ES2199931T3 - Plantas transgenicas resistentes a enfermedades. - Google Patents

Plantas transgenicas resistentes a enfermedades.

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ES2199931T3 ES90105336T ES90105336T ES2199931T3 ES 2199931 T3 ES2199931 T3 ES 2199931T3 ES 90105336 T ES90105336 T ES 90105336T ES 90105336 T ES90105336 T ES 90105336T ES 2199931 T3 ES2199931 T3 ES 2199931T3
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Robert M. Goodman
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George B. Payne
Jeffrey R. Stinson
Jean-Marc Dr. Neuhaus
Mary B Moyer
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Abstract

EL PRESENTE INVENTO SE REFIERE A LOS CONSTRUCTORES DEL ADN QUIMERICO, UTIL PARA LA PRODUCCION DE PLANTAS TRANSGENICAS RESISTENTES A LAS ENFERMEDADES Y A LA INGENIERIA GENETICA, QUE PRODUCE EL FENOTIPO DE LA RESISTENCIA A LAS ENFERMEDADES. EN PARTICULAS, SE REFIERE A LA EXPRESION CONSTITUTIVA DE LAS SECUENCIAS DE ADN EN LAS PLANTAS TRANSGENICAS, QUE CODIFICAN LAS PROTEINAS RELACIONADAS CON LA PATOGENESIS (PRPS). UN OBJETIVO POSTERIOR DEL PRESENTE INVENTO, SON LOS NIVELES INDUCIDOS DE PRPS DE LAS PLANTAS TRANSGENICAS O DE LAS PROTEINAS HOMOLOGAS QUE PROPORCIONAN UN FENOTIPO RESISTENTE A LAS ENFERMEDADES POTENCIADO, CON RESPECTO A LAS PLANTAS SILVESTRES. OTRO OBJETIVO ES PROPORCIONAR RAMAS DE MRNA, QUE TRANSCRIBEN A LAS PLANTAS TRANGENICAS, DE LAS SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN LAS PRPS DE LA PLANTA O RAMAS DE MRNA DE LAS SECUENCIAS DE ADN HOMOLOGAS A LAS SECUENCIAS DE CDNA O GENOMICAS QUE CODIFICAN A LAS PRPS DE LAS PLANTAS. LAS PLANTAS TRANGENICAS TIENEN, POR TANTO, UN FENOTIPO DE RESITENCIA A LAS ENFERMEDADES POTENCIADO, CON RESPECTO A LAS PLANTAS SILVESTRES.

Description

Plantas transgénicas resistentes a enfermedades.
La presente invención se refiere a construcciones de ADN quimérico útiles para producir plantas transgénicas resistentes a enfermedades y para modificar plantas por ingeniería genética para producir el fenotipo de resistencia a enfermedades. En particular, se refiere a la expresión constitutiva en plantas transgénicas de secuencias de ADN que codifican proteínas relacionadas con la patogénesis (PRP). Las plantas de tipo silvestre expresan PRP durante la resistencia sistémica adquirida inducida por patógenos.
Los avances en la tecnología del ADN recombinante, junto con los avances en la tecnología de la transformación y la regeneración de plantas, han hecho posible introducir un nuevo material genético en células vegetales, plantas o tejidos vegetales, introduciendo de esta manera nuevos rasgos, por ejemplo, fenotipos, que mejoran el valor de la planta o del tejido vegetal. Las recientes demostraciones de plantas modificadas por ingeniería genética resistentes a patógenos (documentos EP 0 240 322 y EP 0 223 452) o insectos (Vaeck et al., 1987) y la producción de plantas tolerantes a herbicidas (de Block et al., 1987) subrayan la posibilidad de mejorar los cultivos. Los cultivos diana pueden variar de plantas leñosas tales como árboles y arbustos a plantas ornamentales y a cultivos extensivos.
Cutt et al. (1988) J. Cell Biochem., Suppl. 12c, Abstract Y210, investiga el estado de resistencia a patógenos de plantas transgénicas transformadas con construcciones de proteínas PR, pero no describe resultados ni datos sobre tales plantas.
Ahora puede conseguirse la producción de plantas transgénicas que sean resistentes a enfermedades, por medio de la presente invención que se refiere a, entre otras cosas, construcciones de ADN quimérico útiles para producir plantas transgénicas resistentes a enfermedades. Las construcciones de ADN quimérico contienen una secuencia de ADN codificante que codifica una PRP vegetal que normalmente se induce por patógenos en una planta de tipo silvestre, y una secuencia de ADN promotora que permite la expresión constitutiva de PRP o ARNm anti-sentido para PRP en una planta transgénica que contiene la construcción de ADN quimérico.
A. Proteínas relacionadas con la patogénesis: resistencia sistémica adquirida (SAR)
Las denominadas proteínas relacionadas con la patogénesis (PRP) son proteínas vegetales inducidas después de la infección por un patógeno. Se cree que estas proteínas pueden jugar un papel para proporcionar resistencia sistémica adquirida a la planta. Estas proteínas vegetales se inducen en grandes cantidades en respuesta a la infección por diversos patógenos, incluyendo virus, bacterias y hongos. Las PRP se descubrieron primero en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) que reaccionaban de forma hipersensible a la infección por el virus del mosaico del tabaco (TMV). Posteriormente, se han encontrado PRP en muchas especies vegetales (como revisiones, véase Redolfi, 1983; van Loon, 1985) y se cree que son una respuesta defensiva común de las plantas a la infección por patógenos.
Como se usa en este documento, las PRP son proteínas expresadas en plantas que reaccionan de forma hipersensible con patógenos. Este término incluye, pero sin limitación, las proteínas SAR8.2a y SAR8.2b, las formas ácidas y básicas de las proteínas PR-1a, PR-1b, PR-1c, PR-1', PR-2, PR-N, PR-O, PR-O', PR-P, PR-Q, PR-S y PR-R del tabaco, la quitinasa, que es un homólogo básico de PR-P o PR-Q, y la \beta-1,3-glucanasa (glucan endo-1,3-\beta-glucosidasa, EC 3.2.1.39), que es un homólogo básico de PR-2, PR-N o PR-O, y la quitinasa inducible por patógenos del pepino. Una reacción hipersensible se caracteriza por una necrosis local de los tejidos que rodean inmediatamente al sitio de infección por el patógeno y la localización posterior del patógeno. Esta reacción es diferente de una reacción sensible, donde el patógeno se extiende a lo largo de toda la planta. Son patógenos, por ejemplo, virus o viroides, por ejemplo, el virus del mosaico del tabaco o del pepino, el virus de manchas anulares o virus de necrosis, el virus del enrollamiento de la hoja del pelargonio, el virus del moteado del trébol rojo, el virus de la atrofia del tomate y virus similares, hongos, por ejemplo, Phytophthora parasitica o Peronospora tabacina, bacterias, por ejemplo, Pseudomonas syringae o Pseudomonas tabaci, o áfidos, por ejemplo, Myzus pericae. Esta lista no pretende ser limitante en ningún aspecto.
B. Revisión general de la tecnología de transformación de plantas
En la técnica se conocen diversos métodos para realizar la transformación genética de plantas y tejidos vegetales (es decir, la introducción estable de ADN extraño en plantas). Éstos incluyen la transformación por especies de Agrobacterium y la transformación por transferencia génica directa.
1. Transformaciones mediadas por Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens es el agente etiológico de las agallas de corona, un enfermedad de una amplia serie de dicotiledóneas y gimnospermas, que ocasiona la formación de tumores o agallas en el tejido vegetal en el sitio de la infección. Agrobacterium, que normalmente infecta a la planta en sitios de heridas, lleva un elemento extracromosómico grande denominado plásmido Ti (inductor de tumores).
Los plásmidos Ti contienen dos regiones requeridas para la tumorigenicidad. Una región es el ADN-T (ADN transferido) que es la secuencia de ADN que se encuentra finalmente transferida de forma estable en el ADN genómico de la planta. La otra región requerida para la tumorigenicidad es la región vir (virulencia), que se ha implicado en el mecanismo de transferencia. Aunque la región vir es absolutamente necesaria para una transformación estable, el ADN de vir no se transfiere realmente a la planta infectada. La transformación de células vegetales mediada por la infección con A. tumefaciens y la transferencia posterior del ADN-T solo están bien documentadas (Bevan y Chilton, 1982).
Después de varios años de investigación intensa en muchos laboratorios, el sistema de Agrobacterium se ha desarrollado para permitir la transformación rutinaria de una diversidad de tejidos vegetales. Los tejidos representativos transformados de esta manera incluyen tabaco, tomate, girasol, algodón, colza, patata, soja y álamos. Aunque se sabe que la serie de hospedadores para la transformación con el plásmido Ti usando A. tumefaciens como agente de infección es muy grande, el tabaco ha sido el hospedador elegido debido a su fácil manipulación.
También se ha usado Agrobacterium rhizogenes como vector para la transformación de plantas. Esta bacteria, que estimula la formación de raíces vellosas en muchas especies de plantas dicotiledóneas, lleva un elemento extracromosómico grande denominado plásmido Ri (inductor de raíces) que funciona de una manera análoga al plásmido Ti de A. tumefaciens. La transformación usando A. rhizogenes se ha desarrollado de forma análoga a la de A. tumefaciens y se ha utilizado satisfactoriamente para transformar, por ejemplo, alfalfa, Solanum nigrum L. y álamos.
2. Transferencia génica directa
Se han creado varios procedimientos denominados procedimientos de transferencia génica directa para transformar plantas y tejidos vegetales sin el uso de un intermedio de Agrobacterium. En la transformación directa de protoplastos, la absorción de material genético exógeno en un protoplasto puede potenciarse por medio del uso de un agente químico o campo eléctrico. El material exógeno después puede integrarse en el genoma nuclear. El primer trabajo se realizó en la planta dicotiledónea tabaco, donde se demostró que el ADN extraño se incorporaba y se transmitía a plantas de la progenie (Paszkowski et al., 1984; Potrykus et al., 1985).
Por este procedimiento también se han transformado protoplastos de monocotiledóneas en, por ejemplo, Triticum monococcum, Lolium multiflorum (ballico italiano), maíz y maíz dulce mejicano negro.
Como alternativa, el ADN exógeno puede introducirse en células o protoplastos por microinyección. Una solución de ADN plasmídico se inyecta mecánicamente de forma directa en la célula, normalmente usando una aguja de vidrio fina. De esta manera, se han transformado protoplastos de alfalfa por una diversidad de plásmidos (Reich et al., 1986).
Un procedimiento desarrollado más recientemente para la transferencia génica directa implica el bombardeo de células por microproyectiles que llevan ADN (Klein et al., 1987). En este procedimiento, se aceleran partículas de tungsteno recubiertas con el ADN exógeno hacia las células diana, obteniéndose la expresión al menos transitoria en el ejemplo indicado (cebolla).
C. Regeneración de tejidos vegetales transformados
Al igual que existe una diversidad de métodos para la transformación de tejidos vegetales, también existe una diversidad de métodos para la regeneración de plantas a partir de tejidos vegetales. El método particular de regeneración dependerá del tejido vegetal de partida y de la especie vegetal particular a regenerar. En los últimos años, ha sido posible regenerar muchas especies de plantas a partir de tejidos de callo obtenidos a partir de explantes vegetales. Las plantas que puede regenerarse a partir de callos incluyen monocotiledóneas tales como maíz, arroz, cebada, trigo y centeno, y dicotiledóneas tales como tomate, girasol, soja, algodón, colza y tabaco.
Se ha demostrado la regeneración de plantas a partir de tejidos transformados con A. tumefaciens para varias especies de plantas. Éstas incluyen girasol, tomate, trébol blanco, algodón, tabaco y álamos. También se ha demostrado la regeneración de alfalfa a partir de un tejido transformado con A. rhizogenes. La regeneración de plantas a partir de protoplastos es una técnica particularmente útil (Evans y Bravo, 1983). Cuando una especie vegetal puede regenerarse a partir de protoplastos, pueden utilizarse procedimientos de transferencia génica directa, y la transformación no es dependiente del uso de A. tumefaciens. Se ha demostrado la regeneración de plantas a partir de protoplastos para el arroz, tabaco, colza, patata, berenjena, pepino, álamos y maíz.
Para la transformación con ADN extraño pueden utilizarse diversos tejidos vegetales. Por ejemplo, se han utilizado cultivos de vástagos de cotiledón de tomate para la transformación mediada por Agrobacterium y la regeneración de plantas (documento EP 0 249 432). Otros ejemplos incluyen especies de Brassica (documento WO 87/07299) y especies de plantas leñosas, particularmente álamos (documento US 4.795.855).
D. Campo de la invención
Uno de los objetos de la presente invención es proporcionar plantas transgénicas que expresen constitutivamente niveles inducidos de PRP vegetales o proteínas substancialmente homólogas. Otro objeto es proporcionar plantas transgénicas que expresen constitutivamente tales proteínas, proporcionando un fenotipo resistente a enfermedades con respecto a las plantas de tipo silvestre. Otro objeto de la presente invención es proporcionar plantas transgénicas que transcriban constitutivamente cadenas de ARNm con sentido o anti-sentido de secuencias de ADN que codifican PRP vegetales o que transcriban cadenas de ARNm con sentido o anti-sentido de secuencias de ADN substancialmente homólogas a secuencias genómicas o de ADNc que codifican PRP vegetales, teniendo tales plantas transgénicas de esta manera un mejor fenotipo resistente a enfermedades con respecto a las plantas de tipo silvestre.
Por consiguiente, para cumplir estos objetivos y otros, la presente invención descrita en este documento incluye
(a)
construcciones de ADN quimérico útiles para producir plantas transgénicas resistentes a enfermedades, que comprenden una primera secuencia de ADN que promueve en una planta la transcripción constitutiva de la segunda secuencia de ADN, y una segunda secuencia de ADN que es una secuencia codificante de una PRP vegetal inducible o una secuencia codificante que tiene una homología de secuencia substancial con una secuencia codificante de una PRP vegetal inducible;
(b)
vectores que contienen tales construcciones de ADN quimérico; y
(c)
plantas transgénicas, tejido vegetal transgénico, propágulos y semillas de plantas transgénicas que contienen las construcciones de ADN quimérico para producir plantas resistentes a enfermedades.
En particular, la presente invención describe una secuencia de ADN quimérico que comprende:
(a)
una primera secuencia de ADN que promueve en una planta la transcripción constitutiva de una segunda secuencia de ADN; y
(b)
una segunda secuencia de ADN que comprende una secuencia codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible, o una secuencia codificante que tiene una homología de secuencia substancial con una secuencia codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible, estando dicha segunda secuencia de ADN en una orientación con sentido o anti-sentido con respecto a dicha primera secuencia de ADN.
Se prefiere una secuencia de ADN quimérico, donde la primera secuencia de ADN es de origen heterólogo con respecto a la segunda secuencia de ADN.
Se prefiere especialmente una secuencia de ADN quimérico, donde la primera secuencia de ADN comprende el promotor de la subunidad pequeña de la ribulosa bis-fosfato carboxilasa (RUBISCO) de tabaco o un promotor doble 35S de CaMV.
La segunda secuencia del ADN quimérico preferiblemente codifica una proteína relacionada con la patogénesis de plantas que se selecciona entre el grupo compuesto por PR-1A, PR-1B, PR-1C, PR-R mayoritaria, PR-R minoritaria, PR-P, PR-Q, PR-2, PR-N, PR-O, PR-O', SAR8.2a, SAR8.2b quitinasa/lisozima de pepino, peroxidasa básica de pepino, glucanasa básica de tabaco y quitinasa básica de tabaco.
También se prefiere una secuencia de ADN quimérico, donde la segunda secuencia de ADN codifica una proteína relacionada con la patogénesis de plantas seleccionada entre el grupo compuesto por PR-1A, PR-1B, PR-1C, 
\hbox{PR-R}
mayoritaria, PR-R minoritaria, PR-P, PR-Q, PR-O', SAR8.2a, SAR8.2b quitinasa/lisozima de pepino, glucanasa básica de tabaco y quitinasa básica de tabaco.
Se prefiere especialmente una secuencia de ADN quimérico, donde la segunda secuencia de ADN codifica una proteína relacionada con la patogénesis de plantas seleccionada entre el grupo compuesto por PR-R mayoritaria, 
\hbox{PR-R}
minoritaria, PR-P, PR-Q, PR-2, PR-N, PR-O, PR-O', SAR8.2a, SAR8.2b quitinasa/lisozima de pepino, peroxidasa básica de pepino, glucanasa básica de tabaco y quitinasa básica de tabaco.
También se describen moléculas de ADN recombinante que contienen una secuencia de ADN quimérico de acuerdo con la presente invención.
Preferiblemente, una molécula de ADN recombinante se caracteriza porque es una molécula de vector. Se prefiere especialmente una molécula de vector que comprende pCGN1703.
Un método para producir las secuencias de ADN quimérico anteriores, comprendiendo el método:
(a)
preparar a partir de una fuente adecuada tal como, por ejemplo, un gen RUBISCO vegetal o un genoma de CaMV, una primera secuencia de ADN que promueva en una planta la transcripción constitutiva de una segunda secuencia de ADN;
(b)
preparar una biblioteca de ADN a partir de un patógeno infectado o de un tejido vegetal infectado y no infectado, comprendiendo de esta manera dicha biblioteca de ADN poblaciones de ADN tanto inducidas como no inducidas, y aislar a partir de la misma una segunda secuencia de ADN que comprenda una secuencia codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible, o una secuencia codificante que tenga una homología de secuencia substancial con una secuencia codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible; y
(c)
unir de forma operativa la primera secuencia de ADN de la etapa (a) con la segunda secuencia de ADN de la etapa (b) de tal forma que dicha primera secuencia de ADN promueva la transcripción de la segunda secuencia de ADN usando métodos conocidos en la técnica.
La unión de la primera y la segunda secuencias de ADN preferiblemente se realiza de tal forma que la segunda secuencia de ADN esté en una orientación con sentido o anti-sentido con respecto a dicha primera secuencia de ADN.
La presente invención también comprende plantas, tejidos vegetales, propágulos de plantas o semillas vegetales que contienen una cualquiera de las secuencias de ADN quimérico descritas anteriormente, así como métodos para su producción.
Dentro de la presente invención se prefiere una planta transgénica que expresa constitutivamente niveles inducidos de proteínas relacionadas con la patogénesis de plantas, que proporciona un fenotipo resistente a enfermedades.
También se prefiere una planta transgénica que transcribe de forma constitutiva cadenas con sentido o anti-sentido de secuencias de ADN que codifican una proteína relacionada con la patogénesis de plantas, que proporciona un fenotipo resistente a enfermedades.
Se prefiere especialmente una planta, tejido vegetal, propágulos vegetales o semillas vegetales que contienen una secuencia de ADN quimérico que comprende una primera secuencia de ADN que comprende el promotor de la subunidad pequeña de la ribulosa bis-fosfato carboxilasa (RUBISCO) de tabaco y una segunda secuencia de ADN que comprende la secuencia codificante de la proteína relacionada con la patogénesis PR-1A, donde la segunda secuencia de ADN está orientada con respecto a la primera secuencia de ADN de tal forma que la primera secuencia de ADN promueve la transcripción de la cadena anti-sentido de la segunda secuencia de ADN.
En este documento también se proporciona un método para producir una célula vegetal o tejido vegetal transgénico con potencial para regenerar una planta entera que presenta un fenotipo resistente a enfermedades, que comprende transformar la célula o el tejido vegetal, que puede existir en forma de un cultivo in vitro o como parte de un embrión o una planta entera, con una secuencia de ADN quimérico que comprende una primera secuencia de ADN que promueve en una planta la transcripción constitutiva de una segunda secuencia de ADN, y una segunda secuencia de ADN que comprende una secuencia codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible, o una secuencia codificante que tiene una homología de secuencia substancial con una secuencia codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible, uniéndose dicha primera secuencia de ADN a la segunda secuencia de ADN de tal forma que promueva la transcripción de la segunda secuencia de ADN.
La transformación de células vegetales o tejidos vegetales puede realizarse por medio de los métodos de transformación descritos anteriormente en este documento usando una célula vegetal o un tejido vegetal aislado que forma parte de un cultivo celular o tisular o una célula vegetal o tejido vegetal que forma parte de un embrión vegetal o de una planta entera.
También se prefiere un método para producir una célula vegetal o tejido vegetal transgénico, donde la segunda secuencia de ADN está en una orientación con sentido o anti-sentido con respecto a dicha primera secuencia de ADN.
En este documento también se proporcionan nuevos clones de ADNc que codifican para PRP vegetales. Dentro de la presente invención, se prefieren las siguientes secuencias de ADNc substancialmente puras:
(1)
una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica SAR8.2a, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica SAR8.2a, pero, en particular, el plásmido pCIB/SAR8.2a, con el número de acceso ATCC 40584, depositado el 22 de marzo de 1989.
(2)
Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica SAR8.2b, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica SAR8.2b, pero, en particular, el plásmido pCIB/SAR8.2b, con el número de acceso ATCC 40585, depositado el 22 de marzo de 1989.
(3)
Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica PR-P, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica PR-P, pero, en particular, el plásmido pBScht28, con el número de acceso ATCC 40588, depositado el 24 de marzo de 1989.
(4)
Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica PR-2, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica PR-2, pero, en particular, el plásmido pBSGL117, con el número de acceso ATCC 40691, depositado el 19 de octubre de 1989.
(5)
Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica PR-N, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica PR-N, pero, en particular, el plásmido pBSGL148, con el número de acceso ATCC 40689, depositado el 19 de octubre de 1989.
\newpage
(6)
Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica PR-O, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica PR-O, pero, en particular, el plásmido pBSGL134, con el número de acceso ATCC 40690, depositado el 19 de octubre de 1989.
(7)
Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica PR-2', o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica PR-2', pero, en particular, el plásmido pBSGL135, con el número de acceso ATCC 40685, depositado el 19 de octubre de 1989.
(8)
Una secuencia de ADNc substancialmente pura que codifica la peroxidasa de pepino, o una secuencia de ADN que tiene una homología de secuencia substancial con el ADNc que codifica la peroxidasa de pepino, pero, en particular, el plásmido pBPERI, con el número de acceso ATCC 40686, depositado el 19 de octubre de 1989, o el plásmido pBPERB24, con el número de acceso respectivo ATCC 40687, depositado el 19 de octubre de 1989.
(9)
Una secuencia de ADN substancialmente pura de la "secuencia 6" o que tiene una homología de secuencia substancial con la secuencia mostrada en la "secuencia 6".
(10)
Una secuencia de ADN substancialmente pura de la "secuencia 9" o que tiene una homología de secuencia substancial con la secuencia mostrada en la "secuencia 9".
(11)
Una secuencia de ADN substancialmente pura de la "secuencia 10" o que tiene una homología de secuencia substancial con la secuencia mostrada en la "secuencia 10".
También se proporciona un nuevo método para la selección diferencial y enriquecimiento de poblaciones de ADNc, que comprende
(a)
proporcionar un ADNc monocatenario a partir de poblaciones de ADNc inducidas y no inducidas, teniendo el ADNc monocatenario procedente de las poblaciones inducida y no inducida una polaridad opuesta de ADN, y teniendo el ADNc de la población no inducida una señal de afinidad de biotina;
(b)
hibridar las poblaciones de ADNc monocatenario de la etapa (a) entre sí; y
(c)
separar la mezclar hibridada de la etapa (b) por cromatografía de biotina-avidina para enriquecer la población inducida en ADNc monocatenarios que no se hibridan con el ADNc de la población no inducida.
También se proporciona un método para clonar moléculas de ADNc que codifiquen proteínas de resistencia a enfermedades, que comprende:
(a)
proporcionar un tejido en el que se ha inducido resistencia adquirida sistémica o resistencia adquirida localizada usando inductores biológicos, y
(b)
aislar clones de ADNc que codifiquen proteínas de resistencia a enfermedades. Aunque previamente se han producido ADNc a partir de ARN aislado de material infectado con patógenos, éste el primer ejemplo de la producción de ADNc a partir de ARN aislado de porciones no infectadas de la planta en la que se ha inducido resistencia por patógenos. Es decir, el tejido no se infecta por los patógenos, y demuestra resistencia adquirida.
Los genes quiméricos de los presentes ejemplos que se describen más adelante comprenden secuencias de ADNc vegetales que codifican PRP. Sin embargo, esta invención se aplica igualmente a clones genómicos y secuencias homólogas sintéticas que codifican PRP o proteínas que tienen una homología substancial con las mismas. De esta manera, el alcance de las reivindicaciones de la presente invención no pretende limitarse a las realizaciones específicas descritas.
E. Ejemplos Depósitos con ATCC
Se han realizado los siguientes depósitos en la ATCC de acuerdo con el Tratado de Budapest:
Plásmido Nº de Acceso ATCC Fecha de Depósito
CGN783 67868 23 de diciembre de 1988
pBS-Gluc 39.1 40526 29 de diciembre de 1988
pBScucchi/quitinasa (aka pBScuccht5) 40528 29 de diciembre de 1988
pBSGL6e. 40535 18 de enero de 1989
pCIB/SAR8.2a 40584 22 de marzo de 1989
(Continuación)
Plásmido Nº de Acceso ATCC Fecha de Depósito
pCIB/SAR8.2b 40585 22 de marzo de 1989
pCGN1540 40586 22 de marzo de 1989
pCGN2113 40587 22 de marzo de 1989
pBScht28 40588 24 de marzo de 1989
pBSGL135 40685 19 de octubre de 1989
pBSPER1 40686 19 de octubre de 1989
pBSPERB24 40687 19 de octubre de 1989
pBSPERB25 40688 19 de octubre de 1989
pBSGL148 40689 19 de octubre de 1989
pBSGL134 40690 19 de octubre de 1989
pBSGL117 40691 19 de octubre de 1989
pBSGL125 40692 19 de octubre de 1989
\lambda tobcDNAGL 162* 40693 19 de octubre de 1989
\lambda tobcDNAGL 153* 40694 19 de octubre de 1989
\lambda tobcDNAGL 161* 40695 19 de octubre de 1989
* en Escherichia coli
Definiciones
Para proporcionar una comprensión clara y consistente de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, incluyendo el alcance proporcionado a tales términos, se proporcionan las siguientes definiciones:
Secuencia o gen quimérico: Una secuencia de ADN que contiene al menos dos partes heterólogas, por ejemplo, partes derivadas de secuencias de ADN naturales que no están asociadas en sus estados naturales, o que contiene al menos una parte que es de origen sintético y no se encuentra en la naturaleza.
Secuencia de ADN codificante: Una secuencia de ADN que, cuando se transcribe y se traduce, ocasiona la formación de un polipéptido celular.
Transcripción constitutiva: Transcripción de cantidades substancialmente fijas de una secuencia de ADN, independientemente de las condiciones ambientales.
Gen: Una región cromosómica discreta que es responsable de un producto celular discreto.
Inductores: Moléculas que ocasionan la producción de cantidades mayores de macromoléculas, en comparación con las cantidades encontradas en ausencia del inductor.
Proteína inducible: Proteínas cuya velocidad de producción puede aumentarse por la presencia de inductores en el medio.
Secuencia de ADN no codificante: Una secuencia de ADN que no se traduce dando como resultado la formación de un polipéptido celular cuando se asocia con una secuencia de ADN codificante particular. De esta manera, por ejemplo, una secuencia que no es codificante cuando se asocia con una secuencia codificante puede ser realmente codificante cuando se asocia con otra secuencia codificante o no codificante.
Rasgo fenotípico: Una propiedad observable resultante de la expresión de un gen.
Tejido vegetal: Cualquier tejido de una planta en plantación o en cultivo. Esta expresión incluye, pero sin limitación, plantas enteras, células vegetales, órganos vegetales, semillas vegetales, protoplastos, callos, cultivos celulares y cualquier grupo de células vegetales organizadas en unidades estructurales y/o funcionales. El uso de esta expresión junto con o en ausencia de cualquier tipo específico de tejido vegetal tal como se indicado anteriormente o se incluye de otra forma por esta definición, no pretende excluir ningún otro tipo de tejido vegetal.
Secuencia de ADN substancialmente pura: Una secuencia de ADN aislada en forma substancialmente pura a partir de una fuente natural o no natural. Tal secuencia puede existir en un sistema natural, por ejemplo, en bacterias, virus o en células vegetales o animales, o puede proporcionarse, por ejemplo, por medios sintéticos o como una secuencia de ADNc. Las secuencias de ADN substancialmente puras normalmente se aíslan en forma de un vector que comprende el ADN deseado. Substancialmente puro significa que otras secuencias de ADN distintas de las deseadas están presentes sólo en cantidades marginales, por ejemplo, menores del 5%, menores del 1% o, preferiblemente, menores del 0,1%. Las secuencias de ADN substancialmente puras y los vectores que las contienen pueden proporcionarse, y típicamente se proporcionan, en solución, por ejemplo en solución acuosa que contiene tampones o en el medio de cultivo habitual.
Homología de secuencia substancial: La homología de secuencia substancial significa una relación estructural próxima entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, las secuencias de ADN substancialmente homólogas pueden tener una homología del 60%, preferiblemente del 80 o el 90%, y las secuencias de aminoácidos substancialmente homólogas típicamente pueden tener una homología del 50% o mayor. La homología también incluye una relación en la que falta una o varias subsecuencias de nucleótidos o aminoácidos, o están intercaladas subsecuencias con nucleótidos o aminoácidos adicionales.
Abreviaturas
pb pares de bases
kb kilopares de bases
ATCC American Type Culture Collection, Rockville, MD
TMV Virus del Mosaico del Tabaco
TNV Virus de la Necrosis del Tabaco
HPLC cromatografia líquida de alta presión
Cvcpm Cuentas de Cerenkov por minuto
p/v peso/volumen, excepto cuando se indique otra cosa
ICF fluido intracelular
PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida
PCR Reacción en cadena catalizada por la polimerasa
PCV Volumen celular empaquetado: volumen de células sedimentadas en una pipeta
MW peso molecular
LGT baja temperatura de gelificación
ATP adenosina tri fosfato
BSA albúmina de suero bovino
CETAB bromuro de hexadeciltrimetilamonio
2,4-D ácido 2,4-diclorofenoxiacético
DTT ditiotreitol
dicamba ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico
EDTA ácido etilendiamina N,N,N',N'-tetraacético
MES ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico
MU 4-metil umbeliferil glucurónido
PEG polietilenglicol
picloram ácido 4-amino-3,5,6-ticloropicolínico
SDS dodecilsulfato sódico
TFA ácido trifluoroacético
Tris-HCl clorhidrato de tris(hidroximetil)metilamina
PRP proteínas relacionadas con la patogénesis
CIAP fosfatasa alcalina intestinal de ternero
PTH Feniltiohidantoína
RUBISCO ribulosa-1,5-bis-fosfato carboxilasa
NAA ácido \alpha-naftalenoacético
BAP 6-bencilaminopurina
Medios y tampones
Las reacciones enzimáticas se realizan de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante a menos que se indique otra cosa. Los genes quiméricos y vectores de la presente invención se construyen usando técnicas bien conocidas en la técnica. Se han descrito técnicas adecuadas en Maniatis et al. (1982); Methods in Enzymology, Volúmenes 68, 100, 101 y 118 (1979, 1983, 1938 y 1986); y Glover (1985). Se han descrito composiciones de medio en Miller (1972), así como en las referencias identificadas previamente.
