DK174993B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af humant antithrombin III (ATIII) samt dertil egnede vektorer og værtsceller - Google Patents
Fremgangsmåde til fremstilling af humant antithrombin III (ATIII) samt dertil egnede vektorer og værtsceller Download PDFInfo
- Publication number
- DK174993B1 DK174993B1 DK198703751A DK375187A DK174993B1 DK 174993 B1 DK174993 B1 DK 174993B1 DK 198703751 A DK198703751 A DK 198703751A DK 375187 A DK375187 A DK 375187A DK 174993 B1 DK174993 B1 DK 174993B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- atiii
- vector
- gene
- dhfr
- dhfr gene
- Prior art date
Links
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 title abstract description 35
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 title abstract description 35
- 101000757319 Homo sapiens Antithrombin-III Proteins 0.000 title abstract description 7
- 102000052834 human SERPINC1 Human genes 0.000 title abstract description 4
- 229960004336 human antithrombin iii Drugs 0.000 title abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 claims abstract description 19
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 53
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 5
- 101100278853 Mus musculus Dhfr gene Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 2
- 102100022977 Antithrombin-III Human genes 0.000 claims 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 abstract description 11
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 abstract description 10
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 abstract description 5
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 abstract description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 abstract description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 abstract 1
- 101000641239 Homo sapiens Synaptic vesicular amine transporter Proteins 0.000 description 13
- 102100034333 Synaptic vesicular amine transporter Human genes 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 10
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 6
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 5
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000018932 HSP70 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010027992 HSP70 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101001014059 Homo sapiens Metallothionein-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- -1 hypoxanthine Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8128—Antithrombin III
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
i DK 174993 B1
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af humant antithrombin III (ATIII) samt dertil egnede vektorer og værtsceller.
Fra europæisk patentansøgning med offentliggørelsesnr.
5 0.090.505 er fremstillingen og karakteriseringen af det for ATIII kodende cDNA bekendt, samt fremstillingen af et humant ATIII i E. coli. I denne ansøgning findes der ligeledes anvisninger til, hvordan man kan fremstille ATIII i pattedyrscellekulturer. Som egnet vektor anføres et pBR322-deri-10 vat, som indeholder en markør til selektion i E. coli samt en E. coli-replikationsstart. Vektoren skal endvidere indeholde SV40-replikationsstarten (afledt af et 342bp PvuII-Hindlll-fragment).
Overfor det angår den foreliggende fremgangsmåde en 15 særlig fordelagtig fremgangsmåde, ved hvilken en pattedyrscelle tjener som værtscelle, hvilken celle ikke eller ikke i tilstrækkelig grad kan producere dihydrofolatreduktase, og hvorved denne værtscelle kotransficeres med to ekspressionsvektorer, af hvilke den ene bærer ATIII-genet, og den 20 anden bevirker produktion af dihydrofolatreduktase.
Opfindelsen angår følgelig en fremgangsmåde til fremstilling af humant antithrombin III (ATIII) i pattedyrscellekulturer ved hjælp af en ekspressionsvektor, som indeholder ATIII-cDNA'et, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, 25 at man som pattedyrcelle anvender en dhfr-celle, som kotrans-ficeres med yderligere en vektor, som har et DHFR-gen, der kontrolleres af en svag promotor.
Opfindelsen angår også vektorer og værtsceller egnet til fremgangsmåden.
30 Opfindelsen angår således en ekspressionsvektor med pBR322-sekvenser og ATIII-cDNA’et, som er ejendommelig ved en SV40-promotorsekvens, et SV40-polyadenyleringssted og fravær af "splice sites", og endvidere en vektor med muse-DHFR-genet, som er ejendommelig ved, at DHFR-genet kontrolle-35 res af en svag promotor, og at vektoren ikke indeholder nogen "splice sites".
DK 174993 B1 2
Opfindelsen angår herudover en pattedyrcelle, som er kotransficeret med to vektorer som ovenfor defineret.
Foretrukne udførelsesformer for opfindelsen belyses nedenfor.
5 Kotransfektionssystemet ifølge opfindelsen anvender altså to ekspressionsvektorer, idet den første er en vilkårlig vektor, eksempelvis et pBR322-derivat, i hvilket ATIII-genet på i for sig kendt måde er under kontrol af en i euka-riotiske celler virksom promotor, medens ekspressionen i 10 forbindelse med den anden vektor, som koder for dihydrofolat-reduktasen og dermed også giver mulighed for genamplifika-tion, af DHFR-genet kontrolleres af en DNA-sekvens i pBR322-ori-området.
