nivåene i området 7 x 10 enheter/celle/dag. En del av disse forsterkede cellene ble så overført og oppbevart i nærvær av 10.000 nM MTX. Subkloner av 1-15 og 18B-9 ble under- - søkt videre etter å være oppbevart i ca. 1-2 måneder ved be-tingelsene angitt i Tabell 1'.

Cellelinjene er som- følger: Cellelinje "1" er en ikke-forsterket klon fra det opprinnelige settet på fire. "I-IS^qq"

er en forsterket subklon av cellelinje "1" som ble forsterket opprinnelig i 50 nM MTX til 1-15 og deretter overført for videre forsterkning i 500 nM MTX. 1-151Q 00Q er subklon av l-15[-00som er blitt videre forsterket i nærvær av 10.000 nM MTX. Cellelinje 18B-9 er en subklon av en av de opprinnelig fire påviste som er blitt forsterket på 50 nM MTX.

Alle de forsterkede cellene viser økte nivåer av t-PA-produksjonen utover det som oppvises av den ikke-forsterkede celle-kulturen. Selv den ikke-forsterkede kulturen produserer mengder av t-PA som er større enn 0,5 pg/celle/dag; forsterkning resulterer i nivåer som når opp imot 50 pg/celle/dag.

f

F. Farmasøytiske preparater.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan tilberedes

i henhold til kjente fremgangsmåter for å fremstille farma-søytisk nyttige preparater, hvorved aktivatorproduktet for menneskevevplasminogenet kombineres i blanding med et farma-søytisk akseptabelt bærerhjelpemiddel. Passende hjelpemidler og deres utforming, omfattende andre menneskeproteiner, f.eks. serumalbumin fra mennesker, er beskrevet f.eks. i Remington's Pharmaceutical Sciences av E.W. Martin, som herved innlemmes ved henvisning. Slike preparater vil inneholde en effektiv mengde av proteinet ifølge oppfinnelsen sammen med en passende mengde hjelpestoff for å fremstille farmasøytisk akseptable preparater egnet for effektiv administrering til verten.

F. eks. kan aktivatoren for menneskevevplasminogen ifølge oppfinnelsen administreres parenteralt til individer som lider av sykdommer eller tilstander i" blodåresystemet. Dosestør-relse og doseringshastighet kan være slik som det som vanligvis brukes ved kliniske undersøkelser av andre kardiovaskulære, trombolytiske midler, f.eks. ca. 440 IU/kg kroppsvekt som en intravenøs oppstartingsdose etterfulgt av en kontinuerlig intra-venøs infusjon med-ca. 440 IU/kg/time i 12 timer til pasienter som lider av blodpropp i lungene.

Som et eksempel på en passende doseringsform for i det vesentlige homogen aktivator for menneskevevplasminogen i parenteral form, kan en ampulle som inneholder 25.000 IU vevplasminogenaktivatoraktivitet, 25 mg mannitol og 4 5 mg NaCl, rekonstitue-res med 5 ml sterilt vann for injeksjon og blandes med et passende volum 0,9% natriumkloridinjeksjon eller 5% dextrose-injeksjon for intravenøs administrering.

G. Detaljert beskrivelse av rekombinant menneske- t- PA.

Strukturen til den bestemte utførelsesformen av menneske-t-PA som er fremstilt ved eksemplene, er i en viss utstrekning undersøkt både ved oppklaring av den kodende gelsekvensen _og

r

ved hjelp av teknikker fra profceinbiokjemien. Den inneværende forståelsen av proteinstrukturen er illustrert i fig.. 12.

Det er også tidligere blitt påvist av Coilen og medarbeidere (88) at to menneske-t-PA med to kjeder dannes ved proteolytisk spalting av en-kjede-molekylet til to polypeptider forbundet ved disulfidbinding. Det foreliggende arbeidet gir grunnlag for den konklusjon at den største kjeden (molekylvekt 30882) er avledet fra NH^-endedelen og den minste kjeden (molekylvekt 28126) omfatter COOH-endeområdet. N-ende sekvensbestemmelse av molekylet med to kjeder tyder på at to-kjedeformen genereres ved spalting av en enkelt arginyl-iso- - leusinbinding (fig. 12, angitt med pil).

