ES2197143T3 - Adn que codifica para prolilendopeptidasa. - Google Patents

Adn que codifica para prolilendopeptidasa.

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ES2197143T3 ES92810537T ES92810537T ES2197143T3 ES 2197143 T3 ES2197143 T3 ES 2197143T3 ES 92810537 T ES92810537 T ES 92810537T ES 92810537 T ES92810537 T ES 92810537T ES 2197143 T3 ES2197143 T3 ES 2197143T3
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Toshio Dr. Kokubo
Daisuke Prof. Tsuru
Tadashi Prof. Yoshimoto
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN ADN QUE CODIFICA LA PROLILENDOPEPTIDASA, A VECTORES HIBRIDOS QUE CONTIENEN TAL ADN, A LOS HUESPEDES TRANSFORMADOS CAPACES DE EXPRESAR LA PROLILENDOPEPTIDASA Y A UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE LA PROLILENDOPEPTIDASA QUE CONSISTE EN LOS PASOS SIGUIENTES: CULTIVAR UN ORGANISMO HUESPED TRANSFORMADO MEDIANTE UN VECTOR DE EXPRESION QUE CONTIENE UN ADN QUE CODIFICA LA PROLILENDOPEPTIDASA Y OPCIONALMENTE RECUPERAR LA PROLILENDOPEPTIDASA PRODUCIDA; Y UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE UN PEPTIDO AMIDADO C-TERMINAL A PARTIR DE DOS PRECURSORES DEL MISMO, QUE CONSISTE EN LOS PASOS SIGUIENTES: PONER LOS DOS PRECURSORES EN CONTACTO CON UNA PROLILENDOPEPTIDAS EN UN MEDIO PARA CONVERTIR LOS PEPTIDOS PRECURSORES EN UN PEPTIDO AMIDADO C-TERMINAL Y RECUPERAR EL PEPTIDO AMIDADO C-TERMINAL RESULTANTE.

Description

ADN que codifica para prolilendopeptidasa.
La publicación de Patente Japonesa No Examinada (KOKAI) Nº H2-5880 describe la clonación de un gen post-prolina-peptidasa procedente de Bacteroides gingivalis, pero esta enzima se diferencia claramente de la presente enzima en que la primera escinde glicil-prolina-4- metoxi- \beta-naftilamida, que no puede escindirse por la presente prolilendopeptidasa.
D. Rennex et al., Biochemistry 30, 2195-2203, 1991 describe una clonación de ADNc para prolilendopeptidasa a partir del cerebro porcino, pero no describe la expresión del ADNc.
Biochemistry, Vol. 30, Nº 8, p. 2195-2203 (1991) describe la purificación de la enzima prolil endopeptidasa a partir de riñón porcino, y el uso de oligonucleótidos basados en secuencias peptídicas procedentes de esta enzima para aislar un clon de ADNc a partir de una biblioteca de cerebro porcino. Esta referencia no describe el uso de la enzima que se caracteriza por la SEC. ID. Nº. 1 en un método para preparar un péptido amidado C-terminal.
Se cree que la prolilendopeptidasa es útil para la modificación de péptidos, por ejemplo, la amidación C-terminal de péptidos biológicamente activos tales como LH-RH, oxitocina, calcitoninas o similares, pero para este fin, se necesita obtener una gran cantidad de la enzima. Además, la preparación de enzima debe carecer de otras peptidasas para asegurar una reacción deseada. De esta manera, es esencial la producción de la enzima por un proceso de recombinación génica.
Sumario de la invención
Por consiguiente, la presente invención proporciona un proceso para la producción de prolilendopeptidasa por ingeniería genética. Más específicamente, la invención proporciona un proceso para la producción de un péptido amidado C-terminal a partir de dos precursores del mismo, donde uno de los precursores es un péptido precursor que forma la región N-terminal del péptido amidado C-terminal y que tiene un resto de prolina en su extremo C y otro precursor es un péptido precursor o aminoácido que forma una porción C-terminal del péptido amidado C-terminal, habiéndose amidado en el extremo C el péptido precursor o aminoácido, que comprende la etapas de: poner los dos precursores en contacto con prolilendopeptidasa de F. meningosepticum que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1 en un medio para convertir los péptidos precursores en el péptido amidado C-terminal, y recuperar el péptido amidado C-terminal resultante.
La presente invención también se refiere a las moléculas de ADN preparadas como se ha indicado anteriormente.
La presente invención también se refiere a un vector de expresión que comprende un gen que codifica para prolilendopeptidasa de cualquier origen y secuencias de control de la expresión unidas operativamente con el gen.
La presente invención proporciona además un hospedador transformado con el gen que codifica para una prolilendopeptidasa de cualquier origen, y capaz de producir la prolilendopeptidasa.
La presente invención también proporciona un proceso para la producción de prolilendopeptidasa que comprende las etapas de:
cultivar un organismo hospedador transformado con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica para prolilendopeptidasa para producir la prolilendopeptidasa y, opcionalmente, recuperar la prolilendopeptidasa producida.
La presente invención proporciona además un proceso para la producción de un péptido amidado C-terminal a partir de dos precursores del mismo, donde uno de los precursores es un péptido precursor que forma una región N-terminal del péptido amidado C-terminal y que tiene un resto de prolina en su extremo C y otro precursor es un péptido precursor o aminoácido que forma una porción C- terminal del péptido amidado C-terminal, habiéndose amidado en su extremo C dicho péptido precursor o aminoácido, que comprende las etapas de:
poner los dos precursores en contacto con una prolilendopeptidasa en un medio para convertir los péptidos precursores en el péptido amidado C-terminal, y recuperar el péptido amidado C-terminal resultante.
Descripción detallada de la invención Preparación de un gen que codifica para prolilendopeptidasa
En lo sucesivo, el término prolilendopeptidasa pretende incluir cualquier prolilendopeptidasa. Sin embargo, el significado preferido del término es una prolilendopeptidasa derivada de procariotas, preferiblemente de Flavobacterium spec., en particular de F. meningosepticum, y más preferiblemente de F. meningosepticum cepa IFO 12535 (ATCC 13253).
Por consiguiente, un ADN de la presente invención que codifica para una prolilendopeptidasa puede clonarse a partir de cualquier célula que contenga un gen codificante para prolilendopeptidasa, incluyendo eucariotas tales como mamíferos y procariotas tales como bacterias. En caso de que se elija una fuente de mamífero, por ejemplo, el útero de un mamífero, por ejemplo, de un ser humano, el ADN codificante para la prolilendopeptidasa preferiblemente procede del ARN por medio de la producción de ADNc.
Una fuente preferida de ADN que codifica para prolilendopeptidasa es una bacteria que pertenece al género Flavobacterium, en particular, F. meningosepticum, más preferiblemente F. meningosepticum cepa IFO 12535 (ATCC 13253).
Como el ADN derivado de un procariota tal como una bacteria, por ejemplo, F. meningosepticum no incluye intrones, puede usarse un ADN genómico para clonar un ADN que codifica prolilendopeptidasa si se elige como fuente una célula procariota. En este caso, las células bacterianas que producen prolilendopeptidasa, por ejemplo, células de F. meningosepticum, se homogeneizan y se extrae un ADN genómico entero de acuerdo con un procedimiento convencional (Saito, H. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1963, 72, 619-629). Después, el ADN extraído se digiere completamente o parcialmente con una enzima de restricción apropiada tal como Bgl II, Eco RI, Hinc II, Hind III, Pst I o Bam HI. Después, el producto de digestión se somete preferiblemente a electroforesis preparativa con un gel de agarosa de bajo punto de fusión para enriquecer fracciones de ADN de una cierta longitud. Con esto se pretende enriquecer fragmentos de ADN que codifican prolilendopeptidasa. A continuación, los fragmentos de ADN se clonan en un vector de clonación adecuado. El vector de clonación puede derivar de cualquier vector útil en la técnica de la ingeniería genética, tal como virus, fagos, cósmidos, plásmidos o ADN cromosómico, por ejemplos derivados de SV40, virus del herpes, papilomavirus, retrovirus, baculovirus, fago \lambda, por ejemplo, NM989 o EMBL4, o fago M13, plásmidos bacterianos, por ejemplo pBR322, pUC18, pSF2124, pBR317 o pPLMu., o plásmidos de levadura, por ejemplo el plásmido 2 \mu de levadura, o también ADN cromosómico que comprende un origen de replicación o una secuencia de replicación autónoma (ARS). Preferiblemente, el vector de clonación es un vector bacteriano tal como pBR322, pUC18, pUC19 o similares.
Como alternativa, puede prepararse una biblioteca de ADNc a partir de una célula que expresa prolilendopeptidasa, por ejemplo, a partir de una célula bacteriana tal como, preferiblemente, una bacteria que pertenece al género Flavobacterium, en particular F. meningosepticum, más preferiblemente F. meningosepticum cepa IFO 12535 (ATCC 13253), o a partir de una célula o tejido eucariota, por ejemplo una célula o tejido de mamífero que produce prolilendopeptidasa. Por ejemplo, el ARN se extrae del útero humano y se enriquece en ARNm de acuerdo con un procedimiento convencional. A continuación, se construye una biblioteca de ADNc de acuerdo con un procedimiento convencional tal como el método de Okayama-Berg (Okayama, H. et al., Mol. Cell. Biol. 1982, 2, 161-170), el método de Gubler y Hoffman (Gubler, U. et al., Gene, 1983, 263-270) o similares.
En la técnica se conoce una diversidad de métodos para la incorporación de ADNc bicatenario o ADN genómico en un vector apropiado. Por ejemplo, pueden añadirse tractos de homopolímeros complementarios al ADN bicatenario y el ADN del vector por incubación en presencia de los desoxinucleósido trifosfatos correspondientes y una enzima tal como la desoxinucleotidil transferasa terminal. Después, el vector y el ADN bicatenario se unen por emparejamiento de bases entre las colas homopoliméricas complementarias y finalmente se unen por enzimas de unión específicas tales como ligasas. Otras posibilidades son la adición de engarces sintéticos al extremo del ADN bicatenario, o la incorporación del ADN bicatenario en el vector por unión de extremos romos o escalonados.
La selección de la biblioteca de ADN genómica o de la biblioteca de ADNc se consigue preferiblemente usando una sonda de hibridación de ADN. Son sondas de ADN adecuadas los ADN de secuencia de nucleótidos conocida que constan de al menos 17 nucleótidos, por ejemplo ADN sintéticos, ADNc derivados de ARNm que codifican para prolilendopeptidasa, o fragmentos de ADN genómicos que comprenden, por ejemplo, secuencias de ADN adyacentes que se aíslan a partir de una fuente natural o partir de un microorganismo modificado por ingeniería genética.
Para diseñar sondas de ADN sintéticas para seleccionar la biblioteca de ADN genómico o la biblioteca de ADNc mencionadas anteriormente, se purifica una prolilendopeptidasa para la que se va a clonar una región codificante de ADN, y su secuencia de aminoácidos parcial se determina de acuerdo con un procedimiento convencional. A continuación, se diseñan secuencias de ADN basándose en la secuencia de aminoácidos parcial determinada de esta manera. Cuando no se conoce una secuencia de nucleótidos exacta que codifica para la secuencia de aminoácidos, puede usarse una combinación de secuencias de nucleótidos que incluyen parcial o totalmente posibles secuencias de nucleótidos presentes debido a la degeneración del código genético. Como alternativa, el tercer nucleótido de un codón puede reemplazarse con inosina.
Las sondas de ADN sintéticas se sintetizan de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, por medio de la condensación por etapas usando el método de fosfotriéster, fosfito triéster o fosforamidita en fase sólida, por ejemplo, la condensación de unidades de acoplamiento de dinucleótidos por el método fosfotriéster. Estos métodos se adaptan a la síntesis de mezclas de los oligonucleótidos deseados usando mezclas de dos, tres o cuatro nucleótidos dA, dC, dG y/o dT en forma protegida o las unidades de acoplamiento de dinucleótidos correspondientes en la etapa de condensación apropiada como se describe por Y. Ike et al. (Nucleic Acids Research 11 477,1983).
Para la hibridación, las sondas de ADN se marcan, por ejemplo, se marcan radiactivamente por la reacción de la quinasa bien conocida. La hibridación se realiza de acuerdo con procedimientos conocidos, es decir, en soluciones tampón y de sales que contienen adyuvantes, por ejemplo, quelantes de calcio, compuestos para regular la viscosidad, proteínas, ADN no homólogo y similares, a temperaturas que favorecen la hibridación selectiva, por ejemplo, entre 0ºC y 80ºC, por ejemplo entre 25ºC y 50ºC.
En la realización preferida, se usa la biblioteca de ADN de F. meningosepticum para transformar un hospedador apropiado tal como células E. coli, que después se ponen en placas y se cultivan sobre un medio sólido para desarrollar colonias, y los clones positivos se seleccionan por un método de hibridación de colonias usando las sondas de ADN mencionadas anteriormente. En la técnica se conocen bien la transformación de células hospedadoras apropiadas con la biblioteca de ADN y la selección y multiplicación de células hospedadoras transformadas. A continuación se proporcionan ejemplos de tales métodos.
La secuencia de nucleótidos del ADN seleccionado como se ha descrito anteriormente puede determinarse por métodos conocidos per se; por ejemplo, por el método de Maxam-Gilbert usando ADN marcado terminalmente o por el método de terminación de cadena didesoxi de Sanger.
En la lista de secuencias SEC ID Nº 1 se muestra una secuencia de nucleótidos de ADN genómico procedente de Flavobacterium meningosepticum que codifica para prolilendopeptidasa y la secuencia de aminoácidos correspondiente.
Una vez que se ha determinado una secuencia de nucleótidos que codifica para, o una secuencia de aminoácidos de, prolilendopeptidasa, también puede prepararse un ADN que codifica para la enzima por medio de una síntesis in vitro de acuerdo con métodos convencionales. Los métodos adecuados de la síntesis de ADN se han presentado en forma de resumen por S.A. Narang (Tetrahedron 39, 3, 1983). Las técnicas de síntesis conocidas permiten la preparación de polinucleótidos de hasta 120 bases de longitud, con buenos rendimientos, alta pureza y en un tiempo relativamente corto. Los nucleótidos convenientemente protegidos se unen entre sí por el método de fosfodiéster (K.L. Agarwal et al., Angew, Chemie 84, 489, 1972), el método de fosfotriéster más eficaz (C.B. Reese, Tetrahderon 34, 3143, 1978), el método de fosfito triéster (R. L. Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 98, 3655, 1976) o el método de fosforamidita (S.L. Beaucage y M.H. Carruthers, Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981).
La simplificación de la síntesis de los oligonucleótidos y polinucleótidos se posibilita por el método en fase sólida, en el que las cadenas de nucleótidos se unen a un polímero adecuado. H. Rink et al. (Nucl. Acids Reserach 12, 6369, 1984) usan trinucleótidos en lugar de nucleótidos individuales y los unen por el método de fosfotriéster en la síntesis de fase sólida. De esta manera, puede prepararse un polinucleótido en un corto período de tiempo y con buenos rendimientos. El ADN bicatenario real se construye enzimáticamente a partir de oligonucleótidos solapantes preparados químicamente a partir de las dos cadenas de ADN, que se mantienen juntas en la disposición correcta por emparejamiento de bases y después se unen químicamente por la enzima ADN ligasa. Otra posibilidad comprende incubar oligonucleótidos individuales solapantes procedentes de las dos cadenas de ADN en presencia de los cuatro desoxinucleósido trifosfatos requeridos con una ADN polimerasa, por ejemplo la ADN polimerasa I, el fragmento de Klenow de la polimerasa I o la ADN polimerasa de T4, o con la transcriptasa inversa de AMV (virus de la mieloblastosis aviar). De esta manera, los dos oligonucleótidos se mantienen juntos en la disposición correcta por emparejamiento de bases y se suplementan con los nucleótidos requeridos por la enzima para proporcionar un ADN bicatenario completo (Scarpulla et al., Anal. Biochem. 121, 356, 1982).
Vector híbrido que contiene un gen que codifica para prolilendopeptidasa
En la presente invención, los vectores híbridos incluyen un vector híbrido para la clonación o la amplificación de un gen de prolilendopeptidasa deseado, y vectores de expresión. Un vector híbrido de la invención comprende una secuencia de ADN que codifica para la prolilendopeptidasa definida anteriormente en este documento.
Los vectores híbridos proceden de cualquier vector útil en la técnica de la ingeniería genética, tales como virus, fagos, cósmidos, plásmidos o ADN cromosómico, por ejemplo derivados de SV40, virus del herpes, papilomavirus, retrovirus, baculovirus, fago \lambda, por ejemplo NM989 o EMBL4 o fago M13, plásmidos bacterianos, por ejemplo pBR322, pUC18, pSF2124, pBR317 o pPLMu., o plásmidos de levadura, por ejemplo el plásmido 2 \mu de levadura, o también ADN cromosómico que comprende un origen de replicación o una secuencia de replicación autónoma (ARS), o un virus, fago o plásmido defectuoso en presencia de un virus, fago o plásmido adyuvante que permita la replicación de dicho virus, fago o plásmido defectuoso, por ejemplo, el vector M13(+)KS en presencia de, por ejemplo, el fago adyuvante M13K07. Los baculovirus que pueden usarse en la presente invención son, por ejemplo, el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV), MNPV de Trichoplusia ni, MNPV de Rachiplusia ou, MNPV de Galleria mellonella, virus de la polihedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV) y similares. En Invitrogen está disponible comercialmente un kit que comprende una combinación de un virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica y vectores de transferencia de baculovirus pAc700, pAc701, pAc702, pVL1392 y pVL1393.
Un vector adecuado de la invención es un vector que es operativo en la célula hospedadora microbiana elegida para multiplicar el vector híbrido o para la expresión de prolilendopeptidasa. Los vectores adecuados contienen un replicón completo y un gen marcador, que posibilita la selección y la identificación de los microorganismos transformados por los plásmidos de expresión por medio de una característica fenotípica.
De esta manera, los vectores híbridos de la invención proporcionan medios para la replicación de un ADN de prolilendopeptidasa deseado en un hospedador adecuado, ya sea como un elemento extracromosómico o por integración en el cromosoma del hospedador. Se dispone de varios sistemas vectores posibles para la integración y la expresión del ADN clonado de la invención. En principio, son adecuados todos los vectores que se replican y/o comprenden un gen recombinante que puede expresarse en el hospedador elegido. El vector se selecciona dependiendo de las células hospedadoras previstas para la transformación. En general, tales células hospedadoras pueden ser microorganismos procariotas o eucariotas tales como bacterias, hongos tales como levaduras u hongos filamentosos, o células de origen eucariota superior tales como células animales, por ejemplo de mamífero o de insecto. Más adelante, se describirán con más detalle en este documento células hospedadoras adecuadas. En principio, los vectores híbridos de la invención comprenden un ADN que codifica prolilendopeptidasa, un origen de replicación o una secuencia de replicación autónoma, opcionalmente secuencias marcadoras dominantes y, opcionalmente, sitios de restricción adicionales.
Un origen de replicación o una secuencia de replicación autónoma (un elemento de ADN que confiere capacidades de replicación autónoma a elementos extracromosómicos) se proporciona mediante la construcción del vector de manera que incluya un origen exógeno, tal como el derivado del virus Simiano (SV40) u otra fuente viral, o mediante los mecanismos cromosómicos de la célula hospedadora.
Un vector híbrido de la invención puede contener marcadores selectivos dependiendo del hospedador que se vaya a transformar, seleccionar y clonar. Puede usarse cualquier gen marcador que facilite la selección de los transformantes debido a la expresión fenotípica del marcador. Son marcadores adecuados, particularmente, genes a partir de los cuales puede expresarse un polipéptido que proporciona resistencia contra compuestos tóxicos para el organismo receptor o que compite con el sistema enzimático de un mutante que carece de tal polipéptido esencial, por ejemplo, de un mutante auxotrófico. Los genes marcadores adecuados expresan, por ejemplo, resistencia a antibióticos, por ejemplo contra tetraciclina, ampicilina o cicloheximida, o proporcionan prototrofia en un mutante auxotrófico, por ejemplo una levadura deficiente en el gen ura3, leu2, his3 o trp1. También es posible emplear como marcadores genes estructurales que se asocian con un segmento de replicación autónoma siempre que el hospedador a transformar sea auxotrófico para el producto expresado por el marcador.