Medio SH-0: medio de Schenk y Hildebrandt (1972) sin hormonas. El medio SH puede ser líquido o puede estar solidificado con agar al 0,8% o con GelRite® al 0,5%. El medio normalmente se esteriliza por calor en un autoclave a una temperatura de aproximadamente 125ºC durante un período de 15 a 20 minutos.
Medio SH-30: medio SH-0 que contiene Dicamba 30 \muM.
Medio de SH-45: medio SH-0 que contiene Dicamba 45 \muM.
Medio OMS: Medio de Murashige y Skoog (1962). El medio puede solidificarse con agar al 0,8% o agarosa o con GelRite® al 0,5%.
Medio KM-8p y N6: Los macroelementos^{a}, microelementos^{a} y Fe-EDTA son como se proporcionan en la
bibliografía: medio KM de acuerdo con Kao y Michayluk (1975); medio N6 de acuerdo con Chu et al.,
(1975)
Medio: KM-8p^{b,c,d} N6
Ingredientes orgánicos y vitaminas^{e} [mg/l]:
biotina 0,01
piridoxina-HCl 1,00 0,5
tiamina-HCl 10,00 0,1
nicotinamida 1.00
ácido nicotínico 0,10 0,5
ácido fólico 0,40
D-Ca-pantotenato 1,00
ácido p-aminobenzoico 0,02
cloruro de colina 1,00
riboflavina 0,20
Vitamina B 12 0,02
glicina 0,10 2,0
Azúcares y alcoholes de azúcar [g/l]:
sacarosa 0,25 30,0
glucosa 68,40
manitol 0,25
sorbitol 0,25
celobiosa 0,25
fructosa 0,25
manosa 0,25
ramnosa 0,25
ribosa 0,25
xilosa 0,25
mio-inositol 0,10
pH final 5,8 5,6
Esterilización filtro autoclave
^{a} Los macroelementos normalmente se obtienen como una solución madre concentrada 10 X, y los microelementos como una solución madre concentrada 1000 X. ^{b} El ácido cítrico, fumárico y málico (cada uno a una concentración final de 40 mg/l) y el piruvato sódico (concentración final de 20 mg/l) se preparan como una solución madre concentrada 100 X, ajustada a pH 6,5 con, NH_{4}OH y añadida a este medio. ^{c} La adenina (concentración final de 0,1 mg/l) y la guanina, timidina, uracilo, hipoxantina y citosina (cada una a una concentración final de 0,03 mg/l) se preparan como una solución madre concentrada 1000 X, ajustada a pH 6,5 con NH_{4}OH y añadida a este medio. ^{d} A este medio se le añaden los siguientes aminoácidos usando una solución madre 10 X (pH 6,5 con NH_{4}OH) para producir las concentraciones finales dadas: glutamina (5,6 mg/l), alanina, ácido glutámico (cada uno a 0,6 mg/l), cisteína (0,2 mg/l), asparagina, ácido aspártico, cistina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina (cada uno a 0,1 mg/l). ^{e} La solución madre de vitamina normalmente se prepara concentrada 100 X.
Materiales
Agarosa: La preparación y purificación de agarosa se describen por Guiseley y Renn (1975). La agarosa es uno de los constituyentes del agar. El agar disponible en el mercado normalmente consta de una mezcla de agarosa neutra y agaropectina iónica con un gran número de grupos laterales. Normalmente permanece intacto un cierto número de cadenas laterales y determina las propiedades fisicoquímicas de la agarosa tal como la formación de gel y la temperatura de fusión. Un agente de solidificación preferido es la agarosa de bajo punto de fusión, especialmente la agarosa SeaPlaque®.
Hidrolizado de caseína: Hidrolizado de Caseína-Hidrolizado Enzimático de leche bovina, Tipo 1, Sigma Co., PO. Box 14508, St. Louis, MO 63178, Estados Unidos.
Celulasa RS: Celulasa RS, Yakult Honsha Co. Ltd., 1.1.19 Higashi-Shinbashi, Minato-Ku, Tokio, 105 Japón.
\underline{GelRite®}: GelRite Gellan Gum, Scott Laboratories Inc., Fiskerville, R.I. 02823, Estados Unidos.
Kit de cebador aleatorio IBI: kit de cebador aleatorio "Primer Time", International Biotechnologies Inc., PO. Box 1565, New Haven, CT 07606, Estados Unidos.
\underline{Filtro Nalgene®}: Nalge Co., Division of Sybron Corp. Rochester, N.Y. 14602, Estados Unidos.
\underline{Parafilm®}: Película de laboratorio Parafilm®-American Can Co. Greenwich, CT 06830, Estados Unidos.
ADN ligasa deT4: New England BioLabs
Gene-Screen Plus: DuPont
Electroporador Dialog: (DIA-LOG GmbH, D-4000 Düsseldorf 13, República Federal de Alemania)
Sección 1
Técnicas generales
Este grupo de ejemplos describe manipulaciones generales usadas para realizar los siguientes ejemplos detallados.
Ejemplo 1 Unión en agarosa
Después de la digestión del ADN con endonucleasas de restricción y la separación electroforética de los fragmentos en un gel de agarosa TAE de bajo punto de fusión, se escinden las bandas que contienen los fragmentos apropiados, se ponen en un tubo de ensayo y éste se calienta a 65ºC para fundir la agarosa. Se añaden de 2 a 5 \mul a 15 \mul de agua y la solución se deja a 65ºC durante 10 minutos. Esta solución se enfría a 37ºC y se deja durante cinco minutos para equilibrar la temperatura. Se añaden 2 \mul de tampón ligasa 10 X (Tris 200 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 100 mM, DTT 100 mM, ATP 10 mM) junto con 1 \mul de ADN ligasa de T4, y esta solución se deja solidificar e incubar a 15ºC durante una noche.
Ejemplo 2 Transformación desde agarosa
La agarosa que contiene el ADN apropiado de funde por incubación a 65ºC durante 10 minutos. Se añaden 
\hbox{10
 \mu l}
de esta solución a 30 \mul de tampón TE (Tris 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM), se mezclan y la mezcla se deja en reposo a temperatura ambiente. Se ponen células competentes congeladas (E. coli cepa DH5\alpha) en hielo húmedo para descongelarse. La solución de ADN diluida anterior se añade a 200 \mul de células y se deja en reposo en hielo durante 20 minutos. Las células más el ADN después se someten a un choque térmico durante 90 segundos a 41ºC. Las células después se dejan a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se añaden 0,8 ml de medio SOC (Hanahan, 1983) y el cultivo se incuba a 37ºC durante una hora. Se cultivan 100 \mul del cultivo en placas LB (Miller, 1972) que contienen 100 \mug/ml de ampicilina (L-amp) y las placas se incuban durante una noche a 37ºC. Se seleccionan las colonias supervivientes, se vuelven a cultivar en estrías en una segunda placa con antibiótico y las placas se incuban durante una noche a 37ºC. Ejemplo 3 Marcaje de fragmentos de restricción de ADN
El ADN se trata con las enzimas de restricción apropiadas y los fragmentos se separan por electroforesis en un gel de agarosa LGT. Se escinde una banda que contiene el fragmento de interés y el ADN se purifica por técnicas convencionales. Se marcan 50 ng del fragmento de ADN usando el kit de cebador aleatorio IBI de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.
Ejemplo 4 Transferencia de southern de ADN genómico
Se digieren 3 \mug de ADN de tabaco con diversas enzimas de restricción en las condiciones sugeridas por el proveedor. El ADN se extrae con fenol, se precipita con etanol y después se resuspende en tampón de carga de gel (15% de ficoll, 0,025% de azul de bromofenol, EDTA 10 mM, pH 8). Se introducen muestras en el gel y se someten a electroforesis en un gel de agarosa al 0,5% a 5 Vcm^{-1} hasta que el colorante de azul de bromofenol alcanza el extremo del gel. Después de esto, el ADN se transfiere a Gene-Screen Plus usando el procedimiento de transferencia alcalino descrito por el proveedor. Las etapas previas a la hibridación, la hibridación y el lavado se realizan de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La hibridación se detecta por autorradiografía.
Ejemplo 5 Adaptadores moleculares
Un adaptador molecular típico es la secuencia
5'GGATCCCTGCA-3'
para la conversión de un sito PstI en un sitio BamHI. Esta molécula se sintetiza en un sintetizador Applied Biosystems usando la química de \beta-cianoetilfosforamidita y se purifica por HPLC de fase inversa. Aproximadamente 2 \mug de este oligonucleótido se fosforilan de acuerdo con Maniatis et al., (1982, p. 125). Después de esto, la solución de oligonucleótido se calienta a 65ºC en un baño de agua y se deja enfriar a temperatura ambiente durante un período de aproximadamente 30 minutos. Al ADN digerido se le añade un exceso molar de aproximadamente 10 veces de este adaptador templado junto con tampón ligasa 10 X, ADN ligasa de T4 y una cantidad apropiada de agua. Una reacción típica es:
ADN a adaptar : 1,2 \mul (\sim1 pmol)
Adaptador: 1 \mul (\sim 10 pmol)
Tampón ligasa 10 X: 1 \mul
ADN ligasa de T4: 1 \mul
Agua: 5-6 \mul.
Esta solución se incuba a una temperatura de 12 a 15ºC durante 30 minutos y se calienta a 65ºC durante 30 minutos para inactivar la ligasa. La concentración de sal y el volumen se ajustan para la digestión con las enzimas de restricción apropiadas y el ADN adaptado se digiere para exponer el "extremo adherente" adaptado. Se retiran los adaptadores no incorporados por electroforesis en un gel de agarosa o por precipitaciones secuenciales con isopropanol.
Ejemplo 6 Mapeo de extensión de cebadores
A. Síntesis y marcaje del extremo 5' de cebadores para la extensión de cebadores. Se sintetizan los siguientes oligómeros cebadores usando un sintetizador Applied Biosystems y la química de \beta-cianoetil-fosforamidita.
PR-1: 5'-ATAGTCTTGTTGAGACTT-3'
Los oligonucleótidos que purifican por HPCL de fase inversa. Se fosforilan 5 pmol de cada oligonucleótido (Maniatis et al., 1982, p. 125) usando 200 \muCi de ^{32} P-ATP (6000 Ci/mmol, 10 \muCi/\mul). Después de la incubación a 37ºC durante 30 minutos, la reacción se diluye a 100 \mul, se extrae con fenol/cloroformo y después se precipita tres veces con 50 \mug de ARN de soporte. El precipitado final se resuspende en 1 X tampón de transcriptasa inversa (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, KCl 40 mM, MgCl_{2} 3mM) a una concentración de 2 nM. Se determina una actividad específica del oligonucleótido marcado de aproximadamente 3 C 10^{6} Cvcpm/pmol.
B. Preparación del ARN total. El ARN total se prepara esencialmente como se describe por Lagrimini et al. (1987). El tejido se tritura con nitrógeno líquido en un mortero con su mano. El tejido triturado se añade a tampón de trituración (Lagrimini et al. 1987) usando 2,5 ml/g de tejido. Después se añade un volumen igual de fenol y la emulsión se homogeneiza en un politrón Brinkman. Se añade la mitad del volumen de cloroformo y la emulsión se mezcla suavemente durante 15 minutos. Las fases se separan por centrifugación y la fase acuosa se retira. El ARN se precipita por adición de acetato sódico a 0,3 M y 2,5 volúmenes de etanol. El precipitado se recoge por centrifugación y se resuspende en 2 ml de agua estéril. Se añade cloruro de litio a una concentración final de 3 M y se deja a 4ºC durante una noche. El precipitado se recoge por centrifugación y el sedimento se lava con etanol al 80% enfriado con hielo. El sedimento se seca y se resuspende en 500 \mul de agua estéril. La concentración de esta preparación de ARN total se determina espectrofotométricamente.
Como alternativa, se extrae ARN de callo como se ha descrito anteriormente, con la excepción de que el tejido de callo se corta en cubos con un tamaño de aproximadamente 3 mm, y se añade a morteros pre-enfriados con sus manos para la trituración en nitrógeno líquido antes de la etapa de politrón.
C. Extensión de cebadores. Se liofilizan 50 \mug de ARN total en un tubo Eppendorf de 500 \mul. El ARN se resuspende en 30 \mul de solución de sonda radiomarcada y se calienta a 70ºC durante 10 minutos. El tubo se enfría lentamente a 37ºC y se deja incubar durante una noche. Sin retirar el tubo del baño de agua a 37ºC, se añaden 2 \mul de tampón transcriptasa inversa 10 X (Tris-HCl 500 mM, pH 7,5, KCl 400 mM, MgCl_{2} 30 mM), 1 \mul de BSA a 5 mg/ml, 5 \mul de DTT 10 mM, 5 \mul de dNTP 10 X (una concentración 10 mM de cada dNTP en H_{2}O), 3 \mul de H_{2}O, 2 \mul de RNAsa (80 unidades) y 2 \mul de transcriptasa inversa (400 unidades), y la reacción se incuba a 37ºC durante 30 minutos. Para detener la reacción, se añaden 5 \mul de acetato sódico 3 M pH 5 y 150 \mul de etanol absoluto. El tubo se deja a -20ºC durante 30 minutos, el precipitado se recoge por centrifugación, se lava con etanol al 80% y se deja secar al aire. El precipitado se resuspende en 10 a 20 \mul de colorante de carga (90% de formamida, 0,05% de azul de bromofenol, 0,05% de xileno cianol, EDTA 1 mM) y los productos de extensión se separan en un gel de secuenciación al 6% (Maniatis et al., 1982). Los productos de extensión se visualizan por autorradiografía.
Sección 2
Identificación y caracterización de proteínas
Se aíslan las PRP relevantes para estos ejemplos, se purifican y se secuencian, por primera vez en algunos casos y de acuerdo con los procedimientos bibliográficos en otros, para permitir el aislamiento de los ADNc correspondientes y finalmente para confirmar las identidades de los ADNc.
Ejemplo 7 Técnicas generales para la generación de péptidos, purificación y secuenciación automática
A. Reducción y alquilación. Se disuelve la proteína liofilizada y purificada en guanidina-HCl 6 M que contiene Tris-HCl 1 M, pH 8,6, y EDTA 10 mM. Se añade DTT a una concentración de 20 mM y se añade 4-vinilpiridina a una concentración final de 50 mM. La muestra después se incuba durante 1,5 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. El material piridiletilado se desalifica en HPLC usando una columna de Aquapore fenilo (2,1 x 10 cm, Brownlee). La columna se eluye con un gradiente lineal del 5 al 80% de acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al 0,1%.
B. Escisión con bromuro de cianógeno y eliminación de piroglutamato. La escisión con bromuro de cianógeno se realiza in situ de acuerdo con Simpson y Nice (1984). La digestión de la proteína PR-1 con piroglutamato aminopeptidasa (Boehringer Mannheim) se realiza de acuerdo con Allen, G. (1981).
C. Digestión con LysC. La proteína se digiere con la endoproteinasa Lys-C (Boehringer Mannheim) en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5 durante 24 horas a temperatura ambiente usando una relación de enzima:substrato de 1:10. Los péptidos resultantes se aíslan por HPLC usando una columna Aquapore C-8 (1 x 22 cm, Brownlee) eluida con un gradiente lineal de acetonitrilo:isopropanol (relación 1:1) (del 0 al 60%) en TFA al 0,1%.
D. Digestión con tripsina. La digestión con tripsina (Cooper) se realiza en bicarbonato amónico 0,1 M, pH 8,2, que contiene cloruro cálcico 0,1 M durante cinco horas a 37ºC usando una relación de enzima:substrato de 1:100. Los péptidos generados se separan en HPLC usando las mismas condiciones que con los péptidos Lys-C o se realiza en Tris-HCl 0,1 M pH 8,5 durante 24 horas a 37ºC usando una relación de enzima:substrato de 1:50. Los péptidos se aíslan por HPLC usando una columna Vydac C-18 (2,1 x 150 mm) con un gradiente lineal del 0 al 60% de acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al 0,1%.
E. Secuenciación. Se realizan degradaciones de Edman automáticas con un secuenciador en fase gaseosa Applied Biosystems 470A. Los PTH aminoácidos se identifican usando un analizador Applied Biosystems 102A PTH.
Ejemplo 8 Purificación y secuencia de las proteínas PR-1a y PR-1b
Originalmente se realiza una correlación de las secuencias de ADN de tres clones de ADNc con las proteínas PR-1a, -1b y -1c por Cornelissen, B.J.C. et al. (1986), basándose en una comparación de los datos de secuencia proteica publicados de tres péptidos derivados de PR-1a (Lucas et al., 1985) y la estructura primaria de la proteína se deduce a partir de los clones de ADNc. Sin embargo, el clon de ADNc denominado PR-1a está truncado en el extremo 5' y puede compararse con sólo de los tres péptidos con un desacoplamiento de un resto.
La secuencia de aminoácidos codificada deducida a partir del ADNc, preparada y analizada en el ejemplo indicado más adelante, y la secuencia de ADNc de PR-1a de Pfitzer, U.M. et al., (1987), presentan desacoplamientos con la secuencia proteica publicada en el resto de triptófano como se indica. Tampoco corresponden en otras tres posiciones de la secuencia proteica amino-terminal. Esta anomalía cuestiona la identificación previa de los clones de PR-1. Para confirmar la identidad de nuestros clones de ADNc como PR-1a, PR-1b o PR-1c, se determina una porción grande de la estructura primaria de las proteínas PR-1a y PR-1b purificada y de péptidos derivados de las proteínas por secuenciación de aminoácidos. Estos datos después se comparan con la secuencia de la proteína deducida a partir de la secuencia de nucleótidos de los ADNc para identificar cuál de los clones de ADNc corresponde a cada proteína.
Se cultivan plantas de N. tabacum cv. Xanthi en un invernadero y cuando llegan a una edad de ocho semanas se infectan frotando suavemente las hojas con una suspensión de una cepa común (UI) de TMV (0,5 \mug/ml). Se recogen las hojas siete días después de la infección y el ICF se retira de las hojas por lavado y se recoge de acuerdo con Parent y Asselin (1984). 250 ml de ICF se concentran a 50 ml por liofilización y se introducen en una columna Ultragel ACA54 equilibrada con Tris-HCl pH 8,0 y EDTA 1 mM.
Los eluatos de esta columna se analizan por electroforesis en geles de poliacrilamida nativos al 10%. Se reúnen las fracciones que contienen las proteínas PR-1, se liofilizan, se resuspenden en 3 ml de agua y después se dializan durante una noche frente a agua. Esta preparación se purifica adicionalmente por cromatografía de intercambio aniónico de HPLC en una columna TSK-DEAE 5PN. La columna se eluye con un gradiente de NaCl de 0 a 0,6 M en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 EDTA 1 mM. Las fracciones se analizan por PAGE. Primero eluye PR-1b de la columna a NaCl 0,18 M y PR-1a eluye a NaCl 0,28 M. Las fracciones que contienen cada proteína se reúnen, se dializan frente a agua y se liofilizan.
La pureza de la preparación proteica PR-1a y PR-1b se confirma por HPLC de fase inversa usando una columna de Aquapore fenilo (2,1 x 100 mm, Brownlee) y eluyendo con un gradiente lineal de acetonitrilo:isopropanol (1:1) (del 5 al 80%) en TFA al 0,1%.
La secuencia de la proteína se obtiene a partir del extremo amino desbloqueado de la proteína intacta, a partir de péptidos obtenidos por escisión con bromuro de cianógeno de las proteínas, a partir de péptidos obtenidos por digestión con LysC de las proteínas o a partir de péptidos obtenidos por digestión con tripsina de la proteína usando técnicas detalladas anteriormente o usando otros métodos conocidos en la técnica. Más adelante se muestra un resumen de los datos resultantes de este análisis para PR-1a y PR-1b.
PR-1a
1
PR-1b
2
Ejemplo 9 Purificación y secuencia de PR-R mayoritaria y PR-R minoritaria
Se cultivan plantas de N. tabacum cv Xanthi en un invernadero cuando tienen ocho semanas de edad y se infectan frotando suavemente las hojas con una suspensión de una cepa común (U1) de TMV (0,5 \mug/ml). Se recogen las hojas siete días después de la infección y el ICF se retira de las hojas por lavado y se recoge de acuerdo con Parent y Asselin (1984). 250 ml de ICF se concentran a 50 ml por liofilización y se introducen en una columna Ultragel ACA54 equilibrada con Tris-HCl pH 8,0 y EDTA 1 mM. Los eluatos se analizan por electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%.
Se reúnen las fracciones que contienen la proteína PR-R y varias proteínas contaminantes minoritarias, se liofilizan, se resuspenden en 3 ml de agua y después se dializan durante una noche frente a agua. Esta preparación se purifica adicionalmente por cromatografía de HPLC de fase inversa usando un columna de Aquapore fenilo (2,1 x 100 mm) de Brownlee. La columna se eluye con un gradiente lineal del 20 al 80% de acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al 0,1% usando un caudal de 50 \mul/minuto durante 80 minutos. Se descubre que las proteínas principales presentes son isoformas de PR-R que reciben los nombres de PR-R mayoritaria, para la proteína más abundante que eluye a 46 minutos, y PR-R minoritaria para la proteína menos abundante que eluye a 47,5 minutos.
Los picos que contienen la PR-R mayoritaria y la PR-R minoritaria se recogen y las muestras se reducen a sequedad. Las proteínas después se resuspenden en guanidina-HCl 6 M, Tris-HCl 1 M, se reducen y se alquilan como se ha descrito anteriormente y se someten a una secuenciación automática como se ha descrito anteriormente.
Más adelante se presenta un resumen de los datos obtenidos.
3
4
Ejemplo 10 Purificación secuencia de PR-P y PR-Q
Se cultivan plantas de N. tabacum cv Xanthi en un invernadero cuando tienen ocho semanas de edad y se infectan frotando suavemente las hojas con una suspensión de una cepa común (U1) de TMV (0,5 \mug/ml). Se recogen las hojas siete días después de la infección y el ICF se retira de las hojas por lavado y se recoge de acuerdo con Parent y Asselin (1984). 250 ml de ICF se concentran a 50 ml por liofilización y se introducen en una columna Ultragel ACA54 equilibrada con Tris-HCl pH 8,0 y EDTA 1 mM. Los eluatos se analizan por electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%. Se reúnen las fracciones de la cromatografía Ultragel ACA54 que contienen PR-O, PR-P, PR-Q y PR-R y se concentran por liofilización. Las proteínas se purifican adicionalmente por PAGE seguido de electrotransferencia en una membrana de PVDF (Matsudaira, 1987). Las bandas proteicas transferidas que contiene PR-P y PR-Q se escinden y se tratan con PVP-40 al 0,5% en ácido acético 100 mM de acuerdo con el Boletín del Usuario nº 36 de Applied Biosystems, 21 de marzo de 1988. El desbloqueo de la proteína se realiza con piroglutamato aminopeptidasa como se describe y la proteína se secuencia a partir del PVDF por degradación de Edman automática como se ha descrito anteriormente.
Las secuencias del extremo amino de las proteínas PR-P y PR-Q se describen más adelante.
Para obtener la secuencia proteica a partir de péptidos derivados de PR-P y PR-Q, se reúnen las fracciones de la columna Ultragel que contienen proteínas PR, se liofilizan, se disuelven en agua y después se dializan frente a agua antes de la cromatografía en DEAE-Shephacel. La columna de DEAE-Shephacel se equilibra con Tris-HCl 50 mM, (pH 8,0), EDTA 1 mM y se eluye con un gradiente lineal de 0 a 0,4 M de cloruro sódico. La fracción 6, que contiene una mezcla de PR-R mayoritaria, PR-R minoritaria, PR-P, PR-Q, PR-O y varios contaminantes minoritarios se liofiliza y después se resuspende en agua destilada.
Las proteínas de la fracción 6 se purifican adicionalmente por HPLC usando una columna de fenilo de fase inversa y se eluyen con un gradiente lineal del 20 al 80% de acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al 0,1%. Las proteínas PR-P y PR-Q co-eluyen como un solo pico que se recoge y se concentra casi hasta la sequedad al vacío, se resuspenden en acetato amónico 10 mM pH 7,0 y se aplican a una columna de intercambio iónico de HPLC de Brownlee Labs AX-300 (2,1 mm x 10 cm) equilibrada en acetato amónico 10 mM (pH 7,0). Las proteínas se eluyen de esta columna usando un gradiente lineal de acetato amónico de 10 a 250 mM (pH 7,0). PR-P y PR-Q eluyen como un solo pico característico a concentraciones aproximadas de acetato amónico 75 mM y 95 mM, respectivamente.
Se generan péptidos por escisión con bromuro de cianógeno, digestión con tripsina o digestión con LysC y se purifican como se describe en el ejemplo 7. La secuencia de aminoácidos se determina como se describe en el ejemplo 7 y como se resume más adelante:
\newpage
PR-P
5
PR-Q
6
Ejemplo 11 Purificación de proteínas y secuencia de PR-O'
Se cultivan plantas de N. tabacum cv Xanthi en un invernadero cuando tienen ocho semanas de edad y se infectan frotando suavemente las hojas con una suspensión de una cepa común (U1) de TMV (0,5 \mug/ml). Se recogen las hojas siete días después de la infección y el ICF se retira de las hojas por lavado y se recoge de acuerdo con Parent y Asselin (1984). 250 ml de ICF se concentran a 50 ml por liofilización y se introducen en una columna Ultragel ACA54 equilibrada con Tris-HCl pH 8,0 y EDTA 1 mM. Los eluatos se analizan por electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%. Se reúnen fracciones de la cromatografía Ultragel ACA54 que contiene proteínas PR, como se determina por electroforesis en gel, se liofilizan se disuelven en agua y se dializan frente a agua antes de la cromatografía en DEAE-Sephacel. La columna de DEAE-Sephacel se equilibra con Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y EDTA 1 mM y se eluye con un gradiente lineal de 0 a 0,4 M de cloruro sódico. La fracción 6 que contiene una mezcla de PR-R mayoritaria, PR-R minoritaria, PR-P, PR-Q y varios contaminantes minoritarios se liofiliza y después se resuspende en agua destilada. Las proteínas individuales se purifican adicionalmente por cromatografía de HPLC de fase inversa usando una columna de Vydac fenilo (4,6 x 250 mm). Las proteínas se eluyen usando un gradiente lineal del 20 al 80% de acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al 0,1%. Los resultados de esta etapa de purificación revelan que la mezcla de proteínas contiene al menos 9 proteínas individuales. Una de estas proteínas, PR-O', que eluye a los 46 minutos, se recoge y se concentra por liofilización. La proteína se resuspende en guanidina-HCl 6 M, Tris-HCl 1 M y se reduce y alquila como se ha descrito anteriormente. Se generan péptidos por digestión por tripsina y se separan como se ha descrito anteriormente. A continuación se presenta un resumen de las secuencias de aminoácidos de estos péptidos.
7
Ejemplo 11B Purificación y secuencia proteica de PR-2, PR-N y PR-O
Se cultivan plantas de N. tabacum cv Xanthi en un invernadero cuando tienen ocho semanas de edad y se infectan frotando suavemente las hojas con una suspensión de una cepa común (U1) de TMV (0,5 \mug/ml). Se recogen las hojas siete días después de la infección y el fluido intercelular (ICF) se retira de las hojas por lavado y se recoge de acuerdo con Parent y Asselin (1984). 250 ml de ICF se concentran a 50 ml por liofilización y se introducen en una columna Ultragel ACA54 equilibrada con Tris-HCl pH 8,0 y EDTA 1 mM. Los eluatos se analizan por electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%. Se reúnen las fracciones que contienen proteínas PR como se determina por electroforesis en gel, se liofilizan, se disuelven en agua y se dializan frente a agua antes de la cromatografía en DEAE-Sephacel. La columna de DEAE-Sephacel se equilibra con Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM y se eluye con un gradiente lineal de 0 a 0,4 M de cloruro sódico. La fracción 6, que contiene una mezcla de PR-R mayoritaria, PR-R minoritaria, PR-P, PR-Q, PR-O y varios contaminantes minoritarios, se liofiliza. La fracción 3, que contiene una mezcla de PR-2, PR-N y varios contaminantes minoritarios, también se recoge por separado y se concentra por liofilización.
PR-O se purifica adicionalmente a partir de otras proteínas de la fracción 6 resuspendiendo primero la fracción 6 en 2 ml de agua y separando después las proteínas por cromatografía de HPLC de fase inversa usando una columna Vydac fenilo (4,6 X 250 mm). Las proteínas se eluyen usando un gradiente lineal del 20 al 80% de acetonitrilo:isopropanol (1:1) en TFA al 0,1%. Los resultados de esta etapa de purificación revelan que la mezcla contiene al menos nueve proteínas. Una de estas proteínas, que eluye en un ensayo a 51 minutos, es PR-O, como se determina por electroforesis en gel. El pico que contiene PR-O se recoge y se concentra por liofilización. La proteína se resuspende en guanidina-HCl 6 M, Tris-HCl 1 mM y se reduce y alquila como se ha descrito anteriormente. Se generan péptidos por digestión con tripsina y LysC y se purifican como se ha descrito anteriormente. La secuencia de la proteína se determina como se describe en el ejemplo 7. Más adelante se proporciona un resumen de los datos de secuenciación.
Las proteínas PR-2 y PR-N se purifican a partir de la fracción 3 usando una columna de intercambio aniónico Aquapore AX-300 (2,1 x 100 mm) de Brownlee. Las proteínas se eluyen de la columna usando un gradiente lineal de acetato amónico de 10 mM a 350 mM pH 7,0. PR-N eluye a 37,5 minutos y PR-2 eluye a 50,0 minutos como picos individuales y uniformes. La identidad de las proteínas se confirma por electroforesis en gel. Las proteínas se recogen, se concentran por liofilización y después se reducen y se alquilan como se ha descrito anteriormente. Se generan péptidos por digestión con tripsina y se purifican como se describe en el ejemplo 7. Los datos de secuenciación de la proteína se resumen más adelante.
PR-2
8
PR-N
9 
\newpage
PR-O
10
Ejemplo 12 Purificación y secuencia proteica de quitinasa/lisozima de pepino
Se aísla una proteína quitinasa inducible por patógenos a partir de hojas de pepino infectadas como se ha descrito (Métraux et al., 1988). Se generan péptidos a partir de esta preparación de proteína homogénea esencialmente como se describe en la técnica y como se ha descrito anteriormente. A continuación se resume la secuencia de aminoácidos de estos péptidos.
11
12
13
14
15
Ejemplo 12B Purificación y secuencia proteica de la peroxidasa de pepino
La proteína peroxidasa de pepino, ácida, inducida por patógenos se purifica como se describe por Smith, J.A., PH.D. Thesis, Department of Botany and Plant Pathology, Michigan State University, Lansing, Michigan (1988), a partir de las hojas no infectadas de plantas de pepino se que han infectado siete días previamente con una suspensión de esporas de Colletotrichum lagenarium.
La proteína purificada se reduce y se alquila y la secuencia de aminoácidos del extremo amino y de péptidos derivados de la digestión con LysC o tripsina se determina como se describe en el ejemplo 7. Los resultados de la secuenciación de aminoácidos se resumen a continuación.
16
Sección 3
Aislamiento de nuevos clones de ADNc
Esta sección describe el aislamiento de nuevos clones de ADNc. Se divide en tres secciones: la sección A incluye la construcción de bibliotecas usadas en el aislamiento de clones. La sección B incluye la identificación y purificación de los clones aislados de esta manera. La sección C incluye el desarrollo de una nueva tecnología de clonación de ADNc.