Primærstrukturen for en del av området til den store kjeden

i menneske t-PA (fig. 12) avslører en stor grad av sekvens-homologi med "kringle"-områdene i plasminogen (89) og pro-thrombin (40,41). "Kringle"-området refererer seg til en karakteristisk trippel disulfidstruktur som" opprinnelig ble oppdaget i "pro"-fragmentet av protrombin, først beskrevet i detalj av Magnusson et al. '(91, 92). Ut fra primærsekvensen for t-PA foreligger det tilsynelatende to såkalte "kringle"-områder, hver med 82 aminosyrer, som har en stor grad av homologi med 5 "kringle"-områdene i plasminogen. De gjenværende 91 aminosyrene i N-enden har liten homologi med det vanlige "kringle"-området. Man kan imidlertid spekulere på om dette området også kan anta en struktur som inneholder flere disul-fidbindinger ettersom det her finnes 11 ytterligere cystein-rester.

Det katalytiske stedet i den lette kjeden fra menneske-t-PA - det såkalte serinprotease-området - dannes slik som i andre serinenzymer, sannsynligvis av histidin222'asparagin^y^<->og serin^yg-restene. Videre er aminosyrefrekvensene som omgir disse restene, svært homologe med tilsvarende deler i andre serinproteaser slik som trypsin, protrombin og plasminogen. Til tross for at det er blitt henvist til bestemte foretrukne utførelsesformer, vil det forstås at foreliggende oppfinnelse ikke må betraktes som begrenset til disse, men heller til det rettmessige omfang ifølge kravene.

Litteraturliste

1. US-patentskrift nr. 3.355.361

2. US-patentskrift nr. 3.926.727

3. US-patentskrift nr. 4.029.767

4. US-patentskrift nr. 4.258.030

5. US-patentskrift nr. 4.271.150

6. EP-patentsøknad nr. 37.687

7. Rijken, D.C., "Plasminogen Activator from Human Tissue", Krips Repro Meppel, 198 0

8. US-patentskrift nr. 3.555.000

9. US-patentskrift nr. 3.998.947

10. US-patentskrift nr. 4.245.051

11. EP-patentsøknad nr. 23.860

12. US-patentskrift nr. 4.083.961

13. US-patentskrift nr. 4.177.262

14. US-patentskrift nr. 3.082.612

15. Wallen, P., "Proc.Serono Symp.9, 91 (1977) 16. Thorsen, S., et al., Thrombos.Diathes, haemorrh. 28, 65 (1972) 17. Coilen, Thrombos.Haemostas. 43, 77 (1980)

18. Wiman et al., Nature 272, 549 (1978)

19. EP-patentsøknad nr. 41.766

20. Weimar, W., et al., The Lancet Vol. II,

nr. 8254, s. 1018 (1981)

21. GB-patentsøknad nr. 2.007.676A

22. Wetzel, American Scientist 68, 664 (1980) 23. Microbiology, 2d Ed., Harper and Row Publications, Inc., Hagerstown, Maryland

(1973), esp. pp 1122 et seq.

24. Scientific American 245, 106 (1981)

25. GB-patentsøknad nr. 2.055.382A

26. DE-off.skrift nr. 2.644.432

27. CHang et al., Nature 275, 617 (1978)

28. Itakura et al., Science 198, 1056 (1977)

29. Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057 (1980)

30. EP-patentsøknad nr. 36.776

31. Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)

32. Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979)

33. Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979)

34. Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980)

35. Mortimer et al., Microbiological Reviews 44, 519 (198 ) 36. Miozzari et al., Journal of Bacteriology 134, 48 (1978)

37. Jones, Genetics 85, 23 (1977)

38. Hitzeman et al., J.Biol.Chem. 255, 12073

(1980) 39. Hess et al., J.Adv.Enzyme Regul.7, 149(1968)" 40. Holland et al., Biochemistry 17, 4900 (1978)

41. Bostian et al., Proe. Nati.Acad.Sei.(USA)

77, 4504 (1980)

42. -The Molecular Biology of Yeast (aug. 11-18, 1981), Cold Spring Harbor.Laboratory, Cold

Spring Harbor, New York.