Dentro del significado de vectores híbridos de la invención, también se encuentran vectores de expresión híbridos para la expresión de prolilendopeptidasa. En general, tienen las mismas características que los vectores híbridos descritos anteriormente, y además comprenden secuencias de control de la expresión que permiten la producción y, opcionalmente, la secreción de prolilendopeptidasa. De esta manera, los vectores de expresión híbridos de la invención comprenden una región promotora unida operativamente con un gen estructural que codifica prolilendopeptidasa y, opcionalmente, un fragmento de ADN que codifica un péptido director o señal, un potenciador de la transcripción, un sitio de unión a ribosomas, una región terminadora de la transcripción y/o secuencias reguladoras adicionales.
Puede emplearse una amplia diversidad de secuencias promotoras, dependiendo de la naturaleza de la célula hospedadora. Los más útiles son promotores que son fuertes y que al mismo tiempo están bien regulados. Son secuencias para la iniciación de la traducción, por ejemplo, secuencias Shine-Dalgarno. Las secuencias necesarias para la iniciación y terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm se pueden adquirir comúnmente a partir de las regiones 5' y las regiones 3' no codificantes, respectivamente, de ADNc virales o eucariotas, por ejemplo, procedentes del hospedador de expresión.
Son ejemplos de promotores adecuados \lambdaP_{L}, \lambdaP_{R} o \lambdaN, lac, trp, tac o lpp de E. coli, TRP1-, ADHI-, ADHII-, PHO3- o PH05- de levadura, o promotores glicolíticos tales como el promotor de genes de enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6- fosfato isomerasa, 3- fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, tiosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa, o promotores derivados de virus eucariotas, por ejemplo SV40, virus del sarcoma de Rous, adenovirus 2, papilomavirus bovino, papovavirus, citomegalovirus o baculovirus, por ejemplo, el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV), MNPV de Trichoplusia ni, MNPV de Rachiplusia ou, MNPV de Galleria mellonella, promotores derivados o promotores derivados de células de mamífero, por ejemplo, del gen de actina, colágeno, miosina o \beta-globina. Un promotor eucariota preferido es un promotor del gen de la polihedrina de un baculovirus, preferiblemente del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV). Los promotores eucariotas pueden combinarse con secuencias potenciadoras tales como las secuencias activadoras cadena arriba (UAS) de levadura o potenciadores virales o celulares tales como los potenciadores IE de citomegalovirus, el potenciador de SV40, el potenciador del gen de inmunoglobulina u otros.
Son potenciadores útiles para la expresión secuencias de ADN que estimulan la transcripción, por ejemplo, derivadas de virus tales como el virus Simiano, citomegalovirus, virus de polioma, papilomavirus bovino o virus del sarcoma de Moloney, o de origen genómico. Una secuencia potenciadora también puede obtenerse a partir del ADN ribosómico extracromosómico de Physarum policephalum (documento PCT WO 86/00089), o puede ser el sitio de activación cadena arriba del gen PH05 de la fosfatasa ácida (documento EP-B-0 213 593) o el PH05, trp, híbrido PH05-GAPDH (documento EP-B-0 213 593), o un promotor similar.
Las secuencias señal que pueden usarse para la presente invención pueden ser, por ejemplo, una presecuencia o secuencia directora de la secreción que dirige la secreción de polipéptido, o similar. En la bibliografía se conocen las secuencias señal que pueden usarse en la presente invención, por ejemplo, como se recopila en von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986). Otra secuencia señal adecuada se extiende desde el aminoácido 1 al 19 de la secuencia de aminoácidos representada en la lista de secuencias con la SEC ID Nº 1. En la presente invención también se incluye esta secuencia señal sola, así como una molécula de ADN que la codifica, preferiblemente la molécula de ADN representada por los nucleótidos 260 a 316 de la SEC ID Nº 1.
Un sitio de unión a ribosomas (secuencia de Shine-Dalgarno) está unido naturalmente al promotor usado o puede localizarse en una secuencia de nucleótidos corta que puede unirse covalentemente al extremo 5' de la región codificante para la prolilendopeptidasa. En la técnica se conocen sitios de unión a ribosomas.
Un promotor elegido para la construcción de un vector de expresión híbrido de la invención puede regularse por una proteína reguladora y después la producción de prolilendopeptidasa en la célula hospedadora transformada puede ser inducible o desreprimible. El gen para la proteína reguladora puede localizarse en el genoma de la cepa hospedadora, en un vector plasmídico adicional con el que la cepa hospedadora puede cotransformarse, o en el vector híbrido de la invención. La selección de un gen adecuado para una proteína reguladora depende del promotor usado. Las condiciones para la inducción o desrepresión de la producción de prolilendopeptidasa también dependen del promotor y de la proteína reguladora. Una proteína reguladora que puede usarse en la presente invención es, por ejemplo, una proteína represora, por ejemplo, un producto del gen trpR, lacI, \lambdacro o \lambdacI, o un mutante sensible a la temperatura del mismo.
Los vectores de expresión híbridos preferidos de la invención son vectores de expresión adecuados para la expresión de prolilendopeptidasa madura representados por la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N 1 en E. coli, más preferiblemente, los vectores de expresión que comprenden una secuencia señal, preferiblemente la secuencia señal del gen de prolilendopeptidasa mostrado con la SEC ID Nº 1, unido operativamente al gen que codifica la prolilendopeptidasa madura.
Son vectores de expresión más preferidos los plásmidos pFPH5-KD50, pUK-FPEP-a y pUK-FPEP-b, caracterizados en los ejemplos adjuntos,
Hospedadores transformados y preparación de los mismos
La invención se refiere a una célula hospedadora transformada para multiplicar una molécula de ADN recombinante de la invención o, particularmente, para expresar un gen estructural de prolilendopeptidasa incluido en una molécula de ADN recombinante de la invención.
Las cepas hospedadoras microbianas transformadas se cultivan en un medio líquido que contiene fuentes de carbono y de nitrógeno que pueden asimilarse por la célula microbiana, y sales inorgánicas, aplicando métodos conocidos en la técnica. El cultivo de los hospedadores se realiza en un medio nutriente convencional que puede suplementarse o carecer de ciertos compuestos químicos permitiendo la selección negativa o positiva de los transformantes, es decir, los hospedadores que contienen la molécula de ADN deseada junto con un marcador de selección, a partir de los no transformantes, es decir, los hospedadores que carecen de la molécula de ADN deseada.
Puede usarse cualquier hospedador transformable útil en la técnica, por ejemplo, bacterias tales con E. coli, hongos tales como Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, u hongos filamentosos tales como Aspergillus Spec., por ejemplo A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori o A. niger. Sin embargo, puede ser ventajoso el uso de hospedadores adecuados que carecen o son deficientes en enzimas de restricción o enzimas de modificación. Son ejemplos de tales hospedadores bacterias, por ejemplo, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus y otros, y levaduras, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae y, en particular, cepas de Esquericha coli, por ejemplo E. coli X1776, E. coli Y 1090, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA 221, E. coli DH5\alpha o, preferiblemente, E. coli DH5\alphaF', JM109, MH1 o HB101 o la cepa K12 de E. coli. Otros hospedadores adecuados son células de organismos superiores, en particular, líneas de células animales o humanas continuas establecidas, por ejemplo, fibroblastos de pulmón embrionario humano L132, células de Bowes de melanoma maligno humano, células HeLa, células de riñón transformadas con el virus SV40 del mono verde africano COS-7 o células de ovario de hámster chino (CHO). Otras células hospedadoras adecuadas son líneas de células de insecto establecidas, por ejemplo, Spodoptera frugiperda, tal como Sf21 o preferiblemente Sf9 (ATCC CRL1711), Mamestra brassicae, sistemas celulares de Bombyx mori que usan el virus de la polihedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV) y similares.
La invención también se refiere a un método para la preparación de tales hospedadores transformados que comprende el tratamiento de una célula hospedadora adecuada en condiciones de transformación con una molécula de ADN recombinante de la presente invención, especialmente un vector híbrido de la invención, opcionalmente junto con un gen marcador de selección y, opcionalmente, la selección de los transformantes.
La transformación de microorganismos se realiza de acuerdo con métodos convencionales tales como los descritos en la bibliografía, por ejemplo, para S. cerevisiae (A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 75, 1929, 1978), para B. subtilis (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol, 81, 741, 1961) y para E. coli (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159, 1970).
Por consiguiente, el procedimiento de transformación de células E. coli incluye, por ejemplo, el pretratamiento con Ca^{2+} de las células para permitir la captación del ADN, y la incubación con el vector híbrido. La posterior selección de las células transformadas puede conseguirse, por ejemplo, transfiriendo las células a un medio de crecimiento selectivo que permita la separación de las células transformadas de las células parentales dependiendo de la naturaleza de la secuencia marcadora del ADN del vector. Preferiblemente, se usa un medio de crecimiento que no permite el crecimiento de las células que no contienen el vector. La transformación de levaduras comprende, por ejemplo, etapas de eliminación enzimática de la pared celular de la levadura por medio de glucosidasas, tratamiento de los esferoplastos obtenidos con el vector en presencia de polietilenglicol e iones de Ca^{2+}, y regeneración de la pared celular incluyendo los esferoplastos en agar. Preferiblemente, el agar de regeneración se prepara de tal forma que permita la regeneración y la selección de las células transformadas como se ha descrito anteriormente al mismo tiempo.
La transformación de células de origen eucariota superior, tales como líneas de células de mamífero, se consigue preferiblemente por transfección. La transfección se realiza por técnicas convencionales, tales como precipitación con fosfato cálcico, microinyección, fusión de protoplastos, electroporación, es decir, introducción de ADN por un pulso eléctrico corto que aumenta transitoriamente la permeabilidad de la membrana celular, o en presencia de compuestos adyuvantes tales como dietilaminoetildextrano, dimetil sulfóxido, glicerol o polietilenglicol, y similares. Después del procedimiento de transfección, las células transfectadas se identifican y se seleccionan, por ejemplo, por cultivo en un medio selectivo elegido dependiendo de la naturaleza del marcador de selección, por ejemplo, medios de cultivo convencionales tales como el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo, medio RPMI 1640 y similares, que contienen, por ejemplo, el antibiótico correspondiente.
