ES2178093T5 - Derivados de epotilon y su preparacion. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE DERIVADOS DE EPOTILONA Y DE SU UTILIZACION.

Description

Derivados de epotilón y su preparación.

El presente invento se refiere a un procedimiento para la preparación de un derivado de epotilón de la Fórmula general 7 seguidamente representada

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1

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En la precedente Fórmula 7 significan:

R =

H o alquilo C_{1-4};

R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} =

H, alquilo C_{1-6},

\quad

acilo C_{1-6},

\quad

benzoílo,

\quad

tri-alquil C_{1-4}-sililo,

\quad

bencilo, o

\quad

fenilo, pudiendo el bencilo y el fenilo

\quad

ser bencilo o respectivamente fenilo sustituido con alcoxi C_{1-6}, alquilo C_{6}, hidroxi y halógeno;

y realizándose, en el caso de los grupos alquilo y acilo contenidos en los radicales, que se trata de radicales lineales o ramificados; y

formando Y y Z o bien en común el átomo de O de un epóxido, o uno de los enlaces C-C de un doble enlace C=C,

realizándose que a un epotilón del tipo A, B, C ó D, o a sus derivados protegidos con OH en posición 3 o en posición 7, en los cuales en forma de su lactona de acuerdo con la precedente Fórmula general 7

R = H o alquilo C_{1-4}, R^{3} y R^{4} = H, alquilo C_{1-6}, acilo C_{1-6}, benzoílo, tri-alquil C_{1-4}-sililo, bencilo o fenilo, pudiendo el bencilo y el fenilo estar sustituidos con alcoxi C_{1-6}, alquilo C_{6}, hidroxi y halógeno; y tratándose, en los casos de los grupos alquilo o respectivamente acilo contenidos en los radicales, de radicales lineales o ramificados; y formando Y y Z o bien en común el átomo de O de un epóxido, o uno de los enlaces C-C de un doble enlace C=C,

se le(s) somete a una hidrólisis en condiciones básicas, p. ej. con NaOH en el seno de MeOH o de una mezcla de MeOH y agua, o a una hidrólisis enzimática, en particular con esterasas o lipasas.

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El presente invento se refiere además a derivados de epotilón de la Fórmula general 7 seguidamente representada

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2

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En la precedente Fórmula 7 significan::

R =

H o alquilo C_{1-4};

R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} =

H, alquilo C_{1-6},

\quad

acilo C_{1-6},

\quad

benzoílo,

\quad

tri-alquil C_{1-4}-sililo,

\quad

bencilo, o

\quad

fenilo, pudiendo el bencilo y el fenilo

\quad

ser bencilo o respectivamente fenilo sustituido con alcoxi C_{1-6}, alquilo C_{6}, hidroxi y halógeno;

y realizándose, en el caso de los grupos alquilo y acilo contenidos en los radicales, que se trata de radicales lineales o ramificados; y

formando Y y Z o bien en común el átomo de O de un epóxido, o uno de los enlaces C-C de un doble enlace C=C.

El presente invento se refiere además a un procedimiento para la preparación de un derivado de epotilón de la Fórmula 1

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3

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En la precedente Fórmula 1 significan::

R =

H o alquilo C_{1-4};

R^{1}, R^{2}, R^{3}, R^{4} =

H, alquilo C_{1-6},

\quad

acilo C_{1-6},

\quad

benzoílo,

\quad

tri-alquil C_{1-4}-sililo,

\quad

bencilo, o

\quad

fenilo, pudiendo el bencilo y el fenilo

\quad

ser bencilo o respectivamente fenilo sustituido con alcoxi C_{1-6}, alquilo C_{6}, hidroxi y halógeno;

y realizándose, en el caso de los grupos alquilo y acilo contenidos en los radicales, que se trata de radicales lineales o ramificados; y

formando Y y Z o bien en común el átomo de O de un epóxido, o uno de los enlaces C-C de un doble enlace C=C,

transformando a un compuesto de la Fórmula 7 en un compuesto de la Fórmula 1 por lactonización de acuerdo con los métodos de Yamaguchi (con una mezcla de cloruro de tricloro-benzoílo y DMAP), de Corey (con una mezcla de aldritiol y trifenil-fosfina) o de Kellog (con una mezcla de un ácido omega-bromo-carboxílico y carbonato de cesio) en un compuesto de la Fórmula 1. Métodos de trabajo oportunos se encuentran en las citas de Inanaga y colaboradores en Bull. Chem. Soc. Japan, 52 (1979) 1989; de Corey y Nicolaou en J. Am. Chem. Soc., 96 (1974) 5.614; y de Kruizinga y Kellogg en J. Am. Chem. Soc., 103 (1981) 5.183.

Para la preparación de los compuestos conformes al invento se puede partir por lo tanto también de epotilón C ó D, pudiéndose remitir para la derivatización a los métodos de derivatización seguidamente descritos. En tal caso, se puede hidrogenar selectivamente el doble enlace en posición 12,13, por ejemplo con dimetil-dioxirano o con un perácido.

Acerca de los epotilones A y B se remitirá al documento de solicitud de patente alemana DE-A-41 38 042.

El invento se explica y describe con mayor detalle a continuación mediante la descripción de algunos Ejemplos de realización selectos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Compuesto 7a

20 mg (0,041 mmol) de epotilón se disuelven en 0,5 ml de metanol, se mezclan con 0,5 ml de una solución 1 N de hidróxido de sodio y se agitan a la temperatura ambiente durante 5 minutos.

Para el tratamiento, la mezcla de reacción se reúne con un tampón fosfato 1 M de pH 7 y la fase acuosa se extrae cuatro veces con acetato de etilo. Las fases orgánicas reunidas se lavan con una solución saturada de cloruro de sodio, se secan sobre sulfato de sodio y se ponen en libertad con respecto del disolvente. La purificación del producto bruto se efectúa con ayuda de la cromatografía preparativa en capas (agente eluyente: mezcla de diclorometano y metanol, 85 : 15).

Rendimiento: 11 mg (52%)

R_{f} (en una mezcla de diclorometano y metanol, 85 : 15): 0,92

IR (película): ny =

3438 (s, ancho, hombro), 2971 (vs, ancho, hombro), 1703 (vs), 1507 (m), 1460 (s, hombro), 1383 (m, hombro), 1254 (w), 1190 (w, ancho, hombro), 1011 (w, ancho, hombro), 866 (w, ancho), 729 (s) cm^{-1}

MS (20/70 eV): m/e (%) = 423 (0,1 [M^{+}]), 323 (4), 168 (89), 140 (100), 85 (31), 57 (67).

Alta resolución: C_{23}H_{37}O_{4}NS calculado:

423,2443 para [M^{+}]

encontrado:

423,2410

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Ejemplo 2

Compuesto 7b

5 mg (0,009 mmol) de 7-O-acetil-epotilón se disuelven en 1 ml de metanol, se mezclan con 200 \mul de una solución amoniacal de metanol (2 mmol) de NH_{3}/ml de metanol) y se agitan a 50ºC durante dos días. Para el tratamiento, el disolvente se elimina en vacío. La purificación del producto bruto se efectúa con ayuda de la cromatografía preparativa de capas (agente eluyente: mezcla de tolueno y metanol 90 : 10).

Rendimiento: 3 mg (59%)

R_{f} (mezcla de diclorometano y metanol, 90:10): 0,63

IR (película): ny =

3441 (m, ancho, hombro), 2946 (s, hombro), 1732 (vs) 1600 (w), 1451 (m), 1375 (m), 1246 (s, ancho, hombro), 1013 (m, ancho, hombro) cm^{-1}

UV (metanol): lambda_{max} (log épsilon) = 211 (3,75), 247 (3,59) nm,

MS 20/70 eV): m/e:

567 (1 [M^{+}]), 465 (4), 422 (7), 388 (5), 194 (5), 182 (7), 168 (65), 164 (17), 140 (100), 97 (10), 71 (22), 43 (27).

Alta resolución: C_{29}H_{45}O_{8}NS calculado:

567,2866 para [M^{+}]

encontrado:

567,2849

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Ejemplo 3

50 mg de epotilón A se disuelven en 20 \mul de dimetil-sulfóxido y se diluyen con 30 ml de un tampón de fosfato (de pH 7,1, 30 mM). Después de haber añadido 5 mg de esterasa de hígado porcino (de la entidad Boehringer Mannheim) se agita a 30ºC durante 2 días. Se acidifica con HCl 2 N a un pH de 5 y se extrae el ácido epotilónico 7 con acetato de etilo. La fase orgánica se seca con sulfato de sodio, y se concentra hasta sequedad por evaporación en vacío. Rendimiento: 48 mg (96%).

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Ejemplo 4

48 mg del ácido epotilónico 7 se disuelven en 6 ml de THF absoluto y mediando agitación se reúnen con 40 \mul de trietil-amina y 16 \mul de cloruro de 2,4,6-tricloro-benzoílo. Después de 15 min se separa del precipitado por filtración y en el transcurso de 15 min se añaden gota a gota mediando rápida agitación a una solución hirviendo de 20 mg de 4-dimetilamino-piridina (DMAP) en 200 ml de tolueno. Después de 10 min adicionales, se concentra por evaporación en vacío y el residuo se reparte entre acetato de etilo y un tampón de citrato (de pH 4). El residuo de concentración por evaporación de la fase orgánica proporciona, después de separación por una HPLC preparativa, 15 mg de epotilón A.

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Ejemplo 5

Epotilones C y D como compuestos de partida A. La cepa de producción y las condiciones de cultivación son correspondientes a la patente de base de los epotilones B. Producción con DSM 6773

75 l del cultivo se hacen crecer como se describe en la patente de base y se utilizan para la inoculación de un fermentador de producción con 700 l de un medio de producción a base de 0,8% de un almidón, 0,2% de glucosa, 0,2% de harina de soja, 0,2% de un extracto de levadura, 0,1% de CaCl_{2} x 2H_{2}O, 0,1% de MgSO_{4} x 7H_{2}O, 8 mg/l de Fe-EDTA, pH = 7,4, y opcionalmente 15 l de la resina adsorbente Amberlite XAD-16. La fermentación dura 7 - 10 días a 30ºC, la aireación se efectúa con 2 m^{3} de aire/h. Por regulación del número de revoluciones, el pO_{2} se mantiene en un 30%.

C. Aislamiento

La resina adsorbente se separa del cultivo con un filtro de tratamiento de 0,7 m^{2} y malla 100, y por lavado con 3 volúmenes de lecho de una mezcla de agua y metanol 2 : 1 se libera de sustancias acompañantes polares. Por elución con 4 volúmenes de lecho de metanol, se obtiene un extracto bruto, que se concentra por evaporación en vacío hasta la aparición de la fase de agua. Ésta se extrae tres veces con el mismo volumen de acetato de etilo. La concentración por evaporación de la fase orgánica proporciona 240 g de un extracto bruto, que se reparte entre metanol y heptano, a fin de separar las sustancias acompañantes lipófilas. A partir de la fase de metanol se obtienen, mediante concentración por evaporación en vacío, 180 g de un material refinado, que se fracciona en tres porciones a través de Sephadex LH-20 (columna de 20 x 100 cm, con 20 ml/min de metanol). Los epotilones están contenidos en la fracción, en total de 72 g, eluida con unos tiempos de retención de 240 - 300 min. Para la separación de los epotilones se cromatografía en tres porciones de presencia de Lichrosorb RP-18 (15 \mum, columna de 10 x 40 cm, agente eluyente 180 ml/min con una mezcla de metanol y agua 65:35). Después de los epotilones A y B se eluyen con R_{t} = 90-95 min el epotilón C y con R_{t} = 100-110 min el epotilón D, y después de haber concentrado por evaporación en vacío se obtienen como aceites incoloros en un rendimiento en cada caso de 0,3 g

D. Propiedades físicas

4

Epotilón C

R = H

Epotilón D

R = CH_{3}

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Epotilón C

C_{26}H_{39}NO_{5}S [477]

ESI-MS: (iones positivos): 478,5 para [M+H]^{+}

Para ^{1}H y ^{13}C véase la Tabla de NMR (Resonancia magnética nuclear)

DC (cromatografía de capa fina):R_{f} = 0,82

Hoja de aluminio para DC DC-Alufolie 60 F 254 Merck,

Agente eluyente: mezcla de diclorometano y metanol = 9:1.

Detección:

Extinción de UV a 254 nm. Rociado con un reactivo de vainillina y ácido sulfúrico, coloración de gris azulado al calentar a 120ºC.

HPLC (cromatografía de líquido de alto rendimiento): R_{t} = 11,5 min

Columna: Nucleosil 100 C-18 7 \mum, 125 x 4 mm

Agente eluyente: mezcla de metanol y agua = 65 : 35

Caudal: 1 ml/min

Detección: con un conjunto de diodos

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Epotilón D

C_{27}H_{41}NO_{5}S [491]

ESI-MS: (iones positivos): 492,5 para [M+H]^{+}

Para ^{1}H y ^{13}C véase la Tabla de NMR

DC: R_{f} = 0,82

DC-Alufolie 60 F 254 Merck, agente eluyente: mezcla de diclorometano y metanol = 9:1

Detección:

Extinción de UV a 254 nm. Rociado con un reactivo de vainillina y ácido sulfúrico, coloración de gris azulado al calentar a 120ºC.

HPLC: R_{t} = 15,3 min

Columna: Nucleosil 100 C-18 7 \mum, 125 x 4 mm

Agente eluyente: mezcla de metanol y agua = 65:35

Caudal: 1 ml/min

Detección: con un conjunto de diodos

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TABLA Datos de ^{1}H- y ^{13}C-NMR de epotilón C y epotilón D en [D_{6}]DMSO a 300 MHz

5

Claims (5)

1. Procedimiento para la preparación de un derivado de epotilón de la Fórmula 7

6

significando R = H o alquilo C_{1}, y R^{1}, R^{2},R^{3} y R^{4} = H, alquilo C_{1-6}, acilo C_{1-6}, benzoílo, tri-alquil-C_{1-4}-sililo, bencilo o fenilo, pudiendo el bencilo y el fenilo estar sustituidos con alcoxi C_{1-6}, alquilo C_{6}, hidroxi y halógeno, y realizándose, en el caso de los grupos alquilo y acilo contenidos en los radicales, que se trata de radicales lineales o ramificados; y formando Y y Z o bien en común el átomo de O de un epóxido, o uno de los enlaces C-C de un doble enlace C=C,

caracterizado porque un epotilón del tipo A, B, C ó D, o sus derivados protegidos con OH en posición 3 o en posición 7, en los cuales en forma de su lactona de acuerdo con la precedente Fórmula general 7 R = H o alquilo C_{1}, R^{3} y R^{4} = H, alquilo C_{1-6}, acilo C_{1-6}, benzoílo, tri-alquil C_{1-4}-sililo, bencilo o fenilo, pudiendo el bencilo y el fenilo estar sustituidos con alcoxi C_{1-6}, alquilo C_{6}, hidroxi y halógeno; y tratándose, en los casos de los grupos alquilo o respectivamente acilo contenidos en los radicales, de radicales lineales o ramificados, y formando Y y Z o bien en común el átomo de O de un epóxido, o uno de los enlaces C-C de un doble enlace C=C,

(a)

se hidrolizan enzimáticamente o

(b)

se hidrolizan en un medio alcalino,

y el derivado de epotilón de la Fórmula 7 se obtiene y aísla.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se hidroliza con una esterasa o lipasa y el derivado de epotilón de la Fórmula 7 se obtiene y aísla.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se hidroliza con hidróxido de sodio en el seno de una mezcla de metanol y agua, y el derivado de epotilón de la Fórmula 7 se obtiene y aísla.

4. Derivado de epotilón de la Fórmula 7

7

significando R = H o alquilo C_{1}, y R^{1}, R^{2},R^{3} y R^{4} = H, alquilo C_{1-6}, acilo C_{1-6}, benzoílo, tri-alquil-C_{1-4}-sililo, bencilo o fenilo, pudiendo el bencilo y el fenilo estar sustituidos con alcoxi C_{1-6}, alquilo C_{6}, hidroxi y halógeno, y realizándose, en el caso de los grupos alquilo y acilo contenidos en los radicales, que se trata de radicales lineales o ramificados; y formando Y y Z o bien en común el átomo de O de un epóxido, o uno de los enlaces C-C de un doble enlace C=C.

5. Procedimiento para la preparación de un derivado de epotilón de la Fórmula 1

8

significando R = H o alquilo C_{1}, y R^{1} y R^{2} = H, alquilo C_{1-6}, acilo C_{1-6}, benzoílo, tri-alquil-C_{1-4}-sililo, bencilo o fenilo, pudiendo el bencilo y el fenilo estar sustituidos con alcoxi C_{1-6}, alquilo C_{6}, hidroxi y halógeno, y realizándose, en el caso de los grupos alquilo y acilo contenidos en los radicales, que se trata de radicales lineales o ramificados; y formando Y y Z o bien en común el átomo de O de un epóxido, o uno de los enlaces C-C de un doble enlace C=C,

caracterizado porque un derivado de epotilón de la Fórmula 7 de acuerdo con la reivindicación 4 o como producto del procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 3, se lactoniza

(a)

de acuerdo con el método de Yamaguchi o

(b)

de acuerdo con el método de Corey o

(c)

de acuerdo con el método de Kellog,

y de esta manera se transforma en el derivado de epotilón de la Fórmula 1, y este producto de transformación se aísla.