På tegningen vises i figurerne som eksempler særligt 15 foretrukne udførelsesformer for opfindelsen.
I figur 1 og fortsættelsen deraf, figur la, er beskrevet konstruktionen af vektoren pSVA STOP 1, som indeholder pBR322-EcoRI-PvuII-fragmentet, Hindlll-PvuII-fragmentet med replikationsstarten og promotoren for de tidligere og 20 sene transkripter samt polyadenylierungsstedet fra BamHI-Hpal-fragmentet fra SV40-Genomet og endvidere indeholder translationsstoppet fra plasmidet pUC12 STOP.
I figur 2 vises således indbygningen af den for ATIII kodende DNA-sekvens i vektoren pSVA STOP 1.
25 I figur 3 er beskrevet konstruktionen af vektorerne PMTVAdhfr (som indeholder MMTV-LTR-promotoren) og psvOAdhfr (som ikke har nogen eukariotisk eller viral promotor).
I figur 4 er vist ATIII-ekspressionshastigheden af cellelinier, som hver indeholder en af de to sidstnævnte 30 vektorer, og som fås via en genamplifikation med methotrexat.
Hensigtsmæssigt udstyres ikke kun den første vektor, som indeholder ATIlI-genet, men også den anden vektor med DHFR-gen som pBR322-derivat. Sådanne vektorer har den fordel, at de amplificerer sig i E. coli og samtidig kan anvendes 35 som "pendulvektorer" i eukariotiske celler. Som selektionsmarkør tjener fordelagtigt ampicillinresistensgenet, som DK 174993 B1 3
er indeholdt i EcoRI-PvuII-pBR322-fragmentet. Naturligvis kan andre eller yderligere markører indbygges på i og for sig kendt vis, og uvæsentlige områder kan varieres eller fj ernes. I
5 En yderligere foretrukken udførelsesform for vek torerne består i, at i tilslutning til strukturgenerne følger translationsstop-sekvensen fra pUC12 STOP (M. Broker og E.
Amann, Appl. Microbiol. Biotechnol. 23 (1986) 294-296). På dette DNA-segment befinder der sig translationsstopkodoner 10 for alle tre læserammmer, hvilket tillader ekspressionen af modificerende gener, som ikke har noget eget translationsstopsignal .
Pattedyrceller, som ikke eller ikke i tilstrækkelig grad producerer dihydrofolatreduktase (dhfr), og egnede 15 vektorer, som kan kompensere for denne defekt, er alment kendte (Ernst-L. Vinnacker, Gene und Klone, eine Einfdhrung in die Gentechnologie, VCH Verlagsgesellschaft Weinheim, 1984, s. 267/268, 282,289). Således er eksempelvis beskrevet isoleringen af CHO-cellemutanter, som mangler dihydro-folat-20 reduktase-aktivitet, af G. Urlaub og L.A. Chasin, Proc.
Natl. Acad.Sci. USA 77 (1980), 4216-4220). Man får således cellelinier af dhfr-typen. Analogt kan man ligeledes på reproducerbar måde fremstille andre pattedyrcellelinier.
Mutanterne er tredobbelt auxotrofe og har for at vokse brug 25 for glycin, et purinucleotid, såsom hypoxanthin, og thymidin.
Vektorer, som kan indføre dihydrofolatreduktase-genet i animalske celler, er eksempelvis beskrevet af F. Lee et al., Nature 294 (1981) 288. Hertil gøres der brug af det cDNA, som koder for muse-dihydrofolatreduktase (A.C.Y. Chang 30 et al., nature 275 (1978) 617-624). På analog måde kan andre i animalske celler funktionelle gener for dihydrofolatreduktase anvendes.
Man foretrækker CHO-dhfr-celle/muse-dhfr-gensystemet.