Sección 3A
Construcción de bibliotecas de ADNc Ejemplo 13 Preparación de una biblioteca de ADNc a partir de hojas de tabaco infectadas con TMV
Se infectan hojas de N. tabacum cv. Xanthi con TMV y se recogen 5 días después de la infección. El ARN total se prepara como se ha descrito anteriormente y se aísla el ARN poli A+ usando técnicas convencionales. Se construye una biblioteca de ADNc usando este ARN poli A+ en el vector de clonación Lambda ongC (Stratagene) esencialmente como se describe (Gubler y Hoffman, 1983).
Ejemplo 14A Preparación de una biblioteca de ADNc a partir de hojas no infectadas de tabaco en el que se ha inoculado TMV usando un nuevo vector de clonación de ADNc
pCGN1703, un vector de clonación de ADNc plasmídico del tipo de vector- cebador descrito por Okayama y Berg (1982), se construye como un vector mejorado para simplificar el proceso de clonación y facilitar el lanzamiento de bibliotecas en un vector de fago, así como para proporcionar funciones adicionales que están fuera del presente uso.
A. Construcción del vector de clonación pCGN1703. Como plásmido de partida se usa Bluescribe M13- (Stratagene, Inc.). El sitio BamHI se deleciona por digestión con BamHI y tratamiento con nucleasa de Vigna radiata, seguido de la unión con ADN ligasa de T4 para producir pCGN1700. Este plásmido se digiere con EcoRI y SacI y después se une con un poliengarce sintético bicatenario creado por hibridación de dos oligonucleótidos de la secuencia
17
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De esta manera, el plásmido resultante tiene sitios de restricción adicionales para SmaI, ApaI, XbaI, PstI y BamHI y se denomina pCGN1702. Obsérvese que no se reconstruye el sitio EcoRI.
pCGN1702 se digiere completamente con HindIII y sus extremos se hacen romos con la polimerasa de T4. El ADN resultante se somete a digestión parcial con PvuII y después se une con ADN ligasa de T4. Se selecciona un transformante que ha delecionado el fragmento HindIII/PvuII de 214 pb que incluye la región operador-promotor de lac; este plásmido se denomina pCGN1703.
El uso de plásmidos de vector-cebador tales como pCGN1703 se describió previamente (Alexander, 1987). Como se describe en la sección de ADENDDUM de este trabajo, el presente vector es un vector monomérico. Los tractos T usados para cebar la síntesis de ADNc están presentes en los dos extremos del vector durante las reacciones de transcriptasa inversa y transferasa terminal (cola G), y el ADN del engarce usado para circularizar los productos finales de la clonación de ADNc con pCGN1703 tiene la estructura generalizada siguiente: promotor de T7, un sitio de clonación múltiple (SmaI, ApaI, XbaI, PstI, BamHI, NotI, EcoRI, SacI), tracto homopolimérico C:G (de 10 a 15 restos), inserto de ADNc (5'-3' de cadena con sentido de ARNm), tracto homopolimérico A:T (de 40 a 100 restos), y otro sitio de clonación múltiple (KpnI, SmaI, XbaI, Sail, PstI y SphI), todos contenidos dentro del esqueleto plasmídico derivado de Bluescribe M13- como se ha descrito anteriormente.
B. Construcción de la biblioteca de ADNc usando pCGN1703. Se cultivan plantas de tabaco Xanthi.nc en un fitotrón hasta que tienen una altura de aproximadamente 10 a 12 pulgadas. En dos hojas situadas cerca de la parte inferior de cada planta se inocula una muestra simulada que consta sólo de tampón (fosfato sódico 10 mM, pH 7,0) o una muestra de TMV (10 \mug/ml en el mismo tampón). Once días después, se recogen de 3 a 4 hojas superiores, que no se han inoculado, y se congelan en nitrógeno líquido. El ARNm poli-A+ se aísla por métodos descritos previamente (Hall et al., 1978, p. 3196-3200; Maniatis et al, 1982, p. 297-209). Se construye una biblioteca de ADNc usando el ARN poli-A+ aislado a partir de hojas inducidas con TMV, en el vector pCGN1703 por métodos descritos previamente (Alexander, 1987). El ADN plasmídico de la biblioteca de ADNc amplificada (Alexander, 1987) se digiere completamente con EcoRI y se subclona en el sitio EcoRI de lgt-10 (Stratagene, Inc.) Debe tenerse en cuenta que el vector plasmídico permanece unido a los ADNc y también se clona en el vector del fago. Por lo tanto, usando este proceso, se construyen dos bibliotecas de ADNc, una en la que la biblioteca está contenida en un vector plasmídico y la otra en la que la biblioteca de ADNc está contenida en un vector de fago.
Ejemplo 14B Preparación de una biblioteca de ADNc a partir de hojas de pepino infectadas con TNV
Se infectan hojas de pepino con virus de la necrosis del tabaco (TNV) y el ARN se aísla 5 días después de la infección como se ha descrito anteriormente. Se aísla ARN poli A+ por técnicas convencionales y se construye una biblioteca de ADNc en el vector de clonación lambda Zap (Stratagene), esencialmente como se describe (Gubler y Hoffman, 1983).
Sección 3B
Identificación, aislamiento y caracterización de clones de ADNc Ejemplo 15 Aislamiento de ADNc que codifican PR-1a, PR-1b y PR-1c
Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de la biblioteca de ADNc preparada anteriormente con un oligonucleótido de la secuencia:
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Se purifican 25 placas positivas por técnicas convencionales y se prepara ADN a partir del fago. Un fragmento del fago recombinante que contiene el ADNc se subclona en el plásmido bluescript. Se determina una secuencia de ADNc parcial de cada clon por secuenciación del ADN. Se descubre que los 26 clones pueden tipificarse en tres clases de ADNc. La clase 1 se representa por el clon pBSPR1-207, la clase 2 se representa por el clon pBSPR1-1023 y la clase 3 se representa por el clon pBSPR1-132.
Para determinar la identidad de los tres clones con respecto a las proteínas PR-1 conocidas, se comparan los datos de las secuencias de aminoácidos para las proteínas PR-1a y PR-1b determinadas anteriormente con las secuencias de aminoácidos deducidas a partir de los tres clones de ADNc representativos. La comparación se resume más adelante.
La secuencia de aminoácidos determinada experimentalmente a partir de lo anterior se muestra en la línea superior, mostrando el primer aminoácido (deducido) entre paréntesis. La secuencia deducida a partir de los clones pBSPR1-207 (=a), pBSPR1-1023 (=b) y pBSPR1-312 (=c) se muestra debajo de los datos de los péptidos, indicándose las coincidencias con (-). Los restos que no coinciden se denominan por su símbolo de aminoácidos.
PR-1a
20
21
22
23
24
PR-1b
25
26
27
28
Cuando la secuencia de la proteína para PR-1a se compara con la secuencia de aminoácidos deducida derivada de pBSPR1-20 existe coincidencia en todos los restos. Sin embargo, cuando la secuencia de aminoácidos deducida procedente de los péptidos pBSPR1-1023 o pBSPR1-312 se compara con la secuencia proteica para PR-1a hay siete y seis desacoplamientos, respectivamente. De esta manera, la evidencia demuestra claramente que el clon pBSPR1-207 codifica la proteína PR-1a.
\newpage
Cuando la secuencia de aminoácidos para la proteína PR-1b se compara con la secuencia de aminoácidos deducida derivada de la proteína pBSPR1-1023, hay coincidencia en todos los restos. Sin embargo, en comparaciones con la secuencia derivada de pBSPR1-207 o pBSPR1-312 hay tres o seis desacoplamientos, respectivamente. De esta manera, los datos demuestran claramente que el clon pBSPR1-1023 codifica la proteína PR-1b. Además, por defecto, se determina que el clon pBSPR1-312 codifica la proteína PR-1c. Las secuencias de los ADNc que codifican PR-1a, PR-1b y PR-1c son las siguientes:
Secuencia 1
ADNc de PR-1a clonado en el plásmido pBSPR1-207
29
(Secuencia pasa a página siguiente)
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Secuencia 2
ADNc de PR-1b clonado en el plásmido pBSPR1-1023
30
Secuencia 3
ADNc de PR-1c clonado en el plásmido pBSPR1-312
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Ejemplo 16 Aislamiento de clones de ADNc que codifican PR-R mayoritaria y PR-R minoritaria
Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de la biblioteca construida anteriormente con una sonda oligonucleotídica de la secuencia
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Se purifican quince placas positivas por técnicas convencionales y se prepara el ADN a partir del fago. Un fragmento del fago recombinante que contiene el ADNc se subclona en el plásmido bluescript. La secuencia de ADN parcial del inserto de ADNc revela que los clones pueden tipificarse en dos clases. La secuencia de uno de estos clones, pBSPRR-401, que codifica la forma principal de PR-R (Pierpoint et al., 1987; y supra) es la siguiente:
Secuencia 4
ADNc de PR-P mayoritaria clonado en el plásmido pBSPRR-401
33
La identidad de este ADNc que codifica la forma principal de PR-R mayoritaria se confirma por comparación de la secuencia de la proteína codificada con la secuencia amino terminal determinada experimentalmente antes y por comparación con la secuencia presentada para la isoforma de PR-R mayoritaria por Pierpoint et al (1987). Esta proteína codificada tiene un homología muy fuerte con un inhibidor de tripsina/\alpha-amilasa conocido aislado a partir de maíz (Richardson et al., 1987). La PR-R clonada puede ser un inhibidor de proteasas o \alpha-amilasas y, como tal, conferirá actividad insecticida, viricida o fungicida a las plantas cuando se exprese transgénicamente.
Ejemplo 17 Aislamiento de clones de ADNc que codifica PR-P y PR-Q
Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de la biblioteca de ADNc preparada anteriormente usando una sonda de ADNc marcada que codifica el gen de la quitinasa básica de tabaco (Shinshi et al., 1987) y lavando los filtros a 50ºC en NaCl 0,125 mM, SDS al 1%, fosfato sódico 40 mM (pH 7,2), y EDTA 1 mM. Se purifican 24 placas positivas y la secuencia de ADN de un clon denominado pBScht15 es la siguiente:
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Secuencia 5
ADNc de PR-Q clonado en el plásmido pBScht15
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Se determina que la proteína codificada en el clon de esta secuencia es PRP Q basándose en: (1) la homología estructural limitada con la quitinasa básica de tabaco y (2) la identidad con la secuencia proteica amino-terminal de PR-Q y la identidad con la secuencia de varios péptidos internos derivados de PR-Q, como se determina por secuenciación de proteínas (véase anteriormente). El clon aislado parece ser un ADNc truncado. Para aislar el extremo 5' del ADNc, primero se determina el extremo del ARNm.
Se sintetiza un cebador oligonucleotídico de la secuencia:
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denominado oligo A, por la química de \beta-cianoetilfosforamidita y se purifica por técnicas convencionales. Este cebador se usa en un experimento de extensión de cebadores como se ha indicado anteriormente usando ARN aislado de hojas infectadas con TMV. Se visualizan dos productos de extensión por autorradiografía correspondientes a los puntos terminales de ARNm que son 43 pb y 53 pb mayores que el ADNc de pBScht15.
Para aislar el extremo 5' del ADNc de PR-Q, se desarrolla un nuevo método de clonación basándose en la tecnología de PCR. Esencialmente, se usan dos cebadores para la amplificación y después se clona el extremo 5' del clon de ADNc a partir de la biblioteca de ADNc. En este procedimiento se usará un cebador (oligo A) que es complementario a la cadena con sentido del ADNc y localizado aproximadamente 160 bases dentro del ADNc de pBScht15 y un segundo cebador (oligo B u oligo C, mostrados más adelante) que cebará el ADNc de cualquier lado del vector de clonación \lambda.
El oligo A es complementario al ARNm de PR-Q y contiene una secuencia reconocida por la endonucleasa Nsil. Se sintetizan otros dos oligonucleótidos con la secuencia
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se purifican, y se denominan oligo B y oligo C. El oligo B tiene la misma secuencia que parte del vector de clonación \lambda OngC y el oligo C es complementario al poliengarce del vector de clonación \lambda OngC. Para clonar el extremo 5' del ADNc de PR-Q, se realizan dos PCR, una usando los oligos A y B y la otra usando los oligos A y C. Como plantilla para la reacción se usa una alícuota de la biblioteca de ADNc. Se necesitan las dos reacciones para amplificar clones que se han unido al vector \lambda OngC en cualquier dirección. Como control, también se realizan reacciones en alícuotas del lisado del fago purificado usando el aislado 15 de quitinasa. Después de la amplificación, el ADN se purifica y se digiere con Nsil y EcoRI y se procesa en un gel de agarosa LGT al 1,5%. Se escinden cortes de gel que contienen fragmentos de ADN mayores que el control y se unen a pBluescript que se digiere tanto con EcoRI como con PstI como se ha descrito anteriormente. Después de la transformación, se aíslan colonias positivas y el inserto de ADN se analiza por secuenciación del ADN. Varios insertos contienen el extremo 5' del ADNc de PR-Q y otros contienen el extremo 5' de PR-P (determinado comparando la secuencia de aminoácidos deducida a partir de los clones con la secuencia proteica determinada anteriormente).
El extremo 3' de PR-P después se aísla a partir de la biblioteca de ADNc por selección de aproximadamente 100.000 clones de la biblioteca de ADNc con una sonda de uno de los aislados 5' de PR-P, pBScht5'-5. Los fagos positivos se aíslan y se purifican y el inserto se subclona en pBluescript. Se secuencian varios insertos y se determina que uno, pBScht28 codifica PR-P. La secuencia de ADN de PR-P es la siguiente:
Secuencia 6
ADNc de PR-P clonado en el plásmido pBScht28
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Ejemplo 18 Aislamiento de clones de ADNc que codifican PR-O'
Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de la biblioteca de ADNc descrita anteriormente usando una sonda de ADNc marcada que codifica la forma básica de la \beta-1,3-glucanasa (Shinshi et al., 1988) y lavando los filtros a 50ºC en NaCl 0,125 M, SDS al 1%, fosfato sódico 40 mM (pH 7,2), y EDTA 1 mM. Se aíslan 15 placas positivas y el inserto se subclona en el plásmido bluescript. La secuenciación de ADN parcial revela que pBSGL5 y pBSGL6e codifican ADNc idénticos que tienen una homología de aproximadamente un 55% con la secuencia de ADN conocida de la forma básica de la \beta-1,3-glucanasa. Se determina la secuencia del ADNc en el clon 5 y 6 y se muestra como secuencia 7 para el ADNc en el plásmido pBSGL6e.
Secuencia 7
ADNc de PR-O' clonado en el plásmido pBSGL6e
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Secuencia 7A
PR-O' de longitud completa clonado en el plásmido pBSGL5B-12
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Este ADNc codifica la proteína PR-O' (una forma ácida de la \beta-1,3-glucanasa) basándose en la comparación con la secuencia de aminoácidos de péptidos derivados de la proteína PR-O'.
La comparación de la matriz de puntos con la \beta-1,3-glucanasa básica muestra que la secuencia 7 de ADNc probablemente carece de aproximadamente 80 bases del extremo 5'. Para aislar la forma de longitud completa del ADNc de PR-O', la biblioteca se vuelve a seleccionar con un fragmento de restricción EcoRI marcado procedente del plásmido pBSGL6e. Se aíslan seis clones positivos, se purifican y se subclonan en el plásmido bluescript. Las secuencias de los insertos en los plásmidos se determinan por secuenciación del ADN. Un clon, pBSGL5B-12, tiene 87 pb más que el ADNc en pBSGL6e (secuencia 7A).
Ejemplo 18B Aislamiento de clones de ADNc que codifican PR-2, PR-N, PR-O y PR-2'
Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de la biblioteca de ADNc preparada como se describe a partir del ARN aislado de hojas de tabaco infectadas con TMV, comprendiendo la sonda una mezcla de oligonucleótidos marcados (JR138) de la fórmula:
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donde cada Y se selecciona independientemente entre una pirimidina C o T y cada R se selecciona independientemente entre una purina C o G. Esta sonda tiene una longitud de 17 bases con una redundancia de 16 veces en la mezcla. El diseño de la sonda se basa en un análisis de los datos de la proteína en el ejemplo 11B. La sonda reconocerá clones que contienen la PR-2, PR-N o la \beta-1,3-glucanasa básica, pero no PR-O' o PR-O. Se aíslan 30 placas de hibridación positivas y se purifican, y sus insertos se subclonan en el plásmido bluescript. La secuencia de los insertos se determina por secuenciación del ADN y los resultados indican que se han aislado al menos 3 ADNc distintos. Cuando se comparan con los datos de la proteína del ejemplo 11B, está claro que un tipo de clon contiene un ADNc de longitud completa que codifica la proteína PR-2 (pBSGL117), otro tipo codifica la proteína PR-O (pBSGL134), otro tipo codifica la proteína PR-N (pBSGL125 y pBSGL148) y otro tipo codifica una proteína muy relacionada que no es ni PR-2, ni PR-N, ni PR-O. Hemos denominado a este tipo de ADNc PR-2' (pBSGL135).
Para aislar un clon de ADNc que codifica PR-O y también para aislar más clones de ADNc de longitud completa, la biblioteca se selecciona por segunda vez con un fragmento de restricción PstI de pBSGL125. pBSGL125 es un clon de 500 pb que codifica una PR-N, que está truncada en el extremo 5'. Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de la biblioteca y se aíslan 17 placas positivas, se purifican y los insertos se subclonan en bluescript. Las secuencias de los insertos se determinan por secuenciación del ADN.
Para asegurar que se aíslan clones de longitud completa a partir de las cuatro glucanasas ácidas, se emplean dos estrategias finales. En primer lugar, se realiza una vuelta final de selección usando un fragmento de restricción PVuII-TaqI de 210 pb, derivado de pBSGL117 como sonda. En esta selección se aíslan 17 clones, se purifican, se subclonan en bluescript y sus secuencias se determinan por secuenciación del ADN.
La segunda estrategia es amplificar el extremo 5' del ADNc de la biblioteca por una estrategia de PCR descrita en el ejemplo 17. En este caso, se usan los dos oligonucleótidos B y C junto con un tercer oligonucleótido JR209 que es complementario a las posiciones 152 a 169 de la secuencia de ADNc de PR-2. En este experimento, se realizan dos PCR; conteniendo una de ellas una alícuota de la biblioteca de ADNc como plantilla y los cebadores JR209 y DP01 (oligo B del ejemplo 17) y usando la otra una alícuota de la biblioteca de ADNc como plantilla y usando JR209 y GP38 (oligo C del ejemplo 17) como cebadores. La secuencia de JR209 es la siguiente:
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El control positivo en el experimento de amplificación es una alícuota del clon GL117 purificado que codifica el ADNc de PR-2 de longitud completa amplificado con JR209 y DP01. El control negativo en el experimento es una amplificación que usa JR209 y GP38. Las alícuotas de los productos de la PCR se analizan por electroforesis en gel de agarosa y se descubre una banda de aproximadamente el tamaño del control positivo amplificado de la biblioteca para cada serie de cebadores. Este resultado sugiere que el procedimiento es satisfactorio y, de esta forma, el ADN restante se purifica y después se trata con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I en presencia de los cuatro dNTP, como se describe por Maniatis et al. (1982) para hacer que los extremos de las moléculas de ADN sean "romos". La enzima de Klenow se inactiva por calentamiento a 65ºC durante 5 minutos y el ADN después se restringe con EcoRI. El ADN se purifica y después se somete a electroforesis en un gel de agarosa LGT al 1,5%. La banda de ADN del tamaño correcto se escinde del gel y se usa para unirse al plásmido bluescript, que se ha sometido a restricción tanto con EcoRI como con EcoRV. La unión se usa para transformar bacterias, se seleccionan colonias positivas y se analizan por secuenciación del ADN.
El resultado de los procedimientos anteriores es el aislamiento de clones que comprenden los clones de ADNc de longitud completa para PR-2, PR-N, PR-O y un cuarto tipo de glucanasa ácida, PR-2', que codifica una proteína desconocida. La secuencia de PR-2 es la siguiente:
Secuencia 8
PR-2 clonada en el plásmido pBSGL117
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pBSGL134 es el plásmido aislado que contiene un inserto de ADNc que codifica una proteína PR-O.
Los fagos \lambdatobcDNAGL153 y \lambdatobcDNAGL162 son clones que contienen el ADNc de PR-O de longitud completa. El fago \lambdatobcDNAGL161 es un clon que contiene el ADNc de PR-2' de longitud completa.
La determinación de la proteína codificada en el inserto de ADNc se basa en una comparación entre los datos de la proteína en 11B y la secuencia proteica deducida codificada por el inserto de ADNc.
Ejemplo 19 Aislamiento de clones de ADNc que codifican SAR8.2 y SAR8.2b
Se seleccionan levantamientos de filtro de la biblioteca subclonada preparada anteriormente con sondas de ADNc marcadas en un método descrito previamente (St. John and Davis, 1979), con la excepción de que los mismos levantamientos de filtro se seleccionan secuencialmente en lugar de por selección de los levantamientos replicados. La primera sonda se sintetiza como se ha descrito, usando transcriptasa inversa y [\alpha^{32}P]-dCTP, a partir del ARNm de la muestra de ARN inducida de forma simulada aislada anteriormente; después del sondeo y de la exposición a una película de rayos X, se vuelven a sondear los mismos filtros (sin purificación) usando la sonda sintetizada como se ha indicado anteriormente pero a partir de la muestra de ARN inducida por TMV aislada anteriormente. Después de la exposición, las dos películas de rayos X se comparan usando un sistema de análisis de imágenes digital informatizado (Biological Vision, Inc., San Jose, California) de acuerdo con las especificaciones del fabricante, y se seleccionan las placas que producen una mayor señal cuando se tratan con la sonda inducida con TMV. Las placas seleccionadas se purifican por una segunda vuelta de sondeo a una densidad de placa seleccionada de aproximadamente 100/placa, y los insertos de ADNc se recuperan del fago como se indica a continuación: una pequeña cantidad del ADN del fago aislado se digiere con EcoRI seguido de inactivación de la enzima de restricción, dilución, una segunda unión con ADN ligasa de T4 y transformación de la cepa DH- 5\alpha de E. coli (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland) seguido de un crecimiento selectivo en placas de cultivo que contienen ampicilina. Este procedimiento permite la recuperación directa del ADNc contenido en el vector plasmídico a partir del vector de fago. Las secuencias de ADN de estos dos clones ligeramente diferentes se muestran como secuencia 9 y secuencia 10 para el ADNc en los plásmidos pCIB/SAR8.2 (por ejemplo, ADNc de SAR8.2a) y pCIB/SAR8.2b (por ejemplo, ADNc de SAR8.2b).
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Secuencia 9
ADNc de SAR8.2a clonado en el plásmido pCIB/SAR8.2a
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Secuencia 10
ADNc de SAR8.2b clonado en el plásmido pCIB/SAR8.2b
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El análisis de ARN de hojas de tabaco inducidas de forma simulada frente a hojas de tabaco inducidas con TMV, usando análisis de Northern y el ensayo de extensión de cebadores, confirma que los niveles de estado estacionario de los ARNm de la familia pSAR8.2 se aumentan por la inducción por TMV.
Ejemplo 20 Aislamiento de clones de ADNc que codifican la quitinasa/lisozima procedente de pepino
Se seleccionan dos regiones de la secuencia proteica determinada en el ejemplo 12 y se sintetizan sondas oligonucleotídicas que son complementarias a todas las posibles combinaciones de ARNm capaces de codificar los péptidos. Las secuencias de las sondas son:
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Se cultivan aproximadamente 300.000 placas de la biblioteca construida anteriormente y se someten levantamientos de placas por duplicado a una sonda de una mezcla 1 (sonda 1) o mezcla 2 (sonda 2) de oligonucleótidos marcados con ^{32}P. Se aíslan las placas que muestran resultados positivos cuando se seleccionan con cualquier sonda. El aislamiento de los fagos y la escisión automática se realizan como se ha descrito en el manual de laboratorio de Stratagene Lambda Zap, Stratagene, San Diego, USA.
Una vez aislados los clones de ADNc de quitinasa en el plásmido bluescript, se secuencian por secuenciación didesoxi. La secuencia del ADNc de quitinasa contenido en el plásmido pBScuccht5 (aka pBScucchi/quitinasa) es la siguiente:
Secuencia 11
ADNc de quitinasa/lisozima de pepino clonado en el plásmido pBScucchi. (aka pBScuccht5)
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Ejemplo 20B ADNc de peroxidasa de pepino
Se diseña una sonda oligonucleotídica para aislar ADNc que codifican la peroxidasa de pepino basándose en los datos de la proteína presentados en el ejemplo 12B. La secuencia de la mezcla de oligonucleótidos es la siguiente:
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donde cada R se selecciona independientemente entre una purina G o C. Esta mezcla de oligonucleótidos tiene una longitud de 20 bases y contiene 64 especies.
Se prepara una biblioteca de ADNc a partir de ARN aislado de hojas de plantas de pepino 5 días después de la infección con el virus de la necrosis de tabaco como se describe en el ejemplo 14B. Esta biblioteca se construye en el vector de clonación Lambda ZAP.
Se seleccionan aproximadamente 300.000 placas de esta biblioteca de ADNc con la sonda oligonucleotídica y se aíslan 25 placas. Éstas se vuelven a seleccionar varias veces y se purifican. Como resultado de este proceso, sólo permanecen positivas 6 placas después de muchas vueltas de purificación. Los insertos contenidos en estos clones se escinden usando el protocolo de escisión automático descrito en el manual de laboratorio de Stratagene Lambda ZAP. Los insertos se secuencian por secuenciación didesoxi de doble cadena y después las estructuras se analizan por un análisis de matriz de puntos por comparación con la secuencia de una peroxidasa que forma lignina, ácida, aislada a partir de tabaco (Lagrimini et al., 1987). Dos de estos clones, Per1 y Per25, muestran alguna homología limitada con el ADNc de tabaco y se eligen para un análisis adicional. Tras completar la secuenciación de los clones, se descubre que codifican la misma proteína.
Después se usa una sonda derivada de la peroxidasa de pepino para volver a seleccionar la biblioteca de pepino y se aíslan aproximadamente 30 placas. Después de la purificación, los insertos se escinden del fago como plásmidos y después la secuencia se determina por secuenciación del ADN.
Los resultados de este análisis son el aislamiento de dos tipos de clones de ADNc de peroxidasa a partir de pepino. Uno que codifica una proteína básica codificada por el plásmido pBSER1, cuya secuencia de nucleótidos se presenta a continuación, y el otro que codifica una peroxidasa relacionada contenida en los plásmidos, pBSPER24 y pBSPER25.
Secuencia 12
ADNc de peroxidasa de pepino clonado en el plásmido pBSPER1
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Sección 3C
Desarrollo de una nueva tecnología de clonación y selección diferencial. Ejemplo 21 Esquema de enriquecimiento diferencial
Se ha concebido y desarrollado un método que permite el enriquecimiento eficaz de secuencias presentes en una población de moléculas en mayores cantidades que en otra población. La mayor utilidad del método es en situaciones en las que las poblaciones son muy similares y las secuencias presentes diferencialmente representan una proporción muy pequeña de la población.
Si dos poblaciones de clones son similares y se desea aislar los clones que están presentes en una población en mayores cantidades (es decir "inducidos" o "regulados diferencialmente"), las técnicas previas implicaban la selección con sondas de las dos poblaciones (selección +/- (St. John y Davis, 1979), o el enriquecimiento de sondas de ARNm por hibridación y cromatografía de hidroxi-apatita (HAP) (Davis et al., 1984). El primer método tiene una limitación de sensibilidad demostrada, ya que sólo se detectarán los clones presentes en cantidades mayores de aproximadamente 1 en 2.000. El segundo método es laborioso, técnicamente difícil y consigue enriquecimientos de 20 a 50 veces en el mejor de los casos.
El presente método implica la explotación de dos desarrollos recientes en el campo de la tecnología molecular: PCR (Saiki et al., 1988) y cromatografía de biotina-avidina (Stahl et al., 1988). La PCR permite la síntesis sencilla de grandes cantidades de ADN de secuencia especificada. La cromatografía de biotina-avidina permite la separación eficaz de moléculas que llevan una señal de afinidad de biotina de las moléculas que no llevan la señal.
En su forma general, la técnica consiste en aislar cadenas sencillas de ADNc que representan dos poblaciones diferentes ("inducidas" frente a "no inducidas"), pero de polaridad de ADNc opuesta para las dos poblaciones, es decir, una de polaridad "con sentido" con respecto a los ARNm, y la otra su complementaria o de polaridad "anti-sentido" con respecto a los ARNm. Las cadenas aisladas de la población "inducida" no tendrían señal de afinidad, mientras que las cadenas de polaridad opuesta de las poblaciones "no inducidas" tendrían señales de afinidad estables. Cuando estas dos poblaciones hibridan, se formarán híbridos entre cadenas complementarias presentes en las dos poblaciones. Las cadenas de la población "inducida" que no tengan homólogos, o muy pocos homólogos, en la población "no inducida" permanecerán con una sola cadena. Debido a la presencia de la señal de afinidad (en esencia, un asa) en las cadenas de las moléculas de la población "no inducida", esas cadenas, y lo que es más importante, cualquier molécula híbrida pueden retirarse de la mezcla por cromatografía de afinidad. Esto deja sólo las moléculas "inducidas" que no están representadas significativamente en la población "no inducida". Estas moléculas "inducidas" después pueden clonarse por medios convencionales y servir como una población enriquecida a partir de la cual se aíslan los clones "inducidos"; como alternativa, las moléculas enriquecidas pueden amplificarse individualmente y secuenciarse directamente.
Un esquema alternativo es el mismo que se ha descrito anteriormente con la excepción de que implica la incorporación de una señal de afinidad lábil sólo en las moléculas de la población "inducida", mientras que la señal de afinidad en la población "no inducida" es estable. En este caso, "lábil" significa que la señal de afinidad puede retirarse en el futuro o se alterará en el futuro de tal forma que ya no sirva como una señal de afinidad. En este esquema, todas las moléculas de la mezcla de hibridación podrían unirse a la matriz de afinidad, pero sólo podrían recuperarse selectivamente de la matriz las moléculas "inducidas" que no hibridan con un homólogo complementario "no inducido", para una clonación posterior.
A continuación se proporciona un ejemplo específico del primer esquema descrito anteriormente, usando poblaciones de ADNc en vectores de clonación de fagos. Las poblaciones de ADNc "inducida" y "no inducida" (construidas a partir de ARNm de hojas de tabaco inducidas con TMV o inducidas de forma simulada en este caso) se clonan en dos fagos diferentes de forma que los cebadores usados para amplificar los insertos del clon sean diferentes (y de esta forma no hibriden en etapas posteriores). El banco de ADNc "inducido" se construye en \lambdaGEM-4 (Promega, Inc.) y el banco de ADN "no inducido" o "inducido de forma simulada" se construye en \lambdaZAP-II (Stratagene, Inc). Para cada vector, se sintetizan cebadores oligonucleotídicos específicos de tal forma que representen secuencias en el vector del fago inmediatamente adyacentes al sitio de clonación del ADNc y que, cuando se usen en la reacción en cadena de la polimerasa en presencia del fago correspondiente, se amplifique el ADN clonado en el sitio de clonación de ADNc. Conjuntamente se amplifica una población de fagos que representan todos los miembros de cada banco, produciendo una población de insertos de ADNc que representan el banco. En cada caso, uno de los cebadores oligonucleotídicos está biotinilado, de forma que una cadena específica de cada ADN del banco amplificado puede seleccionarse positivamente por cromatografía de afinidad de avidina y separación de la cadena, seguido de la liberación y recuperación de la cadena seleccionada con biotina; de forma importante, los cebadores usados para la biotinilación se seleccionan de tal forma que se seleccionan cadenas de polaridad opuesta a partir de los bancos de ADNc "inducidos" frente "no inducidos".
