DK2078085T3

DK2078085T3 - Alleler af prpd1-genet fra coryneforme bakterier

Info

Publication number: DK2078085T3
Application number: DK07821449.1T
Authority: DK
Inventors: Brigitte Bathe; Caroline Kreutzer; Georg Thierbach
Original assignee: Evonik Degussa Gmbh
Priority date: 2006-10-26
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2014-12-01
Also published as: ES2518995T3; DE102006050489A1; BRPI0717983A2; WO2008049769A1; BRPI0717983B1; EP2078085B1; KR101276978B1; KR20090078359A; US20080274265A1; EP2078085A1; US7893231B2; PL2078085T3; US8080395B2; US20110171695A1

Claims

1. Isolerede mutanter af coryneforme bakterier, som indeholder et gen, der koder for et polypeptid med 2-methylcitrat-dehydratase-aktivitet, kendetegnet ved, at polypeptidet på position 272 i den position, der svarer til aminosyresekvensen i SEQ ID N0:2, indeholder L-leucin, eller at polypeptidet omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 2, idet der på position 272 er indeholdt L-leucin.

2. Mutanter af coryneforme bakterier ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det i forbindelse med de coryneforme bakterier drejer sig om en bakterie udvalgt af gruppen Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes og Corynebacterium aminogenes, fortrinsvis om Corynebacterium glutamicum.

3. Mutanter af coryneforme bakterier ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det drejer som om bakterier, der udskiller L-aminosyre, fortrinsvis om bakterier, der udskiller L-lysin, L-valin, L-isoleucin, L-tryptophan eller L-homoserin.

4. Mutanter af coryneforme bakterier ifølge krav 1 til 3, kendetegnet ved, at genet omfatter en nukleotidsekvens, som er identisk med nukleotidsekvensen i et polynukleotid, som er opnåligt ved hjælp af en polymerasekædereaktion (PCR) under anvendelse af DNA udvundet af en coryneform bakterie og under anvendelse af et primerpar bestående af en første primer omfattende i det mindste 15 på hinanden følgende nukleotider udvalgt af nukleotidsekvensen mellem position 1 og 750 i SEQ ID NO:3 eller SEQ ID NO:7 og en anden primer omfattende i det mindste 15 på hinanden følgende nukleotider udvalgt af den komplementære nukleotidsekvens mellem position 3000 og 2245 i SEQ ID NO:3 eller SEQ ID NO: 7, eller at det kodede polypeptid omfatter en aminosyresekvens med en længde svarende til 498 L-aminosyrer, eller at det kodede polypeptid fra position 252 til 291 i aminosyresekvensen indeholder aminosyresekvensen svarende til position 252 til 291 i SEQ ID NO: 6, eller at det kodede polypeptid omfatter en aminosyresekvens, som er i det mindste 90 % identisk med aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 6 og på position 272 indeholder L-leucin, eller at genet omfatter en nukleotidsekvens, som er i det mindste 90 % identisk med nukleotidsekvensen i SEQ ID NO:5.

5. Mutanter af coryneforme bakterier ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det kodede protein omfatter en aminosyresekvens udvalgt af gruppen a) aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO:6, b) aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 6 inklusiv maksimalt 5 konservative aminosyreudskiftninger og c) aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 6 inklusiv maksimalt 5 insertioner eller deletioner af aminosyrer.

6. Mutanter af coryneforme bakterier ifølge krav 4, kendetegnet ved, at genet omfatter nukleotidsekvensen i SEQ ID NO:5 eller SEQ ID NO:7.

7. Et isoleret polynukleotid, som koder for et polypeptid med 2-methylcitrat-dehydratase-enzymaktivitet, som på den position, der svarer til position 272 i aminosyresekvensen i SEQ ID NO:2, indeholder L-leucin, eller som omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO: 2, idet der på position 272 er indeholdt L-leucin.

8. Isoleret polynukleotid ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det kodede polypeptid omfatter en aminosyresekvens med en længde på 498 aminosyrer, eller at det kodede polypeptid fra position 252 til 291 i aminosyresekvensen indeholder aminosyresekvensen svarende til position 252 til 291 i SEQ ID NO: 6, eller at det isolerede polynukleotid er identisk med nukleotidsekvensen i et polynukleotid, som opnås ved hjælp af en polymerasekædereaktion (PCR) under anvendelse af DNA udvundet af en coryneform bakterie og under anvendelse af et primerpar bestående af en første primer omfattende i det mindste 15 på hinanden følgende nukleotider udvalgt af nukleotidsekvensen mellem position 1 og 750 i SEQ ID NO: 3 eller SEQ ID NO:7 og en anden primer omfattende i det mindste 15 på hinanden følgende nukleotider udvalgt af den komplementære nukleotidsekvens mellem position 3000 og 2245 i SEQ ID NO:3 eller SEQ ID NO: 7, eller at det isolerede polynukleotid hybridiserer med den til SEQ ID NO: 5 komplementære nukleotidsekvens under stringente betingelser, eller at det kodede polypeptid omfatter en aminosyresekvens, som er i det mindste 90 % identisk med aminosyresekvensen i SEQ ID NO:6, eller at polynukleotidet omfatter en nukleotidsekvens, som er i det mindste 90 % identisk med nukleotidsekvensen i SEQ ID NO: 5, eller at det kodede protein omfatter en aminosyresekvens udvalgt af gruppen a) aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO:6, b) aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 6 inklusiv maksimalt 5 konservative aminosyreudskiftninger og c) aminosyresekvens ifølge SEQ ID NO: 6 inklusiv maksimalt 5 insertioner eller deletioner af aminosyrer.