Foretrukne ekspressionsvektorer for ATIII anvender 35 den tidligere promotor fra DNA-området af SV40-replikations-starten, den humane metallothionein-II-promotor (M. Karin DK 174993 B1 4 og R.I. Richards, Nature 299 (1982) 797-802), enhancer-pro-motor-området fra et H immediate early"-gen fra HCMV (human cytemegalovirus, M. Boshart et al., Cell 41 (1985) 521-530), eller Drosophhila heat shock protein 70 (hsp 70)-promotor 5 (Holmgren et al., Cell 18 (1979) 1359-1370). Ekspressionen af dihydrofolatreduktase sker under kontrol af en i pattedyrcellelinien svagt virksom promotor, såsom MMTV-LTR (mouse mammary tunmor virus-long terminal repeat, F. Lee et al., se ovenfor) eller - svarende til en særlig udformning af 10 opfindelsen - også uden eukariotisk eller viral promotor. I det sidstnævnte tilfælde er der umiddelbart foran dhfr-genet indkoblet en DNA-sekvens fra pBR322, som åbenbart i pattedyrceller opfattes som svagere promotor (K.-D. Langner et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 1598-1602).
15 Egnede ekspressionssystemer er ligeledes beskrevet i US-patentskrifterne nr. 4.399.216 og 4.576.821 samt i de europæiske patentansøgninger nr. 0.100.521 og 0.117.058 til 0.117.060.
En yderligere udformning af opfindelsen består i, at 20 der anvendes vektorer, som ikke indeholder nogle introns eller "splice sites". Fordelen ved vektorer uden "splice sites" ligger i, et forkert ("aberrant") splejsning af mRNA for DHFR og det heterologe protein, som kan føre til uønskede fejlagtige genprodukter, udelukkes. Herved forøges effekti-25 viteten af den omhandlede fremgangsmåde yderligere.
Det er kendt, at dihydrofolatreduktasen inhiberes af methotrexat. Celler, som vokser i medier uden glycin, hy-poxanthin og thymidin, hæmmes derfor af methotrexat i deres vækst eller dræbes. Ved at variere methotrexat-koncentrati-30 onen i mediet og celletætheden kan man udvælge celler, som vokser i nærværelse af methotrexat. Disse celler er på grund af en amplifikation af DHFR-generne og en dermed forbundet øget produktion af enzymet DHFR resistente overfor den valgte methotrexat-koncentration. Overlevende celler kan atter 35 udsættes for forøgede methotrexat-koncentrationer, hvilket derpå leder til cellelinier med et endnu højere antal DHFR- gener.
DK 174993 B1 5
Genamplifikationen kan gennemføres ved hjælp at to forskellige fremgangsmåder: 1. Cellerne amplificeres ved hjælp af simple passager 5 i stigende methotrexat-koncentrationer. Herved dannes en genetisk heterolog cellepopulation, hvori der foreligger celler med forskellige amplifikationsgrad.
2. Ved hvert methotrexat-koncentrationstrin isoleres 10 og analyseres genetisk ensartede cellekloner, idet kun de bedst eksprimerende cellelinier fra et trin overføres til det nærmeste højere trin.
Det har vist sig, at genampl i fikat ionen med metho-trexat ved kotransficerede cellelinier ifølge opfindelsen 15 ikke kun fører til en formering af DHFR-generne, men også til en amplifikation af ATIII-genet.
Til formering af animalske celler i kultur anvender man almindeligvis tilstedeværelsen af serum i vækstmediet.
Det har nu vist sig, at man med afbrydelser kan holde ATIII-20 producerende cellelinier i serumholdigt og serumfrit medium, hvorved der over flere passager ikke viser sig noget fald i ATIII-ekspressionhastighederne. Denne udformning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ikke kun fordelagtig fordi man kan spare dyrt serum, men den letter også fraskillelsen 25 af ATIII betydeligt, når det sidste produktionstrin sker uden serum.
Det ifølge opfindelsen tilvejebragte rekombinante ATIII har fuld biologisk aktivitet. Det stimuleres - ligesom naturprodukt isoleret fra humanplasma - af heparin. Det 30 egner sig derfor ligesom det naturlige produkt til fremstilling af lægemidler.
I de følgende eksempler belyses opfindelsen nærmere. Vektorkonstruktionerne anskueliggøres yderligere ved hjælp af figurerne 1-3, idet tegningerne almindeligvis ikke er i 35 korrekt målestoksforhold. Især er små fragmenter og poly-linker-sekvenser som regel angivet ’'udstrakt”.
DK 174993 B1 6
Eksempel 1 a) Konstruktion af en ekspressionvektor for animalske celler.