43. Chambon, Ann.Rev.Biochemistry, 44, 613 (1975) 44. Tissue Culture, Academic Press, Kruse and

Patterson eds.,(1973)

45. Gluzman, Cell 23, 175 (1981)

46. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)

47. Lusky et al., Nature 293, 79. (1981)

48. Gluzman et al., Cold Spring Harbor Symp.

Quant.Biol. 44, 293 (1980)

49. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978)

50. Reddy et al., Science 200, 494 (1978)

51. Crea et al., Nucleic Acids Research 8, 2331

(1980)

52. Goeddel et al., Nature 287, 411 (1980)

53. Gray et al., Nature 295, 503 (1982)

54. Oppermann et al., Virology 108, 47 (1981)

55. Ward et al., J.Virol.. 9, 61 (1972)

56. Aviv et al., Proe.Nati.Acad.Sei.(USA)

69, 1408 (1972) 57. Lehrach et al., Biochemistry 16, 4743(1977)

58. Lynch et al., Virology 98, 251 (1979)

59. Lodish, Am.Rev. of Biochem.45, 40 (1976) 60. Pelham et al., Eur.J.Biochem.43, 247 (1976) 61. Blobel, et al., J.Cell Biology 67,852(1975)

62. Shields et al., J.Biol.Chemistry 253,

3753 (1978)

63. Laemmli, Nature 227;-680 (1970)

64. Bonner et al., Eur.J.Biochem. 46,83 (1974)

65. Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)

66. Wickens et al., J.Biol.Chem. 253, 2483(1978)

67. Chang et al., Nature 275, 617 (1978)

68. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)

69. Grunstein et al., Proe.Nati.Acad.Sei,

USA 72, 3961 (1975)

70. Hanahan et al., Gene 10, 63 (1980)

71. Birnboim et al, Nucleic Acids Res. 7,

1513 (1979)

72. Smith, Methods Enzymol. 65, 499 (1980)

73. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9,

309 (1981)

74. Maxam et al., Methods in Enzymol. 65,

499 (1980)

75. Crea et al., Proe.Nati.Acad.Sei. 75,

5765 (1978)

76. Lawn et al., Cell 15, 1157 (1978)

77. Southern, J.Moi.Biol. 98, 503 (1975)

78. Benton et al., Science 196, 180 (1977)

79. McGrath and Levinson, Nature 295, 423(1976) 80. Blin et al., Nucleic acid Res. 3,2303(1976)

81. Lawn et al., Science 212, 1159 (1981)

82. Fritsch et al., Cell 19, 959 (1980)

83. Tayloer et al., Biochem.Biophys.Acta

442, 324 (1976)

83b Edman et al., European J.Biochem. 1,

80 (1967) 84. Denhardt, Biochem, Biophys.Res.Comm. 23, 641 (1966)

85. Wahl et al., Proe.Nati.Acad.Sei.(USA)

76, 3683 (1979)

86. Davis et al., Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1980) 87. Granelli-Piperno et al, J.Exp.Med. 148, 223. 88. Rijken et al., J.Biol.Chem-. 256, 7035(1981) 89. Sothrup-Jensen et al., Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, vol. 3,

Raven Press, N.Y., p. 191 (1978)

90. Sothrup-Jensen et al., Proe.Nati.Acad.

Sei. IUSA) 72, 2577 (1975) 91. Magnussen et"al., Proteolysis and Physio-logical Regulation, Ribbons et al., Eds.,

Academic Press, New York, p. 203 (1976)

92. Magnussen et al., Proteases and Biological Control, Cold SpringHarbor Laboratory,

N.Y., p. 123 (1975)

93. Miller, Experiments in Molecular Genetics, s. 431-3, Cold Spring Harbor Lab., Cold

Spring Harbor, New York.v(1972)

94. Reich, E., Proteases and Biological Control, (Ibid) p. 333-341 95. Matsuo, 0., et. al., Throm,Haemostasis 45, 225 (1981) 96. Koringer, C, et al., Throm. Haemostasis 46, 561, 662 (1981) 97. Hoylaerts, M., et al., J.Biol.Chem. 257, 2912 (1982) 98. Koringer, C, et-al., Thromb.Haemostasis 46, 685 (1981).

Claims (2)

1. Mikroorganisme eller cellekultur, karakterisert ved at den er transformert med en replikerbar ekspresjonsvektor som kan uttrykke en DNA-sekvens som innbefatter en frekvens som koder for aktivator for menneskeplasminogen, eller ved at den er transformert med plasmidet pARIPA <0> eller pt-PAtrpl2.

2. Mikroorganisme ifølge krav 1, karakterisert ved at den er oppnådd ved transformasjon av en E. coli-stamme.