9. Isoleret polynukleotid ifølge krav 7 eller 8 kendetegnet ved, at det kodede polypeptid omfatter aminosyresekvensen i SEQ ID NO:6.

10. Isoleret polynukleotid ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det omfatter nukleotidsekvensen SEQ ID NO:5.

11. Et isoleret polynukleotid, som omfatter et nukleinsyremolekyle, som i det mindste koder for en læseramme med en aminosyresekvens svarende til position 252 til 291 i SEQ ID NO:2, idet der på den position, der svarer til position 272 i SEQ ID NO:2, er indeholdt L-leucin.

12. Isoleret polynukleotid ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det i det mindste koder for en læseramme med en aminosyresekvens, der svarer til position 252 til 291 i SEQ ID NO: 6, eller at aminosyresekvensen indeholder en eller flere konservative aminosyreudskiftninger, idet de konservative aminosyreudskiftninger ikke vedrører position 272, eller at det isolerede polynukleotid indeholder en eller flere stille mutationer, eller at det isolerede polynukleotid omfatter i det mindste en nukleotidsekvens svarende til position 1504 til 1623 i SEQ ID NO:7.

13. En rekombinant mikroorganisme, som indeholder det isolerede polynukleotid ifølge krav 7 til 12.

14. Rekombinant mikroorganisme ifølge krav 13, kendetegnet ved, at det drejer sig om en coryneform bakterie eller om en bakterie af slægten Escherichia, fortrinsvis om slægten Corynebacterium og særligt foretrukket om arten Corynebacterium glutamicum.

15. En vektor, som indeholder det isolerede polynukleotid ifølge krav 7 til 12.

16. En rekombinant mikroorganisme, som indeholder vektoren ifølge krav 15.

17. Rekombinant mikroorganisme ifølge krav 16, kendetegnet ved, at det drejer sig om en coryneform bakterie eller om en bakterie af slægten Escherichia, fortrinsvis om slægten Corynebacterium og særligt foretrukket om arten Corynebacterium glutamicum.

18. Fremgangsmåde til fremstilling af L-lysin kendetegnet ved, at man a) fermenterer en isoleret coryneform bakterie i et egnet medie, idet bakterien indeholder i det mindste en kopi af et gen, som koder for et polypeptid med 2-methylcitrat-dehydratase-enzymaktivitet, idet polypeptidet på den position, der svarer til position 272 i aminosyresekvensen i SEQ ID NO:2, indeholder L-leucin, eller idet polypeptidet omfatter den aminosyresekvens i SEQ ID NO: 2, hvor der på position 272 er indeholdt L-leucin, b) og beriger L-aminosyren i fermentationsmassen eller i bakteriernes celler.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, det i forbindelse med den isolerede coryneforme bakterie drejer sig om en mutant ifølge krav 1 til 6 eller om en rekombinant coryneform bakterie, som indeholder et isoleret polynukleotid ifølge krav 7 til 12, eller som fremstilledes under anvendelsen heraf, eller at man isolerer eller samler, fortrinsvis oprenser L-aminosyren.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at man isolerer eller samler L-lysin sammen med bestanddele fra fermentionsmassen og/eller biomassen (> 0 til 100 %) , eller at man a) fra den i trin b) i krav 18 opnåede fermentationsmasse fjerner den dannede biomasse i en mængde på 0 til 100 % og b) fra den i trin a) opnåede masse fremstiller et i det væsentlige tørt og formet produkt ved hjælp af en fremgangsmåde udvalgt af gruppen granulering, kompaktering, spraytørring og ekstrudering.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at man til fermentationsmassen før eller efter trin a) tilsætter en syre udvalgt af gruppen svovlsyre, saltsyre og phosphorsyre, eller at man fra den opnåede masse før eller i trin a) fjerner vand, eller at man påsprøjter det i eller under trin b) opnåede formede produkt med en olie.

22. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at man gennemfører følgende trin a) filtrering af fermentationsmassen, fortrinsvis med et membranfilter, således at der opnås et biomasseholdigt slam og et filtrat, b) opkoncentration af filtratet, fortrinsvis således at der opnås et faststofindhold på 48 til 52 vægt-%, c) granulering af det i trin b) opnåede koncentrat, fortrinsvis ved en temperatur på 50 °C til 62 °C og d) belægning af det i c) opnåede granulat med et eller flere belægningsmidler (coating agent(s)).