Plasmidet pSV2dhfr (figur 1) (Lee et al. se ovenfor) 5 skæres med Hindlll og EcoRI, og det 2,65 kb store vektorfragment, som har SV40-"early"-promotoren, isoleres. Til den således forbehandlede vektor ligeres der et 67 bp Hindlll-EcoRI-fragment fra pUC12 STOP (Broker og Amann, se ovenfor) , hvilket fører til dannelse af plasmidet pSV2 STOP. På 10 67 bp-fragmentet af pUC12 STOP befinder der sig translations- stopkodons i alle tre læserammer. pSV2 STOP lineariseres med SacI og den dannede fremspringende 3'-gruppe fjernes ved hjælp af DNA-polymerase I's 3'-*5'-exonukleaseaktivitet.
Derpå fordøjes der med EcoRI. Efter ligering med et 133 bp 15 stort EcoRI-Hpal-fragment fra pBB3 (figur la) (B. Bourachot et al., Embo J. 1 (1982) 895-900), som bærer SV40-polyade-nyleringssignalet for tidligere transkripter, kan man få ekspressionsvektoren pSVA ST0P1.
Polyadenyleringsstedet kan ligeledes isoleres fra 20 vektoren pIG6 (Bourachot et al., se ovenfor). Ligesådan kan man af SV40-genet isolere det 133 bp BamHI-Hpal-fragment, udfylde BamHI-brudstedet og tilføje en EcoRI-1inker.
pSVA ST0P1 har følgelig mellem SV40-,,early,,-prorootoren og SV40-polyadenyleringssignalet fra tidlige transkripter 25 en koningspolylinker med tre singulære restriktionssteder (Hindlll-Sall-Xbal) og en sekvens med translationsstop i alle tre læserammer.
b) Konstruktion af en ATIII-ekspressionsvektor ATIII-cDNA'en er kendt fra EP-A2 0.090.505 og kan
30 fremstilles som der beskrevet eller syntetiseres ved hjælp af gængse fremgangsmåder. I den tyske patentansøgning nr. P
3.618.638.4 er foreslået plasmidet p/3AT6 (figur 1), som indeholder ATIII-cDNA'en i Smal-brudstedet i plasmidet pUC13.
Subkloningsplasmidet ATIII-cDNA, p/9AT6 (figur 2) , 35 lineariseres ved klipning ved det singulære EcoRI-sted. Den fremspringende 5'-gruppe får ved udfyldning af modstrengen DK 174993 B1 7 med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) stumpe ender og ligeres derpå med Sall-linker 5'd(pGGTCGACC)31.
Ved en derpå følgende Xbal-nedbrydning kan man isolere et 5 ca. 1400 bp stort DNA-fragment, som koder for det fuldstændige præ-ATIII. pSVATIII fås ved ligering af dette fragment til den med Sall og Xbal klippede ekspressionsvektor pSVASTOPl. ATIII-transkriptionsenheden på pSVATIII har ikke nogle m-RNA-"splice sites”.
10 c) Udgangspunkt for de til kotransfektion anvendte DHFR-vektorer er plasmidet pMTVdhfr (Lee et al., se ovenfor). pMTVdhfr (figur 3) skæres med Bglll, og de fremspringende 5'-ender i DNA fyldes ud ved hjælp af DNA-polymerase I (Kle-now-fragment). Efter fordøjelse med EcoRI isoleres et 4,47 15 kb stort fragment, og der ligeres med et 133 bp stort EcoRI-Hpal-fragment fra pBB3 (Bourachot et al., se ovenfor). Det nye plasmid pMTVAdhfr bærer muse-DHFR-cDNA * et, flankeret af MMTV-LTR og SV40-polyadenyleringsstedet for tidlige tran-skripter.
20 pSVOAdhfr fås af pMTVAdhfr ved fjernelse af et 1450 bp stort Hindlll-fragment, som bærer MMTV-LTR. Hverken pMTVAdhfr eller pSVOAdhfr har m-RNA-"splice sites".
Eksempel 2 25 Plasmiderne pSVATIII og pMTVAdhfr eller pSVOAdhfr kotransficeres ved hjælp af calciumphosphatpræcipitationsmetoden (Graham og von der Eb, Virology 52 (1973) 456-467) i CHO-dhfr"-celler. 20 μg af plasmidet pSVATIII blandes og kopræcipiteres herved sammen med 5 /ig af DHFR-ekspressions-30 plasmiderne pMTVAdhfr eller pSVOAdhfr. Kopræcipitatet af plasmidblandingen transficeres som ovenfor beskrevet (0,5 x 106 celler i 25 cm* dyrkningskolbe) , i CHO-dhfr“-celler.