Las células hospedadoras transformadas se cultivan por métodos conocidos en la técnica en un medio líquido que contiene fuentes asimilables de carbono, por ejemplo, carbohidratos tales como glucosa o lactosa, nitrógeno, por ejemplo aminoácidos, péptidos, proteínas o sus productos de degradación tales como peptonas, sales de amonio o similares, y sales inorgánicas, por ejemplo sulfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio. El medio también contiene, por ejemplo, substancias promotoras del crecimiento, tales como oligoelementos, por ejemplo hierro, cinc, manganeso y similares.
El medio se elige preferiblemente de forma que ejerza una presión de selección e impida el crecimiento de células que no se han transformado o que han perdido el vector híbrido. De esta forma, por ejemplo, se añade un antibiótico al medio si el vector híbrido contiene un gen de resistencia a antibióticos como marcador. Por ejemplo, si se usa una célula hospedadora que es auxotrófica en un aminoácido esencial mientras que el vector híbrido contiene un gen que codifica para una enzima que complementa el defecto del hospedador, se usa un medio mínimo deficiente en dicho aminoácido para cultivar las células transformadas.
Las células de origen eucariota superior tales como células de mamífero se cultivan en condiciones de cultivo de tejidos usando medios disponibles en el mercado, por ejemplo, medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo, medio RPMI 1640 y similares, como se ha mencionado anteriormente, suplementados opcionalmente con substancias que promueven el crecimiento y/o sueros de mamífero. Las técnicas para el cultivo en condiciones de cultivo de tejidos son bien conocidas en la técnica e incluyen el cultivo en suspensión homogénea, por ejemplo, en un reactor de aire comprimido o en un reactor de agitación continuo, o el cultivo de células inmovilizadas o atrapadas, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, en microperlas de agarosa, perlas de vidrio poroso, cartuchos de cerámica u otros microsoportes.
El cultivo se realiza por procesos que son conocidos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el valor de pH del medio y el tiempo de fermentación, se eligen de forma que se obtenga un nivel de expresión máximo del polipéptido o derivado de la invención. De esta forma, una cepa de E. coli o de levadura se cultiva preferiblemente en condiciones aerobias por medio de un cultivo sumergido con agitación o mezcla a una temperatura de aproximadamente 20ºC a 40ºC, preferiblemente a aproximadamente 30ºC, y a un valor de pH de 4 a 8, preferiblemente a un pH de aproximadamente 7, durante un periodo de aproximadamente 4 a 30 horas, preferiblemente hasta que se alcancen rendimientos máximos del polipéptido o derivado de la invención.
Producción de prolilendopeptidasa
La presente invención también se refiere a un método para la producción de prolilendopeptidasa.
Para la expresión de prolilendopeptidasa, pueden usarse células hospedadoras procariotas o eucariotas, por ejemplo, cepas de E. coli defectuosas en genes de proteasa, por ejemplo, en el gen de proteasa lon, y genes implicados en la regulación de la síntesis de proteínas inducidas por choque térmico, por ejemplo, en el gen htpR (Patente de Estados Unidos 4.758.512; Buell, G. et. al., Nucleic Acids, Res. 13:1923-1938, 1985).
Preferiblemente, la prolilendopeptidasa se produce usando E. coli. En este caso, para mejorar la expresión, se retira preferiblemente una región no codificante 5' terminal del ADN clonado mientras se mantiene la longitud completa de la región codificante, particularmente la región codificante del polipéptido maduro mostrada en la SEC ID Nº 1. Lo más preferido es que la región codificante esté unida funcionalmente con una secuencia señal que permita la secreción de la prolilendopeptidasa. Además, el gen estructural está unido funcionalmente con una región promotora funcional en E. coli, heteróloga o unida de forma nativa con la región codificante de prolilendopeptidasa. La unión se realiza de acuerdo con un procedimiento convencional, por ejemplo, usando una enzima de restricción apropiada o deleción por digestión con una exonucleasa tal como la exonucleasa III de E. coli, y la formación sucesiva de extremos romos con una nucleasa, por ejemplo, la nucleasa de Vigna radiata.
En una de las realizaciones más preferibles, un ADN genómico que tiene una secuencia de engarce inmediatamente cadena arriba de una región codificante de longitud completa para la prolilendopeptidasa se une a un promotor heterólogo tal como el promotor tac en un vector de expresión, por ejemplo, un plásmido basado en el plásmido pUC119. Muy particularmente, una región codificante presente en el ADN genómico de Flavobacterium meningosepticum codifica una pro-forma de prolilendopeptidasa, por ejemplo, la que está compuesta por una forma madura de la enzima, por ejemplo, que consta desde el resto aminoacídico 1 hasta el extremo de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1, y un péptido señal, por ejemplo los restos aminoacídicos -19 a -1 de la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1. Cuando se usa tal tipo de plásmido de expresión para transformar hospedadores E. coli, y el transformante se cultiva, entonces la prolilendopeptidasa se produce en células E. coli y se secreta en la región periplásmica. En el proceso de secreción, el péptido señal se retira para proporcionar una forma madura de la enzima que no se incorpora en cuerpos de inclusión y, por lo tanto, la prolilendopeptidasa producida se recupera fácilmente.
De acuerdo con otra realización de la presente invención, un ADN que codifica para la presente enzima se inserta en un vector de transferencia de baculovirus para construir un vector de transferencia de baculovirus recombinante, y después, el vector de transferencia de baculovirus recombinante se utiliza para cotransfectar células de insecto con un ADN de baculovirus para que lleven una recombinación homóloga.
Normalmente, el vector de transferencia de baculovirus es un plásmido que contiene un segmento de ADN de baculovirus, segmento que comprende un gen no esencial para la replicación de baculovirus. El gen no esencial para la replicación de baculovirus es, por ejemplo, un gen de polihedrina que comprende un gen estructural de polihedrina y un promotor del mismo. Tales vectores de transferencia de baculovirus, son por ejemplo, pAcYM1 (Matsuura, Y., et al., J. Gen. Virol. (1987) 68, 1233-1250), pAc311, pAc360, pAc373, pAc380 (documento USP 4.745.051), pAc700, pAc701, pAc702, pVL1392, pVL1393, y similares. Se prefiere el uso de pVL1392.
Los baculovirus usados en la presente invención son, por ejemplo, MNPV de Trichoplusia ni, MNPV de Rachiplusia ou, MNPV de Galleria mellonella, y similares. Preferentemente, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV). En Invitrogen Corp. San Diego, CA, USA, está disponible comercialmente un kit que comprende una combinación de un virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica y vectores de transferencia de baculovirus pAc700, pAc701, pAc702, pVL1392 y pVL1393. Las células de insecto usadas en la presente invención son líneas de células de insecto establecidas, por ejemplo, de Spodoptera frugiperda, tales como Sf21 o preferiblemente Sf9 (ATCC CRL1711), pero también de Mamestra brassicae y similares. En la presente invención también puede usarse un sistema celular de Bombyx mori usando el virus de la polihedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV).
La recombinación homologa se realiza de acuerdo con un procedimiento convencional como se describe, por ejemplo, en ``A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, M.D. Summers et al., Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555''. Las células de insecto transfectadas se cultivan de acuerdo con un procedimiento convencional. Particularmente, las células de insecto transfectadas pueden cultivarse en cualquier medio de cultivo de tejidos en el que pueden crecer células de insecto, tal como medio de Grace o TC100 suplementado con suero de mamífero, medio EX-CELL400 sin suero o similares, a una temperatura de 20ºC a 30ºC, preferiblemente de 27ºC a 28ºC, por ejemplo a 27ºC, durante un período de 2 a 10 días, preferiblemente de 3 a 5 días.
La prolilendopeptidasa expresada puede extraerse de células microbianas tales como células E. coli o de un sobrenadante de un cultivo celular por métodos convencionales, por ejemplo, que comprenden la homogeneización de las células, cromatografía, tal como cromatografía de intercambio iónico, hidrófoba o de exclusión molecular, precipitación, por ejemplo, con sulfato amónico o ácido, electroforesis preparativa tal como electroforesis en gel de poliacrilamida o enfoque isoeléctrico, y similares. Particularmente, la prolilendopeptidasa de Flavobacterium meningosepticum, que se expresa en E. coli, se extrae fácil y selectivamente de las células con un método de choque osmótico si la enzima se secreta en la región periplásmica. La enzima bruta obtenida puede purificarse adicionalmente con métodos habituales, por ejemplo, que comprenden cromatografía, tal como cromatografía de intercambio iónico, hidrófoba o de exclusión molecular, electroforesis preparativa tal como electroforesis en gel de poliacrilamida, o enfoque isoeléctrico, y similares.
Producción de péptidos amidados en el extremo C
La presente invención también se refiere a un método para la producción de péptidos amidados en el extremo C por medio del uso de prolilendopeptidasa. La prolilendopeptidasa cataliza no sólo la escisión hidrolítica de un péptido en el lado del extremo C de un resto de prolina, sino también la formación del enlace peptídico en la manera inversa de la hidrólisis, y el acoplamiento de un fragmento peptídico en el extremo C del otro fragmento que está terminado por un resto de prolina. En condiciones controladas, la reacción de acoplamiento es predominante y la prolilendopeptidasa se usa para catalizar el acoplamiento de dos fragmentos peptídicos (o de un aminoácido a un fragmento peptídico). Las condiciones preferidas del acoplamiento son un exceso de uno de los fragmentos peptídicos (o un aminoácido) y la presencia de un disolvente orgánico, tal como glicerol, etilenglicol, butanodiol, etanol, n- propanol, i- propanol, acetonitrilo, DMF y DMSO, en una alta concentración, típicamente mayor que el 50%.
En realizaciones preferibles de la presente invención, los péptidos biológicamente activos cuyos extremos C están \alpha-amidados y tienen restos de prolina, preferiblemente en o cerca de su extremo C, se preparan con una prolilendopeptidasa a partir de dos precursores de los mismos, donde uno de los precursores es un péptido precursor que forma una región N-terminal del péptido bioactivo amidado y que tiene un resto de prolina en su extremo C y el otro precursor es un péptido precursor o aminoácido que forma una porción C-terminal del péptido bioactivo amidado, habiéndose amidado el péptido precursor o aminoácido en el extremo C. Los péptidos bioactivos \alpha-amidados preparados con prolilendopeptidasa incluyen aspartocina, bermofina, calcitonina, CGRR, CGRP II, hormona de concentración de eritróforos de crustáceos, péptido I mioactivo de cucaracha, hormona de cambio de color, glumitocina, granuliberina-R, isotocina, LH-RH, mesotocina, neuropéptido modulador de morfina, \alpha-MSH, oxitocina, fenipresina, SCP_{A}, SCP_{B}, valitocina, vasopresina y vasotocina.
La presente invención proporciona un proceso para la producción de una molécula de ADN recombinante que comprende un gen que codifica para prolilendopeptidasa, que comprende las etapas de preparar ADNc o ADN genómico a partir de las células, preferiblemente células bacterianas, capaces de producir prolilendopeptidasa, insertar fragmentos de ADN que codifican para prolilendopeptidasa en un vector de clonación y seleccionar un vector híbrido que contenga el ADN que codifica para la prolilendopeptidasa.
En particular, la presente invención se refiere a las realizaciones descritas en los ejemplos.
Descripción de las figuras
La fig. 1 representa mapas de restricción de los insectos clonados en pFPEPO2 y pFPEPO3. El recuadro blanco representa la fase de lectura abierta del gen de prolilendopeptidasa y el recuadro negro una secuencia consenso del sitio catalítico de proteasas de serina. Los insertos clonados de pFPH6, pFPH5 y sus subclones de deleción (KD50, KD7 y KD6) también están alineados con los mapas en la misma escala.
Las figs. 2 a 4 representan un proceso para la construcción de plásmidos de expresión pUK-FPEP-a y pUK-FPEP-b a partir de un plásmido intermedio pFPEPO4.
Ejemplos
A continuación, la presente invención se ilustrará adicionalmente, pero sin limitarse de forma alguna, por los siguientes ejemplos.
En los ejemplos, comúnmente se usan los siguientes materiales y métodos.
En la tabla I, se indican las cepas bacterianas y plásmidos usados.
TABLA 1 Cepas y plásmidos 
\nobreak\vskip.5\baselineskip\centering\begin{tabular}{|c|l|}\hline
 Cepas o plásmidos  \+ Genotipos relevantes \\\hline  Cepas \+ \\ 
 E. Coli  \+ \\  JM 83  \+ ara,
 \Delta   (lac  -  proAB),
rpsL(=strA), \diameter 80 ^{r} , lacZ   \Delta  M15 \\   \+ recA1,
endA1, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relA1, \\  JM109  \+
 \lambda^{-} ,  \Delta   (lac  -  proAB),
F'[proAB ^{+} , lacI ^{q} ,  lacZ,  \Delta  M15, \\   \+ traD36] \\ 
HB 101  \+ F ^{-} , hsdS20  (r ^{-}_{B} , m ^{-}_{B} ), recA13,
ara  -  14,  proA2, lacYI, \\   \+ galK2, rpsL20
(Sm ^{I} ), xyl  -  5, mtl  -  1, supE44,
 \lambda^{-} , \\   \+ mcrA ^{+} , mcrB ^{-}  \\  TGI  \+ supE, hsd
 \Delta 5, thi, D  (lac  -  proAB), F'[proAB ^{+} ,
lacI ^{q} , \\   \+ lacZ  \Delta  M15, traD36] \\   \+ IFO 12535
(ATCC 13253) \\   F. meningosepticum  \+ \\  Plásmidos \+ \\ 
pUC19  \+ Amp ^{r} , lacI', lacZ' \\  pUC118  \+ Amp ^{r} , lacI',
lacZ', M13IG \\  pUC119  \+ Amp ^{r} , lacI', lacZ', M13IG
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
La transformación, el mapeo de restricción, la preparación de plásmidos y otros procedimientos de clonación molecular se realizan por métodos convencionales. (Sambrook, J. et al. ``Molecular cloning: a laboratory manual'', 2ª ed. 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor; Silhavy, T.J. et al. ``Experiments with gene fusions'', 1984, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). Las enzimas de restricción y las enzimas de modificación de ADN se usan de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. La deleción con la exonucleasa III se realiza por medio del uso de un kit Kilo-Sequence Deletion (Yanisch-Perron, C. et al., Gene, 1985, 33, 103-119; Henikoff, S. Gene, 1984, 28, 351-359.) Las secuencias de nucleótidos se determinan por el método didesoxi, usando un kit Sequenase. El ADN genómico de F. Meningosepticum se aísla por el método de Saito y Miura (Saito, H. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1963, 72, 619-629).
Las enzimas de restricción, las enzimas modificadoras del ADN, el kit kilo- Sequence Deletion y el kit MEGALABEL se adquieren de Takara Shuzo Co. Ltd. (Kyoto). El kit Sequenase Ver. 2.0 es el producto de U.S. Biochemical Corp. (Cleveland, Ohio). La polilendopeptidasa de F. Meningosepticum y la endoproteinasa Asp-N se adquieren de Seikagaku Corp. (Tokyo) y Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co. Ltd. (Tokio), respectivamente. Los substratos enzimáticos, Z-Gly-Pro-\beta- naftilamida y Z-Gly-Pro- P-nitroanilida, se obtienen de Novabiochem AG (Laeufelfingen, Suiza). Los radioisótopos se adquieren de Amersham Japan Co. Ltd. (Tokio) y los demás agentes bioquímicos se obtienen de Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri), Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Osaka) y Nacalai Tesque Inc. (Kyoto).
Ejemplo 1
Preparación de sondas de ADN
La prolilendopeptidasa obtenida en el mercado se purifica por HPLC de fase inversa en una columna TSKgel Octadecyl NPR de 4,6 x 35 mm (Tosoh Co. Ltd). La columna se eluye con TFA al 0,01% en agua y una mezcla 3:1 de CH_{3}CN e i-PrOH, a un caudal de 1 ml/min. El gradiente del 35-70% de la mezcla de disolvente orgánico se aplica durante 40 minutos y se recoge el pico principal.
Como el extremo N de la endopeptidasa está bloqueado, la enzima debe someterse a escisión proteolítica para determinar su estructura primaria parcial. Las proteasas usadas comúnmente para la escisión, tales como la tripsina, no proporcionan resultados satisfactorios. Por lo tanto, se investigan sistemáticamente las proteasas y las condiciones de la escisión hidrolítica y se descubre que la endoproteinasa Asp-N proporciona los mejores resultados.
La enzima purificada (0,5 mg) en carbonato amónico 10 mM, pH 7,9, que contiene urea 4 mM, se hidroliza por 1 \mug de Endoproteinasa Asp-N a 37ºC durante 24 horas. La mezcla de péptidos obtenida por esta digestión se separa por HPLC de fase inversa en una columna Vydac C18 de 4,6 x 250 mm (Separations Group Corp.) con la fase móvil de TFA al 0,01% en agua y una mezcla 3:1 de CH_{3}CN e i-PrOH. El caudal es de 1 ml/min. Los péptidos aislados se purifican adicionalmente por medio de una segunda cromatografía. La secuencia de aminoácidos de los fragmentos purificados se determina por degradación manual de Edman usando los métodos descritos por Kobayashi y Tarr (Kobayashi, R. et al., Tanpakushitsu Kakusan Koso, 1986, 31, 991-1002; Tarr, G.E. ``Methods in protein sequencing analysis'' (ed. Elzinga, M.), 1982, 223-232, Humana Press, New Jersey).
La secuencias de nucleótidos para las sondas no se determinan únicamente a partir de la secuencias de aminoácidos debido al uso múltiple de los codones. De las 23 secuencias de aminoácidos parciales, se eligen seis que proporcionan relativamente menos combinaciones de secuencias de nucleótidos posibles para obtener sondas de ADN (tabla II). No se conoce el uso preferido de codones en F. Meningosepticu, y se adoptan dos pautas en el diseño de las sondas de nucleótidos. Particularmente, tres de las 6 sondas (A- 12, 13 y 19) se diseñan para que consten de una sola secuencia oligonucleotídica, seleccionando el codón más probable para cada resto aminoacídico suponiendo que el ADN genómico de F. meningosepticum es rico en GC. Las otras tres (A-3, 9 y 18) son mezclas de oligonucleótidos de las posibles secuencias. Para reducir adicionalmente el número de las posibles secuencias en la mezcla, se pone inosina (I) en la posición que puede ser una de las cuatro bases, A, G, C y T, ya que la inosina forma pares de bases estables con las cuatro.
TABLA II Secuencias de aminoácidos parciales determinadas de los fragmentos de prolilendopeptidasa obtenidos por la digestión con Endoproteinasa Asp-N (mostrada por los números de restos aminoacídicos en la SEC ID Nº 1), y posiciones de nucleótidos correspondientes en la SEC ID Nº 1 de las sondas diseñadas a partir de las secuencias de aminoácidos. 
\dotable{\tabskip6pt\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Fragmento Nº \+ Resto aminoacídico Nº \+ Sonda Nº \+ Posición de
nucleótido\cr  \+ en la SEC ID Nº1 \+ \+ correspondiente en la\cr 
\+ \+ \+ SEC ID Nº 1\cr\hline  3 \+ 499  -  509 \+
A  -  3 \+ 1811  -  1833\cr  9 \+
352  -  364 \+ A  -  9 \+
1370  -  1407\cr  12 \+ 28  -  34 \+
A  -  12 \+ 398  -  414\cr  13 \+
182  -  190 \+ A  -  13 \+
860  -  877\cr  18 \+ 380  -  391 \+
A  -  18 \+ 1454  -  1485\cr  19 \+
268  -  276 \+ A  -  19 \+
1118  -  1137\cr\hline}
Los oligonucleótidos se sintetizan con un sintetizador de ADN Applied Biosystems modelo 381A. Después de retirar el grupo dimetoxitritilo al final de la secuencia sintética, los oligonucleótidos se desprotegen y se escinden de los soportes, de acuerdo con los protocolos del fabricante. Después, los ADN sintetizados se someten a electroforesis preparativa con gel de poliacrilamida al 8% en urea 7 M. Los oligonucleótidos purificados se extraen de las bandas separadas y se desionizan por medio del uso de columnas Waters Sep-Pack C-18.
Ejemplo 2
Evaluación de las sondas
El ADN cromosómico se aísla de F. meningosepticum y se digiere por cuatro tipos de enzimas de restricción usadas comúnmente que reconocen secuencias hexanucleotídicas, es decir, PstI, HindIII, EcoRI y BglII.
Las sondas oligonucleotídicas se radio-marcan por medio del uso de un kit MEGALABEL con [\gamma-^{32}P]ATP para proporcionar una actividad específica de aproximadamente 1 x 10^{6} cpm/pmol. Los fragmentos cromosómicos se someten a electroforesis en un gel de agarosa al 0,7% y se transfieren a un filtro de nitrocelulosa Millipore por el método descrito por Sambrook et al. (Sambrook et al., 1989, supra).
Después de la prehibridación de acuerdo con un protocolo convencional (Sambrook, et. al., 1989, supra), la hibridación se realiza en solución de hibridación 6x SSC con 0,2 pmol/ml de la sonda marcada a 45ºC durante 16 horas. El filtro se lava con 6x SSC tres veces durante 3 minutos a temperatura ambiente y después una vez durante 1 minuto a 45ºC. La autorradiografía se realiza con un analizador de imágenes Fuji Bio BAS 2000. Se descubre que sólo la sonda A-3 proporciona una señal clara y específica con cada uno de los ADN digeridos.
Ejemplo 3
Preparación de biblioteca genómica y selección de la misma
Por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (Yoshimoto et al., 1980, supra), se descubre que el peso molecular de la prolilendopeptidasa es bastante grande, de 76.000. El tamaño de la enzima corresponde a 2 kb de la región codificante en el genoma. Cuanto mayor es el ADN clonado, más probabilidad hay de incluir la longitud completa de la fase de lectura abierta. Por lo tanto, más bien se desea un fragmento grande pero suficientemente pequeño como para conseguir una alta eficacia en la transformación, y se seleccionan 7 kb del fragmento BglII. Particularmente, el ADN genómico digerido por BglII se somete a electroforesis preparativa con agarosa de bajo punto de fusión y se corta la fracción del gel que contiene fragmentos de 7 kb. La pieza gel escindida se disuelve en una mezcla de unión y los fragmentos cromosómicos extraídos se clonan en el sitio BamHI de pUC19. Por medio de esta mezcla de unión, se transforma E. coli HB101 para proporcionar una biblioteca genómica que comprende aproximadamente 4.000 recombinantes.
La biblioteca genómica se selecciona con la sonda A-3 por hibridación de colonias y se obtienen 119 clones positivos. Se eligen 16 clones positivos y se analizan adicionalmente por digestión con endonucleasas de restricción y el ensayo enzimático. Se descubre que un clon con el inserto de 7 kb muestra una actividad prolilendopeptidasa comparativamente alta. El plásmido se denomina pFPEP02 y se caracteriza adicionalmente.
Ejemplo 4
Mapeo de restricción y secuenciación del ADN de los clones aislados
El mapa de restricción del inserto de pFPEP02 se muestra en la fig. 1. Para localizar la región codificante, el ADN del inserto se escinde por la enzima de restricción apropiadas y se subclona en pUC118 o pUC119. El clon que tiene 2,6 kb del fragmento HincII-EcoRI (pFPH6) muestra la mayor actividad enzimática. Para determinar la secuencia de nucleótidos entera de este fragmento, se genera una serie de subclones de deleción a partir de cualquier extremo de un fragmento más grande que incluye el fragmento de 2,6 kb (pFPEP03, depositado como FERM BP-3466). A partir de los mutantes de deleción y los fragmentos de restricción subclonados, se determina la secuencia entera del fragmento de 2,6 kb por el método didesoxi (SEC ID Nº 1).
El gen de prolilendopeptidasa se representa por el recuadro blanco en la fig. 1. Se descubre que el gen tiene una fase de lectura abierta de 2.118 pb, que está precedida por una supuesta secuencia promotora separada por 28 pb del codón de iniciación ATG. La endopeptidasa, prevista a partir de la secuencia de nucleótidos, consta de 705 restos aminoacídicos con un peso molecular calculado de 78.700, lo cual está en conformidad con el valor de 77.500 determinado por el equilibrio de sedimentación (Yoshimoto, T. et al., Agric. Biol. Chem. 1982, 46, 2157-2158). La enzima se ha considerado una proteasa de serina basándose en el estudio de inhibidores (Yoshimoto et al., 1980, supra). De acuerdo con la suposición, hay una secuencia consenso de sitio catalítico de la proteasa de serina, Gly-X-Ser-X-Gly, en la región c- terminal. El contenido de G-C del fragmento HincII-EcoRI clonado es del 38,4% y bastante bajo, lo cual es contrario a las expectativas. En los bancos de datos de proteínas NBRF-PIR y SWISS-PROT, no se encuentra ninguna proteína que tenga una homología significativa con la prolilendopeptidasa.
Ejemplo 5
Expresión de prolilendopeptidasa
Para la expresión de prolilendopeptidasa, se cultiva E. coli transformada con un plásmido en medio TY a 37ºC con agitación en un agitador rotatorio (120 rpm). El caldo TY usado para la expresión de prolilendopeptidasa en E. coli contiene un 1% de triptona de Bacto, un 0,1% de extracto de levadura de Bacto, un 0,1% de glucosa, un 0,8% de NaCl, pH 7. Se cultiva F. meningosepticum en un medio de polipeptona que contiene un 1% de polipeptona, un 0,2% de extracto de levadura de Bacto, un 0,1% de MgSO_{4} 7H_{2}O y un 2,5% de NaCl (pH 7), de acuerdo con las instrucciones de una recolección de cultivos.
Para la estimación cualitativa de la actividad enzimática y para la evaluación cuantitativa, se emplean, respectivamente, dos métodos de ensayo (A y B). En el método A, se usa Z-Gly-Pro-\beta- naftilamida (Z = N-benciloxicarbonilo) como substrato. A 0,8 ml de tampón Tris- HCl 20 mM, pH 7,0, se le añaden 0,1 ml de cultivo de E. coli o suspensión de células diluidas y la mezcla se preincubó a 37ºC durante 3 minutos. La reacción se inicia por la adición de 0,1 ml de la solución de substrato (5 mM) en dioxano al 40% y se termina después de 10 minutos por la adición de 0,5 ml de solución de Fast Garnet GBC (1 mg/ml) que contiene Triton X-100 al 10% en tampón acetato 1 M, pH 4,0. La mezcla de reacción se deja a temperatura ambiente durante 20 minutos y se centrifuga a 12.000 g durante 5 min. La absorbancia del sobrenadante se mide a 550 nm.
En el ensayo cuantitativo (B), se recogen células E. coli por centrifugación, se lavan con HEPES 0,1 M (pH 7,4) y se suspenden en el mismo volumen de la solución HEPES que el cultivo. La suspensión de células se sonica en hielo durante 60 segundos con intervalos de 3 minutos para proporcionar un lisado celular. A 0,94 ml de tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 7,0, se les añaden 0,05 ml de Z-Gly-Pro- p-nitroanilida 4 mM en dioxano al 40%. Después de 3 minutos de preincubación a 30ºC, se añaden 0,01 ml del lisado diluido a la mezcla y se sigue el cambio de absorbancia a 410 nm con un espectrofotómetro Hitachi U-3210 a 30ºC. Una unidad de la actividad enzimática se define como la cantidad de la enzima que libera 1 \mumol de p-nitroanilina por minuto, que corresponde a 8,87 OD/min. con este procedimiento convencional.
Aunque el clon que tiene el fragmento HincII-EcoRI (pFPH6) muestra claramente la actividad de la prolilendopeptidasa, la actividad es mucho menor que la de la bacteria original. Para mejorar el nivel de expresión, se prepara otra serie de mutantes de deleción a partir del clon que tiene el fragmento HincII- BamHI (pFPH5). Como la deleción se extiende desde el extremo 5' del fragmento, la actividad enzimática aumenta gradualmente para alcanzar un máximo con pFPH5-KD50 (fig. 1). Y después, la actividad se reduce pero continúa siendo moderada (pFPFH5-KD7), cuando la deleción alcanza la parte inicial de la fase de lectura. Se detecta muy poca actividad en un clon con una deleción adicional (pFPH5- KD6). Por lo tanto, se investiga adicionalmente con detalle la expresión de la enzima en KD50.
El plásmido pFPH5-KD50 contiene 120 pb de una región no codificante cadena arriba que comprende la supuesta secuencia promotora, junto con la longitud completa de la fase de lectura abierta. Se cultiva E. coli (JM83) transformada por este plásmido en medio TY, y se sigue el transcurso de tiempo de la expresión de polilendopeptidasa con la actividad enzimática de la proteína total en un homogeneizado de la célula lavada (tabla III). Después de aproximadamente de 6 a 12 horas, cuando se detiene el crecimiento de las bacterias, la actividad total de las enzimas aumenta rápidamente y alcanza el valor máximo de 3.371 unidades/l que corresponde a 10 veces la actividad enzimática obtenida por F. menigosepticum (346 unidades/l). La actividad total permanece constante hasta 24 horas y después se reduce lentamente. Por otra parte, la actividad específica muestra el rápido aumento después de aproximadamente 6 a 12 horas similar a la actividad total, pero aumenta gradualmente incluso después de 24 horas. Se alcanza una actividad específica máxima de 10,6 unidades/mg de proteína aproximadamente a las 36 horas. Como la actividad específica típica de la prolilendopeptidasa purificada es de aproximadamente 115 unidades/mg de proteína, el nivel de expresión de prolilendopeptidasa en este clon supone aproximadamente 1/10 de la proteína total.
En el análisis de SDS-PAGE, también se demuestra dicho alto nivel de expresión de la prolilendopeptidasa. La muestra para SDS-PAGE se prepara mezclando los lisados descritos anteriormente con un volumen igual de tampón de muestra que contiene SDS y \beta- mercaptoetanol e incubando a 96ºC durante 5 minutos. La electroforesis se realiza usando una placa premoldeada (12,5%, 84 x 90 x 1,0 mm) y el aparato obtenido en Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd. (Tokyo), de acuerdo con los protocolos proporcionados por el fabricante. El gel se tiñe con azul brillante de Coomassie R250.
A las 12 horas, se distingue claramente la aparición de una nueva banda en la misma posición que el patrón de prolilendopeptidasa procedente de F. meningosepticum. La intensidad de esta banda es la más alta aproximadamente a las 12-24 horas, período en el que también se observa el cambio de la actividad total de la enzima.
En la siguiente tabla III se muestra la producción de prolilendopeptidasa.
\newpage
TABLA III Expresión de prolilendopeptidasa en E. coli (JM83) que lleva pFPH5-KD50 
\dotable{\tabskip6pt\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{\hline
 Tiempo (h) \+ Absorbancia a 550 nm en medio \+ Actividad Total \+
Actividad  específica (uni-\cr  \+ de cultivo \+ (unidad/l) \+
dad/mg proteína)\cr\hline  0 \+ 0,12 \+ 0 \+ 0\cr  6 \+ 4,14 \+ 572
\+ 2,2\cr  12 \+ 6,06 \+ 3371 \+ 8,8\cr  24 \+ 5,75 \+ 3388 \+
9,7\cr  36 \+ 5,20 \+ 3003 \+ 10,6\cr  48 \+ 4,69 \+ 2494 \+
10,5\cr\hline}
Ejemplo 6
Mejora adicional de la expresión
La expresión en E. coli JM 83 que lleva pFPH5-KD50 ha alcanzado un nivel bastante alto, pero sería preferible un nivel incluso superior para la producción industrial de prolilendopeptidasa. En pFPH5-KD50 se ha encontrado una supuesta secuencia promotora, procedente de F. meningosepticum, y se supone que funciona en E. coli. Para mejorar el nivel de expresión adicionalmente, este promotor nativo se reemplaza por el promotor híbrido trp-lac fuerte (o promotor tac), como se indica a continuación.
El plásmido pFPEO2 se digiere con HincII para obtener un fragmento HincII de 3,1 kpb que contiene el gel de prolilendopeptidasa, que después se subclona en el sitio SmaI de pUC118 por unión de extremos romos para proporcionar pFPEPO4. Después de la unión, los puntos de inserción en los dos extremos del fragmento no se pueden escindir ni por HincII ni por SmaI (fig. 2). Para delecionar los sitios ScaI y PvuII en la región codificante, se prepara el fragmento oligonucleotídico bicatenario sintético que corresponde a la secuencia entre los sitios SmaI y PvuII pero que está mutado en dos posiciones (fragmento sintético I, véase SEC ID Nº 2) hibridando sólo la cadena inferior y la cadena superior cuyo extremo 5' se ha fosforilado de antemano por la polinucleótido quinasa de T4.
Por otra parte, el plásmido pFPEPO4 se escinde en le único sitio SmaI que existe en la fase de lectura abierta, y el fragmento SmaI-PvuII mutado mencionado anteriormente se une al plásmido linealizado en los dos sitios SmaI terminales. El producto de unión después se digiere por SacI y el fragmento más largo, que contiene la porción 5' de la región codificante, se aísla por electroforesis en gel de agarosa. Después de fosforilar el fragmento aislado, se une la pieza que falta entre los sitios PvuII y SacI, preparada por separado a partir de pFPEPO4, para construir el plásmido pFPEPO4'. Como se ha cambiado un nucleótido en el extremo generado por PvuII en el fragmento sintético, el sitio PvuII no se regenera por esta ciclación.
A continuación, se crea un nuevo sitio EcoRI inmediatamente cadena arriba del codón de iniciación del gen de la prolilendopeptidasa como se indica a continuación (véase la fig. 3). El fragmento sintético II (SEC ID Nº 3) se prepara por unión de los cuatro oligonucleótidos U1, U2, L1 y L2 (véanse las SEC ID Nº 4, 5, 6, y 7 respectivamente), habiéndose fosforilado dos de ellos (U2 y L1) en su extremo 5'. El fragmento preparado corresponde desde el codón de iniciación al sitio PvuII en la región codificante cadena arriba y tiene extremos 5' cohesivos salientes inmediatamente cadena arriba del sitio de iniciación para introducir el sitio EcoRI después de la unión. Para la posterior unión, los dos extremos 5' del fragmento preparado se fosforilan por la polinucleótido quinasa de T4.
El plásmido pFPEPO4' en el que se ha delecionado uno de cuatro PvuII, se digiere con PvuII, y el fragmento que contiene la mayor parte de la región codificante se aísla por electroforesis en gel de agarosa y se une al segundo fragmento sintético descrito anteriormente. El producto obtenido por la unión se digiere con EcoRI para aislar la fase de lectura abierta completa con los extremos cohesivos salientes 5' en los dos extremos, que después se subclona en el sitio EcoRI de pUC119. Las dos regiones sintéticas en el plásmido obtenido, pFPEP-EE, se secuencian y se confirman las secuencias de nucleótidos mutadas. El plásmido resultante es pFPEP-EE.
En la siguiente etapa de la construcción del vector, como se muestra en la fig. 4, la región codificante entera, junto con una región no codificante cadena abajo corta, se escinde de pFPEP- EE por EcoRI. El fragmento después se inserta en el sitio EcoRI del vector de expresión, pKK223- 3, para proporcionar pKK- FPEP en el que la transcripción del gel de prolilendopeptidasa está bajo el control del promotor tac.
El origen de replicación de pKK223-3 procede de pBR322, y el número de copias de este vector de expresión en una sola célula es habitualmente bajo. Debido al mayor efecto de dosis del gen, es preferible un plásmido con un alto número de copias como vector de expresión para conseguir un nivel de expresión superior. Por lo tanto, a) una serie del promotor y la región codificante o b) una serie del promotor, la región codificante y el terminador se escinde por BamHI o BbiII, respectivamente, y se transplanta en el plásmido con alto número de copias, pUC119. Como el gen de la peptidasa se transfiere desde pKK-FPEP junto con el promotor tac, el promotor lac original de pUC119 se retira por PvuII para evitar un promotor doble. Entre los extremos romos generados por esta digestión con PvuII, se inserta la serie de gen a) o la serie b), en la que los extremos se han convertido en extremos romos por la ADN polimerasa de T4, para proporcionar pUK-FPEP-a o pUK-FPEP-b, respectivamente (fig. 4).
Para la sobreexpresión de la prolilendopeptidasa, se transforma E. coli, JM 109 por pUK-FPEP-a o pUK-FPEP-b. Los transformantes se seleccionan en placas LB que contienen 50 \mug/ml de ampicilina y se cultivan en medio LB con la ampicilina durante una noche. Para la expresión de la prolilendopeptidasa, se inoculan 100 ml de medio CIRCLEGROW (BIO 101, Inc., Vista, California) (sin ampicilina) con 2 ml del cultivo de una noche y se agitan a 37ºC. En un experimento preliminar, se descubre que el nivel de expresión máximo en el transformante que lleva pUK-FPEP-a (13.500 unidades/l) es dos veces mayor que para pUK-FPEP-b (6.600 unidades/l) cuando la expresión se refuerza con IPTG 1 mM medio día después de la inoculación. Sin el IPTG, los niveles de expresión basal para los dos clones también son bastante altos; en el caso de pUK-FPEP-b es incluso mayor (8.060 unidades/l) que el nivel obtenido por la adición de IPTG.
Como pUK-FPEP-a muestra el mayor nivel de expresión, alcanzando 39 veces la actividad enzimática obtenida por F. meningosepticum y 4 veces en nivel de expresión conseguido con pFPH5-KD50, se sigue el transcurso de tiempo de la expresión con o sin la adición de IPTG (tabla IV). Como el crecimiento, controlado por la absorbancia del caldo de cultivo a 550 nm, se ralentizó aproximadamente 4 horas después de la inoculación, la actividad de la enzima aumenta linealmente a lo largo del transcurso de tiempo. Sin el refuerzo de la expresión por el IPTG, la actividad aumenta adicionalmente de forma lineal hasta 20 horas para conseguir el nivel máximo de 7.400 unidades/l a las 24 horas y después se reduce. La actividad específica de la endopeptidasa permaneció constante a aproximadamente 11 unidades/mg de proteína después de 12 horas. Por otra parte, cuando se añade IPTG 1 mM a las 12 horas, el aumento se potencia claramente inmediatamente después de la adición, alcanzando el máximo nivel de expresión de 13.500 unidades/l a las 28 horas. También se observa un aumento significativo en la actividad específica simultáneamente con un aumento rápido en el nivel de expresión, y la actividad específica máxima, 40 unidades/mg de proteína, se observa a las 28 horas y posteriormente, lo cual demuestra claramente el efecto de la inducción de IPTG sobre el promotor tac. Como se informó que una preparación pura típica de prolilendopeptidasa procedente de F. meningosepticum mostraba un actividad específica de 115 unidades/mg de proteína (Yoshimoto, T. et al., 1978 supra), la enzima expresada representa más de un 30% de la proteína total extraída de E. coli.
Tal alto nivel de expresión de prolilendopeptidasa también se demuestra en el análisis de SDS-PAGE. Ya a las 6 horas después la inoculación, se detecta claramente la aparición de una nueva banda en la misma posición que el patrón de polilendopeptidasa, y la expansión de esa banda demuestra claramente el aumento en el nivel de expresión durante el transcurso de tiempo de 12 a 28 horas, conjuntamente con el cambio de la actividad total de la enzima.
TABLA IV Expresión de prolilendopeptidasa en E. coli (JM109) que lleva pUK-FPEP-a^{a}
1
Ejemplo 7
Producción de prolilendopeptidasa recombinante
Como la prolilendopeptidasa se expresa en E. coli en una forma soluble y activa y el nivel de expresión es tan alto (más de un 30% de la proteína extraída total), el aislamiento de la enzima expresada es bastante directo.
Se cultivan células E. coli transformadas con el plásmido de expresión pUK- FPEP-a en el medio CIRCLEGROW con refuerzo por IPTG durante 28 horas a 37ºC. Las células E. coli se recogen por centrifugación (3.000 g durante 10 minutos) y se lavan con tampón HEPES 0,1 M, pH 7,4 frío. Las células lavadas se resuspenden en HEPES 0,1 M y se rompen por sonicación de forma intermitente durante 20 minutos con un SONIFIER 450 (BRANSON Sonic Power Co.). El lisado después se fracciona con precipitación con sulfato amónico. La proteína precipitada con sulfato amónico saturado al 65-90% se disuelve en tampón fosfato 20 mM, pH 6,2 y se dializa frente al mismo tampón. El dializado se aplica a una columna CM52 (Whatman BioSystems Ltd.) equilibrada con el mismo tampón. La enzima se eluye por un gradiente lineal de NaCl. Las fracciones activas se combinan, se concentran por ultrafiltración con una célula Amicons y un membrana YM30 (Amicon Div., W.R.Grace & Co.) y se dializan frente a tampón fosfato 20 mM, pH 6,8. La prolilendopeptidasa se purifica adicionalmente en una columna Mono S HR 10/10 (Pharmacia LKB Biotechnology AB). Con un gradiente de NaCl (0-0,075 M), la endopeptidasa se eluye en un pico agudo aproximadamente a una concentración de 0,035 M de NaCl. La enzima purificada parece ser homogénea, produciendo sólo una banda en SDS-PAGE.
Ejemplo 8
Producción de hormona de liberación de hormona luteinizante (LH-RH)
Como la LH-RH (un decapéptido) tiene un resto de prolina en la penúltima posición, se prepara a partir del precursor nonapeptídico y glicina-amida. En presencia de una cantidad catalítica de prolilendopeptidasa (0,08 \muM), se incuban 1 mM del precursor y glicina-amida 2,0 M en glicerol al 60% a pH 7,0 y a 30ºC. Después de 48 horas, el acoplamiento llega al equilibrio con la hidrólisis y la LH-RH se obtiene en una conversión del 67% con un rendimiento cuantitativo (rendimiento de aislamiento del 97%). El resto del precursor se recupera en la purificación por HPLC y no se indica ninguna reacción secundaria.
Ejemplo 9
Producción de oxitocina
La oxitocina, un nonapéptido que tiene un resto de prolina en la tercera posición desde su extremo C, se obtiene por acoplamiento del precursor de los primeros siete restos a leucilglicina-amida con prolilendopeptidasa. En un ejemplo típico, se incuban 1 mM del precursor de oxitocina [1-7] y leucilglicina-amida 0,8 M con prolilendopeptidasa 0,13 \muM en glicerol al 60% a pH 6,5 y a 30ºC. El acoplamiento avanza hasta alcanzar el equilibrio después de 48 horas y un 55% del precursor se convierte en oxitocina con un rendimiento cuantitativo (rendimiento de aislamiento del 91%). No se detecta ningún subproducto y se recupera el 43% del material de partida.
Ejemplo 10
Método alternativo para la purificación de prolilendopeptidasa recombinante
Se recogen células E. coli que expresan prolilendopeptidasa por centrifugación (10.000 g durante 10 min) y se lavan con tampón Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 frío. Las células lavadas se resuspenden en solución de sacarosa 0,5 M que contiene EDTA 5 mM tamponada a pH 8,0 con Tris- HCl 0,1 M. Se añade lisozima (160 \mug/ml) a la suspensión y la mezcla se deja en hielo durante 2 minutos antes de la dilución con el mismo volumen de agua enfriada con hielo. La suspensión celular diluida se deja adicionalmente en hielo durante 30 minutos y después se centrifuga a 10.000 g durante 20 minutos. El sobrenadante se diluye de nuevo con el mismo volumen de agua enfriada con hielo y su pH se ajusta a 7,0 con NaOH 1 N. La solución enzimática bruta obtenida (una fracción de periplasma) se aplica directamente a una columna CM 52 (Whatman BioSystems Ltd.) equilibrada con tampón fosfato 20 mM, pH 6,8. La enzima se eluye en un solo pico con un gradiente lineal (0-0,25 M) de NaCl. En este método de purificación alternativo con el procedimiento de choque osmótico, la prolilendopeptidasa se purifica hasta la homogeneidad a juzgar por el análisis de SDS-page con una sola etapa de cromatografía.
Ejemplo 11
Propiedades de prolilendopeptidasa recombinante de Flavobacterium meningosepticum expresada en E. coli
El método (B) descrito en el ejemplo 5 se modifica para ensayar la prolilendopeptidasa purificada. Se incluyen DTT (1 mM) y BSA (100 \mug/ml) en la solución tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0) para el ensayo, para mejorar la reproducibilidad y exactitud de la medición cinética. A 0,94 ml de esta solución tampón se les añaden 0,05 ml de Z-Gly-Pro-p-nitroanilida 4 mM en dioxano al 40%. Después de una preincubación de 3 minutos a 30ºC, se añaden a la mezcla 0,01 ml de la solución enzimática obtenida en el ejemplo 10 y se siguen los cambios de la absorbancia 410 nm a 30ºC.
En una purificación típica, se obtiene la enzima con una actividad específica superior a 120 unidades/mg de proteína. Se estima que el peso molecular es de 71.000 y 74.000 por exclusión molecular con una columna TSK-GEL G3000SW (Tosoh Corp.) y SDS-PAGE, respectivamente. La enzima muestra un coeficiente de extinción (1%/280 nm) de 15,5. Hay dos restos de cisteína de acuerdo con la secuencia de aminoácidos deducida con la SEC ID Nº 1, pero no se detecta ningún grupo sulfhidrilo libre por valoración con ácido p-cloromercuribenzoico en condiciones desnaturalizadas con urea 8 M.
Se ha descubierto que la secuencia N-terminal de la prolilendopeptidasa recombinante comienza con Ala y sigue con Gln, Asn, Ser, Asn, X (desconocido), Leu, Lys, Tyr y Pro, demostrando que los primeros 19 restos aminoacídicos mostrados en la secuencia con la SEC ID Nº 1 codifican una secuencia señal y están ausente del extremo N-terminal de la enzima madura.
Microorganismos depositados
E. coli TG1/pFPEPO3 se depositó, según el tratado de Budapest, en el Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRI), 1-3, Higashi 1- chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón, el 5 de julio de 1991, como FERM BP-3466.
\global\parskip.333\baselineskip
SEC ID Nº 1
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido con proteína correspondiente
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 2636 pares de bases
CADENA: doble
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
FUENTE ORIGINAL
ORGANISMO: Flavobacterium mengosepticum
FUENTE EXPERIMENTAL INTERMEDIA
NOMBRE DEL PLÁSMIDO: pFPEP 03
\begin{tabular}{lll}
\hspace{-2mm}CARACTERÍSTICAS: ADN \hspace{-4mm}\mbox{}\+  genómico
que codifica  para prolilendopeptidasa\hspace{-10cm}\mbox{}\\ \+ de
1 a 259 \+ región promotora\\ \+ de 260 a 316 \+ secuencia señal\\
\+ de 317 a 2374 \+ región codificante de prolilendopeptidasa
madura\\ \+ de 2375 a 2377 \+ codón stop \end{tabular}
92
93
94
95
96
97
98
SEC ID Nº 2
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 44 pares de bases
CADENA: doble
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
GGGAGTAGGA GTTCTGGATA TGCTTCGTTA TAATAAGTTT ACTG 
\hfill
44
SEC ID Nº 3
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 54 pares de bases
CADENA: doble
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
AATTCATGAA GTACAACAAA CTTTCTGTGG CAGTTGCAGC CTTTGCTTTT 
\hfill
50
GCAG 
\hfill
54
SEC ID Nº 4
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 23 bases
CADENA: sencilla
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
AATTCATGAA GTACAACAAA CTT 
\hfill
23
SEC ID Nº 5
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 31 bases
CADENA: sencilla
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
TCTGTGGCAG TTGCAGCCTT TGCTTTTGCA G 
\hfill
31
SEC ID Nº 6
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 25 bases
CADENA: sencilla
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
CACAGAAAGT TTGTTGTACT TCATG 
\hfill
25
SEC ID Nº 7
TIPO DE SECUENCIA: Nucleótido
LONGITUD DE LA SECUENCIA: 25 bases
CADENA: sencilla
TOPOLOGÍA: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético
CTGCAAAAGC AAAGGCTGCA ACTGC 
\hfill
25 
\global\parskip0pt

Claims (6)

1. Un proceso para la producción de un péptido amidado C-terminal a partir de dos precursores del mismo, donde uno de los precursores es un péptido precursor que forma la región N- terminal del péptido amidado C-terminal y que tiene un resto de prolina en su extremo C y el otro precursor es un péptido precursor o aminoácido que forma una porción C-terminal del péptido amidado C-terminal, habiéndose amidado dicho péptido precursor o aminoácido en el extremo C, que comprende las etapas de:
poner los dos precursores en contacto con prolilendopeptidasa de F. meningosepticum que tiene la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1 en un medio para convertir los péptidos precursores en péptido amidado C-terminal, y recuperar el péptido amidado C-terminal resultante.
2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, que se realiza en un exceso de uno del péptido precursor o el aminoácido y en presencia de un disolvente orgánico.
3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2, donde el disolvente orgánico se selecciona entre el grupo de glicerol, etilenglicol, butanodiol, etanol, n-propanol, i- propanol, acetonitrilo, DMF y DMSO.
4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 3, donde la concentración en el disolvente orgánico es mayor que el 50%.
5. Proceso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior para la producción de péptidos biológicamente activos cuyos extremos C están alfa-amidados y tienen restos de prolina a partir de dos precursores de los mismos, donde uno de los precursores es un péptido precursor que forma la región N- terminal del péptido bioactivo amidado y que tiene un resto de prolina en su extremo C y el otro precursor es un péptido precursor o aminoácido que forma una porción C-terminal del péptido bioactivo amidado, habiéndose amidado dicho péptido precursor o aminoácido en el extremo C.
6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 5, donde los péptidos bioactivos alfa- amidados son aspartocina, bermorfina, calcitonina, CGRP, CGRP II, hormona de concentración de eritróforos de crustáceos, péptido I mioactivo de cucaracha, hormona de cambio de color, glumitocina, granuliberina-R, isotocina, LH-RH, mesotocina, neuropéptido modulador de morfina, alfa-MSH, oxitocina, fenilpresina, SCPA, SCPB, valitocina, vasopresina y vasotocina.
ES92810537T 1991-07-24 1992-07-15 Adn que codifica para prolilendopeptidasa. Expired - Lifetime ES2197143T3 (es)

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EP91810595 1991-07-24
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GB9205457 1992-03-12

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