La señal de biotina en el caso del ADN "inducido" es lábil, ya que el brazo espaciador a través del cual se une el resto de biotina contiene un enlace disulfuro, y la señal en el ADN "no inducido" es estable. En este caso, la cadena sencilla de la población "inducida" se libera por tratamiento con DTT, perdiendo su señal de biotina, y la cadena sencilla de la población "no inducida" se libera por desnaturalización de la molécula de avidina, mientras que retiene su señal de biotina. Cuando el ADN "diana" recuperado (cadena sencilla de la biblioteca "inducida") se hibrida con el ADN "director" recuperado (cadena sencilla de la biblioteca "inducida de forma simulada" o "no inducida"), los complejos que se forman y el exceso de ADN "director" pueden retirarse por cromatografía de afinidad de avidina. El ADN "diana" restante aún lleva las secuencias de cebador, haciendo muy sencilla su recuperación por medio de la reparación posterior o amplificación y clonación.
En el esquema alternativo, se recuperan tanto los ADN monocatenarios "diana" como "director" por desnaturalización de la avidina en la matriz de afinidad, reteniendo ambos tipos sus señales de biotina. Después de la hibridación, todas las moléculas se unen a la matriz de afinidad y, después del lavado, el ADN "diana" no hibridado, que lleva la señal de afinidad "susceptible", se eluye selectivamente de la matriz por DTT.
Esta modificación permite una selección positiva del ADN "diana" monocatenario, evitando problemas potenciales con la unión menor que cuantitativa de la mezcla de hibridación a la matriz de afinidad. La ventaja de esta técnica con respecto a las descritas previamente es la capacidad de aislar los genes que se activan sólo a bajos niveles, en circunstancias específicas, y que pueden participar de forma causal en algunos fenómenos biológicos importantes.
En las dos formas de la técnica descrita anteriormente, el ADN monocatenario "diana" y "director" se genera por cromatografía de afinidad de biotina-avidina.
Un método alternativo para generar estas poblaciones de una sola cadena es un método descrito como PCR "asimétrica" (Gyllensten y Erlich, 1988). Este método consta de múltiples ciclos de extensión de polimerasa y desnaturalización, como en la PCR, pero en presencia de únicamente uno de los cebadores. El cebador elegido determina la polaridad del ADN resultante, permitiendo de esta manera la polaridad selectiva crítica para la técnica como se ha descrito anteriormente. En este caso, la PCR asimétrica se realiza más fácilmente usando como plantilla una pequeña cantidad de productos de PCR bicatenarios de la población relevante, a partir de la cual se ha retirado el exceso de cebadores.
Sección 4
Genes quiméricos
Esta sección describe combinaciones de secuencias de ADNc con secuencias que promueven la transcripción de los ADNc y con las que facilitan el procesamiento del extremo 3' del ARNm en las células vegetales. La primera serie de ejemplos incluye la construcción de plásmidos que contienen el cassette de expresión y la segunda sección describe la subclonación de ADNc en los cassettes tanto en la orientación con sentido como en la orientación anti-sentido.
Sección 4A
Construcción de plásmidos que contienen cassettes de expresión vegetales Ejemplo 22 Construcción de pCGN1509 (cassette de promotor de subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco)
pCGN1509 es un plásmido de cassette de expresión que contiene la región reguladora 5' y el promotor de un gen de la subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco, y la región 3' del gen de la octopina sintasa (ocs) del plásmido Ti de A. tumefaciens, con sitios de restricción únicos entre estas dos partes. La región reguladora 5' finalmente se obtiene a partir de un fragmento EcoRI de 3,4 kb que contiene el gen de la subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco TSSU3-8 (O'Neal et al., 1988).
El fragmento EcoRI de 3,4 kb de TSSU3-8 se clona en el sitio EcoRI de M13 mp18 (Yanisch-Perron et al., 1985) para producir un clon de M13 8B. Como plantilla para extender el cebador oligonucleotídico "Sonda 1" (O'Neal et al., 1987) se usa ADN monocatenario usando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I. Los productos de extensión se tratan con nucleasa de Vinca radiata y después se digieren con HindIII para producir un fragmento de 1450 pb que contiene la región promotora de la subunidad pequeña; el fragmento se clona en pUC18 digerido con HindIII-SmaII (Yanisch-Perron et al., 1985) para producir pCGN625. El fragmento BamHI-EcoRI de pCGN625 se clona en el fragmento grande BamHI-EcoRI (esqueleto plasmídico) de pCGN607 digerido con BamHI-EcoRI en el que el sitio SmaI en la posición 11207 (Barker et al., 1983) de la región ocs 3' se convierte en un sitio BglII por unión de un engarce BglII sintético (Facciotti et al., 1985). Esto produce el plásmido pCGN630. El sitio BamHI de pCGN630 se deleciona por digestión con BamHI y por tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I para crear pCGN1502. El sitio KpnI de pCGN1502 se reemplaza por un sitio BamHI por digestión de pCGN1502 con KpnI, tratamiento con la enzima de Klenow y unión de un engarce sintético BamHI. La construcción resultante es pCGN1509.
Ejemplo 23 Construcción de pCGN1761 (un cassette promotor doble 35S de CaMV/terminador que contiene resistencia a ampicilina) y pCGN1431 (un cassette promotor doble 35S de CaMV/terminador, que contiene resistencia a cloranfenicol)
pCGN1761 contiene un promotor doble 35S de CaMV y la región tm-I 3' con un sitio EcoRI entre ellos, contenidos en un esqueleto plasmídico derivado de pUC. El cassette del sitio de procesamiento promotor-EcoRI-3' está bordeado por múltiples sititos de restricción para permitir una eliminación fácil. El plásmido se obtiene por una serie de etapas (véase más adelante) a partir de un plásmido inicial doble 35S, pCGN2113, que procede de pCGN164 y pCGN638.
pCGN1431 también contiene el promotor doble 35S de CaMV y la región tm-1 3' con un sitio de clonación múltiple entre ellos. Este cassette de promotor/terminador está contenido en un vector derivado de pUC que contiene un gen de resistencia a cloranfenicol en lugar de un gen de resistencia a ampicilina. El cassette está bordeado por múltiples sitios de restricción para facilitar la eliminación.
A. Construcción de pCGN986. pCGN986 contiene un promotor 35S de CaMV y una región de ADN-T tm-I 3' con múltiples sitios de restricción entre ellos. pCGN986 procede de otro plásmido, pCGN206, que contiene un promotor 35S de CaMV y una región 3' diferente, la región de extremo 3' VI de CaMV. El promotor 35S de CaMV se clona como un fragmento AluI (pb 7144-7734) (Gardner et al., 1981) en el sitio HincII de M13mp7 (Messing et al., 1981) para crear C614. Una digestión con EcoRI de C614 produce el fragmento EcoRI de C614 que contiene el promotor 35S que se clona en el sitio EcoRI de pUC8 (Vieira y Messing, 1982) para producir pCGN147.
El pCGN148a, que contiene una región promotora, un marcador selectivo (kanamicina con 2 ATG) y una región 3', se prepara por digestión de pCGN528 con BglII e inserción del fragmento promotor BamHI-BglII procedente de pCGN147. Este fragmento se clona en el sitio BglII de pCGN528 de forma que el sitio BglII esté próximo al gen de kanamicina de pCGN528.
El vector lanzadera, pCGN528, usado para esta construcción se obtiene como se indica a continuación: pCGN525 se obtiene por digestión de un plásmido que contiene Tn5 que lleva un gen de kanamicina (Jorgensen et al., 1979) con HindIII-BamHI e insertando el fragmento HindIII-BamHI que contiene el gen de resistencia a kanamicina en los sitios HindIII-BamHI en el gen de tetraciclina de pACY184 (Chang y Cohen, 1978). pCGN526 se obtiene por la inserción del fragmento BamHI 19 de pTiA6 (Thomashow et al., 1980) modificado con engarces XhoI insertado en el sitio SmaI, en el sitio BamHI de pCGN525. pCGN528 se obtiene delecionando el XhoI pequeño y volviendo a realizar la unión.
pCGN149a se obtiene por clonación del fragmento del gen de kanamicina BamHI desde pMB9kanXXI en el sito BamHI de pCGN148a. pMB9KanXXI es una variante de pUC4K (Vieira y Messing, 1982) que carece del sitio XhoI pero contiene un gen de kanamicina funcional de Tn903 para permitir una selección eficaz en Agrobacterium.
pCGN149a se digiere con HindIII y BamHI y se une a pUC8 digerido con HindIII y BamHI para producir pCGN169. Esto retira el marcador de kanamicina Tn903. Tanto pCGN565 como pCGN169 se digieren con HindIII y PstI y se unen para formar pCGN203, un plásmido que contiene el promotor 35S de CaMV y parte del extremo 5' del gen de kanamicina TN5 (hasta el sitio PstI, Jorgensen et al., 1979). Se añade una región reguladora 3' a pCGN223 desde pCGN204 (un fragmento EcoRI de CaMV (pb 408-6105) que contiene la región 3' del gen VI subclonada en pUC18 (Gardner et al.,1981) por digestión con HindIII y PstI y unión. El cassette resultante, pCGN206, es la base para la construcción de pCGN986.
Las secuencias de ADN-T tm-I 3' de pTiA6 se subclonan desde el fragmento Bam19 ADN-T (Thomashow et al., 1980) como un fragmento BamHI-EcoRI (nucleótidos 9062 a 12, 823, numeración como en Barker et al., 1983) y se combinan con el origen de replicación de pACYC184 (Chang y Cohen, 1978) como un fragmento EcoRI-HindII y un marcador de resistencia a gentamicina (del plásmido pLB41), [D. Figurski] como un fragmento BamHI-HindII para producir pCGN417.
El único sitio SmaI de pCGN417 (nucleótido 11.207 del fragmento Bam19) se cambia a un sitio SacI usando engarces y el fragmento BamHI-SacI se subclona en pCGN565 para dar pCGN971. El sitio BamHI de pCGN971 se cambia a un sitio EcoRI usando engarces para producir pCGN971E. El fragmento EcoRI-SacI resultante de pCGN971, que contiene las secuencias reguladoras tm-1 3', se une a pCGN206 por digestión con EcoRI y SacI para dar pCGN975. La parte pequeña del gen de resistencia a kanamicina Tn5 se deleciona del extremo 3' del promotor 35S de CaMV por digestión con salI y BglII, haciendo romos los extremos y por unión con engarces Sail. El cassette de expresión final pCGN986 contiene el promotor 35S de CaMV seguido de dos sitios Sail, un sitio XbaI, BamHI, SmaI KpnI y la región 3' de tm-1 (nucleótidos 11207-9023 del ADN-T).
B. Construcción de pCGN164. El fragmento AluI de CaMV (pb 7144-7735) (Gardner et al., 1981) se obtiene por digestión con AluI y se clona en el sitio HincII de M13mp7 (Vieira y Messing, 1982) para crear C614. Una digestión con EcoRI de C614 produce el fragmento EcoRI de C614 que contiene el promotor 35S, que se clona en el sitio EcoRI de pUC8 (Vieira y Messing, 1982) para producir pCGN146. Para recortar la región promotora, el sitio BglII (pb 7670) se trata con BglII y Bal31 y posteriormente se une un engarce BglII al ADN tratado con Bal31 para producir pCGN147. PCGN147 se digiere con EcoRI y HphI y el fragmento EcoRI-HphI resultante que contiene el promotor 35S se une a M13mp8 digerido con EcoRI-SmaII (Vieira y Messing, 1982) para crear pCGN164.
C. Construcción de pCGN638. La digestión de CaMV10 (Gardner et al. 1981) con BglII produce un fragmento BglII que contiene una región promotora 35S (pb 6493-7670) que se une al sitio BamHI de pUC19 (Norrander et al., 1983) para crear pCGN638.
D. Construcción de pCGN2113. pCGN164 se digiere con EcoRV y BamHI para liberar un fragmento EcoRV-BamHI que contiene una porción del promotor 35S (pb 7340-7433); pCGN638 se digiere con HindIII y EcoRV para liberar un fragmento HindIII-EcoRV que contiene una porción diferente del promotor 35S (pb 6493-7340). Estos dos fragmentos se unen en pCGN986 que se ha digerido con HindIII y BamHI para retirar el fragmento KindIII-BamHI que contiene el promotor 35S; esta unión produce pCGN639 que contiene el esqueleto y la región 3' de tm-l de pCGN986 y los dos fragmentos promotores 35S de pCGN164 y pCGN638. pCGN638 se digiere con EcoRV y DdeI para liberar un fragmento del promotor 35S (pb 7070-7340); el fragmento se trata con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I para crear extremos romos, y se une al sitio EcoRV de pCGN639 para producir pCGN2113, que tiene el fragmento en la orientación apropiada.
E. Construcción de pCGNT1761. El pCGN2113 se digiere con EcoRI y el plásmido se une en presencia de un adaptador de ADN sintético que contiene un sitio XbaI y un sitio BamHI (el adaptador contiene extremos adherentes EcoRI en cualquiera de los extremos, pero las bases adyacentes son tales que no se reconstruye un sitio EcoRI en esta localización) para producir pCGN2113M. pCGN2113M se digiere completamente con SacI y después se somete a digestión parcial con BamHI. Este ADN después se trata con la ADN polimerasa de T4 para crear extremos romos y un engarce EcoRI se une al plásmido de extremos romos. Después de la transformación, se selecciona un clon plasmídico que contiene un sitio EcoRI único entre el promotor y la región 3' tm-l intacta, y se denomina pCGN1761.
F. Construcción de pCGN1431. El fragmento SalI-EcoRI de pCGN2113, que contiene el cassette promotor-poliengarce-3' entero, se retira por digestión con SalI-EcoRI y se clona en pCGN565 digerido con salI-EcoRI para crear pCGN2120; pCGN565 es un vector de clonación basado en pUC8-Cm [K. Buckley, tesis doctoral, UC San Diego 1985] pero que contiene el poliengarce de pUC18 (Yanisch-Perron et al, 1985]. pCGN2120 se digiere completamente con PstI y después se vuelve a unir. Se selecciona un clon que tenga delecionado sólo el fragmento PstI-PstI de 858 pb (9207-10065, Barker et al., 1983) de la región 3' tm-l para crear pCGN1431.
Sección 4B
Genes Quiméricos Ejemplo 24 Construcción de pCGN1752A y pCGN1752B (cassette de expresión promotor SSU/PR-1A (orientación con sentido y anti-sentido))
El fragmento EcoRI de 807 pb de pBSPR1-207 se subclona en pCGN1509 digerido con EcoRI y se seleccionan los plásmidos que llevan el ADNc en cada una de las dos orientaciones posibles; el plásmido en el que sería de esperar que el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco generara un transcrito con la cadena con sentido de ARNm de PR1a se denomina pCGN1752A, y el plásmido en el que sería de esperar que el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco generara un transcrito con la cadena anti-sentido (es decir, la secuencia complementaria del ARNm) de PR1a se denomina pCGN1752B.
Ejemplo 25 Construcción de pCGN1753A y pCGN1753B (cassette de expresión promotor SSU/PR-1B (orientación con sentido y anti-sentido))
El fragmento EcoRI de 717 pb de pBSPR1-1023 se subclona en pCGN1509 digerido con EcoRI y se seleccionan los plásmidos que llevan el ADNc en cada una de las dos orientaciones posibles; el plásmido en el que sería de esperar que el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco generara un transcrito con la cadena con sentido de ARNm de PR-1b se denomina pCGN1753A, y el plásmido en el que sería de esperar que el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco generara un transcrito con la cadena anti-sentido (es decir, la secuencia complementaria del ARNm) de PR-1b se denomina pCGN1753B.
Ejemplo 26 Construcción de pCGN1762A y pCGN1762B (cassette de expresión promotor doble 35S de CaMV/PR-1A (orientación con sentido y anti-sentido))
Se libera un fragmento EcoRI de 807 pb que lleva un ADNc de PR1a de tabaco a partir de pBSPR1-207 por digestión con EcoRI y se subclona en pCGN565 digerido con EcoRI para producir pCGN1750. Se libera un fragmento EcoRI de 717 pb que lleva la región codificante entera de un ADNc de PR-1b de tabaco a partir de pBSPR1-1023 por digestión con EcoRI y se subclona en pCGN565 digerido con EcoRI para producir pCGN1751. Estos dos plásmidos se construyen para facilitar los experimentos de subclonación posteriores.
El fragmento EcoRI de 807 pb de pCGN1750 se subclona en pCGN1761 digerido con EcoRI y se seleccionan los plásmidos que llevan el ADNc en cada una de las dos orientaciones posibles; el plásmido en el que sería de esperar que el promotor doble 35S generara un transcrito con la cadena con sentido de ARNm de PR-1a se denomina pCGN1762A, y el plásmido en el que sería de esperar que el promotor doble 35S generara un transcrito con la cadena anti-sentido (es decir, la secuencia complementaria del ARNm) de PR-1a se denomina pCGN1762B.
Ejemplo 27 Construcción de pCGN1763A y pCGN1763B (cassette de expresión promotor doble 35S de CaMV/PR-1b (orientación con sentido y anti-sentido))
El fragmento EcoRI de 717 pb de pCGN1750 (véase anteriormente) se subclona en pCGN1751 digerido con EcoRI y se seleccionan los plásmidos que llevan el ADNc en cada una de las dos orientaciones posibles; el plásmido en el que sería de esperar que el promotor doble 35S generara un transcrito con la cadena con sentido de ARNm de PR-1b se denomina pCGN1763A, y el plásmido en el que sería de esperar que el promotor doble 35S generara un transcrito con la cadena anti-sentido (es decir, la secuencia complementaria del ARNm) de PR-1b se denomina pCGN1763B.
Ejemplo 28 Construcción de pCIB1002 y pCIB1003 (cassette de expresión promotor doble 35S de CaMV/PR-R mayoritaria (orientación con sentido y anti-sentido))
El plásmido pBSPRR-401 se digiere parcialmente con EcoRI y los fragmentos de ADN resultantes se separan en un gel de agarosa LTG al 1,0%. Se escinde una banda de aproximadamente 900 pb que contiene el inserto de ADNc de PR-R de longitud completa y se une a pCGN1761 que se ha dirigido completamente con EcoRI y se ha desfosforilado usando fosfatasa alcalina de intestino de ternero. El ADN se une y se utiliza para la transformación como se ha descrito anteriormente, se seleccionan colonias positivas y se analizan sus plásmidos. Se selecciona un plásmido que contiene el ADNc de PR-R en una orientación con sentido con respecto al promotor doble 35S de CAMV y se denomina pCIB1002. Se selecciona un segundo plásmido, en el que el ADNc de PR-R está en una orientación anti-sentido con respecto al promotor 35S de CaMV y se denomina pCIB1003.
Ejemplo 29 Construcción de pCIB1020 y pCIB1021 (cassette de expresión promotor doble 35S de CaMV/PR-P (orientación con sentido y anti-sentido))
El plásmido pBScht28 (véase anteriormente) se digiere con EcoRI y los fragmentos se separan en un gel de agarosa LGT al 0,5%. La banda que contiene el ADNc de PR-P se escinde y se mezcla con pCGN1761 (véase anteriormente) que se ha digerido con EcoRI, tratado con CIAP y purificado en un gel de agarosa LGT al 0,5%. La mezcla se une y se utiliza para la transformación como se ha descrito. Se seleccionan plásmidos para la inserción del ADNc de PR-P en cualquier orientación. El plásmido en el que el ADNc de PR-P se inserta en una orientación con sentido con respecto al promotor doble 35S de CaMV se denomina pCIB1020. El plásmido en el que el ADNc de PR-P se inserta en una orientación anti-sentido con respecto al promotor doble 35S de CaMV se denomina pCIB1021.
Ejemplo 30 Construcción de pCIB1022 y pCIB1023 (cassette de expresión promotor doble 35S de CaMV/PR-O (orientación con sentido y anti-sentido))
La secuencia de ADNc de longitud completa para PR-Q está contenida en dos plásmidos diferentes, pBScht15 contiene el extremo 3' del ADNc y pBScht5'-4 contiene el extremo 5' del ADNc. Debido a esta situación, los plásmidos pCIB1022 y pCIB1023 se construyen en una unión de tres vías y difieren en su orientación en el vector pCGN1761. pCGN1761 se digiere con EcoRI, se trata con CIAP y se purifica en un gel de agarosa LGT al 0,5%. pBScht15 (véase anteriormente) se digiere con NsiI y EcoRI y los fragmentos se separan en un gel de agarosa LGT al 0,5%. Se realiza una PCR usando pBScht5'- 4 (véase anteriormente) como plantilla y los oligonucleótidos
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como cebadores para amplificar el extremo 5' del ADNc de PR-Q. El producto de PCR se purifica y digiere con NsiI y EcoRI y el producto de 210 pb se purifica en un gel de agarosa LGP al 1,0%. El vector pCGN1761 purificado, el fragmento NsiI/EcoRI de 810 pb de pBScht15 y el fragmento de PCR digerido con NsiI/EcoRI se unen y se utilizan para la transformación como se ha descrito anteriormente. Se investigan y seleccionan los transformantes que incluyen el ADNc entero en cualquier orientación. El plásmido que tiene el ADNc de PR-Q de longitud completa en una orientación con sentido con respecto al promotor doble 35S de CaMV se denomina pCIB1022. El plásmido en el que el ADNc de PR-Q de longitud completa se inserta en la orientación anti-sentido con respecto al promotor se denomina pCIB1023.
Ejemplo 31 Construcción de pCIB1024 y pCIB1025 (cassette de expresión promotor doble 35S de CaMV/PR-O' (orientación con sentido y anti-sentido))
El ADNc de PR-O' clonado en pBSGL6e está truncado en el extremo 5' y carece de casi toda la secuencia señal completa. Esta secuencia es necesaria para el transporte extracelular de la proteína y debería reemplazarse para obtener por ingeniería genética plantas transgénicas que secreten la proteína. Este ejemplo describe la subclonación del ADNc de PR-O' en el cassette de expresión de promotor doble 35S de CaMV de tal forma que se añade un péptido señal de PR-1a a la proteína PR-O'.
Esta construcción se realiza como una unión complicada de tres vías. Primero se realiza una fusión del líder de PR-1a y el péptido señal y la secuencia codificante de la PR-O' madura se obtiene por un método de fusión génica por PCR. Después, esta pieza se une junto con el extremo 3' del ADNc de PR-O' en el vector pCGN1761 y se seleccionan los transformantes con el inserto en cualquier orientación con respecto al promotor.
Ho et al. (1989) ha creado una técnica de fusión génica basada en la amplificación por PCR. En esta técnica, se realiza una fusión génica creando dos fragmentos con extremos solapantes por PCR. En una reacción posterior, estos dos fragmentos después se fusionan también por PCR para generar una fusión perfecta entre las dos moléculas. Esta estrategia se usa para fusionar el péptido señal de PR-1a y el líder al ADNc de PR-O'. Se sintetizan 4 oligonucleótidos con las siguientes secuencias:
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Los oligonucleótidos GP50 y GP51 son complementarios entre sí y contienen la secuencia de ADN deseada para la fusión entre el líder de PR-1a y la señal y la secuencia codificante madura de PR-O'. Esto se esquematiza a continuación:
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El oligonucleótido GP52 tiene la misma secuencia que el extremo 5' del ADNc de PR-1a y contiene en el extremo 5' una secuencia que codifica un sitio EcoRI.
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El oligonucleótido GP53 sirve como cebador y es complementario a las posiciones 180 a 195 de la secuencia de PR-O', secuencia 7.
Para fusionar las dos piezas de ADN se preparan dos PCR. Una usa el plásmido pBSPR1-207 como plantilla y los dos cebadores GP52 y GP50; la otra usa pBSGL6e como plantilla y los cebadores GP51 y GP53. Los productos de PCR se analizan por electroforesis en gel. Los productos de PCR después se purifican y se usa una alícuota de cada uno en una PCR de segunda fase. En esta reacción, las plantillas son los dos productos de las dos primeras reacciones y los cebadores son GP52 y GP53. Se establece una PCR modificada de tal forma que en la primera vuelta de síntesis se añadan las plantillas de ADN sin los cebadores y las plantillas se calientan y se dejan enfriar y después se extienden a 65ºC. Después se añaden los dos cebadores y la PCR se realiza normalmente. Se analiza una alícuota de los productos de PCR por electroforesis en gel. El ADN restante después se purifica y se digiere con SacI y EcoRI y el producto de digestión se somete a electroforesis en un gel de agarosa LGT al 1,5%. La banda correspondiente al producto de PCR correcto se escinde y se usa para la unión.
El plásmido pBSGL6e se digiere tanto con SacI como con EcoRI y el producto de digestión se somete a electroforesis en un gel de agarosa LGT al 0,5%. La banda de 1,0 kb que contiene el fragmento PR-O' grande se escinde y se une con el producto de PCR SacI-EcoI anterior y el plásmido pCGN1761 que se ha digerido con EcoRI y CIAP y se purifica en un gel de agarosa LGT al 0,5%.Los fragmentos se unen y se utilizan para la transformación como se ha descrito anteriormente. Los transformantes se seleccionan con respecto a la construcción correcta. El plásmido en el que el líder y la señal de PR-1a se han fusionado a la secuencia codificante madura de PR-O' y está en la orientación con sentido con respecto al promotor se denomina pCIB1024; esta construcción se confirma por secuenciación del ADN. El plásmido con la fusión correcta pero en la orientación opuesta con respecto al promotor se denomina pCIB1025. Esta construcción también se verifica por secuenciación del ADN.
Ejemplo 31A Construcción de pCIB1024 y pCIB1025A (cassette de expresión promotor doble 35S de CaMV/PR-O' (orientación con sentido y anti-sentido))
El plásmido pBSGL5B-12, que contiene un ADNc de longitud completa que codifica la proteína PR-O', se digiere con EcoRI y los fragmentos se separan en un gel de agarosa LGT al 0,5%. La banda de 1,2 kb se escinde y se une con pCGN1761, que se digiere con EcoRI, se trata con CIAP y se purifica en un gel de agarosa LGT al 0,5% como se ha descrito anteriormente. La mezcla de unión se utiliza para la transformación como se ha descrito y los transformantes se seleccionan con respecto a un clon que contiene el ADNc de PR-O' en cualquier orientación. El plásmido en el que el ADNc se inserta en una orientación con sentido con respecto al promotor doble 35S de CaMV se denomina pCIB1024. El plásmido en el que el ADNc se inserta en una orientación anti-sentido con respecto al promotor se denomina pCIB1025A.
Ejemplo 31B Construcción de pCIB1032 y pCIB1033 (cassette de expresión promotor doble 35S de CaMV/PR-2 (orientación con sentido y anti-sentido))
El plásmido pBSGL117 contiene un ADNc de longitud completa que codifica la proteína PR-2. El ADNc de PR-2 de pCGN117 se subclona en el plásmido de expresión pCGN1761 en cualquier orientación para crear pCIB1032 y pCIB1033. Sin embargo, el ADNc contiene un sitio EcoRI interno y, de esta forma, el ADNc tiene que escindirse por digestión parcial con EcoRI.
El plásmido pBSGL117 se digiere con EcoRI en condiciones en las que se obtiene un producto de digestión parcial. Los productos de digestión se separan en un gel de agarosa LGT al 0,5% y la banda de 1,2 kb que contiene el ADNc de longitud completa para PR-2 se escinde y se une a pCGN1761, que se ha digerido con EcoRI, tratado con CIAP y purificado en un gel de agarosa LGT al 0,5%. La unión y la transformación se realizan como se ha descrito previamente. Se aíslan transformantes positivos y se seleccionan con respecto a la presencia del fragmento de ADNc de PR-2 grande insertado en cualquier orientación. El plásmido con el ADNc de PR-2 subclonado en una orientación con sentido con respecto al sitio de inicio de la transcripción se denomina pCIB1032 y el plásmido con el fragmento en una orientación anti-sentido se denomina pCIB1033. La estructura de estas construcciones puede verificarse por secuenciación del ADN.
Ejemplo 31C Construcción de pCIB1034 y pCIB1035 (cassette de expresión promotor doble 35S/PR-2(orientación con sentido y anti-sentido))
Un plásmido que contiene un ADNc de longitud completa que codifica la proteína PR-N se usa como fuente para subclonar el ADNc de PR-N en el plásmido de expresión pCGN1761 en cualquier orientación. Los plásmidos resultantes se denominan pCIB1034 y pCIB1035. Sin embargo, el ADNc contiene un sitio EcoRI interno y, de esta forma, el ADNc tiene que escindirse por digestión parcial.
El plásmido que contiene el ADNc de PR-N de longitud completa se digiere con EcoRI en condiciones en las que se obtiene un producto de digestión parcial. Los productos de digestión se separan en un gel de agarosa LGT al 0,5% y la banda de 1,2 kb que contiene el ADNc de longitud completa para PR-N se escinde y se une a pCGN1761, que se ha digerido con EcoRI, tratado con CIAP y purificado en un gel de agarosa LGT al 0,5%. La unión y la transformación se realizan como se ha descrito previamente.
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Se aíslan transformantes positivos y se seleccionan con respecto a la presencia del fragmento grande de ADNc de PR-N insertado en cualquier orientación. El plásmido con el ADNc de PR-N subclonado en una orientación con sentido con respecto al sitio de inicio de la transcripción se denomina pCIB1034 y el plásmido con el fragmento en una orientación anti-sentido se denomina pCIB1035. La estructura de estas construcciones se verifica por secuenciación del ADN.
Ejemplo 31D Construcción de pCIB1036 y pCIB1037 (cassette de expresión promotor doble 35S/PR-O (orientación con sentido y anti-sentido))
Un plásmido que contiene un ADNc de longitud completa que codifica la proteína PR-O se usa como fuente para subclonar el ADNc de PR-O en el plásmido de expresión pCGN1761, en cualquier orientación. Los plásmidos resultantes se denominan pCIB1036 y pCIB1037. Sin embargo, el ADNc contiene un sitio EcoRI interno y, de esta forma, el ADNc tiene que escindirse por digestión parcial con EcoRI.
El plásmido que contiene el ADNc de PR-O de longitud completa se digiere con EcoRI en condiciones en las que se obtiene un producto de digestión parcial. Los productos de digestión se separan en un gel de agarosa LGT al 0,5% y la banda de 1,2 kb que contiene el ADNc de longitud completa para PR-O se escinde y se une a pCGN1761 que se ha digerido con EcoRI, tratado con CIAP y purificado en un gel de agarosa LGT al 0,5%. La unión y la transformación se realizan como se ha descrito previamente. Se aíslan los transformantes positivos y se seleccionan con respecto a la presencia del fragmento grande de ADNc de PR-O insertado en cualquier orientación. El plásmido con el ADNc de PR-O subclonado en una orientación sen sentido con respecto al sitio de inicio de la transcripción se denomina pCIB1036 y el plásmido con el fragmento en una orientación anti-sentido se denomina pCIB1037. La estructura de estas construcciones se verifica por secuenciación del ADN.