EFter 3 dages forløb trypsineres cellerne, overføres til flere 60 mm petriskåle, og der tilsættes selektionsmedium 35 (uden glycin, hypoxanthin og thymidin). Under disse betingelser overlever kun de celler, som er stabilt transficerede 8 DK 174993 B1 med DHFR-genet.
Efter 1-3 ugers forløb bliver kolonier, bestående af transficerede celler, synlige i petriskålene. Følgende transfektionsrater kan herved opnås: 5 pMTVAdhfr 5 x lo”6 pSVOAdhfr 1 x 1θ“5
Enkelte kolonier isoleres og formeres i medium uden glycin, hypoxanthin og thymidin.
Kultursupernatanter fra disse nye cellelinier (CHO 10 SVAT III) testes ved hjælp af specifik ELISA til påvisning af menneskeligt ATIII i rekombinant ATIII. Herved viser det sig, at hver gang 20 % af de afprøvede CHO-dhfr+-celle-linier udskiller påviseligt menneskeligt ATIII for mediet.
For at bestemme ekspressionshastigheden af de linier, der 15 producerer ATIII, kvantitativt, gennemføres følgende standardtestprocedure: 0,5 x 106 celler udplateres i 5 ml medium i 25 cm2 dyrkningskolber. 24 timer efter udskiftes mediet (5 ml). Yderligere 24 timer senere opsamles mediet til ELISA, og cellerne trypsineres og tælles. De angivne værdier er 20 middelværdier for mindst tre passager, hvorved ekspressionshastighederne forbliver konstante indenfor en svingning på ±25 %. Ved alle i det følgende angivne ekspressionshastigheder (pq/io6 celler pr. 24 timer) ligger celleantallet pr.
25 cm2 kolbe ved slutningen af afprøvningen på 1±0,25 x 25 io6 celler. Den følgende oversigt giver ekspressionshas-tighedeme af på den beskrevne måde afprøvende basiskloner: CHO SVAT III-MTVAdhfr Klon 1: 0,14 μg/106 celler/24 t
Klon 2: 0,11 Mg/106 celler/24 t CHO SVAT III-SVOAdhfr Klon 1: 0,08 Mg/106 celler/24 t 30 Klon 2: 0,14 Mg/106 celler/24 t 35 DK 174993 B1 9
Eksempel 3
Amplifikation af de integrerede ATIII-sekvenser a) Amplifikation uden isolering af enkeltkloner CHO SVAT III-MTVAdhfr (klon 1 og 2) og CHO SVAT III-5 SVOAdhfr (klon 1 og 2) omsættes succesivt i stigende metho-trexat-(Mtx)-koncentration. Ved den ovenfor beskrevne standardmetode bestemmes følgende ekspressionshastigheder (μg/106 celler pr. 24 timer):
MtX CHO SVAT III-pMTVAdhfr CHO SVAT III-SVOAdhfr 10 Klon 1 Klon 2 Klon 1 Klon 2 0 0,14 0,11 0,08 0,14 0,05 0,34 0,54 0,15 - 0,60 0,64 2,7 15 0,3 0,55 1,15 - 3,3 0,6 1,18 2,00 0,86 1 - 1,5 5 μΜ - 4,00 - 8,5 20 b) Amplifikation under isolering af enkeltkloner
Som Mtx-koncentrationstrin anvendes 0,1 μΜ og ΙμΜ.
