ES2191103T5

ES2191103T5 - Procedimientos de prevencion o de tratamiento de alergia.

Info

Publication number: ES2191103T5
Application number: ES96918707T
Authority: ES
Inventors: Erika Isolauri; Leena Metsaniitty; Hannu Korhonen; Seppo Salminen; Eeva-Liisa Syvaoja
Original assignee: Valio Oy
Current assignee: Valio Oy
Priority date: 1995-06-14
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 2009-11-03
Anticipated expiration: 2016-06-12
Also published as: EP0833649B1; ES2191103T3; CN1187772A; DE69625690T2; EE9700339A; CA2224320C; DK0833649T4; HK1010081A1; US6506380B1; AU6127896A; KR100494741B1; NO321504B1; ZA965088B; US20030113340A1; US7172756B2; KR19990022914A; EE03424B1; MY113912A; SK284245B6; SK171597A3

Abstract

LA INVENCION ACTUAL SE REFIERE A METODOS Y MEDIOS DE SUPRIMIR LAS REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD INDUCIDAS POR ALIMENTOS EN ENFERMOS QUE PADECEN ALERGIA ALIMENTARIA. EN PARTICULAR, LA INVENCION PROPORCIONA METODOS DE FABRICAR UNA FORMULA DE HIDROLIZADO DE PROTEINAS PARA LA REGULACION NEGATIVA DE REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD Y PARA LA PROMOCION DE LA BARRERA INMUNITARIA INTESTINAL, Y METODOS DE PREVENCION O TRATAMIENTO DE LAS ALERGIAS, ESPECIALMENTE LA ALERGIA A LA LECHE DE VACA EN LOS LACTANTES, AL REFORZAR LA ELIMINACION DE LA LECHE DE VACA DE LA DIETA POR MEDIO DE LAS ADECUADAS BACTERIAS PROBIOTICAS DERIVADAS DEL TRACTO GASTROINTESTINAL, FUNDAMENTALMENTE LACTOBACILOS. ADEMAS, AL ADMINISTRAR FRAGMENTOS DE UN ALERGENO MODIFICADO POR LAS BACTERIAS GASTROINTESTINALES, PUEDE LOGRARSE QUE LA RESPUESTA INMUNITARIA REVIERTA DESDE LA SENSIBILIZACION A LA HIPORREACTIVIDAD SISTEMICA. UNA BACTERIA DE USO PREFERENTE EN ESTA INVENCION ES LACTOBACILLUS GG (ATCC 53103).

Description

Procedimientos de prevención o de tratamiento de alergia.

Fórmulas de hidrolizados de proteínas para prevenir o tratar alergias y métodos y preparación y uso de las mismas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para la preparación de fórmulas de hidrolizados de proteínas para suprimir las reacciones de hipersensibilidad inducidas por alimentos en pacientes que padecen alergias alimentarias. Particularmente la invención proporciona el uso de los productos hidrolizados para la preparación de fórmulas farmacéuticamente activas para la prevención o tratamiento de alergias especialmente la alergia a la leche de vaca en niños. La invención también se refiere al desarrollo de fórmulas específicas para niños alérgicos con función de la barrera intestinal deteriorada.

La alergia a la leche de vaca (CMA) se define como una reacción adversa con mediación inmunitaria a las proteínas de leche de vaca. El presente tratamiento de elección es la eliminación completa de los antígenos de la leche de vaca. En niños con CMA, es necesario usar una fórmula de substitución cuando no se puede obtener leche humana. Las fórmulas hidrolizadas, basadas en el suero derivado de leche de vaca o caseína, son usadas para proveer nutrición adecuada con una carga de antígenos reducida. El tratamiento térmico preliminar de la leche de vaca afecta principalmente la conformación de proteínas y facilita su hidrólisis. La hidrólisis enzimática subsiguiente con pepsina, tripsina, extractos pancreáticos y extractos de la mucosa intestinal provoca la destrucción progresiva de los epitopes secuenciales y mejora la fórmula a la forma menos antigénica y alergénica.

En la mayoría de los casos, las fórmulas derivadas de leche de vaca ampliamente hidrolizada pueden ser introducidas en forma segura y éstas son eficientes y clínica y metabólicamente bien toleradas. La hidrólisis enzimática, sin embargo, no hace necesariamente a la fórmula no alergénica, ya que la extensión óptima de hidrólisis no es conocida y vestigios de la proteína original son detectados en el hidrolizado. Por lo tanto, la administración de estos substitutos a los niños con alergia a la leche de vaca debe ser cuidadosa.

La propuesta para controlar la inflamación alérgica por eliminación de antígenos no ha sido satisfactoria, particularmente en pacientes con múltiples alergias a los alimentos (Sampson y col., 1992). Estos pacientes muestran frecuentemente una permeabilidad intestinal aumentada y disfunción de la barrera de defensa intestinal (Majamaa y col., 1996, Majamaa e Isolauri, 1996). Esto aumenta el riesgo para los trastornos del crecimiento y sensibilidad a múltiples alimentos. Se requieren urgentemente nuevas propuestas para el tratamiento de alergia a la leche de vaca para mejorar las fórmulas substitutas en la CMA.

La manipulación de antígenos intestinales determina una respuesta inmunitaria subsiguiente al antígeno. En salud, los antígenos son absorbidos a través del epitelio a lo largo de dos caminos funcionales. El camino principal es degradativo reduciendo la inmunogenicidad del antígeno. Un camino menor permite el transporte de proteínas intactas que es crucial para respuestas inmunitarias antígeno-específicas. La absorción de antígenos aberrante aumenta el proceso de sensibilización (Fargeas y col., 1995).

La producción diferencial de citokinas por células T-helper (Th) durante una reacción inmunitaria tiene importantes efectos regulatorios sobre la naturaleza de la respuesta inmunitaria. El perfil de citokina de la respuesta inmunitaria natural determina el fenotipo de la respuesta inmunitaria específica subsiguiente. Aparte de controlar la síntesis de IgE, la IL-4 es crucial para el desarrollo y la maduración del fenotipo Th2, caracterizado por inflamación alérgica.

Este procedimiento parece crucial para el desarrollo de tolerancia a la proteína ingerida. La tolerancia oral es un estado de no-reactividad sistémica antígeno-específico caracterizado por la respuesta IgA antígeno-específico local.

Una cepa intestinal humana aislada, la cepa Lactobacillus GG (Lactobacillus GG, ATCC 53103) ha demostrado recientemente promover respuestas IgA locales contra antígenos dietarios encontrados por la vía enteral y puede por lo tanto ayudar a la eliminación inmunitaria (Isolauri y col., 1993). No se sabe hasta ahora si cepas particulares de bacterias intestinales podrían modificar directamente la inmunogenicidad de los antígenos de los alimentos y en consecuencia disminuir las reacciones de hipersensibilidad.

Los lactobacilos están incluidos en la flora microbiana de los intestinos sanos. Se ha supuesto que los lactobacilos actúan en el tracto intestinal compitiendo por los receptores y nutrientes contra los microbios patógenos en la mucosa intestinal.

Los probióticos son preparaciones microbianas viables que promueven la salud manteniendo la microflora natural en el intestino. Una preparación microbiana puede ser reconocida como probiótica si se conocen los microbios que actúan de la misma y su modo de acción. Los probióticos se adhieren a la mucosa intestinal, colonizan el tracto intestinal humano y previenen la adherencia de microbios perjudiciales. Una presunción crucial es que llegan a la mucosa del intestino y no son destruidos en la parte superior del tracto gastrointestinal. El Lactobacillus GG es una de las bacterias conocidas que tienen características probióticas.

Descripción de la invención

Los presentes inventores han hallado ahora que ciertas bacterias del tracto gastrointestinal, especialmente las bacterias que tienen características probióticas, y especialmente los Lactobacilos que tienen características de adhesividad y colonización y un sistema de enzima proteasa que son similares a los de la cepa Lactobacillus GG (ATCC 53103) pueden ser usadas para aumentar la eficacia de las dietas de eliminación y mejorar la tolerancia oral, para prevenir o tratar las reacciones de hipersensibilidad inducida por alimento en un paciente.

Un aspecto de la invención es que los hidrolizados de proteína obtenidos por hidrólisis de proteínas con las bacterias gastrointestinales arriba mencionadas también pueden ser usadas para tal propósito. Mostramos aquí que los hidrolizados de proteínas obtenidos de acuerdo con esta invención tienen una hipoalergenicidad que promueve el efecto inmunológico. Los hidrolizados disminuyen las reacciones de hipersensibilidad promoviendo así la función barrera inmunitaria del intestino, es decir, estabilizando la barrera mucosa del intestino.

La presente invención proporciona una fórmula de hidrolizado de proteínas mejorada que disminuye las reacciones de hipersensibilidad y promueve la función barrera inmunitaria del intestino. La fórmula de hidrolizado se puede obtener hidrolizando proteínas con enzimas derivadas de la cepa Lactobacillus GG (ATCC 53103) y con tripsina y/o pepsina. El método de preparación de la fórmula de hidrolizado de proteínas es también un objeto de la invención.

Alternativamente, una fórmula de hidrolizado de proteínas de la invención puede ser obtenida hidrolizando proteínas con tripsina y/o pepsina, y agregando al hidrolizado así obtenido una preparación bacteriana que comprende bacterias de la cepa Lactobacillus GG (ATCC 53103). El método de preparación de la fórmula de hidrolizado de proteínas es también un objeto de la invención. Las bacterias se agregan a la fórmula de hidrolizado preferentemente como una preparación liofilizada.

Cuando se administra tal fórmula de hidrolizado a un paciente, se espera que las enzimas que hidrolizan las bacterias presentes sean liberadas in vivo, por lo que se alcanza el mismo efecto que con la fórmula de hidrolizado mejorada como se definió más arriba. Además, las bacterias viables estabilizan la barrera mucosa del intestino aumentando la defensa local.

La presente invención también se dirige al uso de la fórmula de hidrolizado de proteínas mejorado de la invención, o alternativamente una fórmula de hidrolizado de proteínas junto con una preparación bacteriana que comprende la cepa Lactobacillus GG (ATCC 53103) para la manufactura de una fórmula farmacéuticamente activa para la prevención o tratamiento de las reacciones de hipersensibilidad inducidas por alimentos en un niño con riesgo.

La invención se dirige adicionalmente al uso de la fórmula de hidrolizado de proteínas mejorado de la invención o, alternativamente de una fórmula de hidrolizado de proteína junto con una preparación bacteriana que comprende la cepa Lactobacillus GG (ATCC 53103) para la manufactura de una fórmula farmacéuticamente activa para el tratamiento de la alergia a la leche de vaca en un paciente.

La invención también proporciona el uso de la fórmula de hidrolizado de proteína mejorada de la invención en un paciente o, alternativamente, de una preparación bacteriana que comprende la cepa Lactobacillus GG (ATCC 53103), o, alternativamente, de una fórmula de hidrolizado de proteínas, junto con una preparación bacteriana que comprende la cepa Lactobacillus GG (ATCC 53103) para la preparación de una fórmula farmacéuticamente activa destinada a ser administrada oralmente para promover respuestas inmunitarias tolerogénicas a los antígenos de los alimentos en un paciente.

En los usos de la invención, como se definieron más arriba, cuando se usa una fórmula de hidrolizado de proteína en combinación con Lactobacillus GG (ATCC 53103), tal fórmula puede ser cualquier fórmula de hidrolizado de proteínas adecuada, conocida o nueva. Puede ser por lo tanto un hidrolizado de proteínas parcial, o alternativamente una fórmula ampliamente hidrolizada. La preparación de un hidrolizado de proteínas adecuado para ese propósito se revela, por ejemplo, en la solicitud de Patente Europea nº 601.802.

La cepa Lactobacillus GG (ATCC 53103) y sus características de adherencia y de colonización están descritas en la Patente Europea nº 199.535.

Abreviaturas

CI: intervalo de confianza

IFN-\gamma: Interferon-\gamma

IgA: Inmunoglobulina A

IgE: Inmunoglobulina E

IL-4: Interleucina-4

LGG: Lactobacillus GG (ATCC 53103)

OKT3: anticuerpo anti-CD3

PBMC: Células mononucleares de la sangre periférica

TNF-\alpha: factor de necrosis tumoral \alpha

WF: grupo de prueba que recibe la fórmula de suero ampliamente hidrolizada

WF-GG: grupo de prueba que recibe la fórmula de suero ampliamente hidrolizada y preparación con LGG

P/T-caseína =: caseína hidrolizada por pepsina y tripsina

P/T-\alpha_{s1}-caseína =: \alpha_{s1}-caseína hidrolizada por pepsina y tripsina

\vskip1.000000\baselineskip

Fig. 1A-1D. Respuestas proliferativas inducidas por mitógeno de PBMCs in vitro a P/T-caseína (1A), P/T-\alpha_{S1}-caseína (1B), P/T-caseína adicionalmente hidrolizada con enzimas derivadas de LGG (1C) y P/T-\alpha_{s1}-caseína adicionalmente hidrolizada con enzimas derivados de LGG (1D). Los resultados son expresados como recuentos promedio por minuto para cultivos sin producto hidrolizado (PRA-RPMI 1640) y con producto hidrolizado en tres concentraciones (0,1, 10 y 1000 \mug/ml). Las líneas horizontales representan la media geométrica de recuentos por minuto de seis experimentos, enumerados en forma igual para cada individuo.

Fig. 2. El resultado clínico de la dermatitis atópica (SCORAD), en cada paciente y el resultado promedio para la extensión (A), intensidad (B) y resultados subjetivos (C) para la dermatitis atópica antes del tratamiento (0) y un mes más tarde (I) en niños que reciben la fórmula de suero ampliamente hidrolizado sin (WF) o la misma con Lactobacillus GG (WF-GG).

Fig. 3. El efecto de la caseína y la caseína degradada con Lactobacillus GG en la producción de IL-4 e IFN-\gamma por PBMC en pacientes atópicos (a, b) y en niños sanos no atópicos (c, d). Las columnas blancas representan la producción media de citokina en cultivos control; las columnas negras, en cultivos que contienen caseína purificada; y las columnas sombreadas; en cultivos que contienen caseína degradada con Lactobacillus GG. La intersección de líneas representa los cuartiles superiores e inferiores. Comparación de a pares estadísticamente significativa para cultivos control.

Fig. 4. El efecto de \alpha_{s1}-caseína y la \alpha_{s1}-caseína degradada por Lactobacillus GG sobre la producción de IL-4 e IFN-\gamma por PBMC en pacientes atópicos (a, b) y en niños sanos no atópicos (c, d). Las columnas blancas representan la producción de citokina media en cultivos control; las columnas negras, en cultivos que contienen \alpha_{s1}-caseína; y las columnas sombreadas, en cultivos que contienen \alpha_{s1}-caseína degradada por Lactobacillus GG. Las líneas de intersección representan los cuartiles superiores e inferiores. * Comparación de a pares estadísticamente significativa para cultivos control.

Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la invención. Se describen métodos para preparar el hidrolizado mejorado, así como también experimentos que muestran el efecto terapéutico beneficioso observado en los presentes estudios.

Experimental

Ejemplo 1

Supresión de la proliferación de linfocitos in vitro por caseínas bovinas hidrolizadas con enzimas derivadas de Lactobacillus GG 1.a. Hidrólisis de proteínas de leche de vaca

Caseína total bovina y componentes de caseína (\alpha_{s1}-caseína) fueron purificados de leche de vaca (Syväoja, 1992). La hidrólisis con la mezcla de enzima derivada de Lactobacillus GG fue aplicada separadamente a la caseína y a la \alpha_{s1}-caseína. Las enzimas fueron aisladas usando el método modificado de Exterkate y de Veer, 1985. Brevemente las enzimas fueron liberadas por sonicación de células bacterianas congeladas. El sobrenadante de las células centrifugadas fue separado y usado para la hidrólisis de caseína y \alpha_{s1}-caseína. La hidrólisis se realizó durante 24 horas a 34ºC.

Los hidrolizados de GG así obtenidos fueron hidrolizados adicionalmente con pepsina y tripsina. Brevemente, las muestras fueron hidrolizadas primero con 0,1% de pepsina en 0,1 mol/1 HC1 durante 3 horas a 37ºC, pH 2,5. Después del ajuste del pH con 250 mg de NaHCO_{3}, y 2 moles/1 NaOH, se agregó 0,1% de tripsina a las muestras y las mismas fueron hidrolizadas durante 5 horas a 37ºC, pH 8,0.

Las muestras de P/T-caseína y P/T-\alpha_{s1}-caseína fueron obtenidas hidrolizando la caseína purificada y la \alpha_{s1}-caseína solo con pepsina y tripsina como se describió más arriba, sin hidrolización GG.

1.b. Prueba de transformación de linfocitos

Se usó una modificación del micrométodo de sangre entera para la transformación de linfocitos inducida por mitógeno. Seis a ocho individuos sanos voluntarios fueron los dadores de sangre para el experimento. Brevemente, la sangre venosa heparinizada fue obtenida y diluida 1:7 con medio de cultivo RPMI 1640 (Grand Island Biological Co. NY, EE.UU.) que contenía antibióticos. Se diluyó fitohemaglutinina (PHA) (Difco Laboratories, Detroit, Mich., EE.UU.) con RPMI 1640 que contenía antibióticos, con rangos de concentraciones finales en cultivos de 5 a 1250 \mug/ml. Los hidrolizados liofilizados de caseína y \alpha_{s1}-caseína fueron diluidos en RPMI 1640 a sus concentraciones finales de 0,1 \mug/ml (baja), 10 \mug/ml (media) y 1000 \mug/ml (alta) que probaron ser no tóxicas sobre las células T en los estudios de exclusión de colorantes con eosina.

Dos juegos de experimentos fueron realizados para investigar las respuestas proliferativas inducidas por mitógeno de células mononucleares de sangre periférico (PBMCx) a (A) caseína hidrolizada con pepsina y tripsina (= P/T-caseína), (B) \alpha_{s1}-caseína hidrolizada con pepsina y tripsina P/T-\alpha_{s1}-caseína), (C) P/T-caseína hidrolizada adicionalmente con enzimas derivadas de Lactobacillus GG y (D) P/T-\alpha_{s1}-caseína hidrolizada adicionalmente con enzimas derivadas de Lactobacillus GG.

El experimento consistía en cuatro cultivos control con diferentes diluciones del medio de cultivo y el mitógeno, así como también cultivos de prueba correspondientes con 25 \mul de productos hidrolizados a tres concentraciones diferentes. El ensayo fue realizado como se describió en Sütas y col., 1996.

La proliferación inducida por mitógeno de PBMC fue expresada como recuentos por minuto, excluido la base. Los resultados fueron presentados para cultivos control que contenían 125 \mug/ml PHA y RPMI 1640 y para los tres cultivos de prueba que contenían 125 \mug/ml de PHA y productos hidrolizados a las concentraciones baja, media y alta.

1.c. Análisis estadístico

Una prueba de a pares no paramétrica (Prueba Wilcoxon de rango orientado) fue usada para comparar el cambio de los valores en recuentos por minuto de cada uno de los cultivos de prueba con los de los cultivos controles. El nivel de significancia era p < 0,05.

Los resultados significativos de las comparaciones de a pares fueron presentados como supresión o estimulación de acuerdo con el aumento o la disminución de los valores en recuentos por minuto en el cultivo de prueba.

1.d. Resultados

En los experimentos realizados con P/T-caseína y P/T-\alpha_{s1} caseína adicionalmente hidrolizada con enzimas derivadas de Lactobacillus GG la proliferación inducida por mitógeno de PBMC fue suprimida significativamente a 0,1, 10 y 1000 \mug/ml (p = 0,03, p = 0,03 y p = 0,03) (Figs. 1C y 1D) comparado con P/T-caseína y P/T-\alpha_{s1}-caseína (Figs. 1A y 1B).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

El tratamiento de niños con dermatitis atópica con fórmula de hidrolizado de proteína suplementado con bacterias de ácido láctico 2.a. Pacientes y diseño del estudio

El estudio comprendió 31 niños, entre 2,5 a 15,7 (edad promedio 8) meses, que reunían los criterios de Hanifin (Hanifin, 1987) para eczema atópico en niños. Han sido enviados a una clínica pediátrica sobre la base de un eczema atópico y sospecharon alergia a la leche de vaca. La edad promedio al comienzo de los síntomas era de 2,4 meses. La duración de la alimentación con pecho fue de 5,9 meses. Se observó una historia familiar positiva de enfermedades atópicas (asma, eczema atópico y rinitis alérgica) o alergia a alimentos en parientes de primer grado en 26 (84%) pacientes. Las lesiones ezcematosas fueron tratadas con emolientes y corticosteroides tópicos. Ningún paciente recibía tratamiento con corticosteroides sistémicos. Aparte del eczema atópico, se observaron trastornos gastrointestinales tales como heces blandas, vómitos o diarrea en 9 (19%) pacientes. Después de los períodos de estudio los pacientes fueron asignados a una prueba de toma de leche de vaca a doble ciego controlado con placebo. Solo aquellos que tenían una reacción positiva (27/31) fueron incluidos en la población de estudio final.

Los pacientes fueron asignados al azar a dos grupos durante un mes. Un grupo (WF, n = 14) recibieron la fórmula de suero ampliamente hidrolizada (Valio, Ltd., Helsinki, Finlandia, EP-A-601802) y otro grupo (WF-GG, n = 13) recibió la misma fórmula con una preparación adicional de Lactobacillus GG (5 x 10^{8} cfu/g) (suministrada por Valio, Ltd., Helsinki, Finlandia). Después del tratamiento de un mes con su fórmula asignada ambos grupos recibieron una fórmula de suero ampliamente hidrolizada (Valio, Ltd.) durante un mes adicional. Se determinaron la concentración de IgE total en suero, la IgE específica de la leche de vaca (RAST, Pharmacia, Uppsala Suecia) y las pruebas de la herida punzante en la piel en todos los pacientes antes de la intervención dietaria. La prueba de la herida punzante, se realizó en el aspecto volar del antebrazo usando un alergeno a la leche de vaca (ALK) que se puede obtener comercialmente (Allergologisk, Laboratorium Horsholm, Dinamarca) y fórmula de prueba diluida a concentración de alimentación normal. Se usó una lanceta con respaldo para evitar una penetración más profunda (ALK), con diclorhidrato de histamina 10 mg por mililitro (ALK) como control positivo. Las reacciones se leyeron después de 15 minutos, y se registró una respuesta la mitad del tamaño o más de la reacción a histamina como positiva con la condición de que el diámetro medio del edema de la piel era de por los menos 3 mm y el control negativo al mismo tiempo 0 mm.

Muestras fecales para la determinación de \alpha-1 antitripsina y TNF-\alpha fueron recogidas antes de comenzar el tratamiento y 1 (correspondiente al período de estudio) y 2 meses después.

La severidad de la dermatitis atópica fue evaluada de acuerdo con el método SCORAD, establecido por la European Task Force sobre Dermatitis Atópica (1993). Brevemente, se estimó la extensión (resultado A) de la dermatitis usando la regla de nueves. La intensidad (resultado B) de la dermatitis era la suma de los resultados individuales (0-3) para eritema, edema y/o pápulas, excoriación, liquenificación y sequedad. Las manifestaciones (evaluadas 1-10) subjetivas (resultado C), incluyendo prurito y falta de sueño, fueron evaluadas de acuerdo a las estimaciones de los padres. Se obtuvo el SCORAD con el cálculo: A/5+3, 5xB+C.

El protocolo de estudio fue aprobado por el Ethical Review Committee del Hospital Universitario de Tampere. Se obtuvo un consentimiento informado de los padres.

2.b Determinación de a-1 antitripsina en muestras fecales

Muestras fecales congeladas fueron descongeladas a temperatura ambiente y homogeneizadas. Aproximadamente 1 g fue transferido a un tubo de vidrio y liofilizado. El material seco resultante fue molido y se transfirieron 50 mg a un tubo de Eppendorf. Se agregó 1 ml de solución de NaCl 0,15 M, y se extrajo \alpha-1 antitripsina mezclando enérgicamente en un mezclador Vortex durante 20 minutos a temperatura ambiente. La suspensión resultante fue centrifugada a 25.000 g durante 10 minutos para eliminar los desechos, y el sobrenadante fue usado para la determinación de \alpha-1 antitripsina usando un nefelómetro BNA de Behring de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados están dados como mg/g de peso seco de heces liofilizadas.

2.c Determinación de TNF-\alpha en muestras fecales

Muestras fecales super congeladas fueron descongeladas a temperatura ambiente, suspendidas 1:1 (p/v) en solución salina fisiológica y se dejaron sedimentar. Del sobrenadante, se transfirieron 0,5-1,0 ml a un tubo de Eppendorf y se centrifugaron a 25.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante fue usado luego para la determinación de TNF-\alpha. Se usó un inmunoensayo enzimático comercial (Kit ELISA-TNF-\alpha humano, Endogen Inc., Boston, Massachusetts, EE.UU.), como se instruyó para muestras de suero, para las determinaciones de TNF-\alpha fecal.

2.d Estadísticas

En razón de las distribuciones asimétricas de las concentraciones séricas de IgE, se usó la transformación logarítmica (1n) y los datos fueron presentados como un promedio con intervalos de confianza de 95% (CI). Las concentraciones de los parámetros inflamatorios se presentan con promedios con cuartiles inferiores y superiores. La prueba de rango orientado de wilcoxon y la prueba de U de Mann-Whitney fueron usadas en las comparaciones estadísticas.

2.e. Resultados 2.e.1. Datos clínicos

La IgE total sérica promedio (95% CI) fue de 31 (15-61) kU/l en pacientes que recibían la fórmula de hidrolizado. El RAST para la leche de vaca fue positivo (>0,4 kU/l) en 10/31 (37%) pacientes con eczema atópico. La prueba de la herida punzante en la piel para la leche de vaca fue positiva en 8/31 (30%) pacientes.

La severidad de la dermatitis atópica en cada paciente antes de comenzar con los tratamientos y un mes después, es decir, después del período de estudio, se presentan en la Figura 2. El resultado SCORAD promedio (cuartil inferior-cuartil superior) era 21 (14-31) en el grupo WF y 26 (17-38) en el grupo WF-GG antes del tratamiento (p = 0,33). Hubo una mejora significativa del resultado de SCORAD después de la intervención durante un mes en aquellos que recibían Lactobacillus GG (p = 0,008), pero no en los que recibían fórmula ampliamente hidrolizada sin Lactobacillus GG (p 0,89). El resultado SCORAD fue luego de 19 (13-31) en el grupo WF y 15 (7-28) en el grupo WF-GG. La disminución en el resultado SCORAD en WF-GG se debía a la reducción de la extensión (resultado A, p = 0,004), intensidad (resultado B, p = 0,05) y resultado subjetivo (resultado C, p = 0,01) para la dermatitis atópica (Figura 2). La mejora del resultado SCORAD se logró en 2 meses en el grupo WF y en el grupo WF-GG quedó igual después de suspender el Lactobacillus GG. A los 2 meses, el resultado SCORAD promedio (cuartil inferior-cuartil superior) en el grupo WF era de 14 (2-38) y en el grupo WF-GG 16 (6-25).

2.e.2. Las concentraciones de (Y-1 antitripsina y TNF-\alpha en las heces

En los controles sanos (n = 9) la concentración media (cuartil inferior-cuartil superior) de \alpha-1 antitripsina era de 0,5 (0,5-1,7) mg/g. La concentración de \alpha-1 antitripsina era comparable entre los grupos WF y WF-GG antes del tratamiento (p = 0,22). Como se indicó en la Tabla 1, la concentración de \alpha-1 antitripsina disminuyó significativamente en el grupo WF-GG (p = 0,03), pero no en el grupo WF (p = 0,68) durante el período de estudio de un mes. A los dos meses, la concentración de \alpha-1 antitripsina era de 1,2 (0,5-1,6) en WF y 0,5 (0,5-0,7) en WF-GG.

La concentración de TNF-\alpha fecal era 0 (0-0,08) pg/g en los controles sanos. La concentración de TNF-\alpha fecal era significativamente mayor en niños atópicos, p < 0,0001 (Tabla 1). La concentración de TNF-\alpha fue comparable entre los grupos WF y WF-GG antes del tratamiento (p = 0,57). La concentración de TNF-\alpha fecal disminuyó significativamente en WF-GG (p = 0,003) pero no en WF (p = 0,38) durante el período de estudio de un mes. (Tabla 1). Se logró una reducción de la concentración de TNF-\alpha en 2 meses en el grupo WF, mientras que en el grupo WF-GG a los que también se les dio fórmula ampliamente hidrolizada sin Lactobacillus GG se detectó una tendencia a TNF-\alpha aumentada. La concentración de TNF-\alpha fue luego 84 (25-124) en WF y 144 (20-338) en WF-GG.

TABLA 1 Las concentraciones de \alpha-1 antitripsina y TNF-\alpha antes del tratamiento (0) y un mes después (I) en niños que recibían la fórmula de suero altamente hidrolizado (WF) o la misma fórmula que contenía la bacteria Lactobacillus GG (WF-GG). Los datos indican promedios (cuartil inferior-cuartil superior)

1

Ejemplo 3

Disminución de la producción de citokina por células mononucleares de la sangre periférico en niños atópicos 3.a. Pacientes y métodos

En total se estudiaron 14 pacientes de 5-29 (promedio 16) meses que cumplían con el criterio de Hanifin de dermatitis atópica (Hanifin, 1987) y ocho niños sanos no atópicos de edad similar. Ninguno recibió corticosteroides sistémicos en el momento del estudio.

OKT3 (anticuerpo anti CD3) que contenía fluido de ascitis nos fue obsequiado por el Dr. M. Kaartinen, Departamento de Bacteriología e Inmunología, Universidad de Helsinki, Helsinki, Finlandia. La caseína total bovina había sido purificada de lecho bovina como se describe en Syváoja (1992). La caseína purificada fue hidrolizada con enzimas derivadas de Lactobacillus GG como se describe en el Ejemplo 1. La caseína purificada o la caseína degradada con Lactobacillus GG fueron liofilizadas y almacenadas a temperatura ambiente. Antes de los experimentos, fueron diluidas en RPMI 1640 y se aplicó esterilización por filtro (0,1 \mum, Millipore Corporation, Bedford, MA, EE.UU.)

El medio de cultivo completo consistía en RPMI 1640 con 10% de suero fetal de ternero, 10 mM tampón Hepes, 2 mM L-glutamina (Gibco Life Technologies, Paisley, GB), 50 U/ml bencilpenicilina (Sigma, St. Louis, MO. EE.UU), 10 mg/ml gentamicina (Roussel, Laboratories, Ltd., Uxbridge, Middlesex, GB). Se obtuvo sangre venosa periférico (5 ml). PBMC que contenía 90% de células linfoides fue aislado por centrifugación de gradiente de FicollPaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y se suspendió a 1 x 10^{6} células/ml en medio de cultivo completo. Las cavidades de cultivo fueron recubiertas previamente con fluido de ascitis que contenía anticuerpo anti-CD3 a una dilución óptima probada previamente. El cultivo de prueba contenía adicionalmente dilución de caseína o caseína degradada por Lactobacillus GG a una concentración final de 1 mg/ml. Estos experimentos se repitieron para \alpha_{s1} caseína bovina purificada o \alpha_{s1} caseína degradada con Lactobacillus GG. Después de 24 horas de incubación en una atmósfera de CO_{2} al 5% a 37ºC se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -70ºC para los ensayos de citokina. IL-4 e IFN-\gamma en sobrenadantes de cultivos fueron determinados por kits de ELISA que se pueden obtener comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante (IL-4: CLB, kit de ELISA de Interleucina-4 humana compacto, Laboratorio Central del Servicio de Transfusión de Sangre de la Cruz Roja de los Países Bajos, Amsterdam, Países Bajos; IFN-\gamma, EIFNG, Endogen Inc., Cambridge, MA, EE.UU.). Los resultados de diferentes corridas fueron igualados empleando la comparación de curvas estándar y fueron expresados como pg/ml. La sensibilidad de los ensayos para la IL-4 fue de 2,3 pg/ml y para IFN-\gamma, 5 pg/ml. La prueba de rango orientado de Wilcoxon fue usada en comparaciones estadísticas de los cultivos de prueba con respecto a los cultivos controles. El nivel de significancia fue de P < 0,05.

3.b Resultados

En pacientes atópicos, la producción de IL-4 e IFN, 7 aumentó en cultivos que contenían caseína purificada cuando se comparaba con los cultivos controles, P = 0,008 y P = 0,008, respectivamente (Fig. 3a, b). No se observó tal efecto de caseína bovina cuando se degradaba con las enzimas de Lactobacillus GG. Por el contrario, la producción de IL-4 en cultivos que contenían caseína degradada con Lactobacillus GG era significativamente menor que en los cultivos control, P = 0,003 (Fig. 3a), y la producción de IFN-\gamma en, esos cultivos fue comparable a los cultivos control, P = 0,10 (Fig. 3b).

En niños sanos, la producción de IL-4 e IFN-\gamma en cultivos que contenían caseína purificada fueron comparables con respecto a los cultivos control, P = 0,10 y P = 0,10 (Fig. 3c, d). Paralelamente a los hallazgos en los pacientes atópicos, los niños sanos tenían una producción significativamente menor de IL-4 en cultivos que contenían caseína degradada con Lactobacillus GG que en cultivos control, P = 0,01 (Fig. 3c) y la producción de IFN-\gamma en estos cultivos permaneció comparable a los cultivos control, P 0, 50 (Fig. 3d). Se obtuvieron resultados paralelos con \alpha_{s1} caseína y _{s1}\alpha-caseína degradada con Lactobacillus GG (Fig. 4).

Referencias

- European task force on atopic dermatitis. Severity scoring of atopic dermatitis; the SCORAD index. Dermatology 1993; 186: 23-31.

- Exterkate F and de Veer G. Partial isolation and degradation of caseins by cell wall proteinase(s) of Streptococcus cremoris, Appl. Environ Microbiol 1985; 49: 328-32.

- Fargeas MJ, Theodorou V, More J, Wal JM, Fioramonti J, Bueno L. Boosted systemic immune and local responsiveness after intestinal inflammation in orally sensitized guinea pigs. Gastroenterology 1995; 109: 53-62.

- Hanifin JM, Epidemiology of atopic dermatitis. Monogr Allergy 1987; 21:116-131.

- Isolauri E, Majamaa H, Arvola T, Rantala I, Virtanen E, Arvilommi H. Lactobacillus casei strain GG reverses increased intestinal permeability induced by cow milk in suckling rats. Gastroenterology 1993; 105: 1643-1650.

- Majamaa H, Isolauri E, Evaluation of gut mucosal barrier: evidence for increased antigen transfer in children with atopic eczema. J. Allergy Clin, Immunol 1996, in press.

- Majamaa H, Miettinen A, Laine S, Isolauri R, Intestinal inflammation in children with atopic eczema: faecal eosinophil cationic protein and tumor necrosis factor-\alpha as noninvasive indicators of food allergy. Clin. Exp. Allergy 1996: 26:181-187.

- Sampson HA, James MJ and Bernhisel-Broadbent J. Safety of an amino acid-derived infant formula in children allergic to cow milk. Pediatrics 1992; 90: 463-465.

- Sütas Y, Soppi E, Korhonen H, Syväoja EL, Saxelin M, Rokka T, Isolauri E. Suppression of lymphocyte proliferation in vitro by bovine caseins hydrolyzed with Lactobacillus casei GG derived enzymes. J. Allergy Clin Immunol 1996, in press.

- Syväoja EL. Quantitative determination of the main casein components and purification of \alpha_{s2}- and \kappa-casein from bovine milk. Milchwissenschaft 1992: 47: 563-566.

Claims

1. Un método para preparar in vitro una fórmula de hidrolizado de proteínas para disminuir las reacciones de hipersensibilidad y para promover una barrera inmunitaria en el intestino, que comprende las etapas de hidrolizar proteínas con enzimas derivadas de una preparación bacteriana que comprende la cepa Lactobacillus GG (ATCC 53103), y con pepsina y/o tripsina.

2. Un método para preparar in vitro una fórmula de hidrolizado de proteínas para disminuir las reacciones de hipersensibilidad y para promover una barrera inmunitaria en el intestino, que comprende las etapas de hidrolizar proteínas con pepsina y/o tripsina, y agregar al hidrolizado una preparación bacteriana que comprende la cepa Lactobacillus GG (ATCC 53103).

3. Una fórmula oral de hidrolizado de proteínas para disminuir las reacciones de hipersensibilidad y para promover una barrera inmunitaria en el intestino, cuyo hidrolizado es obtenible por el método definido en las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Uso de un hidrolizado de proteínas de fórmula según la reivindicación 3, para la producción de una fórmula farmacéuticamente activa a administrar oralmente para promover las respuestas tolerogénicas inmunitarias frente a los antígenos alimenticios en un paciente.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, donde la fórmula de hidrolizado de proteínas se utiliza para la fabricación de una fórmula farmacéuticamente activa para el tratamiento de la alergia a la leche de vaca en un paciente.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, donde la fórmula de hidrolizado de proteínas se utiliza para la fabricación de una fórmula farmacéuticamente activa para la prevención o tratamiento de las reacciones de hipersensibilidad inducidas por alimentos en un niño.

7. Uso de una preparación bacteriana que comprende la cepa Lactobacillus GG (ATCC 53103)junto con una fórmula de hidrolizado de proteínas con dicha preparación bacteriana para la fabricación de una fórmula farmacéuticamente activa para promover las respuestas tolerogénicas inmunes frente a los antígenos alimentarios en un paciente.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, donde la fórmula de hidrolizado de proteínas junto con la preparación bacteriana se utiliza para la fabricación de una fórmula farmacéuticamente activa para el tratamiento de la alergia a la leche de vaca en un paciente.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, donde la fórmula de hidrolizado de proteínas junto con la preparación bacteriana se utiliza para la fabricación de una fórmula farmacéuticamente activa para la prevención o tratamiento de las reacciones de hipersensibilidad inducidas por alimentos en un niño.