Ejemplo 31E Construcción de pCIB1038 y pCIB1039 (cassette de expresión promotor doble 35S/PR-2' (orientación con sentido y anti-sentido))
Un plásmido (pBSGL135 del ejemplo 18B) que contiene un ADNc de longitud completa que codifica la proteína PR-2' se usa como fuente para subclonar el ADNc de PR-2' en el plásmido de expresión pCGN1761 en cualquier orientación. Los plásmidos resultantes se denominan pCIB1038 y pCIB1039. Sin embargo, el ADNc contiene un sitio EcoRI interno y, de esta forma, el ADNc tiene que escindirse por una digestión parcial con EcoRI.
El plásmido que contiene el ADNc de PR-2' de longitud completa se digiere con EcoRI en condiciones en las que se obtiene un producto de digestión parcial. Los productos de digestión se separan en un gel de agarosa LGT al 0,5% y la banda de 1,2 kb que contiene el ADNc de longitud completa para PR-2' se escinde y se une a pCGN1761 que se ha digerido con EcoRI, tratado con CIAP y purificado en un gel de agarosa LGT al 0,5%.
La unión y la transformación se realizan como se ha descrito previamente. Se aíslan los transformantes positivos y se seleccionan con respecto a la presencia del fragmento grande de ADNc de PR-2' insertado en cualquier orientación. El plásmido con el ADNc de PR-2' subclonado en una orientación con sentido con respecto al sitio de inicio de la transcripción se denomina pCIB1036 y el plásmido con el fragmento en una orientación anti-sentido se denomina pCIB1039. La estructura de estas construcciones se verifica por secuenciación del ADN.
Ejemplo 32 Construcción de pCIB1005B y pCIB1006B (cassette de expresión de promotor doble 35S de CaMV/glucanasa básica (orientación con sentido y anti-sentido))
El plásmido pGLN17 es un ADNc híbrido que codifica la \beta-1,3-glucanasa básica a partir de N. tabacum (Shinshi et al., 1988) construido por fusión del extremo 5' del clon pGL31 y el extremo 3' del clon pGL36. La secuencia codificada en este ADN híbrido es la siguiente:
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Secuencia 13
Secuencia de ADNc del híbrido de ADNc de la \beta-1,3-glucanasa básica clonado en el plásmido pGLN17
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55 
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Este ADNc está truncado en el extremo 5' y no codifica el péptido señal entero. Para obtener plantas transgénicas en las que esta proteína esté dirigida de manera apropiada (es decir, la vacuola central), es necesario añadir esta secuencia de nuevo al ADNc truncado. Por lo tanto, el cassette de expresión 35S doble de CaMV se construye en un proceso de dos etapas. En la primera etapa, el péptido señal del ADNc se reemplaza por un péptido señal codificado por el clon genómico. En la segunda etapa, este "ADNc reparado" se transfiere al vector de expresión.
El plásmido pSGL2 es un subclon del ADNc de pGLN17. Este plásmido se digiere con ClaI y EcoRI y el fragmento de 1 kb que contiene el ADNc de glucanasa se aísla a partir de un gel de agarosa LGT. El plásmido pBluescript se digiere con EcoRI, se trata con CIAP y se purifica en un gel de agarosa LGT.
El plásmido pBS-Gluc 39.1 contiene un inserto de 4,4 kb que incluye la secuencia codificante de glucanasa, aproximadamente 1,5 kb de la secuencia flanqueante 5', un intrón de 600 pb y aproximadamente 1 kb de la secuencia flanqueante 3'. Este plásmido se usa como plantilla en un experimento de PCR que contiene los dos siguientes cebadores:
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El resultado de esta amplificación es producir un fragmento para reemplazar el extremo 5' truncado del ADNc de la glucanasa. Se introduce una mutación de una sola base que crea un sitio EcoRI para facilitar los experimentos de clonación. El producto de PCR se digiere con EcoRI y ClaI y los fragmentos se separan en un gel de agarosa LGT al 2,0%. Se escinde una banda de 120 pb, se mezcla con el fragmento ClaI-EcoRI de 1 kb procedente de pSGL2 y el vector bluescript digerido con EcoRI, purificado, se une y se utiliza para la transformación como se ha descrito anteriormente. Los transformantes se seleccionan con respecto a la presencia del inserto y el plásmido con la estructura apropiada se denomina pCIB 1009.
El plásmido pCIB1009 se digiere con EcoRI y el fragmento de 1,2 kb se purifica en un gel de agarosa LGT. El plásmido pCGN1761 se digiere con EcoRI, se trata con CIAP, se purifica en un gel de agarosa LGT, se mezcla con el fragmento EcoRI de 1,2 kb y después se une y se utiliza para la transformación. Los transformantes se seleccionan con respecto a la presencia del inserto. El plásmido en el que el ADNc de la glucanasa está en una orientación con sentido con respecto al promotor de CaMV se denomina pCIB1005B. Otro plásmido, con el inserto de ADNc en una orientación anti-sentido se denomina pCIB1006B.
Ejemplo 33 Construcción de pCIB1007 y pCIB1008 (cassette de expresión promotor doble 35S de CaMV/quitinasa básica (orientación con sentido y anti-sentido))
El plásmido pSCH10 contiene un inserto de ADNc de la quitinasa básica de tabaco que es similar al inserto de pCHN50 (Shinshi, H. et al, 1987), pero con una extensión de 81 pb en el extremo 5'. Las 80 pb extra son:
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pSCH10 se digiere con BamHI y después se une con un adaptador molecular a la secuencia 5'GATCCGGAATTCCG3' como se describe en el ejemplo 5. El producto de unión después se purifica y se digiere con EcoRI y el fragmento de 1,2 kb que contiene el ADNc de la quitinasa adaptado se purifica a partir de un gel de agarosa LGT.
Este fragmento se mezcla con pCGN1761 tratado con CIAP y digerido con EcoRI que también se purifica a partir de un gel de agarosa LGT y la mezcla se utiliza para la unión y transformación.
Los transformantes se seleccionan con respecto al inserto de ADNc de quitinasa y el plásmido que contiene el ADNc de quitinasa en una orientación con sentido con respecto al promotor de CaMV se denomina pCIB1007.
El plásmido con el ADNc de quitinasa en una orientación anti-sentido con respecto al promotor se denomina pCIB1008.
Ejemplo 34 Construcción de pCGN1788A y pCGN1788B (cassette de expresión promotor doble 35S de CaMV/SAR8.2 (orientación con sentido y anti-sentido))
El ADNc de pSAR8.2 (véase anteriormente) se subclona en el cassette promotor doble 35S de CaMV/terminador 3'tm-l pCGN1431 (véase anteriormente) usando un método de amplificación por PCR. Se sintetizan cuatro oligonucleótidos, dos para cada una de las construcciones con sentido y anti-sentido, y cada uno de 33 nucleótidos de longitud, para uso como cebadores para generar la secuencia de ADNc de pSAR8.2a por PCR usando el plásmido pSAR8.2a como plantilla. Los cebadores contienen secuencias adicionales en sus extremos 5' que generan nuevos sitios de restricción tras completar la amplificación por PCR.
Para la construcción con sentido, la secuencia del oligonucleótido 1167 es
58
que genera un sitio SstI próximo al extremo 3' de la secuencia de ADNc. La secuencia del oligonucleótido 1168 es
59
y genera un sitio BamHI próximo al extremo 5' del ADNc. Para la construcción anti-sentido, la secuencia del oligonucleótido 1224 es
60
que genera un sitio BamHI próximo al extremo 3' del ADNc. La secuencia del oligonucleótido 1225 es
61
y genera un sitio SstI próximo al extremo 5' del ADNc.
Los oligonucleótidos 1167 y 1168 se usan en una PCR en la que el plásmido pSAR8.2 sirve como plantilla de ADN. El producto de PCR purificado generado en esta reacción se digiere con SstI y BamHI se clona en pCGN1431 que se digiere con SstI y BamHI. EL ADN se utiliza para la transformación y los plásmidos se seleccionan con respecto a la presencia del inserto de ADNc de pSAR8.2 en una orientación con sentido con respecto al promotor doble 35S de CaMV. Los supuestos plásmidos después se someten a secuenciación del ADN y el que tiene la orientación apropiada y no contiene mutaciones introducidas, se denomina pCGN1788A.
Para la construcción anti-sentido, se usan los oligonucleótidos 1224 y 1225 en una PCR como se ha descrito anteriormente. Después de la digestión con SstI y BamHI, el ADN se clona en pCGN1431 digerido con SstI y BamHI. Los supuestos plásmidos positivos se seleccionan con respecto a la inserción del ADNc en una orientación anti-sentido con respecto al promotor y las construcciones se verifican por secuenciación del ADNc entero. El plásmido en el que el ADNc se inserta en la orientación correcta y la secuencia de ADN es correcta, se denomina pCGN1788B.
Ejemplo 35 Construcción de pCIB1000 y pCGN1001 (cassette de expresión de promotor doble 35S de CaMV/quitinasa de pepino/lisozima (orientación con sentido y anti-sentido))
El plásmido, pBScuccht5 (también denominado pBScucchi/quitinasa) se digiere con EcoRI y los fragmentos se separan en una gel de agarosa LGT al 0,5%. La banda de 1,2 kb se escinde y se une con pCGN1761 que se ha digerido con EcoRI, tratado con CIAP y purificado en un gel de agarosa LGT al 0,5% como se ha descrito anteriormente. La mezcla de unión se utiliza para la transformación como se ha descrito y se seleccionan los transformantes que contienen el ADNc de quitinasa/lisozima en cualquier orientación. El plásmido en el que el ADNc se inserta en una orientación con sentido con respecto al promotor doble 35S de CaMV se denomina pCIB1000. El plásmido en el que el ADNc se inserta en una orientación anti-sentido con respecto al promotor doble de CaMV se denomina pCIB1001.
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Sección 5
Vectores
Esta sección detalla la construcción de vectores binarios que contienen todos los genes quiméricos. La primera sección explica el desarrollo de los vectores binarios a usar y la segunda sección detalla la subclonación del cassette de expresión en el vector binario.
Sección 5A
Construcción de vectores binarios Ejemplo 36 Construcción de pCGN783
pCGN783 es un plásmido binario que contiene los bordes de ADN-T izquierdo y derecho del plásmido Ti de la octopina de A. tumefaciens pTiA6 (Currier y Nester, 1976), el gen de resistencia a gentamicina de pPh1JI (Hirsch y Beringer, 1984), el promotor 35S de CaMV (Gardner et al., 1981), el gen de resistencia a kanamicina de Tn5 (Jorgensen et al., 1979), y la región 3' del transcrito 7 de pTiA6 (Currier y Nester, 1976). El vector se construye en un proceso de múltiples etapas detallado a continuación.
A. Construcción de pCGN739. Para obtener el marcador de resistencia a gentamicina, el gen de resistencia se aísla a partir de un fragmento EcoRI-PstI de 3,1 kb de pPhIJI (Hirsch y Beringer, 1984) y se clona en pUC9 (Vieira y Messing, 1982), produciendo pCGN549. El fragmento HindIII-BamHI de pCGN549 que contiene el gen de resistencia a gentamicina reemplaza al fragmento HindIII-BglII de pCGN587 (anterior) construyendo pCGN594. La región HindIII-BamHI de pCGN594 que contiene un fragmento ocs-kanamicina-ocs se reemplaza por la región de poliengarce HindIII-BamHI de pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985) para obtener pCGN739.
B. Construcción de pCGN726C. pCGN566 contiene el engarce EcoRI-HindIII de pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985), insertado en los sitios EcoRI-HindIII de pUC13-cm [K. Buckley, tesis doctoral, UC San Diego 1985]. El fragmento HindIII-BglII de pNW31c-8,29-1 (Thomashow et al., 1980) que contiene la ORF1 y 2 (Barker et al., 1983) se subclona en los sitios HindIII-BamHI de pCGN566 produciendo pCGN703. El fragmento Sau3A de pCGN703 que contiene la región 3' del transcrito 7 de pTiA6 (que corresponde a las bases 2396-2920 de pTi5955 (Barker et al., 1983) se subclona en el sitio BamHI de pUC18 (Yanisch-Perron al., 1985) produciendo pCGN709. La región de poliengarce EcoRI-SmaI de pCGN709 se reemplaza por el fragmento EcoRI-SmaI de pCGN587 (para la producción, véase más adelante) que contiene el gen de resistencia a kanamicina (APH3'II) produciendo pCGN726. El fragmento EcoRI-SalI de pCGN726 más el fragmento BglII-EcoRI de pCGN734 se insertan en los sitios BamHI-SalI de pUC8- pUC13-cm [resistente a cloranfenicol, K. Buckley, tesis doctoral, UC San Diego 1985] produciendo pCGN738. Para construir pCGN734, el fragmento HindIII-SphI de pTiA6 correspondiente a las bases 3390- 3241 (Barker et al., 1983) se clona en el sitio HindIII-SphI de M13mp19 (Yanisch-Perron et al., 1985: Norrander et al., 1983). Usando un oligonucleótido correspondiente a las bases 3287 a 3300, la síntesis de ADN se ceba a partir esta plantilla. Después de un tratamiento con la nucleasa S1 y digestión con HindIII, el fragmento resultante se clona en el sitio HindIII-SmaI de pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985). El fragmento EcoRI-HindIII resultante correspondiente a las bases 3287-3390 (Barker et al., 1983), se clona con el fragmento EcoRI-HindIII de pTiA6 (correspondiente a las bases 3390-4494) en el sitio EcoRI de pUC8 (Vieira y Messing, 1982), obteniéndose pCGN374. pCGN726c procede de pCGN738 por deleción del fragmento EcoRI-EcoRI de 900 pb.
C. Construcción de pCGN766C. EL fragmento HindIII-BamHI de pCGN167 (véase infra) que contiene el promotor 35S de CaMV, 1 ATG-gen de kanamicina y el fragmento 19 BamHI de pTiA6 se clona en los sitios BamHI-HindIII de pUC19 (Norrander et al., 1983; Yanisch-Perron et al., 1985) construyendo pCGN976. El promotor 35S y la región 3' del transcrito 7 se desarrollan insertando un fragmento HindIII-EcoRI de 0,7 kb de pCGN976 (promotor 35S) y el fragmento EcoRI-SalI de 0,5 kb de PCGN709 (transcrito 7:3') en los sitios HindIII-SalI de pCGN566 construyendo pCGN766c. Para construir pCGN167, se obtiene el fragmento AluI de CaMV (pb 7144-7735) (Gardner et al 1981) por digestión con AluI y se clona en el sitio HincII de M13mp7 (Vieira y Messing, 1982) para crear C614. Un producto de digestión EcoRI de C614 produce el fragmento EcoRI de C614 que contiene el promotor 35S que se clona en el sitio EcoRI de pIC8 (Vieira y Messing, 1982) para producir pCGN146. Para cortar la región promotora, el sitio BglII (pb 7670) se trata con BglII y Bal31 y posteriormente se une un engarce BglII al ADN tratado con Bal31 para producir pCGN147. Se prepara pCGN148a que contiene una región promotora, un marcador selectivo (KAN con 2 ATG) y la región 3' por digestión de pCGN528 (véase más adelante) con BglII y la inserción del fragmento promotor BamHI-BglII de pCGN147. Este fragmento se clona en el sitio BglII de pCGN528, de forma que el sitio BglII esté próximo al gen de kanamicina de pCGN528. El vector lanzadera usado para esta construcción, pCGN528, se obtiene como se indica a continuación. pCGN525 se obtiene por digestión de un plásmido que contiene Tn5 que lleva un gen de kanamicina (Jorgenson et al., 1979) con HindIII-BamHI e inserción del fragmento HindIII-BamHI que contiene el gen de kanamicina en los sitios HindIII-BamHI en el gen de tetraciclina de pACYC184 (Chang y Cohen, 1978). pCGN526 se obtiene por inserción del fragmento BamHI 19 de pTiA6 (Thomashow et al., 1980) en el sitio BamHI de pCGN525. pCGN528 se obtiene delecionando el fragmento XhoI pequeño de pCGN526 por digestión con XhoI y una segunda unión. pCGN149a se obtiene por clonación del fragmento BamHI del gen de kanamicina procedente de 9MB9KanXXI en el sitio BamHI de pCGN148a. pMB9KanXXI es una variante de pUC4k (Vieira y Messing, 1982) que carece del sitio XhoI pero contiene un gen de kanamicina funcional procedente de Tn903 para permitir la selección eficaz de Agrobacterium. pCGN149a se digiere con BglII y SphI. Este fragmento BglII-SphI pequeño de pCGN149A se reemplaza por el fragmento BamHI-SphI de MI (véase más adelante) aislado por digestión con BamHI y SphI. Esto produce pCGN167, una construcción que contiene un promotor de CaMV de longitud completa, 1 ATG-gen de kanamicina, un extremo 3' y el gen de kanamicina de tipo Tn903 bacteriano. MI es un fragmento EcoRI procedente de pCGN550 (véase la construcción de pCGN587) y se clona en el sitio de clonación EcoRI de M13mp9 de tal forma que el sitio PstI en el 1 ATG-gen de kanamicina esté cerca de la región de poliengarce de M13mp9.
D. Construcción de pCGN451. pCGN451 contiene el cassette ocs5'-ocs3' clonado en un derivado de pUC8 (Vieira y Messing, 1982). El vector modificado se obtiene por digestión de pUC8 con HincII y unión en presencia del ADN de engarce sintético, creando pCGN416, y después delecionando el sitio EcoRI de pCGN416 por digestión con EcoRI seguido de tratamiento con enzima de Klenow y autounión para crear pCGN426. El cassette ocs5'-ocs3' se construye por una serie de etapas a partir de ADN derivado del plásmido Ti de octopina pTiA6 (Currier y Nester, 1976). Un fragmento EcoRI de pTiA6 (pb 13362-16202; la numeración es la de Barker et al. (1983) para el plásmido Ti muy relacionado pTi 15955) se retira de pVK232 (Knauf y Nester, 1982) por digestión con EcoRI y se clona en pACYC184 digerido con EcoRI (Chang y Cohen, 1978) para generar pCGN15. El fragmento BamHI-EcoRI de 2,4 kb (pb 13774-16202) de pCGN15 se clona en pBR322 digerido con EcoRI-BamHI (Bolivar et al., 1977) para producir pCGN429. El fragmento EcoRI-BamHI de 412 pb (pb 13362-13774) de pCGN15 se clona en pBR3322 digerido con EcoRI-BamHI (Bolivar et al., 1977) para producir pCGN407. El fragmento promotor cortado se obtiene digiriendo pCGN407 con XmnI (pb 13512), seguido de resección con la exonucleasa Bal31, unión de los engarces EcoRI sintéticos y digestión con BamHI. Se purifican en gel los fragmentos resultantes de aproximadamente 130 pb y se clonan en M13mp9 (Vieira y Messing, 1982) y se secuencian. Se identifica un clon, I-4, en el que el engarce EcoRI se ha insertado en el pb 13642 entre el punto de inicio de la transcripción y el codón de inicio de la traducción, por comparación con la secuencia de Greve et al. (1982); el sitio de escisión EcoRI está en la posición 13639, cadena abajo del sitio de inicio del ARNm. El fragmento EcoRI-BamHI de 141 pb de I-4, que contiene el promotor cortado, se clona en pBR322 digerido con EcoRI-BamHI (Bolivar et al., 1977) para crear pCGN428. La pieza promotora de EcoRI-BamHI de 141 pb de pCGN428, y la pieza ocs 5', EcoRI-BamHI de 2,5 kb procedente de pCGN429 se clonan conjuntamente en pUC9 digerido con EcoRI (Vieira y Messing, 1982) para generar pCGN442, reconstruyendo la región cadena arriba de ocs con una sección de promotor cortado. El fragmento HindIII de pLB41 [D. Figurski] que contiene el gen de resistencia a gentamicina se clona en pACYC184 digerido con HindIII (Chang y Cohen, 1978) para crear pcDNA413b. El fragmento BamHI de 4,7 kb de pTiA6 (Currier y Nester, 1976), que contiene la región ocs 3', se clona en pBR325 digerido con BamHI (Bolivar, 1978) para crear 33c-19. El sitio SmaI en la posición 11207 de 33c-19 se convierte en un sitio XhoI usando el ADN de engarce sintético de XhoI, generando pCGN401.2. El fragmento BamHI-EcoRI de 3,8 kb de pCGN401.2 se clona en pCGN413b digerido con BamHI-EcoRI para crear pCGN419. El cassette ocs5'-ocs3' se genera por clonación del fragmento EcoRI de 2,64 kb de pCGN442, que contiene la región 5', en pCGN419 digerido con EcoRI para crear pCGN446. El fragmento XhoI de 3,1 kb de pCGN446, que tiene la región ocs 5' (pb 13639-15208) y la región ocs 3' (pb 11207-12823), se clona en el sitio XhoI de pCGN426 para crear pCGN451.
E. Construcción de pCGN587. El fragmento HindIII-SmaI de Tn5 que contiene el gen estructural entero para APH3'II (Jorgensen et al., 1979) se clona en pUC8 (Vieira y Messing, 1982), esto convierte el fragmento en un fragmento HindIII-EcoRI, ya que hay un sitio EcoRI inmediatamente adyacente al sitio SmaI. El fragmento PstI-EcoRI de pCGN300, que contiene la porción 3' de gen APH3'II, después se combina con un engarce EcoRI-BamHI-SalI-PstI en el sitio EcoRI de pUC7 para obtener pCGN546W. Un codón ATG está cadena arriba y fuera de la fase de lectura con el codón de iniciación ATG de APH3'II. El ATG indeseado se evita insertando un fragmento Sau3A-PstI del extremo 5' de APH3'II, careciendo dicho fragmento del ATG superfluo, en el sitio BamHI-PstI de pCGN546W, para proporcionar el plásmido pCGN550. El fragmento EcoRI de pCGN550 que contiene el gen APH3'II después se clona el sitio EcoRI de pUS8-pIC13-cm [K. Buckley (1985), supra] para dar pCGN551. El plásmido pCGN451 (descrito anteriormente) que tiene el ocs 5' y el ocs 3' en la orientación apropiada, se digiere con EcoRI y el fragmento EcoRI de pCGN551 que contiene el gen de resistencia a kanamicina intacto se inserta en el sitio EcoRI para proporcionar pCGN552 que tiene el gen de resistencia a kanamicina en la orientación apropiada. Este gel ocs/KAN se usa para proporcionar un marcador selectivo para el vector binario de tipo trans pCGN587. La porción 5' del cassette del promotor de octopina sintasa modificado por ingeniería genética consta de ADN de pTiA6 del XhoI en el pb 15208-13644 (Barker et al., 1983) que también contiene la secuencia del límite del ADN-T (borde) implicada en la transferencia del ADN-T. En el plásmido pCGN587, el gen ocs/KAN de pCGN552 proporciona un marcador selectivo así como el borde derecho. La región límite izquierda primero se clona en M13mp9 como una pieza HindIII-SmaI (pCGN502) (pb 602-2212) y se vuelve a clonar como un fragmento KpnI-EcoRI en pCGN565 para proporcionar pCGN580. pCGN565 es un vector de clonación basado en pUC-pUC13-Cm, [K. Buckley, tesis doctoral, UC San Diego 1985] pero que contiene engarces pUC18 (Yanisch-Perron et al., 1985). pCGN580 se linealiza con BamHI y se usa para reemplazar el fragmento BgII más pequeño de pVCK102 (Knauf y Nester, 1982) creando pCGN585. Al reemplazar el fragmento SalI más pequeño de pCGN585 por el fragmento XhoI de pCGN552 que contiene el gen ocs/KAN, se obtiene pCGN587.
Construcción final de pCGN783. El fragmento HindIII-EcoRI de 0,7 kb de pCGN766c (promotor 35S-CaMV) se une al fragmento EcoRI-SalI de 1,5 kb de pCGN726c (región 2 ATG- KAN-3') en los sitios HindIII-SalI de pUC119 [Sambrook J. et al., 1989) para producir pCGN778. La región de 2,2 kb de pCGN778, el fragmento HindIII-SalI que contiene el promotor 35S de CaMV (región 1-ATG-KAN-3') reemplaza a la región de poliengarce HindIII-SalI de pCGN739 para producir pCGN783.
Ejemplo 37 Construcción de pCGN1539 y pCGN1540
pCGN1539 y pCGN1540 son vectores de transformación de plantas binarios que contienen los bordes de ADN-T izquierdo y derecho del plásmido Ti de octopina de A. tumefaciens pTiA6 (Currier y Nester, 1976), el gen de resistencia a gentamicina de pPHiJI (Hirsch y Beringer, 1984), un origen de replicación del plásmido Ri de A. rhizogenes procedente de pLJB11 (Jouanin et al., 1985), la región promotora mas y la región mas 3' de pTiA6 con el gen de resistencia a kanamicina de Tn5 (Jorgensen et al., 1979), un origen de replicación CoIEI de pBR322 (Bolivar et al., 1977) y un gen marcador seleccionable lacZ' de pUC18 (Norander et al., 1983). El esqueleto de pCGN1539-1540, que contiene el gen de resistencia a gentamicina y los orígenes Ri y ColEI, procede de pCGN1532 (véase más adelante). Los bordes Ti y el gen marcador selectivo de plantas (mas 5'-kan-mas3'), proceden de pCGN1537; el cassette marcador selectivo de plantas a su vez procede de pCGN1536, mientras que el borde derecho y los fragmentos lacZ' proceden de pCGN565RBx2X, y el borde izquierdo procede de pCGN65.
A. Construcción de pCGN1532. El fragmento EcoRI-PstI de 3,5 kb que contiene el gen de resistencia a gentamicina se retira de pPhUI (Hirsch y Beringer, 1984) por digestión con EcoRI-PstI y se clona en pUC digerido con EcoRI-PstI (Vieira y Messing, 1982) para generar pCGN549. La digestión con HindIII-PstI de pCGN549 produce un fragmento de 3,1 kb que lleva el gen de resistencia a gentamicina, que se convierte en un fragmento de extremos romos por el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I y se clona en pBR322 digerido con PvuII (Bolivar et al., 1977) para crear pBR322Gm. pBR322Gm se digiere con DraI y SphI, se trata con enzima de Klenow para crear extremos romos, y el fragmento de 2,8 kb se clona en el origen Ri que contiene el plásmido pLJbB11 (Jouanin et al., 1985) que se ha digerido con ApaI y se ha hecho de extremos romos con la enzima de Klenow, creando pLHbB11Gm. El origen ColEI extra y el gen de resistencia a kanamicina se delecionan de pLHbB11GM por digestión con BamHI seguido de autocierre para crear pGMB11. El sitio HindII de pGmB11 se deleciona por digestión con HindII seguido de tratamiento con enzima de Klenow y autocierre, creando pGmB11-H. El sitio PstI de pGmB11-H se deleciona por digestión con PstI seguido de tratamiento con enzima de Klenow y autocierre, creando pCGN1532.
B. Construcción de pCGN1536. El fragmento EcoRI de 5,4 kb se retira de pVK232 (Knauf y Nester, 1982) por digestión con EcoRI y se clona en pACYC184 (Chang y Cohen, 1978) digerido con EcoRI para crear pCGN14. El fragmento ClaI-SphI de 1434 pb de pCGN14, que contiene la región mas 5' (pb 20128-21562 de acuerdo con la numeración de Barker et al., 1983) se clona en pUC19 digerido con AccI-SphI (Yanisch-Perron et al., 1985) para generar pCGN50. Un fragmento EcoRV-NaeI de 746 pb de la región mas 5' se reemplaza por un sitio XhoI por digestión de pCGN40 con EcoRV y NaeI seguido de unión en presencia de un ADN de engarce Xho I sintético para crear pCGN1036. El fragmento SstI-HindIII de 765 pb (pb 18474-19239) de pCGN14, que contiene la región mas 3', se clona en pUC18 digerido con SstI-HindIII (Norander et al., 1983) para producir pCGN43. El sitio HindIII de pCGN43 se reemplaza por un sitio EcoRI por digestión con HindIII, creación de extremos romos con la enzima de Klenow y unión del ADN de engarce EcoRI sintético para crear pCGN1034. El fragmento EcoRI de 767 pb de pCGN 1034 se clona en pCGN1036 digerido con EcoRI en la orientación que pone el pb 19239 de la región mas 3' próximo a la región mas 5' para crear pCGN1040. pCGN1040 se somete a digestión parcial con SstI, se trata con ADN polimerasa de T4 para crear extremos romos, y se une en presencia de ADN de engarce XhoI sintético; se selecciona un clon el que sólo se reemplaza el sitio SstI en la unión de pb 18474 y el ADN del vector (construido en pCGN43 y llevado a pCGN1040) por un sitio XhoI para generar pCGN1047. pCGN565 [véase anteriormente] se digiere con EcoRI y HindIII, se trata con enzima de Klenow para crear extremos romos, y se une en presencia de ADN de engarce XhoI sintético para crear pCGN1003; esto recrea el sitio EcoRI adyacente al engarce XhoI. pCGN1003 se digiere con EcoRI, se trata con enzima de Klenow para crear extremos romos y se une en presencia del ADN de engarce PstI sintético para crear pCGN1007. El fragmento XhoI de 1,5 kb de pCGN1047, que contiene la región mas 5' y la región mas 3' con un sitio de clonación múltiple entre ellos, se clona en pCGN1007 digerido con XhoI para construir pCGN1052.
Una porción del sitio de clonación múltiple de pCGN1052 se deleciona por digestión con XbaI y SstI, se trata con enzima de Klenow para obtener extremos romos, y se une para generar pCGN1052\deltaXS. El fragmento EcoRI-SmaI de 1 kb de pCGN550 [descripción de pCGN783], que contiene 1 ATG-gen de resistencia a kanamicina, se clona en Bluescript M13-KS (Stratagene, Inc.) digerido con EcoRI-SmaI para crear pBSKm; este plásmido contiene una región M13 que permite la generación de ADN monocatenario. El ADN monocatenario se genera de acuerdo con las recomendaciones del proveedor, y se realiza una mutagénesis in vitro (Adelman, et al., 1983) usando un oligonucléotido sintético con la secuencia
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para alterar un sitio PstI dentro del gel de resistencia a kanamicina y hacerlo indigerible, creando pCGN1534. pCGN15
34 se digiere con SmaI y se une en presencia de ADN de engarce EcoRI sintético para generar pCGN1535. El fragmento EcoRI de 1 kb de pCGN1536 se clona en pCGN1052\deltaXS digerido con EcoRI para crear el cassette marcador selectivo de plantas mas5'-kan mas 3' pCGN1536.
\newpage
C. Construcción de pCGN565RAx2X. pCGN451 [descripción de pCGN783] se digiere con HpaI y se une en presencia de ADN de engarce SphI sintético para generar pCGN55. El fragmento XhoI-SphI de pCGN55 (pb 13800-15208, incluyendo el borde derecho, del ADN-T de A. tumefaciens; Barker et al., 1977) se clona en pUC19 digerido con SalI-SphI (Yanisch-Perron et al., 1985) para crear pCGN60. El fragmento HindIII-BamHI de 1,4 kb de pCGN60 se clona en pSP64 (Promega, Inc.) digerido con HindIII-BamHI para generar pCGN1039. pCGN1039 se digiere con SmaI y NruI (deleción de pb 14237-15203; Barker et al., 1977) y se une en presencia del ADN de engarce BglII sintético creando pCGN1039\deltaNS. El fragmento EcoRI-HindIII de 0,47 kb de pCGN1039\deltaNS se clona en pCGN565 digerido con EcoRI-HindIII [descrito en la descripción de pCFN783] para crear pCGN565RB. El sitio HindIII de pCGN565RB se reemplaza por un sitio XhoI por digestión con HindIII, tratamiento con enzima de Klenow y unión en presencia de ADN de engarce XhoI sintético para crear pCGN565RB-H+X. pUC18 (Norrander et al., 1983) se digiere con HaelI para liberar el fragmento lacZ', se trata con enzima de Klenow para crear extremos romos, y el fragmento que contiene lacZ' se une a pCGN565RB-H+X, que se ha digerido con AccI y SphI y se ha tratado con enzima de Klenow, en tal orientación que el promotor lacZ' este próximo al fragmento de borde derecho; esta construcción, pCGN565RBx2x es positiva para la expresión de lacZ' cuando se cultiva en un hospedador apropiado y contiene los pb 13990-14273 de los fragmentos de borde derecho (Barker et al., 1983) que tienen delecionado el fragmento AccI-SphI (pb 13800-13990).
D. Construcción de pCGN65. pCGN501 se construye por clonación de un fragmento EcoRI-XhoI de 1,85 kb de pTiA6 (Currier y Nester, 1976) que contiene las bases 13362-15208 (Barker et al., 1983) del ADN-T (borde derecho), en M13mp9 digerido con EcoRI-SalI (Vieira y Messing, 1982). pCGN502 se construye por clonación de un fragmento HindIII-SmaI de 1,6 kb de pTiA6, que contiene las bases 602-2212 del ADN-T (borde izquierdo), en M13mp9 digerido con HindIII-SmaI. pCGN501 y pCGN502 se digieren con EcoRI y HindIII y los dos fragmentos que contienen el ADN-T se clonan juntos en pUC9 digerido con HindIII (Vieira y Messing, 1982) para producir pCGN503, que contiene los dos fragmentos de borde de ADN-T. pCGN503 se digiere con HindIII y EcoRI y los dos fragmentos HindIII-EcoRI resultantes (que contienen los bordes de ADN-T) se clonan en pHC79 digerido con EcoRI (Hohn y Collins, 1980) para generar pCGN518. El fragmento KpnI-EcoRI de pCGN518, que contiene el borde de ADN-T izquierdo, se clona en pCGN565 digerido con KpnI-EcoRI para generar pCGN580. El fragmento BamHI-BglII de pCGN580 se clona en el sitio BamHI de pACYC184 (Chang y Cohen, 1978) para crear pCGN51. El fragmento BamHI-SphI de 1,4 kb de pCGN60 (véase la sección anterior de pCGN65x2X) que contiene el fragmento del borde derecho de ADN-T, se clona en pCGN51 digerido con BamHI-SphI para crear pCGN65.
E. Construcción de pCGN1537. pCGN65 se digiere con KpnI y XbaI, se trata con enzima de Klenow para crear extremos romos y se une en presencia de ADN de engarce BglII sintético para crear pCGN65\deltaKX. pCGN65\deltaKX se digiere con SalI, se trata con enzima de Klenow para crear extremos romos, y se une en presencia de ADN de engarce XhoI sintético para crear pCGN65\deltaKX-S+K. El fragmento BglII-XhoI de 728 pb de pCGNRBx2X, que contiene la pieza de borde derecho del ADN-T y el gen lacZ', se clona en pCGN65\deltaKX-S+K digerido con BglII-XhoI, reemplazando a pCGN65x2X. El fragmento ClaI de pCGN65x2X se deleciona y se reemplaza con un engarce XhoI por digestión con ClaI, se trata con la enzima de Klenow para crear extremos romos y se une en presencia del ADN de engarce XhoI sintético para crear pCGN65\delta2XX. pCGN65\delta2XX se digiere con BglII y se fusiona con pCGN549 digerido con BglII (véase la sección de pCGN1532) para crear pCGN1530 que contiene los dos esqueletos plasmídicos. pCGN1530 se digiere con XhoI y se vuelve a unir, y después se elige un clon sensible a cloranfenicol y resistente a gentamicina que haya delecionado el esqueleto derivado de pACYC184, creando pCGN1530A. El fragmento XhoI de 2,43 kb de pCGN1536, que contiene el cassette mas5'-kan-mas3' se clona en pCGN1530A digerido con XhoI para crear pCGN1537.
F. Montaje final de pCGN1540. El fragmento BglII de pCGN1537, que contiene el gen marcador selectivo de plantas y el gen marcador seleccionable lacZ' (con múltiples sitios de clonación), entre los bordes de ADN-T, se clona en pCGN1532 digerido con BamHI. El clon de la orientación que lleva el borde derecho de ADN-T adyacente al origen de replicación de pBR322 se denomina pCGN1539, y la orientación que lleva el borde derecho de ADN-T adyacente al origen de replicación del plásmido Ri se denomina pCGN1540. Estos vectores binarios tienen varias características ventajosas, incluyendo una cantidad mínima de ADN entre los bordes de ADN-T, una alta estabilidad en hospedadores de Agrobacterium, un alto número de copias en hospedadores de E. coli, y una selección azul/blanco con múltiples sitios de restricción para facilitar la clonación del ADN diana.
Sección 5B
Construcción de vectores binarios que contienen genes quiméricos
En la sección previa, se detalla la construcción de pCGN783 y pCGN1540. Éstos son vectores binarios que pueden usarse en experimentos de transformación mediada por Agrobacterium para transformar plantas. Los vectores están diseñados para cotransformar un gen quimérico de interés en una planta, sin embargo, el gen quimérico primero debe subclonarse en el vector binario. La siguiente sección detalla la subclonación de los genes quiméricos construidos en la Sección 4 en los vectores binarios pCGN783 o pCGN1540. Los vectores resultantes son capaces de transformar plantas con el gen quimérico.
Ejemplo 38 Construcción de pCGN1754 y pCGN1760 (conteniendo pCGN783 el cassette promotor SSU vacío en cualquier orientación)
El sitio BamHI de pCGN783 está cerca del borde derecho del ADN-T, estando el gen marcador selectivo de plantas entre el borde izquierdo del ADN-T y el sitio BamHI. La clonación de una construcción génica quimérica en el sitio BamHI coloca el gen quimérico entre el gen marcador selectivo de plantas y el borde derecho del ADN-T. El único sitio BglII de pCGN1509 está en la porción no esencial de la región ocs3'.
pCGN1509 se digiere con BglII y el vector entero se clona en el sitio BamHI de pCGN783, y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO y las regiones ocs 3' están próximos al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se denomina pCGN1754, y el plásmido en el que el promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO y las regiones ocs 3' están próximos al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1760.
Ejemplo 39 Construcción de pCGN1755A, pCGN1755B, pCGN1755C y pCGN1755D (conteniendo pCGN783 el cassette de expresión SSU/PR-1a (con sentido y anti-sentido) en cualquier orientación)
pCGN1752A se digiere con BglII y el vector entero se clona en pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que las regiones promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs 3' están próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se denomina pCGN1755C, y el plásmido en el que las regiones promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs 3' están próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1755A.
pCGN1752B se digiere con BglII y el vector entero se clona en pCGN783 digerido con BamHI y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que las regiones promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs 3' están próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se denomina pCGN1755B, y el plásmido en el que las regiones promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs 3' están próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1755B.
Ejemplo 40 Construcción de pCGN1756A, pCGN1756B, pCGN1756C y pCGN1756D (conteniendo pCGN783 el cassette de expresión promotor de SSU/PR-1b (con sentido y anti-sentido) en cualquier orientación)
pCGN1753A se digiere con BglII y el vector entero se clona en pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que las regiones promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs 3' están próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se denomina pCGN1756C, y el plásmido en el que las regiones promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs 3' están próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1756A.
pCTN1753B se digiere con BglII y se clona en pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que las regiones promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs 3' están próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se denomina pCGN1756D, y el plásmido en el que las regiones promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO-PR1-ocs 3 están próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1756B.
Ejemplo 41 Construcción de pCGN1766 y pCGN1767 (conteniendo pCGN783 un cassette promotor doble 35S de CaMV vacío en cualquier orientación)
pCGN1761 se digiere con BamHI y el vector entero se clona en pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que el promotor doble 35S de CaMV y las regiones tm-I 3' están próximos al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1767 y el plásmido en el que el promotor doble 35S y las regiones tm-I 3' están próximos al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se denomina pCGN1766.
Ejemplo 42 Construcción de pCGN1764A, pCGN1764B, pCGN1764C y pCGN1764D (promotor doble 35S de CaMV/PR-1a (con sentido y anti-sentido) en pCGN783)
pCGN1762A se digiere con BamHI y se clona en pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que las regiones 35S doble-PR1-tm-I 3' están próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1764A, y el clon en el que las regiones 35S doble-PR1-tm-I 3' están próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se denomina pCGN1764C.
pCGN1762B se digiere con BamHI y se clona en pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que el promotor doble 35S está próximo al gen marcador selectivo de plantas se denomina pCGN1764B. El plásmido en la orientación opuesta se denomina pCGN1764D.
Ejemplo 43 Construcción de pCGN1765A, pCGN1765B, pCGN1765C y pCGN1765D (promotor doble 35S de CaMV/PR-1b (con sentido y anti-sentido) en pCGN783 en cualquier orientación)
pCGN1763A se digiere con BamHI y se clona en pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que las regiones 35S doble-PR1-tm-I 3' están próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1765A, y el plásmido en el que las regiones 35S doble-PR1-tm-I 3' están próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se denomina pCGN1765C.
pCGN1763B se digiere con BamHI y se clona en pCGN783 digerido con BamHI, y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que las regiones 35S doble-PR1-tm-I 3' están próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1765B y el plásmido en el que las regiones 35S doble-PR1-tm-I 3' están próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se denomina pCGN1765D.
Ejemplo 44 Construcción de pCGN1780A, pCGN1780B, pCGN1780C y pCGN1780D (promotor doble 35S de CaMV/quitinasa/ lisozima de pepino (con sentido y anti-sentido) en pCGN783 en cualquier orientación)
pCIB1000 se digiere con BamHI y se clona en el sitio BamHI en pCGN783, y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que las regiones 35S doble-quitinasa-tm-I 3' están próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1780A, y el plásmido en el que las regiones 35S doble-quitinasa-tm-I 3' están próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se denomina pCGN1780C.
pCIB1001 se digiere con BamHI y se clona en pCGN783 digerido con BamHI en cualquier orientación. El plásmido en el que las regiones 35S doble-quitinasa-tm-I 3' están próximas al gen marcador selectivo de plantas de pCGN783 se denomina pCGN1780B y el plásmido en el que las regiones 35S doble-quitinasa-tm-I 3' están próximas al borde derecho del ADN-T de pCGN783 se denomina pCGN1780D.
Ejemplo 45 Construcción de pCGN1789 (cassette vacío de promotor doble 35S de CaMV en pCGN1540 en cualquier orientación)
El fragmento XbaI-PstI de 2,36 kb de pCGN1431 se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI-PstI para crear el plásmido pCGN1789. Este plásmido tiene el inserto orientado en una dirección de forma que el promotor doble 35S de CaMV está próximo al marcador selectivo de plantas.
Ejemplo 46 Construcción de pCGN1774A, pCGN1774B, pCGN1774C y pCGN1774D (promotor doble 35S de CaMV/PR-1a (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540 en cualquier orientación)
El fragmento XbaI de 4,2 kb de pCGN1762A se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI, y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que el fragmento promotor doble 35S está próximo al borde derecho del ADN-T de pCGN1540 se denomina pCGN1774A, y el plásmido en el que el fragmento promotor doble 35S está próximo al gen marcador selectivo de plantas de pCGN1540 se denomina pCGN1774C.
El fragmento XbaI de 4,2 kb de pCGN1762B se clona en pCGN1540 digerido con XbaI y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que el fragmento promotor doble 35S está próximo al borde derecho del ADN-T de pCGN1540 se denomina pCGN1774B y el plásmido en el que el fragmento promotor doble 35S está próximo al gen marcador selectivo de plantas de pCGN1540 se denomina pCGN1774D.
Ejemplo 47 Construcción de pCGN1775A, pCGN1775B, pCGN1775C y pCGN1775D (promotor doble 35S de CaMV/PR-1b (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540 en cualquier orientación)
El fragmento XbaI de 4,1 kb de pCGN1763A se clona en pCGN1540 digerido con XbaI, y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que el fragmento promotor doble 35S está próximo al borde derecho del ADN-T de pCGN1540 se denomina pCGN1775A, y el plásmido en el que el fragmento promotor doble 35S está próximo al gen marcador selectivo de plantas de pCGN1540 se denomina pCGN1775C.
El fragmento XbaI de 4,1 kb de pCGN1763B se clona en pCGN1540 digerido con XbaI y se recuperan las dos orientaciones posibles. El plásmido en el que el fragmento promotor doble 35S está próximo al borde derecho del ADN-T de pCGN1540 se denomina pCGN1775B, y el clon en el que el fragmento promotor doble 35S está próximo al gen marcador selectivo de plantas de pCGN1540 se denomina pCGN1775D.
Ejemplo 48 Construcción de pCGN1783C y pCGN1784D (promotor doble 35S de CaMV/PR-R mayoritaria(con sentido y anti-sentido) en pCGN1540 en cualquier orientación)
El fragmento XbaI de 4,5 kb de pCIB1002 se subclona en pCBN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el promotor doble 35S esté próximo al gen marcador selectivo de plantas de 1540. Este plásmido se denomina pCGN1783C.
El fragmento XbaI de 4,5 kb de pCIB1003 se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor doble 35S esté próximo al gen marcador selectivo de plantas de pCGN1540 para crear pCGN1783D.
Ejemplo 49 Construcción de pCIB1026 y pCIB1027 (promotor doble 35S de CaMV/PR-P (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540 en cualquier orientación)
El fragmento XbaI de pCIB1020, que contiene el gen PR-P quimérico, se subclona en
pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor esté próximo al gen marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina pCIB1026.
El fragmento XbaI de pCIB1021, que contiene el gen anti-sentido PR-P quimérico, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor esté próximo al gen marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina pCIB1027.
Ejemplo 50 Construcción de pCIB1028 y pCIB1029 (promotor doble 35S de CaMV/PR-Q (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540 en cualquier orientación)
El fragmento XbaI de pCIB1022, que contiene el gen PR-Q quimérico, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor esté próximo al gen marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina pCIB1028.
El fragmento XbaI de pCIB1023, que contiene el gen PR-Q quimérico anti-sentido, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor esté próximo al marcador selectivo de plantas. El plásmido se denomina pCIB1029.
Ejemplo 51 Construcción de pCIB1030 y pCIB1031 (promotor doble 35S de CaMV/PR-O' (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540 en cualquier orientación)
El fragmento XbaI de pCIB1024, que contiene el gen PR-O' quimérico, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador selectivo de plantas. El plásmido se denomina pCIB1030.
El fragmento XbaI de pCIB1025, que contiene el gen PR-O' quimérico anti-sentido, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en una orientación similar a pCIB1030. El nuevo plásmido se denomina pCIB 1031.
Ejemplo 51A Construcción de pCIB1030 y pCIB1031 (promotor doble 35S de CaMV/PR-O' (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540)
El fragmento XbaI de pCIB1024A, que contiene el gen PR-O' quimérico, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina pCIB1030A.
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El fragmento XbaI de pCIB1025A, que contiene el gen PR-O' quimérico en una orientación anti-sentido, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador selectivo de plantas. Este plásmido resultante se denomina pCIB1031A.
Ejemplo 51B Construcción de pCIB1042 y pCIB1043 (promotor doble 35S de CaMV/PR-O' (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540)
El fragmento XbaI de pCIB1032, que contiene el gen PR-O' quimérico, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina pCIB1042.
El fragmento XbaI de pCIB1033, que contiene el gen PR-O' quimérico en una orientación anti-sentido, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador selectivo de plantas. El plásmido resultante se denomina pCIB1043.
Ejemplo 51C Construcción de pCIB1044 y pCIB1045 (promotor doble 35S de CaMV/PR-N (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540)
El fragmento XbaI de pCIB 1034, que contiene el gen PR-O' quimérico se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina pCIB1044.
El fragmento XbaI de pCIB1035A, que contiene el gen PR-O' quimérico en una orientación anti-sentido, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador selectivo de plantas. Este plásmido resultante se denomina pCIB1045.
Ejemplo 51D Construcción de pCIB1046 y pCIB1047 (promotor doble 35S de CaMV/PR-O (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540)
El fragmento XbaI de pCIB1036, que contiene el gen PR-O' quimérico, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina pCIB1046.
El fragmento XbaI de PCIB1037, que contiene el gen PR-O' quimérico en una orientación anti-sentido, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador selectivo de plantas. El plásmido resultante se denomina pCIB1047.
Ejemplo 51E Construcción de pCIB1048 y pCIB1049 (promotor doble 35S de CaMV/PR-2' (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540)
El fragmento XbaI de pCIB1038, que contiene el gen PR-O' quimérico, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador selectivo de plantas. Este plásmido se denomina pCIB1048.
El fragmento XbaI de PCIB1039, que contiene el gen PR-O' quimérico en una orientación anti-sentido, se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI de tal forma que el promotor 35S esté próximo al marcador selectivo de plantas. El plásmido resultante se denomina pCIB1049.
Ejemplo 52 Construcción de pCGN1781C y pCGN1781D (promotor doble 35S de CaMV/glucanasa básica (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540 en cualquier orientación)
El fragmento XbaI de 4,9 kb de pCIB1005B se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor doble 35S esté próximo al gen marcador selectivo de plantas de pCGN1540 para crear pCGN1787C.
El fragmento XbaI de 4,5 kb de pCIB1006B se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor doble 35S esté próximo al gen selectivo de plantas de pCGN1540 para crear pCGN1787D.
Ejemplo 53 Construcción de pCGN1782C y pCGN1782D (promotor doble 35S de CaMV/quitinasa básica (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540 en cualquier orientación)
El fragmento XbaI de 4,8 kb de pCGN1007 se clona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor doble 35S está próximo al gen marcador selectivo de plantas de pCGN1540 para crear pCGN1782C.
El fragmento de 4,8 kb de pCIB1008 se clona en pCGN1540 digerido con XbaI, de forma similar, para crear pCGN1782D.
Ejemplo 54 Construcción de pCGN1790C y pCGN1790D (promotor doble 35S de CaMV/SAR8.2 (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540 en cualquier orientación)
El fragmento XbaI-PstI de 2,89 kb de pCGN1788A se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI-PstI para crear pCGN1790C. La orientación del promotor doble 35S en esta construcción es la misma que en las otras construcciones de tipo C de los ejemplos anteriores.
El fragmento de 2,89 kb de pCGN1788B se subclona en pCGN1540 digerido con XbaI-PstI para crear pCGN1790
D. La orientación del promotor en la construcción es la misma que en pCGN1790C.
Ejemplo 55 Construcción de pCGN1779C y pCGN1779D (promotor doble 35S de CaMV/quitinasa/lisozima de pepino (con sentido y anti-sentido) en pCGN1540 en cualquier orientación)
El fragmento XbaI de 4,6 kb de pCIB 1000 se clona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor doble 35S esté próximo al gen marcador selectivo de plantas de pCGN1540 para crear pCGN1779C. El fragmento XbaI de 4,6 kb de pCIB1001 se clona en pCGN1540 digerido con XbaI en tal orientación que el fragmento promotor doble 35S esté próximo al gen marcador selectivo de plantas de pCGN1540 para crear pCGN1779D.
Ejemplo 56 Vectores que tienen resistencia a higromicina como gen marcador selectivo de plantas
Se han construido vectores de transformación de plantas que tienen el gen de resistencia a higromicina en lugar del gen de kanamicina como se ha usado anteriormente (Rothstein et al., 1987). El vector pCIB743 es uno de tales vectores. El gen quimérico para la expresión en la planta se corta de cualquiera de los vectores descritos anteriormente usando una enzima de restricción adecuada, por ejemplo XbaI, y se inserta en el poliengarce de pCIB743. De esta manera se construye un gen o genes quiméricos para la expresión en plantas en el vector de transformación de una amplia serie de hospedadores que confiere resistencia a higromicina al tejido vegetal transformado. Esto permite a un especialista en la técnica utilizar resistencia a higromicina, resistencia a kanamicina, o ambas, como selección del tejido vegetal transformado.
Sección 6
Transformación de A. tumefaciens Ejemplo 57 Transformación de A. tumefaciens con vectores binarios
Los vectores binarios descritos en la sección 5 se utilizan para transformar la cepa LB4404 de A. tumefaciens por el siguiente método. La cepa de Agrobacterium se cultiva a 30ºC durante una noche en 5 ml de medio LBMG (50% de caldo L, 50% de caldo de manitol-glutamato (Garfinkel y Nester, 1980). El cultivo de 5 ml se añade a 250 ml de LBMG y la mezcla se agita vigorosamente hasta que la densidad de cultivo alcanza una OD=0,6 a una longitud de onda de 600 nm. Las células después de recogen por centrifugación a 8000 X g y se resuspenden en 5 ml de LBMG. Se añaden 200 \mul de células a 0,2-1 \mug de ADN plasmídico binario en LBMG y la mezcla se congela inmediatamente en un baño de hielo seco/etanol. Después de 5 minutos, el tubo se pone en un baño de agua a 37ºC durante 5 minutos y después se añaden 2 ml de LBMG. La suspensión se mantiene en un baño de agua a 30ºC durante 2 a 3 horas y después las células se recogen por centrifugación. Las células se resuspenden en un volumen mínimo de LBMG y después se cultivan en medio selectivo (placas de LBMG con 100 \mug/ml de gentamicina). Las colonias aparecen después de 2 a 3 días a 30ºC.
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Sección 7
Transformación de plantas Ejemplo 58 Transformación de N. tabacum mediada por A. tumefaciens
Se cortan explantes de aproximadamente 5 a 10 mm a partir de hojas jóvenes de 3 a 5 cm de longitud y de la tercera a la sexta desde el ápice de N. tabacum cv "Xanthi nc" cultivado en condiciones axénicas (Facciotti y Pilet, 1979) en medio MS sólido (Murashige y Skoog, 1962), que contienen un 0,7% de fitagar (Gibco-BRL), 1 mg/l de IAA, y 0,15 mg/l de quinetina. Estos explantes se cultivan en medio MS sólido que contiene un 0,6% de fitagar, 40 mg/l de sulfato de adenina, 2 mg/l de IAA y 2 mg/l de quinetina, en cuya superficie se pone en un filtro Whatman Nº 1, y se incuban durante 24 horas en la oscuridad a 24ºC. Se cultivan cepas de Agrobacterium (que llevan las construcciones génicas quiméricas preparadas en la Sección 5) durante una noche en LBMG a 30ºC en un agitador a 180 rpm. Se sumergen explantes en una suspensión bacteriana de 3,3 x 108 células/ml durante aproximadamente 5 minutos, se secan en toallas de papel estériles y se vuelven a cultivar en las mismas placas. Después de 48 horas, los explantes se ponen en medio de selección que contiene el mismo medio de placa que se ha indicado anteriormente más 350 mg/l de cefotaxima y 100 mg/l de kanamicina. El tejido de control co-cultivado se pone en el mismo medio pero sin kanamicina. Los explantes se transfieren a medio nuevo cada dos semanas. Se recogen vástagos de 4 a 8 semanas después del co-cultivo, se ponen en tubos de cultivo de 50 ml con 25 ml de medio MS sólido que contiene un 0,6% de fitagar, 1 mg/l de IBA, 350 mg/l de cefotaxima y 100 mg/l de kanamicina. Todo el tejido se cultiva a una temperatura de 24º a 28ºC, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, con una intensidad de la luz de 6700 a 8400 1x. Los vástagos producen raíces en 1 a 2 semanas y después se trasplantan a una mezcla de plantación en tiestos de 4 pulgadas y se ponen en el "fitotrón de plantas transgénicas".
Ejemplo 59 Transformación de discos de hojas de tabaco
Se cultivan cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios descritos anteriormente durante 18 a 24 horas en medio de sales de glutamato ajustado a pH 5,6 y suplementado con un 0,15% de manitol, 50 \mug/ml de kanamicina, 50 \mug/ml de espectinomicina y 1 mg/ml de estreptomicina antes de diluirse a una OD_{600} de 0,2 en el mismo medio sin los antibióticos. Las bacterias después se cultivan durante 3 a 5 horas antes de la dilución a una OD_{600} de 0,2 a 0,4 para la inoculación de discos de 5 a 7 mm cortados a partir de hojas de N. tabacum cv. xanthi que se han cultivado asépticamente recipientes GA7, siguiendo una modificación del método de Horsch et al. (1985).
Los discos de hoja se mantienen en agar al 0,7% que contiene sales mayoritarias y minoritarias de Murashige y Skoogs (MS), 1 mg/l de benciladenina y 1 mg/ml de NAA durante 2 días antes de la transferencia al mismo medio que contiene 50 \mug/ml de kanamicina, 100 \mug/ml de carbenicilina y 100 \mug/ml de mefoxin. Se escinden los vástagos que se forman en los discos y se propagan hasta que se obtienen seis plántulas por subcultivo de las puntas de los vástagos en medio MS que contiene 50 \mug/ml de kanamicina en recipientes GA7.
Las plántulas forman raíces en medio que no contiene hormonas y 50 \mug/ml de kanamicina, se transfieren al substrato y se robustecen en un fitotrón antes de transferirse al invernadero para inducir el tratamiento con reguladores químicos. En el momento de la floración, se induce la autopolinización de las flores. Las semillas se recogen después de la maduración.
Ejemplo 60 Producción de callos y plantas de tabaco transgénicas
Se usan cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios para transformar callos que se forman a partir de los discos de hoja (ejemplo 34). Los callos que se forman en medio de selección MSBN que contiene kanamicina se mantienen en un medio de crecimiento de callos compuesto por MS mayoritario, sales minoritarias y Fe-EDTA (Gibco Nº 500-1117; 4:3 g/l); vitaminas MS, 100 mg/l de mioinositol, 20 g/l de sacarosa, 2 mg/l de NAA y 0,3 mg/l de quinetina.
Los callos pueden usarse para regenerar plantas transgénicas transfiriendo piezas de callos a medio MSBN y siguiendo los métodos descritos.
Ejemplo 61 Transformación de zanahoria
Se cultivan cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios como se ha descrito en el ejemplo 59. Las bacterias, diluidas a una OD_{600} de 0,2 a 0,4, después se usan para la inoculación de discos cortados de zanahorias esterilizadas superficialmente.
Para esterilizar superficialmente las zanahorias, se pelan y después se sumergen 20 minutos en una solución al 10% de clorox. Las zanahorias se aclaran con agua estéril, se cortan en piezas de 5 mm y se ponen con el lado basal hacia arriba sobre agar con agua. Después se aplican de 20 a 50 \mul de bacterias a la superficie superior de los discos. Después de 7 días, los discos se transfieren a agar al 0,7% que contiene sales MS, sacarosa al 3%, 0,1 mg/l de 2,4-D, 50 \mug/ml de kanamicina, 100 \mug/ml de carbenicilina y 100 \mug/ml de mefoxin. Se escinde el callo que se forma alrededor del anillo del cambium y se pone en agar MS al 0,7% suplementado con sacarosa al 3%, 0,1 mg/l de 2,4-D, 50 \mug/ml de kanamicina, 100 \mug/ml de carbenicilina y 100 \mug/ml de mefoxin. Después de haberse cultivado el callo, se corta en piezas pequeñas y se distribuyen aleatoriamente en cuatro placas del mismo medio.
Ejemplo 62 Transformación de girasol
Se cultivan cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios, como se ha descrito. Las bacterias, diluidas a una OD_{600} de 0,2 a 0,4, después se usan para la inoculación de tallos de plantas de girasol preparados como se indica a continuación:
se sumergen semillas de girasol durante 10 minutos en captano al 10% seguido de 10 minutos en clorox al 10% y se aclaran con agua estéril. Las cubiertas de las semillas se retiran y las semillas se germinan en agar con agua al 0,7% en la oscuridad durante 3 días, después de lo cual se ponen en un incubador Labline a 23ºC con 12 horas de luz y de oscuridad. Las plántulas se cultivan durante una semana antes de la decapitación y la inoculación de las bacterias en la superficie de corte del tallo. Después de una semana, los tallos inoculados se cortan y se ponen en agar al 0,7% que contiene sales MS, sacarosa al 3%, 2 mg/ml de NAA, 1 mg/ml de BAP, 100 \mug/ml de carbenicilina, 100 \mug/m de mefoxin y 50 \mug/ml de kanamicina. El callo se transfiere a medio nuevo cada dos semanas hasta que se obtiene una cantidad suficiente para cuatro placas. La mitad de los callos que crecen a partir de las cepas de Agrobacterium virulentas se transfieren a medio sin hormonas que contiene 50 \mug/ml de kanamicina.
Ejemplo 63 Transformación de tomate
Se cultivan cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios como se ha descrito en el ejemplo 59. Las bacterias, diluidas a una OD_{600} de 0,2 a 0,4, después se usan para la inoculación de tallos de plántulas de tomates preparadas como se indica a continuación:
se sumergen semillas de tomate durante 20 minutos en clorox al 10% y se aclaran con agua estéril. Las semillas se germinan en agar con agua al 0,7% en la oscuridad durante 3 días, después de lo cual se ponen en un incubador Labline a 23ºC con 12 horas de luz y de oscuridad. Las plántulas se cultivan durante una semana antes de la decapitación y la inoculación de las bacterias en la superficie de corte del tallo.
Después de una semana, los tallos inoculados se cortan y se ponen en agar al 0,7% que contiene sales MS, sacarosa al 3%, 2 mg/ml de NAA, 1 mg/ml de BAP, 100 \mug/ml de carbenicilina, 100 \mug/ml de mefoxin y 50 \mug/ml de kanamicina. El callo se transfiere a medio nuevo cada dos semanas hasta que se obtiene una cantidad suficiente para 4 placas.
Ejemplo 64 Transformación de algodón
Se cultivan cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios como se ha descrito. Las bacterias, diluidas a una OD_{600} de 0,2 a 0,4 después se usan para la inoculación de cotiledones de algodón preparados como se indica a continuación:
las semillas de algodón se sumergen durante 20 minutos en clorox al 10% y se aclaran con agua estéril. Las semillas se germinan en agar con agua al 0,7% en la oscuridad. Las plántulas se cultivan durante una semana antes de la inoculación de las bacterias en la superficie de los cotiledones.
Se deja que los cotiledones inoculados formen callos antes de cortase y se ponen en agar al 0,7% que contiene sales MS, sacarosa al 3%, 100 \mug/ml de carbenicilina y 100 \mug/ml de mefoxin. Los callos se transfieren a medio nuevo cada tres semanas hasta que se obtiene una cantidad suficiente para 4 placas. La mitad de los callos que crecen a partir de las cepas de Agrobacterium virulentas se transfieren a medio sin hormonas que contiene 50 \mug /ml de kanamicina.
Ejemplo 65 Preparación de un tipo especial de callo de Zea mays, línea endogámica Elite Funk 2717
Se cultivan plantas de Zea mays de la línea endogámica Funk 2717 hasta la floración en el invernadero, y se autopolinizan. Se retiran espigas inmaduras que contienen embriones de aproximadamente 2 a 2,5 mm de longitud de las plantas y se esterilizan en solución de clorox al 10% durante 20 minutos. Se retiran asépticamente los embriones de las semillas y se cultivan con el eje del embrión hacia abajo en medio OMS que contiene 0,1 mg/l de 2,4-D, un 6% de sacarosa y L-prolina 25 mM solidificada con Gelrite® al 0,24% (medio de iniciación). Después de dos semanas de cultivo en la oscuridad a 27ºC, el callo que se desarrolla en el escutelo se retira del embrión y se cultiva en medio B5 (Gamborg et al., 1968) que contiene 0,5 mg/l de 2,4-D y solidificado con Gelrite® al 0,24%. El callo se subcultiva cada dos semanas en medio nuevo. Después de un total de ocho semanas desde la colocación de los embriones en el medio de iniciación, se identifica el tipo especial de callo por su morfología característica. Este callo se subcultiva adicionalmente en el mismo medio. Después de un período adicional de dos meses, el callo se transfiere y se subcultiva en serie en medio N6 que contiene 2 mg/l de 2,4-D y se solidifica con Gelrite®.
Ejemplo 66 Preparación de un cultivo en suspensión de Zea mays, línea endogámica Elite Funk 2717
El callo descrito anteriormente se subcultiva durante un total de al menos seis meses. El tipo de callo elegido para el subcultivo es relativamente no mucilaginoso, granular y muy friable, de tal forma que se separa en pequeños agregados celulares individuales cuando se pone en medio líquido. No se retienen cultivos que contienen agregados con células expandidas grandes. Se ponen alícuotas de aproximadamente 500 mg del callo especial de la línea endogámica Elite de Zea mays Funk 2717 en 30 ml de medio N6 que contiene 2 mg/l de 2,4-D en matraces Delong de 125 ml. Después de una semana de cultivo a 26ºC en la oscuridad en un agitador giratorio (130 rpm, desplazamiento vertical de 2,5 cm), el medio se reemplaza por medio nuevo. Las suspensiones se subcultivan de nuevo de esta manera después de otra semana. En este momento, los cultivos se inspeccionan, y se retienen los que no muestran grandes números de células expandidas. Se desechan los cultivos en suspensión que contienen agregados con células expandidas grandes. El tejido preferido consta de agregados celulares de división citoplásmica densa que tienen una superficie característicamente más lisa que el tipo habitual de agregados celulares. Los cultivos retenidos tienen al menos un 50% de las células representadas en estos agregados pequeños. Ésta es la morfología deseada. Estas suspensiones también tienen una velocidad de crecimiento rápida, con un tiempo de duplicación menor de una semana. Los cultivos de suspensión se subcultivan semanalmente transfiriendo 0,5 ml de PCV en 25 ml de medio nuevo. Después de 4 a 6 semanas de subcultivo de esta manera, los cultivos aumentan de dos a tres veces por subcultivo semanal. Los cultivos en los que más de un 75% de las células tienen la morfología deseada se retienen para un subcultivo adicional. Las líneas se mantienen eligiendo siempre para el subcultivo el matraz cuyo contenido presenta la mejor morfología. En algunos casos se usa una filtración periódica a través de tamices de acero inoxidable con un tamaño de poro de 630 \mum cada dos semanas para aumentar la dispersión de los cultivos, pero no es necesario.
Ejemplo 67 Preparación de protoplastos a partir de cultivos en suspensión de Zea mays
Se incuban de 1 a 1,5 ml de PCV de las células de cultivo en suspensión anterior en 10 a 15 ml de una mezcla esterilizada en filtro que consta de un 4% de celulasa RS con un 1% de Rhozyme en solución salina KMC (8,65 g/l de KCl, 16,47 g/l de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O y 12,5 g/l de CaCl_{2}\cdot2 H_{2}O, 5 g/l de MES, pH 5,6). La digestión se realiza a 30ºC en una mesa de agitación lenta durante un período de 3 a 4 horas. Con un microscopio invertido, se controla la liberación de protoplastos en la preparación. Los protoplastos que se liberan se recogen como se indica a continuación: La preparación se filtra a través de un tamiz de malla de 100 \mum, seguido de un tamiz de malla de 50 \mum. Los protoplastos se lavan a través de los tamices con un volumen de solución salina KMC igual al volumen original de solución enzimática. Se ponen 10 ml de la preparación de protoplastos en cada uno de varios tubos de centrífuga de plástico desechables, con 1,5 a 2 ml de solución de sacarosa 0,6 M (tamponada a pH 5,6 con MES al 0,1% y KOH) depositados por debajo. El tubo se centrifuga a 60-100 x g durante 10 minutos, y los protoplastos que forman bandas en la interfase se recogen usando una pipeta y se ponen en un tubo limpio. La preparación de protoplastos se resuspende en 10 ml de solución salina KMC nueva, y se centrifuga durante 5 minutos a 60-100 x g. El sobrenadante se retira y se desecha y los protoplastos se resuspenden suavemente en el residuo que queda, y después se añaden gradualmente 10 ml de una solución KMC de concentración 13/14. Después de centrifugar de nuevo durante 5 minutos, el sobrenadante se retira de nuevo y los protoplastos se resuspenden en una solución KMC de concentración 6/7. Se toma una alícuota para el recuento y los protoplastos se sedimentan de nuevo por centrifugación. Los protoplastos se resuspenden a 10^{7} por ml en medio KM-8p o en manitol 0,5 M que contiene MgCl_{2} 6 mM u otro medio adecuado para uso en la transformación como se describe en los siguientes ejemplos. Esta suspensión de protoplastos se usa para la transformación y se cultiva como se describe más adelante.
Ejemplo 68 Transformación de protoplastos de Zea mays por electroporación
A. Todas las etapas excepto el choque térmico se realizan a temperatura ambiente (de 22 a 28ºC). Los protoplastos se resuspenden en la última etapa del procedimiento anterior en manitol 0,5 M que contiene un 0,1% de MES y MgCl_{2} 6 mM. La resistencia de esta suspensión se mide en la cámara de un Electroporador Dialog y se ajusta a 1-1,2 k\Omega usando una solución de MgCl_{2} 300mM. Los protoplastos se someten a un choque térmico por inmersión del tubo que contiene la muestra en un baño de agua a 45ºC durante 5 minutos, seguido de refrigeración a temperatura ambiente en hielo. Se añaden 4 \mul del plásmido linealizado que contiene un gel de resistencia a higromicina selectivo en plantas tal como el descrito por Rothstein et al. (1987) o construcciones de genes quiméricos como se han descrito y se añaden 20 \mug de ADN de soporte de timo de ternero a alícuotas de 0,25 ml de esta suspensión. A los protoplastos se les añaden 0,125 ml de solución de PEG al 24% (MW 8000) en manitol 0,5 M que contiene MgCl_{2} 30 mM. La mezcla se mezcla bien pero suavemente y se incuba durante 10 minutos. La muestra se transfiere a la cámara del electroporador y las muestras se someten a pulsos tres veces a intervalos de 10 segundos, con voltajes iniciales de 1500, 1800, 2300 o 2800 Vcm^{-1} y un tiempo de desintegración exponencial de 10 mseg.
Los protoplastos se cultivan como se indica a continuación. Las muestras se cultivan en placas petri de 6 cm a temperatura ambiente. Después de un período adicional de 5 a 15 minutos, se añaden 3 ml de medio KM-8p que contiene un 1,2% de agarosa SeaPlaque y 1 mg/l de 2,4-D. La agarosa y los protoplastos se mezclan bien y el medio se deja gelificar.
B. Esto se repite con una o más de las siguientes modificaciones:
(1)
La resistencia de la preparación de protoplastos se ajusta a 0,5-0,7 k\Omega.
(2)
El PEG usado es PEG con una MW de 4000.
(3)
No se añade PEG, o se añade la mitad del volumen de PEG al 12%.
(4)
Los pulsos se aplican a intervalos de tres segundos.
(5)
Los protoplastos se cultivan después de la electroporación en placas puestas en una placa enfriada a una temperatura de 16ºC.
(6)
Los protoplastos se ponen en tubos después de la etapa de electroporación, se lavan con 10 ml de solución KMC con una concentración de 6/7 o con solución W5 (que comprende 380 mg/l de KCl, 18,375 g/l de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 9 g/l de NaCl; 9 g/l de glucosa, pH 6,0) y después se recogen por centrifugación a 60 x g durante 10 minutos, se resuspenden en 0,3 ml de medio KM y se cultivan como en A.
(7)
No se añade al ADN de soporte de timo de ternero.
Ejemplo 69 Transformación de protoplastos de Zea mays por tratamiento con PEG
A. Los protoplastos se resuspenden en la última etapa del procedimiento anterior en solución de manitol 0,5 M que contiene MgCl_{2} de 12 a 30 mM. Se aplica un choque térmico de 45ºC durante 5 minutos como se ha descrito. Los protoplastos se distribuyen en alícuotas para la transformación en tubos de centrífuga, suspendiéndose 0,3 ml de protoplastos por tubo. Durante los siguientes 10 minutos, se añade lo siguiente: ADN y solución de PEG (MW 6000, 40% que contiene Ca(NO_{3})_{2} 0,1 M y manitol 0,4 M; pH 8 a 9 con KOH) para proporcionar una concentración final de PEG al 20%. Las alícuotas se incuban durante 30 minutos con agitación suave ocasional y después los protoplastos se ponen en placas petri (0,3 ml de suspensión de protoplastos original por placa de 6 cm de diámetro) y se cultivan como se ha descrito.
B. Esto se repite y los protoplastos se lavan después de 30 minutos de incubación en la solución de PEG anterior, añadiendo 0,3 ml de solución W5 cinco veces a intervalos de 2 a 3 minutos. La suspensión de protoplastos se centrifuga, el sobrenadante se retira y los protoplastos se cultivan como se ha descrito.
C. Se repite lo anterior con la modificación de que la concentración final de PEG está comprendida entre el 13 y 25%.
Ejemplo 70 Regeneración de callos de protoplastos
Las placas que contienen los protoplastos en agarosa se ponen en la oscuridad a 26ºC. Después de 14 días, se producen colonias a partir de los protoplastos. La agarosa que contiene las colonias se transfiere a la superficie de una placa petri de 9 cm de diámetro que contiene 30 ml de medio N6 que contiene 2 mg/l de 2,4-D, solidificado con Gelrite® al 0,24%. Este medio se denomina 2N6. El callo se cultiva adicionalmente en la oscuridad a 26ºC y se subcultivan piezas de callo cada dos semanas en medio 2N6 sólido reciente.
Ejemplo 71 Selección de callos transformados de Zea mays
El ejemplo anterior se repite con la modificación de que se añaden 100 mg/l o 200 mg/l de higromicina B al medio 2N6 para seleccionar las células transformadas.
Ejemplo 72 Regeneración de plantas de maíz
A. Se pone un callo en medio 2N6 para mantenimiento y en medio ON6 (que comprende medio N6 que carece de 2,4-D) y M61 (que comprende medio N6 que contiene 0,25 mg/l de 2,4-D y10 mg/l de quinetina) para iniciar la regeneración. El callo que crece en medios ON6 y N61 se cultiva en condiciones de luz (16 horas/día de luz de 840 a 8400 1x a partir de lámparas fluorescentes blancas). El callo que crece en medio N61 se transfiere a medio ON6 después de dos semanas, ya que un tiempo prolongado en medio N61 es perjudicial. El callo se subcultiva cada dos semanas aunque el callo se vaya a transferir de nuevo a la misma formulación de medio. Aparecen plántulas en aproximadamente cuatro a ocho semanas. Una vez que las plántulas tienen una altura de al menos 2 cm, se transfieren a medio ON6 en recipientes GA7. Se forman raíces en un período de dos a cuatro semanas, y cuando las raíces parecen suficientemente bien formadas como para soportar el crecimiento, las plántulas se transfieren al substrato en tiestos con turba, bajo un sombreado durante los primeros cuatro a siete días. A menudo es útil poner un recipiente de plástico transparente invertido sobre los transplantes durante dos a tres días para ayudar al robustecimiento. Una vez establecidas las plantas, se tratan como plantas de maíz normales y se cultivan hasta la madurez en el invernadero. Para obtener plantas descendientes, se autopolinizan o se cruzan con un tipo silvestre.
B. El ejemplo anterior se repite con la modificación de que se añaden 100 mg/l o 200 mg/l de higromicina B al medio usado para mantener los callos.
Ejemplo 73 Preparación de suspensiones embriogénicas a partir de tejido de Dactylis glomerata L. (dáctilo aglomerado)
A. Se inicia un callo embriogénico a partir de secciones basales de las hojas más jóvenes de plantas de dáctilo aglomerado cultivadas en invernadero (Dactylis glomerata L.) como se describe por Hanning y Conger (1982). Las hojas se esterilizan superficialmente por inmersión en una dilución 1:10 de solución de Clorox (hipoclorito sódico al 5,25%; The Clorox Company, Oakland, Ca.) durante aproximadamente 10 minutos y después se cortan asépticamente en pequeños segmentos de 1 a 5 mm de longitud o de diámetro. Estos segmentos se cultivan en medio SH-30 estéril que contiene agarosa al 0,8% como agente de gelificación. Aparecen estructuras de callo y/o embriogénicas en un período de 2 a 6 semanas después de cultivo en placas, tras el cultivo a aproximadamente 25ºC. El callo embriogénico se mantiene por subcultivo en medio SH-30 nuevo cada 2 a 4 semanas y por cultivo en la oscuridad a 25ºC.
B. Se inician cultivos de suspensión embriogénicos poniendo aproximadamente 0,5 g de peso fresco de callo embriogénico en 50 ml de medio líquido descrito por Gray y Conger (1985) que contiene dicamba 45 \muM y 4 g/litro de hidrolizado de caseína. Los cultivos en suspensión se cultivan a 27ºC bajo un fotoperíodo de 16 horas de luz (3300 1x) y 8 horas de oscuridad en un agitador giratorio a aproximadamente 130 rpm en matraces Delong de 125 ml sellados con una tapa metálica y parafilm®. Después de aproximadamente cuatro semanas, se dejan sedimentar los cúmulos grandes durante aproximadamente 30 segundos, se retiran alícuotas de 10 ml del medio sobrenadante que contiene cúmulos celulares pequeños y se transfieren a 50 ml de medio nuevo. Este proceso se repite cada tres a cuatro semanas usando los cultivos más satisfactorios a juzgar por el pequeño tamaño de los cúmulos y la mejor calidad basándose en la presencia de células citoplásmicas pequeñas. Después de 5 a 8 transferencias, las suspensiones carecen esencialmente de células no embriogénicas y la mayoría de los cúmulos de células embriogénicas son bastante pequeños (de 150 a 2000 \mum).
Ejemplo 74 Aislamiento y purificación de protoplastos de Dactylis glomerata L.
Se preparan protoplastos a partir de cultivos en suspensión embriogénicos del ejemplo anterior filtrando asépticamente las células en una unidad de filtro Nalgene®; de 0,2 \mum y añadiendo después 0,5 g de células, en peso fresco, a cada 12,5 ml de mezcla de enzimas de protoplastos en un placa petri. La mezcla de enzimas consta de un 2% de celulasa RS, CaCl_{2} 7 mM x H_{2}O, NaH_{2}PO_{4} 0,7 mM x H_{2}O, MES 3 mM (pH 5,6), glucosa (550 mOs/kg de H_{2}O de pH 5,6), y se esteriliza por filtración. La mezcla se agita en un agitador orbital aproximadamente 50 rpm con una luz tenue (<420 1x) durante un periodo de aproximadamente 4 a 5 horas. El producto de digestión después se tamiza a través de tamiz de acero inoxidable (tamaño de malla 100 \mum) y se distribuye en tubos de centrifuga de 12 ml que se centrifugan a aproximadamente 60-100 x g durante aproximadamente 5 minutos. Después, el sedimento que contiene los protoplastos se lava tres veces con medio de cultivo de protoplastos KM-8p ajustado a 550 mOs/kg de H_{2}O con glucosa. En este momento, puede incluirse una etapa de flotación para la purificación adicional de los protoplastos. En este caso, los protoplastos lavados se depositan encima de 10 ml de medio de cultivo KM-8p ajustado a 700 mOs/kg de H_{2}O con sacarosa. Después de la centrifugación a 60-100 x g durante aproximadamente 10 minutos, los protoplastos que forman bandas en la interfase se recogen usando una pipeta fina. Finalmente, los protoplastos se resuspenden en 1 a 2 ml de medio de cultivo KM-8p y se tamizan a través de un tamiz de malla inoxidable (tamaño de malla 20 \mum). Los protoplastos liberados se recogen, y se lavan y se resuspenden en medio KM-8p para el cultivo o en medio ajustado osmóticamente adecuado para la transformación de acuerdo con los siguientes ejemplos.
Ejemplo 75 Cultivo de protoplastos de Dactylis glomerata L. y desarrollo de callos
A. Los protoplastos purificados se cultivan a una densidad de aproximadamente 5 x 10^{5} protoplastos por ml en medio de cultivo KM-8p que contiene agarosa SeaPlaque® al 1,3% (FMC Corp., Marine Colloids Division, Rockland, Marine, USA) y de un 30 a un 40% de medio acondicionado (obtenido a partir de cultivos en suspensión embriogénicos de Dactylis glomerata L. de 3 a 4 semanas, filtrando el medio a través de un filtro Nalgene® estéril de 0,2 \mum, haciendo el medio de 550 mOs/kg de H_{2}O por la adición de glucosa, y de nuevo esterilizando por filtración). Las placas después se ponen en la oscuridad a una temperatura constante de 28ºC. Después de 10 a 14 días, la agarosa se corta en cuñas y se pone en un "cultivo de perlas" como se describe por Shillito et al. (1983) usando 20 ml de medio de cultivo en suspensión SH-45 con un 3% de sacarosa por 3 ml de cultivo impregnado en agarosa original. Las placas se ponen en un agitador de plataforma y se agitan a aproximadamente 50 rpm con luz a 670 1x. Se forman nuevos cultivos de suspensión según crecen las colonias de la agarosa y se liberan células en el medio de cultivo. Las células cultivadas en suspensión resultantes se cultivan en medio SH-30 solidificado con agar y se ponen en la oscuridad a 25ºC hasta que se forman callos.
B. Se cultivan protoplastos como se ha descrito anteriormente con la excepción de que el medio de cultivo no contiene medio acondicionado.
Ejemplo 76 Transformación de protoplastos de Dactylis glomerata L. por medio de electroporación
A. Inmediatamente después de la purificación de los protoplastos, se realiza una electroporación de acuerdo con Shillito et al. (1985) usando un plásmido linealizado. Los protoplastos se resuspenden después del último lavado a una densidad de aproximadamente 7 x 10^{6} protoplastos por ml en el tampón de electroporación (manitol 0,4 M, MgCl_{2} 6 mM). Los protoplastos se ponen en alícuotas de 0,7 ml en tubos de centrífuga de plástico de 10 ml. A los tubos se les añaden ADN plasmídico y ADN de timo de ternero sonicado (Sigma) para proporcionar concentraciones finales de 10 \mug/ml y 50 \mug/ml respectivamente. Después se añaden 0,38 ml de solución de PEG [PEG 6000 al 24% en manitol 0,4 M, MgCl_{2} 30 mM, MES al 0,1% (pH 5,6)] y la solución se mezcla suavemente. La suspensión de protoplastos se transfiere a la cámara de un electroporador Dialog® y se aplican 10 pulsos de un voltaje inicial de 3250 Vcm^{-1} y una constante de desintegración exponencial de 10 mseg. a intervalos de 30 segundos. La muestra se retira de la cámara y se pone en una placa petri de 10 cm de diámetro. Se añaden 10 ml de medio KM-8p que contiene agarosa SeaPlaque® al 1,2%, los protoplastos se distribuyen uniformemente a lo largo del medio y la agarosa se deja gelificar.
B. Se repite lo anterior, con la excepción de que el voltaje inicial usado es 3500 Vcm^{-1}, 5000 Vcm^{-1}, 3000 Vcm^{-1} o 2500 Vcm^{-1}.
Ejemplo 77 Transformación de protoplastos de Dactylis glomerata L. por tratamiento con PEG
A. Se realiza una transferencia génica directa mediada por PEG de acuerdo con Negrutiu, I. et al., (1987). El ADN usado es el plásmido linealizado descrito.
Los protoplastos se suspenden después del último lavado en manitol 0,5 M que contiene MgCl_{2} 15 mM a una densidad de aproximadamente 2 x 10^{6} por ml. La suspensión de protoplastos se distribuye como alícuotas de 1 ml en tubos de centrífuga de plástico de 10 ml. El ADN se añade como se ha descrito anteriormente y después se añaden 0,5 ml de la solución de PEG (PEG 4000 al 40% en manitol 0,4 M, Ca(NO_{3})_{2} 0,1 M, pH 7,0).
Las soluciones se mezclan suavemente y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 24ºC) durante 30 minutos con agitación ocasional. Después se añaden 1,4 ml de la solución de lavado, y se mezcla suavemente el contenido del tubo. La solución de lavado consta de manitol 87 mM, CaCl_{2} 115 mM, MgCl_{2} 27 mM, KCl 39 mM, Tris-HCl 7 mM y mioinositol a 1,7 g/l, pH 9,0. Se añaden cuatro alícuotas de 1,4 ml adicionales de solución de lavado a intervalos de 4 minutos, con mezcla después de cada adición. El tubo después se centrifuga a aproximadamente 60 x g durante aproximadamente 10 minutos, y el sobrenadante se desecha. Se recogen los protoplastos sedimentados en 1 ml de medio de cultivo KM-8p y se ponen en una placa petri de 10 cm. Se añaden 10 ml de medio KM-8p que contiene agarosa SeaPlaque® al 1,2%. Los protoplastos se distribuyen uniformemente a lo largo de todo el medio y la agarosa se deja gelificar.
B. Esto se repite con una o más de las siguientes modificaciones:
(1)
El pH de la solución de lavado se ajusta a 5,6 o 7,0
(2)
El PEG usado es PEG de MW 6000, PEG de MW 2000 o PEG de MW 8000.
(3)
El medio de lavado consta de NaCl 154 mM, CaCl_{2} 125 mM, KCl 5 mM, glucosa 5 mM, pH a 6,0 con KOH, de CaCl_{2} 0,2 M, MES al 0,1%, pH 6,0 con KOH, o de CaCl_{2} 0,2 M, Tris/HCl 7 mM, pH 9,0 con KOH.
Ejemplo 78 Transformación de protoplastos de Dactylis glomerata L. por electroporación o tratamiento con PEG
La transformación se realiza como se ha descrito anteriormente con la excepción de que los protoplastos se tratan a 45ºC durante aproximadamente 5 minutos antes de la distribución de las alícuotas en tubos para la transformación o después de la distribución de las alícuotas, y antes de la adición del PEG.
Ejemplo 79 Selección de colonias transformadas
A. Las placas de cultivo (placas petri) que contienen los protoplastos se incuban durante 10 días en la oscuridad a aproximadamente 25ºC y después se cortan en 5 cortes iguales para obtener "cultivos de perlas" (Shillito el al., 1983). Cuatro de los cortes se ponen en 20 ml de medio de cultivo SH-45 con 4 g/l de hidrolizado de caseína y 20 \mug/ml de higromicina B. El quinto corte se pone en 20 ml del mismo medio pero sin higromicina B como control no seleccionado. Después de 4 a 5 semanas, se cortan de la agarosa las supuestas colonias celulares derivadas de protoplastos que han crecido en higromicina B y se ponen en una placa petri de 19 mm con 2 ml de medio SH-45 líquido que contiene 20 \mug/ml de higromicina B, que se agita a aproximadamente 50 rpm en un agitador orbital. Después de otras 4 a 5 semanas, todas las colonias que crecen para obtener nuevas suspensiones se transfieren a matraces Erlenmeyer de 125 ml y se cultivan de una manera similar al cultivo en suspensión parental, con la excepción de que en el medio se incluyen 20 \mug/ml de higromicina B.
Las nuevas suspensiones se subcultivan cada 1-3 semanas usando medio SH-45 que contiene 4 g/l de hidrolizado de caseína y 20 \mug/ml de higromicina B. Las células de estas suspensiones también se cultivan en medio SH-30 solidificado que contiene 20 \mug/ml de higromicina B y se incuban a aproximadamente 25ºC en la oscuridad. Los callos desarrollados a partir de las células cultivadas en placas se subcultivan cada dos semanas en medio nuevo. Se supone que las células que crecen en presencia de higromicina B son transformantes.
B. Se realiza una selección como se ha descrito, con la excepción de que las colonias celulares derivadas de protoplastos que crecen en medio que contiene higromicina B se ponen en placas de agar de medio SH-30 que contiene 20 \mug/ml de higromicina B y se incuban a aproximadamente 25ºC en la oscuridad.
Ejemplo 80 Regeneración de plantas Dactylis glomerata L. transformadas
A. Se cultivan callos de Dactylis glomerata L. (obtenidos como se ha descrito) procedentes de protoplastos en medio SH-30 solidificado, y se subcultivan cada dos semanas. Cualquier embrión que se forme se retira y se cultiva en medio de germinación (SH-0) y se pone a la luz (de 3800 a 4600 1x). La germinación de estos embriones tiene lugar en 1 a 4 semanas y las plántulas resultantes se ponen en medio SH-0 en condiciones de luz para formar sistemas radiculares. Se introducen en el invernadero en la etapa de 6 a 12 hojas y se robustecen gradualmente.
B. Se cultiva el callo (obtenido como se ha descrito) procedente de protoplastos en medio SH-0 solidificado con Gelrite® al 0,24% en condiciones de luz (de 3800 a 4600 1x), y se subcultiva cada dos semanas. Las plántulas resultantes se ponen en una mezcla 1:1 de SH-0 y medio OMS solidificado con una combinación de Gelrite® al 0,12% y agar al 0,4% en condiciones de luz para formar sistemas radiculares. Se introducen en el invernadero en la etapa de 6 a 12 hojas y se robustecen gradualmente.
C. Se obtienen pequeñas plántulas como se describe en los ejemplos 44A y 44B y se ponen en medio OMS solidificado con agar al 0,8% en condiciones de luz para formar sistemas radiculares. Se introducen en el invernadero en la fase de 6 a 12 hojas y se robustecen gradualmente.
D. Se obtienen pequeñas plántulas como se describe en el ejemplo 44A anterior y se ponen en una mezcla 1:1 de SH-O y medio OMS solidificado con una combinación de Gelrite® al 0,12% y agar al 0,4% en condiciones de luz para formar sistemas radiculares. Se introducen en el invernadero en la fase de 6 a 12 hojas y se robustecen gradualmente.
Ejemplo 81 Introducción de ADN en protoplastos de N. tabacum por tratamiento con PEG
A. La preparación de protoplastos de N. tabacum puede realizarse de acuerdo con Paszkowski et al, (1984); documentos GB 2 159 173, EP 0 129 668; Shillito y Potrykus (1987) o por otros métodos conocidos en la técnica.
B. Se introduce ADN en protoplastos por una modificación del método de Negrutiu et al. (1987). Los protoplastos preparados como se ha descrito se resuspenden después de la última etapa de lavado en una solución que consta de manitol 0,4 M, CaCl_{2} de 15 a 30 mM y MES al 0,1%, a una densidad de 1,6 a 2 x 10^{6} por ml. La suspensión de protoplastos se distribuye como alícuotas de 0,5 ml en tubos de centrífuga de plástico de 10 ml. El ADN se añade en 10 \mul de agua destilada estéril, se esteriliza como se describe por Paszkowski et al. (1984), y después se añaden 0,5 ml de la solución de PEG (PEG MW 8000 al 40%, manitol 0,4 M, Ca(NO_{3})_{2} 0,1 M, pH 7,0). Las soluciones se mezclan suavemente y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 24ºC) con agitación ocasional. Después se añade 1 ml de la solución de lavado y el contenido del tubo se mezcla suavemente. La solución de lavado consta de NaCl 154 mM, CaCl_{2} 125 mM, KCl 5 mM, glucosa 5 mM, pH 6,0 con KOH. Se añaden secuencialmente alícuotas adicionales de 2 ml, 3 ml y 4 ml de solución de lavado a intervalos de 5 minutos, con mezcla después de cada adición. El tubo después se centrifuga a aproximadamente 10-100 x g durante aproximadamente 10 minutos, y el sobrenadante se desecha. Los protoplastos sedimentados se recogen en suficiente medio de cultivo K3 con glucosa 0,3 M como agente osmótico, y sin sacarosa, para conseguir una densidad final de 10^{5} por ml y se cultivan en una placa petri de 10 cm.
C. Lo anterior se repite con una o más de las siguientes modificaciones:
(1)
El pH de la solución de lavado se ajusta a 5,6 o 7,0.
(2)
El PEG usado es PEG con un MW de 4000.
(3)
El medio de lavado consta de CaCl_{2} 0,2 M, MES al 0,1%, pH 6,0 con KOH, o de CaCl_{2} 0,2 M, Tris/HCl 7 mM, pH 9,0 con KOH.
(4)
Se añaden 50 \mug de ADN de timo de ternero cortado en 25 \mul de agua estéril junto con el ADN plasmídico.
(5)
El ADN plasmídico se linealiza antes del uso por tratamiento con una enzima de restricción adecuada (por ejemplo, BamHI).
Ejemplo 82 Introducción de ADN en protoplastos de N. tabacum por electroporación
A. La introducción de ADN en protoplastos de N. tabacum se realiza por tratamiento de los protoplastos con un pulso eléctrico en presencia del ADN apropiado, en una modificación de los métodos de Fromm et al. (1987); y Shillito y Potrykus (1987).
Los protoplastos se aíslan como se ha descrito. Los protoplastos se resuspenden después del último lavado en la siguiente solución: manitol 0,2 M, MES al 0,1%, NaCl 72 mM, CaCl_{2} 70 mM, KCl 2,5 mM, glucosa 2,5 mM, pH 5,8 con KOH, a una densidad de 1,6 a 2 x 10^{6} por ml. La suspensión de protoplastos se distribuye como alícuotas 10 ml en cubetas desechables de plástico y se añaden 10 \mug de ADN como se ha descrito. La resistencia de la solución en este punto, medida entre los electrodos de la serie de electrodos 471 del aparato de electroporación descrito más adelante, está en el intervalo de 6 \Omega.
El ADN se añade en 10 \mul de agua destilada estéril, y se esteriliza como se describe por Paszkowski et al. (1984). La solución se mezcla suavemente y después se somete a temperatura ambiente (de 24 a 28ºC) a un pulso de 400 Vcm^{-1} con una constante de desintegración exponencial de 10 ms desde un aparato de electroporación BTX-Transfector 300 usando el conjunto de electrodos 471. Los protoplastos se dejan en reposo durante 5 minutos y después se ponen en una placa petri y medio K3 como se ha descrito y se añaden para llevar la densidad de los protoplastos a 10^{5} por ml.
B. Lo anterior se repite con una o más de las siguientes modificaciones:
(1)
El voltaje usado es 200 Vcm^{-1}, o está comprendido entre 100 Vcm^{-1} y 800 VCm^{-1}.
(2)
La constante de desintegración exponencial es de 5 ms, 15 ms o 20 ms.
(3)
Se añaden 50 \mug de ADN de timo de ternero cortado en 25 \mul de agua estéril junto con el ADN plasmídico.
(4)
El ADN plasmídico se linealiza antes del uso por tratamiento con una enzima de restricción adecuada (por ejemplo, BamHI).
Ejemplo 83 Introducción de ADN en Protoplastos de Zea mays Línea 2717
Se preparan protoplastos de la línea endogámica de maíz Funk 2717 como se describe en los ejemplos 67 a 69 y se resuspenden en cualquiera de las soluciones descritas para la resuspensión de los protoplastos de N. tabacum anteriores a una densidad de 10^{7} por ml. La transformación se realiza esencialmente como se ha descrito anteriormente. Los protoplastos se cultivan después de la transformación a una densidad de 2 x 10^{6} por ml en medio KM-8p sin añadir agentes de solidificación y conteniendo 1 mg/l de 2,4-D.
Ejemplo 84 Introducción de ADN en protoplastos de Sorghum bicolor
Se preparan protoplastos de suspensión de sorgo FS 562 esencialmente como se ha descrito para Zea mays anteriormente, y se resuspenden en cualquiera de las soluciones descritas para la resuspensión de los protoplastos de N. tabacum anteriores a una densidad de 10^{7} por ml. Se realiza la transformación. Los protoplastos se cultivan después de la transformación a una densidad de 2 x 10^{6} por ml en medio KM-8p, sin añadir agente de solidificación.
Ejemplo 85 Introducción de ADN en protoplastos de N. plumbaginifolia, Petunia hybrida y Lolium multiflorum
Se preparan protoplastos de N. plumbaginifolia, P. hybrida o L. multiflorum como se describe en Shillito and Potrykus (1987) y se tratan como se ha descrito anteriormente. Se cultivan en el medio descrito por Shillito y Potrykus (1987) sin la adición de agarosa o ningún otro agente de gelificación.
Ejemplo 86 Introducción de ADN en protoplastos de Glycine max
Se preparan protoplastos de Glycine max por el método descrito por Tricoli et al. (1986) o Chowhury y Widholm (1985), o Klein et al (1981). Se introduce ADN en estos protoplastos esencialmente como se ha descrito anteriormente. Los protoplastos se cultivan como se describe en Klein et al. (1981), Chowhury y Widholm (1986) o Tricoli et al. (1986) sin la adición de alginato para solidificar el medio.
Sección 8
Análisis de plantas transgénicas
En las secciones anteriores se ha descrito la creación de plantas transgénicas que expresan genes quiméricos de resistencia a enfermedades. En esta sección se explica el desarrollo de líneas de semillas transgénicas y la caracterización de esas líneas con respecto a la expresión de genes quiméricos. Esencialmente, este proceso de caracterización comprende una selección preliminar de las plantas transgénicas para la expresión del gen quimérico, la segregación del gen quimérico en líneas homocigotas estables y la caracterización adicional de la expresión génica.
Ejemplo 87 Desarrollo de líneas de semillas transgénicas T3
Aquí se usan las designaciones de genotipo para las plantas transgénicas de acuerdo con la siguiente convención: la planta inicial que resulta de un suceso de transformación y que se ha desarrollado a partir de un cultivo de tejidos se denomina una planta T1. Las plantas resultantes de una autopolinización de las flores naturales de la planta T1 se denominan T2, habiendo adquirido un nuevo genotipo durante el proceso meiótico normal. De forma similar, las semillas procedentes de una autopolinización de las flores naturales de plantas T2 (es decir, cultivadas a partir de semillas T2) se denominan T3, etc.
Se cultivan plantas transgénicas (T1) hasta que alcanzan la madurez. Se deja que las flores se autopolinicen y se recogen vainas de semillas después de la desecación normal. Se recogen semillas de cada planta individual y se almacenan por separado. Cada lote de semillas se ensaya por un análisis de segregación genética para determinar el número de loci mendelianos que llevan el rasgo de resistencia a kanamicina. Las semillas T2 se esterilizan superficialmente por un lavado múltiple en hipoclorito al 2% que contiene Tween-20 al 0,02% (v/v), seguido de aclarados en agua estéril. Aproximadamente 150 de las semillas se ponen el papel de filtro saturado con 0,2 X sales MS (Murashige y Skoog, 1962) que contiene 150 \mug/ml de kanamicina. Después de la germinación y la expansión de los cotiledones hasta aproximadamente 5 mm, se determina la relación de cotiledones de color verde normal (kan-r) frente a cotiledones blanqueados (kan-s). Sólo se conservan los lotes de semillas T2 que presentan una relación de aproximadamente 3:1 (kan-r:kan-s) para un análisis adicional; esta relación de segregación es indicativa de un solo locus mendeliano que lleva el gen marcador de kanamicina.
De cuatro a diez plantas se cultivan hasta la madurez a partir de cada lote de semillas T2 (usando las mismas condiciones descritas anteriormente), y se dejan autopolinizar. La recolección de las semillas T3, la esterilización de las semillas y la germinación de las semillas se realizan como se ha descrito anteriormente para las semillas T2. Los lotes de semillas T3 en los que el 100% de las semillas ensayadas (n = 150) presentan el fenotipo kan-r se consideran homocigotos para el rasgo (es decir, resultante de una planta parental T2 homocigota) y se conservan para el análisis fenotípico.
Ejemplo 88 Ensayos para el análisis de tejidos de plantas transgénicas que expresan PR-1 con sentido o anti-sentido
La expresión de PR-1a en una orientación con sentido o anti-sentido se ensaya en material de planta transgénica usando un ensayo ELISA para la proteína PR-1a o un ensayo de extensión de cebadores para el ARNm de PR-1 como se ha descrito.
A. ELISA para la proteína PR-1. Se realizan ensayos en placas de microtitulación Immunolon II (Dynatech) que se han aclarado con etanol y se han dejado secar al aire. El material de hoja de tabaco se tritura con un homogeneizador de tejidos de plástico (Kontes) en un tampón que consta de Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, 2-mercaptoetanol 200 mM, PMSF 2 mM (Sigma), BAM 2 mM (Sigma), ACA 10 mM (Sigma), y leupeptina al 0,048% (sal hemisulfato) (Sigma); se usan 3 ml de tampón de extracción por gramo de tejido de hoja. Se obtiene una muestra suficiente del extracto de hoja sano (tabaco no tratado) de forma que una dilución 1/10 de este extracto pueda servir como diluyente para todas las demás muestras. Los extractos se centrifugan en una microcentrífuga en tubos de polipropileno de 1,5 ml a 12.000 x g (máximo) durante 15 minutos para retirar el desecho celular. Los pocillos se recubren con una solución de anticuerpo monoclonal específico para la proteína PR1 (tabaco). Después del lavado, los pocillos se bloquean durante 30 a 120 minutos con una solución de BSA al 1% y después se lavan de nuevo. Las muestras desconocidas y las muestras de curva patrón, diluidas hasta las concentraciones apropiadas en una solución 1/10 de extracto vegetal sano, se añaden a los pocillos y se incuban durante 1 hora a 37ºC. (Se realiza una curva patrón usando proteína PR-1a muy purificada). Después del lavado, se añade un antisuero policlonal de conejo (5 \mug/ml) específico para PR1 a los pocillos y se incuba durante una hora más a 37ºC, y después los pocillos se lavan de nuevo. Se añade un anticuerpo IgG de cabra anti-conejo (113 ng/ml) con el que está conjugada la enzima indicadora fosfatasa alcalina (Promega) y la reacción del indicador se revela de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La reacción se detiene después de 30 minutos por la adición de NaOH y la absorbancia se lee a 405 nm.
B. Ensayo de extensión de cebadores para PR1. Se extrae ARN a partir de tejido de hoja de tabaco por un método descrito previamente (Ecker y Davis, 1987). Los ensayos de extensión de cebadores se realizan como se describe en el ejemplo 6 usando oligonucleótidos sintéticos de la secuencia
5'GTAGGTGCATTGGTTGAC3'
El complemento de esta secuencia existe tanto en el ARNm de PR-1a como en el ARNm de PR-1b, obteniéndose el cebado de los dos tipos de ARNm en el ensayo. Los productos de extensión de cebadores del producto génico quimérico se distinguen de los productos de los genes de PR-1 endógenos usando PAGE. El transcrito de PR-1a quimérico generado a partir del promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco de derivados de pCGN1509 da como resultado un producto de extensión de cebadores que tiene 90 pb más que el gen de PR-1a endógeno, mientras que el transcrito de PR-1b quimérico generado a partir del promotor de la subunidad pequeña de RUBISCO de tabaco de los derivados de pCGN1509 produce un producto de extensión de cebadores que tiene 95 pb más que el gen de PR-1b endógeno. El transcrito de PR-1a quimérico generado a partir del promotor doble 35S de derivados de pCGN1761 produce un producto que tiene 4 pb más que el gen de PR-1a endógeno, mientras que el transcrito de PR-1b quimérico generado a partir del promotor doble 35S de derivados de pCGN1761 produce un producto que tiene 10 pb más que gen de PR-1b endógeno.
Ejemplo 89 Análisis de líneas de semillas derivadas de la transformación de tabaco con vectores de la serie pCGN1755 y pCGN1756 (SSU RUBISCO/PR-1a o PR-1b/ocs 3')
Se toma una muestra de tejido de hoja a partir de plantas T1 transformadas con: pCGN1754 o pCGN1760 (como controles de cassette vacíos); una de las series de vectores binarios pCGN1755 (promotor SSU/PR-1a en todas las orientaciones); o una de las series de vectores binarios pCGN1756 (promotor SSU/PR-1b). La expresión de la proteína PR-1 en este tejido se determina por ELISA para la proteína PR-1 y en algunos casos el nivel de ARN se controla por ensayos de extensión de cebadores.
Se prevé que el tejido transformado con los plásmidos de control pCGN1754 y pCGN1760 (cassette vacío) producirá un cierto nivel basal de proteína PR-1 que se debería a la síntesis endógena. El tejido transformado con los plásmidos pCGN1755A, pCGN1755C, pCGN1756A o pCGN1756C (PR-1a o PR-1b en una orientación con sentido) produciría plantas que expresan PR-1 a un nivel significativamente superior que el nivel basal. El tejido transformado con pCGN1755B, pCGN1755D, pCGN1756B o pCGN1756D (PR-1a o PR-1b en una orientación anti-sentido) produciría niveles significativamente menores de proteína PR-1 con respecto al control. Cuando el tejido T1 transformado se selecciona con respecto a la proteína PR-1 por ELISA, las plantas que cumplen las expectativas se promueven para el análisis de T2. En esta investigación, se intenta eliminar los transformantes que no se contransforman con el gen PR-1 quimérico junto con el gen de resistencia a antibióticos. Muchas plantas de cada transformación no cumplen las expectativas y el resultado de la proteína se confirma por análisis de extensión de cebadores del ARN para asegurarse de que el mayor nivel de expresión en las plantas con sentido se debe a la expresión de genes quiméricos.
Los ensayos se repiten en la generación T2 y en este punto se eligen varias líneas para una caracterización adicional. Las líneas se eligen basándose en: (1) una segregación 3:1 de la resistencia a antibióticos, que indica un rasgo mendeliano heredado (una sola inserción); (2) altos niveles de expresión de PR-1 para la construcción con sentido, bajos niveles para las construcciones anti-sentido y niveles intermedios para las plantas de control. Las líneas elegidas para un estudio adicional y los datos para la expresión de PR-1 y la segregación se muestran más adelante.
Línea de semillas Análisis de segregación T2 ELISA de expresión de PR-1
(% Kan-R) en T2 (ng/ml)
1754-12 77% 300
1755A-4 75% 175 (Av=515 en T3)
1755B-2 83% \leq2
1755B-3 76% \leq2
1760-1 93% 240
La nomenclatura de la línea de semillas es tal que primero se designa el plásmido de transformación y en segundo lugar se designa el transformante individual. Por ejemplo, 1755A-4 representa una planta transgénica resultante de la transformación con el plásmido pCGN1755A, y éste es el cuarto transformante individual seleccionado. En muchos de estos experimentos, el nivel de control de la expresión de PR-1 parece artificialmente alto (es decir el 1754-12 anterior está a un nivel de 300 ng/ml, que es aproximadamente 30 veces mayor que el nivel normal). Este nivel se reduce en el control, pero no en las plantas experimentales con generaciones sucesivas.
Las líneas de semillas T2 anteriores son genotipos mixtos con respecto al gen de PR-1 quimérico. Por ejemplo, algunas de las plantas de una línea de semillas son homocigotas y otras son heterocigotas para el rasgo. Para aislar las líneas de semillas homocigotas, se dejan autopolinizar entre cuatro y diez plantas de cada línea y se establecen las semillas. Estas semillas se recogen y la segregación se determina como se ha explicado anteriormente. A continuación se muestran estos datos de segregación para varias líneas.
Línea de semillas T3 Segregación (% Kan-R)
1754-12-10 100
1755A-4-2 100
1755B-2-1 100
1755B-3-1 100
1760-1 ND
Estas líneas de semillas homocigotas después se analizan con respecto a la resistencia a enfermedades generalizadas como se describe más adelante. La conclusión general de los análisis de esta serie de plantas es que las construcciones con sentido (tanto PR-1a como PR-1b) producen de 6 a 150 veces la cantidad de PR-1 en tejido de tabaco sano y las construcciones anti-sentido normalmente producen mucho menos PR-1 que en el tabaco sano.
Ejemplo 90 Análisis de líneas de semillas derivadas de la transformación de tabaco con la serie de vectores pCGN1764, pCGN17 65, pCGN1774 y pCGN1775 (Promotor doble 35S de CaMV/PR-1a)
El desarrollo de líneas de semillas en este ejemplo incluye las transformaciones de tabaco con el promotor doble 35S de CaMV unido a PR-1a (series pCGN1764 y pCGN1774) en la orientación con sentido y anti-sentido y el promotor doble 35S de CaMV unido a PR-1b (series pCGN1765 y pCGN1775) en la orientación con sentido y anti-sentido. La diferencia entre las construcciones pCGN1764/pCGN1765 y pCGN1774/pCGN1775 es que el vector binario es diferente (véanse los ejemplos relevantes anteriores). Los controles de cassette vacíos para pCGN1764 y pCGN1765 son pCGN1766 y pCGN1767. El control de cassette vacío para pCGN1774 y pCGN1775 es pCGN1789.
La expresión de la proteína PR-1 en las plantas T1 "con sentido" (todos los acontecimientos) varía desde niveles indetectables hasta aproximadamente 13.000 ng/ml de extracto; este nivel máximo está dentro de dos veces los niveles observados en una hoja primaria muy infectada que lleva muchas lesiones. Los niveles observados en el tejido secundario, incluso en condiciones óptimas, son varias veces inferiores a éste. El nivel de expresión medio de todas las plantas T1 "con sentido" es de aproximadamente 4.200 ng/ml, que más de 20 veces mayor que el promedio para las plantas transgénicas PR-1 de subunidad pequeña.
No se observan diferencias significativas en los niveles de expresión del gen quimérico entre el vector binario pCGN783 (series pCGN1764 y pCGN1765). Las dos series de plantas tienen un amplio intervalo de niveles de expresión, como es común en experimentos transgénicos de este tipo. La máxima expresión en los dos tipos es similar, y el número de plantas que expresan a un bajo nivel es aproximadamente igual. El promedio para las plantas binarias pCGN783 es mayor que el promedio para las plantas transgénicas de subunidad pequeña-PR1.
No se observan diferencias significativas en los niveles de expresión del gen quimérico entre el vector binario pCGN783 (series pCGN1764 y pCGN17065) y el vector binario pCGN1540 (series pCGN1774 y pCGN1775). El promedio para la plantas binarias de pCGN783 es 3.955 ng/ml, y para las plantas binarias de pCGN1540 es de 4.415 ng/ml, pero considerando la variación, esta diferencia no es significativa. De forma similar, la orientación de los genes en el binario no tiene un efecto importante sobre la expresión. La orientación "C" (cabeza a cola) proporciona tres de las cuatro plantas de máxima expresión, pero también proporciona más plantas de un nivel de expresión bajo. Las plantas con orientación "A" (cabeza a cabeza) tienden a agruparse más en el intervalo de expresión moderado, pero de nuevo, la variación y el pequeño tamaño de la muestra impiden la asociación de cualquier significado estadístico a estas diferencias. El análisis de extensión de cebadores de un número limitado de muestras demuestra que el ARNm del gel quimérico es el dominante del único ARNm de PR1 presente.
La conclusión de los datos de T1 es que el nivel de proteína PR-1 en plantas transformadas con las construcciones de promotor doble 35S de CaMV/PR-1a o PR-1b es varios cientos de veces mayor que el nivel de las plantas de control. El nivel de expresión de PR-1 en plantas transformadas con la construcción anti-sentido es muy bajo. El vector binario usado para la transformación (pCGN783 o pCGN1540) no afecta significativamente al nivel de expresión de PR-1 en las plantas transgénicas. De forma similar, la orientación del cassette de expresión dentro del vector no tiene ningún efecto significativo sobre el nivel de expresión de PR-1. Por lo tanto, se selecciona un línea que produzca altos niveles de PR-1a debido a la expresión con sentido y se selecciona una que produzca bajos niveles de PR-1a debido a la expresión anti-sentido para un desarrollo adicional. Se incluye una línea de control con un cassette vacío. Los resultados de la expresión de PR-1 y la segregación de anticuerpos para las líneas seleccionadas se muestran a continuación.
Línea de semillas T2 Análisis de segregación ELISA de expresión de PR-1
(% Kan-R) de T2 (ng/ml)
1774A-10 409/553 9000
1774B-3 109/142 \leq2
1789-10 371/459 5,6
Se generan líneas de semillas T3 homocigotas a partir de cada una de las líneas seleccionadas como se describe en el ejemplo previo. Los resultados del análisis de segregación se muestran a continuación.
Línea de semillas T3 Segregación (% Kan-R)
1774A-10-1 100
1774B-3-2 100
1789-10-3 100
Estas líneas de semillas homocigotas se evalúan con respecto a la expresión de PR-1 y de resistencia a enfermedades como se describe más adelante.
Ejemplo 91 Análisis de líneas de semillas derivadas de la transformación de tabaco con la serie de plásmidos pCGN1779 (promotor doble 35S de CaMV/quitinasa/lisozima de pepino
Se toma una muestra de tejido de hoja de plantas T1 transformadas con cualquiera de los vectores binarios pCGN1779C o pCGN1779D. El contenido de quitinasa/lisozima de pepino se determina usando un ensayo ELISA esencialmente como se ha descrito anteriormente con la excepción de que los anticuerpos monoclonales y policlonales se dirigen contra la quitinasa/lisozima de pepino.
Ocho de trece plantas T1 "con sentido" producen cantidades muy altas (>10.000 ng/ml de extracto) del producto génico extraño de quitinasa de pepino. De nuevo, se observa un amplio intervalo, desde indetectable hasta 31.500 ng/ml de extracto, con un promedio de 12.500 ng/ml de extracto.
La conclusión de los datos de T1 es que las plantas T1 transformadas producen varios miles de veces más de la proteína transgénica que la que está presente en las plantas de control. Se obtienen líneas de semillas T3 a partir de las plantas T1 de alta expresión como se describe en el ejemplo 87 y estas líneas de semillas T3 mantienen sus altos niveles de expresión de quitinasa/lisozima.
Ejemplo 91B Análisis de líneas de semillas derivadas de la transformación de tabaco con series del plásmido pCGN1782 (promotor doble 35S de CaMV/quitinasa básica de tabaco)
Se toma una muestra de tejido de hoja a partir de plantas T1 transformadas con cualquiera de los vectores binarios pCGN1782C o pCGN1782D. El contenido de proteína quitinasa básica de tabaco se estima por una técnica de inmunotransferencia (Towbin et al., 1979) modificada por Johnson et al. (1984), siguiendo SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Los anticuerpos usados se inducen contra la proteína quitinasa básica de tabaco por métodos convencionales y son específicos para la proteína quitinasa básica de tabaco. Se hacen avanzar plantas T1 con el plásmido pCGN1782C (que contienen el cassette de expresión con sentido) que muestran altos niveles de expresión con respecto al control y las plantas anti-sentido, hasta las líneas de semillas T3 como se describe en el ejemplo 87. Las plantas T2 homocigotas que producen estas semillas T3 continúan expresando la proteína a altos niveles. También se hacen avanzar plantas T1 transformadas por el plásmido pCGN1782D (que contiene el cassette de expresión anti-sentido) que proporciona bajos niveles de expresión hasta semillas T3 como se describe en el ejemplo 87.
Ejemplo 91C Análisis de líneas de semillas derivadas de la transformación de tabaco con la serie de plásmidos pCGN1781 (promotor doble 35S de CaMV/glucanasa básica de tabaco
Se toma una muestra de tejido de hoja a partir de plantas T1 transformadas con cualquiera de los vectores binarios pCGN1781C o pCGN1781D. El contenido de proteína glucanasa básica de tabaco se estima por una técnica de inmunotransferencia como se describe en el ejemplo 91B. Los anticuerpos usados se inducen contra la proteína glucanasa básica de tabaco por métodos convencionales y son específicos para la proteína glucanasa básica de tabaco. Las plantas T1 con el plásmido pCGN1781C (que contiene el cassette de expresión con sentido) que muestran altos niveles de expresión con respecto al control y las plantas anti-sentido, se hacen avanzar hasta líneas de semillas T3 como se describe en el ejemplo 87. Las plantas T2 homocigotas que producen estas semillas T3 continúan expresando la proteína a altos niveles. Las plantas T1 transformadas con el plásmido pCGN1781D (que contienen el cassette de expresión anti-sentido) que proporcionan bajos niveles de expresión también se hacen avanzar hasta las semillas T3 como se describe en el ejemplo 87.
Sección 9
Evaluación del fenotipo
En las secciones 1 a 8 se explica el desarrollo de líneas de semillas transgénicas estables de tabaco que expresan genes PRP quiméricos en una orientación con sentido y anti-sentido. Una vez desarrolladas las líneas de semillas, se evalúan cuantitativamente con respecto a la resistencia a diversas enfermedades.
Ejemplo 92 Evaluación de tabaco transgénico que expresa PR-1 en una orientación con sentido y anti-sentido con respecto a la resistencia a enfermedades
Las líneas de semillas 1755A-4-2 y 1755B-2-1 se analizan con respecto a la resistencia a TMV. El resultado de estos experimentos es que no hay ninguna diferencia significativa en el tamaño de las lesiones o en el número de lesiones debido a los niveles elevados o reducidos de proteína PR-1.
La líneas seminales 1755A-4-2 y 1755B-2-1 se analizan con respecto a la resistencia al patógeno fúngico Peronospora nicotiana (mildíu velloso de moho azul) por pulverización de una suspensión de esporas en las hojas de las plantas e incubación en condiciones convencionales durante siete días. Las plantas después se evalúan con respecto a la resistencia al moho azul basándose en el porcentaje de área de superficie de la hoja infectada por el patógeno. Seis plantas de la línea 1755A-4-2 que expresan un promedio de 1454 ng/ml de proteína PR-1 muestran un 98 \pm 3% de área de superficie infectada. Seis plantas de la línea 1755B-2-1, que expresan un promedio de 370 ng/ml de proteína PR-1, muestran un 45% \pm 26% de área de superficie infectada. Seis plantas derivadas de tabaco Xanthi.nc transformadas que producen 559 ng/ml de proteína PR-1 muestran un 99% \pm 1% de área de superficie infectada. Este resultado indica que la expresión anti-sentido de PR-1a produce una resistencia significativa y valiosa al mildíu velloso en plantas transgénicas.
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GB 2 159 173

Claims (29)

1. Un método para producir una planta que tiene un fenotipo resistente a enfermedades, que comprende:
(a)
transformar tejido o células vegetales con una secuencia de ADN quimérico que comprende una primera secuencia de ADN que comprende un promotor que promueve en una planta la transcripción constitutiva de una secuencia de ADN asociada, unida operativamente a una segunda secuencia de ADN que comprende una secuencia codificante que codifica una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible, donde dicha proteína relacionada con la patogénesis no es un quitinasa;
(b)
expresar constitutivamente la proteína relacionada con la patogénesis a un nivel suficiente para proporcionar un fenotipo resistente a enfermedades en la planta transformada de acuerdo con la etapa (a); y
(c)
seleccionar las plantas que presentan un fenotipo resistente a enfermedades, donde dicha enfermedad se produce por hongos patógenos.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dichos hongos patógenos se seleccionan entre el grupo compuesto por Phytophtora y Peronospora.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha primera secuencia de ADN es de origen heterólogo con respecto a la segunda secuencia de ADN.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la primera secuencia de ADN se prepara a partir de un gen que codifica la subunidad pequeña de la ribulosa bis-fosfato carboxilasa de tabaco (RUBISCO).
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la primera secuencia de ADN, que se prepara a partir del genoma de CaMV, comprende el promotor doble 35S de CaMV.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la segunda secuencia de ADN se puede obtener a partir de una biblioteca de ADN preparada a partir de un tejido vegetal en el que se ha inducido resistencia adquirida sistémica o resistencia adquirida localizada usando inductores biológicos.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la segunda secuencia de ADN codifica una proteína relacionada con la patogénesis de plantas seleccionada entre el grupo compuesto por PR-1A codificada por la secuencia 1, PR-1B codificada por la secuencia 2, PR-1C codificada por la secuencia 3, PR-R mayoritaria codificada por la secuencia 4, PR-R minoritaria, PR-P codificada por la secuencia 6, PR-Q codificada por secuencia 5, PR-2 codificada por la secuencia 8, PR-N, PR-O, PR-O' codificadas por la secuencia 7A, SAR8.2a codificada por la secuencia 9, SAR8.2b codificada por la secuencia 10, peroxidasa básica de pepino codificada por la secuencia 12, y glucanasa básica de tabaco.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la unión de la primera y la segunda secuencia de ADN se ha realizado de una forma en la que la segunda secuencia de ADN se orienta con respecto a la primera secuencia de ADN de tal forma que la primera secuencia de ADN promueve la transcripción de la cadena con sentido de la segunda secuencia de ADN.
9. Un método de la reivindicación 1, donde la secuencia de ADN quimérico comprende además una tercera secuencia de ADN que es un gen marcador selectivo en plantas.
10. Una planta transgénica que incluye la progenie de la misma, que se ha transformado con una molécula de ADN quimérico que comprende un promotor que promueve en una planta la transcripción constitutiva de una secuencia de ADN asociada, unida operativamente a una secuencia codificante que codifica una proteína relacionada con la patogénesis en plantas inducible, donde dicha proteína relacionada con la patogénesis no es una quitinasa, para expresar constitutivamente una proteína relacionada con la patogénesis a un nivel suficiente para proporcionar un fenotipo resistente a enfermedades, donde dicha progenie comprende dicha molécula de ADN quimérico, donde dicha enfermedad se produce por hongos patógenos.
11. Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 10, donde dichos hongos patógenos se seleccionan entre el grupo compuesto por Phytophtora y Peronospora.
12. Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 10, donde la proteína relacionada con la patogénesis vegetal se selecciona entre el grupo compuesto por PR-1A codificada por la secuencia 1, PR-1B codificada por la secuencia 2, PR-1C codificada por la secuencia 3, PR-R mayoritaria codificada por la secuencia 4, PR-R minoritaria, PR-P codificada por la secuencia 6, PR-Q codificada por la secuencia 5, PR-2 codificada por la secuencia 8, PR-N, PR-O, PR-O' codificadas por la secuencia 7A, SAR8.2a codifica por la secuencia 9, SAR8.2b codificada por la secuencia 10, peroxidasa básica de pepino codificada por la secuencia 12 y glucanasa básica de tabaco.
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13. Una planta transgénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, que es una planta seleccionada entre el grupo compuesto por tabaco, zanahoria, girasol, tomate, algodón, sorgo, Petunia y Glycine.
14. Una planta transgénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, que es una planta seleccionada entre el grupo compuesto por Zea mays, Dactylis y Lolium.
15. Una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 14, que es una planta de maíz.
16. Una semilla de una planta transgénica obtenida a partir de una planta de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, donde dicha semilla comprende dicha molécula de ADN quimérico.
17. Una planta resistente a enfermedades producida por un método de la reivindicación 1, donde dicha enfermedad se produce por hongos patógenos.
18. Una planta resistente a enfermedades de acuerdo con la reivindicación 17, donde dichos hongos patógenos se seleccionan entre el grupo compuesto por Phytophtora y Peronospora.
19. Una planta resistente a enfermedades producida por un método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, donde dicha enfermedad se produce por hongos patógenos.
20. Una planta resistente a enfermedades de acuerdo con la reivindicación 19, donde dichos hongos patógenos se seleccionan entre el grupo compuesto por Phytophtora y Peronospora.
21. Un tejido vegetal que expresa constitutivamente niveles inducidos de proteínas relacionadas con la patogénesis de plantas o que expresa constitutivamente niveles de proteínas relacionadas con la patogénesis, que proporcionan un fenotipo resistente a enfermedades, con la condición de que las proteínas relacionadas con la patogénesis sean de origen heterólogo con respecto a la planta a transformar y no sean una quitinasa, donde dicha enfermedad se produce por hongos patógenos.
22. Un tejido vegetal de acuerdo con la reivindicación 21, donde dichos hongos patógenos se seleccionan entre el grupo compuesto por Phytophtora y Peronospora.
23. Un método para proteger una planta contra las lesiones producidas por una enfermedad vegetal, que comprende transformar tejido o células vegetales con una secuencia de ADN quimérico que comprende una primera secuencia de ADN que promueve en una planta la trascripción constitutiva de una segunda secuencia de ADN, y comprendiendo la segunda secuencia de ADN una secuencia codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible o una secuencia codificante que tiene una homología de secuencia substancial con una secuencia codificante de una proteína relacionada con la patogénesis de plantas inducible, de tal forma que la planta transformada presente un fenotipo resistente a enfermedades, y plantar dicha planta transformada en un medio, donde puede producirse la enfermedad, donde dicha proteína relacionada con la patogénesis no es una quitinasa, y donde dicha enfermedad se produce por hongos patógenos.
24. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, donde la segunda secuencia de ADN codifica una proteína relacionada con la patogénesis de plantas del grupo compuesto por PR-1A codificada por la secuencia 1, PR-1B codificada por la secuencia 2, PR-1C codificada por la secuencia 3, PR-R mayoritaria codificada por la secuencia 4, PR-R minoritaria, PR-P codificada por la secuencia 6, PR-Q codificada por secuencia 5, PR-2 codificada por la secuencia 8, PR-N, PR-O, PR-O' codificadas por la secuencia 7A, SAR8.2a codifica por la secuencia 9, SAR8.2b codificada por la secuencia 10, peroxidasa básica de pepino codificada por la secuencia 12 y glucanasa básica de tabaco.
25. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, donde los hongos patógenos son los seleccionados entre el grupo compuesto por Phytophtora y Peronospora.
26. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, donde la planta a proteger es una planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 20.
27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, donde la planta a proteger es una planta seleccionada entre el grupo compuesto por tabaco, zanahoria, girasol, tomate, algodón, sorgo, Petunia y Glycine.
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28. Un método de acuerdo con la reivindicación 27, donde la planta a proteger es una planta seleccionada entre el grupo compuesto por Zea mays, Dactylis y Lolium.
29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28, donde la planta a proteger es una planta de maíz.
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