Idet man går ud fra CHO SVAT III-MTVAdhfr (klon 2) isoleres 8 ("BM i figur 4) og idet man udgår fra CHO SVAT III-SVOAdhfr (klon 1) 11 ("A" i figur 4) i forhold til 0,1 μΜ Mtx resi-25 stente kloner og karakteriseres med hensyn til deres ekspressionshastigheder (figur 4); ordinaten viser udbyttet af ATIII i mg/106 celler pr. 24 timer). Alle disse kloner producerer en større mængde ATIII end den tilsvarende udgangsklon (s.o.). Ekspressionshastighederne af de kloner, der 30 vokser ved 0,1 μΜ Mtx, ligger, idet man går ud fra CHO SVAT
III-MTVAdhfr (klon 2) på mellem 0,15 og 0,8 μg pr. 106 celler pr. 24 timer (svarende til en øgning med en faktor 1,4-7), og idet man går ud fra CHO SVAT III-SVOAdhfr (klon 1) , på mellem 0,35 og 3,2 μg pr. 106 celler pr. 24 timer (svarende 35 til en øgning med faktoren 4-40). I "Southern blots" (Southern, J.Mol.Biol. 98 (1975) 503) kan det påvises, at der i DK 174993 B1 10 alle analyserede, ved 0,1 μΝ Mtx voksende kloner amplificeres et specifikt 1400 bp BamHI-Hindlll-fragment fra det trans» ficerede ATIII-cDNA.
Med den bedst producerende, ved 0,1 μΗ Mtx resistente 5 cellelinie (CHO SV AT III-SVOAdbfr, klon 1 A2: 2,2 Mg/106 celler/24 t; indtegnet i figur 4 som "A2") gennemføres yderligere en amplifikationsrunde ved 1 μΜ Mtx. Herved kan man ved atter 9 afprøvede kloner isolere en cellelinie (CHO SVAT III-SVOAdhfr klon 1A27) , som producerer ca. 10 μg pr.
10 106 celler pr. 24 timer.
Eksempel 4
Synthese af ATIII i serumfrit medium CHO SVAT III-SVOAdhfr klon 1 A27 (1 μΜ Mtx) dyrkes i 15 175 cm2 dyrkningskolber i HamF12 selektionsmedium (uden glycin, thymidin og hypoxanthin) i nærværelse af 10 volumen% føtal kalveserum til ca. 80% konfluens, cellerne vaskes derpå med serumfrit Iskoves-medium og holdes derpå i 48 timer i dette medium til produktion af ATIII. Efter dette tidsrum 20 foreligger ATIII i en koncentration på 5-6 μg/ml i mediet. Cellerne holdes derpå i 24-48 timer i det serumholdige medium, indtil der begynder en yderligere 48 timer lang produkt ionssrunde i serumfrit medium. Den beskrevne produktionscyklus kan gentages flere gange uden fald i ATIII-eks-25 pressionshastighederne.
Eksempel 5
Rensning og karakterisering af ATIII fra animalske celler 30 ATIII opkoncentreres ved hjælp af affinitetschromato- grafi på heparin-SEPHAROSE^ (Miller-Anderssen et al., Thromb. Res. 5 (1974) 439-452), såvel fra serumholdigt og fra serumfrit medium. Det opkoncentrerede materiale viser ved immundiffusionstest ifølge Ouchterlony (Prog. Allergy 35 5, (1958) 1) immunologisk identitet med fra humanserum ud vundet ATIII. Også ved "Western blot" med ATIII-specifikke DK 174993 B1 11 antistoffer foreligger der identitet mellem det fra humanplasma og det fra CHO-celler udvundne rekombinante ΑΤΙΪΙ.
Det af CHO-celler udsondrede ΆΤΙΙΙ har både heparin-kofaktor (Hensen og Loeliger, Thromb. Diath. Haemah. (1963) 5 Suppl. i, 18-29) og progressivinhibitoraktivitet (Schrader et al., Årztl. Lab. 29 (1983) 35-39) i fuld udstrækning.
Claims (20)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af humant ant i thrombin III (ATlii) i pattedyrcellekulturer ved hjælp af en 5 ekspressionsvektor, som indeholder ATIII-cDNA'et kendetegnet ved, at man som pattedyrcelle anvender en dhfr'-celle, som kotransf iceres med yderligere en vektor, som har et DHFR-gen, der kontrolleres af en svag promotor.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-10 net ved, at der foran DHFR-genet ikke er koblet nogen eu- kariotisk eller viral promotor.
3. Fremgangsmåde ifølge krav l eller 2, kendetegnet ved, at DHFR-genet forbindes efter pBR322-ori-regionen.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, ken detegnet ved, at DHFR-genet forbindes efter ori-regi-onen i et pBR322-segment, som indeholder en selektionsmarkør.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at selektionsmarkøren er ampicillinresistens- 2. genet.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at der som pBR322-segment anvendes EcoRI-PvuII-fragmentet.
7. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 25 1-6, kendetegnet ved, at ATIII-genet står under kontrol af en viral promotor.
8. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-7, kendetegnet ved, at vektorerne ikke indeholder nogen "splice sites".
9. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-8, kendetegnet ved, at DHFR-genet sammen med ATIII-genet ampiificeres med methotrexat.
10. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-9, kendetegnet ved, at ATIII-produktionen 35 sker i serumfrit medium. DK 174993 B1 13
11. Ekspressionsvektor med pBR322-sekvenser og ATIII-cDNA'et, kendetegnet ved en SV40-promotorsekvens, et SV40-polyadenyleringssted og fraværet af "splice sites".
12. Vektor ifølge krav li, kendetegnet 5 ved, at polyadenyleringsstedet i det væsentlige er det 133 bp store BamHI-Hpal-fragment.
13. Vektor ifølge krav 11 eller 12, kendetegnet ved translationsstopsekvensen fra pUC12 STOP.
14. Plasmiderne pSV2 STOP (figur 1) og pSVA ST0P1 10 (figur la).
15. Plasmidet pSVATIII (figur 2).
16. Vektor med muse-DHFR-genet, kendetegnet ved, at DHFR-genet kontrolleres af en svag promotor, og at vektoren ikke indeholder nogen "splice sites".
17. Vektor ifølge krav 16, kendetegnet ved et SV40-polyadenyleringssted.
18. Plasmiderne pMTVAdhfr og pSVOAdhfr (figur 3).
19. Pattedyrcelle, kotransficeret med en vektor ifølge krav 11-15 og med en vektor ifølge krav 16-18.
20. Celle ifølge krav 19, kendetegnet ved, at den er selektioneret ved hjælp af methotrexat.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3624453 | 1986-07-19 | ||
| DE19863624453 DE3624453A1 (de) | 1986-07-19 | 1986-07-19 | Verfahren zur herstellung von humanem antithrombin iii (atiii), dafuer geeignete vektoren und wirtszellen, so erhaltenes, biologisch aktives atiii und dieses enthaltende arzneimittel |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK375187D0 DK375187D0 (da) | 1987-07-17 |
| DK375187A DK375187A (da) | 1988-01-20 |
| DK174993B1 true DK174993B1 (da) | 2004-04-13 |
Family
ID=6305549
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198703751A DK174993B1 (da) | 1986-07-19 | 1987-07-17 | Fremgangsmåde til fremstilling af humant antithrombin III (ATIII) samt dertil egnede vektorer og værtsceller |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0256302B1 (da) |
| JP (2) | JP2721158B2 (da) |
| AT (1) | ATE85348T1 (da) |
| AU (1) | AU610830B2 (da) |
| CA (1) | CA1305932C (da) |
| DE (2) | DE3624453A1 (da) |
| DK (1) | DK174993B1 (da) |
| ES (1) | ES2053476T3 (da) |
| FI (1) | FI94425C (da) |
| GR (1) | GR3007700T3 (da) |
| PT (1) | PT85346B (da) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03215430A (ja) * | 1990-01-19 | 1991-09-20 | Kita Kiyoshi | 関節腔抗凝固剤 |
| DE3901917A1 (de) * | 1989-01-24 | 1990-07-26 | Behringwerke Ag | Mutanten von humanem antithrombin iii |
| EP1453966B1 (en) * | 2001-11-28 | 2012-07-11 | Sandoz AG | Method for producing a recombinant polypeptide |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS597693B2 (ja) * | 1978-01-07 | 1984-02-20 | 株式会社ミドリ十字 | 抗トロンビン製剤及びその製法 |
| JPS5846100A (ja) * | 1981-09-11 | 1983-03-17 | Agency Of Ind Science & Technol | ３種の遺伝標識を有するプラスミドベクタ−及びその製造方法 |
| EP0090505B1 (en) * | 1982-03-03 | 1990-08-08 | Genentech, Inc. | Human antithrombin iii, dna sequences therefor, expression vehicles and cloning vectors containing such sequences and cell cultures transformed thereby, a process for expressing human antithrombin iii, and pharmaceutical compositions comprising it |
| AU555146B2 (en) * | 1982-03-15 | 1986-09-11 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Method for intorducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products materials |
| IL73854A0 (en) * | 1983-12-27 | 1985-03-31 | Genetics Inst | Vectors containing accessory dna for transformation of eucaryotic cells |
| IL71691A (en) * | 1984-04-27 | 1991-04-15 | Yeda Res & Dev | Production of interferon-ypsilon |
| US4656254A (en) * | 1985-12-02 | 1987-04-07 | Miles Laboratories, Inc. | Method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor and antithrombin III |
-
1986
- 1986-07-19 DE DE19863624453 patent/DE3624453A1/de not_active Withdrawn
-
1987
- 1987-07-11 ES ES87110027T patent/ES2053476T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-11 DE DE8787110027T patent/DE3783968D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-11 AT AT87110027T patent/ATE85348T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-07-11 EP EP87110027A patent/EP0256302B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-16 PT PT85346A patent/PT85346B/pt unknown
- 1987-07-16 FI FI873153A patent/FI94425C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-07-17 DK DK198703751A patent/DK174993B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-07-17 CA CA000542428A patent/CA1305932C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-17 AU AU75773/87A patent/AU610830B2/en not_active Expired
- 1987-07-18 JP JP62179879A patent/JP2721158B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-04-27 GR GR930400430T patent/GR3007700T3/el unknown
-
1996
- 1996-10-16 JP JP8273823A patent/JP2798659B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI873153L (fi) | 1988-01-20 |
| FI94425C (fi) | 1995-09-11 |
| DE3783968D1 (de) | 1993-03-18 |
| ATE85348T1 (de) | 1993-02-15 |
| DE3624453A1 (de) | 1988-01-28 |
| GR3007700T3 (da) | 1993-08-31 |
| JPS6344898A (ja) | 1988-02-25 |
| AU7577387A (en) | 1988-03-03 |
| PT85346A (de) | 1987-08-01 |
| AU610830B2 (en) | 1991-05-30 |
| DK375187D0 (da) | 1987-07-17 |
| FI873153A0 (fi) | 1987-07-16 |
| EP0256302B1 (de) | 1993-02-03 |
| EP0256302A2 (de) | 1988-02-24 |
| FI94425B (fi) | 1995-05-31 |
| CA1305932C (en) | 1992-08-04 |
| ES2053476T3 (es) | 1994-08-01 |
| JPH09117293A (ja) | 1997-05-06 |
| EP0256302A3 (en) | 1989-11-02 |
| JP2798659B2 (ja) | 1998-09-17 |
| DK375187A (da) | 1988-01-20 |
| PT85346B (pt) | 1990-06-29 |
| JP2721158B2 (ja) | 1998-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5789203A (en) | Protein complexes having factor VIII:C activity and production thereof | |
| EP0255231B1 (en) | Human erythropoietin gene: high level expression in stably transfected mammalian cells | |
| CA1285505C (en) | Stable dna constructs containing as selectable markers, genes whose products are essential for normal cell growth on complex media | |
| DE3851289T2 (de) | Verfahren zur Züchtung rekombinanter Zellen. | |
| EP0986644B1 (de) | Herstellung von erythropoietin durch endogene genaktivierung mit viralen promotoren | |
| CA2024607C (en) | Recombinant dna method and host cells | |
| AU656311B2 (en) | Protein complexes having factor VIII:C activity and production thereof | |
| DE69101634T2 (de) | Rekombinant hergestellte blutfaktoren, verfahren zur exprimierung besagter blutfaktoren sowie in besagtem prozess verwendeter rekombinanter vaccina-virus. | |
| JPH0655136B2 (ja) | ヒトエリスロポエチンをコードするｄｎａにより形質転換されている細胞 | |
| CA2162770A1 (en) | Expression plasmid, a fusion protein, a transfected eukaryotic cell line, a method of producing foreign proteins, a foreign protein preparation as well as a pharmaceutical composition | |
| US20060122376A1 (en) | Protein complexes having factor VIII:C activity and production thereof | |
| DK174993B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af humant antithrombin III (ATIII) samt dertil egnede vektorer og værtsceller | |
| CA1224168A (en) | Human growth hormone produced by recombinant dna in mouse cells | |
| ES2719505T3 (es) | Línea altamente productora de fibrinógeno recombinante y método para su producción | |
| KR0136909B1 (ko) | 고발현수준을 갖는 재조합 진핵세포의 제조방법 | |
| JP2826114B2 (ja) | 遺伝子産物の製法 | |
| CA2042005A1 (en) | Plasmids, transformed animal cells and process for producing foreign protein |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |