JPH0335783A - 耐病性トランスジェニック植物 - Google Patents

耐病性トランスジェニック植物

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JPH0335783A
JPH0335783A JP2076564A JP7656490A JPH0335783A JP H0335783 A JPH0335783 A JP H0335783A JP 2076564 A JP2076564 A JP 2076564A JP 7656490 A JP7656490 A JP 7656490A JP H0335783 A JPH0335783 A JP H0335783A
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plant
dna
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JP2076564A
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John A Ryals
ジョン　エー．ライアルス
Danny C Alexander
ダニイ　シー．アレクサンダー
Robert M Goodman
ロバート　エム．グッドマン
Frederick Meins Jr
フレデリック　マインス　ジュニア
George B Payne
ジョージ　ビー．ペイン
Jeffrey R Stinson
ジェフレイ　アール．スティンソン
Jean-Marc Neuhaus
ヤーン‐マルク　ノイハウス
Mary B Moyer
マリイ　ビー．モイヤー
Eric Russell Ward
エリック　リッセル　ワード
Shericca Cherrer Williams
シェリカ　チェラー　ウイリアムス
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はトランスジェニック耐病性植物をつくるために
有用なキメラＤＮＡ構築物に関し、また、耐病性の表現
型をつくるための植物の遺伝工学に関するものである。
特に、これは発病関連蛋白（ＰＲＰｓ）をコードするＤ
ＮＡ配列のトランスジェニック植物にかける構成的発現
に関するものである。野生型ｌａ物は病原誘埠全身性獲
得耐性中にＰＲＰｓを発現する。
（ｇＥ米の技術ｐよひ発明が解決しようとする課題）植
物形質転換りよび再生技術の進歩と組合わさった組換え
ＤＮＡ技術の進歩は、新しい遺伝材料を植物細胞、植物
ｌたは植物組織に導入して、したがって新しい特色、例
えば表現型を導入することが可能となり、これは植物ま
たは植物組織の価値を高める。遺伝的に加工した病原体
（ｇ−ロッパ特許第０２４０５５２号釦よびヨーロッパ
特許第０２２３４５２号）、會たは昆虫（ベック等１９
８７年）に耐性の植物および除草剤耐性植物の製造（ド
ブロック等、１９８７年）が最近示されたことは農作物
改良の可能性を強調するものである。目標の農作物は樹
木や潅木のような木質の植物から装飾用植物オで、また
畑作物までの範囲に広がる。
（課題を解決するための手段） 耐病性トランスジェニック植物の製造は、とυわけ、ト
ランスジェニック耐病性植物をつくるために有用なキメ
ラＤＮＡ構築物を目的とする本発明によって今や実現で
きる。キメラＤＮＡ構築物には、正常には野生型植物に
おいて病原誘導性の植物ＰＲＰｓをコードするコードＤ
ＮＡ配列、シよびキメラＤＮＡ構築物を含むトランスジ
ェニック植物にかいてＰＲＰｓｔたはＰＲＰｓのための
、アンチセンスｍＲＮＡを構成的に発現するプロモータ
ーＤＮＡ配列が含まれる。
Ａ０発病関連蛋白：全身性獲得耐性（ＳＡＲ）いわゆる
発病関連蛋白（ＰＲＰｓ　）は病原体の感染に続いて誘
導される植物蛋白である。これらの蛋白は植物に全身性
獲得耐性を与え名役割を持っていると信じられている。
これらの植物蛋白はウィルス、細菌およびカビを含む種
々の病原体の感染に反応して多量に誘導される。
ＰＲＰｓＨタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）感染に過
敏に反応するタバコ植物にコチアナタバクムＮ１ｃｏｔ
ｉａｎｓｉ　ｔａｂａｃｕｍ　）で初めて見い出された
。次いでＰＲＰｓ＃ｉ多くの檜物橿で見い出され（総説
１−４Ｖドに７４１９８３年、Ｒｅｄｏｌｆｉ　　１９
８３；パンルーｙ１９８５年、ｖａｎＬｏｏｎ、１１３
５参１＠）、病原体感染に対する植物の共通の防禦反応
であると信じられている。
本明細書において、、ＰＲＰｓは病原体に対して過敏に
反応する植物にかいて発現される蛋白を云う、コノ語は
、５ＡＲａ２ａ＞ｊび５ＡＲａ２ｂ蛋白、タバコＰＲ−
１ａ、、ＰＲ−１ｂ、　ＰＲ−１ｃ、　ＰＲ−１′、Ｐ
Ｒ−２；　ＰＲ−Ｎ、　ＰＲ−０、ＰＲ−０’、ＰＲ−
Ｐ。
ＰＲ−Ｑ、、ＰＲ−３，ＰＲ−Ｒ蛋白の酸性釦よび塩基
性型、ＰＲ−Ｐ筐たはＰＲ−Ｑの塩基性対応体であるキ
チナーゼ、およびＰＲ−２、ＰＲ−ＮまたはＰＲ−０の
塩基性対応体であるβ−１，３−グルカナーゼ（グルカ
ン　エンド−１，５−β−グルコシダーゼ、ＥＣＣ１０
１，５９）　：ｉ？よびキュウリの病原体誘導性キチナ
ーゼを含むが、これらに限定されるものではない、過敏
な反応とは、病原体感染部位のぼ最周辺の組織の局所的
壊死および引続く病原体の局在で特徴づけられる。これ
は病原体が植物全体に広がる感受性反応と対比される。
病原体とは、例えばウィルス渣たはウィロイド、例えば
タバコ筐たはキュウリ　モザイク　ウィルス、軸点ウィ
ルス筐たは壊死ウィルス、テンジクアオイ縮葉ウィルス
、赤りローバー斑絞ウィルス、トマ）Ｍ木理化ウィルス
その他のウィルス、カビ、例えばフィトフトラバラシテ
ィ力（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｐａｒａｓｉｔｉｃ
ａ　）　ｔたはベロノスポラ　タパシナ（Ｐｅｒｏｎｏ
ｓｐｏｒａ　ｔａ　−ｂｓｚｃｉｎａ　）％細菌、例え
ばシュードモナス　シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　ｓｙｒｉｎｇａｅ　）またはシェードモナス　タバコ
（Ｒｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔａｂａｃｉ　）、ｌたは
アブラムシ、例えばミズス　ベルシケ（Ｍｙｚｕｍ　ｐ
ｅｒｓｉｃａｅ　）である、この表はいかなる観点から
も限定的意味はない。
Ｂ、植物形質転換の一般的概観 植物および植物組織の遺伝的形質転換（すなわち、外米
ＤＮＡの植物への安定な導入）を行うために、種々の方
法がこの分野で公知である。
これらにはアグロバクテリウム（へｇｔｏｂａ’ｃｔｅ
ｒｉｕｍ；撞による形質転換および直接遺伝子導入によ
る形質転換が含まれる。
アグロバクテリウム　テ瓢メファシエンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）は広い
範囲の双子葉植物および裸子植物の病気であるクラウン
ゴールの病固体であう、感染部位に植物組織にかける繍
瘍筐たは虫こぶの形成を起す。通常は傷害部位で植物に
感染するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　）はＴｉ（ＩＩ！ｌ瘍誘導ｔｕｍｏｒ　−ｉｎｄ
ｕｃｉｎｇ　）プラスミドと呼ばれる大きな染色体外素
子を運ぶ、ＴＩプラスミドは腫瘍原性のために必要な２
つの領域を含む、１つの領域は植物ゲノムＤＮＡＫ最終
的には安定に導入されることがわかっているＤＮＡ配列
であるＴ−ＤＮＡ（トランスフアートＤＮＡ　）である
。ｍ瘍原性に必要なもう一つの領域は導入機構に関係す
るｖｉｒ　Ｌピルレンス）＠域である。　ｖｉｒ領域が
安定な形質転換に絶対に必要ではあるが、マ１ｒＤＮＡ
は実際には感染された植物に導入されるわけではない。
アグロバクテリウム　テユメファシエ／ス（Ａ、　ｔｕ
ｍｅｆｉｃｉｅｎｓ　）感染で仲介される植物細胞の形
質転換と引１ｆ（Ｔ−ＤＮＡのみの導入は十分に報告さ
れている（ベバン　アンドチルトｙ　　１９Ｂ２年、Ｂ
ｅｖａｎ　ａｎｄ　Ｃｈｉｌｔｏｎ。
１９８２）。
多くの研究室にかける数年間の激烈な研究の後ζアグロ
バクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）系は種
々の植物組織の形質転換を定常的に行えるように発展し
た。この方法により形質転換された代表的な組織にはタ
バコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、ナタネ、ポテト、ダイ
スおよびポプラが含まれる。感染体としてアグロパクテ
リウムテユメファシエンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆｓ＋ｃｉ
ｅｎｓ　）を使用するＴｉプラスミド形質転換の宿主域
は非常に広いが、操作の容易さからタバコが宿主として
選択される。
アグロバクテリウム　リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃ−ｔ
ｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　）も植物形質転換
のベクターとして使用される。多くの双子葉植物種に毛
様板形成を刺激するこの細菌は、アグロバクテリウム　
テエメファシエンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　
）のＴｉプラスミドと同様に機能するＲｉ　（根誘導ｒ
−ｏａｔ−ｊｎｄｕｃｎｇ　）プラスミドと呼ばれる大
きな染色体外素子を運ぶ。アグロバクテリウム　リゾゲ
ネシス（Ａ、　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓｉｓ　）　ｆ使っ
た形質転換はアグロバクテリウム　テエメファシエンス
（Ａ、　ｔｕｔｎｅｆａｃｉｅｎｓ　）のものと同様に
開発され、例えばアルファルファ、ソラナム　ニゲラム
リンネ（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｎｉｇｒｕｍ　Ｌ、ンおよび
ポプラを形質転換するために利用して成功している。
２　直接遺伝子導入 アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）
　中間体を使用しないで植物および植物組織を形質転換
するため、いくつかのいわゆる直接遺伝子導入法が開発
された。プロトプラストの直接形質壱ム 転換にかいて、外圧の遺伝物質のプロトプラストへの木
地４ｎ化学薬剤または電場の使用によって強化される。
その時、外在物質は核ゲノムに組込１れる。初期の研究
は双子１１！植物のタバコで行われ、外来のＤＮＡが取
込１れ、子孫ｍ物に伝播することが示された（パブコラ
スキー等、１９８４年ｓ　Ｐｍｓｚｋｏｗｓｋｉ　ｅｔ
　１）（ａ）−、１９８ａ　；ボ）　ＩＪカス等、１９
８５年、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　ａｔ　１）（ａ）、、　１
９８５　）。
単子葉植物のプロトプラストもこの方法で形質転換され
、例えばトリティカム　モノコヵム（Ｔｒ　ｉ　ｔ　ｉ
ｃｕｍ　ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ　）、ロリウム　マルテ
ィ７ｏラム（Ｌｏｌｉｕｍ　ｍｕｌ　ｔｉｆ　ｆｏｒｕ
ｍ　）　（イタリアライグラス）、ノイズおよびブラッ
クメキシカンスイートコーンである。
別法として、外在ＤＮＡを微量注入法によって細胞また
はプロトプラストに導入することができる。プラスミド
ＤＮＡ溶液を、通常ｉｊａ＜伸ばしたガラス針を使って
細胞内に直接機械的に注入する。この方法で、アルファ
ルファプロドグラストを種々のプラス建ドによって形質
転換できた（ライヒ等１９８６年、Ｒｅ１ｃｈ　ｅｔ　
１）（ａ）。
ｔ９８６）。
直接遺伝子導入のために極〈最近開発された方法には、
ＤＮＡを運ぶ微細発射体によう細胞を攻撃することが含
まれる（クライン等、１９８７年、　Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ
　１）（ａ）、、　１９８７　）。この方法に分いては
、外米ＤＮＡで被慎したタングステン粒子を目標細胞に
受って加速源ぜ、実施例に報告するように、少くとも一
時的な発現が得られる（タマネギ）。
Ｃ０形質転換植物組織の再生 植物組織の形質転換のために・種々の方法があるのと同
様に、植物組織からの植物の再生のために種々の方法が
ある。再生する方法は再生させるべき出発の植物組織お
よび植物種に依存する。近年、多くの種の植物を植物移
植体から出たカルス組織から再生させることが可能にな
ってきた。カルスから再生させることができた植物には
コーン、コメ、オオムギ、コムギ、ライムギのような単
子葉植物、釦よびトマト、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、ナ
タネおよびタバコのような双子葉植物が含１れる。
アグロバクテリウム　テエメファシェンス（Ａ、　ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）で形質転換した組織からの植物
の再生はいくつかの種の植物で示された。これらにはヒ
マワリ、トマト、白クロージー　ナタネ、ワタ、タバコ
シよびポプラが台筐れている。アグロバクテリウム　リ
ゾゲネス（Ａ。
ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　）で形質転換した組織からのア
ルファルファの再生も示された。プロトプラストからの
植物再生は特に有用な技術である（エバンス　アンド　
ブラボ、１９８５年、Ｅｖａｎｓ　ａｎｄＢｒａｖｏ、
１９８３）、植物種がプロトプラストから再生されると
、直接遺伝子導入法を使用でき、形質転換はアクロバク
テリウム　テユメフアシ、ｚ　ｙ　ｘ　（Ａ、　ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ　）の使用に依存しない。
プロトプラストからの植物再生はコメ、タバコ、ナタネ
、ポテト、ナス、キュウリ、ポプラ、およびコーンで示
された。
種々の植物組織が外米ＤＮＡを使った形質転換に利用で
きる０例えば、トマトの子葉苗条培養がアクロバクテリ
ウム　（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）仲介形質転換
および植物の再生に利用された（ヨーロッパ特許第０２
４９４３２号）、その他の例にはブラシカ（Ｂｒａｓｓ
ｉｃｉ　）橿（ＷＯ８７１０７２９９）　ｋよび木質の
植物種、特にポプラ（アメリカ特許第４，７９５，８５
５号）が台筐れる。
Ｄ６発明の分野 本発明の一つの目的は植物ＰＲＰｓｔたは実質的に相同
の蛋白の誘導されたレベルを！ｌＩ或的に発現するトラ
ンスジェニック植物を提供することである。更にもう一
つの目的は野生型植物について高められた耐病性表現型
を与える、そのような蛋白を構成的に発現しているトラ
ンスジェニック植物を提供することである。本発明のも
う一つの目的は、植物ＰＲＰｓをコードするＤＮＡ配列
のセンスまたはアンチセンスｍＲＮＡ鎖を構成的に転写
するか、または植物ＰＲＰｓをコードするゲノムまたは
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列と実質的に相同のＤＮＡ配列のセン
スまたはアンチセンスｍＲＮＡ＠を構成的に転写してい
るトランスジェニック植物で、そのトランスジェニック
植物がこれによシ野生型植物に関して高められた耐病性
表現型を持つものを提供することである。
したがって、これらの目的およびその他に合致するため
に、ここに開示された本発明は、（ａｔ　　植物におい
て第２のＤＮＡ配列の構成的転写を増進する第１のＤＮ
Ａ、ｂよび誘導性植物ＰＲＰｓのコード配列、または、
誘導性植物ＰＲＰｓのコード配列と実質的に相同の配列
を持つコード配列を含むトランスジェニック耐病性植物
をつくるに有用なキメラＤＮＡ構築物。
（ｂｌ　　このようなキメラＤＮＡ構築物を含むベクタ
ー：訃よび （ｃ）　　ｊｔ病性植物をつくるためのキメラＤＮＡ構
築物を含むトランスジェニック植物、トランスジェニッ
ク植物組織、零余子、トランジェニック種物の種子を含
む 特に、本発明は （ａ）　　Ｎｉ物にかいて第二のＤＮＡ配列の構成的転
写を増進する第一のＤＮＡ配列、および（ｂ）　　誘導
性植物発病関連蛋白のコード配列、または誘導性植物発
病関連蛋白のコード配列と実質的に相同の配列を持つコ
ード配列を言む第二のＤＮＡ配列で、その第二のＤＮＡ
配列は上記の第一のＤＮＡ配列についてセンス筐たはア
ンチセンス方向いずれかＫあるもの５を含むキメラＤＮ
Ａ配列に関するものである。
本発明の目的内で望ましいものは、第一のＤＮＡ配列が
第二のＤＮＡ配列について異る起源のものであるキメラ
ＤＮＡ配列である。
特に望ましいものは、第一のＤＮＡ配列がタバコリブロ
ースビスホスフェートカルポキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣ
Ｏ）の小サブユニットのプロモーターまたは二重ＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーターを含むキメラＤＮＡ配列である。
キメラＤＮＡの第二のＤＮＡ配列は、ＰＲ−１Ａ、ＰＲ
−ＩＢ、、ＰＲ−Ｉ　Ｃ、、ＰＲ−ＲメイジャーＰＲ−
Ｒマイナー　ＰＲ−Ｐ、、ＰＲ−Ｑ、　ＰＲ−２、ＰＲ
−Ｎ、ＰＲ−Ｏ、ＰＲ−０’、５ＡＰＩＩＬ２ａ、ＳＡ
Ｒ＆２ｂ。
キュウリキチナーゼ／リゾチーム、キュウリ塩基性ペル
オキシダーゼ、タバコ塩基性グルカナーゼレよびタバコ
塩基性キチナーゼからなる群から選ばれた植物発病関連
蛋白をコードすることが望ましい。
筐た望筐しいものは、第二のＤＮＡ配列が、ＰＲ−１Ａ
、ＰＲ−Ｉ　Ｂ、、ＰＲ−１Ｃ、ＰＲ−ＲメイジャＰＲ
−Ｒマイナー　ＰＲ−Ｐ、、ＰＲ−Ｑ、、ＰＲ−０’、
５ＡＲ１Ｌ２ａ、５ＡＲａ２ｂ、＊ｓ−’７リキーｙ−
ナーゼ／リゾチーム、タバコ塩基性クルカナーゼＤよひ
タバコ塩基性キチナーゼからなる群から選ばれた植物発
病関連蛋白をコードするような、キメラＤＮＡ配列であ
る。
特に望筐しいものは、第二のＤＮＡ配列が、ＰＲ−Ｒメ
イジャー　ＰＲ−Ｒマイナー　ＰＲ−Ｐ。
ＰＲ−Ｑ、、ＰＲ−２、ＰＲ−Ｎ、、ＰＲ−０，、ＰＲ
−Ｏ′、ＳＡＲ８．２　ａ％５ＡＲａ２ｂ、キｓ−’７
　！Ｊ　　’Ｐ　ｆ　す”ｙ！　／　’Ｉ　”／チーム
、キュウリ塩基性ペルオキシダーゼ、タバコ塩基性グル
カナーセおよびタバコ塩基性キチナーゼからなる群から
選ばれた植物発病関連蛋白をコードするような、キメラ
ＤＮＡ配列である。
本発明に更に含ちれているものは、本発明によるキメラ
ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子である。
望普しくは、本発明はベクター分子である組換えＤＮＡ
に関するものである。特に望ましいものはｐｃＧＮｊ７
０３を含むベクター分子である。
本発明の史なる実ｍＤ様は、 （ａ）　　例えば植物ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子またはＣａ
ＭＶケノムのような好適な起源から、４［物にかける第
二のＤＮＡ配列の構成的に転写を増進する第一のＤＮＡ
配列を調製すること； （ｂ）　　感染した病原体から、筐たは感染釦よび非感
染の植物繊紙から、誘導され、筐たＦ′ｉ誘導すよび非
誘導両方のＤＮＡ集団を含むＤＮＡライブラリーを調製
し、それから誘導性植物発病関連蛋白のコード配列、ま
たは誘導性植物発病関連蛋白のコード配列と実質的に相
同配列を持つコード配列を含む第二のＤＮＡ配列を分離
すること：かよひ （ＣＪ　　本技術分野で公知の方法を使い、第一のＤＮ
Ａ配列が第二のＤＮＡ配列の転写をプロモートするよう
にステップ（ａ）の第一のＤＮＡ配列とステップ（ｂ）
の第二のＤＮＡ配列との連結操作を行うこと を含むような、上記のキメラＤＮＡ配列の製造方法に関
するものである。
第一と第二のＤＮＡ配列の連結は、第二のＤＮＡ配列が
上記の第一のＤＮＡ配列に関してセンス筐たはアンチセ
ンス方向のいずれかにあるよう行うことが望ましい。
本発明には、上記のキメラＤＮＡ配列のいずれかを含む
植物、種物組織、植物零余子または種物種子、更にはそ
れらを・製造する方法も金管れる。
本発明の範囲内で望！しいものは、耐病性表現型を提供
する種物発病関連蛋白の誘導レベルを構成的に発現する
トランスジェニック植物である。
史に望ましいものは、耐病性表現型を提供する種物発病
関連蛋白をコードするＤＮＡ配列のセンスまたはアンチ
センス釦を構成的に転写するトランスジェニック植物で
ある。
特に望ましいものは、タバコリブロースビスホスフェー
トカルボキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小サブユニッ
トのプロモーターを含む第一のＤＮＡ配列、シよび、Ｐ
Ｒ−ＩＡ発病関連蛋白のコード配列を含む第二のＤＮＡ
配列で、その第二のＤＮＡ配列は第一のＤＮＡ配列に関
して、第二のＤＮＡ配列のアンチセンス鎖の転写ｔ−第
一のＤＮＡ配列がプロモートするような方向にあるもの
を含む、キメラＤＮＡ配列を含む植物、植物組織、植物
零余子または植物種子である。
インビトロ培養の形筐たは胚筐たは植物全体の一部とし
て存在していてよい植物細胞または組織を、植物にかけ
る第二のＤＮＡ配列の構成的転写をプロモートする第一
のＤＮＡ、および、誘導的植物発病関連蛋白のコード配
列、または誘導的４１に初発病蛋白のコード配列と実質
的に相同の配列を持つコード配列を含む第二のＤＮＡ配
列を含み、この第一のＤＮＡ配列が第二のＤＮＡ配列の
転写をプロモートするように第二のＤＮＡ配列に連結さ
れているキメラＤＮＡ配列を用いて形質転換することを
含む、耐病性表現型を示す植物全体に再生する能力を持
つトランスジェニック植物細胞筐たは植物組織を製造す
る方法をも提供する。
植物細胞筐たは植物組織の形質転換は、細胞または組織
培養の一部である分離された植″＃Ｊ細胞筐たは植物組
織、または植物胚またＦｉ植物全体の一部である植物細
胞筐たは植物組織のいずれかを使って、前に記載した形
質転換法により行うことができる。
更に望ましいものは、第二のＤＮＡ配列が上記の第一の
ＤＮＡ配列に関してセンス會たはアンチセンスの方向い
ずれかにあるような、トランスジェニック植物細胞また
は植物組織を製造する方法である。
種物ＰＲＰｓをコードする新規なｃＤＮＡクローンも筐
た提供される。本発明の範囲内において、下記の実質的
に純粋なｃＤＮＡ配列が望ましい：ｆｉｌ　　５ＡＲａ
２ａをコードする実質的に純粋なｃＤＮＡ配列、筐たｔ
！ＳＡＲａ２ｍをコードするｃＤＮＡと実質的な配列相
同性を持つＤＮＡ配列で、特に、１９８９年５月２２Ｅ
３に寄託したＡＴＣＣ受人番号４０５８４のプラスミド
ｐｃＩＢ／ＳＡＲａ２ｇ。
＋２１　　Ｓ　Ａ　Ｒａ　２　ｂをコードする実質的に
純粋なｃＤＮＡ配列、または５ＡＲａ２ｂ　ｆ＝＋−ド
するｃＤＮＡと実質的な配列相同性を持つＤＮＡ配列で
、特に１９８９年３月２２日に寄託したＡＴＣＣ受入れ
番号４０５８５のプラスミドｐｃＩＢ／ＳＡＲ＆２ｂ。
（３１ＰＲ−Ｐｔ＝ｆｆ−ドする実質的に純粋なｃ　Ｄ
ＮＡ配列、またｑＰＲ−Ｐをコードするｃ　ＤＮＡ　　
と実質的な配列相同性を持つＤＮＡ配列で、特に１９８
９年３月２４日に寄託したＡＴＣＣ受入番号４０５８Ｂ
のプラスミドｐＢｓｃｈｔ２８゜（４１Ｐ　Ｒ−２をコ
ードする実質的に純粋なｃＤＮＡ配列、ｉたばＰＲ−２
をコードするｃ　ＤＮＡ　　と実質的な配列相同性を持
つＤＮＡ配列で、特に、１９８９年１０月１９日に寄託
したＡＴＣＣ受人番号４０６９１のプラスミド９ＢＳＧ
Ｌ１５４゜＋５１　　Ｐ　Ｒ−Ｎをコードする実質的に
純粋なｃ　ＤＮＡ配列、またはＰＲ−Ｎをコードするｃ
　ＤＮＡ　　と実質的な配列相同性を持つＤＮＡ配列で
、特に１９８９年１０月１９ｆ３に寄託したＡＴＣＣ受
入番号４０６８９のプラスミドｐＢＳＧＬ　１４　Ｂ。
（６１Ｐ　Ｒ−０をコードする実質的に純粋なｃＤＮＡ
配列、またはＰＲ−０をコードするｃＤＮＡ　　と実質
的な配列相同性を持つＤＮＡ配列で、特に１９８９年１
０月１９日に寄託したＡＴＣＣ受入番号４Ｑ６９０のプ
ラスミド９ＢＳＧＬ１５４゜（７１Ｐ　Ｒ−２’をコー
ドする実質的に純粋なｅＤＮＡ配列、また１ＰＲ−２’
をコードするｃＤＮＡ　　、！；実質的な配列相同性を
持つＤＮＡ配列で、特に１９８９年１０月１９日に寄託
したＡＴＣＣ受入番号４０６８５のプラスミドｐＢＳＧ
Ｌ　１３５゜（８）　　キュウリのペルオキシダーゼを
コードスル実質的に純粋なｃＤＮＡ配列、筐たはキュウ
リのペルオキシダーゼをコードするｃＤＮＡと実質的な
配列相同性を持つＤＮＡで、特に、それぞれ１９８９年
１０月１９日に寄託したＡＴＣＣ受入番号４０６８６の
プラスミドｐＢＰＥＲ１、または１９８９年１０月１９
日に寄託したＡＴＣＣ受人番号４０６８７のプラスミド
　ｐＢＰｔＥＲＢ２４゜ （９）「配列６」の、または「配列６」に示した配列と
実質的な配列相同性を持つ実質的に純粋なりＮＡ配列。
Ｑｌ　　ｒ配列９」の、または「配列９」に示した配列
と実質的な配列相同性を持つ実質的に純粋なりＮＡ配列
。
α力　「配列１０」の、または「配列１０」に示した配
列と実質的な配列相同性を持つ実質的に純粋なりＮＡ配
列。
（ａ）　　ｎ導または非誘導のｃＤＮＡ集団からの一本
＠ｃＤＮＡで、その誘導管たは非誘導の集団からの一本
鎖ｃＤＮＡが相対する極性を持ち、非誘導集団からのｃ
ＤＮＡがビオチン親和性タグを持つものを提供し、 （ｂ）　　ステップ（ａｔの一木調ｃＤＮＡ集団金たが
いにハイブリダイズし：そして （Ｃ）　　−本＠ｃＤＮＡを濃厚化するために、ビオチ
ン−アビジンクロマトグラフィーによシ、非誘導集団か
らのｃＤＮＡにハイブリダイズしない誘導集団からステ
ップ（ｂ）のノ・イブリダイズした混合物を分離するこ
とを含むｃＤＮＡを分別スクリーニングし、濃厚化する
新規な方法をも提供する。
更に、 （耐　生物学的誘導体を使って全身的獲得耐性または限
局性獲得耐性に誘導された組織を提供し、 （ｂ）　　耐病性蛋白をコードするｃＤＮＡクローンを
分離すること を含む耐病性蛋白をコードするｃＤＮＡをクローニング
する方法が提供される。ｃＤＮＡｔ’ｌ病原体感染材料
から分離したＲＮＡが以前につくられていたが、これは
病原体により耐性に誘導された４１ＨＩ！７の非感染部
分から分離されたＲＮＡ力・らｃＤＮＡをつくる最初の
例である。すなわち、組織は病原体で感染されてからす
、獲得耐性を示している。
下記の本実施例のキメラ遺伝子はＰＲＰｓをコードする
植物ｅＤＮＡ配列を含む。しかしながら、本発明はＰＲ
Ｐｓ筐たけそれと実質的相同性を持つ蛋白をコードする
ゲノムクローンや合成相同配列にも同じように適用され
る。したがって、本発明の脣許請求軛囲の領域は開示し
た特定の実施態様に限定されるものではない。
（実施例釦よび発明の効果） Ｅ、実施例 ブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ　Ｔｒｅａｔｙ　）
に基き下記の寄託をＡＴＣＣに行ったニ プラスミド ｐｃＧＮ７８５ ｐＢＳ−Ｇ１ｕｃ３９．１ ｐＢｓｃｕｃｃｈｉ／ｃｈｉｔｉｎａｓｅ（ａｋａ　ｐ
ＢＳｃｕｃｃｈｔ５　） ｐＢＳＧＬ６ｅ。
ＰＣＩＢ／５ＡＲａ２ａ ｐｃＩ　Ｂ／５ＡＲａ２ｂ ｐｃＧＮ１５４０ ｐｃＧＮ２ｆＬ５ ｐＢＳＣｈｔ２Ｂ ｐＢＳＧＬ　１５５ ｐｎｓｐＥＲｔ １）ＢＳＰＥＲＢ２４ ９８ＳＰＥＲＢ２５ ｐＢＳＧＬ　１４８ ｐＢｓＧＬ１３４ ｐＢｓＧＬ　ｊ　１７ ｐＢｓＧＩｊ２５ λｔｏｂｃＤＮＡＧＬ　ｔ　６２　＊ λｔｏｂｃＤＮＡＧＬ　１５　Ｓ　＊ λｔｏｂｃＤＮＡＧＬ　１６　ｊ　＊ 本エシェリヒア　コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ＡＴＣＣ 受入轟 ７Ｂ６８ 寄託臼 １９８６年１２月２３８ １９８ａ年１２月２９日 １９８８年１２月２９日 １９８９年　１月１８Ｂ １９８９年　３月２２日 １９８９年　５月２２日 １９８９年　３月２２日 １９８９年　３月２２日 １９８９年　３月２４日 １９８９年１０月１９日 １９８９年１０月１９日 １９８９年１０月１９日 １９８９年１０月１９日 １９８９年１０月１９日 １９８９年１０月１９日 １９８９年１０月１９日 １９８９年１０月１９日 １９８９年１０月１９日 １９８９年１０月１９日 １９８９年１０月１９Ｂ ＣＯ目）中で 定義 明細書および特許請求の範囲を、明解に６尾−員して理
解して貰うため、また用語に与えられた範囲も含めてｆ
記の定義を行う： 質の部分を含むＤＮＡ配列、例えば天然に存在する状態
で関連しない天然のＤＮＡ配列から誘導された複数の部
分、または合成起源で天然に見い出されない少くとも一
つの部分を含む。
に、細胞のポリペプチドを形成するに到るＤＮＡ配列。
構成的転写：）ｆ４囲の条件に関係なく実質的に一定量
のＤＮＡ配列の転写。
遺伝子二　個別的な細胞生産物に対して責任を持つ個別
の染色体領域。
誘導体：　誘導体が存在しない場合に見られる量に比収
して、よシ多量の高分子物の産生を引起す分子。
誘導性蛋白：　環境に誘導体が存在することによってそ
の産生速度が増大する蛋白。
列と関連して、細胞のポリペプチド形成に到るように翻
訳されないＤＮＡ配列、したがって、例えば一つのコー
ド配列と関連した時に非コードである配列ももう一つの
コード筐たけ非コード配列と関連すると実際はコードで
ある場合がある。
秦できる性質。
植物組ｗｋ：苗筐たは培養での植物のいかなる組織。こ
の用語は、限定的ではないが、植物全体、植ｖＪ細胞、
植物器官、植物種子、プロドブ５ス）、カルス、細胞培
養釦よび構造的および／普たは機能的単位に有機化され
た植物細胞のいかなるグループをも含む。上記に表示し
た。さもなければ、この定義に含まれる植物組織のいか
なる特定のタイプと結びつけて、筐たＶｉ無関係に使用
したとしても他のいかなるタイプの植物組織を除外して
いるわけではない。
熱源から実質的に純粋な形で分離されたＤＮＡ配列。そ
のような配列は天然の系、例えば細菌、ウィルス筐たは
植物筐たは動′ａｊ細胞に存在するか、筐たは例えば合
成手段にょｂｌまたはｃＤＮＡ配列として供給され得る
。実質的に純粋なりＮＡ配列は目的のＤＮＡを含むベク
ターの形で使用できるようにして分離される。実質的に
純粋とは目的のもの以外のＤＮＡ配列がわずかのみ、例
えば５％未満、１優未満、または望筐しくばｕｔ１未満
で存在することを意味する。実質的に純粋なりＮＡ配列
およびそれを含むベクターは、それが典型的であるが、
溶液で、例えば緩衝液を含む水溶液で、筐たは普通の培
養液で供給される。
、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の近い構造的関係
を意味する。例えば、実質的に相同のＤＮＡ配列は６０
％相同、望筐しくＶｉａ　。
優また＃′１９０ｅｓ相同であり１実質的に相同のアミ
ノ酸配列は典型的にはｓｏ、１以上の相同をいう。相同
性ＶＣは１筐た灯いくっかのヌクレオチド筐たはアミノ
酸のサブ配列が失われていたシ、筐たは余分のヌクレオ
チド筐たはアミノ酸のサブ配列が中に分散してる関係も
含む。
号 ＭＶ ＰＬＣ ｖｃｐｍ Ｗ／　ｖ ＣＦ ＡＧＥ 塩基対 キロ＃１基対 アメリカン　タイプカルチャー　コレクシ１ン、ロック
ビル、メリーランド州 タバコ　モザイク　ウィルス 高圧液体クロマトグラフィー １分当９のセレンコツ（Ｃｅｒｅｎｋｏｖ　）カウント 特に記さないかぎシ重量／容積 細胞内液 ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＣＲ ＰＣｖ Ｗ ＧＴ ＴＰ ＳＡ ＥＴＡＢ ２．４−Ｄ ＴＴ ｄ　ｉ　ｃ　ａｍｂ　ａ ＤＴＡ ポリメラーゼ触媒鎖反応 圧縮細胞容積：ピペット中の沈降細 胞容積 分子量 低ゲル化温度 アデノシン　トリホスフェート ウシ血清アルブミン ヘキサデシルトリメチルアンモニウム　ブロマイド ２．４−ジクロロフェノキシ酢酸 ジチオスレイトール ムロ−ジクロロ−２−メトキシ安息 香酸 エチレンジアミンＮ、　Ｎ、　Ｎ’、　Ｎ’−テＥＳ Ｕ トラ酢酸 ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスル ホン酸 ４−メチルウンベリフェリル　グル クロニド ＥＧ ポリエチレン　グリコール ４−アミノームＳ、６−１リクロロビ コリン酸 ドデシル硫酸ナトリウム トリフルオロ酢酸 トリス（ヒドロキシメチル）メチル アミン塩酸 発病関連蛋白 コウシ楊アルカリホスファターゼ フェニルチオヒダントイン リブロース−１，５−ビス−ホスフェ ートカルボキシラーゼ ＮＡＡ　　　　α−ナフタレン酢酸 ＢＡＰ　　　　６−ベンジルアミノプリンＦＡ ＤＳ ｐｉｃｌｏｒａｗｎ ＲＰ ＩＡＰ ＴＨ ＲＵＢＩＳＣＯ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。
特に指示のない場合には、酵素反応は製造者推奨の方法
にしたがって行う０本発明のキメラ遺伝子およびベクタ
ーは本技術分野で公知の手法を使って構築する。好適な
手法がマニアチス等（１９８２年）　Ｍａｎｉａｔｉｓ
　（１９８２）　：メンーヅイン　エンザイモロジー　
６８％、１００巻、１０１巻しよび１１８巻（１９７９
年、１９８３年、１９８９年および１９８６年）、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｍｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　　Ｖｏｌ
ｕｍｅｓ　　６　８．１００．１０１ａ（１ｄ　　１１
８）１９７９，１９８３，１９８３ａｎｄ１９８６）：
　釦よびグローパー（１９８５年）、Ｇｌｏｖｅｒ　（
１９８５）に記載されている。培地組Ｗ、ｈミ５−（１
９７２年）、Ｍｉ目ｅｒ（１９７２）。
釦よび前に示した参考文献に記載されている。
５Ｈ−０培地：　ホルモンなしのシェンク　アンド　ヒ
ルデブランド（１９７２年）、５ｃｈｅｎｋａｎｄ　Ｈ
ｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ　（１９７２）の培地。ＳＨ培地
は液体管たばα８悌寒天筐たは（Ｌ５多Ｇｅ１Ｒｉｔｅ
■で固体化できる。この培地はオートクレーブ中、約１
２５℃１５乃至２０分で正常に熱滅菌される。
５Ｒ−３０培地：　　３０　ｐｍ　Ｄｉｃａｍｂａを含
む５Ｈ−０培地つ ５Ｈ−４５培地：　　ａ　５　ａｍ　Ｄｉｃａｍｂａを
含む５Ｈ−Ｏ培地。
０ＭＳ培地：　ムラシゲ　アンド　スクーグ（１９６２
年）、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　（１
９６２）の培地。この培地はＣＬ５％寒天豊寒天子ガロ
ースにより、！たＦｉ１１５％Ｇｅ１Ｒｉｔ町により固
化させてよい。
微量成分”ｂよびＦｅ−ＥＰＴＡＬｆｉ文献に示されて
いる：カオ　アンド　ミカイルク（１９７５年）、Ｋａ
ｏ　ａｎｄＭｉｃｈａｙｌｕｋ（１９７５）　ＫｊルＫ
Ｍ培地；チュー等（１９７５手）、Ｃｈｕ　ｅｔ　１）
（ａ）（１９７５）によるＮ６培地。
有機物かよひビタミンｅ［ｗｔ」 ビオチン ピリドキシン−ＨＣｔ チアミン−ＨＣｔ ニコチンアミド ニコチン酸 葉酸 Ｄ−Ｃａ−パントチネート ｐ−アミノ安息香酸 Ｑ、０１ １．００ ｔｃｔｏ。
Ｌ１０ α４０ １．００ 化０２ １１．５ α１ （Ｌ５ 塩化コリン　　　　　　　　　　　　　　１．００リボ
フラビン　　　　　　　　　　　（１２０ビタミンＢ１
２　　　　　　　　　　　　α０２グリシン　　　　　
　　　　　　　　　０．１０Ｓおよび糖アルコールＬｙ
／ｌコニ 蔗糖　　　　　　　　　　ＣＬ２５ グルコース　　　　　　　６ａ４０ マンニトール　　　　　　　０．２５ ンルビトール　　　　　　　（Ｌ２５ セロビオース　　　　　　　ＣＬ２５ フラクトース　　　　　　　ａ、２５ マンノース　　　　　　　　ａ２５ ラムノース　　　　　　　　ＣＬ２５ リボース　　　　　　　　　α２５ キシロース　　　　　　　　（Ｌ２５ ミオ−イノシトール　　　ａ、１０ ＆終ｐＨ−８ 殺菌　　　　　　　　　　　　フィルターＣＬＯ オートクレーブ ａ　大量成分は一般に１０ Ｘ嬢（保存溶液とし てつ〈９、微量成分は１０００ｘ濃度保存溶液としてつ
くる。
ｂ　クエン酸、フマルｅＲカよびリンーｆｔｌｌｃ各４
０噌／を終＃度）およびピルビン酸ナトリウム（２０ｒ
ｌＩｇ／／、Ｒ１１度）ｔｉＩＱＯｘ濃度保存溶液とし
て′ｇ４＃シ、ＮＨ４ＯＨでｐＨ６，５ＫｖＩ４贅して
この培地に加える。
Ｃアデニン（α１η／Ｌ終ａ度）、しよびグアニン、チ
ミジン、ウラシル、ヒボキサンチンおよびシトシン（各
［Ｌ０３１７ダ／Ｌ＃！濃度）′ｋＩＱＯＱｘｇ度保存
溶液としてｗ４製し、ＮＨ４ＯＨでｐＨ瓜５に調整して
この培地に加える。
ｄ　　１０ｘ保存溶液（ＮＨ４０ＨでｐＨ＆５）を使っ
て下記のアミノ酸をこの培地に加え、示した終ｆ＃１度
にする： グルタミン（Ｓ、６η／ｌ）、アラニン、グルタミニ４
（各１１６Ｒｙ／ｌ）、システィｙ　（（１２ｗｑ／　
Ｌ　）、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、ヒ
スチジン、インロイシン、ロイシン、リジン、メチオニ
ン、フェニルアラニン、フロリン、セリ／、スレオニン
、）＋７７”）ファン、チロシンおよびバ１１ノ（各（
Ｌ１＋ｙ／ｌ）。
ｅ　ビタミン保存溶液は通常１００×濃度で調製する。
材料 アガロース：　アガａ−スの調製および精製は＊　スｌ
　−７７ド　しｙ（１９７５年）、Ｇｕｉｓｅ−１ｅｙ
　ａｎｄ　Ｒｅｎｎ　（１９７５）　　によって記載さ
れている。アン！／ロースは寒天の成分の一つである。
市販の寒天は通常中性のアガロースおよび多数の側基を
持つイオン性アガロペクチンの混合物からなっている０
通常側鎖のいくつかはその１１で残シ、ゲル形成および
融解温度のようなアガロースの理化学的性質を決める。
低融点アガロース、特に５ｅａＰ１ａｑｕｅ■アガロー
スは望ましい固化剤である。
カゼイン加水分解物：　ウシ乳からのカゼイン加水分解
物−酵素加水分解、タイプ１、シグマカンパニー、私書
箱１４５０Ｂ、セントルイス、ミズリー州６３１７８、
アメリカ合衆国Ｌ　Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、、　ＰＤ、　Ｂ
ｏｘｆ　Ａ　５０８．　　Ｓｔ、　Ｌｏａｆｓ。
ＭＯ６ｓ１ｙ８　　ＵＳＡ）。
セルラーゼＲ８：　セルラーセＲ５，ヤクルト本社株式
会社、１．１．１．９東新橋、港区、東京、１０５日本
（Ｙａｋｕｌｔ　Ｈｏｎ５ｈａ　Ｃｏ、、　Ｌｔｄ、、
　　ｔ　１゜１９　　Ｈｉｇａｓｈｉ−３ｈｉｎｂａｓ
ｈｉ、　Ｍｉｎａｔｏ−ｋｕ、　Ｔｏｋｙｏ。
１　０　５　　　　Ｊａｐａｎ　　）　　ｅＧｅｌＲｉ
ｔｅ’ｊり：　　ゲルライト　ゲラン　ガム、スコツト
　ラボラトリーズ　インコーボｖイテッド、フィスカー
ビル、ロードアイランド州０２８２５、アメリカ合衆国
（Ｇｅ１Ｒｉｔｅ　ＧｅｌｌａｎＧｕｍ、　　５ｃｏｔ
ｔ　ＬａｂｏｒＩｌｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ＋、　Ｆｉｓ
ｋｅｒｖｉｌｌｑＲ，１，０２８２３ＵＳＡ　）。
ム　タイム」ランダム　プライマー　キット、インター
ナショナル　バイオテクノａジーズインコーポレイテッ
ド、私書箱１５６５．ニエーヘイブン、コネチカット　
０７６０６．アメリカ合衆国（’Ｐｒｉｍｅ　Ｔｉｍｅ
　’　ｒａｎｄｏｍ　ＰｒｉｍｅｒＫｉｔ、　Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎ１）（ａ）　Ｂｉｏｔｅｃｈ−ｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、。
ＰＯ，Ｂｏｘ　　ｆ　５６５．Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、Ｃ
Ｔ　　０７６０６゜ｔ）ＳＡ）。
デイビジ璽ン　オブ　シブロン　コーボレイシ璽ン、ロ
チヱスター　二ニーヨーク １４６０２、アメリカ合衆国（Ｎ１）（ａ）ｇｅ　Ｃｏ
、、　Ｄｉ　−ｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　５ｙｂｒｏｎ　Ｃ
ｏｒｐ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｎ、Ｙ。
１ａｂ０２．ＵＳＡ）。
Ｐａｒａｆ　ｉ　１ｍ■：　　Ｐａｒａｆｉ１ｍ■ラボ
ラトリ−７４ルム　アメリカン　カンパニー　グリーン
ウィッチ、コネチカット　０６８３０、アメリカ合衆国
（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃａｎ　Ｃｏ＋Ｇｒｅｅｎｗｉｃ
ｈ、　ＣＴ０６ａ３０．ＵＳＡ）。
ィオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ
　）。
アーログ　ゲゼルシャフト　ミツト　ベシ島しンクター
　ハフトウング、Ｄ−４０００ジエッセルドルフ　１３
、ドイツ連邦共和国）（ＤＩＡ−ＬＯＧ　　ＧｍｂＨ，
Ｄ−４０００Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆこの群の実施例は以
下の詳細な実施例を実施するために使用する一般的操作
を記述している。
実施例１　アガロースでの連結 ＤＮＡＱ制限エンドヌクレアーゼ消化し、低融点ＴＡＥ
アガロース　ゲル上で７ラグメントを電気泳動で分離し
た後、適当なフラグメントを含むバンドを切シ出し、試
Ｍ管に入れて６５℃に加熱してアガロースを融解する。
２乃至５μｔを１５μｔの水に加え、その溶液（１−６
５℃で１０分間置く、この溶液を３７℃に冷却し、温度
平衡させるため５分間直く。１０×リガ一ゼｗｋ１１液
（２００ｍＭ　トリス、ｐＨ＆０．１００ｍＭ　ＭｇＧ
４、１００ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＡＴＰ　）　　２
μｔを１μＬのＴ４ＤＮＡＩ＋ガーゼと共に加え、この
溶液を固、化させて１５℃で１夜置く。
適当なりＮＡを含むアガロースを６５℃で１０分間置い
て融解し、この溶液１０μｔをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）
リスｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）３０μＬに加え
、混合して室温に放置する。凍結適合細胞（エシェリヒ
ア　コリＥ、　ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株）を氷水で解凍す
る。上記の希釈ＤＮＡ溶液を細胞２００μｔに加え、２
０分間、氷上に置く。
次いで細胞とＤＮＡを４１℃で９０秒間、加熱シラツク
を行う。次にその細ｆ＆を室温に１０分間置＜、ＳＯＣ
培地（ハチハフ１９８３年、Ｈａｎａ−ｈａｎ、１９８
５）（Ｌ８−を加え、この培ｓ物を３７℃に１時間置く
。この培養物１００μｔをアンピシリン（Ｌ−アンプ）
１００μｆｌｔｔｌを含むＬＢプレート（ミラー　１９
７２年、Ｍｉｌｌｅｒ。
１９７２）上に置き、そのプレートを３７℃に１夜置く
、生残コロニーを拾い、第二の抗生物質プレートに再度
機いて３７℃に一装置く。
実施例５　　ＤＮＡ制限７ラグメントの標識ＤＮＡを適
当な制限酵素で処理し、フラグメン）ＩＬＧＴアガロー
スゲル上での電気泳動で分離する。目的の７ラグメント
を含むバンドを切シ出し、ＤＮＡを＋Ｓ準法で精製する
。このＤＮＡフラグメント５０ηをＩＢＩランダム　プ
ライマー　キットをメーカーの指示通うに使用して標識
する。
実施例４　ゲノムＤＮＡのサザーン　プロッティング タバコＤＮＡ３μｔを檀々の制限酵素を使ってメーカー
の指示した条件下で消化する。そのＤＮＡをフェノール
で抽出し、エタノールで沈殿させ、次いでゲル付加用緩
衝液（１５俤フイコール、α０２５ｔｓブロモフエノー
ル　ブルー１０ｍＭ　ＥＤＴＡ％ｐＨ８）に再懸濁する
。試料をゲルに付加し、（Ｌ５嘩アガロースゲル上、５
ｖｃ！Ｉ１１で、ブロモフェノール　ブルー色素がゲル
の末端に達する筐で電気泳動する。この後、ＤＮＡをジ
ーン　スクリーン　プラス（Ｇｅｎｅ−５ｃｒｅｅｎ　
Ｐｌｕｇ　）に、アルカリ性緩衝液法によりメ゛−カー
によシ記載されたようにして移す。プレハイプリダイゼ
イシッン、ハイブリダイゼイジョンおよび洗浄をメーカ
ーの推奨法に従って行う。ハイプリダイゼイションをオ
ートラジオグラフィーで検出する。
Ｐｓｔ　１部位のＢａｍＨ１部位への転換のための典型
的分子アダプターは配列 ５’　−ＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡ　−３’である。こ
の分子をβ−７アノエチルホルホルアミダイト化字を使
いアプライド　バイオシステムズ　シンセサイザー（Ａ
ｐｐ目ｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＳｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｅｒ　）で合成し、逆相ＨＰＬＣでｎＩｍする。このオ
リゴヌクレオチド約２μｔ２マニアテイス等（１９８２
年、１２５頁）、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　１）（ａ
）（ｆ９８２．ｐ、１２５）にしたがってリン酸化する
。
その後、このオリゴヌクレオチド溶液を水浴中で６５℃
に加熱し、約３０分かけて室温に冷却する。このアニー
ルしたアダプター約１０倍分子的過剰量を消化したＤＮ
Ａにｌ０ＫＩＪガーゼ緩衝液、Ｔ４ＤＮＡＩＩガーセお
よび適当な量の水と共に加える。典型的な反応は以下の
ものである： アダブトさせるべきＤ　Ｎ　Ａ　　１〜２ｔｔｌ（〜１
ｐｍｏｌ）アダプター　　　　　　　　１μｔ（〜１０
ｐｍｏり１０Ｘリガーセ緩衝液　　　　１μｔ Ｔ４ＤＮＡリガー−＋！　　　　　　１μを水　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　５〜６μｔこの溶液を
１２°乃至１５℃で５０分間ｔｊｔき１．６５℃で３０
分加熱してリガーゼを失活させる。
塩濃度と容積を制限酵素消化に適当なように調整し、ア
ダブトしたＤＮＡを消化してアダブトした「スティッキ
ー　エンド（５ｔｉｃｋｙ　ｅｎｄ　）　Ｊを露出笹せ
る。取込１れなかりたアダゲタ−を７ガロースゲルで電
気泳動するか、連続的イングロパノール沈殿で除去する
。
実施例６　プライマー伸長マツピング Ａ、プライマー１甲長のためのプライマーの合成および
５′−末端標識 下記のプライマーオリゴマーをアプライドバイオシステ
ムズ　シンセサイザー（Ａ＋）ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　）　　ｂよびβ−
シアノエチルホスホルアミダイド化学を使って合成スる
： ＰＲ−１：　５’−ＡＴＡＧＴＣＴＴＧＴＴＧＡＧＡＧ
ＴＴ−５’このオリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣで精
製する。各オリゴヌクレオチド５　ｐｍｏｌ　ｋ”Ｐ−
ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏ１．１０ｆｉＣｉ／１ｉ
ｔ）　２００／ｊｃｉを使ってリン酸化する（マニアナ
イス等、１９８２年、１２５頁、Ｍａｎｉａ、ｆｉｓ　
ｅｔ　１）（ａ）　、　１９８２、ｐ１２５）。３７℃
で３０分分間−た後、反応液を１００μｔニ希釈ｔ、、
フェノール／クロロホルムで抽出、次いでキャリアーＲ
ＮＡ　　Ｓｏμりと共に３回沈様させる。最後の沈殿を
Ｉ　Ｘ　１バ一ストランスクリプターゼ緩価Ｋ　（５Ｇ
ｍＭ　）　＋７　ｘ　−ＨＣＬ、　ｐＨ７，５，４０ｍ
ＭＫｃｔ、　５　ｍＭＭｇＣ／４　）に２μＭＯａ度で
再Ｓ渇する。標識オリゴヌクレオチドの比活性ｔｌｌｌ
Ｊ定すると約３×１０・Ｃｖｃｐｍ／ｐｍｏｌである。
Ｂ、全ＲＮＡ調製 全ＲＮＡを本質的に２グリミニ等（１９１３７年）、Ｌ
ａｇｒｉｍｉｎｉ　ｅｔ　ｉｆ、　（ｆ　９８７　）の
記載のようにして調製する。磨枠組ｍを磨砕緩衝液（ラ
グ＋３　ミニ等、１９８７年、Ｌａｇｒｉｍｉｎｉ　ｅ
ｔ　１）（ａ）　、　１９８７　）に２．５　ｔｅｌ／
　ｆ組織で加える。次いで等量のフェノールを加え、乳
濁液をプリンクマン　ポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　
ｐｏｌｙｔｒｏｎ　）でホモケナイズする。
半量のクロロホルムを加え、乳濁液ｆｔ１５分間、緩や
かに混合する。各相を遠心分離で分離し、水相を取る。
ＲＮＡを酢酸ナトリウムを（１３Ｍに、エタノール２．
５容を加えて沈殿させる。沈ｊ１１２を遠７［７分離で
集め、＠耐水２ｒｔｌに再懸濁する。
塩化リチウムを終濃度５Ｍになるように加え、４℃で一
装置く、沈殿を遠心分離で集め、ベレット’２氷冷ａｏ
ｌエタノールで洗浄する。そのベレットを乾燥し、５０
０μｔの滅餉水に再懸濁する。この全ＲＮＡ標品を分光
法で分析する。
別法として、ＲＮＡをカルスから上記のようにして抽出
するが、この時、カルスを約３１Ｉｌｌサイズのサイコ
ロ状に刻み、ポリトロンのステップに進める前に液体窒
素中で磨砕するため予じめ冷却した乳鉢と乳棒に加える
。
Ｃ，ブライマー伸長 全ＲＮＡ５０μｆｉ　５００μｔエツペンドルフチユー
ブで凍結乾燥する。ＲＮＡを放射性標識プローブ溶液３
０μｔに再禰濁し、７０℃で１０分間加熱する。チェー
ンをゆつくりと３７℃に冷却し一装置く。チェーンを３
７℃の水浴から出さずに、１０ｘリバーストランスクリ
プターゼ緩衝液（５００ｍＭ　トリＸ−ＨＣ１％ｐＨ７
，５，４００ｍＭＫＣｌ、　５０ｍＭＭｇＣ１ｚ　）　
２　ａ！、、　　５　〃り／ｄＢＳＡ１μｔ、［ＯＯｍ
ＭＤＴＴ５μｔ１１０ＸｄＮＴＰｓ　（各ｄＮＴｐ　　
１０ｍＭ水浴液）５ｐｔ。
Ｈ，０３μｔ、ＲＮＡアーセ（８０ユニツト）３μｔｂ
よびリバーストランスクリペターゼ（４００ユニツト）
２μＬを加え、反応液ｔ−３７℃に３ａ分間置く。反応
を停止するため、３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨｓ、ｓμＬ
と絶対エタノール１５０μｔを加える。チェーンを一２
０℃で３０分置き、沈殿を遠心分離で集め、８０％エタ
ノールで洗浄し、風乾する。沈殿を付加色素（９０％ホ
ルムアミド、α０５％ブロモフェノールブルー　α０５
％キシレンシアノール、１ｍＭＥＤＴＡ　　１　Ｇ乃至
２０　ａＬＶｃ再懸１４シ、伸長された生成物をオート
ラジオグラフィーで見えるようにする。
セクション２　蛋白の同定と性質 これらの実施例に関したＰＲＰｓを、相当するｅＤＮＡ
を分離し、終局的には七のｃＤＮＡの確認を行うために
％ある場合は初めて、残すは文献の方法にしたがって、
分離、精製し、配列を決定する。
実施例７　ペプチド生成、精製トよぴ自動配列決定 Ａ、還元シよびアルキル化 精製し、凍結乾燥した蛋白を１Ｍトリス−ＨＣｔ、　ｐ
Ｈａ　６　、　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む６Ｍグアニ
ジン−ＨＣｌＶＣ１ａ解する。ＤＴＴを２０ｍＭになる
ように加え、４−ビニルピリジンを終濃度５０ｍＭにな
るように加える。次いでこの試料を窒素雰囲気下に１．
５時間置く。ピリジルエチル化された物質をアカポア（
Ａｑｕａｐｏｒｅ　）　フェニルカラム（Ｚ　Ｉ　Ｘ　
１０５１．ブラウンリー、Ｂｒｏｗ−１ｅｅ）を使った
ＨＰＬＣで脱塩する。カラムを化１１ＴＦＡ中５から８
０％のアセトリトリル：イソプロパノール（１：１）直
線濃度勾配で溶出する。
Ｂ、臭化シアノゲン開裂とピログルタメートの除去 臭化シアノゲン開ａＬｆｔシンプソン　アンドナイＸ（
１９８４年）、ｔ−Ｓｉｍｐｓｏｎ　ａｎｄ　Ｎ１ｃｅ
（１９８４）に（ｆｆ−ｖでイン　シテＳ（ｉｎ　５ｉ
ｔｕ　）で行う。ＰＲ−１蛋白のピログルタメート　ア
ミノペプチダーゼ（べ−ＩＪ　７ガー　マンハイムＢｏ
ｃｈｒｉｒ１ｇｅｒ　Ｍｍｎｎｈｅｉｍ　）による消化
をアレン、ジー、（１９８１年）、Ａ目ｅｎ％Ｇ、（１
９８１）に従って行う。
Ｃ，ＬｙｓＣ消化 蛋白をエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（ベーリンガー
　マンハイム、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ−
ｉｍ　）を使い、α１Ｍ）リスーＨＣ１，ｐＨａＳ中、
室温で２４時間、酵素二基貧化１：１０で消化する。得
られたペプチドを、アカボア（Ａｑｕａｐｏｒｅ　）Ｃ
−８カラム（ＩＸ２２ｔＭ１、ブラウンリーＢｒｏｗｎ
ｌｅｅ　）を使い、α１１ＴＦＡ中、アセトニトリル：
イソ１０パノール（１：１比）の直線濃度勾配（０から
６０％）で浴出して分離する。
Ｄ、　　）リプシン消化 トリプシン（クーパー　Ｃｏｏｐｅｒ　）　　による消
化を、α１Ｍ塩化カルシウムを含む１１１Ｍ重炭酸アン
モニウム、ｐＨａＺ中％　５７℃で５時間、酵素二基貧
化１：１０で行う。生じたペプチドをＬｙｓ−Ｃペプチ
ドと同じ条件でＨＰＬＣによう分離するか、またはαＩ
ＭトリスーＨＣｔ％ｐＨａｓ中、３７℃で２４時間、酵
素：基質比１：５０で行う、ペプチドを、バイダク（Ｖ
ｙｄａｃ　）　　Ｃ−１８カラ！（２，Ｉ　Ｘ　１５０
ｍ）を使１７−、　（１１１ＴＦＡ中、アセトニトリル
：イソプロパノール（１：１）Ｑから６Ｑｔ４（Ｄ直！
！！ｌｆｔ勾配−ｆ’溶出ｆルＨＰＬＣで分離する。
Ｅ、配列決定 自動エドマン（Ｅｄｍａｎ　）分解をアプライド　バィ
オシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
　）　４７０　Ａ気相シーケンサ−を使って行う、ＰＴ
Ｈアミノ酸を７プライド　バイオシステムズ（Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　）　１２０Ａ　ＰＴＨア
ナライザーを使り同定する。
と配列 ｓｍのｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列とＰＲ−１ａ、−
ｂ＞よび−１Ｃ蛋白との相関を、ＰＲ−１３から誘導さ
れた３檀のペプチドの報告された蛋白配列データルよび
ｃＤＮＡクローンから推論される蛋白の一次構造との比
較に基き、コーネリッセン、ビー、ジェイ、シー、等（
１９８６年）、Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ　、　Ｂ、　Ｊ
、　Ｃ，ｅｔ　１）（ａ）、　（１９８６）により元々
釦こなわれる。しかしながら、ＰＲ−１ａと命名された
ｃＤＮＡクローンは５′末端で端を切り、３檀のペプチ
ドの内、２種のみと１残基のミスマツチを持って比較で
きる。下記の実施例で調製し分析されたようにｃＤＮＡ
から推定された、コードされたアミノ酸配列、およびプ
フイツｆ　−ニー　、　：Ｉ−ム等（１９８７年）　、
Ｐｆｉｔｚｎｅｒ　ｓＵ、Ｍ、　ｅｔ　１）（ａ）、、
　（１９８７）、かものＰＲ−Ｉｓ　ｃＤＮＡ配列は報
告されたようにトリプトファン残基の所で報告された蛋
白配列とミスマツチがある。
これらは筐た、アミノ末端蛋白配列の三つの他の位置で
マツチしない。この異例からみて、前のＰＲ−１クロー
ンの同定が疑問になる。我々のｃＤＮＡクローンがＰＲ
−１ａ、ＰＲ−１ｂｔたはＰＲ−１Ｃであるという同定
を確かめるため、精製されたＰＲ−１ａ＞よびＰＲ−１
ｂ蛋白およびそれらの蛋白から誘導されたペプチドの一
次構造の大部分をアミノ酸配列決定によって分析する。
次いでどのｃＤＮＡクローンがとの蛋樹に相当するかを
同定するため、このデータをｃＤＮＡのヌクレオチド配
列から推定される蛋白配列と比較する。
ニコチアナ　タパクム　ミーブイ　キサンチ（Ｎ、　ｔ
ａｂａｃｕｒｎ　Ｃｙ、　Ｘａｎｔｈｉ　）の植物を温
室で生育させ、８週令の時にＴＭＶの普通の株（ＵＩ　
）の懸濁液（α５μ？／ｄ）を葉を柔かく擦υつけて感
染させる。感染７日後に葉を採集し、ペアレントアンド
アセリｙ（１９８４年）、Ｐａｒｅｎｔ　ａｎｄＡｓｓ
ｅｌｉｒ＋　（１９８４ンにしたがってＩＣＦを葉から
洗い出して、果める＊ＩＣＦ２５０ｍを凍結乾燥によっ
て５０ｄｉＣ＃縮し、トリス−ＵＣＺ　。
ｐＨａ　Ｏ＞よび１　ｍＭＥＤＴＡで平衡化したウルト
ラゲル（Ｕｌｔｒａｇｅｌ　）　ＡＣＡ　５４カラムに
かける。
このカラムの溶出液を普通の１０％アクリルアミドゲル
の電気泳動で分析するａ　Ｐ　Ｒ−’蛋白を含む画分を
集め、凍結乾燥して３ｄの水に再懸濁し、次いで水に対
して一夜透析する。この標品を、ＴＳＫ−ＤＥＡＥ　５
ＰＮカラムでのＨＰＬＣ陰イオン交換クロマトグラフィ
ーで更に精製する。カラムを５０ｍＭ）リスーＨＣｔ％
ｐＨａＯ１ＩｍＭＥＤＴＡ中での０から（Ｌ６ＭのＮａ
Ｃｔ濃度勾配で溶出する。虐分をＰＡＧＥで分析する。
ＰＲ−１ｂ＃′ｉカラムから最初にＣＬ１８ＭＮａＣｔ
で溶出され、ｐＲ−１＠ｉｊα２８ＭＮａＣｔで溶出さ
れる。
各蛋白を含む画分を集め、水に対して透析して凍結乾燥
する。
ＰＲ−１ａ：ｌｒよびＰＲ−１ｂ蛋白標品の純度はアカ
ボア（Ａｑｕａｐｏｒｅ　）フェニル　　カラム（２，
ｌＸ１００ｍｍ、ブラウンリー　Ｂｒｏｗｎｉｅｓ　）
を使い、ｕｔｌＴＦＡ中、アセトニトリル：イソプロパ
ノール（１：１）の直線濃度勾配（５から８０儂）で溶
出する逆相ＨＰＬＣで確認する。
そのままの蛋白のブロックをはずしたアミノ末端、蛋白
の臭化シアノゲン開裂から誘導されるペプチド、蛋白の
Ｌｙｓ　Ｃ消化で誘導されるペプチド、１次は蛋白のト
リプシン消化で誘導されるペプチドから、上記の方法ま
たは本技術分野で公知の方法を使って、蛋白配列を得る
。この分析で得られたデータの要約をＰＲ−１ａとＰＲ
−１ｂについて以下に示す。
ＰＲ−１ｍ Ａ、　　（ＱＩＮＳＱＱＤＹＬＤＡ）ＩＮＴＡＲＡＤＢ
、　（Ｒ）ＡＤＶＧＶＥＰＬＴＷＤＤＱＶＡＡＹＡＱＮ
ＹＡＳＱＬＡＡＤＣＮ　ＬＶＨ３Ｈ−ＧＱＹＧＥＮＬＡ
Ｅ Ｃ，ＭＴＡＡＫＡＶＥＭＷＶＤＥＫＱＹＹＤ、　（ＩＱ
ＱＹＹＤＨＤＳＮＴＣＡＱＧＱＶＣＧＨＹＴＱＶＶＶｆ
ｆＮ’３ＶＲＥ、　の）ＰＰＧＮＹＲＧＥＳＰＹ ＰＲ−１ｂ Ａ、　■）ＦＭＴＡＡＫＡＶＥＭＷＶＤＢ、　　Ｍ）Ｔ
ＡＡＫＡＶＥＭＷＶＤＥＫＱＹＣ，ＩＮ）ＧＧＹＶＶＳ Ｄ、　　（Ｄ）ＰＰＧＮｖｌＧＱＳＰＹニコチアナ　タ
バクム　ジーブイ、キサンチ（Ｎ、　ｔｍｂａｃｕｍ　
ｃｖ、　Ｘａｎｔｈｉ　）の植物を温室で生育させ、８
過分の時にＴＭＶの普通の株（Ｕｌ）の懸濁液（ａ、Ｓ
μ９／ｒＪ）を葉にやわらかく擦りつけて感染させる。
感染から７日後に葉を集め、ペアレント　アノド　アセ
リン（１９８４年）。
Ｐａｒｅｎｔ　ａｎｄ　Ａｓ５ｅｌｉｎ　（１９８４）
に従って、ＩＣＦを葉から洗い出して集める。ＩＣＦ２
５０ｄを凍結乾燥で５０−に濃縮し、トリス−ＨＣ１％
ｐＨａＯと１ｍＭＥＤＴＡで平衡化したウルトラゲル（
Ｕｌｔｒａｇｅｌ　）　Ａ　ＣＡ　５４　カラムにカケ
；ｂ。溶出液を１０％ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動で分析する。
ＰＲ−Ｒ蛋白といくつかの微を混入蛋白を含む両分を集
め、凍結乾燥して水３ｄに再懸濁し、次いで水に対して
一夜、透析する。この標品を、ブラウンクー　アカボア
（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　Ａｑｕａｐｏｒｅ　）フェニル　
カラム（２，１ｘ１００ａｗ）を使ったＩ（ＰＬＣ逆相
クロマトグラフィーで更に精製する。
カラムを、α１１ＴＦＡ中、アセトニトリル：インプロ
パノール（１：１）の２０から８０％の直線濃度勾配を
使い５０μｔ／分の流速で８０分かけて溶出する。存在
する主要蛋白ｔｉＰＲ−Ｒメイジャーと呼ばれるＰＲ−
Ｒのイン７オームで、はとんどの蛋白が４６分で溶出さ
れ、少量の蛋白がＰＲ−Ｒマイナーとして４７．５分に
溶出されることがわかる。ＰＲ−ＲメイジャーおよびＰ
Ｒ−Ｒマイナーを含むピークを集め、その試料を乾燥さ
せる。次にこの蛋白を６Ｍグアニジン−ＨＣＬ、ＩＭ）
リスーＨＣｔに再懸濁し、上記のようにして還元し、ア
ルキル化して、上記のように自動配列決定する。得られ
たデータの要約を下に示す。
ＰＲ−Ｒ／　（ジャー：　ＡＴＦＤＩＶＮＫＣＴＹＴＶ
ＷＡＡＡＳＧＧＧＲＲ ＰＲ−Ｒ？　（す−：　ＡＴＦＤＩＶＮＱＣＴＶＴＶＷ
ＡＡＡＳＰＧＧＲＱＬＮ 実施例１０　　ＰＲ−ＰおよびＰＲ−Ｑの精製と配列ニ
コチアナ　タバクム　ジーブイ　キサンチ（Ｎ、　ｔａ
ｂａｃｕｍ　ｃｙ、　Ｘａｎｔｈｉ　）の植物を温室で
生育させ、８過分の時にＴＭＶの普通の株（Ｕりの懸濁
液（［ｌＬ５μｆ／ｄ）を葉に柔かく擦りつけて感染さ
せる。感染７日後に葉を集め、ペアレント７７）’７セ
リー（１９８４年）、Ｐａｒｅｎｔ　ａｎｄＡｓｓｅｌ
ｉｎ　（１９８ａ　）に従ってＩＣＦを葉から洗い出し
て集める。ＩＣＦ２５０５ｄを凍結乾燥で５０−に濃縮
し、トリス−ＨＣｔ、ｐＨ＆Ｏと　１ｍＭＥＤＴＡで平
衡化したウルトラゲル（Ｕｌｔｒａ−ｇｅｌ）ＡＣＡ５
４カラムにかける。溶出液をｔｏｌポリアクリルアミド
　ゲルの電気泳動で分析する。ＰＲ−０、、ＰＲ−Ｐ、
ＰＲ−ＱひよびＰＲ−Ｒを含むウルトラゲル（Ｕｌｔｒ
ａｇｅｌ　）　Ａ　ＣＡ　５　ａクロマトグラフィーの
画分を集め、凍結乾燥で濃縮する・更にこの蛋白をＰＡ
ＧＥ、次いでＰＶＤＦ膜のエレクトロプロッティング（
マツダイ九１９８７年、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ、　１９
８７　）で精製する。
ＰＲ−ＰｋよびＰＲ−Ｑを含むブロッティングした蛋白
バンドを切り出し、アプライド　バイオシステムズ　ユ
ーザー　ブレティン　４３６゜１９８８年３月２１日（
Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＵｓｅｒＢｕ
目ｅｔｉｎ　Ａ３６．　Ｍａｒｃｈ　２１．１９８８　
）に従って１ａＯｍＭ６１！！Ｉ２中、α５％ＰＶＰ−
ａＯで処ｍする。
上記したようにピログルタメート　アミノペブチダーセ
を使って蛋白のブロックをはずし、上記のようにして自
動エドマン（Ｅｄｍａｎ　）分解によ、９ＰＶＤＦから
蛋白の配列を決める。
ＰＲ−ＰＴｈよびＰＲ−Ｑ蛋白のアミノ末端の配列を下
に示す。
ＰＲ−ＰおよびＰＲ−Ｑからのペプチドからの蛋白配列
を得るため、ＰＲ−蛋白を含むウルトラゲル（Ｕｌｔｒ
ａｇｅｌ　）カラムからの画分を集め、凍結乾燥して水
に溶解し、次にＤＥＡＥ−セファセル（ＤＥＡＥ−５ｅ
ｐｈａｃｅｌ　）　ｐ　Ｔ：１　？ドグラフイー前に水
に対して透析する。ＤＥＡＥ−セファセルカラムを５０
　ｍＭ　）リスーＨＣ４（ｐＨａ　Ｏ）、１ｍＭＥＤＴ
Ａで平衡化し、塩化す）　ＩＪウムの０から０．４Ｍの
直線ｍ度勾配で溶出する。ＰＲ−Ｒメイジャー　ＰＲ−
Ｒマイナー　ＰＲ−Ｐ、ＰＲ−Ｑ。
ＰＲ−（１−よびいくつかの微量混入物を含む画分６を
凍結乾燥し、蒸溜水に再憑渇する。
更に一分６からの蛋白を逆相フェニルカラムを使い、Ｃ
Ｌ１１ＴＦＡ中、アセトニトリル：イソプロパノール（
１：１）の２０から８０％の直線濃度勾配で溶出するＨ
１’ＬＣで精製する。ＰＲ−ＰとＰＲ−Ｑ蛋白は単一ピ
ークとして一緒に溶出され、これを集めてほとんど乾固
する１で真空濃縮し、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ
７Ｏに再懸濁して、１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ７
，０）中で平衡化したブラウンリー　ラプズ（Ｂｒｏｗ
ｎｌｅｅ　Ｌａｂｓ　）　ＡＸ−３００ＨＰＬＣイオン
交換カラム（２，１調Ｘ　１０　ｅｘ　）に付加する。
１０から２５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７，０）
の直線ａ度勾配を使って蛋白をとの力２ムから溶出する
。ＰＲ−Ｐ釦よびＰＲ−Ｑはそれぞれ約７５ｍＭと約９
５ｍＭ６ｆｉアンモニウムの所で別の単一ピークとして
溶出される。
実施例７に記載したようにして、臭化シアノゲン開裂、
トリプシン消化！たはＬｙｓ　Ｃ消化によりペプチドを
得て、精製する。アミノ嬶紀列を実施例７に記載したよ
うにして決定し、以下に要約する。
Ｒ−Ｐ アミノ末端 ＮＢＲ Ｔｒｙｐ　４瓜４ Ｔｒｙｐ　６４．７ Ｔｒｙｐ　６α２ Ｒ−Ｑ アミノ末端 ＮＢＲ Ｔｒｙｐ　７４．２ Ｔｒｙｐ　Ｊ４７ （ＱＧＩＧＳＩＶＴ？ＤＬＦＮＥＭＬ ＭＬＫＮＲＮＤＧＲ？ＰＡＮＧＦＹＴＹＤＡＦＩＡ（Ｒ
／Ｋ）？ＰＡＮＧＦＹＴＹＤＡＦ （Ｒ／Ｋ）ＧＰＩＱＬＴＮ（Ｒ／Ｋ） （ＱＩＧＩＧＳＩＶＴＮＤＬＦＮＥＭＬＲＮＤＧＲ？Ｐ
ＡＮＧＦ （Ｒ／Ｋ）ＧＰＩＱＬＴＮＱＮＮＹＥＫ（Ｒ／Ｋ）ＱＤ
ＬＶＮＮＰＤＬＶＡＴＤＡＴＩ（Ｒ／り＜）Ｙ？ＧＭＬ
ＮＶＡＰＧＤＮＬＤ？−ＹＮＱ（Ｒ／Ｋ）Ｔｒｙｐ！ｉ
ａ６　　　（Ｒ／Ｋ）ＷＴＰＳＡＡＤＱＡＡＮ（Ｒ／Ｋ
）Ｔｒｙｐ　３７．５　　　（Ｒ／Ｋ　）１．ＱＹ、Ｙ
（Ｒ／Ｋ　）Ｔｒｙｐ　　５αｓ　　　（Ｒ／Ｋ）ＹＣ
ＧＭＬＮＶＡＰＧＥＮＬＤＣＹＮニコチアナ　タバクム
　ジーブイ、キサンチ（Ｎ、　ｔａｂａｃｕｍ　ｅｖ、
　Ｘａｎｔｈｉ　）の植物を温室で生育させ、７過分の
時に、ＴＭＶの普通の株（Ｕｌ　）の＠濁液（（Ｌ５μ
９７−）を葉に柔かく擦りつけて感染させる。感染７日
後に′Ｊを集め、ペアレント　アンド　アセクン（１９
８４年）、Ｐａｒｅｎｔａｎｄ　Ａｓ５ｅｌｉｎ　（ｔ
　９８　ａ　）に従ってＩＣＦｋｍから洗い出して集め
る。ＩＣＥ２５０−を凍結乾燥しテ５０ｗ１ＶＣ濃縮し
、トリＸ−ＨＣＬｐＨ１ｌＬＯと１ｍＭＥＤＴＡで平衡
化したウルトラゲル（Ｕｌｔ−ｒａｇｅｌ　）　ＡＣＡ
　５４　カラムにカケ７）、　ｆｉｌ出液’ｃ１０ｅＩ
Ｉポリアクリルアミド　ゲルの電気泳動で分析する。ゲ
ル電気泳動でみてＰＲ−蛋白を含むウルトラゲル（Ｕｌ
ｔｒａｇｅｌ　）　ＡＣＡ　５４りＯ”？ドグラフイー
の画分を集め、凍結乾燥して水に溶ＳＬ、ＤＥＡＥ−セ
ファセルのクロマトグラフィー前に水に対して透析する
。５０　ｍＭ　）　’ＪスーＨＣｔ（ｐＨａＯ）と１ｍ
ＭＥＤＴＡでＤＥＡＥ−セファセル　カラムを平衡化し
、塩化ナトリウムの０からｌ１４Ｍの直線濃度勾配で溶
出する。ＰＲ−Ｒメイジャー　ＰＲ−Ｒマイナー　ＰＲ
−Ｐ、ＰＲ−Ｑおよびいくつかの微量混入物の混合物を
含む画分６を凍結乾燥し、次いで蒸留水に再＠渇する。
バイダク（Ｖｙｄａｃ　）フェニル　カラム（４，６Ｘ
２５（１ｍ）を使ったＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィー
で各蛋白を更にＳａする。蛋白をａｔｅＴＦＡ中、アセ
トニトリル：インプロパノール（１：１）の２０から８
０％の直線濃度勾配を使って溶出する。この精製ステッ
プの結果から、この蛋白混合物は少くとも９種の別々の
蛋白を含むことがわかる。これらの一つで４６分で溶出
されるＰＲ−０’　　を集め、凍結乾燥で濃縮する。
蛋白を６Ｍグアニジン−ＨＣｔ、ＩＭ）リスーＨＣＬに
再ｓｍ　Ｌ、、上記のようにして還元し、アルキル化す
る。トリプシン消化で生じたペプチドを上記のようにし
て分離する。これらのベプチドのアミノ酸配列の要約を
下に示すつＡ、　　ＶＳＴＡＩＥＴＧＬＴＴＤＴＳＰＰ
Ｂ、　　ＴＹＮＮＮＬＩ Ｃ，ＹＶＰＶＬＬＮＡＭＲ Ｄ、　　ＱＦＩＥＰＩＩＮＦＬＶＴＮ Ｅ、　　ＮＬＦＤＡＩＬＤＡＴＹＳＡＬＥＫニコチアナ
　タバクム　ジーブイ、キサンチ（Ｎ−ｔａｂａｃｕｍ
　ａｙ、　Ｘａｎｔｈｉ　）の植物を温室で生育させ、
８ａ令の時に、ＴＭＶの普通の株（Ｕｌ　）の懸濁液（
０，５μＷ／ｌｄｊ＞を葉に柔かく擦シつけて感染させ
る。感染７日後に葉を集め、ペアレントア、ド　アセリ
（１９８４年）、Ｐａｒｅｎｔ　ａｎｄＡｓｓｅｌｉ　
（１９８４）ニ従ッテ細胞内Ｑ（ＩＣＦ）１葉から洗い
出して果める。ＩＣＦ２５０−を凍結乾燥によってＳｏ
ｄに濃縮し、トリス−ＭＣ１、ｐＨａ　Ｏと１ｍＭＥＤ
ＴＡで平衡化したウルトラゲル（ＴＪｌｔｒａｇｅｌ　
）　ＡＣＡ　５４カラムにかける。溶出液を１０％ポリ
アクリルアミド　ゲル電気泳動で分析する。ゲル電気泳
動で決定したＰＲ−蛋白を含む画分を集め、凍結乾燥し
、水に溶解り、ＤＥＡＥ−セファセル　クロマトグラフ
ィーにかける前に水に対して透析する。ＤＥＡＥ−セフ
ァセル　カラムを５０ｍＭ　トリス−ＨＣｔ（ｐＨａＯ
）、１ｒｎＭＥＤＴＡで平衡化し、塩化ナトリウムの０
から（１４Ｍの直線濃度勾配で溶出する。ＰＲ−Ｒメイ
ジャー　ＰＲ−ＲマイナーＰＲ−ＰｌＰＲ−Ｑ、ＰＲ−
０＆よびいくつかの微量の混入物の混合物を含む画分６
を凍結乾燥する。
ＰＲ−２、ＰＲ−Ｎ＆よびいくつかの微量の混入物の混
合物を含む画分３も別に集めて凍結乾燥によって濃縮す
る。
先ず、画分６を２−の水に再＠濁し、次いでバイダク（
Ｖｙｄａｃ　）フェニル　カラム（４，６Ｘ２５０　ｗ
ｍ　）を使ったＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーによっ
て蛋白を分けることによυ、ＰＲ−０を画分すの蛋白か
ら更に精製する。蛋白は、ＱｌｌＴＦＡ中、アセトニト
リルニインプロバノー＃（１：　ｔ　）　ノ２　ｏカラ
ａ　ｏ　ｔｌｃｖＫＨａＫ勾配で溶出する。この精製ス
テップの結果から、この混合物が少くとも９１）（ａ）
ｌの蛋白を含むことがわかる。１つの試行の５１分で溶
出されるこれら蛋白の中の一つをゲル電気泳動からＰＲ
−０と決定する。ＰＲ−０を含むピークを集め、凍結乾
燥でｍ縮する。この蛋白１に６Ｍグアニジン−ＨＣｔ。
Ｉ　Ｍ　）　ＩＪスーＨＣｔに再懸濁し、上記のように
して還元し、アルキル化する。上記のようにしてトリプ
シンおよびＬｙｓ　Ｃ消化で生じたペプチドをｎＩ製す
る。実施例７に記載したようにして蛋白配列を決定する
。配列データの要約を下に示す。
ｐＲ−２ｊ？よびＰＲ−Ｎ蛋白を画分５からブラウンリ
ー　アカボア（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　Ａｑｕａｐｏｒｅ　
）　Ａ　Ｘ−５００＠イオン交換カラム（２，１Ｘ１０
０１１１１）を使って精製する。カラムから蛋白を１０
ｍＭから５５０　ｍＭｆ）ｈｆＲ７７モ＝　”＞　Ａ、
ｐＨ７，０７）［線濃度勾配を使って溶出する。ＰＲ−
Ｎは３７．５分で、　ＰＲ−２ｔｆ　５０分で、単一の
整ったピークとして溶出される。蛋白の同定はゲル電気
泳動で確認する。蛋白を集め、凍結乾燥で濃縮して、上
記のようにして還元し、アルキル化する。ペプチドをト
リプシン消化で得て、実施例７に記載したようにして精
製する。蛋白配列データを下に要約する。
Ｒ−２ ４９，２ ５４７６９，５ ５４／７２ ５＆９ ６＆９ ＡＮＧＲＶＱＤＮＩ　ＩＮ ＥＬ８ ８２．５ ９１．８ Ｒ−Ｎ ５ＩＦＲ ＱＬＮＦＮ ＶＳＴＡＴＹＳＧＩＬＡＮＴＮＰ ＨＦＧＬＦＳＰＤＱＲ ＩＹＮＰＤＴＮＶＦＮｓ　７／ｑｔｓ ＡＰＧＮＡＩＥＴＹＬＦＡＭＦＤＥＮＮ、ＥＧＤＹＩＡ
ＶＧＮＥＶＳＰＧＮＮＧＱＹＡＰＦＧＳＮＩＥＩＩ ａ１３ ＱＬＮＦＮ ＶＳＴＡＴＹＳＧＩＬＡＮ、ＹＰ ５！Ｌ３ ６５．３ ６５．５８ ６＆６Ａ ６５．６３ Ｒ−０ ＤＮＬＰＰＤＱＱＶＩＮＬＹＮＡ ＩＹＮＰＤＴＮＶＥＮＡＬ ＡＧＧＱＮＶＥＩＩＶＳＥＳＧ、ＰＳＥＤＩＥＴＹＬＦ
ＡＭＦＤ、ＮＮ、ＥＧＤＡＧＧＱＮＬＥＩ　Ｉ ＤＩＥ、ＹＶＦＡＭ ＩＹＮＰＤＴＮＶＦＮＡＬ ＧＳＮＩＥＩＩＬＤＶＰＬＱＤＬＱＳＬＴＤＰ５９、１ ４６．７ ５１．５ ５４．５ ５′１６ ６４．９ ７α９ ８五３ 実施例１ ＬＩＤＨＶ ＱＬＮＦ Ｉ（ＦＧＬＦＳＰＤＱＲ ＩＡＮＮＬＰＳＤＱＤＶＩＮＬＹＮＡＮＧＩＰＥＮＴＮ
ＶＦＮＡＬ ＮＮＬＰＬＬＡＮＶＹＰ ＧＳＮＩＥＩ　ＩＬＤＶＰＮＱＤＬＥＳＬＴＤＰＳＹＩ
ＡＶＧＮＥＶＳＰＴＮ ＡＧＧＰＮＶＥＩ　ＩＶＳＥＳＧ、Ｐ ２　キュウリ　キテナーー＋！／リゾチームの精製と配
列 病原体誘導性キチナーゼ蛋白を記載されたようにして（
メトロ等、１９８８年、Ｍｅｔｒａｕｘ　ｅｔ１）（ａ
）　１９８８）、感染されたキュウリの葉から分離する
。本質的には本技術分野で記載されたようにおよび上記
のようにして、この均質な蛋白標品からペプチドを生成
させる。これらのペプチドのアミノ酸配列を以下に要約
する。
アミノ末端　　ＡＧ　Ｉ　Ａ　Ｉ　ＹＷＧＱＮＧＮＥＧ
Ｓ　ＬＡＳＴＣＡＴＧＮＹＥＦＶＮＩＡＦＬ ＬｙｓＣペプチド　　（Ｋ）ＮＦＧＱＶＩＬＳＡＡＰＱ
ＣＰＩＰＤＡＨＬＤＡＩＫ （Ｋ）ＴＧＬＦＤＳＶＷＶＱＦＹＮＮＰＰＣＭＦＡＤＮ
ＡＤＮＬＬＳ ■ＬＹＭＧＬＰＡＡＲＥＡＡＰＳＧＧＦ　Ｉ　ＰＡＤ（
Ｋ）ＡＳＳＮＹＧＧＶＭＬＷＳＫ ＭＧＬＰＡＡＲＥＡＡＰＳＧＧＦＩＰＡＤＶＬ、ｌ５Ｑ
ＶＬＰＴＩ ＴＧＬＦＤ？Ｖ ＬＹＭＧＬＰＡＡ ＡＳＳＮＹＧＧＶ ＦＤＮＧＹ 病原体誘導性で酸性のキ１ウリ　ペリオキシダーゼ蛋白
を、スミス、ジェイ、エイ１、学位論文、デパート　　
メント　オプ　ボタニー　アンド　プラント　バソロジ
ー　ミシガン州立大学、ランシング、ミシガン州（１９
８９年）（Ｓｍ１ｔｈ、　Ｊ、　Ａ、、　ＰＨ，Ｄ、　
Ｔｈｅｓｉｓ　、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＢｏｔ
ａｎｇ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、　
Ｍｉｃｈｉｇａｎ　５ｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、
　Ｌａｎｓｉｎｇ、　Ｍｉｃｈｔｇｉｎ　（１９８８）
　）に記載されたように、コ１１ネバクテリウム　ラゲ
ナリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＩＨｅｎ
ａｒｉｕｍ　）の胞子＠濁液で７日前に感染されたキエ
ウリ植物の感染のない葉から精製する。
実施例７に記載したようにして、精製蛋白を還元し、ア
ルキル化して、アミノ末端のアミノ酸配列、およびＬｙ
ｓＣ４たはトリプシン消化から誘導されるペプチドのア
ミノ酸配列を決定する。アミノ酸配列決定の結果を以下
に要約する。
アミノ末端　　　　（ＱＩＬＳＰＴＦＹＮＴＴＷＰＮＶ
ＬｙｓＣ８４，Ｏ／６［Ｌ７　　ＴＡＶＥＮＶＣＰＧＶ
ＶＳＣＡＤＩＬＡＬＧＳＲＡＶＴ ＬｙｓＣ７１，６ＤＡＶＴＬＡＳＧＱＧＷＴＶＱＬＧＲ
ＬｙｓＣ５４，ｆ１５１）（ａ）　　　Ｉ　ＩＲＬＨＦ
ＨＤＣＦＶＤＧＣＤＧＳＶＬＬＥＤＱＤＧＩＴ、Ｅ ＬｙｓＣ２＆６　　　　　　ＴＧＴＴＧＥＩＲＴＮＣＲ
ＲＬＮＴｒｙｐ６６．４　　　　　　ＬＮＮＮＰＮＡＤ
ＤＳＰＩＤＳＴＡＹＡＳＱＬセクション３　新規なｃＤ
ＮＡクローンの分離このセクションには新規なｃＤＮＡ
クローンの分離を記載する。５つのセクションに分け、
セクションＡではクローン分離に使用するライブラリー
の構築を記載する。セクシ覆ンＢＫはそのようにして分
離されたクローンの同定と精製を記載し、セクションＣ
では新規なｃＤＮＡクローニング技法の開発を記載する
。
セクシ璽ン５Ａ　　ｃＤＮＡライブラリーの構築ニコチ
アナ　タバクム　ジーブイ、キサンチーニスシー（Ｎ、
　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ、　Ｘａｎｔｈｉ　−ｎｃ　）
の葉をＴＭＶで感染させ、感染５日後に集める。上記の
ようにして全ＲＮＡｔ−調製し、標準法を使りてポリＡ
＋ＲＮＡを分離する。このポリＡ＋ＲＮＡをラムダｏｎ
ｇＣクローニング　ベクターにかいて使い、本質的には
記載されたようにして（ガプラー　アンド　ホフマン、
１９８３年。
Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ　、　１９８３
　）、ｃＤＮＡライブラリーを構築する。
オカヤマ　アンド　バーブ（１９８２年）、Ｏｋａｙａ
ｍａ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ　（１９８２）によう記載され
たベクター−プライマー型のプラスミドｃＤＮＡクロー
ニング　ベクターであるｐｃＧＮ１７０３を、クローニ
ング法を簡単にし、ファージベクターへのライブラリー
のシャトル性を容易にし、また今回の使用とはずれるが
他の機能を加えるために、改良ベクターとして構築する
。
Ａ−ｐｃＧＮ１７０３クローニング　ベクターの構築 ブルースクライプ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　）　Ｍ　１
３−　（ｘトラタジーン　インコーホレイチット、Ｓｔ
ｒａｔａ−ｇｅｎｅ、　Ｉｎｃ−）を出発プラスミドと
して使用する。
ＢａｍＨ１部位をＢａｍＨ１消化とナタマメ（ｍｕｎｙ
ｂｅａｎ　）ヌクレアーゼ処理で除去し、Ｔ　４　ＤＮ
Ａリガーゼで連結させてｐｃＧＮ１’７００を得る。こ
のプラスミドをＥＣ０Ｒ１とＳａｃ　Ｉで消化し、次い
で、配列 （第１−ｆ４４７　）５’−ＡＡＴＴＴＣＣＣＧＧＧＣ
ＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣ
Ｔ−３’（オリゴ◆ａｂ　３５’−ＣＣＧＡＴＣＣＡＣ
ＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＧＡ−３’ の二つのオリゴヌクレオチドをアニーリングするごとに
よシつくった二重鎖合成ポリリンカーと連結する。
このようにして得られたプラスミドは更にＳｍ１）（ａ
）、Ａｐ１）（ａ）、　Ｘｂａ　Ｉ、Ｐｓｔｌ、＆よび
ＢａｍＨＩの制限部位を持ち、ｐｃＧＮ１７０２と命名
する。
　ＥｃｏＲＩ部位が再構築されていないことに注目して
ｔヨしい。
ｐｃＧＮ１７０２をＨｉｎｄ　ｍで完全に消化してＴ４
ボリメラーセでプラント末端をつくる。得られたＤ　Ｎ
　Ａ　ｔ−ＰＶＵＩＦで部分消化し、Ｔ４ＤＮＡリガー
セで連結する。ｌａｃオペレーター−プロモーター領域
を含ム２１４ｂｐ）Ｈｉｎｄ　ｍ　−Ｐｖｕｌｌ　７ラ
グメントを欠損させた形質転換体を選別する。
このプラスミドをｐＣＧＮ　１７０５と命名する。
ｐｃＧＮ１７０５のようなベクター−プライマープラス
ミドの使用は以前に記載されていた（アレキサンダー　
１９８７年、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、　１９８７　）。
その研究報告の補遺（ＡＤＤＥＮＯＵＭ　）　に記載さ
れているように、本ベクターは七ノマーベクターである
。リバーストランスクリプターゼおよびターミナルトラ
ンスフェラーゼ（Ｇ−ティリング）反応中のベクターの
両端にｃＤＮＡ合或を合皮るために使用されるＴ−）ラ
クトが存在し、ｐｃＧＮ１７０３を使ったｃＤＮＡクロ
ーニングの最終生成物を遠吠化するために使用されるリ
ンカ−ＤＮＡは下記の一般構造を持つ：Ｔ７：７’ロモ
ーター　マルチプル　クローニング部位（ＳｍａＩ。
Ａｐ１）（ａ）、Ｘｂｍ　Ｉ　％Ｐｓｔ　Ｉ、　Ｂａｍ
ＨＩ、Ｎｏｔ　Ｉ　％ＥｃｏＲＩ、　Ｓａｃ■）、Ｃ：
Ｇホモポリマー　トラクト（１０乃至１５残基）、ｃＤ
ＮＡ挿入（ｍＲＮＡ−センスストランドのｓｒ　−ｓｒ
　＞、Ａ：Ｔホモポリマートラクト（４０乃至１００残
基）、釦よびもう一つのマルチプルクローニング部位（
ＫｐｎＩ、Ｓｍ１）（ａ）。
Ｘｂ１）（ａ）、Ｓｍ目、Ｐｓｔｌ＆よび５ｐｈｌ）で
、すべてが上述のようにブルー７クライブ（Ｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｂｅ　）Ｍ１！−から誘導されたプラスミド骨格
内に含まれる。
Ｂ：　　ｐｃＧＮ１７Ｇ！５を使ったｃＤＮＡライブラ
リーの構築 キサンチ　ェヌシー（Ｘｍｎｔｈｉ、　ｎｃ　）　　タ
バコ植物をファイトトロン内で約２５乃至３０−の高さ
になる筐で生育させる。各植物の根元に近い２枚の葉に
、対照の緩衝液のみの試料（１０ｍＭリン酸ナトリｒ７
Ａ、ｐＨ７，０）、またはＴＭＶ試料（同じ緩衝液中に
１０μｆ／−）を接種する。
１１日後、感染させていない上の万の３乃至４枚の葉を
集め、液体窒素中で凍結する。罰に記された方法（ホー
ル等、１９７８年、３１９０−５２００頁、Ｈ１）（ａ
）ｌ　ｅｔ１）（ａ）、１９７Ｂ、　ｐ、５１９６−３
２００　：　？ニアチス等、１９８２年、２９７−３０
９頁、Ｍａｎｉａ−ｔｉｓ　ｅｔ１）（ａ）、１９８２
，２９７−３０９）によってポリＡ＋ｍＲＮＡを分離す
る。ｃＤＮＡベクターｐＣＧＮ１７０３に、ＴＭＶ誘導
葉から分離したボＩＪＡ＋ｍＲＮＡを使い、創に記載さ
れた方法（アレクサンダー　１９８７年、Ａｌｅｘａｎ
ｄｅｒ　１９８７　）でｃＤＮＡＤＮＡライブラリーす
る。増巾されたｃＤＮＡライブラリー（アレクサンダー
　１９８７年、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ　、　１９８７　）
のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで完全に消化し、Ｉｇ
ｔ　−１０（ストラタジーン　インコーホレイテッド、
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ。
Ｉｎｃ、　）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングする
。
プラスミドベクターばｃＤＮＡに付いたままであシ、こ
れもファージベクターにクローニングされていることに
注目して欲しい。したがって、この方法を使って、二つ
のｃＤＮＡライブラリーが構築される。＋つはライブラ
リーがプラスミドベクター内に含ちれてしす、もう一つ
はｃＤＮＡがファージベクター内に貴重れている。
キエウリの葉にタバコ壊死ウィルス（Ｔａｂａｃｃ。
Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　）　（ＴＮＶ）を感染
させ、上記のようにして感染後５日してＲＮＡを分離す
る。
標準法でボ！ＪＡ＋ＲＮＡを分離し、本質的には記載さ
れたようにして（ガプラー　アンド　ホフマン、１９８
３年、Ｇｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ、　１９
８３）ラムタｚａｐ　　クローニング　ベクター（スト
ラタジーン、Ｓｔｒｍｔａｇｅｎｅ　）にｃＤＮＡライ
ブラリーを構築する。
セクシ璽ン３Ｂ　　ｅＤＮＡクローンの同定、分離およ
び性質 上のように調製したｃＤＮＡライブラリーから約５００
，０００プラークを配列 ５’ＣＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＣＡＡＧＡＣＴＡＴＴＴ
ＧＧＡＴＧＣＣのオリゴヌクレオチドについてスクリー
ニングする。
標準法で２５の陽性のプラークを精製し、ファージから
ＤＮＡを調製する。ＤＮＡを含む組換えファージのフラ
グメントをブルースクリプトにサブクローニングする。
各クローンの部分的ｃＤＮＡ配列１ＤＮＡ配列分析で決
定する。
２６のクローンを５群のｃＤＮＡにタイプ分けできるこ
とがわかる。クラス１ＦｉクローンｐＢＳＰＲ１−２０
７で代表され、クラス２はクローンｐＢｓＰＲ１−１０
２３で代表され、クラス５はクローンｐＢＳＰＲ１−３
１２で代表される。
公知のＰＲ−１蛋白に関してこの三つのクローーンの同
定を行うために、上記のようにして決定したＰＲ−１ａ
とＰＲ−１ｂ蛋白のアミノ酸配列データを三種の代表的
ｃＤＮＡクローンから推定されるアミノ酸配列と比較す
る。比較を以下に要約する。
上記から実験的に決定したアミノ酸配列を最初の（推定
の）アミノ酸を括弧に入れて一番上の行に示す。クロー
ンｐＢＳＰＲ１−２０７（＝ａ　）、ｐＢＳＰＲｌ−１
０２３（＝ｂ）ｋよびｐＢＳＰＲｌ−３１ｚ（＝ｃ）か
ら推定される配列をペプチドデータの下に一致している
と（ハ）によ＃）１す。一致しない残基をアミノ酸記号
で示す。
Ｒ−１ｓｔ Ａ、　　（Ｑ）ＮＳＱＱＤＹＬＤＡＨＮＴＡＲＡＤｂ　
　−−−−−−−−−−−−−−−−−Ｃ−−−−−−
−−−−−−−−−−−Ｂ、　　（Ｒ）ＡＤＶＧＶＥＰ
ＬｆｆＤＤＱＶＡＡＹＡＱＮＹＡＳＱＬＡＡＤＣＮＬＶ
Ｈ３ＨＧＱＹＧＥＮＬＡＥ ｉ　　−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
″−一＋−一一一一ｂ　　−−−−−−−−−−−−Ｎ
Ｇ−−−−−−−−Ｖ−−一−−−−−−−−−−−−
−−−−−−Ｑ ｃ　　−−−−−−−−−−−−−−−−一−−−−−
−″″＋−−−−−−−−−−一−−−−−−−−−−
Ｗ Ｃ，ＭＴＡＡＫＡＶＥＭＷＶＤＥＫＱＹＹｓｉ　　−−
−−−−−−−−−−−−−−“ｂ　　−−−一−−−
−−−−−−−−−−ｃ　　Ｌ−−−−−−−−−−−
Ｎ−−−−Ｄ、　　（Ｋ）ＱＹＹＤＨＤＳＮＴＣＡＱＧ
ＱＶＣＧ）ＩＹＴＱＶＶＷＲＮＳＶＲａ　　−一−−−
−−−−−−−−−−一一−−−−−−−−　　　−一
−ｂ　　−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
−−−−−−−−−ｃ　　−−−−Ａ　−−−−−−−
−−−−−−−−−−一−−一−−−Ｅ−（ＤＩＰＰＧ
ＮＹＲＧＥＳＰＹ ａ　　−−−−−−−−−−−− ｂ　　−−−−−ＶＩ　−Ｑ　−−− Ｃ−−一−−ＶＩ−に一一− Ｒ−１ｂ Ａ、　　（Ｄ）ＦＭＴＡＡＫＡＶＥＭＷＶＤＳ　　−−
−−−−−−−−−−−− ｂ　　−−−一−−−−−−−−−− ｃ　　−−Ｌ−−−−−−−−−−Ｎ Ｂ、　　ＩＪＴＡＡＫＡＶＥＭＷＶＤＥＫＱＹａ　　−
−−−−−−−−−−−−−−−ｂ　　−−−−−−一
−−−−−−−−−ｃ　　Ｌ−−−−−−−−−−Ｎ−
−−−Ｃ−（Ｎ）ＧＧＹＶＶＳ ｃ−−−−１−一 り、　　（ＤＩＰＰＧＮＶＩＧＱＳＰＹａ　　−−−−
−ＹＲ−Ｅ−−− ｂ　　−−−一−−−−−−−− ｃ　　−−−−−−−−Ｋ　−−− ＰＲ−１ｍの蛋白配列をｐＢＳＰＲＩ−２０７から得ら
れる推定のアミノ酸配列と比較すると、すべての残基で
一致している。しかし、ｐＢｓＰＲｌ−１０２！Ｓまた
はｐＢｓＰＲｌ−５１２ペプチドから得られる推定のア
ミノ酸配列をＰＲ−１１の蛋白配列と比較すると、それ
ぞれ７）よび６の不一致がある。したがって、この事実
は明らかにクローンｐＢｓＰＲ１−２０７がＰＲ−１ｍ
蛋白をコードしていることを示す。
ＰＲ−１蛋白のアミノ酸配列をｐＢｓＰＲｌ　−１０２
３蛋白から得られる推定のアミノ酸配列と比較すると、
すべての残基で一致している。しかし、ｐＢＳＰＲｌ−
２０７筐たはｐＢｓＰＲｌ−５１２からの配列と比較す
ると、それぞれ５またＩＩ′ｉ６の不一致がある。した
がって、このデータは明らかにクローン、ＢＳＰＲＩ−
１０２５がＰＲ−１ｂ蛋白をコードしていることを示し
ている。更にクローンｐＢｓＰＲ１−５１２はＰＲ−１
ｅ蛋白をコードしていると決定される。ＰＲ−１ｍ、、
ＰＲ−１ｂお・よびＰＲ−１ｃをコードするｃＤＮＡの
配列は以下の通シである： 実施例１６ＰＲ−ＲメイジャーおよびＰＲ−Ｒマンの分
離 上記のようにして構築したライブラリーからの約３０へ
０００プラークを配列 ５’−ＧＡＡＣＴＴＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＴ
ＴＴＴＡＴＧＣＣ−３′ のオリゴスクレオチド　グローブを用いて選択する。１
５の陽性プラークを標準法で精製し、ファージからＤＮ
Ａをｙ４！！！！する。ｅＤＮＡを含む組換ファージの
フラグメントをブルースクリプトプラスミドにサブクロ
ーニングする。ｃＤＮＡ挿入の部分的ＤＮＡ配列から、
クローンは二つのクラスに分けられることがわかる。Ｐ
Ｒ−Ｒのメイジャー型（ビアポイント等、１９８７年、
Ｐｉｅｒｐｏｉｎｔ　ｅｔ　１）（ａ）、、　ｆ　９８
７　：　　ｐよび上記）をコードする、これらクローン
の一つのｐＢＳＰＲＲ−４０１の配列は下記の通シであ
る：ＰＲ−Ｒメイジャーのメイジャー型をコードすると
するこのｅＤＮＡの同定を、上記のように実峻的に決定
したアミノ末端配列とコードされた蛋白配列を比較する
ことにより、ｔた、ＰＲ−Ｒメイジャー　イン型のため
にビアポイント等（１９８７年）、　Ｐｉｅｒｐｏｉｎ
ｔ　ｅｔ　ｍｌ、　（１９８７）によう提出された配列
と比較することにより、　ａｉｊ！する。このコード蛋
白はノイズから分離された公知のトリプシン／α−アミ
ラーゼ阻止剤（リチャードソ／等、１９８７年、Ｒ３ｃ
ｈｉｒｄｓｏｎ　ａｔ　ｍｌ。
１９８７）と非常に強い相同性を持っている。クローニ
ングしたＰＲ−ＲＦｉプロテアーセかα−アミラーゼの
阻害剤かもしれず、筐た、そのようにして、トランスジ
ェニックに発現されると植物に対して殺虫的、殺ウイル
ス的または殺菌的活性を授けるであろう。
上記のように調製したｃＤＮＡライブラリーの約３００
．Ｇｏｏプラークを、タバコ塩基性キチナーゼ遺伝子を
コードする標、ｌ１ｃＤＮＡプローブを使イ（シンク等
、１９８７年、５ｈｉｎ＠ｈｉ　ｅｔ　ａｔ、。
１９８７）、７４　Ａ／　ｐ−を（Ｌ１２５ｍＭＮａＣ
ｔ、　１　％ＳＤＳ、４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ
７，２）、ＩｍＭＥＤＴＡ中、５０℃で洗浄してスクリ
ーニングする。２４の陽性のプラークを精製し、ｐＢｓ
ｃｈｔ　１５と命名された１つのクローンのＤＮＡ配列
は以下の通シである： この配列のクローンにコードした蛋白は、（１１塩基性
タバコキチナーゼと限られた構造相同性、 （２）　ＰＲ−Ｑのアミノ末端蛋白配列との相同性、釦
よび蛋白配列分析で決定したようにＰＲ−Ｑから誘導さ
れた多くの内部ペプチドの配列との相同性（上記参＠） に基きＰＲＰ　　Ｑであると決定される０分離したクロ
ーンはトランクイトされたｃＤＮＡであるらしい。その
ｃＤＮＡの５′−末端を分離するために、ｍＲＮＡの末
端を１ず決定する。
配列 ５’ＣＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＡＡＴＧＣＡＴ５’のオリ
ゴヌクレオチド　プライマーをオリゴＡとして、β−シ
アノエチルホスホルアミダイト化学で合成し、標準法で
精製する。このプライマーをＴＭＶ感染葉から分離した
ＲＮＡを使い、上記のようにプライマー伸長実験で使用
する。
二ツノ伸長生放物を、ｐＢｓｃｈｔ　１５ＣＤＮＡ　　
よシ４３　ｂ　ｐ　ｋ　ヨび５３ｂｐ長いｍＲＮＡ末端
ポイントに相当するとオートラジオグラフィーで示す。
ＰＲ−ＱｃＤＮＡの５′−末端を分離するために、クロ
ーニングの新しい方法をＰＣＲ手法に基いて開発する。
本質的には、二つのプライマーを、ｃＤＮＡライブラリ
ーからのｃＤＮＡクローンの５′−末端を増鴫し、クロ
ーニングするのに使用する。１つのプライマー（オリゴ
Ａ）ｉ！ｃＤＮＡのセンス−ストランドに相補的で９Ｂ
ｓｃｂｔ１５ｃＤＮＡに約１６０塩基這入って位置し、
第二のプライマー（下記のオリゴＢまたはオリゴＣ）Ｕ
λクローニングベクターの両サイドからｃＤＮＡにプラ
イマーとして働くもので、これらをこの方法で使用する
。
オリゴＡａ　ＰＲ−ＱｍＲＮＡと相補的でエンドヌクレ
アーゼＮ５ｉｌで認識される配列を含む。
配列 ５’ＧＧＣＡＧＧＧＡＴＡＴＴＣＴＧＧＣ５’によひ５
’ＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣ（ｊ’を持つ他の
二つのオリゴヌクレオチドを合成、精製してオリゴＢｊ
？よび第１１ゴＣと命名する。
オリゴＢはλＯｎｇＣクローニングベクターの部分と同
じ配列を持ち、オリゴＣばλＯｎｇＣクローニングベク
ターのポリＩＪンカーに相補的である。
ＰＲ−ＱｃＤＮＡの５′−末端をクローニングするため
、二つのＰＣＲを行う。一つはオリゴＡｂよびＢを使用
し、もう一つはオリゴＡとＣを用いる。ｃＤＮＡライブ
ラリーの一部を反応のテンプレートとして使用する。い
ずれもの方向でλＯｎｇＣベクターに連結されるクロー
ンを増幅するためには二つの反応が必要である。対照と
して、キチナーゼ１５分離体を使い、精製７アージ破砕
物の一部で反応を行う、増幅後、ＤＮＡを精製し、Ｎ５
ｉＩとＥｃｏＲＩで消化し、ｔ　５　％　Ｌ　Ｇ　Ｔア
ガロースゲルに流す、対照よう長いＤＮＡフラグメント
を含むゲル片を切シ出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連
結し、上記のようにＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化す
る。形質転換後、陽性コロニーを分離し、ＤＮＡ配列分
析でＤＮＡ挿入を調べる。いくつかの挿入がＰＲ−Ｑｃ
ＤＮＡの５１−末端を含み、他のものＦｉＰＲ−Ｐの５
′−末端を含む（クローンから推定されるアミノ酸配列
を上記のように分析した蛋白配列と比較して決定）。次
いで、ＰＲ−Ｐの３′−末端を、ＰＲ−Ｐ％ｐＢＳｃｈ
ｔ　５’　−５の５′−分離体の一つからのプローブを
使いｃＤＮＡライブラリーの約１０１１１１．０００ク
ローンをスクリーニングして、ｃＤＮＡライブラリーか
ら分離する。陽性ファージを分離、精製し、挿入をｐＢ
ｌ−ｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングする。いくつ
かの挿入の配列を分析し、その一つ、ｐＢＳｅｈｔ、２
８がＰＲ−Ｐをコードしていると決定、ＰＲ−ＰのＤＮ
Ａ配列は下記の通シである： 実施例１　Ｂ　　ＰＲ−０’をコードするｃＤＮＡクロ
ーンの分離 β−１，３−グルカナーゼ（シンク等、１９８８年、５
ｈｉｎｓｈｉ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１９８８　）の
塩基性型をコードするｌｌｉ＠ｃＤＮＡグローブを使い
、フィルターを５０℃で、αｊ２５ＭＮａｃｔ、　　ｊ
％ｓＤｓ、　４０ｍＭリン酸ナトリウＡ（ｐＨ７２）、
１ｍＭＥＤＴＡ中で洗浄する方法で、上記のｅＤＮＡラ
イブラリーの約５００，０００プラークをスクリーニン
グする。１５の陽性プラークを分離し、その挿入をプラ
スミド　ブルースクリプト（ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　）
にサブクローニングする。部分的にＤＮＡ配列を決定す
ることから、ｐＢｓＧＬ５とｐＢｓＧＬ６ｅがβ−１，
５−グルカナーゼ塩基性型の公知のＤＮＡ配列と約５５
優の相同性を持つ向じｃＤＮＡをコードしていることが
わかる。クローン５１１？よび６のｃＤＮＡの配列を定
め、１ラスミドｐＢＳＧＬ６ｅ中（７）ｃＤＮＡの配列
７として示す。
ＰＲ−０’蛋白からのペプチドのアミノ酸配列との比較
に基き、このｃＤＮＡはＰＲ−０’蛋白Ｌβ−１，３−
グルカナーゼの酸性型）をコードしている。
塩基性β−１，３−グルカナーゼとのドツトマトリクス
比較から、ｃＤＮＡ配列７は釦そら＜５′−末端から約
８０項基を失っているらしいことがわかる。ＰＲ−０’
ｃＤＮＡの全長型を分離するため、ｐＢＳＧＬ６ｅ　　
プラスミドから誘導された標！１ｌｌＥｃｏＲＩ制限フ
ラグメントを使ってライブラリーを再度スクリーニング
する。６つの陽性クローンを分離し、精製してブルース
クリプトプラスミドにサブクローニングする。プラスミ
ドへの挿入の配列をＤＮＡ配列分析で決定。１つのり０
　７、ｐＢＳＧＬ５Ｂ−１２はｐＢＳＧＬＡｅ中のｃＤ
ＮＡよシ８７塩基長い（配列７Ａ）。
−ンの分離 ＴＭＵ感染感染コバ３ら分離したＲＮＡから上記のよう
にしてｖ４製したｃＤＮＡライブラ＋７−の約３０α０
００　プラークについて、式：　　ＡＴＧＴＴＹＧＡＹ
ＧＡＲＡＡＹＡＡ（式中、 各Ｙは独立にピリミジンＣまたはＴから選ばれ、 各Ｒは独立にプリンＧｔたはＣから選ばれる：で表わさ
れる標識オリゴヌクレオチド（ＪＲ１３８：の混合物を
含むプローブをスクリーニングする。
このプローブは混合物中で１６の折りたたみ重複を持つ
１７塩基長である。このプローブのデザインは実施例１
１Ｂの蛋白データの分析に基〈。
このプローブはＰＲ−２、ＰＲ−Ｎ筐た＃ｉ塩基性β−
１，３−グルカナーゼを含むクローンを認識し。
ＰＲ−０’またはＰＲ−０を認識しない。３０の陽性に
ハイブリダイズしたプラークを分離し、精製して、その
挿入をブルースクリプト　プラスミドにサブクローニン
グする。挿入の配列をＤＮＡ配列分析で決定し、その結
果から、少くとも５種の区別できるｃＤＮＡが分離され
たことがわかる。実施例１［１の蛋白データと比較する
と、１つの型のクローンがＰＲ−２蛋白をコードする全
長のｃＤＮＡを含み（ｐＢｓＧＬ１１７）、モラーつの
型がＰＲ−０蛋白をコードしく　ｐＢＳＧＬ１３４　）
、今一つの型がＰＲ−Ｎ蛋白をコードしく　ｐＢＳＧＬ
１２５およびｐＢＳＧＬ　１４８　）、筐た、一つの型
はＰＲ−２，ＰＲ−Ｎ　−１タＦｉＰＲ−０−ｔ’ｔｆ
　ナイ高度に関連性のある蛋白をコードしていることが
明らかである。
ＰＲ−０をコードするｃＤＮＡクローン、を分離し、！
た、よシ全長のｃＤＮＡクローンを分離するために、ｐ
ＢｓＧＬｆ２５のＰａｔｌ制限フラグメントを用いてラ
イブラリーの二度目のスクリーニングを行う、ｐＢｓＧ
Ｌｆ２５ｔｉＰＲ−Ｎをコードする５００ｔ）ｐのクロ
ーンで、５′−末端はトランヶイトされている。ライブ
ラリーの約３０ＱＯＯＯプラークをスクリーニングして
、１７の陽性プラークを分離し、精製してブルースクリ
プトにサブクローニングする。その挿入の配列をＤＮＡ
配列分析で決定する。
すべての酸性グルカナーゼから全長のクローンが分離さ
れたことを確かめるため、二つの最終的戦法を使う。第
一は、ｐＢＳＧＬ１１７からの、２１０ｂｐのｐＶｕｌ
ｌ　　ＴＩｑＩ制限フラグメントをプローブとして使っ
た最終のスクリーニングを行う、このスクリーニングで
１７のクローンを分離し、精製してブルースクリプトに
サブクローニングし、その配列をＤＮＡ配列分析によっ
て決定する。
第二の戦法は実施例１７に記載したようなＰＣＲ戦法、
・札（よノリライブラリーからのｃＤＮＡの５′−末端
を増幅することである。この場合には、ＰＲ−２ｃＤＮ
Ａ配列の位［１５２から１６９に相補的な第三のオリゴ
ヌクレオチドＪＲ２０９と共に二種のオリゴヌクレオチ
ドｔ３ｊ？よびＣを使う。
この実験にＤいて、二つのＰＣＲを使用する：１つはテ
ンプレートとしてｃＤＮＡライブラリーの一部分よびプ
ライマーＪＲ２０９とＤＰＯＩ（実施例１７のオリゴＢ
）を含み、もう一つはテンプレートとしてｃＤＮＡライ
ブラリーの一部を使い、プライマーとしてＪＲ２０９と
ＧＰ５Ｂ（実施例１７のオリゴＣ）を使う。ＪＲ２０９
の配列は以下の通り： ＪＲ２０９５’ＡＡＣＡＴＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＴＧＧ
３’アンプリフイケーシ璽ン（増幅）実験に１ける陽性
対照は、ＪＲ２０９とＤＰＯｔで増幅された全長のＰＲ
−２ｃＤＮＡをコードする精製ＧＬ１１７クローンの一
部である。この実験の陰性対照ＶｉＪＲ２０９とＧＰ５
Ｂを使った増幅である。ＰＣＲ。
生成物の一部をアガロース　ゲル電気泳動で分析し、は
ぼ陽性対照のサイズのバンドが各プライマーのセットに
ついてライグラ１１−から増幅されることがわかる。こ
の結果は、この方法で成功が得られ％ＤＮＡ分子１フラ
ッジ瓢」の末端をつくるために、残シのＤＮＡを精製し
、マニアチス等（１９８２年）、Ｍａｎｉａｔｔｓ　ｅ
ｔ　ａｈ（１９８２）によシ記載されているように、　
４種のｄＮＴＰすべての存在下にＤＮＡポリメラーセ！
のフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）フラグメントで処理でき
ることを示唆している。フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）酵
、索を６５℃で１５分間加熱して失活させ１次いでその
Ｄ　Ｎ　Ａ　ｆｔＥｃｏＲＩで制限分解する。ＤＮＡを
精製し、１．５％ＬＧＴアガロース　ゲルで電気泳動す
る。ゲルから正しい大きさのＤＮＡバンドを切り出し、
ブルースクリプト　プラスミドに連結するためＶＣ使用
し、プラスミドは予じめＥｃｏＲＩとＥ　Ｃｏ　ＲＶで
制限分解してｐ〈。連結して細菌を形質転換し、陽性コ
ロニーを選択してＤＮＡバンド、列分析で分析する。
前に行う方法のＭ４Ｆｉ、ＰＲ−２、ＰＲ−Ｎ、、ＰＲ
−０＞よび第四の型の酸性グルカナーゼ、未知蛋白をコ
ードしているＰＲ−２’のための全長ｃＤＮＡクローン
を含むクローンの分離である。ＰＲ−２の配列は次の通
りである： ／ ｐＢＳＧＬ１５４＃−１ＰＲ−０蛋白をコードするｃＤ
ＮＡ挿入を含む分離されたプラスミドである。λファー
ジλｔｏｂｃＤＮＡＧＬ１５５　ｈよびλｔｏｂｃＤＮ
ＡＧＬ１６２ＦｉＰＲ−ＯｃＤＮＡ全ＤＮＡむクローン
である。ファージλｔｏｂｃＤＮＡＧＬ　ｔ　６１は全
長ＰＲ−２’ｃＤＮＡを含むクローンである。
ｃＤＮＡ挿入にコードされた蛋白の決定＃−ｔ１１ＢＫ
＆ける蛋白データとｃＤＮＡ挿入でコードされた推定の
蛋白配列との比較に基く。
上記のようにして調製したサブクローニングされたライ
ブラリーのフィルターリフトを、同じフィルターリフト
について二重のリフトをスクリーニングすることにより
、引き続くスクリーニングを行うこと以外は、前に記載
された方法で（セントジ璽ン　アンド　デイビス、１９
７９年、Ｓｔ　Ｊｏｈｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｔ、　１９
７９　）で標識ｃＤＮＡプローブを使ってスクリーニン
グするつ第一のプローブを、上記のように分離したモツ
ク誘導ＲＮＡ試料のｍＲＮＡからリバーストランスクリ
グターセと［♂”Ｐ］−ｄｃＴＰを使い、上記のように
合成するニゲローブとして使いＸ線フィルムに暴露した
後、同じフィルターを、上記のように、筐たは上記で分
離したＴＭＶ−誘導ＲＮＡ試料から合成したプローブを
使い、再びグローブする（ストリッピングはしない）６
暴露した後、二枚のＸ線フィルムを、コンビエータ−化
ディジタル　イメージ　アナリシス　システム（バイオ
ロジカル　ヒシ璽ン、インコーボレーシ９）、サンホセ
、カリホルニア州Ｂｉｏｌｏｇｉｃ１）（ａ）　Ｖｉｓ
ｉｏａ　Ｉｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、Ｃａ１ｉｆｏ
ｒｎｉａ）を使い、メーカーの指示書に従って比較する
。
そして、ＴＭＶ−誘導グローブでプローブした時にシグ
ナルが上昇しているプラークを選択する。選択したプラ
ークを、約１００／プレートの選択されたプラーク密度
で第二回目のブロービングを行うことでＳ製する。ｃＮ
ＤＡ挿入を下記のようにしてファージから回収する：少
量の分離したファージＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そ
の制限酵素を不活性し、希釈、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼで
再連結してエシェリヒア　コ’）　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　
）ＤＨ−５α株（ベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ
、ベセスダ、メリランド州、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅ
ａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　）に形質転換し、アンピシ
リン含有培養プレート上で生育するものを選択する。こ
の方法は、ファージ　ベクターからのプラスミドベクタ
ーに金管れるｃＤＮＡを直接回収できる。これら二つの
や＼異るクローンのＤＮＡ配列をプラスミドｐｃＩＢ／
ＳＡＲＥＬ２ａ　（例えばｃＤＮＡ　５ＡＲａ２ａ）と
ｐｃＩＢ／５ＡＲａ２ｂ（例えばｃＤＮＡ　５ＡＲａ２
ｂ）中のｃＤＮＡとして配列９および配列１０として示
す。
ノーサン　アナリシスおよびプライマー伸長分析によシ
、モック誘導対ＴＭＶｆｓ導タバコ葉からのＲＮＡの分
析から、ｐＳＡＲ＆２群ｍＲＮＡの定常状態レベルＦｉ
ＴＭＶ誘導によう上昇することが確認される。
実施例１２で決定した蛋白配列の二つの領域を選択し、
そのペプチドをコードできるｍ　ＲＮ　Ａのすべての可
能な組合せに相補的なオリゴヌクレオチドを台底する。
−ｔ−のプローブの配列は以下の通り： ＧＴ　　　　　　　　　　Ａ プローブ１　：　５’−ＣＣＡＴＴＣＴＧＮＣＣＣＣＡ
ＧＴＡ−３’ＧＧＧＣ プローブ２　：　５’−ＧＧＡＴＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡ
ＴＴＧＮＡＣＣＣＡ−３′ 上記で構築したライブラリーから約３００，０００プラ
ークをブレーティングし、プラークリフトを二重にＭａ
ｐ−標識オリゴヌクレオチド混合物（グローブ１）筐た
は混合物２（プローブ２）でグローブ分析する。いずれ
かのグローブでスクリーニングして陽性の結果を示すプ
ラークを分離する。ファージの分離と目動切出しをスト
ラｆｉジーン　ラムダ　ザップ　ラボラトリーマニエア
ル、ストラタジーン、サンジエゴ　アメリカ合衆国（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｌａｍｂｄａ　Ｚａｐ　１ａｂｏ
ｒａ　−ｔｏｒｙ　ｍａｎｕ１）（ａ）、　Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ、　ＳａｎＤｉｅｇｏ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、
　）に記載しであるようにして行う。
キチナーゼｃＤＮＡクローンをプルスクリプトプラスミ
ドに分離してから、ジデオキシ配列決定法で配列を決め
る。プラスミドル　Ｂ　Ｓ　ｃｕｃｃｈｔＳ（ａｋａ　
ｐＢｓｃｕｃｃｈｉ／キチナーゼ）に含１れるキチナー
ゼｃＤＮＡの配列は次の通り： 実施例２０Ｂ：　キエウリベルオキシダーゼｃ　ＤＮＡ 実施例１．２Ｂに示した蛋白データに基きキ瓢ウリペル
オキシダーゼをコードするｃＤＮＡを分離するためにオ
リゴヌクレオチドプローブを指定する。オリゴヌクレオ
チド混合物の配列は次の通りである： ＪＲ７４５’ＡＣＲＡＡＲＣＡＲＴＣＲＴＧＲＡＡＲＴ
Ｇ　５’ここで、各Ｒは独立にプリンＧまたはＣから選
ばれる。このオリゴヌクレオチド混合物は２０塩基の長
さで６４種を含む。
実施例１４Ｂに記載したようにタバコ壊死ウィルスを感
染５日後のキュウリＳ物の葉から分離したＲＮＡからｃ
ＤＮＡライブラリーをｖ４瞥する。このライブラリーは
ラムダＺＡＰクローニングベクターで構築する。
このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの約３０α０００プラ
ークをオリゴヌクレオチドプローブを使ってスクリーニ
ングし、２５グラークを分離する。これらは何回か再ス
クリーニングして精製する。
この方法によう、多数回の精製後、な１陽性を示すもの
として６プラークが残る。これらのクローンに含まれる
挿入をストラタジーン　ラムダ　ザップ　ラボラトリ−
マニュアル（Ｓｔｒａｔａ−ｇｅｎｅ　Ｌａｍｂｄａ　
ＺＡＰ　１ａｂｏｒｅｔｏｒｙ　ｍａｎｕ１）（ａ）　
）に記載された自社切出しグロトコールを使って切り出
す、この挿入をダブルストランプイツト　ジデオキシ配
列決定法によシ配列を定め、その構造をタバコから分離
された酸性リグニン形成ペルオキシダーゼの配列（ラプ
リミニ等、１９８７年、Ｌａｇｒｉｍｉｏｉ　ｅｔ　１
）（ａ）、、　１９８７　）とドツト　マトリクス分析
比較により解析する。これらクローンの内の二つ、Ｐｅ
ｒ！によびＰｅｒ２５、はタバ：７　ＣＤＮＡとある限
られた相同性を示し、更に分析するために選出する。こ
のクローンの完全な配列決定により、これは同じ蛋白を
コードしていることがわかる。
次いで、キエウリペルオキシダーゼかう得たプローブを
キュウリライブラリーの再スクリーニングに使用し、約
ＳＯプラークを分離する。
精製後、挿入をプラスミドとしてのファージから切り出
し、その配列１ｋＤＮＡ配列分析によって決定する。
この分析の結果、キュウリからの二つの型のベルオキシ
ダーセｃＤＮＡクローンを分１１１ｔルーーつはプラス
ミドｐＢＳＰＥＲＩでコードされた塩基性蛋白をコード
し、そのヌクレオチド配列は次の通シであり、もう一つ
はグラスミドｐＢＳＰＥＲ２４とｐＢＳＰＥＲ２５に含
１れる関連ペルオキシダーゼをコードする。
セクタ曹ン３Ｃ新規な分別クローニングおよびスクリー
ニング技法の開発 他の分子集団よう非常に多い量の分子集団で存在する配
列の効果的なエンリッチメントを可能にする方法を考え
開発する。この方法の最も有効な利用は、その集団が非
常に類似していて、分別されて存在する配列がその集団
の非常に少い集団であるような場合である。
もし、二つのクローンの集団が類似していて、一つの集
団として存在するクローンをよシ多い量で分離したと考
える時（すなわち、「誘導された」筐たは「分別的に制
御される」）、過去の手法では、二つの集団からグロー
ブを使ったスクリーニング（＋／−スクリーニング　セ
ントジ曹ン　アンド　デイビス、１９７９年（ＳｔＪｏ
ｈｎ　ａｎｄ　Ｄｉｖｉｓ、　１９７９　）　）％４り
ｆｉ、／Ｓイブリダイゼイシッンおよびヒドロキシアパ
タイト（ＨＡＰ）クロマトグラフィー（デイビス等１９
８４年、Ｄａｖｉｅｔ　１）（ａ）、、　１９８４　）
によるプロ−フ゛またはｍＲＮＡのエンリッチメントを
使う。
第一の方法は約２０００に１以上で存在するクローンが
検出されるという感度の制限が示されてかり、第二の労
力がかかり、技術的に困難で、殻間でも２０乃至５０倍
のエンリッチメントである。
本発明の方法は分子工学における最近の発展：ＰＣＲ（
サイキ等、１９８８年、５ｉｉｋｉ　ｅｔ　ｍｌ、。
１９８８）＄−よひビオチン−アビジ−クロマドグ：７
７４−　（スター　ｋ等１９８８年、５ｔａｈｌ　ｅｔ
　ｍｌ、。
１９８８）を利用している。ＰＣＲにより特定の配列の
ＤＮＡを大量に簡単に合成でき、ビオチンーアヒシンク
ロマトグラフィーはビオチン親和タグを持つ分子をタグ
を持たない分子から効果的に分離できる。
一般的な形でｔｉ、この方法は二つの異る集団（「誘導
された」対「非誘導の」）を代表するｃＤＮＡの単一ス
トランドで、二つの集団で相反する（：ＤＮＡｍ性を持
ち、すなわち、ｍＲＮＡと相対的に「センス」極性の一
つと、他はその相補的なもの、またはｍＲＮＡと相対的
に１アンチセンス」極性のものを分離することから成り
立っている。「誘導された」集団からの分離ストランド
は親和タグを持つであろうし、一方、「非誘導の」集団
からの相対する極性のストランドは安定な親和タグを待
つであろう、これら二つの集団をハイブリダイズすると
、ハイブリッドが二つの集団に存在する相補的ストラン
ド間で形成されるであろう。相手を持たない「誘導され
た」集団からのストランド、あるいは「非誘導の」集団
のほとんど相手のない多くは単一ストランド（１本鎖）
で残る。１非誘導の」集団分子のストランド上に親和タ
グ（云わば取手）が存在するため、これらのストランド
および、最も重要なことは、バイブリド分子をすべて親
和クロマトグラフィーで混合物から除くことができる。
これによシ、「非誘導の」集団で有意に表わされない「
誘導された」分子のみが残る。
次に、この「誘導された」分子を標準法でクローニング
し、それから「誘導の」クローンを分ａするためのエン
リッチされた集団として使う。
あるいは、このエンリッチされた分子を個々に増幅して
直接に配列を決めることもできる。
別法のスキームは上記と同じであるが、不安定な親和タ
グを「誘導の」集団分子にのみ取込豊せ、「非誘導の」
集団の親和タグは安定である点が異る。この場合の「不
安定」は、その親和タグをいつでも除去できるか、また
はもはや親和タグとして使用できないようにいつでも考
えられることをｆｆ１ｌＪＲする。このスキームでは、
ハイプリダイセイション混合物のすべての分子は親和マ
トリクスに結合できるが、相補的な「非誘導の」相手に
ハイブリダイズされない「誘導の」分子のみが次のクロ
ーニングのマトリクスから選択的に回収される。
下記のものはファージクローニングベクター０ｃＤＮＡ
集団を使った上記の第一のスキームの特定の例である。
「誘導の」ｐよび「非誘導の」ｃＤＮＡ集団（この場合
、ＴＭＶ＃導會たはモック誘導タバコ葉からのｍＲＮＡ
から構築）を二種の異るファージにクローニングし、そ
のクローン挿入の増幅のために使うプライマーは異って
いる（そのため後のステップでハイブリダイズしない）
、「誘導のＪｃＤＮＡバンクをλＧＥＭ−４（プロメカ
、インコーポレイテッド、Ｐｒｏｍｅｇ＾Ｉｎｃ、　）
で構築し、「非誘導の」または１モツク誘導のＪＤＮＡ
パンクをλＺＡＰ−Ｉｆ　（ストラドジン、インコーホ
レイテッド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ。
Ｉｎｃ、　）で構築する。各ベクターのために、特定の
オリゴヌクレオチド　ブライマーを合成するが、それら
はファージベクターでｃＤＮＡクローニング部位の直ぐ
隣の配列を表わし、相当するファージの存在下にポリメ
ラーゼ連鎖反応で使用する時、ｃＤＮＡクローニング部
位にクローンされたＤＮＡが増幅されるようにする。各
々バンクのすべてのメンバーを表わすファージの集団を
いっしょに増幅し、バンクを表わすｃＤＮＡ挿入の集団
をつくる。各々の場合のオリゴヌクレオチドプライマー
の一つはビオチン化し、各増幅されたバンクＤＮＡの特
定のストランドをアビジン親和クロマトグラフィーとス
トランド分離、次いでビオチン選択ストランドの放出と
回収でポジティブに選択できる：重要なことは、ビオチ
ン化のために使用するプライマーを１誘導の」対「非誘
導のＪｃＤＮＡバンクから相反対の極性のストランドを
選択するように選択する。
「誘導のＪＤＮＡの場合のビオチン　タグは不安定なも
ので、ビオチン残基がそれを介して結合しているスペイ
サ−アームはジスルフィド結合を含み、「非誘導のＪＤ
ＮＡのタグは安定なものである。この場合、「誘導の」
集団からの一本＠はＤＴＴ処理で放出され、ビオチンタ
グを失い、「非誘導の」集団からの一本ｆｉはアビジン
分子の変性で放出されるがビオチンタグは残る０回収さ
れた「目標のＪＤＮＡ（「誘導の」ライブラリーからの
単一ストランド）を回収された「ドライバーＪＤＮＡ（
ｒモツクー誘導の」嘗たば「非誘導の」ライブラリーか
らの一本鎖）とハイブリダイズさせた時、形成される複
合体および過剰の「ドライバー」ＤＮＡをアビジン親和
クロマトグラフィーで除去できる。残存の１目的のＪ　
Ｄ　Ｎ　ＡＨＡだプライマー配列を持っていて、引き続
くリペア筐たは増幅およびクローニングにより、回収金
非常に容易にする。
別のスキームでは、「目的の」釦よび「ドライバーの」
−木調ＤＮＡ両方を親和マ）　ＩＪクス上のアビジン変
性にょう回収し、両方ともビオチン　タグを保持してい
る。ハイプリダイダイシロン後、すべての分子を親和マ
トリクスに結合させ、洗浄後、「不安定な」親和タグを
持つ非・・イブリダイズ性の「目的のＪＤＮＡをＤＴＴ
によってマトリクスから選択的に溶出する。
この修局方法は、ハイブリダイゼイション混合物の親和
マトリクスへの定量的以下の結合についての問題がなく
、−木調の「目的のＪＤＮＡのポジティブな選択を可能
にする。
この方法が前に記載した方法より優れている所は、特定
の環境で低レベルにのみ作用開始し、ある重要な生物学
的現象で原因となる役割を果すような遺伝子を分離する
ことができる点である。
上記の方法の両方の形において、「目的の」かよひ「ド
ライバーの」−木調ＤＮＡはビオチン−アビジン親和ク
ロマトグラフィーで得られる。
これらの−木調果ｔ！ｆｌを生じさせる別の方法は１非
対称ＪＰＣＲとして記載された方法である（ジレンステ
ン　アンド　エールリッヒ、１９８８年、Ｇｙｌｌｅｎ
ｓｔｅｎ　ａｎｄ　Ｅｈｒｌｉｃｈ、　１９８８　）。
これは、ＰＣＨの場合と同じであるがプライマーの一つ
のみを存在させて行うポリメラーゼ伸長と変性の多数回
のサイクルで成立りている。
選んだプライマーが得られるＤＮＡの極性を決定するの
で、上記のような方法に必要な極性の選択ができる。こ
の場合、非対称ＰＣＲをテンプレートとして適切な集団
の二本＠ＰＣＲ生成物の少量を使用して容易に実施でき
、それから過剰のプライマーを除く。
セクション屯　キメラ遺伝子 このセクションには、ｃＤＮＡの転写をプロモートする
配列と植物細胞にかいてｍＲＮＡの３′−末端のグロセ
ッシングを容易にする配列を持っｃＤＮＡ配列の組合せ
を記載する。
セクション４Ａ　植物発現カセットを含ムプラスミドの
構築 ｐＣＧＮ　１５０９ｄ、タハ：７　ＲＵＢ　Ｉ　ＳＣＯ
小す７’　−Ｌ　ニット遺伝子からの５′−調節領域お
よびプロモーター、アグロバクテリウム　テ瓢メファシ
ェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）のＴｉプラ
スミドのオクトビンシンターゼ（ｏｃｓ）遺伝子からの
３′−領域を含み、これら二つの部分の間に特異な制限
部位を持つ発現カセットプラスミドである。その５′−
調節領域はタバコＲＵＢＩＳＣＯ小すブユニット遺伝子
ＴＳＳＵ３−８を含むｌ　４　ｋｂＥｃｏＲＩ　フラグ
メントから究極的に誘導される（オニール等、１９８８
年、Ｏ’ｎｅ１）（ａ）　ｅｔ　１）（ａ）、、　　１
９８８　）ａこのＴＳＳＵ３−８の五４　ｋｂＥｃｏＲ
ＩフラグメントをＭ１３ｍｐ１Ｂ（ヤニシュ、−ベロン
等、１９８５年、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ
　１）（ａ）、、　１９８５　）のＥ　ｃｏ　Ｒ１部位
にクローニングしてＭ１３クローン８Ｂｉ得る。ＤＮＡ
ポリメラーゼｌのフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）フラグメ
ントを使ってオリゴヌクレオチドプライマー「グローブ
１」（オニール等、１９８７年、αＮｅ１）（ａ）　ｅ
ｔ　１）（ａ）、、　１９８７　）を伸長すルタめに単
一ストランドＤＮＡをテンプレートとして使用する。伸
長生成物をナタマメ（ｍｕｎｙ　ｂｅａｎ）ヌクレアー
ゼ処理し、　Ｈｉｎｄ　ＤＩで消化して小サブユニット
プロモーター領域を含む１４５０ｂｐ　　フラグメント
を得る：そのフラグメントをＨｉｎｄ田−８ｍ１）（ａ
）ｌ消化ｐＶＣ１８）’ｒ＝−７ｚ−べ１）（ａ）等、
１９８５年、Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　１
）（ａ）、、　１９８５　）にクローニングしてｐＣＧ
Ｎ　６２５を得る。　ｐｃＧＮｂ２５のＢａｍＨＩ−Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントを、ｏｓｃｓ’領域の１１２０７
位のＳｍａ　１部位（バーカー等、１９８５年、Ｂａｒ
ｈｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１９８３　）が合成Ｂ
ｇｌ［Ｉリンカ−（ファシオッティ等、１９８５年、Ｆ
ａｃｃ−ｉｏｔｔｉ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１９８５
　）の連結によってＢｇｌｎ部位に変換されたＢａｍＨ
Ｉ　−Ｅ　ｃｏ　ＲＩ消化ｐＣＧＮ６０７の大きなりａ
ｍＨＩ　−Ｅ　ｃｏ　ＲＩフラグメント（プラスミド骨
格）にクローニングする。これによってプラスミド１）
ＣＧ８６３０ｔ−得る。ｐ　ＣＧＮ６３０のＢａｍＨ１
部位をＢａｍＨＩによる消化で欠落させ、ＤＮＡポリメ
ラーセｌのフレノウ（Ｋｌ、ｅｎｏｗ　）フラグメント
処理でｐｃＧＮ１５０２をつくる。ｐｃＧＮ１５０２の
Ｋｐｎ　１部位を、Ｋｐｎ　１によるｐＣＧＮ　１５０
２の消化、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素処理、および
合成りａｍＨＩ’Ｊンカーとの連結によってＢａｍＨｎ
部位で置換する。得られる構築物がｐ　ＣＧＮ　１５０
９である。
カセット）の構築 ｐｃＧＮ１７６１ｉｊ、ｐＶＣ−誘導グー）スミド骨格
に、二重Ｃａ　ＭＶ　５５　Ｓプロモーター訃よび１ｍ
−１３’部位と、その間にＥｃｏＲｎ部位を含む。グロ
モーターＥｃｏＲＩ−３’グロセッシング部位カセット
は容易に除去できるように複数の制限部位で縁取られて
いる。このプラスミドは、その自身がｐＣＧＮ１６４か
ら誘導された最初の二重−５５Ｓグラスミド、ｐＣＧＮ
２１１３とｐＣＧＮ６５８から、一連のステップ（下に
記す）で誘導される。
ｐＣＧＮｌ　４３１も二重　ＣａＭＶ　３５　Ｓ　　プ
ロモーターとｔｍ−ｊ３’領域、およびその間に複数の
クローニング部位を含んでいる。このプロモーター（タ
ーミネイターカセットはアンピシリン耐性よりむしろク
ロラムフェニコール耐性を含むｐＵＣ−誘導ベクター中
に台筐れる。このカセットは容易に除去するために複数
の制限部位で縁取られている。
Ａ、　ｐＣＧＮ９８６の構築 ｐＣＧＮ９８６　ｉｊ　３５ＳＣａＭＶ　３５プＯモー
１−Ｔ−ＤＮＡ　ｔｍ　−１５’＠／域、しよびその間
に複数の制限部位を含む。ｐＣＧ８９８６は、（：ａＭ
Ｖ５５Ｓプロモーターかよひ異る３′領域であるＣａＭ
Ｖ＠域Ｍ　３／−末端を含むもう一つのプラスミドのｐ
ｃＧＮ２０６から誘導される。ＣａＭＶ　３５　Ｓ　プ
ロモーターをＡｌｕｌフラグメント（ｂｐルア１４−７
７３４）（ガードナー等、１９８１年、Ｇａｒｄｎｅｒ
　ｅｔ　１）（ａ）、。
１９８１）として、Ｍｌ　３ｍｐ　７　（メッシング等
、１９８１年、Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、　１９
８　ｊ　）のＨｉｎｅ　ｎ部位にクローニングして０６
１４をつくる。
Ｃ６１４をＥｃｏＲＩ消化すると３５５プロモーターを
含むＣ６１４からのＥｃｏＲＩ　フラグメントを生じ、
これｅｐＵｃａ（ビイエラ　アンド　メッシング、１９
８２年、Ｖｊｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ
　１）（ａ）、。
１９８２）のＥｃｏ　Ｒ１部位にクローニングしてｐＣ
ＧＮ　１４７を得る。
プロモーター領域、選択性マーカー（２ＡＴＧを持つカ
ナマイシン）および３′領域を含むｐＣＧＮ１４８Ｊｌ
を、ｐｃＧＮ５２１３をＢｇｌｌｌで消化し、ｐＣＧＮ
１４７からのＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ［ｌプ（ｆｆ％−ター
フラグメントを挿入することによって調製する。このフ
ラグメント會、Ｂｇｌ１１部位が、ｐＣＧＮ５２８のカ
ナマイシン遺伝子に最も近くなるようにｐＣＧＮ５２Ｂ
のＢｇｌ［１部位にクローニングする。
この構築に使用するシャトル　ベクター　ｐＣＧ８５２
Ｂ　を次のようにしてつくる。：＄）ＣＧＮ５２５を、
カナマイシン遺伝子を入れたＴｎ５を含むプラスミド（
ヨルゲンセン等、１９７９年、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ　ｅ
ｔ　１）（ａ）、、　１９７９　）をＨｉｎｄ　Ｉｎ　
−ＢａｍＨＩで消化し、そのカナマイシン耐性遺伝子を
含むＩ（ｉｎｄ　Ｉｌｌ　−Ｂａｒｎ　ＨＩフラグメン
トをｐＡＣＹＣ１８４のテトラサイクリン遺伝子（チャ
ン　アンド　：７−　ｚ　：／　　１９７８年、Ｃｈａ
ｍ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｍ。
１９７８）のＨｉｎｄ　１０−１０−Ｂａ　　部位に挿
入することによってつくる。ｐＣＧＮ５２６５（、Ｓｍ
ａ　１部位に挿入されたＸｈｏ　Ｉ　’Ｊンカーで修飾
されたｐＴｉＡ６（トマ’／！ｌつ等、１９８０年、Ｔ
ｈ　ｏｍａ　ｓ　ｈ　ｏｗｅｔ　１）（ａ）、、　１９
８０）のＢａｍＨＩ７ラグメント１９をｐｃＧＮ５２５
のＢａｍＨＩ部位に挿入することによっテラくル。ｐＣ
ＧＮ　５２８　Ｆ′ｉ小Ｘｂｏ　Ｉ　ノ欠落と再連結に
よって得られる。ｐＣＧＮ１４９ａを、ｐＭＢ９Ｋａｎ
　ＸＸＩからのＢａｍＨＩカナマイシン遺伝子フラグメ
ントをｐＣＧＮ１４８ａのＢａｍＨ１部位にクローニン
グすることによシつくる。ｐＭＢ９ＫａｎＸＭはｐ　Ｕ
　Ｃ４Ｋ亜株で（ビエイラ　アンド　メツシング、１９
８２年、Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　１
９８２　）。
Ｘｈｏ１部位を失っているがＴａ２０５　からの＠能カ
ナマイシン遺伝子を含み、アグロノくクテリウム（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）にかいて効果的選択ができ
る。
ｐＣＧＮ　１４９　Ｂ　ｆ　Ｈｉｎｄ　０１とＢａｍＨ
Ｉで消化し、Ｈｉｎｄ　ｍとＢａｍＨＩで消化したｐＵ
Ｃ８に連結してｐＣＧＮ　１６９を得る。これにより’
ｌ”ｎ９０３カナマイシンマーカーを除去する。ｐＣＧ
Ｎ　５６５とｐ　ＣＧＮ１６９両方をＨｉｎｄ　ｍとＰ
ｓｔｌで消化し、連結してｐｃＧＮ２０３を得る。この
プラスミドｌｄｃａＭＶ３５ＳプロモーターとＴＮ５カ
ナマイシン遺伝子の５′末端の部分（Ｐｓｔ　１部位１
で、ヨルゲンセン等、１９７９年、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ
　ａｔ　ａＬ、、　１９７９　）を含む。３′調節領域
を、ｐｃＧＮ２０４　（ｐＵｃ１８）ガードナー等、１
９８１年、Ｇａｒｄｎｅｒ　ｅｔ　ｉｌ、。
１９８１）にサブクローニングされた遺伝子■の３１領
域を含むＣａ　Ｍ　ＶのＥ　ｃｏ　ＲＩフラグメント（
ｂｐａｏａ−ｓｔｏｓ　）　）からＨｉｎｄ　Ｉｌｌと
Ｐｓｔ　Ｉで消化し、連結することによってｐｃＧＮ２
０３に加える。祷られたカセットｐｃＧＮ２０６がｐＣ
ＧＮ９８６構築の基礎である。
ｐＴｉＡ６Ｔ−ＤＮＡ　Ｌｍ　−１５’−配列をＢａｍ
１９　Ｔ−ＤＮＡフラグメント（トマシ３り等、１９８
０年、Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１
９８０　）からＢａｍＨＩ　−Ｅｃ。
Ｒ１フラグメント（バーカー等、１９８３年、Ｂａｒｋ
ｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１９８５にかける番号で
ヌクレオチド９０６２から１２．８２３）としてサブク
ａ−ユングし、４１製オリジンｐＡＣＹＣＩ８４　（チ
ャンアンド　コーエン、１９７８年、Ｃｈａｎ　ａｎｄ
　Ｃｏｈｅｎ。
１９７Ｂ）とＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄ　ＩＩ　　フラグ
メントとして、筐たゲンタマイシン耐性マーカー（プラ
スミドル［、Ｂａ１からの）〔デイ−、フィブルスキー
　　Ｄ、Ｆｉｇｕｒｓｋｉ　）とＢａｍＨＩ　−Ｈｌｎ
ｄ　Ｉｔ　７ラグメントとして結合させてｐＣＧＮ　４
１７をつくる。
１）ＣＧＮ　４１７の特異なＳｍａ　１部位（Ｂａｍ１
９７ラグメントのヌクレオチド１１，２０７）をリンカ
−を使ってＳａｃ　１部位に変え、ＢａｍＨＩ　−５ａ
ｃ　ｌ　７ラグメントをｐＣＧＮ　５６５にサブクロー
ニングしてｐＣＧＮ　９７１を得る。ｐＣＧＮ９７１の
ＢａｍＨ１部位をリンカ−を使ってＥｃｏＲＩに変えて
ｐＣＧＮ９７１Ｅ１ｆｔ得る。得られたｔｍ−１ｓ′−
調節配列を含むｐＣＧＮ９７１ＥのＥｃｏＲＩ　−５ａ
ｃ　Ｉ　７ラグメントをＥｃｏＲＩとＳａｃ　Ｉ消化に
よりｐｃＧＮ２０６につなぎｐＣＧＮ９７５を得る。Ｃ
ａＭＶ　５５　Ｓプロモーターの５′末端から５ｉｌｌ
とＢｇｌＯ消化し、プラント末端にして５１）（ａ）ｌ
リンカ−と連結させてＴｎ５カナマイシン耐性遺伝子の
小部分を欠落させる。最終的な発現カセットｐＣＧＮ９
８６は二つの５ｉｌｌ部位を伴うＣａＭＶ３５Ｓプロモ
ーターＸｂａ１部位、ＢａｍＨＩ　、　Ｓｍａ　Ｉ　Ｋ
ｐｎｌ　＞よびｔｍ−一１３′領域（ＴＤＮＡのヌクレ
オチド１１２０７−９０２３）を含む。
Ｂ、　　ｐＣＧＮ　ｔ　６４の構築 ＣａＭＶのＡｌｕ　Ｉフラグ）１７ト（１）ｐ７１４４
７７５５）（ガードナー等、１９８１年、Ｇａｒｄｎｅ
ｒｅｔ１）（ａ）、、　１９８１　）を、Ａｌｕ　Ｉで
消化し、Ｍ１５ｍ。
７のＨｉｎｃ　ｎ部位にクローニングしくビエイラアン
ド　メッシング、１９８２年、Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄＭ
ｅｓｓｉｎｇ、　１９８２　）、Ｃ６１４をつくること
によって得るｅｃ６１４をＥｃｏＲＩ消化すると３５５
７°ロモータを含むＥｃｏＲ１フラグメントを生じ、こ
れをｐＵＣ８）ビエイラ　アンド　メッシング、１９８
２年、Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　１９
８２　）のＥｃｏＲ１部位にクローニングしてｐｃＧＮ
１４６金得る。７’ｏモーター領域の縁を取るため、Ｂ
ｇｌＯｇ位（ｂｐ７６７ｏ）をＢｇｌ［ｌとＢａ１３１
で処理し、次いでＢｇ同クリンカをＢａ１３ｆ　処理′
したＤＮＡに付けてｐＣＧＮ　１４７をつくる＠　ｐｃ
ＧＮ１４７をＥｃｏＲＩで消化し、得られた３５Ｓ　プ
ロモーターを含むＥ　ｃｏＲ１−Ｈｐｈ　Ｉフラグメン
トをＥｃｏＲＩ−３ｍ１）（ａ）Ｉ消化Ｍ　１３ｍｐ　
８　（ビエイラアンドメツシング、１９８２年、Ｖｉｅ
ｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ。
ｆ９８２）に連結してｐＣＧＮ　１６　Ａをつくる。
Ｃ，ｐＣＧＮ　６５８の構築 ＣａＭＶｆＱ（ガードナー等、１９８１年、Ｇａｒｄ−
ｎｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１９８１　）　ｉＢｇ
ｌｎで消化して３５Ｓプロモーター領域（ｂｐ　６４９
３−７６７０　）を含む８ｇｌｌｌフラグメントをつく
り、これをｐＵＣ１９（ノランダー等、１９８３年、Ｎ
ｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）、。
１９８５）のＢａｍ１１部位に連結してｐｃＧＮ６３Ｂ
をつくる。
Ｄ、　　ｐＣＧＮ　２　ｆ　１５の構築ｐ　ＣＧＮ　１
６４をＥｃｏＲＶとＢａｍ）Ｌｌ　で消化して３５５プ
ロモーターの−ｇ　（ｂｐ　７３４０−７４３３　）を
含むＥ　ｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩフラグメントを放出し；
。
ｐｃＧＮ６５ＢをＢｉｎｄｌｌとＥｃｏＲＶで消化して
６５Ｓプロモーカーの別の部分（ｂｐ６４９５−７３４
０）を含む）ｌｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｅ　ｃｏＲＶ　ｙラグ
メントを放出する。これら二つのフラグメントをＨｉｎ
ｄ　ｍとＢａｍＨＩで消化してかいたｐｃＧＮ９８６に
連結してＳＳＳプロモーターを含む、Ｈｉｎｄ　１１−
ＢａｍＨＩ　７ラグメントを除去する：この連結により
、骨格釦よひｐＣＧＮ　９８６からの１（ｙｌ−１５’
領域＆ｊびｐｃｃＮ１６４とｐｃＧＮ６３Ｂからの二つ
の３５５プロモーターフラグメントを含むｐＣＧＮ６３
９を得る。
ｐＣＧＮ６３ＢをＥｃｏＲＶとＤｄｅ　Ｉで消化して３
５Ｓプロモーター（Ｄ７うｆ）１７ト（ｂ　ｐ　７Ｑ７
Ｑ−７５４０）を放出；このフラグメントをＤＮＡポリ
メラーゼ１のフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）フラグメント
で処理してプラント末端をっくり、Ｉ）ＣＧＮ６３９の
Ｅｃ。
ＲＶ部位に連結して、正しい方間でフラグメントを持つ
ｐｃＧＮ２１１３を得る。
Ｅ、　　ｐＣＧＮ　１７６１の構築 ｐｃＧＮ２１１３をＥｃｏＲＩで消化し、Ｘｂａ　１部
位とＢａｍＨＩＮ５位を含む合ＪｌｉｌＥＤＮＡアダプ
ターの存在下に（このアダプターは両末端にＥｃｏＲＩ
付着末端を含むが、隣接の塩基ばＥｃｏＲｆ　部位がこ
の場所で再構築されないようになっている）連結してｐ
ＣＧＮ２１１５Ｍを得る。　ｐＣＧＮ２１１３ＭをＳａ
ｃ　１で完全に消化し、次にＢａｍＨＩで部分消化する
。このＤＮＡを７４ＤＮＡポリメラーゼで処理してプラ
ント末端をつくり、ＥｃｏＲＩリンカ−をこのプラント
末端のグラスミドに連結する。形質転換後、プロモータ
ーとそのま１のｔ＠−１３’領域の間に特異なＥｃｏＲ
１部位を含むグラスミドクローンを選択し、ｐＣＧＮ１
７６１と命名する。
Ｆ、　　ｐＣＧＮ１４３１の構築 プロモーター−ポリリンカー−３′力セツト全体を含む
ｐｃＧＮ７１１３のＳａ　１．　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ　　
７ラグメントを５ａｉｌ−ＥｃｏＲＩ消化で取りはずし
、ＳＦ目−ＥｃｏＲＩ消化ｐＣＧＮ５６５にクローニン
グレテｐｃＧＮ２１２０　ｆツ（ル：　ｐｃＧＮ５６５
１１　ｐＵＣ８−Ｃｍ（ケイ、バクリー、学位論文　ユ
ニバージティー　オブ　カリフォルアア　サンジエゴ、
１９８５年、Ｋ、　Ｂｕｃｋｌｙ、　ＰＲ，Ｄ、　Ｔｈ
ｅｓｉｓ、　ＵＣ３ａｎ　Ｄｉｅｇｏ　１９８５　）ｆ
ｔ基礎にしテＩＡルカ、　ｐＵＣ１８）ヤニシューペロ
ン等、１９８５年、Ｙａｎｉｓｃｈ　−Ｐｅｒｒｏｎ　
ｅｔ　１）（ａ）−、ｊ　９８５　）からノポリリンカ
ーを含んでいる。　ｐｃＧＮ２１２０をＰｓｔＩで完全
に消化して再連結する。ｔｍ−４３’領域からの８５８
ｂｐ　Ｐｓｔｌ−ＰｓｔＩ　７　ラ／　メ７ト（９２０
７−１００６５、パーカー等、１９８３年、Ｂａｒｋｅ
ｅｒ　ｅｔ１）（ａ）、、１９８３）のみを欠損したク
ローンを選択してｐｃＧＮＩＡ３１を得る。
ｐＢＳＰＲ１−２０７の８０７ｂｐＥｃｏＲＩフラグメ
ント１ＥｃｏＲＩ消化ｐｃＧＮ１５０９にサブクローニ
ングし、二つの可能性のある方向のそれぞれにあるｃＤ
ＮＡを持つプラスミドを選択する：タバコＲＵＢＩＳＣ
Ｏ小すブユニットグロモーターがＰＲｌａのｍＲＮＡセ
ンスストランドを用５Ｉ−ＯｋＪを起すと期待されるプ
ラスミドをｐＣＧＮ　１７５２Ａと命名し、タバコＲＵ
ＢＩＳＣＯ小サブユニットプロモーターがＰＲ−１ａの
アンチセンス　ストランド（すなわちそのｍＲＮＡの相
補的配列）を用いて転写を起すと期待されるプラスミド
をｐＣＧＮ１７５２Ｂと命名する。
現カセット（センス釦よびアンチ ｐＢＳＰＲｌ−１０２３の７１７ｂｐＥｃｏＲＩフラダ
メントをＥｃｏＲＩ消化ｐｃＧＮ１５０９にサブクロー
ニングし、二つＯ可能性ある方向のそれぞれにあるｃ　
ＤＮＡを持つグラスミドを選択する；タバコＲＵＢＩＳ
ＣＯ／Ｊ翫サブユニットプロモーターがＰＲ−１ｂのｍ
ＲＮＡ　　センスストランドを用いて転写を起すと期待
されるプラスミドをｐＣＧＮ１７５３Ａと命名し、タバ
コＲＵＢＩＳＣＯ小サブユニットプロモーターがＰＲ−
１ｂのアンチセンス　ストランド（すなわちそのｍＲＮ
Ａの相補的配列）を用いて転写を起すと期待されるプラ
スミドをｐＣＧＮ１７５３Ｂと命名する。
タバコＰＲ１ａｃＤＮＡを持つ８０７ｂｐ　ＥｃｏＲＩ
フラグメントをｐＢｓＲＲｌ−２０７からＥｃ　ｏＲｒ
消化によって放出させ、Ｅｃ　ｏＲＩ消化ｐＣＧＮ　５
６５にサブクローニングしてｐｃＧＮ１７５０を得る。
タバコＰＲ−１６ｃＤＮＡのすべてのコード領域を持つ
７１７ｂｐＥｃｏＲＩフラグメントをｐＢＳＰＲｌ−１
０２５からＥｃｏＲＩ消化によって放出させ、ＥｃｏＲ
１消化１）ＣＧＮ５６５にサブクローニングしてｐｃＧ
Ｎ１７５１を得る。これらの二つのグラスミドを次のサ
ブクローニング実験を容易にするために構築する。ｐＣ
ＧＮ／７５０の８０７ｂｐＥｃｏＲＩフラグメントをＥ
ｃｏＲ１消化ｐｃＧＮｊ７６ｆにサフクａ　−＝　ｙグ
し、二つの可能性ある方向のそれぞれにあるｃＤＮＡｋ
Ｎつグラスミドを選択する；二重５５Ｓプロモーターが
ＰＲ−１ａのｍＲＮＡセンスストランドを用いて転写を
起すと期待されるグラスミドをｐｃＧＮ１７６２Ａと命
名し、二重５ｓｓプロモーターがＰＲ−１ｇのアンチセ
ンス　ストランド（すなわち、そのｍＲＮＡの相補的配
列）を用いて転写を起すと期待されるプラスミドｉ　ｐ
ＣＧＮ１７６２Ｂと命名する。
（二重ＣａＭＶ　３５５プＯモー　ｐ　−／ｐｃＧＮ１
７ｓ１（上記）の７１７　ｂｐＥｃｏＲｒフラグメント
をＥｃｏＲＩ消化ｐＣＧＮ　１７６１にサブクローニン
グし、二つの可能性ある方向のそれぞれにあるｃＤＮＡ
を持つプラスミドを選択する；二重３５ＳプＣ１−１−
一ターがＰＲ−１６のｍＲＮＡセンスストランドを用い
て転写を起すと期待されるプラスミドをｐＣＧＮ　１７
６３Ａと命名し、二重３５ＳプロモーターがＰＲ−１ｂ
のアンチセンス　ストランド（すなわち、そのｍＲＮＡ
の相補的配列）を用いて転写を起すと期待されるプラス
□ドをｐｃＧＮ１７６３Ｂと命名する。
の構築 プラスミドｐＢＳＰＲＲ−４０１をＥｃｏＲＩで部分的
に消化し、得られたＤＮＡフラグメントを１．０％ＬＧ
Ｔアカロースゲルで分離する。ＰＲ−ＲｃＤＮＡ挿入の
全長を含む約９００ｂｐの所のバンドを切り出し、Ｅｃ
ｏＲＩで完全に消化してかいたｐｃＧＮ１７６１に連結
し、コウシ陽アルカリホスファターー＋！を使って脱リ
ン酸化する。このＤＮＡを上記のように連結し、形質転
換して、陽性のコロニーをスクリーニングし、そのグラ
スミドを解析する。二重ＣａＭＶ５５Ｓプロモーターに
関してセンス方向にあるＰＲ−ＲｃＤＮＡｋ含む一つの
プラスミドを選択し、ｐｃＩＢ１００２と命名する。
ＰＲ−ＲｃＤＮＡが二重ＣａＭＶ３５Ｓプｏ　モー　ｐ
　−ニ関してアンチセンス方向にある第二の１ラスミド
を選択してｐｃＩＢ１００３と命名する。
１ラスミドｐＢｓｃｈｔ２Ｂ　（上記）をＥｃｏＲＩで
消化し、フラグメントをα５　％　ＬＧＴ　　アガロー
ス　ゲルで分離する。ＰＲ−ＰｃＤＮＡ　を含むバンド
を切り出し、ＥｃｏＲＩで消化してかいたｐＣＧＮ１７
６１　（上記）と混合し、ＣＩＡＰで処理、住５％ＬＧ
Ｔアガロース　ケルでｄＩ製する。混合物ｆｃ連結して
上記のように形質転換する。プラスミドについていずれ
かの方向でのＰＲ−ＰｃＤＮＡの挿入をスクリーニング
する。ＰＲ−ＰｃＤＮＡが二重ＣａＭＶ　３５　Ｓプロ
モーターに関してセンス方向に挿入された一つのプラス
ミドをｐｃＩＢ１０２０と命名する。ＰＲ−ＰｃＤＮＡ
が二重ＣａＭＶ１５Ｓプロモーターに関してアンチセン
ス方向に挿入されたプラスミドをｐｃＩＢ１０２１と命
名する。
ＰＲ−Ｑのための全長のｃＤＮＡ配列は二つの異るプラ
スミドに含１れて釦り、ＰＢＳｃｈ　ｔ　１５Ｈそのｃ
ＤＮＡの３′末端を含み、ρＢＳｃｈｔ５’−４はＣＤ
ＮＡの５′−末端を含む、この状況のため、プラスミド
ｐｃＩＢ１０２２とｐｃＩＢ１０２３はｐＣＧＮｌ　７
６１ベクター中で三つの方法で、方向の異るように構築
される。ｐＣＧＮｌ　７６　ｊをＥｃｏＲＩで消化し、
ＣＩＡＰで処理してＣＬ５ｃｌＩＬＧＴアガロースケル
で精製する。ｐＢｓｃｈ　ｔ　１５　（上記）全Ｎ５ｉ
ＩとＥｃｏＲｌで消化し、フラグメン）ｆｉｒｌ１５％
ＬＧＴアカロース　ゲルで分離する。テンプレートとし
てｐＢＳｃｈｔ５’−４（上記）、フライマートシテオ
リゴヌクレオチド （１）５’ＣＴＡＴＧＡＡＴＧＣＡＴＣＡＴＡＡＧＴＧ
３’あ・よか′（２）　５’　ＧＣＧＧＡＡ　　　　　
　　　　　ＣＡＴＡＡＧ　５’を使ったＰＣＲを行って
ＰＲ−ＱｃＤＮＡの５′−末端を増幅する。ＰＣＲ生戒
生金物製し、Ｎ５ｉｌとＥｃｏＲＩで消化して、その２
１０ｂｐ　　生成物を１．０％ＬＧＴ了ガロースケルか
ら精製する。精製ｐｃＧＮ１７６１ベクター　ｐＢｓｃ
ｈ　ｔ　１５からの８１０　ｂｐＮｓｉｌ／ＥｃｏＲＩ
フラグメント釦よびＮｓｉ／ＥｃｏＲＩ消化ＰＣＲフラ
グメントを連結し、上記のように形質転換する。全ｃＤ
ＮＡをいずれかの方向に含む形質転換体をスクリーニン
グして選択する。二重ＣａＭＶ　５５Ｓ　７０モーター
に関してセンス方向に全長ＰＲ−ＱｃＤＮＡを持つ一つ
のグラスミドをｐＣＩ　Ｂ　１０２２と命名する。１０
モーターに関してアンチセンス方向に全長ＰＲ−ＱｃＤ
ＮＡが挿入されているプラス□ドをｐＣＩＢ１０２５と
命名する。
ｐＢｓＧＬ６ｅにクローニングされたＰＲ−０’ｃＤＮ
Ａは５′−末端がトランケイトされ、完全な信号配列の
ほとんどすべてを失っている。この配列は蛋白の細胞外
輸送に必要で、蛋白を分泌するトランスジェニック植物
をつくるために置換されなければならない。本実施例は
、ＰＲ−０’ｃＤＮＡを二重Ｃａ　ＭＹ　３５　Ｓ発現
カセットＫ、ＰＲ−１からの信号ペプチドがＰＲ−０’
蛋白に加えられるようにサブクローニングすることを記
載する。
この構築は複雑な三つの方法での連結として行う−ｙ４
　　ｎ　Ｐ　Ｒ−１ａ　＋）−ダートよひ信号ペプチド
と成熟Ｐ　Ｒ−０’のコード配列の融合をＰＣＲ遺伝子
融合法で行う。次いで、この小片ヲＰＲ−Ｏ’ｃＤＮＡ
の３′末端と共にｐｃＧＮ１７６１ベクターに連結シ、
プロモーターに関していずれかの方向の挿入を持つ形質
ｋｍ体を選択する。
ＰＣＲ増幅に基〈遺伝子融合手法はホー等、１９８９年
、（Ｈｏ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１９８９　）によっ
て開発された。この手法にかいては、遺伝子融合をＰＣ
Ｈによりオーバーラツプした末端を持つ二つのフラグメ
ントをつくることによって行う、引続く反応で、これら
二つのフラグメントをもＰＣＲＫよって融合して二分子
間の完全な融合を行う。この戦″４ｉＰＲ−１信号ペプ
チドおよびリーダーをＰＲ−０’ｃＤＮＡ　に融合させ
るために使用する。下記の配列を持つ４種のオリゴヌク
レオチドを含酸する： ＧＰ　５０−５’ＣＣＡＴＡＡＣＡＡＡＣＴＣＣＴＧＣ
ＴＴＧＧＧＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＧＧＡＴＡ　５
’ ＧＰｓ　１−５”Ｉ’ＡＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＧ
ＴＧＣＣＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＴＴＡＴＧＧ　
３’ ＧＰ５２−５’　ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＴＣＡＡＧ
ＡＴＡＣＡＡＣＡＴＴＴＣＴ　　３’ ＧＰ５３−５’ＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＧＴＣＣＧＧ　３
’ＧＰ５０＆よびＧＰ５１Ｐリゴヌクレオチドはたがい
に相補的で、ＰＲ−１１）（ａ）Ｊ−ダーシよび信号と
Ｐ　Ｒ−０’　ｉ熟コード妃列との間の融合にとって望
ましいＤＮＡ配列を含む。これは下記のように四穴化さ
れる： 目 オリゴヌクレオチドＧＰ　５２ＦｉＰＲ−１ａ　ｃＤＮ
Ａの５′末端と同じ配列で、５′末端にＥｃ　ｏＲ１部
位をコードする配列を含む。
オリゴヌクレオチドＧＰ５５はプライマーとして働き、
ＰＲ−０’配列、配列７の位ｆ！ＩＬ１８０から１９５
と相補的である。
二つのＤＮＡ片を融合するために、二つのＰＣＲを組立
てる。一つはテングレートとしてプラスミドｐＢＳＰＲ
１−２０７と二つのグライマーＧＰ５２およびＧＰ５０
を使い二もう一つはテングレートとしてｐＢＳＧＬ６ｅ
とプライマーＧＰＳ１ｊ？よびＧＰ５３を使う。ＰＣＲ
生底物をゲル′電気泳動で分析する。択いでＰＣＲ生成
物ｔＳ製−し、それぞれの一部を第二段階でのＰＣＲに
使用する。
この反応で、テングレートハ最初の二つの反応の両生酸
物であシ、プライマーｆｉ　ＧＰ　ｓ　Ｉ＆よびＧＰ５
３である。第一回目の合成で、ＤＮＡテングレートをプ
ライマーなしで加え、そのテングレートを加熱し、冷却
を、次いで６５℃で伸ばすようにしたＰＣＲ変法を行う
０次いで二つのプライマーを加え、普通のＰＣＲを行う
、ＰＣＲ生成物の一部をゲル電気泳動で分析する。残り
のＤＮＡを稽製し、５ａｃｌとＥｃｏＲＩで消化し１、
その消化物（ｉ−１，５４Ｌ　Ｇ　Ｔアカロース　ゲル
で電気泳動する。正しいＰＣＲ生成物に相当するバンド
を切り出して連結反応に使用する。プラスミドｐＢＳＧ
Ｌ６ｅを５ａｃＩとＥｃｏＲＩ両方で消化し、その哨化
物を［Ｌ５％ＬＧＴアカロース　ゲルでの電気泳動にか
ける。大ＰＲ−０’フラグメントを含むｔＯＫｂバンド
を切り出し、上記からの５ａｃｌ−ＥｃｏＲＩ　ＰＣＲ
生成ｙｂよびＥｃｏＲＩ　とＣＩＡＰで消化しておいた
プラスミドｐｃＧＮ１７６１と連結してα５％ＬＧＴア
ガロース　ゲルで精製する。フラグメントを連結し、上
記のように形質転換する。正しく構築された形質転換体
をスクリーニングする。ＰＲ−１ａリーダーおよび信号
がＰＲ−０’成熟コ一ド配列と融合され、プロモーター
に関してセンス方向にあるグラスミドをｐｃＩＢ１０２
４と命名する；この配列をＤＮＡ配列分析で確認する。
正しい融合をしているが、プロモーターに関して反対の
方向にあるプラスミドをｐｃＩＢ１０２５と命名する。
この構築もＤＮＡ配列分析で８１認する。
実施例３１Ａ　　ｐｃＩＢ１０２４Ａ　ｈよびｐｃＩＢ
１０２５Ａチセンス方向））の構築 ＰＲ−０蛋白をコードするｃＤＮＡの全＊を含むプラス
ミドｐＢＳＧＬ５Ｂ−１２をＥｃｏＲＩで消化し、フラ
グメントｔ−ｔ１５％ＬＧＴアガロース　ゲルで分離す
る。１．２Ｉ（１）バンドを切り出し、上記Ｌ：／）よ
うに、ＥｃｏＲＩで消化しＣＩＡＰ処理されたｐＣＧＮ
１７６１と連結して（Ｌ５％ＬＧＴアガロース　ゲルで
精製する。連結した混合物を上記のように形質転換し、
形質転換体について、ＰＲ−０’ｃＤＮＡをいずれかの
方向に含むクローンをスクリーニングするａ　ｃＤＮＡ
が二ｉｃａＭＶ３５ｓプｏモーターに関してセンス方向
に挿入された一つのプラスミドをｐ　ＣＩ　Ｂ　１０２
４と命名する。　　ｃｌ）ＮＡがプロモーターに関して
アンチセンス方向に挿入されたプラスミドをｐｃＩＢ１
０２５Ａと命名する。
発現カセット（センス訃よびアン プラスミドｐＢＳＧＬｊ１７ばＰＲ−２蛋白をコードす
る全長のＣＤＮＡを含む。ｐＢＳＧＬ　１１７からのＰ
Ｒ−２ｃＤＮＡをｐｃＧＮ０６１発現プラスミトニイス
れかの方向にサブクローニングしてｐｃＩＢ１０３２か
よひｐｃＩＢ１０３３をつくる。しかし、そのｃＤＮＡ
は内部にＥｃｏＲＩ部位を含むので、そのｃＤＮＡを部
分的ＥｃｏＲＩ消化で切断されなければならない。
７′ラスミドｐＢＳＧＬ　１１７を部分消化が起る条件
下にＥｃｏＲＩで消化する。消化生成物をα５％ＬＧＴ
アガロース　ゲルで分離し、ＰＲ−２のｃＤＮＡの全長
を含む１．２　Ｋ　ｂのバンドを切り出し、ＥｃｏＲＩ
で消化しＣＩＡＰで処理したｐＣＧＮ１７６１に連結し
て［Ｌ５９６ＬＧＴアガロース　ゲルで精製する。連結
と形質転換を前記のようにして行う、陽性の形質転換体
を分離し、いずれかの方向に挿入された大ＰＲ−２ｅＤ
ＮＡフラグメントの存在をスクリーニングする。転写開
始部位に関してセンス方向にサブクローニングｌｔ７’
ｃＰＲ−２ｃＤＮＡを持つプラスミドをｐｃＩＢ１０５
２と命名し、アンチセンス方向のフラグメントを持つグ
ラスミドｉ　ｐｃＩ８１０３３と命名する。これら構築
物の構造をＤＮＡ配列分析で確認できる。
ＰＲ−Ｎ蛋白をコードしているｃＤＮＡ全長を含むプラ
スミドを、いずれかの方向にＰＲ−Ｎ　ｃ　ＤＮＡをｐ
ｃＧＮ１７６１＠現プラスミドにサブクローニングする
源として使用する。得られたプラスミドをｐｃＩＢ１０
３４およびｐｃＩＢ１０３５と命名する。
しかし、ｃＤＮＡは内部にＥｃｏＲ１部位を含み、この
ｃＤＮＡＦｉｇ分消化で切断されなければならない。
全長のＰＲ−ＮｃＤＮＡを含むプラスミド金部分消化が
起るような条件下でＥｃｏＲＩで消化する・消化生成物
を（Ｌ５％ＬＧＴアガロース　ゲルで分離し、ＰＲ−Ｎ
のための全長のｃＤＮＡを含む１、２　Ｋｂバンドを切
り出してＥｃｏＲＩで消化されたｐｃＧＮ１７６１と連
結し、ＣＩＡＰ処理して（Ｌ５％ＬＧＴアガロース　ゲ
ルで精製する。前述のようにして連結と形質転換を行う
。
陽性の形質転換体を分離し、いずれかの方向に挿入され
た大ＰＲ−ＮｃＤＮＡフラグメントの存在をスクリーニ
ングする。転写開始部位に関しテセンス方向にサブクロ
ーニング−Ｊｎ７’ｊＰＲ−ＮｃＤＮＡを持つグラスミ
ドをｐｃＩＢ１０３４と命名し、アンチセンス方向にフ
ラグメントを持つグラスミドをｐｃＩ８１０３５と命名
する。これらの構築物の構造をＤＮＡ配列分析で確認す
る。
ＰＲ−Ｏｉ白をコードするｃＤＮＡ全長を含むプラスミ
ドを、いずれかの方向にＰ　Ｒ−Ｏｃ　ＤＮＡｋｐＣＧ
Ｎ１７６１発現プラスミドにサブクローニングするため
の源として使用する。しかし、このｃＤＮＡｌ’ｉ内部
にＥｃ　ｏＲ１部位を含むのでｃ　ＤＮＡは部分的Ｅｃ
ｏＲＩ消化で切断されるべきである。
全長ＰＲ−ＯｃＤＮＡを含むプラスミドを部分消化が起
る条件下でＥｃｏＲＩで消化する。消化生成物をα５４
ＬＧＴアガロースゲルで分離し、ＰＲ−０のためのｃＤ
ＮＡ全長を含む１．２Ｋｂバンドを切り出し、ＥｃｏＰ
Ｉで消化したｐＣＧＮ１７６１に遅結し、ＣＩＡＰ処理
して（Ｌ５％ＬＧＴアガロース　ゲルで精製する。前述
のようにして連結釦よひ形質転換を行う。陽性形ｆｆｊ
！転換体を分離し、いずれかの方向に挿入された大ＰＲ
−ＯｃＤＮＡフラグメントの存在をスクリーニングする
。転写開始部位に関してセンス方向にサブクロングング
されたＰＲ−ＯｃＤＮＡを持つグラスミドをｐｃＩＢ１
０３６と命名し、アンチセンス方向のフラグメントを持
つグラスミドをｐｃＩＢ１０３７と命名する。これらの
構築物の構造をＤＮＡ配列決定で確認する。
（二重３５Ｓプロモーター／ＰＲ− ＰＲ−２’蛋白をコードするｃＤＮＡ全長を含むグラス
ミド（実施側１８ＢからのｐＢＳＧＬ　１５５　）を、
ｐｃＧＮ１７６１発現プラスミドにいずれかの方向にＰ
Ｒ−２’ｃＤＮＡ　　をサブクローニングするための源
として使用する。得られたプラスミド七ｐｃＩＢ　１０
３８釦工びｐｃＩＢ１０３９と命名する。しかし、この
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは内部のＥｃｏＲＩ　部位を含むので、
このｃＤＮＡは部分的ＥｃｏＲＩ消化によって切断され
るべきである。
全長ＰＲ−２’ｃＤＮＡ　　を含むプラスミドを部分消
化が起る条件下でＥｃｏＲＩによって消化する。
消化生成物を［Ｌ５１ＬＧＴアガロース　ゲルで分離し
、Ｐ　Ｒ−２’のための全長ｅＤＮＡを含む１．２Ｋｂ
バンドを切り出し、ＥｃｏＲｌで消化しりｐＣＧＮ　１
７６１　　Ｋ連結ｔ、、ＣＩＡＰｒ処理、α５％ＬＧＴ
アガロース　ケルで精製する。
前述のようにして連結と形質転換を行う、陽性形質転換
体を分離し、いずれかの方向で挿入された大ＰＲ−２’
ｃＤＮＡフラグメントの存在をスクリーニングする。転
写開始に関してセンス方向でサブクローニングされたＰ
Ｒ−２’　　ｃＤＮＡを持つ一つのプラスミドをｐｃＩ
Ｂ　ｊ０５６と命名し、アンチセンス方向にフラグメン
トを持つプラスミドをｐｃｉ８１０３９と命名する。こ
れらの構築物の＊ｆｉ１ｋＤＮＡ配列分析でＮ認する。
プラスミドｐＧＬＮ１７は、ｐＧＬ３ｆクローンの５′
−末端とｐＧＩｊ６クローンの３′末端を融合すること
によって構築されたニコチアナ　タバクム（Ｎ−ｔａｂ
ａｃｕｍ　）の塩基性β−１，３−グルカナーセ金コー
ドするバイブリドｃＤＮＡであるＩ　　Ｘ１ｙ−ｙ’ｋ
Ｌ　　　　４　ｏａａ　　乃ＣＣＬエニーに！　　−ａ
　　−１）。このバイブリ ドｃＤＮＡにコードされ た配列は次の通りである： このｃ　ＤＮＡは５′末端でトランケイトされてか多信
号ペプチド全体をコードしていない、この蛋白が正当に
目標とされているトランスジェニック植物をつくるため
に（すなわち中央空胞）、この配列をトランケトンされ
たｃＤＮＡに付は戻す必要がある。それ故、二重ＣａＭ
Ｖｆ５８発現カセット全二つのステップの方法で構築す
る。第一のステップで、ｃＤＮＡ信号ペプチドをゲノム
クローンでコードされている信号ペプチドで置換する。
第二のステップで、この「修復ｃＤＮＡＪを発現ベクタ
ー中に動かす。
グラスミドル８ＧＬ２はｐＧＬＮ　１７　ｃＤＮＡのサ
ブクローンである。このプラスミドをＣ１１）（ａ）＞
よびＥｃｏＲＩで消化し、グルカナーゼｃ　ＤＮＡ金含
む１ｋｂフラグメートをＬＧＴアカロースゲルから分離
する。ｐＢｌｕｓｅｒｉｐｔプラスミドをＥｃｏＲＩで
消化し、ＣＩＡＰで処理し、ＬＧＴアガロースゲルで精
製する。
プラスミドｐＢｓ−Ｇｌｕ　５９．１はグルカナーゼコ
ード配列、５′フランキング配列の１．５　ｋｂ　、１
０ｂｐハントロン、および３７ランキング配列の約ｔ　
ｋｂを含む４゜４　ｋｂ挿入を含む、このプラスミドを
下記の二つのブライマー： 全含むＰＣＢ実験にテンプレートとして使用する′。
この増幅の結果はグルカナーゼｃ　ＤＮＡのトランケイ
トされた５′末端を置換するためのフラグメントをつく
ることである′。ＥｃｏＲＩ部位をつくる単一塩基変異
をクローニング実験を容易にするために導入する。
ＰＣＲ生底生金物ｃｏ　ＲＩとＣ１ａＩテ消化し、フラ
グメントを２．０％ＬＧＴアガロースゲルで分離する。
１２０ｂｐバンドを切り出し、ｐｓＧＬ２からの１ｋｂ
　Ｃ１ａ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラグメントシよび精製し
たＥｃｏＲＩ消化ブルースクリプトベクターと混合して
上記のように連結して形質転換する。形質転換体につい
て挿入の存在をスクリーニングし、正しい構造を持つ一
つのプラスミドをｐＣＩＢ１００９と命名する。
プラスミ）’ｐｃＩＢ１００９をＥｃｏ　ＲＩ　　で消
化し、１．２　ｋｂフラグメントをＬＧＴアガロースゲ
ルで精製する。プラスミドｐＣＧＮ　１７６１をＥｃｏ
Ｒ，Ｉで消化し、ＣＩＡＰで処理し、ＬＧＴアガロース
　ゲルで精製してｔ　２　ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメン
トと混合、次いで連結し、形質転換する。挿入の存在を
形質転換体についてスクリーニングする。
グルカナーゼｃ　ＤＮＡがＣａＭＶプロモーターに関し
てセンス方向にある一つのプラスミドをｐＣＩ８１００
５Ｂと命名する。アンチセンス方向にあるＣ　ＤＮＡ挿
入を持つもう一つのプラスミドをｐＣＩＢ１００６Ｂと
命名する。
築 プラスミドル８ｃＨ１０はｐｃＨＮ５０（シンク、エイ
チ等、１９８７年、８ｈｉｎｓｌｘｉ　、　）ｉ、　ｅ
ｔ１）（ａ）、、　１９８７　）にかける挿入に類似し
ている一！Ｊ！　５末端に８１ｂｐの延長を持つタバコ
塩基性キチナーゼのｃＤＮＡ挿入を含む、その８０ｂｐ
の余分は：ｐ８ｃＨ１０をＢａｒｎＨＩで消化し、実施
例５に記載した配列５　’ＧＡＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣ
Ｇ３　’を持つ分子アダプターと連結する０次いで連結
生成物を精製し、ＥＣ０ＲＩで消化して、適応キチナー
ゼＣＤＮＡ　　ヲ含む１．２ｋｂフラグメントをＬＧＴ
アガロースゲルからｆ＃製する。このフラグメントを、
ＬＧＴアガロースゲルから精製したＥｃｏＲＩ消化、Ｃ
ＩＡＰ処理ｐＣＧＮ１７６１と混合し、混合物を連結し
、形質転換する。形質転換体をキチナーゼｃ　ＤＮＡ挿
入についてスクリーニングし、ＣａＭＶプロモーターに
関してセンス方向にキチナーゼＣＤＮＡを含む一つのプ
ラスミドをｐｃＩＢ１００７　と命名する。プロモータ
ーに関してアンチセンス方向にあるキチナーゼｃ　ＤＮ
Ａを持つプラスミドをｐＣ！Ｂと命名する。
ｐ８ＡＲａ２　ａ　ｃＤＮＡ　（上記）を二重ＣａＭＶ
３５Ｓプロモーター／３’−ｔｍ−１ターミネイターカ
セツトｐｃＧＮ１ｔ５１　（上記）にＰＣＲｔＩＩＩ幅
法を使ってサブクローニングする。４種のオリゴスクレ
オチドで、センスおよびアンチセンス構築それぞれに２
種づつで、いずれも３３７クレオチドの長さのものをブ
ライマーとして使うために合成し、テンプレートとして
プラスミドｐｓＡＲ＆２ａを使ツー（ｐｃｉ−ｔにより
　ｐＳＡＲａ２ａのｃＤＮＡ配列をつくる。そのブライ
マーは５′末端に余分の配列を含み、これがＰＣＢ増幅
完結時に新しい制限部位を生ずる。
センス構築のために、オリゴヌクレオチド１１６フの配
列は。
ＣＡＧ’ｌ”ＡＣＡＡＴＡ−３’ で、これはｃ　ＤＮＡ配列の３′末端の近い所に３ｓｔ
Ｉ部位を生ずる。オリゴヌクレオチド１１６８の配列は ５　’ＡＣ■旬■ＡＴＣＣＡＣＡＧＴハ叙鳳Ｏ０μ脱Ｔ
ＣＣ−ｓ’で、これはｃＤＮＡの５′末端の近い所にＢ
ａｍＨＩ部位を生ずる。アンチセンス構築について、オ
リゴヌクレオチド１２２４の配列は ５’　　　　　　　　　　　　　　　　　ＴＡ−５’で
、これはｃ　ＤＮＡの３′末端に近い所にＢａｍＨＩ部
位を生ずる。オリゴヌクレオチド１２２５１ｒｉ５’−
Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　−５’で、ｃＤＮＡの５′末端に近い
所に８ｓｔＩ部位を生じる。
オリゴヌクレオチド１１６７と１１６８をプラスミド１
）ＳＡＲａ２ａがＤＮＡテン１レートとして働くＰＣＢ
で使用する。この反応で生じたｆ＃製ＰＣＲ生成物を８
ｓｔ　ＩとＢａｍＨＩで消化し、８ｓｔ　ＩとＢａｍＨ
Ｉで消化し−Ｃ＞いたｐｃＧＮ１４３１にクローニング
する。そのＤＮＡを形質転換し、プラスミドにつｈて、
二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモータに関してセンス方向にあ
るｐ８ＡＲａ２ａ　ｃＤＮＡ挿入の存存をスクリーニン
グする。そうだと思われるプラスミドをＤＮＡ配列決定
し、正しい方向を持ち、変異の導入されていないものを
ｐＣＧＮ　１７８８Ａと命名する。
アンチセンス構築のために、オリゴヌクレオチド１２２
４と１２２５を上記のようにＰＣＢに使用する。８ｓｔ
ＩとＢａｍＨＩで消化後、そのＤＮＡを５ｓｔＩおよび
３３　ａ　ｍ　ＨＩ消化１）ＣＧＮ１４５１にクローニ
ングする。確からしい陽性プラスミドについて、プロモ
ーターに関してアンチセンス方向にあるｃＤＮＡの挿入
をスクリーニングし、その構築物を全ｃ　ＤＮＡの配列
決定で確かめる。ｃＤＮＡが正しい方向に挿入され、そ
のＤＮＡ配列が正しい、一つのプラスミドをｐＣＧＮ１
７８８Ｂと命名する。
ンス方向））の構築 プラスミドｐＢ８ｃｕｃｃｈｔ　５　（ｐＢ８ｃｕｃｃ
ｈｊ／キチナーゼとも呼ぶ）をＥｃｏ　ＲＩで消化し、
フラグメントを１５％ＬＧＴアガロースゲルで分離する
。
１、２　ｋｂバンドを切り出し、ＥＣｐＲＩＩで消化し
て釦いたｐｃＧＮ１７６１と連結、ＣＩＡＰ処理し、Ｃ
Ｌ５％ＬＧＴアガロースゲルで精製する。連結混合物を
上記のようにして形質転換し、形質転換体をいずれかの
方向でキチナーゼ／リゾチームｃＤＮＡを含むかどうか
スクリーニングする。二重ＣａＭＶ５５Ｂプロモーター
に関してセンス方向にｃＤＮＡが挿入された一つのプラ
スミドをｐｃＩＢｌｏｏｏと命名する。二重ＣａＭＶ３
５８プロモーターに関してアンチセンス方向にｃ　ＤＮ
Ａが挿入されたプラスミドをｐｃＩＢｉｏｏｌと命名す
る。
セフシロン５　ベクター このセフシランにはキメラ遺伝子のすべてを含むバイナ
リ−ベクターの構築を洋間に記載する。最初のセクシヨ
ンで使用されるバイナリ−ベクターの開発を説明し、第
二のセフシランで発現カセットのバイナリ−ベクターへ
のサブクローニングを詳説する。
ｐｃＧＮ７８３は、アグロバクテリウム　テネメ７７　
シエンス（Ａ、　Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）オクトビ
ンＴｉ−プラスミドｐＴｉＡ６　（カリアー　アンド　
ネスター１９７６年、Ｃｕｒｒｉｅｒ　ａｎｄ　Ｎｅ５
ｔｅｒ、　１９７６　）の左ｐよび右Ｔ　−ＤＮＡボー
ダー　ＣａＭＶ　Ｏ５５８プロモーター（カー）”ナー
等、１９８１年、Ｇａｒｄ−ｎｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）
、、　１９８１　）、Ｔａ２のカナマイシン耐性遺伝子
（ヨルケンセン等、１９７９年、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎｅ
ｔ　１）（ａ）、、　１９７９　）、およびｐＴｉＡ６
（カリアーアンド　ネスター　１９７６年、Ｃｕｒｒｉ
ｅｒ　ａｎｄ　Ｎｅ５−ｔｅｒ、１９７６）のトランス
クリプト７からの３′−領域を含むバイナリ−プラスミ
ドである。このベクターを下記の複数のステップの方法
で構築する。
Ａ、　　ｐＣＧＮ７！５９の構築 ゲンタマイシン耐性マーカーを得るため、耐性遺伝子を
ｐＰｈＩＪＩ　（ヒルシェアンドベリンガー　１９８４
年、Ｈｌｒｓｃｈ　ａｎｄ　Ｂｅｒｉｎｇｅｒ　、　１
９８４）のｓ、１ＫｂＥｃｏ　ＲＩ−Ｐｓｔ　Ｉ　７　
　ラングメントから分離し、ｐＵＣ？（ビエイラアンド
メクシング、ｊ９８２年、　Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍ
ｅｓｓｉｎｇ　＊　１９８２　）にクローニングしてｐ
ｃＧＮ５１　ｔ−得る。ゲンタマイシン耐性遺伝子を含
むｐｃＧＮ５４９　Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ　−Ｂ１ｙ２１Ｈ
Ｉ　７ラグメノトテｐＣＧＮ５８７　　（上記）　（Ｄ
Ｈｌｎｄ　ｍ　−Ｂａｎ　ＨＩフラグメントを置換して
ｐＣＧＮ５９４　ｔ−構築する＠　０ｅ８−カナマイシ
：／−Ｇｅｌ　７ラグメントを含むｐＣＧＮ５９４　Ｈ
ｌｎｄ　　ｆｉｌ　−Ｂａｍ　ＨＩ領領域ｐＵｏ１８）
ヤニツシェーベロン等、１９８５年、　Ｙａｎｉｓｃｈ
　−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａＩ　、　１９８５）からの
Ｈｌｎｄ　ｍ　−Ｂａｍ　Ｈｌボ！７１Ｊ７カーＩＪｊ
域−ｔ’ｆｌ換してｐＣＧＮ７５９をつくる。
Ｂ、　　ｐＣＧＮ　７２６　Ｃの構築 ｐＣＧＮ　５６６　Ｆｉ、　　ｐＵＣｌ　５−　ｃｍ　
　（ケイ、パクリー、学位論文ユニバーシイティ　オプ
カリフォルニアサンジエゴ　１９８５年、　Ｋ、　Ｂｕ
ｅｋｌｓＦ　。
ｐｈ、　Ｄ、　Ｔｈｅｓｉｓ、　ＵＣＳａｎ　Ｄｔｅｇ
ｏ　１９８５）のＥｃｏＲＩ−Ｈｌｎｄ　ｍ部位に挿入
されたｐＵｏ　１　Ｂ　（’ｒ＝　’／ｚ　−ヘＯン等
、１９８５年、Ｙａｎｉｓｅｈ　−Ｐｅｒｒｏｎｅｔ１
）（ａ）、、　１９８５　）のＥｅｏ　Ｒ１−Ｈｌｎｄ
　［１リンカ−を含む％ｐＮＷ３１ｃｍ８のＨｌｎｄ　
ｌｌ１−　Ｂｇ　１　［７ラグメント、　０ＲＦ１およ
び２（バーカー等、１９８３年。
Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）、　１９８３　）を含
む２９−１（）−ｒ／璽つ等、１９８０年、　Ｔｈｏｍ
ａｓｈｏｗ　ｅｔ　１）（ａ）、　、　１９８０　）ヲ
ｐＣＧＮ　５６６　ＯＨｉｎｄ　Ｉｌｌ　−Ｂａｍ　Ｈ
Ｉ　　部位にサブクローニングしてｐｃＧＮ７ｏｓをつ
くる＊Ｐ’ｌ’ｉＴ６からのトランスクリグト７０３′
領域（ｐＴｉ１５？５５　（バーカー等、１９８５年、
　Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ１）（ａ）、ｅ１９８３）の塩４
２５９６−２９２０１ｆＣ相当）を含むｐｃＧＮ７０３
の５ａｕ３Ａ７ラグメノトをｐＵｏ１８）’ｒ　二Ｖ　
ｚ　−／＜　ｏ　ｙ等、　１ｔｓｓ年、Ｙａｎｉｓｃｈ
　−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１９８５　
）のＢａｎ　ＨＩ部位に？フラグメントしてｐｃＧＮ７
０９をつくる。ｐｃＧＮ７０　ｑ　ｒ）　Ｅ（ＨｇａＩ
　−Ｓｍｍ　ｌポリリンカー領域を、カナマイシン耐性
遺伝子（人ＰＨ３’ｌｌ）を含むｐ　ＣＧＮ５８７（製
造を下記）からのＥｅｏ　ＲＩ　−Ｓｍｍ　Ｉ　７ラグ
メントで置換し、　ｐｃＧＮ７２ｔ−をつくる、ｐＣＧ
Ｎ７２６のＥｃｏ　ＲＩ　−８１）（ａ）　ｌフラグメ
ントｂよびｐＣＧＮ７５４のＢｇｌ　ｎ　−Ｅｃｏ　Ｒ
Ｉ　ｙラグメントをｐＵｏ８−ｐＵＣｌ３−ｃｍ（クロ
ラムフェニコール耐性、ケイ、バクリー、学位論分、ユ
ニパーシイティ　オプカリホルニアサンジエゴ１９８５
ＥＫ、　Ｂｕｃｋｌｅｙ、Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ　、
　ＵＣ８ａｎ　Ｄｉｅｇｏ　１９８５）のＢ＠ｍＨＩ　
−Ｓ１）（ａ）　Ｉ部位に挿入してｐｃＧＮ７５８をっ
くる。
ｐｃＧＮ７３４を構築するために、塩基５５９０−５２
４１（バーカー等、１９８３年、　ｎａｒ−ｋｅｒ　ｅ
ｔ　ａ！、、　ｆ　９８５　）　ＶＣ相当するｐＴｉＡ
６のＢｉｎｄ［１−８ｐｈｌフラグメントをＭ　１３ｙ
ｌｐ　１９（ヤ＝シェーぺｔｘｙ等、１９８５年、　Ｙ
ａｎｉｓｃｈ　−ＰｅｌｒｒＯＢｇ、ｔ＠１．．１９８
５：ノランダー等、　　１９８３年、Ｎ０ｒ−ｒａｎｄ
ｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）、　、　１９８３　）のＨｉｎ
ｄ　ｍ　−Ｓｐｈ　Ｉ部位にクローニングする。塩基５
２８７から３５００に相当するオリゴヌイレオチドを使
って、ＤＮＡ合成をこのテンプレートで始める。Ｓ１ヌ
クレアーゼ処理とＨ１ｎｄｌ消化後、得られたフラグメ
ントをｐＵｃ？　（ヤニシューペクン等、１９８５年。
Ｙａｎｌｓｃｈ　　　−Ｐｅｒｒｏｎ　　　ｅｔ　　　
１）（ａ）−ｅ　　１　９　８　５　　　）　　の　Ｈ
ｌｎｄ　　ｍ　　　−Ｓｍａ　Ｉ部位にクローニングす
る。塩基５２８７−５５９０（、＜−カー等、１９８３
年、　Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）、。
１８３　）に相当する得られたＥｃｏ　ＲＩ　−Ｈｌｎ
ｄ　　ｍフラグメントをｐＴｉＡ６（塩基３３９０−４
４９４に相当）と共にｐＵｃ８）ビエイラアンドメツシ
ング、　１９８２年、Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ、　１９８２　）のＥｅｏＲＩ部位にクローニン
グしてｐＣＧＮ３７４　を得る。　ｐＣＧＮ　７２６　
ｃをｐｃＧＮ７３Ｂから９００ｂｐＥ６０　ＲＩ　−Ｅ
ｃｏ　ＲＩ　　フラグメントを落して誘導する。
Ｃ，ｐＣＧＮ７６６Ｃの構築 ＣＩＭＶ　−Ｓ　５　Ｓプｅ１％−ター　ＡＴＧ　　カ
ナマイシン遺伝子★よびｐＴｉＡ６のＢａｍＨＩ　　プ
ラスミド）１９を含むｐＣＧＮＩ６７（下記）のＨｉｎ
ｄ　ｍ　−ＢａｍＨＩ７ラグメントをｐＵＣ１９（ノラ
ンダー等、１９８３年、Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　１
）（ａ）、、　１９８５　：　　ヤニシ、　−Ｎｏ　７
等、１９１３５年、　ＹａｎＬｓｈ　−Ｐｅｒｒｏｎ　
ｅｔ１）（ａ）、、１９８５）のＢ４ｍＨＩ　−Ｈｉｎ
ｄ　ｍ部位にクローニングし、ｐｃＧＮ？７４ｔ−構築
する。
５５８７００モーターおよびトランスクリプト７の３′
領域を、ＰＣＧＮ９７６の（Ｌ７Ｋｂ　Ｈｉｎｄ　Ｉ［
１−Ｅｅｏ　ＲＩ　７ラグメント（３５ＳプＩｆｆ％−
ター）ｊ？よびｐｃＧＮ７０？のα５　Ｋｂ　Ｅｃｏ　
ＲＩ　−５１）（ａ）Ｉ　７ラグメント（トランスクリ
プト７：３’）をｐＣＧＮ５６６のＨｌｎｄ　ｍ　−８
１）（ａ）　Ｉ部位に挿入してｐＣＧＮ７６６ｃを構築
することによって開発する。ｐＣＧＮ１６７を構築する
ために、ＣＩＭＶのＡｌｕＩフラグメント（ｂｐ　７１
４４−７７３５　）（ガードナー等、１９８１年。
Ｇａｒｄｎｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１９８１　）
をＡｌｕＩによる消化で得てＭ１３ｍｐ７（ビエイラア
ンドメッシング。
１９８２年、　Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ
、　１９８２　）のＨｌｎｃ　ｍ部位にクローニングし
てＣ６１４をつくる・Ｃ６１４をＥｃ、　ＲＩ消化して
３５Ｓプロモーターを含むＣ６１４からのＥｃｏＲＩフ
ラグメントをつくり、ｐＩＣ８）ビエイラ　アンド　メ
ッシング・１９８２年、　Ｖｌｅｌｒａ　ａｎｄ　Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ、　　１９８２　）のＥａｏＲＩ部位にクロ
ー二ンダしてｐＣＧＮ１４６をつくる。プロモーター領
域を整理するため、Ｂｇ１田部位（ｂｐ７６７０）をＢ
ｇ１■およびＢａ　１３１で処理し１次いでＢｇｌ［１
リンカ−をＢａ　ｊ　５１処理ＤＮＡに付けてｐＣＧＮ
１４７をつくる。プロモーター領域１選択性マーカー（
２ＡＴＧｓ’を持つＫＡＮ）ｋよび３′領域を含むｐｃ
ＧＮ１４８ｍを。
ｐＣＧＮ５２８）下記）をＢｇ　１出で消化し、ｐＣＧ
Ｎ１４７からＯＢａｍＨｌ−ＢｇＩＩｌプロモーターフ
ラグメントを挿入することによって調整する。このフラ
グメントをｐＣＧＮ５２８のＢｇ　Ｉ　１１　部位に。
そのＢｇ１１部位がｐＣＧＮ５２８のカナマイシン遺伝
子のすぐ隣にあるようにクローニングする。
この構築に使用するシャトルベクター、ｐＣＧＮ５２８
を下記のよりにしてつくる。ｐＣＧＮ５２８を、カナマ
イシン遺伝子（ヨルゲンセン等。
１９７９年、　Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ　＠ｔ　ａｔ、、　
１９７９　）　　を持つＴｎ５を含むプラスミドを出ｎ
ｄ　ｍ　−Ｂａｎ　ＨＩで消化し、このカナマイシン遺
伝子を含むＨｌｎｄ　１ｌｌ−ＢａｍＨＩフラグメント
をｐＡＣＹＣ１８４（チャンアントコ−エン、１９７８
年、Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ。
１９７８）のテトラサイクリン遺伝子にシけるＨｌｎｄ
　ｍ−Ｂａｎ　ＨＩ部位に挿入してつくる。ｐＣＧＮ５
２６をｐＴｉＡ６　（）マシｌつ等、１９８０年。
Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ　ｅｔ　ａｔ、　ｅ　１９８０　）
のＢａｍＨＩフラグメント１９をｐＣＧＮ５２５のＢａ
ｍ　ＨＩ部位に挿入することによってつくる。ｐＣＧＮ
５２８をｐＣＧＮ５２６から小Ｘｈｏｌフラグメントを
Ｘｈｏｌ消化と再連結により除いて得る。ｐｃＧＮ１４
９ａを９　ＭＢ　９　Ｋａｎ　ＸＸ　ＩからのＢａｍＨ
Ｉ　カナマイシン遺伝子フラグメントをｐＣＧＮ１４８
ａのＢ１ｍＭＩ部位にクローニングすることでつくる。
ｐＭＢ　９ＫａｎＸＸＩ　ＦｉｐＵＣ４Ｋ　　亜株（ビ
エイラ７７　）”７７７７７．１９８２年、　Ｖｌｅｉ
ｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｔｓｓｉｎｇ１９８２　）で％Ｘｈ
ｏ　ｒ部位を欠くがＴｎ９０３からの機能的カナマイシ
ン遺伝子を含んでいて、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏ
ｂａｅｔｅｒｉｕｍ　）で効果的選択が可能である。ｐ
ｃＧＮ１４９ＢをＢｇ　１　■と５ｐｈｌで消化する。
このｐＣＧＮ１４９ａの小Ｂｇ　１１［−８ｐｈｌフラ
グメントを、ＢａｍＨｌとＳｐｈ　ｌ　での消化によっ
て分離したＭＩ（下記）からのＢａｍＨｌ−８ｐｈｌフ
ラグメントと置換する。これによＭ、全長ＯｃａＭＶ１
＊モー１−　　ＩＡＴＧ−カナマイシン遺伝子、３′末
端および細１１Ｔｎ９０３型カナマイシン遺伝子を含む
構築物であるｐＣＧＮ１６７を得る。ＭＩはｐＣＧＮ５
５０（ｐＣＧＮ５８７構築を参照）からのＥｅ、　ＲＩ
フラグメントで１Ｍ１３ｍｐ９のＢｅｏＲＩクローニン
グ部位にクローニングされてかり、ＩＡＴＧ−カナマイ
シン遺伝子にｂけるＰ會ｔＩ部位ＦｉＭ　１３　ｍｐ　
９　のポリリンカー領域の隣にある。
Ｄ、　　ｐ　ＣＧＮ　４５　ｊの構築 ｐｃＧＮ４５１ばｐＵＣ８）ビエイラアンドメｙ　’／
　７グ、１９８２年、Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ　＊１９Ｂ２）の誘導体にクローニングとれたｏ
ｅａ　ｓ”ａｃｓｓ’カセクトを含む、この修飾ベクタ
ーは。
ｐＵＣ８をＨｌｎｃ　ｌ［で消化し、合成リンカ−ＤＮ
Ａの存在下に連結してｐＣＧＮ　４１６をつくり、次い
でＥｃＯＲＩ消化とフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）酵素処
理でｐｃＧＮ４１６のＥｃｏＲ１部位を欠落させ、自己
連結でｐＣＧＮ４２６をつくることで得られる。
ｏｃａ　ｓ’−０ｃ８３’カセツトをオクトビンＴｉプ
ラスミドｐＴｉＡ６（カリエアンドネスター、　１９７
６年、Ｃｕｒｒｉｅｒ　ａｎｄ　Ｎｅａｔｅｒ　、　１
９７６　）から誘導されたＤＮＡから一連のステップで
構築する。
ｐＴｉＡ４（１）ｐ　ｊ３３４２−１６２０２：Ｔｉ　
プラ：Ｘ　ミ）’ｐＴｉ　１５９５５　　に非常に近い
ため、バーカー等。
１９８３年、Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）、　、　
１９８３　、にょる番号付けである〉のＥｅＯＲ＋　Ｉ
フラグメントをｐＶＫ２３２（クナウファンドネスター
、１９８２年、Ｋｎａｕｆ　ａｎｄ　Ｎａ５ｔｅｒ　、
　１９８２　）からＥｅｏＲＩ消化で取り＃ｉずし、Ｅ
ｃ６ＲＩ消化ｐＡｃＹｃ１８４　（チーｗンアンドコー
エン、１９７８年、　Ｃｈａｎｇ　ａｎｄＣｏｈｅｎｍ
　１９７８　）にクローニングしてｐＣＧＮｆ５をつく
る。ｐｃＧＮ１５の２．４　Ｋ　ｂ　Ｂａｍ　ＨＩ　−
Ｅｃ　ｏＲＩフラグメント（ｂｐ　１３７７４−１６２
０２　）をＥ６０ＲＩ　−ＢａｍＨＩ消化ＰＢＲ３２２
（ポリバー等。
１９７７午、　Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　１）（ａ）、　
、　ｊ　９７７　）　　にクローニングしてｐＣＧＮ４
２９を得る。ｐＣＧＮ１５のＥｃｏ　ＲＩ　−ＢａｍＨ
Ｉ　ｙラグメント（ｂｐ　１３５６２−１３７７４　）
をＥｃ６　ＲＩ　−ＢＢｍＨＩ消化ｐＢＲ３５２２Ｃポ
リパー等％１９７７年、　Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　１）
（ａ）、。
１９７７　）ＫりＱ−ｚｙグしてｐＣＧＮ４０７をつく
る。切断したＣカットダウン）ブローターフラグメント
を、ｐｃＧＮ４０７をＸｍｎ　Ｉで消化しく　ｂｐ　１
５５１２　）　ｋＢａＩ　Ｓｌ　エキソヌクレアーゼで
再切断し２合成ＥｃｏＲＩ　　＋）ンカーの連結。
ＢａｍＨｌによる消化によって得る。得られた約１３０
ｂｐの７ラグメントをゲルで精製し、Ｍ１３ｍｐ？（ビ
エイラ　アンド　メッシング、１９８２年。
Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　＊　１９８２
）にｌ　ａ　−＝　ｙ　ｆ　Ｌで配列を決める。Ｅｃ、
Ｒ＋ｌ　　リンカ−が転写開始点と翻訳開始コドンの間
の１）ｐ１３ｄ４２　　に挿入さｆ′したクローン１−
４をグレープ等、１９８２年、Ｇｒｅｙｓ　ｅｔ　１）
（ａ）、　、　１９８２の配列と比較して同定する：Ｅ
ｃｏＲ１開裂部位は位置１５６５９．ｍＲＮＡ出発部位
より下流である。カットダウンプロモーターを含むｌ−
４の１４１　ｂｐ　ＥｃｏＲｌ　−ＢａｍＨｌフラグメ
ントをＥｃ６　Ｒｌ　−ＢａｍＨｌ消化ｐＢＲ３２２（
ポリバーｅｔ　１）（ａ）、、　１９７７年ｈ　Ｂｏｌ
ｉｖａｒａｔ　１）（ａ）、、　１９７７　）にクロー
ニングしてｐ　ＣＧＮ４２８をつくる。ｐＣＧＮ４２８
からの１４１ｂｐのＥ６０Ｒ１−ＢａｍＨｌプロ％−タ
ー片とｐＣＧＮ４２９から（Ｑ　２．５　Ｋｂ　Ｅｃｏ
Ｒｌ−Ｂ＆ｍＨ１ｏｅｓ５’片をいつしょにＥｅｏＲ１
消化ｐＵＣ？　　（ビエイラアンドメクシング、１１９
８２年、　Ｖｉｅｔｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ。
１９８２）ＫりＱ　−二７グしてｐＣＧＮ４４２をっ〈
す、カプトダウン　プロモータ一部分ヲ使ってＯＣａ上
流領域を再構築する。ゲンタマイシン耐性遺伝子を含む
ＰＬＢ４１（デイ−、フィブルスキー、　Ｄ　、　Ｆｉ
ｇｕｒｓｋｌ　）のＨｉｎｄｌ　ｙラグメントをＨｉｎ
ｄ　ｍ消化ｐＡｃＹｃ１８４（チャ：／　７：／　）’
　３−ｚｙ、１９７８年、　Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏ
ｈｅｎ　、　１９７８　）にクローニングしｐｃＤＮＡ
４１３ｂをつくる＊　ＯＣＩ！３′領域を含むｐＴｉＡ
４　　（カリエアンドネスター　　１９７６年ＩＩＣｕ
ｒｒｉｅｒ　ａｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒ＊　１９７６）の４
７　Ｋｂ　ＢａｍＨｌ　７ラグメントをＢａｍＨ１消化
ｐＢＲ３２５（ポリバー　１９７８年、Ｂｏｌｉｖａｒ
。
１９７８　）にクローニングして３３ｅ−１９をつくる
。５５６−１９の位［１１２０７にあるｓｒｎ＆１　　
部位を合１ＸｈｏｌリンカーＤＮＡを使ってＸｈｏ１部
位に変換してＰＣＧＮ４０１．２をつくる。ｐＣＧＮ４
０ｔ２のＡ８Ｋｂ　ＢａｍＨｌ　−ＥｃｏＲｌ　７ラグ
メントをＢａｍＨｌ　−Ｅｃｏ　Ｒｌ消化ｐｃＧＮ４１
３ｂにクロ−ニングしてｐＣＧＮ４　ｊ　９をつくる。
ＯｅＢ　５’−ＯｅＢ　５’カセツトを、５′領域を含
むｐＣＧＮ４４２の２．６４ＫｂＥｃｏＲ１フラグメン
トをＥｅｏＲ１消化ｐＣＧＮ４１９にクローニングして
ｐＣＧＮ４４６をつくることにＬＤ得る。　Ｏｅ島５′
領域（ｂｐ　１５６５９−１５２０８）とｏｅｓ　ｓ’
領領域　ｉ）ｐ　１ｆ２０７−１２８２３）を持つｐＣ
ＧＮ４４６のｓ、１Ｋｂ　Ｘｈｏ　ｌ　　フラグメント
をｐＣＧＮ４２６のＸｈｏ１部位にクローニングしてｐ
ｃＧＮ４５１を得る。
Ｅ、　　ｐＣＧＮ５８７の構築 ＡＰＩ３’ｌ［ヨルゲンセン等、１９７９年。
Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ　ａｔ　１）（ａ）、　、　１９７
９　）の全構造遺伝子を含む’ｒｎｓのＨｉｎｄ　ｍ　
−Ｓｍａ　ｌ　フラグメントをｐＵＣ８）ビエイラアン
ドメッシング、１９８２年。
Ｖｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　、　１９８２
　）にりａ　−ニングする。Ｅｃ、　Ｒｉ部位がＳｍａ
　１部位のすぐ隣にあるので、これによりＨｌｎｄ　ｌ
−Ｅｃｏ　Ｒｌフラグメントに変る。ＡＰＨ３’ｌ［遺
伝子の３′部分を含むｐ　ＣＧＮ３００のｐｓｔ　Ｉ−
ＥｃｏＲ１フラグメントをＥｅｏＲ＋ｌ−ＢａｍＨｌ−
８ａ１１−Ｐｓｔｌリンカ−とイっしょにｐＵＣ７０Ｅ
ｃｏＲ＋１部位に入れてｐｃＧＮ５４６Ｗをつくる。Ａ
ＴＧコドンはＡＰＨ３’ｌ［のＡＴＧ開始コドンを持つ
読取りフレームの外の上流である。
余分のＡＴＧを持つていたい、ＡＰ５Ｈ’ｌｌの５′末
端からのＳａｕ　３Ａ　−Ｐｓｔ　ｌ　７　ラグメント
をｐＣＧＮ５４６ＷのＢａｍＨｌ　−Ｐｓｔ　１部位に
挿入してプラスミドｐｃＧＮ５５０をつくることによシ
、望普しくないＡＴＧを避ける１次いでＡＰＭ３’［遺
伝子を含むｐｃＧＮ５５０のＥｃｏＲＩフラグメントを
ｐＵ８８−ｐＩＣ１５−ｃｒｎ（ケイ、バクリー、前掲
）のＥｃ、　Ｒ１部位にクローニングしてｐＣＧＮ５５
１を得る５ｏｅ８５’とｏｃｓｓ’を正しい方向に持つ
プラスミドｐＣＧＮ４５１（上記）をＥｃｃ）Ｒ１で消
化し、そのま筐のカナマイシン耐性遺伝子を含むｐｃＧ
Ｎ５５１からのＥｃｏＲ１７ラグメントをＥＣＱＲ１部
位に挿入して正しい方向にカナマイシン耐性遺伝子を持
つｐ　ＣＧＮ　５５２を得る。このｏｓｓ／ＫＡＮ遺伝
子を使ってトランス型バイナリ−ベクターｐＣＧＮ５８
７のための選択マーカーを得る。操作したオクトビンシ
ンターゼ　プロモーター　カセットの５′部分Ｈ，Ｔ−
ＤＮＡ輸送に関係するＴ−ＤＮＡ境界領域（ボーダー）
をも含むｂｐ　１５２０８−ｊ３６４４　（パーカー等
、１９８３紙Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）−＊　１
９８３　）でＸｈｏ　ｌからのｐ’ｒｉＡ６Ｄ　Ｎ　Ａ
から成る。プラスミドｐＣＧＮ５８７に訟いて、ｐＣＧ
Ｎ５５２からのｏａｃ／ＫＡＮ遺伝子は右ボーダーと共
に選択マーカーを与える。
左ボーダーを最初にＨｉｎｄ　Ｉｎ　−Ｓｍａ　１片（
ｐＣＧＮ５０２）（ｂｐ　６０２−２２１２　）として
Ｍ１３ｍｐ９　　にクローニングし、ＫｐｎＩ　−Ｅｃ
ｏ　ＲｌフラグメントとしてｐｃＧＮ４Ｍ５ｉＣｑりｏ
−二７ｆＬ、−”ＣｐＣＧＮ５８０を得る。ｐＣＧＮ　
５６５ｉｌｔｐＵＣ−ｐＵＣ１３−Ｃｍ（ケイ、パクリ
ー学位論文、コンバーシテーオブカリフォルニアサンジ
エゴ　１９８５年。
Ｋ、　Ｂｕｃｋｌｅｙ、　Ｄｈ、　Ｄ、　Ｔｈ＠ｓｉｓ
　Ｕ、　Ｃ，ＳａｎＤｌｅｇｏ　＊１９８５　）に基〈
クローニングベクターであるが、ｐＵＣ１８リンカ−（
ヤニシューペロン等、１９８５年、Ｙａｎｉｓｃｈ　−
Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　１）（ａ）、　、　１９８５　）
を含む。ｐｃＧＮ５８０をＢａｍＨｌで直鎖状とし。
ｐｖＣＫ１０２（ケナウフ　アンドホスター１９８２年
、　Ｋｎａｕｆ　ａｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒ　、　１９８２
　）の小さい方のＢｇ１１フラグメントを置換してｐＣ
ＧＮ５８５をつくる。ｐＣＧＮ５８５の小さい方の８１
）（ａ）ｌフラグメントをｏｅｓ／ＫＡＮ遺伝子を含む
ｐＣＧＮ５５２からのＸｈｏｌフラグメントで置換する
ことによってｐｃＧＮ５８７を得る。
Ｆ、　　ｐｃＧＮ７８３の最終の構築 ｐＣＧＮ　７６６ｃ（Ｃａ　ＭＶ−３５Ｓプロモーター
）のａ　７　Ｋｂ　Ｈ４ｎｄｌＯ−ＥｃｏＲｌ　７ラグ
メントをｐ　ＣＧＮ７２６　ｃ　ｆ）　１．５　Ｋｂ　
ＥｃｏＲＩ　−８ａ　１１　フラグメント（２ＡＴＧ−
ＫＡＮ−３’領域）に連結し、ｐＵｃ１ｔ？（サンプル
ｙり、ジエイ０等、１９８９年、　Ｓａ−ｍｂｒｏｏｋ
　Ｊ、　ａｔ　１）（ａ）、　１９８９　）のＨｉｎｄ
　［１−８ａ１１部位に入れｐＣＧＮ７７８をつくる。
ｐＣＧＮ７７８　　の２．２　Ｋｂ領領域　ＣａＭＶ　
３５　Ｅ３　プロモーターを含むＨｌｎｄｍ−８ａ　１
１７ラグメント（１−ＡＴＧ−ＫＡＮ””　Ｓ”ｆＲ域
）　チル　ＣＧＮ　７３９のＨｌｎｄ　［１−Ｓａ　１
　ｉポリリンカー領域を置換してｐｃＧＮ７８３を得る
。
の構築 ｐＣＧＮ　１５３９　ｋよびｐｃＧＮ１５４０は、アグ
ロハクテリウムテユメファシエンス（Ａ、　Ｔｕｍ６−
ｆａｃｉｅｎｓ　）オクトピンＴｉ−プラスミドｐＴｉ
Ａ６（カリエアンドネスター　１９７６年、Ｃｕｒｒｉ
−ｅｒ　ａｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒ、　１９７６　）の左ｐ
よび右’ｌ’−ＤＮＡボーダー　ｐＰＨｔＪｌ　　（ハ
ーシェ　アンドベリンガー　１９８４年、　Ｈｌｒｓｅ
ｈ　ａｎｄ　Ｂｅｒｉｎｇｅｒ、１９８４）のゲンタマ
イシン耐性遺伝子、ｐＬＪＢｌｌ（ジ１アニン等、　　
１９８５年、　Ｊｏｕａｎｉｎ　ｅｔ　１）（ａ）、　
１９８５　）からの複製のアブロバフタ−リゾゲネス（
Ａ。
ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ　）　Ｒｉプラスミドオリシフ、
Ｔｎ５（ヨルゲンセン等、１９７９年、　ｔＴｏｒｇｅ
ｎｓｅｎ　ｅｔ　１）（ａ）、ｅ１９７９）のカナマイ
シン　耐性遺伝子を持つｐＴｉＡ６のｍａＢプロモータ
ー領域とｍａｓ　ｓ’領領域ｐＢＲ３２２（ポリパー等
、１９７７年、Ｂｏｌｉｖａｒｅｔａ１．．１？７７）
からの複製のＣｏ１Ｅ１オリジン。
およびｐＵＣ１８）ノランダー等、１９８５年。
Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ａｔ　１）（ａ）、　、　１９８
３　）からの１．ａｅＺ’スクリーニング可能なマーカ
ー遺伝子を含バイナリー植物形質転換ベクターである。
ゲンタマイシン耐性遺伝子とＲｉおよびＣｏＩＥ１オリ
ジニを含むｐＣＧＮ１５３９−１５４０の骨格け、ｐｃ
ＧＮ１５３２（下記）から誘導される。Ｔｉボーダーと
植物選択性マーカー遺伝子（ｍａａ５’−ｋａｎ−ｍａ
８５’　）　ＦｉｐＣＧＮ１５３７からである；　植物
選択性マーカー　カセットｆｌｐｃＧＮ１５！５６がら
であり、右ボーダーとＩａａＺ’７ラグメントｎ　ｐＣ
ＧＮ　５６５ＲＢｚ２Ｘから誘導され、左ボーダーはｐ
ｃＧＮ４５から誘導される。
Ａ、　　ｐＣＧＮ　１５５２構築 ゲンタマイシン耐性遺伝子を含む五５ＫｂＥｅＯＲ１−
Ｐ３ｔ　ｌフラグメントをＰｈ　Ｉ　Ｊ　１　　（バー
　シェ　アンドベリンガー　１９８４年、　Ｈｉ　ｒｓ
ｃｈ　ａｎｄＢｅｒｉｎｇｅｒ　、　１９８４　）から
ＥＣ６Ｒｌ　−Ｐｓｔ　Ｉ　　消化で取！７ばずし、　
ＥｃｏＲｌ−Ｐｓｔ　ｌ消化ｐＵＣ９（ビエイラアンド
メッシング、１９８２年、　Ｖｉｅｉｒａａｎｄ　Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ　、　１９８２　）にクローニングしてｐＣ
ＧＮ５４９をつくる。ｐＣＧＮ５４９をＨｌｎｄ　ＩＩ
Ｉ　−Ｐｓｔ　１消化してゲンタマイシン耐性遺伝子を
持つ３．１ｋｂフラグメントを得て、ＤＮＡポリメラー
ゼｌのフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）フラグメントでプラ
ント東端をつ＜ｔ’Ｊ、Ｐｖｕｆｌ消化ｐ　ＢＲ，３２
２（ホリハー等。
１９７７年、　Ｂｏｌｉｖａｒ　ａｔ　１）（ａ）、、
　１９７７　）　ＫクローニングしてｐＢＲ３２２０ｍ
をつくる。ｐＢＲ３２２０ｍをＤｙ１）（ａ）と８ｐｈ
　ｌで消化し、フレノウ（Ｋｌｅ−ｎｏｖ　）酵素で処
理してプラント末端をつくわ。
その２．８　Ｋｂフラグメントを、Ａｐ１）（ａ）で消
化し。
フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）酵素でプラント末端をつく
ったＲＩオリジンを含むプラスミドｐＬＪＢ　１ｆ（ジ
瓢アニン等、１９８５年、　Ｊｏｕａｎｉｎ　ｅｔ　１
）（ａ）、。
１９８５）にクローニングしてｐＬＨｂ　Ｂ　１１　Ｇ
ｎｌをつくる。余分のＣ０ＩＥ１オリジンとカナマイシ
ン耐性遺伝子を、ＢａｍＨｌで消化して欠落させ。
自己閉環してｐＧｒＨＢ　１１をつくる。ｐＧｍＢｌｌ
をつくる。ｐＧｙｌＢｌｌのＨｉｎｄｕ部位をＢｉｎｄ
　ｌ［消化で欠落畜せ、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）５
１表テ処理し、自己閉環してｐＧｍＢ　１１−Ｈをつく
る。
ｐｏｍ　Ｂ　１１−ＨのＰｓｔ　１部位をＰｓｔｌ　　
消化で落し、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）　　酵素処理
し、自己閉環させてｐｃＧＮ１５３２をつくる。
Ｂ、ｐＣＧＮ　１５５６構築 ５４Ｋｂ　ＥｃｏＢ−１７ラグメントをｐＶＫ２３２（
フナラフ　ァンドネスター　１９８２年ｂ　Ｋｎ−ａｕ
ｆ　ａｎｄ　Ｎｅａｔｅｒ　、　１９８２　）からＥｃ
ｏＲ１消化”？’取り　出り、　ＥｃｏＲ１消化ｐＡＣ
ＹＣ１８４（チャンアンド−ｙ　−ｘ　ｙ　ｆ　９７８
年、　Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ。
１９７８）にクローニングしてｐＣＧＮ１４をっくる＊
　ｍ＆Ｂ　５’領域（ｂｐ　２０１２８−２１５６２バ
一カー等、、ｆ９８３年、　Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　１）
（ａ）、　、　１９８３の番号性）を含むｐＣＧＮ１４
の１４３４　ｂｐ　ＣＸ１）（ａ）−８ｐｈ１フラグメ
ントをＡｃｅ　ｌ　−８ｐｈ　ｌ消化ｐＵＣ１９（ヤニ
シネーベロン等、１９８５年、　Ｙａｎｉａｃｈ　−Ｐ
ｅｒｒｏｎ　ａｔ　１）（ａ）ｚ　１９８５　）　ｉｆ
ｃクローニングしてｐｃＧＮ５０をつくる。ｍａｓｓ’
領域の７４６ｂｐＥｃ。
ＲＶ−Ｎａｅｉフラグメントを。ｐｃＧＮ４０をＥＣ０
ＲｖとＮａＬ、　ｌで消化し１合成動０１リンカーＤＮ
Ａの存在下に連結することにょ５．Ｘｈｏ１部位で置換
してｐＣＧＮ１０５６をつくる。ｍＬＩ３３’領域ヲ含
ムｐＣＧＮ　１４　ｃ７）　７６５　ｂｐ　Ｓａｔ　ｌ
−Ｈ１ｎｄｌｎ７ラグメント（ｂｐ　１８４７４−１９
２３９　）をＳａｔ　１−Ｂｉｎｄｌ［［消化ｐＵ０１
８）ノランダー等、１９８３年、　Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ
　ｅｔ　１）（ａ）、　、　１９８３　）　　にクロー
ニングしてｐｃＧＮ４３をつくる。ｐＣＧＮ４３のＨｉ
−ｎｄ　ｍ部位を、Ｈｌｎｄ　Ｉｌｌ　’Ｉｃよる消化
、／ｌ／／’）（Ｋｌｅｎｏｗ　）　ｌｌｌ［素による
プラント末端づ〈シ、シよび合Ｉ！；ｔＥｃｏＲＩリン
カーＤＮＡの連結によってＥｃｏＲ１部位で置換して１
）ＣＧＮ１０！１４をつくる。
ｐＣＧＮ１０５４の７６７　ｂｐ　ＥｃｏＲｌ　７ラグ
メントを、ｍａｓ５’領域のｂｐ１９２３９をｍａ８５
’領域の隣に置く方向でＥｃ、　Ｒｌ消化ｐＣＧＮ　１
０３６にクローニングしてＰＣＧＮ１０４０をつくる。
ｐ　ＣＧＮ１０４０を５ｓｓｔ　ｌで部分消化し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで処理してグランド末端をつ〈シ１
合成Ｘｈｏｌ！ＪンカーＤＮＡの存在下に連結する；ｂ
ｐｔ８４７４とベクターＤＮＡの接続部での（ｐＣＧＮ
４５に構築しｐＣＧＮ１０４０に持込み）Ｓａｔ１部位
のみをＸｈｏ１部位で置換してＰＣＧＮ１０４７をつく
るようなりローンを選択する。ｐＣＧＮ５６５（上記）
をＥｃｏＲｌとＨｌｎｄｌで消化し、りｔ／／つ（Ｋｌ
ｅｎｏｗ　）酵素で処理してプラント末端をつくり２合
ｆｌｉ　Ｘｈｏ　ｌ　’）フカ−ＤＮＡ　　の存在下に
連結してｐＣＧＮ　１００３をつくる；これによりＸｈ
ｏｌリンカ−の隣にＥｃ、　Ｒ１部位を再びつくる。
ｐｃＧＮ１ｏｏ３をＥｃｏＲｌで消化し、フレノウ（Ｋ
ｌｅｎｏｗ　）酵素で処理してプラント末端をりくり１
合成ＰｓｔｌリンカーＤＮＡの存在下に連結してｐＣＧ
Ｎ１００７をつくる。ｍａｓｓ’領域とｍＪＬ８３領域
と、その間に複数クローニング部位とを含むｐＣＧＮ１
０４７のｔ　５　Ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　フラグメントをＸ
ｈｏ　ｌ消化ｐｃＧＮ１００７に　クロー　＝　ン／　
してＰＣＧＮ１０５２を構築する。
ｐｃＧＮｔｏｓ２の複数クローニング部位の部分を、Ｘ
ｂ１）（ａ）とＳｓｔ　ｌによる消化で欠落させ。
フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）酵素処理してプラント末端
をつ（ｎ、連結してｐＣＧＮ１０５２δＸＳをつくる。
ＩＡＴＧ−カナマイシン耐性遺伝子を含むｐＣＧＮ５５
Ｇ　（ｐＣＧＮ７８３の記述）のＩ　Ｋｌ）ＥｅｏＲｌ
−ｓｍ１）（ａ）　フラグメントをＥｃｏ　Ｒｉ　−５
ｒｎａ　ｌ消化ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｓｃｒｉ
ｐｔ　）　Ｍ　１３Ａ＆ＩＪ　Ｉ　／’　Ｉ”フグクー
ン、インコーボレイテクトζＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、　
１　ｎ　ｃ、　）　　にクローニングしてｐＢ８Ｋｍを
りくる；　このプラスミドは一本鎖ＤＮＡを生ずるＭ１
５領域を含む、−木調ＤＮＡをメーカーの指示に従って
つくり、配列５’ＧＡＡＣＴＣＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣ
３’を持つ合成オリゴヌイレオチドを使ってインビ）ｅ
ｔ（試験管内）変異原性を行って（アデルマン等、１９
８３年、　Ａｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　１）（ａ）、　、　
１９８５　）　　カナマイシン耐性遺伝子内のＰｓｔ１
部位を変え、消化できなくしてｐＣＧＮ　１５３４をつ
くる。
ＰＣＧＮ１５３４をＳｍａ　ｌで消化し５合成Ｅｃ６Ｒ
１リンカーＤＮＡの存在下に連結してｐＣＧＮ１５３５
をつくる。ＰＣＧＮ　１５３６の［ＫｂＥｃ。
Ｒ１フラグメントをＥｃｏＲ１消化ｐＣＧＮ　１０５２
δＸＳＫクローニングしてｍａ　ｓ　５’　−ｋａｎ　
ｍａｓ　３選択性ツーカーカセットｐｃＧＮ１ｓ３６　
をっくる。
Ｃ，ｐＣＧＮ５６５ａＡｘ２Ｘ構築 ｐＣＧＮ４５１　（ｐＣＧＮ７８５　Ｆ）記述）　ｔＨ
ｐａ　Ｉで消化し、合成ｓｐｈ　ｌリンカ−ＤＮＡの存
在下に連結してｐＣＧＮ５５をりくる。ｐＣＧＮ５５の
Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｓｐｈ　１フラグメント（アグロバクテ
リウム　チエメツアシｘ　ｙ　ｘ　（Ａ、　ｔｕｍｅｆ
ａｃｉｅｎｓ）Ｔ−ＤＮＡ　；パーカー等、１９７７年
、Ｂａｒｋｅｒｅｔ１）（ａ）、、　ｊ　９７７、の右
ボーダーを含むｂｐ１５８００−１５２０８）をＳ１）
（ａ）　ｌ　−Ｓｐｈ　ｌ消化ｐＵＣ１？（セニシェー
ベロン等、１９８５　％　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏ
ｎ　ｅｔ１）（ａ）、、　１９８５　）にクローニング
してｐｃＧＮ６０をつくる。ｐｃＧＮ６０の１．４　ｋ
ｂ　Ｈｌｎｄ厘−ＢａｍＨＩ７ラグメントをＨｉｎｄ　
ｌｌ−ＢａｍＨＩ消化ｐ８Ｐ６４　（プロメガ、インコ
ーホレイテッド、Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｉｎｃ、　）にク
ローニングしてｐｃＧＮｌｏｓｑをっくる。ｐＣＧＮ１
０３９をＳｍ１）（ａ）とＮｒａ　ｌで消化しくｂｐ１
４２７３−１５２０８を欠落；パーカー等１９７７等、
Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）、。
１９７７）、合ｇＤｇ　Ｉ　ＩＩｌリンカＤＮＡの存在
下に連結してｐＣＧＮ　１ｏ　ｓ　ｒｐδＮ８をつくる
。
１）ＣＧＮ１０３９δＮ８の（Ｌ　４７　ｋｂ　Ｅｃｏ
　ＲＩ　−Ｈｉｎｄ■フラグメントをＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄｌｌ消化ｐ　ＣＧＮ５６５　（ｐＣＦＮ７８３の記
述）にクロー二／グしてｐＣＧＮ　５６５　ＲＢをつく
る。ｐＣＧＮ　５６５　ＲＢのＨｉｎｄｌ１部位を、Ｈ
ｉｎｄ［［消化、フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）酵素処理
、合成Ｘｈｏ［リンカ−ＤＮＡの存在下での連結により
　Ｘｈｏ　１部位で置換してｐＣＧＮ　５６５　ＲＢ　
−Ｈ＋Ｘをつくる。ｐＵＣ１８）ノランター等、１９８
３年、Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ａｔ１）（ａ）、、　　ｆ
　９８３　）をＨａｅｌで消化して１ａｃＺ’７ラグメ
／トを放出し、フレノウ（Ｋｌ　ｅｎｏｗ　）酵素処理
してプラント末端をつ（１）、１ａｃＺ’含有７ラグメ
ントをＡｃｃｌとｓｐｈ　ｌで消化し、フレノウ（Ｋｌ
　ｅｎｏｗ　）酵素で処理したｐｃＧＮ５ｓ５ＲＢ　−
Ｈ＋Ｘに、１ａｃＺ’プｏ　−ｅ　−ｐ　−カ右ホータ
ーフラグメントの隣にあるように連結：この構築物、ｐ
ＣＧＮ　５６５　ＲＢｘ　２　ｘは、適当な宿主にプレ
イティングすると１ａｃＺ’発現陽性であシ、Ａｃｃ　
ｌ　−Ｓｐｈ　ｌフラグメント（ｂｐ１５８００−１３
９９０　）を欠損した右ボーダー７−ｙグメント（バン
カー等、１９８３年、Ｂａｒｋｅｒ　ａｔ　１）（ａ）
、。
１９８３）のｂｐ　１５９９０−１４２７３を含む。
Ｄ、　ｐｃＧＮ６ｓ構築 ｐｃＧＮ５０１を、Ｔ−ＤＮＡ（右ボーダー）の塩基１
５５６２−１５２０８　（パーカー等、１９８３年、Ｂ
ａｒｋｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１９８５　）を含
むｐＴｉＡ　６（カリニ　アンド　ネスター、１９７６
年、Ｃｕｒｒｉｅｒ　ａｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒ、　１９７
６　）の１．８５ｋｂＥｃｏ　ＲＩ　−Ｘｈｏ　ｌ　７
ラグメントをＥｃｏＲＩ−８１）（ａ）　ｌ消化Ｍ１３
ｍｐ？（ビエイラ　アンド　７１７７７１９８２年、Ｖ
ｉｅｉｒａ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　１９８２　）に
クローニングすることによって構築する。
ｐｃＧＮ５０２を、Ｔ−ＤＮＡ（左ボーダー）の塩基６
０２−２２１２を含むｐＴｉ　Ａ　６のｔ　６　ｋｂ　
Ｈｉｎｄｌ［−Ｓｍａ）７ラグメントをＨｉｎｄ　ｌｌ
［−Ｓｍａ　ｌ消化ＭＢｍｐ９　にクローニングするこ
とによって構築する。ｐｃＧＮ　５０１とｐＣＧＮ　５
　ｏ　ｚ両方をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｉｌで消化し、両
Ｔ−ＤＮＡ含有７ラグメントをＨｉｎｄｌｌ消化ｐＵＣ
９（ビエイラアンド　メツシング、１９８２年、Ｖｉｅ
ｉｒａａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　１９８２　）にイっ
しょにクローニングして両方のＴ−ＤＮ人ボーダーフラ
グメントを含むｐＣＧＮ　５０５をつくる。ｐＣＧＮ　
５０３をＨｉｎｄｉ［とＥｃｏＲＩで消化し、二つの得
られるＨｉｎｄｌｌ−ＥｃｏＲＩ　７９グメント（Ｔ−
ＤＮＡボーダーを含む）をＥｃｏＲＩ消化ｐＨＣ７９（
ホーン７７Ｙ　　：’す／、（１９８０年、Ｈｏｈｎ　
ａｎｄＣｏｆｆｉｎｓ、　　１９８０　）にクローニン
グしてｐＣＧＮ５１Ｂをつく１０左Ｔ−ＤＮＡボーダー
を含むｐ　ＣＧＮ５１８からのＫｐｎ　１−ＥｃｏＲＩ
フラグメントをＫｐｎｌ−ＥｃｏＲＩ消化ｐＣＧＮ　５
６５にクローニングしてｐｃＧＮ５８０を得る。ｐｃＧ
Ｎ５８０のＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ山フラグメントをｐＡＣ
ＹＣｌ　８４　（チャンアントコ−エン、１９７８年、
Ｃｂａｎｇａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、　１９７８　）　ＯＢ
ａｍＨ１部位にクローニングしてｐＣＧＮｓｉをつくる
。Ｔ　−ＤＮＡ右ボーダーフラグメントを含むｐｃＧＮ
６０（上記のｐｃＧＮ６５ｘ２ｘに記述）の１．４　ｋ
ｂ　ＢａｍＨｌ−８ｐｈ１７ラグメントをＢａｍＨＩ　
−Ｓｐｈ　Ｉ消化ｐｃＧＮ５１にクローニングしてｐＣ
ＧＮ６５をつくる。
Ｅ、　ｐＣＧＮ　１５３７構築 ｐＣＧＮ　６５をＫｐｎ　ｌとＸｂａ　ｌで消化してフ
レノウ（Ｋｌ　ｅｎｏｗ　）酵素で処理してプラント末
端をつ〈シ、合成Ｂｇｌｉ［リンカ−ＤＮＡの存在下に
連結してｐＣＧＮ　６５δＫＸをつくる。ｐ　ＣＧＮ６
５δＫＸ　ｔ−８ａ　１１で消化し、りｖ）つ（Ｋｌｅ
ｎｏｗ）酵素で処理してプラント末端をつくり、合成Ｘ
ｈｏｌリンカーＤＮＡの存在下に連結してｐＣＧＮ６５
δＫＸ−８＋Ｘを得る。Ｔ−ＤＮＡ右ボーダー片とＩａ
ｃ　Ｚ’遺伝子を含むｐＣＧＮＲＢＸ２Ｘの７２８ｂｐ
　Ｂｇ　１　ｆｌ　−Ｘｈｏ　ｌフラグメントをＢｇ　
Ｉ　ＩＩ　−Ｘｈｏ　１消化ｐＣＧＮ６５δＫＸ−８−
）−ＫにクローニングしてｐＣＧＮ６５ｘ２Ｘを置換す
る。Ｃ１ａ１７ラグ）１７）ｐｃＧＮ４５ｘ２Ｘを欠落
させ、Ｃ１１）（ａ）テ消化し、フレノウ（Ｋｌ　ｅｎ
ｏｗ　）酵素で処理してプラント末端をつくｂ１合ｇｌ
　Ｘｈｏ　ｌリンカ−ＤＮＡの存在下に連結して、Ｘｈ
ｏ　ｌ　ＩＪンカーで置換してｐｃＧＮｄ５δ２ＸＸを
得る。ｐＣＧＮ　６５δ２ＸＸをＢｇ　１１で消化し、
８ｇ１■消化ｐｃＧＮ５４９（上記ｐｃＧＮ１５５２の
項）と融合して両プラスミド骨格を含むＰＣＧＮ１５３
０をつくる。ｐ　ＣＧＮ１５５０をＸｈｏｊで消化し、
再連結してから、ｐＡＣＹＣ１８４からの骨格を欠落さ
せたゲンタマイシン耐性クロラムフェニコール感受性ク
ローンを選択してｐＣＧＮ　１５５　ｏＡをつくる。
ｍａｓ　５’　−Ｋａｎ　−ｍａｓ　３’カセ９トを含
むｐｃＧＮ１５３６のＬ　４５　Ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉフラ
グメントをＸｈｏｒ消化ｐｃＧＮ１５５０Ａにクローニ
ングしてｐ　ＣＧＮ１５３７をつくる。
Ｆ、ｐＣＧＮ１５４０の最終組立 植物選択性マーカー遺伝子と１ａｃＺ’スクリーニング
可能なマーカー遺伝子（複数クローニング部位内に）を
すべてＴ−ＤＮＡボーダーの間に含むｐｃＧＮ１５３７
の８ｇｌｌｌフラグメントを１３ａｍＨ１消化ｐｃＧＮ
　１ｓ　５２にりｏ　−二７　りする。複数のｐＢＲ３
２２オリジンの隣にＴ−ＤＮＡ右ボーダーを持つ方向の
クローンをρα取１５５９と、命名し、複数のＲｉ　プ
ラスミドオリジンの隣にＴ−ＤＮＡ右ボーダーを持つ方
向をｐｃＧＮ１５４０と命名する。Ｔ−ＤＮＡボーダー
の間に最少量のＤＮＡを含むこのバイナリ−ベクターは
いくつかの有利な点を持ち、アグロバクテリウＡ　（Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）宿主に釦ける高い安定性
、エシェリヒア　コＩ）　（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）にシい
て高コピー数、および目的のＤＮＡを容易にクローニン
グできる複数の制限部位をもつｆ／白ススクリーンある
。
前のセフシランでｐＣＧＮ　７８５とｐｃＧＮ１５４０
の構築を詳説している。これらは、植物を形質転換する
ためのアゲロバクチＶウム （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）仲介形質転換実験に
使用できるバイナリ−ベクターである。ベクターは目的
のキメ２遺伝子を植物に共形質転換するためにデザイン
されているが、まずキメラ遺伝子をそのバイナリ−ベク
ターにサブクローニングしなければならない。続くセフ
シランではセクシ廖ン４で構築したキメラ遺伝子をｐＣ
ＧＮ　７８５またはｐｃＧＮｆ５４０バイナリ−ベクタ
ーいずれもにサブクローニングすることを詳説する。得
られたベクターはキメラ遺伝子で植物を形質転換できる
。
築 ｐＣＧＮ　７８３のＢａｍＨＩ部位は右Ｔ　−ＤＮＡボ
ーダーの近くにあう１植物選択性マーカー遺伝子は左Ｔ
−ＤＮＡボーダーとＢａｍＨＩ部位の間にある。Ｂａｍ
ＨＩ部位中にキメラ遺伝子構築物をクローニングすると
、植物選択性マーカー遺伝子と右Ｔ−ＤＮＡボーダーの
間にそのキメラ遺伝子が位置する。ｐｃＧＮｔｓｏ９の
特異なりｇｌ［部位はｏｃｓ　５’領域の非本質的部分
にある。
ｐＣＧＮ１５０９をＢｇｌｌ［で消化し、そのベクター
全体をｐＣＧＮ　７８５０　ＢａｍＨＩ部位にクローニ
ングし、可能な方向を両方とも・回収する。
ＲＵＢＩ８ＣＯ小サブユニットプロモーターとｏｃｓ　
５’領域がｐｃＧＮ７８５の右Ｔ−ＤＮＡボーダーの近
くにあるプラスミドをｐＣＧＮｌ　７５４と命名し、Ｒ
ＵＢＩ８ＣＯ小サブユニットプロモーターとｏｃｓ　３
’領域がｐＣＧＮ　７８５の植物選択性マーカー遺伝子
の近くにあるプラスミドをｐＣＧＮｔ　７６０と命名す
る。
実施例５９　ｐＣＧＮ１７５５Ａ、ｐｃＧＮ１７５５Ｂ
。
ｐＣＧＮｌ　７５５ＣｈよびｐＣＧＮ　１７５５ＤｐＣ
ＧＮ　ｊ　７５２ＡをＢｇｌｉｌで消化、そのベクター
すべてをＢａｍＨＩ消化ｐＣＧＮ　７８５にクローニン
グし、可能な方向の両方を回収する。
ＲＵＢＩ８ＣＯ小サブユニットプロモーターＰＲＩ　−
ｏｃｓ　３’領域がｐｃＧＮ　７８３の右Ｔ　−ＤＮＡ
ボーダーの近くにあるプラスミドをｐＣＧＮ　１７５５
Ｃと命名し、ＲＵＢＩ８ＣＯ小サブユニ、トプユ。
−ター−ＰＲＩ−ｏｃｓ　５’領域がｐｃＧＮ７１３３
０植物選択性マーカー遺伝子の近くにあるプラスミツド
をｐＣＧＮ　１７５５Ａと命名する。
ｐｃＧＮｌ　７５２Ｂ　ｔ−Ｂｇｌ　ｌで消化し、その
ベクター全体をＢａｍＨＩ消化ｐＣＧＮ　７８５にクロ
ーニングし、可能な方向の両方を回収する。
ＲＵＢＩＳＣＯ小サブユニットフロモーターＰＲＩ　−
ｏｃｓ　３’領域がｐＣＧＮ　７８５の右Ｔ　−ＤＮＡ
ボーダーに近いプラスミドをｐｃＧＮ１７５５Ｂと命名
し、ＲＵＢＩＳＣＯ小サブユニットプロモーター−ＰＲ
Ｉ　−ｏｃｓ　５’領域がｐＣＧＮ　７８３の植物選択
性マーカー遺伝子の近くにあるグラスミドをｐｃＧＮ１
７５５Ｂと命名する。
ｐｃＧＮ１７５３Ａｔ−Ｂｇｌｌで消化し、そのベクタ
ー全体をＢａｍＨＩ消化ｐＣＧＮ　７８５にクローニン
グし、可能な方向の両方を回収する。
ＲＵＢＩＳＣＯ小サブユニットフロモーター−ＰＲＩ　
−ｏｃｓ　５’領域がｐＣＧＮ　７８５の右Ｔ　−ＤＮ
Ａボーダーの近くにあるプラスミドをｐＣＧＮ１７５６
Ｃと命名し、ＲＵＢＩ８ＣＯ小サブユニットプロモータ
ー−ＰＲＩ　−ｏｃｓ　５’領域がｐＣＧＮ　７８５の
植物選択性マーカー遺伝子の近くにあるプラスミドをＩ
）ＣＧＮ１７５６Ａと命名する。
ｐＣＧＮ　１７５５　ＢをＢｇｌｌｌで消化し、Ｂａｍ
ＨＩ消化ｐＣＧＮ　７　ａ　ｓにクローニングして、可
能な方向の両方を回収する。ＲＵＢＩＳＣＯ小サブユニ
ットプロモーター−ＰＲＩ　−ｏｃｓ　５’領域がｐｃ
ＧＮ　７８３の右Ｔ−ＤＮＡボーダーの近くにあるプラ
スミドをｐＣＧＮ１７５６Ｄと命名し、ＲＵＢＩＳＣＯ
小？　フユニットプロモーターｏｃｓ５’領域がｐＣＧ
Ｎ　７８５の植物選択性マーカー遺伝子の近くにあるプ
ラスミドをｐｃＧＮ１７５６Ｂと命名する。
実施例４１　ｐＣＧＮ１７６６およびｐｃＧＮｌ　７６
７（空の二重ＣａＭＶ　３５８プロモーターカセツトを
いずれかの方向に含むｐＣＧＮ ｐＣＧＮｌ　７６　ｊをＢａｍＨｒで消化し、そのベク
ター全体をＢａｍＨＩ消化ｐＣＧＮ　７８３にクローニ
ングし、可能な方向の両方を回収する。
二重ＣａＭＶ　３５　Ｓプロモーターとｔｍ−１５’領
域がｐＣＧＮ　７８５の植物選択性マーカー遺伝子の近
くにあるプラスミドをｐＣＧＮ１７６７と命名し、二重
プロモーターとｔｍ−１３’領域がｐＣＧＮ　７８５の
右Ｔ−ＤＮ人ボーダーの近くにあるグラスミドをｐｃＧ
Ｎ　１ｙ　６６と命名する。
ｐｃＧＮ１７６２人をＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩ
消化ｐＣＧＮ　７８５にクローニングし、可能な方向の
両方を回収する。二重３５８−ＰＲＩ−ｔｍ−１５′領
域がｐＣＧＮ　７８　Ｂの植物選択性マーカー遺伝子の
近くにあるプラスミドをｐＣＧＮ１７６４Ａと命名し、
二重５５８−ＰＲＩ−ｔｍ−１５’領域がｐＣＧＮ　７
８５の右Ｔ−ＤＮＡボーダーの近くにあるクローンをｐ
ＣＧＮｊＺ６４Ｃと命名する。
ｐＣＧＮ１７６２ＢをＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩ
消化ｐＣＧＮ　７８５にクローニングして、両方向を回
収する。二重５５８プロモーターが植物選択性マーカー
の近くにあるプラスミ　ドをｐｃＧＮ１７６４Ｂと命名
する。反対の方向にあるグラスミドをｐｃＧＮ１７６４
ｃと命名する。
ｐｃＧＮ１７６５人をＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩ
消化ｐＣＧＮ　７　ａ　ｓにクローニングし、可能な方
向の両方を回収する。二重３５８−ＰＲＩ−ｔｍ−１３
′領域がｐＣＧＮ　７８３の植物選択性マーカー遺伝子
の近くにあるプラス□ドをｐｃＧＮ１７６５Ａと命名し
、二重３５８−ＰＲＩ−ｔｔｎ−１５’領域がｐＣＧＮ
　７８５の右Ｔ−ＤＮＡボーダーの近くにあるプラスミ
ドをｐｃＧＮ１７６５ｃと命名する。
ｐＣＧＮｌ　７６５Ｂ　ｔ−ＢａｍＨＩで消化し、Ｂａ
ｍＨＩ消化ｐＣＧＮ　７８５にクローニングして、可能
な方向の両方を回収する。二重３５８−ＰＲＩ−ｔｍ−
１イ領域がＩ）ＣＧＮ　７８　ｓの植物選択性マーカー
遺伝子の近くにあるプラスミドをｐｃＧＮ１７６５Ｂと
命名し、二重５５８−ＰＲＩ−ｔｍ−１５’領域がｐＣ
ＧＮ　７８５の右Ｔ−ＤＮＡボーダーの近くにあるプラ
スミドをｐＣＧＮ１７６５Ｄと命名する。
１）ＣＩＢｌｏｏｏをＢａｒｎＨＩｆ消１ヒし、ｐｃＧ
Ｎ７８５のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、可能な方
４向の両方を回収する。二重ＣａＭＶ３５Ｓ−キチナ−
−１！’　−ｔｍ−１５’領域がｐＣＧＮ　７８３の植
物選択性マーカー遺伝子の近くにあるプラスミドをｐｃ
ＧＮ１７８０Ａと命名し、二重ＣａＭＶ１５Ｓ−キチナ
ーゼーｔｍ−１３’領域がｐｃＧＮ　７８５の右Ｔ−Ｄ
ＮＡボーダーの近くにあるプラスミドをｐｃＧＮ１７８
０ｃと命名する。
ｐＣＩＢ　１ｏ　ｏ　１をＢａｍＨＩで消化し、Ｂａｍ
ＨＩ消化ｐｃＧＮ　７８５にいずれかの方向でクローニ
ングする。二重５ＳＳ−キチナーゼ−ｔｍ−１５’領域
がｐｃＧＮ７８３の植物選択性マーカー遺伝子の近くに
あるプラスミドをｐｃＧＮ１７８０Ｂと命名する。二重
３５Ｓ−キチナーゼ−１ｍ−１３領域がｐＣＧＮ　７８
５の右Ｔ−ＤＮＡボーダーの近くにあるプラスミドをｐ
ｃＧＮ１７８０Ｄと命名する。
ｐｃ０１１４３１０２．３６　ｋｂＸｂａ　Ｉ−Ｐｓｔ
　１７ラグメントをＸｂ１）（ａ）−Ｐｓｔｌ消化ｐｃ
ＧＮ１ｓ４ｏにサブクローニングしてプラスミドｊ）Ｃ
ＧＮ１７８９をつくる。このプラスミドは、二重３５８
Ｃａｊ＃プロモーターが撞物遺択性マーカーの近くにあ
るような方向で挿入されている。
ｐｃＧＮｌ　７６２Ａノ４．２ｋｂＸｂａ　Ｉ　７．９
グメントをＸｂａ　ｌ消化ｐＣＧＮ　１５４　Ｑにサブ
クローニングし、可能な方向の両方を回収する。二重Ｓ
ＳＳグロモーターフラグメ／トがｐｃＧＮ１５４０の右
Ｔ−ＤＮＡに近くにあるプラスミドをｐＣＧＮｌ　７７
４Ａと命名し、二重５５Ｂプロモーターフラグメントが
ｐＣＧＮ　１５４Ｃ１のＷ物選択性マーカー遺伝子の近
くにあるプラスミドをｐｃＧＮ１７７４ｃと命名する。
ｐＣＧＮｌ　７６２Ｂの４．２ｋｂＸｂ１）（ａ）　　
７ラグ）１７トをＸｂ１）（ａ）消化１）ＣＧＮｌ　５
４０　ニク０−二７ｆし、可能な方向の両方を回収する
。二重ＳＳＳプロモーターフラグメントがｐＣＧＮｌ　
５４０の右Ｔ−ＤＮＡボーダーの近くにあるプラスミド
をｆ）ＣＧＮ１７７４Ｂと命名し、二重３５８プロモー
ターフラグメントがｐｃＧＮ１ｓ４ｏの植物選択性マー
カー遺伝子の近くにあるプラスミドをｐＣＧＮｆ７７４
Ｄと命名する。
ｐＣＧＮ　１７６５　ＡのｔｆｋｂＸｂａＩ　７：７／
ｌ　ントをＸｂａ［消化ｐｃＧＮｌ　５４０　Ｋ　りｏ
−二重　ｆし、可能な方向の両方を回収する。二重３５
８プロモーター７ラグメ／トがｐＣＧＮ　ｆ　５４０の
右Ｔ−ＤＮＡボーダーの近くにあるプラスミドをｐＣＧ
Ｎ　ｊ　７７　ｓＡと命名し、二重３５８プロモーター
フラグメントがｐＣＧ１１５４０の植物選択性マーカー
遺伝子の近くにあるプラスミドをｐｃＧＮ１７７５ｃと
命名する。
ｐｃＧＮｆ　７６３Ｂの４．１ｋｂＸｂａ　ｌ　７ラグ
メントをＸｂ１）（ａ）消化ｐｃＧＮ［５４０［りＯ−
二７りし、可能女方向の両方を回収する。二重５５８プ
ロモーターフラグメントがｐＣＧＮｌ　ｓ　４０の右Ｔ
−ＤＮＡボーダーの近くにあるプラスミドをｐｃＧＮ１
７７５Ｂと命名し、二重３５８ブロモ−ターフ２グメン
トが１）ＣＧＮ１５４０の植物選択性マーカー遺伝子の
近くにあるグラスミドをｐｃＧＮ１７７５Ｄと命名する
。
ｐＣＩＢ　１００２　Ｏ４，５ｋｂＸｂａ　Ｉ　７ラグ
メントをＸｂ１）（ａ）消化ＰＣＧＮ　１５４０に、二
重５５８プロモーターが１５４０の植物選択性マーカー
遺伝子の近くにある方向でサブクローニングする。この
プラスミドをｐｃＧＮ１７８３ｃと命名する。
ｐＣＩＢ　１００５　ｃＤ　４．５　ｋｂＸｂａ　Ｉ　
７ラグメントをＸｂａ　ｌ消化ｐＣＧＮ　１ｓ　４０に
、二重５５８プロモーター７ラグメントがｐＣＧＮ　１
５４０の植物選択性マーカー遺伝子の近くにある方向で
サブクローニングしてｐｃＧＮ１７８３Ｄをつくる。
の構築 キメラＰＲ−Ｐ遺伝子を含むｐｃＩＢ１０２０のＸｂ１
）（ａ）フラグメントを、そのプロモーターフラグメン
トが植物選択性マーカー遺伝子の近くにある方向で、Ｘ
ｂ１）（ａ）消化ｐｃＧＮｉｓ４ｏにサブクローニング
する。このプラスミドをｐ（ＪＢｔｏ２６と命名する。
キメラＰＲ−Ｐアンチセンス遺伝子を含ｂｐＣＩＢ１０
２１のＸｂ１）（ａ）フラグメントを、そのプロモータ
ーフラグメントが植物選択性マーカー遺伝子の近くにあ
るような方向で、Ｘｂ１）（ａ）消化ｊ）ＣＧＮ１５４
０にサブクローニングする。
このプラスミドをｐＣＩＢ　１０２７と命名する。
キメＦＰＲ−Ｑ遺伝子を含むｐＣＩＢ　Ｉ　Ｑ　２２の
Ｘｂ１）（ａ）フラグメントを、そのプロモーターフラ
グメントが植物選択性マーカーの近くにある方向で、Ｘ
ｂ１）（ａ）消化１）ＣＧＮ１５４０　ニｆ７−クロー
ニングする。このグラスミドをｐｃＩＢ１０２Ｂと命名
する。
キメラＰＲ−Ｑアンチーセンス遺伝子を含むｐｃＩＢ　
１０２３　ノＸｂａ　ｌ　７ラグメントを、そのプロモ
ーターフラグメントが植物選択性マーカーの近くにある
ような方向で、Ｘｂ１）（ａ）消化ｐｃＧＮ１ｓ４ｏに
サブクローニングする。このプラスミドをｐＣＩＢ　１
０２　ｃｐと命名する。
キメラＰＲ−０’遺伝子を含むｐｃＩＢｌ［＋　２４の
Ｘｂ１）（ａ）フラグメントを、その３５８プロモータ
ーが植物選択性マーカーの近くにあるように、Ｘｂ１）
（ａ）消化ｐｃＧＮ　１５４０にサブクローニングする
。このプラスミドをｐＣＩＢ　１ｏ　３゜と命名する。
キメラＰ凡−Ｏアンチ−センス遺伝子を含むｐｃＩＢ１
０２５のＸｂａ１７ラグメントを、ｐＣＩＢ　１０５０
と同様の方向で、ＸｂａＩ消化ｐｃＧＮ１５４０にサブ
クローニングする。この新しいプラスミドをｐＣＩＢ　
１０３１と命名する。
実施例５１Ａ ｐＣＩＢ　１０５０釦よびｐＣＩＢ１０３１構築 キメラＰＲ−０’遺伝子を含むｐＣＩＢ　１０２４Ａの
Ｘｂａ１７ラグメントを、その３５８プロモーターが植
物選択性マーカーの近くにあるように、Ｘｂａ　ｌ消化
ｐｃＧＮ１５４０ｉｃサブクローニングする。このプラ
スミドをｐｃＩＢ１０３０Ａと命名する。
キメラＰＲ−〇′遺伝子をアンチ−センス方向Ｋｔｔｒ
ｐＣＩＢ１０２５ＡのＸｂ１）（ａ）７：７グメントを
、３５Ｓプロモーターが植物選択性マーカーの近くにあ
るように、Ｘｂａ　Ｉ消化ｐｃＧＮ１５４０にサブクロ
ーニングする。この得られたグラスミドをｐｃＩＢｌｏ
ｇｌＡと命名する。
ＰＲ−０’　　センス釦よびアンチ−センス）　　ｐｃ
ＧＮｌ　５４０の中に）の構築 キメラＰＲ−０’遺伝子を含むｐｃＩＢ　１０３２のＸ
ｂａ　ｌフラグメントを、その３５８プロモーターが植
物選択性マーカーの近くにあるように、Ｘｂａ　ｌ消化
１）ＣＧＮ１５４０にサブクローニングする。このプラ
スミドをｐＣＩＢ　１０４２と命名する。
キメラＰＲ−０’遺伝子をアンチ−センス方向に含むｐ
ＣＩＢｌ　０３３　ノＸｂａ　ｌ　７ラグメントを、そ
の３５８プロモーターが植物選択性マーカーの近くにあ
るように、Ｘｂ１）（ａ）消化ｐＣＧＮ１５４０にサブ
クローニングする。得られたプラスミドをｐｃＩＢ　ｆ
　０４５と命名する。
キメラＰＲ−０遺伝子を含むｐｃＩＢ１０３４のＸｂａ
　ｌフラグメントを、その５５８プロモーターが植物選
択性マーカーの近くにあるように、ＸｂａＩ消化ｐＣＧ
Ｎ　１５４０にサブクローニングする。このグラスミド
をｐ（ＪＢ１０４４　、！：命名する。
キメラＰＲ−０’遺伝子をアンチ−センス方向に含むｐ
ｃＩＢ１ｏ３４のＸｂａ■フラクメントヲ、その３５８
グロモーターが植物選択性マーカーの近くにあるように
、Ｘｂ１）（ａ）消化ｐｃＧＮ１５４０にサブクローニ
ングする。この得られたグラスミドをｐｃｉ８１０４５
と命名する。
構築 キメラＰＲ−０’遺伝子を含むｐｃＩＢ　１０５６のＸ
ｂａ１７ラグメントを、その３５８プロモーターが植物
選択性マーカーの近くにあるように、Ｘｂ１）（ａ）消
化ｐＣＧＮ１５４Ｑにサブクローニングする。得られた
プラスミドをｐｃＩＢ１０４７と命名する。
構築 キメラＰ九−〇′遺伝子を含むｐＣＩＢ　１ｏ　ｓ　ａ
ののＸｂ１）（ａ）フラグメントを、その３５８プロモ
ーターが種物選択性マーカーの近くにあるように、Ｘｂ
１）（ａ）消化りＣＧＮ１５４０にサブクローニングす
る。このプラスミドをｐＣＩＢ　ｊ　０４８と命名する
。
キメラＰＲ−０’遺伝子をアンチ−センス方向に含むｐ
ＣＩＢｌ　０５９　）Ｘｂ１）（ａ）　７　？グメント
ヲ、その５５Ｂプロモーターが捕物選択性マーカーの近
くにあるように、Ｘｂ１）（ａ）消化１）ＣＧＮ　１５
４０にサブクローニングする。得られたプラスミドをｐ
ＣＩＢ　１０４９と命名する。
実施例５２　　ＣＧＮ１７８１Ｃおよ　　ＣＧＮ１７１
１）（二重ＣａＭＶ　５５　Ｓプロモーター／塩ｐｃＩ
Ｂ１００５Ｂの４．９　ｋｂ　Ｘｂａ　Ｉ　７ラグメン
トを、その二重３５８プロモーターフラグメントがＩ）
ＣＧＮ１５４０の植物選択性マーカー遺伝子の近くにあ
るような方向で、Ｘｂａ■消化ｐｃＧＮ１５４０にサブ
クローニングしてｐＣＧＮ１７８７０をつくる。
ｐＣＩＢｌ　００６ＢのｔｓｋｂＸｂ１）（ａ）　７ラ
グメントを、その二重３５８プロモーターフラグメント
がｐＣＧＮ１５４ａ′の植物選択性遺伝子の近くにある
ような方向で、Ｘｂ１）（ａ）消化ｐｃＧＮ１５４０に
サブクローニングしてｐＣＧＮ１７８７Ｄをつくる。
一センス）をいずれかの方向で ｐＣＧＮ　１５４０　Ｆ）中ニ）ノ構築ｐＣＧＮ　１ｏ
　０７の４．８ｋｂＸｂ１）（ａ）フラグメントを、そ
の二重５５８プロモーターフラグメントがｐｃＧＮｌｓ
ａｏの植物選択性マーカー遺伝子の近くにあるような方
向で、Ｘｂ１）（ａ）消化ｐＣＧＮ１５４０にクローニ
ングしてｐＣＧＮ　１７８２　Ｃをつくる。
ｐＣＩＢ　１ｏ　ｏ　ａの４．８ｋｂフラグメントを同
様にＸｂ１）（ａ）消化ｐＣＧＮ１５４０にクローニン
グしてｐｃＧＮｔ７８２Ｄをつくる。
／ ％施例５４　　ｐｃＧＮ１７９０ｃ＞よびＩ）ＣＧＮ１
７９０ＤＰＣＧ８１７８８Ａの２．８９Ｋｂ　ＸｂａＩ
−Ｐｓｔ　Ｉ　　７ラグメント１ＸｂａＩ−ＰｓｔＩ消
化ｐｃＧＮ１５４０にサブクローニングしてｐＣＧＮ　
？　ｙｑａ　２りくる。この構築物に９ける二重３５８
プロモーターの方向は上記の他Ｃ型構築物と同じである
。
ｐｃＧＮ１７８８Ｂの２．．８９ＫｂフラグメントをＸ
ｂａ　Ｉ−４’ｓ　ｔ　Ｉ消化ｐＣＧＮ１５４０にサブ
クローニングしてｐＣＧＮ　１７９０Ｄ　ｆつくる。こ
の構築物のプロモーターの方向はｐｃＧＮ１７９０ｃと
同じであるＯ 中に）の構築 ｐｃＩＢｌｏｏｏの４．６　Ｋｂ　ＸｂａＩ　７ラグ７
’７）ｉ、その二重３５８７’ロモーターフラグメント
がｐｃＧＮｌｓａｏの種物選択性マーカー遺伝子の近り
ニアルヨうな方向”ｔ’、ＸｂａＩ消化１）ＣＧＮ１５
４０にクローニングしてＩ）ＣＧＮ１７７９（：２つく
る。
０ＣＩＢ１００１の４．６Ｋｂ　ＸｂａＩフラグメント
金、その二重３５ｓプロモーターフラグメントがｐｃＧ
Ｎｌｓａｏの種物選択性マーカー遺伝子の近くにあるよ
うな方向で、ＸｂａＩ消化ｐｃｕＮ１ｓ４゜にクローニ
ングしてｐｃＧＮ１７７９Ｄｉ２（る。
ター 上記で使ったカナマイシン遺伝子の代りにハイグロマイ
シン耐性遺伝子を持つｍ物形質転換ベクター金構築した
（ｃ１トスタイン等、１９９７年、　Ｒｏｔｈｓｔｅｉ
ｎ　ｅｔ　１）（ａ）、　、　１９８７　）　。ヘクタ
ーｐｃＩＢ７４３はそのようなベクターの一つである。
植物にかける発現のためのキメラ遺伝子を上記ベクター
のいずれかから、好適な制限酵素、例えばＸｂａＩｔ、
使って切り出し、ｐｃＩＢ７４３のポリリンカーに挿入
する。これにより、形質転換された槙＊組織にノ・イグ
ロマイクン耐性を与える広宿主範囲形質転換ベクターに
かいて植物発現のためのキメラ遺伝子を構築することに
なる。
これで、本分野の技術者が、ノ・イグロマイシン耐性、
またｉ−ｔカナマイシン耐性、または両方を形質転換Ｗ
ｔ物組織の選択のために利用することが可能である。
セクシ曹ン６　アグロバクテリウムテ）メファシエンス
（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）の形質転換 セフシラン５に記載【７たバイナリ−ベクターを下記の
方法でアブロバフタ−テエメ７アシエンス（Ａ、　ｔｕ
ｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）　ＬＢ４４０４株に形質転換す
る。このアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）株をＬＢＭＧ培地（５０幅り培地、５０係マンニ
トール−グルタメイト　ブロス（ガーフインケルアンド
ネスター、　　１９８０年、　Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ａ
ｎｄＮｅｓｔｅｒ　、　　１９８０））５ｄ中で、３０
℃、−夜、生育させる。その５−培養物をＬＢＭＧｚｓ
ｏ−に加え、培養物の濃度が６００ｎｍ波長でｏＤ−（
１，６にな７？まで、激しく攪拌する。次いで、細胞を
８００ＸＨの遠心分離で集め、ＬＢＭＧ　５　、ｔに再
懸濁する。ＬＢＭＧ中（１２乃至１μゾのバイナリ−プ
ラスミドＤＮＡに細胞２００μｌ金加え、この混合物を
ドライアイス／エタノール浴中で直ちに凍結する。５分
後、試験管を３７℃水谷中に５分間置き、次いで細胞金
遠心分離で集める。
細＠を最少量のＬＢＭＧに再懸濁し、選択培地（１００
μ９／Ｗｄゲンタマイシンを含むＬＢＭＧプレート）上
にブレーティングする。５０℃で２乃至５日後にプロニ
ーが生じる。
セクシ冒ン７　植物の形質転換 工ｙ　ｘ　（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）仲介形
質転換 １７％７アイトアガー（ギブコーピーアールエル、　Ｇ
ｉｂｃｏ−ＢＲＪ、　）、　１　ｌＩ９／　１ＩＡＡ　
、　Ａ１５ｑ／Ｉキネチンを含む固体ＭＳ培地（ムラシ
ゲアンドスクーグ、　１９４２年、　Ｍｒａｓｈｉｇｅ
　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ。
１９６２）で、アキセエック条件下（ファシオティ　ア
ンドビレット、　　１９７９年、　Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ
ａｎｄ　Ｐｉｌｅｔ、　１９７９　）Ｉｃ生Ｗ　Ｌ、ｆ
ｔ二：ｙ　チａｔ　　タバクム（Ｎ−ｔａｂａｃｕｍ）
ｃｖ　’Ｘａｎｔｈｉ　ｎｃ’の先端から３乃至６番目
の若い３乃至５傷長さの葉から、移植体約５乃至１０ｆ
１４切り取る。この移植体を、１ｌＬ６４フアイトアガ
ー　４０　Ｍｇ／＃硫酸アデニン、２ｑ／６Ｉ）ｋ　、
＆よび２ｑ／Ｚキネチンを含む固体ＭＳ培地表面上にワ
ットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）　Ｆ紙◆１金置いてブレ
ーティングし、２４℃で２４時間、暗黒下に置く。アグ
ロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）　Ｑ
　（（！り’／　ｗ　７５　テ調製したキメラ遺伝子構
築物を持つ）をＬＢｅｄＧ中、３０℃、１ａｏｒｐｍの
シェーカー上で一夜、生育させる。移植体を五５ｘ１ｏ
ａ細＠／−の細菌懸濁液に約５分間浸し、殺菌した紙タ
オルで水分を取り、同じプレート上に戻す。４８時＋１
５後、移植体を、上記の成分に３５０η／ｌセホタキシ
ムと１００ｆｌ／Ｉ　　カナマイシンを含んだ上記のプ
レート培地を含む選択培地上に置く。同時に培養した対
照組織をカナマイシンを含まない同じ培地上に壁く。移
植体１！ｉ−２週間毎に新鮮な培地に移す。同時培養後
４乃至８週して新芽を採取し、化６囁ファイト　アガー
　１叩／＃　ＩＢＡ、３５０η／ｌセホタキシム卦よび
１００η／ｌカナマイシンを含む固体ＭＳ壇地２５−と
共に５０ｄ培養試験管に置く。すべての組織金２４°乃
至２８℃で、１２時間照明、１２時間暗黒で生育させ、
照度は６７００乃至８４００ルツクスとする。新芽は１
乃至２週間で根を出し、これｔ−１０（至）（４インチ
）ポットのプランティング　ミックスに移１１Ｌ、、ｒ
）ランスジェニック　プラント　ファイトトロンＪ　（
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ　ｐｈｙｔｏｔｒｏ
ｎ）内に置く。
実施例５９　タバコの葉ディスク形質転換上記のバイナ
リ−ベクターを含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ　）株を、０．１５１！ｌマンニトール
、５０μｇ／−カナマイシン、５０μ９／−スベクチノ
マイシンによび１１１１ｉ１／Ｗｔストレプトマイシン
を補ったｐＨ’ｆｈ　６　、Ａ整のグルタミン酸塩培地
で１８乃至２４時間培養し、抗生物質を含まない同じ培
地で１１２のＯＤ・（１１１まで希釈する。この細菌を
３乃至５時間培養し、化２乃至ａ４σ）ＯＤ、。。に希
釈して、ＧＡ７コンテナー中で無菌的にホＡ／　’／　
ｚ等、　　１９８５年（Ｌ−１ｏｒｓｃｈ　ｅｔ　１）
（ａ）、　。
１９８５　）の変法にしたがって予め生育させたニコチ
アナ　タバクＡ　（Ｎ、　ｔａｂａｃｕｍ）ｃｖ、　ｘ
ａｎｔｈｉの葉から打抜い７ｔ５乃至７−ＩＪＩのディ
スクに接種する。その葉ディスクを、ムラシゲアンドス
クーグ（Ｍｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　）の
主および副の塩ａ　（ＭＳ　）　、　　１η／ｌベンジ
ルアデニンおよび１ｍｇ／ｄ　ＮＡＡを含むａ７鳴寒天
上に２日間置き、５０　ｔＪ’Ｊ／−カナマイシンを含
む同じ培地に移す。
ディスク上に生じた新芽を切り、ＧＡ７コンテナー中で
５０μｇ／−カナマイシンを含むＭＳ培地上で新芽片を
培養することにより６個の少植物苗が得られるまで繁殖
させる。
苗はホルモンを含まず、５０μり／−カナマイシンを含
む培地上で根を出させ、土に移してファイトトロン中で
硬くした後、温室に移して化学調節剤による化学誘導処
理を行う。開花期に花を自家受粉させる。成熟後、種子
を集める。
バイナリ−ベクターを含むアグロバクテリウム　（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）株を使って葉ディスク（実
施例３４）からのカルス形成を形質転換する。カナマイ
シン含、Ｖ　ＭＳＢＮ選択培地上でのカルス形成を、Ｍ
Ｓの主訃よび副の塩類訃よびＦｅ−ｇＤＴＡ　（ギブ＝
ｒ　、　Ｇｉｂｃｏ、　＋５００−１１１７　：４゜３
ｇ／＃）、ＭＳビタミン、１００Ｍ９／Ｚミオイノシト
ール、２０　ｇ／ｌｋ蔗糖、２１個ｇ／／　＃　ＮＡＡ
　＞よび１１．３ＩＩｇ／＃キネチンを含むカルス生育
培地上で保持する。カルス片ｔ−ＭＳＢＮ培地に移し下
記の方法によって、七〇カルスをトランスジェニック種
物に再生させることができる。
実施例６１　ニンジンの形質転換 バイナリ−ベクターを含むアグロバクテリウム　（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）株１５Ｎ！施例５９に記載
したようにして生育させる。０Ｄ１１６（１ｆ　（Ｌ　
２乃至α４に希釈した細＃ｉを使ってＲ［したニンジン
表面から切り出したディスクに接種する。
ニンジンを表面殺菌するため、皮をむき、クロロックス
（ｃｈｏｒｏｘ　）の１０僑溶液に２０分間浸す。この
ニンジンｔ−ｆｆ＠水で洗浄して５個片だ刻み、水寒天
上に基底側を上にして置く。次いで、細［２０乃至５０
μｚ６デイスクの上部表面に付ける。７Ｂ後、ＭＳ塩類
、５４１に糖、（Ｌ１ｍ／１２．４−Ｄ、５０ｕり／＋
ｄ力＋−ｒイシｙ、１００μｑ／−カルベニシリン、訃
よび１０口μ９／−メツオキシンを含むα７４寒天にデ
ィスクを移す。
形質層リング周辺のカルス形成を切り出し、３４蔗糖、
ｃＬ１ｑ／Ｚ２．４−Ｄ、５Ｑｆｉ９／ｄｆＪナマイシ
ン、１００μｇ／ｗｊカルベニシリン、シよヒ１００μ
ｇ／−メフォキシンを補ったα７１Ｍ５寒天上に置く。
カルスが生育した後、小片に刻んで同じ培地の４枚のプ
レートに無作意に置く。
実施例６２　ヒマワリの形質転換 バイナリ−ベクターを含むアグロバクテリウム　（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）株を上記のように生育させ
る。江２乃至α４の００１１００に希釈した細菌ヲ下記
のように調製したヒマワＩＪ　ｉ物の茎への接種に開用
する： ヒマワリ種子を１０４カプタン（ｃａｐｔａｎ　）に１
０分間浸し、次いで１０ｑｂクロロクス（ｃｈｌｏｒｏ
ｘ　）　ｉｃ　１０分間浸し、殺菌水ですすぐ。
種子被覆を除去し、その種子ｆ０．７４水寒天上で暗黒
下、３日間発芽させる。その後、これを２′５℃、１２
時間の昼と夜にセットしたラブラインインキュベイター
（１ａｂｌｉｎｅ　１ｎｃｕｂａｔｏｒ　）に入れる。
１週間、苗を生育させ、頭部を切って細菌をその切った
基面に接種する。１週間後、接種された茎を切り、ＭＳ
塩類、３４蔗糖、２Ｑ／ｍ　ＮＡＡ　、　Ｉ　ＩＱ／ｄ
　ＢＡｐ　、　１００　ｕ９　／ｒｄ　力ｋ　ヘ二シリ
ン、１００μｇ／ｌｌｔメフォキシム会よび５０μり／
−カナマイシンを含む１１寒天上に置く。
そのカルスを、４枚のプレートに十分な量が得られるま
で、２週間毎に新鮮な培地に移す。感染力のあるアグロ
バクテリウム（Ａｇｒｏｄａｃｔｅｒｉｕｍ）株から生
育したカルスの半分をホルモンを含まず、５０μｇ／−
カナマイシンを含む培地に移す。
バイナリ−ベクターを含むアグロパクター（Ａｇｒｏｂ
ａｃ　ｔｅｒ　）株を実施例５９に記載されたようにし
て生育する。ｏ　Ｄ　、ｏ、が化２乃至（１４になるま
で希釈した細菌を使って下記のように調製したトマト苗
の茎に接種するニ ドマド種子を１０係クロロクス（ｃｈｌｏｒｏｘ　）に
２０分間浸して殺菌水ですすぐ・その種子をｃＬ７％水
寒天上で暗黒下、５日間発芽させ、これを２５℃、１２
時間の昼および夜に七７）したラブラインインキュベイ
ター（１ａｂｌｉｎｅ　１ｎ−Ｃｕｂａｔｏｒ　）の中
に入れる。苗を１週間生育させ、頭部金切って、その切
った茎の表面に細ｌ！Ｉを接種する。
１週間後、接種した茎を切り、ＭＳ塩類、３僑蔗糖、２
’９／＋＋＋ｊＮＡＡ、１ダ／ｄＢＡｐ、　１００μｑ
／−カルベニシリン、１００μ９／−メツオキシム、シ
よび５０μｇ／−カナマイシンを含む（Ｌ７１１Ｅ天上
に置く。そのカルスｉ　　４枚のプレートにとって十分
な量が得られるまで、二週間毎に新鮮な培地に移す。
バイナリ−ベクターを含むアブロバフタ−（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒ　）株を記載したようにして生育させる。細
菌を０１）ｇｏｏが（１２乃至（１，４になるように希
釈して、下記のように調製したワタ子葉の接種に使用す
る： ワタ種子ｔ−１０ｑｂりａロクｘ　（ｃｈｌｏｒｏｘ　
）に２０分間浸し、殺直水ですすぐ。種子を暗黒下に１
７４水寒天上で発芽させる。その苗を１週間生育させ、
細菌を子！Ｊ衣表面接種する。
接種した子葉をカルス形成させ、それを切って、ＭＳ塩
類、３嶋蔗糖、１００μり／−カルベニシリン、）よび
１００μｇ／−メツオキシムを含むα７憾寒天上に置く
。カルスを、４枚のプレートに十分な量が得られるまで
、３週毎に新鮮な培地に移す。感染可能なアグロバクテ
リウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）株から生育し
たカルスの半分全ホルモンを含まずに５０μ９／、ａｔ
カナマイシンを含む培地に移す。
の調製 同系交配系ファンク（Ｆｕｎｋ）　２７１７のセアメイ
ズ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　）植物を温室内で生育、開花さ
せ、自家授粉させる。胚を含む約２乃至２．５−長さの
未成熟Ｉ！ｔ−檀吻から取り、１０１１＆クロロクス（
ｃｈｌｏｒｏｘ　）溶液中で２０分間殺菌する。
胚を無菌的に仁から取り、（１１ダ／Ｚ２．４−Ｄ、６
鳴蔗糖、および２５　ｍＭ　Ｌ−プロリンを含み、（Ｌ
２４％ゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ■）で固めた０ＭＳ
培地（最初の培地）上に胚軸を下方にしてブレーティン
グする。２７℃、暗黒下に２週間培養した後に、胚盤上
に生育したカルスを胚から取り、０．５ｙｄ／Ｚ２．４
Ｄｆ（含み、化２４％ゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ［有
］）で固めたＢ５培地（ガンボルグ等。
１９６８竿、　Ｇａｍｂｏｒｇ　ｅｔ　１）（ａ）、、
　１９６８　）　上ニブレーティングする。そのカルス
を二週間毎に新鮮な培地で移植培養する。胚を最初の培
地に置いてから全部で８Ｊ！！間後に、特別な型のカル
スを特徴的形態から口定する。このカルスを更に同じ培
地で移植培養する。更に２ケ月後、カルスｆ’　２１９
／＃　２．４−Ｄ　ｉ含みゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ
■）で固めたＮ６培地に移し、連続して移植培養する。
上記のカルスを全体で少くとも６ケ月間＃植培養する。
移植培養のために選ぶカルスの型は比較的粘液質でなく
、粒状で砕けやすいもので、液体培地に入れると小さな
バラバラの細胞凝集物に分離するようなものである。大
きな、膨んだ細胞を持つ凝集物を含む培養を残さないよ
うにする。ゼア　メイズ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ　）エリー
ト同系交配ファンク（ｆｕｎｋ）２７１７の特別なカル
スの約５ｏｏａ５＋６．１２５−デｏ　ンク（Ｄｅｌｏ
ｎｇ）　７５スコに入れた２ａｆｌ／Ｚ　２．４−Ｄ　
ｆ含むＮ６培地５〇−中に入れる。旋回シェイカー（１
５０ｒｐｍ、　２−５（至）スロー）上で、暗黒下、２
６℃で１週間培養した後、培地を新鮮なものに変える。
懸濁液を１週間後に同じようにして移植培養する。この
時に培養物を調べ、膨んだ細胞が多くないものを残す。
大きくて膨んだ細胞を持つ凝集を含む懸濁培養を捨てる
。望ましい組織は通常の型の細胞凝集物よ１３％徴的に
滑かな表面を持つ、密に細胞質分裂細胞凝集からなる。
これが望ましい形態である。これらの懸濁液はまた速い
生育速度を持ち、ダブリングタイムは１週間以下である
。懸濁培養の（Ｌ　５　ｙ　ｐｃｖを毎週新鮮な培地２
５−に移して移植培養する。このようにして４乃至６週
の移植培養した後、培養は毎週の移檀培養当り２乃至５
倍に増加する。７５４以上の細胞が望ましい形態である
培養を以後の移植培養用に残す。常に、最上の形態を含
むフラスコの系を移植培養用に保持する。２週間毎に、
６３０μｍポアサイズのステンレススチール篩で定期的
に濾過して培養の分散性を高める場合もあるが、必須で
はない。
上記カラ（７）＠ｐＲ培養の１乃至１．５ｄｌ’ＣＶｇ
、ＫＭＣ（ａ６５ｇ／ｌＫＣ＃、　１＆４７り／＃Ｍｇ
Ｃ＃、　−６ｔ（，０釦よび１２．５り／Ｌ　ＣａＣ＃
、　−２）１，０　、　５　ｇ／　＃　ＭＥＳ　。
ｐＨ５，６）塩溶液中に１４ｏザイム（Ｒｈｏｚｙｍｅ
　）と共に４４セルラーゼＲ８からなるフィルター殺菌
した混合液１０乃至１５−中に置く。ゆるやかに揺する
板上で３乃至４時間、５０℃で消化を行う。この標品に
ついて倒立懸微境下にプロトプラスト放出を監視する。
放出賂れたプロトプラストラ下記のようにして集める：
標品金１００μｍメツシュ篩、次いで５０μｍメツシュ
篩でＰ遇する。プロトプラストを酵素溶液の最初の量と
同じ容量のＫＭＣ塩溶液を使って篩を通して洗浄する。
プロトプラスト標品の１０ｄ１に：いくつかのディスポ
ーザブルプラスチック遠心分離チューブそれぞれに入れ
、（Ｌ６Ｍ蔗糖溶液（ａ、１係ＭＥ８とＫＯ）ｌでｐ）
Ｉｓ、　６に緩衝化）１．５乃至２−をその下に層状に
入れる。チェープｆ：６０乃至１１０Ｏｘで１０分間遠
心分離し、界面のプロトプラストバンドをピペットで集
めて新しいチューブに移す。プロトプラスト標品を新鮮
なＫＭＣ塩溶液１０ＩＩＩ／！／ｃ再懸濁し、６０乃至
１１００Ｘで５分間遠心分離する。上澄を取って捨て、
プロトプラストを残っている液滴にｐだやかに再懸濁し
、１３７１４倍希釈のＫＭＣｇ液を少しづつ加える。５
分間遠心分離した後、再び上澄を除き、プロトプラスト
を６／７倍希釈のＫＭＣ溶液に再懸濁する。一部を取っ
て数を計測し、再びプロトプラストを遠心分離で沈殿さ
せる。このプロトプラストを１０？／−で、ＫＭ−８ｐ
培地、または４ｍＭＭｇＣ＃、含有（Ｌ５Ｍマｙニト−
ル、または以下の実施例に記載する形質転換に使用する
ために好適な他の培地に再懸濁する。このプロトプラス
ト懸濁液を下記のように形質転換に使用し、培養する。
人、ヒートシロツタ以外のすべてのステップを室温（２
２乃至２８℃）で行う。
プロトプラストを上記の最後のステップでα１％　ＭＥ
Ｓと６　ｍＭ　ＭｇＣ＃、　ｆ含む（１５Ｍ−ｒン＝ト
ールに再懸濁する。この懸濁液の抵抗をダイアログエレ
クトロボレイター（Ｄｉ１）（ａ）ｏｇ　Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｏ−ｒａｔｏｒ　）のチヱインパー内で副定し、５
００　ｍＭＭｇＣ＃、溶液を使って１乃至１．２にΩに
調節する。
プロトプラストに、試料を含むチ１−プ金４５℃の水浴
に５分間没し、次いで氷で室温まで冷却することにより
Ｗ−）シラツク金与える。ロトスタイン等、　　１９８
７年（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ　ｅｔ　１）（ａ）、。
１９８７　）　　によって記載されているような植物選
抗性ハイグロマイシン耐性遺伝子、または上記で構築し
たようなキメラ遺伝子金倉む直鎖状プラスミド４μ９ｐ
よびコウシ胸腺キャリアーＤＮ人２０μりをこの懸濁液
のα２５−に加える。
３０　ｍＭ　ＭｇＣＬ＠　’ｆｃ含む（Ｌ　５　ＭＷ　
７　二）−に中の２ａ４　ＰＥＧ溶液（ＭＷ　８０００
　）　Ｃ）　（Ｌ１２５ｄｉ　７’　ａドプラストに加
える。この混合物を十分に、しかし、公だやかに混合し
、１０分子ｔ！Ｉ装く。試料をエレクトロボレーターの
チーインバーに移し、１０秒間隔で５回、最初の電圧を
１５００．１８００゜２５００または２８００　Ｖ□□
□−１でパルス荷電し、エクスボネンシャルデケイ　タ
イムは１０ｍ５ｅｃである。
このプロトプラス）ｔ−次のように培養する：試料金室
温で６（至）ベトリ皿にブレーティングする。更に５乃
至１５分後に、Ｌ２４ジ−プラク（５ｅａｐｌａｑｕｅ
　）アガロースと１１１９／＃Ｚ、４−Ｄを含むＫＭ−
Ｂ　ｐ　培地５１１ｔｔ−加える。アガロースとプロト
プラストを十分に混合し、培地をゲル状にする。
Ｂ、これは一つ以上の下記の変法で繰返す：（１）　　
プロトプラス）Ｗ品の抵抗ｆ、ｃｓ乃至化７にΩに調整
する。
（２）使用するＰＥＧをＭＷ　４００　ＧのＰＥＧとす
る。
（３３Ｐｚｏｔ−加えない、または半量の１２優ＰＥＧ
を加える。
（４）パルスを３秒間隔で与える。
（５）　　プロトプラストをエレクトロボレーシコン後
に１６℃の温度に冷却した板上に置いた皿にブレーティ
ングする。
（６）　　プロトプラストをエレクトロボレーターン　
ステップ後にチューブに入れ、６／７希釈ＫＭＣ溶液１
０ｄまたはＷ５溶液（３８０η／１ＫＣｂ、　１　＆５
７５（ｉｌＺ　Ｃａ（、＃、　−２Ｈ，０，９’ｉ／　
＃ＮａＣＺ：９９／ｌグルコース、ｐＨ１ｓ、Ｏｆ含む
）で洗浄し、６Ｑｘｇ、１０分間の遠心分離で集めてＫ
Ｍ培地０，５−に再懸濁、Ａにかけるようにグレーティ
ングする。
（７）　　コウシ胸腺キャリアーＤＮＡ　ｔ−加えない
〇ｍａｙｓ）プロトプラストの形質転換 人、上記の最後のステップで、プロトプラストｆ、１２
　乃至５　Ｑ　ｍＭ　ＭｇＣｊ、　ｆ含むａ、５Ｍマン
ニトール溶液に再懸濁する。前述のように４５℃で５分
間のヒートシロブクを与える。
プロトプラストを形質転換のために遠心チューブに懸濁
液ａ５−づつ分けて入れる。次の１０分間の間に下記の
ものを加える：　ＤＮＡｋよびｒＥｏ溶液（（Ｌ　Ｉ　
ＭＣａ（Ｎｏ、　）＊と［１４Ｍマｙニトールを含むＭ
Ｗ６０００の４０優、ｐＨ金８乃至９ｉＣＫＯＨテ調整
）　ｉ　２．Ｏｆｉ　ＰＥＧ（７）終＊［になるように
する。時々ゆるやかに攪拌しながら３０分間置き、次い
で、プロトプラストをペトリ皿にブレーティングしく６
１）（ａ）Ｉペトリ皿当り最初のプロトプラスト懸濁液
α３−）、上記のように培養する。
Ｂ、これは繰返す。上記のＰＥＧ溶液で３Ｈ分間置いた
後に、Ｗ５溶液ｃＬ３−を２乃至３分間隔で５回加える
ことによってプロトプラストを洗浄する。このプロトプ
ラスト懸濁液を遠心分離し、上澄を除いて、プロトプラ
スト１−上記のように培養する。
Ｃ，ＰＥＧの終濃度ｉｌ　５１と２５優の間にする変法
で上記を繰返す。
生 アガロース中のプロトプラスト’６含むプレー）ｔ′２
６℃で暗黒下に置く。１４日後、プロトプラストからコ
ロニーを生じる。コロニーを含むアガロースを、２叩／
１２．．４−Ｄを含みα２４４ゲルライト（Ｇｅｌｒｉ
ｔｅ■）で固め７’ｃＮ６培地３〇−を入れた９（至）
直径のベトリ皿の表面に移す。
この培地を２Ｎ６とする。カルスを更に２６℃、暗黒下
に培養し、２週間毎にカルス片を新鮮な固体２Ｎ６培地
上で移植培養する。
択 形質転換された細胞を選択するため１００呼／ｌまたば
２ｏｏａｇ／＃ハイグロマイシンＢ　ｌ　２Ｎ６培地に
加える変法を使って上記実施例を繰返す。
実施例７２　コーン植物の再生 人、カルスを維持のために２８６培地上に、また再生を
開始させるためにＯＮＥ　（２，４−Ｄｔ−含まないＮ
６培地を含む）およびＮ６１培地しくＬ２５＊／＃２．
４−Ｄ′１？よびｔｏｑ／Ａキネチンヲ含むＮ６培地を
含む）上に置＜　ｏ　ＯＮ６　ｋよびＮ６１培地上で生
育したカルスを明るい所で生育させる（白色螢光灯から
の８４０乃至８４００ルクスの光合１日ＩＣ１６時間）
。Ｎ６１培地で生育したカルス′ｔ−２週間後にＯＮ６
培地に移す。
ｆ１１培地で長く生育させることは有害であるＯカルス
を同じ組成の培地に再移植して２週間毎に移植培養する
。小植物が約４乃至８週間で現われる。小植物が少くと
も２１ｍの高さになっ７２う、ＧＡ７コンテナー内のＯ
Ｎ６培地に移す。２乃至４週間で根を生じ、その根が生
育を支えるに十分形成されたように見えた時、小植物金
ビートポットの土に移し、最初の２乃至４週間は遮光す
る。硬くするのを助けるために２乃至５日の間、移植体
の上に透明なプラスチックカップを逆にしてかぶせるこ
とは有用でちることが多い。植物として基礎が一担出来
ると、通常のコーン植物として扱い、温室内で生育させ
て成熟させる。子孫を得るために、植物を自家授粉させ
るか、野生型と交配させる。
Ｂ、カルス′ｆ：維持するために使用する培地に１００
η／ｌ／または２００η／ｌノ飄イグロマイシンＢを加
える変法を使って上記実施例を繰返すＯ／′ ／ 実施例７５　ダクチリス　グロメラタリンネの調製 Ａ、胚形成性カルスヲ、ノ）ニング　アンド　コンガー
　１９８２年（Ｈａｎｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｎｇｅｒ
。
１９８２）に記載されたように温室で育てたカモガヤ植
物（ダクチリス　グロメラタ　／曳／ネ、　Ｄａｃｔｙ
ｌｉｓ　ｇｌｏｍｅｒａｔａ　Ｌ、）の最も若い葉の基
底切片から初める０葉ｆｔ１：１０希釈のりｏｏクス（
Ｃｈｌｏｒｏｘ）溶液（５，２５％次亜塩素酸ナトリウ
ム；ザクロロクス　カンノくニーオークランド、カリホ
ルニアＡ−１．’ｌ’ｈｅＣｈｌｏｒｏｘ　Ｃｏｍｐａ
ｎｙ、　０ａｋｌａｎｃＬ　Ｃａ−）に約１０分間浸す
ことによって表面殺菌し、次いで長さまたは直径が１乃
至５ｓＩｌの小切片に無菌的に切る。この切片會ゲル化
剤として（１８％アガロースを含むｆｌｌ！５Ｒ−ｓｏ
培地上にブレーティングする。カルスによび／または胚
形成性構造が約２５℃で培養しているとブレーティング
後２乃至６週間以内に現われる。胚形成性カルスを、新
鮮５）ｌ−３０培地に２乃至４週間毎に移植培養し、暗
黒下に２５℃で培養することで保持する。
Ｂ、胚形成性懸濁培養を、４５μＭジカンパおよび４２
／ｌカゼイン加水分解物金含む、グレイ７７）”：７７
ガン、１９８５年（Ｇｒａｙ　ａｎｄ　Ｃｏｎｇｅｒ。
１９８５）に記載された液体培地５０！Ｌｉ中に、新鮮
なものの重量で約α５ｔの胚形成性カルスを入れること
によって初める。この懸濁培養を金属キャップとパラフ
ィルム（Ｐａｒａｆ　ｉ　１ｍ■）テシールし７１１２
５ＩＬｔデｌｆｆ７グ（Ｄｅｌｏｎｇ）フラスコに入れ
、約ｔ３０ｒｐｍの節回シェーカー上、２７℃で１６時
間の照明（ｊ３００ルクス）、８時間の暗黒期間として
生育させる。約４週間後、大きな固まりを約３０秒間、
沈めて、小さな細胞の群れ（クラスター）を含む上澄培
地１０ｄｉ５０ａ＃の新鮮培地に移す。より小さな群れ
のサイズと小さな細胞質の細胞の存在に基づくより良い
質から判断して最も或功している培養を使って、このプ
ロセスを３乃至４週間毎に繰返す、５乃至８回の移植の
後に、懸濁液は非胚形成性細胞は実際上なくなり１胚形
成性細胞クラスターのほとんどは非常に小さい（１５０
乃至２０００．ａｍ）。
上記の胚形成性懸濁培養から、細胞をナルゲン（Ｎａ１
ｇｅｎｅ＠　）　（１２μｍ　フィルター５．　二７ト
で無菌的に濾過し、新鮮な細胞重量でｒｘｓｇをペトリ
皿中でプロトプラスト［８混合物各１２−５−に加える
ことにより、ブヨドプラストを調製する。
酵素混合物は２多セルラーゼＲ８、７ｒｎＭ　ＣａＣ１
ｘＨ２Ｏ，（Ｌ　７　ｍＦｖｌＮａＨ２ＰＯ４ｘ　ＨＩ
ｏ　、　５ｒｒＭＭＥ８　（ｐＨ５，６）、グル：Ｆ　
−ス（５５０ｍＯｓ／′ＫＩＩＨ＊Ｏ、ｐＨ５，６）か
らなう１濾過殺菌する。混合物を約ｓ　ｏ　ｒｐｍのオ
ービタルシェーカー上で約４乃至６時間、薄黒い中で（
＜４２０ルクス）渦巻攪拌する０次いで、その消化物を
ステンレス　るチ゛−ル＠　（１００ｔｍメツシ、）１
−通し、１２ＩＬｌ遠心チー−ブに分注して約６０乃至
１．０．０Ｘｆで約５分間、遠心分離する。プロトプラ
ストを含む沈殿を、グルコースで５５０ｍ０　ｓ　／　
Ｌｙ　）ｂｏに調整したプロトプラスト培養液ＫＭ　−
８９で３回洗浄する。この時点で、プロトプラス）１更
に精製するために浮遊ステップを入れてもよい。この場
合、洗浄プロトプラストを蔗糖でｙ　ｏ　０ｍＯｓ　／
　Ｋｉｉ　ＨｘＯに調整したＫＭ−８ｐ培地１０ＩＬｌ
の上に層状にのせる。６０乃至１００×２で約１０分間
、遠心分離した後、界面にあるプロトプラスト　バンド
１ｆｒ細いピペットを使って集める。最後に、プロトプ
ラストｆ：１乃至２ｄのＫＭ−８ｐ培地に再懸濁してス
テンレススチール篩（２０μｍメッシェ）ヲ通す。放出
されたプロトプラストラ集め、洗浄して培養のためにＫ
Ｍ−８９培地に、ま７２：は下記の実施例にしたがって
形質転換に好適な浸透圧的に調整した培地に再懸濁する
。
プラスト培養とカルスの生育 Ａ、精製したブヨドプラストを、ｔ　５　％シーブラン
ク（Ｓｅａｐｌａｑｎｅ■）アガロース（エフ　エムシ
ー　コーポレイシ曹ン、マリン　コロイヅディビジラン
、ロックランド　メイン州、アメリカ合衆国、ＦＭＣＣ
ｏｒｐ、　Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄａＤｉｖｉｓ
ｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　Ｍａｉｎｅ、　ＵＳＡ
　）およびコンディジ璽ンド培地（ダクチリス　グロメ
ラタリンネ、　Ｄａｃｔｙｌｉｓ　ｇｌｏｍｅｒａｔａ
　Ｌ、　ｆ　３乃至４週間、胚形成性懸濁培養した培地
を殺菌したナルゲン（Ｎａ１ｇｅｎｅ■）Ｑ、２μｍフ
ィルターで濾過し、グルコースを加えて培地ｙｓｓｏｍ
＋ｏｓ／〜ＨｚＯにして再び濾過殺菌して得る）を５０
乃至４０％含むＫＭ−８９培地に約５Ｘ１０’プロトン
ラスト１−の濃度でブレーティングする。このプレート
金暗黒下、２８℃の一定温度に置く、１０乃至１４日後
に、アガロースをくさび形に切り、元のアガロース埋込
み培養５ｄ当り、３％庶蔗糖含む５）ｉ−４５１！！濁
培養地２０ｍを使りて、シリト等、１９８３年（Ｓｈｉ
ｌｌｔｔｏ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１９８３年）に記
載されたような「ピース培養」に入れる。
プレート金プラクトフォームシェーカー上に置き、６７
０ルクスの照明をして約５０ｒｐｍで攪拌する。アガロ
ースからコロニーを生じたら新たな懸濁培養を行い、液
体培地中に細胞を放出する。
得られた懸濁培養細胞を寒天で固めた５）Ｉ−３０培地
にグレーティングし、カルスを生じる筐で２５℃で暗黒
下に置く。
Ｂ、培地にコンディションド培地金加えないことを除き
、上記のようにプラトプラストを培養する。
Ａ、プロトプラストラ精製後、直ちに、直線状プラスミ
ドを使ってシリト等、１９８５年（Ｓｈｉｌｌｉ　ｔ。
ｅｔ１）（ａ）、、１９８５）にしたがってエレクトロ
ボレイシ冒ンを行う。プロトプラスト會、最後の洗浄後
にエレクトロボレイシッン緩衝液（１１４Ｍマンニトー
ル、６　ｍＭＭｇｃ−／ａ　）中に約７Ｘ１０’　プロ
トプラスト／ｊｌＬｌの濃度で再懸濁する。プロトプラ
ストＱ、７ｘｌｆ１０ｍｌプラスチック遠心チューブに
入れる。プラスミドＤＮＡと音波処理コウシ胸腺ＤＮＡ
（ジグーｒ　Ｓｉｇｍａ）　ｆそれぞれ終濃度１ｏμｆ
／ｍｅと５０μ？／！Ｌｔになるようにチューブに加え
る。
次ｎ　テ、　　（１３８ｔｘｅ　（Ｄ　ＰＥＧ溶液（０
，４Ｍ−ｒｙ＝トール、５０　ｍＭＭ、ｇｃｔ２．　［
１１％ＭＥＳ　（ｐＨ５，６）中に２４％ＰＥＧ６００
０）ｆ加え、その溶液をシだやかに混合する。プロトプ
ラスト懸濁液をダイアログエレクトロボレーター（Ｄｉ
１）（ａ）ｏｇ＠Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）のチ
エインバーに移し、初期電圧３２５０Ｖ３−’とエクス
ボネンシャルデケイ定数１０　ｍ５ｅｃとして３０秒間
隔で１０パルスを与える。
試料をチエインバーから取り出し、１０ａｎ直径のベト
リ皿に入れる。１．２％ジ−プラク（Ｓｅａ　Ｐｌａｇ
ｎｅＯ）アガロースを含むＫＭ−８ｐ培地１０ｍ１を加
え、プロトプラストを培地全体に均一に分布するように
して、アガロース全ゲル化させる。
Ｂ、初期電圧に３５００ＶｃＭ　、４０００Ｖｍ−”５
０００Ｖｍ　　、３０００Ｖｃｍ　　、ｔ＊ｔｔ　２５
００Ｖｍ−’を使うこと以外は上記繰返す。
形質転換 Ａ、　　ＰＥＧ仲介直接遺伝子注入をネグルチューアイ
０等、１９８７年、（Ｎｅｇｒｎｔｉｕ、　１．　ｅｔ
　１）（ａ）、。
１９８７）にしたがって行う。使用するＤＮＡは上記の
直線状プラス□ドである。
プロトプラストを最後の洗浄後、１５ｒｒＬＭＭｇＣ！
４を含むα５Ｍマンニトールに約２　ｘ　１０’／ｍの
濃度で懸濁する。プロトプラストｓ濁液を１０ｄプラス
チツク遠心チユーブにＩＩＩＬ／ｉづつ分注する。上記
のようにＤＮＡを加え、次いでＰＥＧ溶液（０，４？　
７　二）　−ｋ、（Ｌ　Ｉ　Ｍ　Ｃａ（Ｎ０ｓ）ｚ　＊
　ｐＨｚｏ）０．５ｘＪ金加える。
溶液會９だやかに混合し、時々攪拌しなから室ｍ（約２
４℃）で５０分間置く。次いで洗浄溶液１．４　ｍ　ｆ
加え、チューブの内容ｔおだやかに混合する。洗浄溶液
は５７ｍＭマンニトル、１１５ｍＭ　ＣａＣｔｚ　、　
２７ｍＭ　ＭｇＣｔｘ　、　３９ｍＭ　ＫＣ４７ｍＭト
リス−ＨＣｔふ・よび１．７？／ｌミオイノシトール、
ｐＨ９，０からなる。更に１．４−の洗浄溶液を４回、
４分間隔で加え、その度に混合する。
チューブを約６０Ｘｆで１０分間、遠心分離し、上澄を
捨てる。沈殿したプロトプラストを１−〇ＫＭ−８９培
地に取り、１０のベトリ皿内に置く。ｔ２％ジ−プラク
（Ｓｅａ　Ｐｌａｇｎｅ■）アガロースを含むＫＭ−８
９培地の１０ｄを加える。プロトプラス）ｔ−培地全体
に均等に分布させ、アガロースをゲル化する。
Ｂ、下記の変法の１以上を使って、これを繰返す： ｔｏ　　洗浄浴液のｐＨを５．６またはＺＯに調整する
。
（２）　使用すルＰＥＧｔ’ＭＷ６００００ＰＥＧ、Ｍ
Ｗ２０００のＰＥＧまたはＭＷ　８０００のＰＥＧとす
る。
（３）　　洗浄溶液が１５４　ｍＭＮａｃｔ、　１２５
　ｍＭｃａｃｔｚ　ｔ５ｍＭＫＣｔ、５ｍＭグルコース
、ＫＯＨでＰＲ＆　Ｏからなるか、α２ＭＣａＣｔ２．
　［１１％ＭＥＳ、ＫＯＨでｐＨ６，０からなるか、１
　Ｌ　！”ｔ　（Ｌ　２Ｍ　ＣａＣｔｚ　、　７ｍＭ　
）リス／ＨＣ１，ＫＯ）１でｐＨ９，０からなる。
形質転換のためにチューブに分注する前、分注後、訃よ
びＰＥ（ｌ加える前に４５℃で５分間、プロトプラス）
ｆ処理すること以外ぼ、上記のようにして形質転換を行
う。
実施的７９　形質転換烙れたコロニーの選択プロトプラ
ストを含む培養プレート（ペトリ皿）を約２５℃、暗黒
下に１０日間置き、「ビーズ培養」（シリト等、１９８
５年、５ｈｉｌｌｉｔ。
ｅｔ１）（ａ）、、１９８５）のために５個の同じ大＠
さの薄切片に切る。切片の４枚ｋ　４　ｆ／ｌカゼイン
加水分解物と２０μ’／／１）（ａ）−・イグロマイシ
ンＢを含む５Ｒ−４５培地２０ｍに入れる。５番目の切
片を非選択対照としてハイクロマイシフＢｋ含まない同
じ培地２０ｘｔｌに入れる。
４乃至５週間後、ハイグロマイシンＢで生育した後の形
質転換プロドグラスト誘導細胞コロニー金アガロースか
ら切り出し、２０μｆ／　ｒｉｇハイグロマイシンＢを
含む液体ＢＨ−ａｓ培地２ｊＩｊと共に１９１１１１ペ
トリ皿に入れ、オービタル　シェーカー上、約５　Ｏｒ
ｐｍで揺する。更に４乃至５週間後、新たな懸濁ａをつ
くるために生育させたすべてのコロニー１１２５ｄエル
レンマイヤー　フラスコに移し、元の懸濁培養と同様に
して生育させるが、培地に２０μ？／ｌｄのハイグロマ
イシンＢｔ加える。
新たな懸濁液を４　ｔ／ｌカセイン加水分解物と２０μ
ｆ／ｄハイグロマイシンＢ’ｔ−含む５Ｈ−４５培地を
使って１乃至５週間毎に移植培養する。
これら懸濁液からの細胞も２０μＷ／ｄ・・イグロマイ
シ７Ｂｔ−含む固体５Ｈ−３ｏ培地上にブレーティング
して約２５℃、暗黒下に置く、ブレーティングした細胞
から生育したカルスを新鮮培地に２４間毎に移植培養す
る。／・イグロマイシンＢ存在下に生育する細胞は形質
転換体と推定される。
Ｂ、前述のようにして選択を行うが、ハイグロマイシン
Ｂ含有培地で生育するプロトプラスト誘導ｍ胞コロニー
を２０μｆ／ｍｌ八イグロマイシンＢを含む５Ｈ−３０
培地の寒天グレート上に置き、暗黒下、約２５℃に置く
。
植物の再生 Ａ、　プロトプラストから誘導された（上記のようにし
て得られた）ダクチリス　グロメラタリンネ（Ｄａｃｔ
ｙｌｉａ　ｇｌｏｍｅｒａｔａ　Ｌ、）カルスを固体５
Ｈ−３０培地で生育地、２週間毎に移植培養する。形成
したいかなる胚も取り出して発芽培地（Ｓ）Ｉ−０）に
ブレーティングし、明るい所に置く（３８００乃至４６
００ルクス）。これらの胚の発芽が１乃至４週間で起り
、得られた小植物を明るい所で５Ｈ−０培地上に置き、
根！？形成させる、６乃至１２−Ｊｌステージで温室に
移し、しだいに硬化させる。
８、　プロトプラストから誘導された（上のようにして
得られた）カルス’ｊｉ（１２４％ゲルライト（Ｇｅｌ
ｒｉｔｅ’）で固化した５Ｈ−０培地上で露光下に（３
８００乃至４６００ルクス）生育させ、２週間毎に移植
培養する。得られた小植物’１ｎ１２％ゲルライ）　（
Ｑｅｌｒｉｔｅ■）とα４％寒天の組合せで固化した５
Ｈ−０とＤＭＳ培地の１：１混合物上に置き、明るい所
で根系を形成させる。６乃至１２葉ステージでｍ室に移
し、しだいに硬化させる。
Ｃ９実施例４４Ａと４４］３に記載したようにして小さ
な小植物を得て、０．８％寒天で固めた０ＭＳ培地上に
置き、明るい所で根系を形成させる。６乃至１２葉ステ
ージで温室に移し、しだいに硬化させる。
Ｄ、上記の実施例４４Ａに記載したようにして小さな小
植物を得て、（１１２％ゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ■
）と（１４％寒天の組合せで固めた５Ｒ−０と０ＭＳ培
地の１：１混合物上に置き、明るい所で根系を形成させ
る。６乃至１２葉のステージで温室に移し、しだいに硬
化させる。
Ａ、ニコチアナ　タバクム（Ｎ、　ｔａｂａｃｕｍ）の
プロドブ２ストｖＩ４ａｔ、バスツコウスキー等、１９
８４（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ　ａｔ　１）（ａ）、、　
１９８４　）　；トイ７％許第２１５９１７５号明細書
（Ｑ１３２１５９１７３）　；ヨーロッパ特許第０１２
９６６８号明細書（ＥＰＯ１２９６６８）：シルト　ア
ンド　ボトリクス、１９８７年（Ｓｈｉｌｌｉｔ。
ａｎｄ　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、　１９８７　）にし７？７
）Ｅうか、または本技術分野で公知の他の方法によって
行ってよい。
Ｂ、　　ＤＮＡのプロトプラストへの導入をネグルチュ
ー等、１９８７年（Ｎｅｇｒｕｔｉｎ　ｅｔ　ａｔ、、
　　１９８７　）の方法の変法で行う、上記のようにし
てｖｊ４表したプロトプラストを最後の洗浄の後にα４
Ｍマンニド−ル、１５乃至５０　ｍＭｃａｃ＆　、　Ｃ
Ｌ　Ｉ　ＭＥ　Ｓからなる溶液に１．６乃至２×１０９
欝の濃度で再懸濁する。プロトプラストＷＡ濁液を１０
ｍプラスチック遠心チューブに（Ｌ５ｄづつ分注する。
ＤＮＡ’ｔ１０μｔの殺菌蒸溜水に加え、パスツコウス
キー等、１９８４年（ｐａｓｇｋｏｗｅｋｉ　ｅｔ　１
）（ａ）、、　１９８４）に記載されたようにして殺菌
し、０．５ｓｕのＰＥＧ溶液（０，４Ｍマｙ二）−ル、
Ｑ、　Ｉ　Ｍ　Ｃａ（ＮＯｘ）ｚに４０９６　ＰＥＧ　
ＭＷ８０ｏＯ，ｐＨ７，０）ｋ加ｔル。溶液をおだやか
に混合し、室温で（約２４℃）時々攪拌しながら３０分
間、置く１次いで１　ｍｌの洗浄溶液を加え、チューブ
の内容物を釦だやかに混合する。洗浄溶液は１５４ｍＭ
ＮａＣ４１２５ｒｎＭ　Ｃａ　Ｃｔｔｅ　５ｍＭ　ＫＣ
ｔ、　５　ｍＭグルコース、ＫＯＨでｐ）（＆Ｏからな
る。洗浄溶液金更に２ｘｌ、５ｍｇ、’によび４ｘ１１
連続的に５分間隔で加え、その添加の度に混合する。次
いでチューブを約１０乃至１００Ｘ？で約１０分間遠心
分離し、上澄を捨てる。ベレットにしたプロトプラスト
Ｔｈ、浸透圧調整剤としてのα５Ｍグルコースを加え、
蔗糖を加えない十分量のに３培地に取り、１０Ｓ／ｄの
終濃度として１０５１ベトリ皿で培養する。
Ｃ１下記の変法の一つ以上を用いて上記を繰返す： （１１洗浄溶液のｐ　、）ｌ　ｆ　５Ｌ、　６乃至７．
０に調整する。
（２）　使用するＰＥＧをＭＷ４０００のＰＥＧとする
。
（３）　　洗浄培地がａ　２　ＭＣａＣｔｚ　、　（Ｌ
１％ＭＥＳ、　ＫＯＨでｐ　Ｈ６，０からなるか、ｔａ
Ｕ、０．２　Ｍ　ＣＪＬＣ４＊７ｍＭトリス／　ＨＣ４
ＫＯＨでｐ　ｌ（９，０からなる。
（４）　２５μを殺菌水に入れた５０μ？のせん断コウ
シ胸腺ＤＮＡ　？プラスミドＤＮＡと共に加える。
（５）　プラスミドＤＮＡを適当な制限酵素（例えは１
３ｄｍ　Ｈｌ）の処理で使用前に直線状にする。
Ａ、　　ニコチアナ　タパクム（Ｎ、　ｔ１）（ａ）ａ
ｃｕｍ）プロトプラストへのＤＮＡの導入を、クロム等
、１９８７年（Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１
９８７　）　：　ｊ？よびシリト　アンド　ボトリクス
、１９８７年（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ　ａｎｄＰｏｔｒｙｋ
ｕｓ、　１９８７　）の方法の変法で、適当なりＮＡの
存在下に電気パルスでプロトプラストｒ処理して行う。
グロトプラス）１−上記のようにして分離する。
プロトプラスト１ｋｓ後の洗浄後に下記の溶液に１．６
乃至２Ｘ１０’／ａｆｆの濃度で再懸濁する：（Ｌ　２
　Ｍ　−ｒ　ｙ　二）　ル、江１％ＭＥＳ、７３ｍＭＮ
ａＣｔ。
７０ｍＭＣ５Ｃｔ２．Ｌ５ｍＭＫＣ１，２，，５ｍＭグ
ルコース、ＫＯＨでｐＨ會５．８．プロトプラス懸濁液
金プラスチックディスポーザブル　キュペクトに１ｄ分
注し、上記のようにＤＮＡ　１０μｔを加える。下記の
エレクトロボレイション装置の４７１を極セクトの電極
間で測定した時、この時点での溶液の抵抗は６Ωの範囲
である。ＤＮＡ１１０μｔの般菌蒸溜水に加え、パスッ
コウスキー等、１９８４年（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ　ｅ
ｔ　１）（ａ）、、　　１９８４　）に記載されたよう
に殺菌する。この溶液全おだやかに温合し、室温（２４
乃至２８℃）で、ＢＴＸ−トランス７エクター（ＢＴＸ
　−Ｔｒａｎｓｔｅｃｔｏｒ）　３００　ｘ　ｖ　り）
ロボレイシッン装置から４７１電極アセングリ−を使っ
てエクスポネンシャル　デイケイコンスタント１０ｍ５
で４００　Ｖｚ　　のパルスを与える。
プロトプラストを５分間、イｃｉｌもしないで置き、ペ
トリ皿に入れて上記のに３培地を加えて１０’／ｍのグ
ロトプラスト濃度にする。
Ｂ、下記の変法の一つ以上を用いて上記を繰返す： （１）　　使用する電圧ｆ　２００　Ｖｃｍ−１ｍまた
ｆ　１００　Ｖｔｙｎ−’と８００　Ｖａｎ　　の間に
する。
（２；　　エクスポネンシャル　デイケイ　コンスタン
ト１に５ｍｓ、　１５ｍ５または２０ｍ８とする。
（３）　２５μｔの殺菌水に入れた５０μ？のせん断コ
ウシ胸腺ＤＮＡ　ｔプラスミドＤＮＡと共に加える。
（４）　　適当な制限酵素（例えば３ｄｍＨＩ）の処理
によりプラスミドＤＮＡ　？使用前に直線状にする。
ノイズ同系交配系フンク（Ｆｕｎｋ２７１７）のプロト
プラストを本質的にゼアメイズ（ｚｅａ　ｒｎａｙｓ）
のために上に記したように１Ｊｌｌ製し、ニコチアナタ
バクＡ　（Ｎ、　ｔａｂａｃｕｍ）プロトプラストの再
懸濁のために上に記した溶液中に１０’／ａｔの濃度で
再懸濁する。形質転換を行う。形質転換後、プロトプラ
スト’を固化剤を加えていないＫＭ−８ｐ培地に２　Ｘ
　１０’／ｄの濃度で培養する。
ニコチアナ　グルバギニフォリア（Ｎ、　ｐｌｕｂａ−
ｇｉｎｉｆｏｌ　ｉａ）、ペチュニア　ヒブリダ（Ｐ、
ｈｙｂｒｉｄａ）筐たはロリウム　マルチフロルム（Ｌ
、　ｍｕ　ｌ　ｔ　ｉ　ｆ　１　ｏ　−ｒｕｍ　）のプ
ロトプラストをシリト　アンド　ボトリクス、１９８７
年（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ　ａｎｄ　Ｐｏｔｒｙｋｕ４１９
８７）に記載されたようにして調製し、上記のように処
理する。シリト　アンド　ボトリクス、１９８７年（Ｓ
ｈｉｌｌｉｔｏ　ａｎｄ　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　、　１９
８７　）に記載された培地にアガロースまたは他のゲル
化剤を入れないで培養する。
グリシネ　マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｒｎａｘ）のプロ
トプラストをトリコリ等、１９８６年（Ｔｒｉｃｏｌｉ
　ｅｔ１）（ａ）、、１９８６）ｔたはコハリー　アン
ド　ウィドネルＡ１９８５年（Ｃｈｏｗｂｕｒｙ　ａｎ
ｄ　Ｗｉｄｈｏｌｍ、　１９８５　）マタはクラ’（７
等、１９８１４Ｆ、　（Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　１）（ａ）
、。
１９８１）に記載された方法で調製する。Ｌ）ＮＡをこ
のプロトプラストに不質的に上記のようにして導入する
。プロドグラストをり２イン等、１９８１年（Ｋｌｅｉ
ｎ　ｅｔ　１）（ａ）、、　１９８１　）、コハリーア
、ド　ウィドホルム、１９８６年（Ｃｈｏｗｈｕｒｙａ
ｎｄ　Ｗｉｄｈｏｌｍ　、　　１９８６　）またはトリ
コリ等、１９８６年（Ｔｒｉｃｏｌｉ　ｅｔ　１）（ａ
）、、　１９８６　）に記載されているようにして培養
するが、培地を固化するだめのアルギネ）ｔ−加えない
。
セクンヨン８　トランスジェニック植物の分析前のセク
ションで、キメラ耐病性遺伝子を発現するトランスジェ
ニック植物の創造を記載した。本セクシ冒ンにおいては
、トランスジェニック檀子系の開発とキメラ遺伝子発現
に関するこれらの性質解析を説明する。本質的には、こ
の性質解析プロセスにキメラ遺伝子発現のためのトラン
スジェニック植物の一次スクリーニング、キメラ遺伝子
の安定なホモ型系への分離と更に遺伝子発現の性質解析
が台筐れる。
実施例８７　トランスジェニ７りＴ３種子系の開発 トランスジェニック植物のための遺伝子型命名を以下の
取決に従って本明細書で使用する：形質転換から得られ
た最初の植物で組織培養から生育したものをＴ１植物と
呼ぶ。ＴＩＭ物の自然の花の自家授粉から得られる植物
’ｔＴ２と呼び、これは自然の減数分裂プロススで新し
い遺伝子型た獲得している。同様にＴ２植物の天然の花
の自家授粉から生じた種子（すなわち７２種子から生育
しｆｃ）ｋＴ５と呼ぶ。
トランスジェニック植物（Ｔ１）を成熟させる。
花を自家授粉させ、正常に枯れ賂せて橿のさやを集める
。七ｒＬぞれの植物からの８１ヲ集めて、分けて貯蔵す
る。各種子のロフトを遺伝子分離分析金してカナマイシ
ン耐性のｗｍｌ：を持りメ／デル座の数を決定する。７
２種子を（１０２％（Ｖ／￥）ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）
−２０を含む２φ次亜塩Ｒ酸で数回洗浄して表面殺菌し
、殺菌水ですすぐ。約１５０の種子ｔ’、１５０μｆ　
／ｐｔｌカナマイシンを含む（１２ＸＭＳ塩（ムラシゲ
　アンド　スクーグ、１９６２年、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ
　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　、　１９６２　）　Ｔ飽和させ
たＦ紙上に置く。発芽して子葉が約５園に広がった後、
漂白された子葉（ｋａｎ−ｓ）対正常な緑色子葉（ｋａ
ｎ−ｒ）の比を決定する。約３：１（ｋａｎ−ｒ　：　
ｋａｎ−ｓＪ比を示す７２種子のロフトのみを次の分析
のために保存する：この分離比はカナマイシンマーカー
遺伝子を持つ単一のメンデル座を示している。
各Ｔ２橿子ロットから４乃至１０の植物を生育成熟させ
（上記と同じ条件を使って）、自家授粉させる。Ｔ３種
子採集、種子消毒をよび種子発芽ｔＴ２種子のために記
載したようにして行う。試験した種子（ｎ＝＝１５０）
の１００％がｋａｎ−ｒ表現型を示すＴ５種子ロットヲ
その特徴についてホモ型と推定しくすなわち、ホモ型両
親植物から得られた）、 表現型分析のために保存する。
センスまたはアンチ−センス方向いずれかにｋける発現
を、ＰＲ−１蛋白のＥＬＩＳＡ分析または記載されたＰ
Ｒ−１ｍＲＮＡのプライマー伸長分析いずれかを使って
、トランスジェニック植物材料で分析する。
Ａ、　　ＰＲ１蛋白のＥＬ、ＩＳＡ 分析をエタノールですすぎ、風乾したイムノ０７　（Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｎ）　［１？イクロタイター　プレート
（ダイナチク、　Ｄｙｎａｔｅｃｈ）で行う。タバコ集
材料をプラスチック組織ホモジナイザー（コンテス、Ｋ
ｏｎｔｅａ）　’に使い、５０　ｍＭ　）リス−ＨＣｌ
。
ｐ　Ｈａ　５．　２００ｍＭ　２−メルカプトエタノー
ル、２ｍＭＰＭＳＦ　Ｃ’／グマ、Ｓｉｇｍａ）、２ｍ
ＭＢＡＭ（シグマ、３　ｉ　ｇｍａ　）、１０　ｍＭ　
ＡＣＡ　（シグマ、３ａｇｍａ）　Ｊｐよび（ＬＯ４８
％　ｏイペプチン（半値酸塩）（シグマ、Ｓｉｇｉｍａ
）からなる緩衝液中で磨細する；葉組織１２当り５−の
抽出緩衝液を使用する。健康な葉（非処理タバコ）抽出
物の十分な試料をつくり、これの１／１０希釈したもの
を他のすべての試料のための希釈剤として使用する。
抽出物を１．５ｄポリエチレンチユーブで、１２、ｏｏ
ｏｘｒ（最大）、１５分間遠心分離して滓を除く。穴（
ウェル）　’ｔ−ＰＲ１蛋白（タバコ）に特異的なモノ
クローン抗体溶液で被覆する。洗浄後、穴を１％ＢＳＡ
溶液で５０乃至１２０分間、ブロックし、再度洗浄する
。健康な植物抽出液の１／１０溶液で適当な濃度に希釈
した未知試料と標準曲線用試料を穴に入れ、３７℃で１
時間置く、（標準曲線を高度に＃＃Ｉｉ！したｐｌ（−
１ａ蛋白を使ってつくる。）洗浄後、ＰＲｌに特異的な
ウサギポリクローン抗血清１５μｆ／ｄ　）を穴に加え
、更に３７℃で１時間置いた後、穴を再び洗浄する。指
示薬酵素アルカリホスファターゼを結合させたヤギ抗つ
サギＩｇＧ抗体（プロメガ、Ｐｒｏｍｅｇａ）（１５５
ｎｔ／　ＩＬｌ）　ｆ加え、メーカー推奨方法に従って
、指示薬反応全行う、反応を３０分後にＮａＯＨ’に加
えて停止し、４０５　ｎｍが吸収を読む。
Ｂ、　　ＰＲＩのためのプライマー伸長分析タバコ葉組
織からＲＮＡｋ前述の方法で抽出する（エカー　アンド
　デイビス、１９８９年、Ｅｃｋｅｒ　ａｎｄ　Ｉ）ａ
ｖｉｓ　、　１９８７　）。プライマー伸長分析を実施
例６に記載したようにして配列５’ＧＴＡＧＧＴＧＣＡ
ＴＴＧＧＴＴＧＡＣ５’の合成オリゴヌクレオチドを使
って行う。
コ（７）配列Ｏａ補がＰＲ−１ａ＆よびｐＲ−ＩｂｍＲ
ＮＡ両方で起り、分析で両方の型のｍＲＮＡのブライマ
ー伸長となる。キメラ遺伝子生産物のプライマー伸長生
成物ｉ　ＰＡＧＥ　ｋ使りて内在性ＰＲ−１遺伝子生腫
物から区別する。ｐｃＧＮ１５０９誘導体のタバコＲＵ
ＢＩＳＣＯ−小サブユニットプロモーターから生じたキ
メラＰＲ−１ａ転写物は、内在性ｐＲ−１ａ遺伝子のも
のより９０ｂｐ長いプライマー伸長４生：酸物をつくる
。一方、ｐＣＧＮ１５０９誘導体のタバコＲＵＢＩＳＣ
Ｏ小すプユニクトグロモーターから生じたキメラｐＲ−
１ｂ転写物は内在性ＰＲ−１ｂ遺伝子のものより９５　
ｂｐ長いプフィマー伸畏物をつくる。ｐＣＧＮｌ　７６
１誘導体の二重３５ｓプロモーターから生じたキメラＰ
Ｒ−１ａ転写物は内在性ＰＲ−１ａ遺伝子のものよＱ４
ｂｐ長い生成物をつくり、ｐｃＧＮｌ　７６１誘導体の
二重３５Ｓプロモーターから生じたキメラＰＲ−１ｂ転
写物は内在性ＰＲ−１ｂ遺伝子のものより１０ｂｐ長い
生成物をつくる。
ｐＣＧＮ１７５４ま７ｃはｐＣＧＮ　１７６０（空のカ
セット対照として）のいずれかを使って形質転換したＴ
１植物から葉組織試料を取る：　ｐＣＧＮ１７５５バイ
ナリ−ベクター　シリーズ（スべての方向のＳＳＵプロ
モーター／ＰＲ−１ａ　）（７）一つ；　ｐＣＧＮ１７
５６パイナリー　ベクター　シリーズ（ＳＳＵプロモー
ター／ＰＲ−１ｂ）の一つ。
この組織に３けるＰＲ−１蛋白の発現’ｔ−ＰＲ−１蛋
白のＥＬＩＳＡで分析するか、または、いくつかの場合
では、　ＲＮＡレベルをプライマー伸長分析で監視する
。
対照プラスミド、ｐＣＧＮ１７５４とｐＣＱＮ１７６０
（空のカセット）で形質転換した組ａは内在性合成によ
るであるうＰＲ−１蛋白の基準レベルとなることが予測
される。プラスミドｐＣＧＮ１７５５Ａ、　ｐＣＧＮ　
１７５５Ｃｅ　ｐＣＧＮ　１７５６Ａ　　またはｐＣＧ
Ｎ１７５６Ｃ（センス方向のＰＲ−１ａまたはＰＲ−１
ｂ）で形質転換された組織は基準レベルエフ有意に高い
レベルでＰＲ−１を発現する植物をつくるはずである。
ｐｃＧＮ１７５５Ｂ、ｐＣＧＮｌ　７５５Ｄ、　ｐＣＧ
Ｎｌ　７５６Ｂ筐たはｐＣＧＮｌ　７５６Ｄ（アンチ−
センス方向のＰＲ−１ａまたＨ　ＰＲ−１６）で形質転
換された組織は対照に対して有意に低いレベルのＰＲ−
を蛋白會つくるはずである。形質転換Ｔ１組織をＥＬＩ
ＳＡでＰＲ−１蛋白をスクリーニングして、現時に合致
する植物會Ｔ２分析に進める。このスクリーニングに釦
ける意図は、抗生物質耐性遺伝子とキメラＰＲ−１遺伝
子を共に形質転換していない形質転換体を除くことであ
る。各形質転換からの多くの植物が現時通りであり、セ
ンス植物での高レベルでの発現がキメラ遺伝子発現によ
ることを確かめるためのＲＮＡのプライマー伸長分析に
より、蛋白の結果も確認される。
Ｔ２世代について分析を繰返し、この時点に訃いていく
つかの系金更に性質解析のために選択する。その系は、 （１１抗生？！ｌ質耐性の３：１分離、これはメンデル
遺伝（単一挿入事項）の特徴を示す；（２）４ンス構築
物で高レベルのＰＲ−１発現、アンセーセンス構築物で
低レベル、対照植物で中間レベルに基いて選択する。以
後の研究のために選択された系によびＰＲ−ｊ発現と分
離のデータ金子に示す。
種子系　　Ｔ２分離　　　Ｔ２ＰＲ−１発現分析（％Ｋ
ａｎ−Ｒ）　　ＥＬ　Ｉ　Ｓ　Ａ　（ｎ　ｇＡｌ　）１
７５４−１２　７７％　　　　　３００１７５５Ａ−４
７５％　　　　　　１７５（平均＝５１へＴ３において
［１７５５Ｂ−２１３５多　　　　≦２ １７５５３３−３　７６％　　　　≦２１７６０−１　
　９５Ｔｏ　　　　　２４σ種子系の命名は形質転換プ
ラスミドを最初に命名し、個々の形質転換体を次に命名
する。９′ｌＩえば、１７５５Ａ−４はプラスミドＩ）
ＣＧＮｆ７５５Ａによる形質転換から得られたトランス
ジエニッ゛り植物５ｒ表わし、これが選択され７ｔ４＃
ｒ目の形質転換体である。これらの実験の多くで、ＰＲ
−１発現の対照レベルが人為的に高くみえる（すなわち
、上記１７５４−１２の５０　Ｏｎｔ／ｘｌは正常より
約５０倍高い）、このレベルは対照で低下するが、次の
世代を持つ実験区植物では低下しない。
上記のＴ２ｍ子系はキメラＰＲ−１遺伝子に関して混合
遺伝型である６例えは、その特徴について、種子系から
の植物のいくつかはホモ型で１、いくつ力為は−＼テａ
型である。ホモ型種子系金分離するために、各系の４か
ら１０プレートの間で自家授粉させて種子をつくらセる
。この種子を集めて分Ｍを上記のようにして決定する。
これらいくつかの系の分離データを下に示す。
Ｔ５種子系　　　　　　　分離 （％Ｋａｎ−Ｒ） １７５５Ａ−４−２１０ｎ １７５５Ｂ−２−１１００ １７５５Ｂ−３−１１００ １７６０−１検出されず これらのホモ州楯子系金下記のように一般的耐病性會分
析する。このシリーズの植物の分析で得られる一般的結
論は、センス構築物（ＰＲ−１ａとＰＲ−１ｂ共に）は
健康なタバコｌｆ１織のＰＲ−１７の６乃至１５０倍會
生産し、アンチ−センス構築物は通常、健康なタバコよ
りはるかに少いＰＲ−１’ｉ生産するという事である。
ズのベクター（二重ＣｈＭＶｓｓＢプ 析 本実施例に釦ける種子系の開発は、センスジよびアンチ
−センス方向にＰＲ−１ａ　（ｐＣＧＮｌ　７６４　ｈ
よびｐＣＧＮｌ　７７４シリーズ）にリンクする二重Ｃ
ａＭＶ３５Ｓプロモーター　釦よびセンスによびアンチ
−センス方向でｐＢ−１ｂ（ｐＣＧＮｆ７Ｓ５ｊｙ−よ
びρＣＧＮ１７７５シリーズ）にリンクする二重ＣａＭ
Ｖ３５Ｓプローターによるタバコの形質転換を含む。ｐ
ＣＧＮ　１７６４／ｐＣＧＮ　１７６５とｐＣＧＮｌ　
７７４／Ｉ）ＣＧＮｌ　７７５構築物の間の差は／４イ
ナリー　ベクターが異ることである（相当する上記の実
施的参照）＠　ｐＣＧＮ１７６５のための空のカセクト
対照はｐＣＧＮ１７６６とｐＣＧＮ１７６７である。Ｐ
ＣＧＮ　１７７４とｐＣＧＮｌ　７７５のための空のカ
セット対照はｐＣＧＮ　１７８９である。
「センスＪ’ｌ’１植物のＰＲ１蛋白発現（すべての場
合）は検出できないレベルから約１五０００ｎｓＦ／ａ
ｕ抽出物の範囲にある：この最高レベルは多くの病斑を
持つ高度に感染された一次の葉でみられるレベルの２倍
以内である。二次の組織でみられるレベルは、最適条件
下でもこれより数倍低い。すべての「センスＪ’ｌ’１
植物の平均発現レベルは約４，２００　ｎｆ／ｘｔｌで
、これは小サブユニットＰＲ−１トランスジェニック植
物の平均より２０倍以上高い。
ｐＣＧＮ７８５バイナリ−ベクター（ρＣＧＮ１７６４
ｐよびｐｃＧＮｌ　７６５　シリーズ）間のキメラ遺伝
子の発現レベルに有意な差がみられない。両セットの植
物は広い範囲の発現レベル金持ち、この型のトランスジ
ェニック実験に共通したものである。両型の最高発現は
似ていて、低レベルで発現する植物の数はほぼ同じであ
る。ｐＣＧＮ７８５バイナリ−植物の平均は小サブユニ
ット−ＰＲ−１）う／スジェニツク植物の平均より高い
。
ｐＣＧＮ　７８３バイナリ−ベクター（ρＣＧＮ１７６
４によびρＣＧＮ１７６５シリーズ）とρＣＱＮｆ５４
Ｑバイナリーベクター（ρ（：ＱＮ１７７４ｊ？よびｐ
ＣＧＮ１７７５シリーズ）の間にキメ２遺伝子の発現レ
ベルで有意な差はみられない。
ＰＣＧＮ７８３バイナリ−植物の平均は！１．ｑｓｓｎ
ｆ／ｍｌで、ｐｃＧＮ１ｓａａバイナリ−植物の平均Ｆ
１４，４１５ｎｆ／ｄであるが、変動を考えると差は有
意ではない。
同様にバイナリ−にｐける遺伝子の方向は発現に主たる
効果を持たない。「Ｃ」方向（・＼ラドからテイル）は
４つの最高の発現植物の内の５つであるが、より低い発
現植物もつくる。「Ａ」（ヘッドからヘッド）方向の植
物はより中等度の発現範囲の群の傾向を持つが、変動と
試料サイズが小さいことから、この差に統計学的意味を
与えることはできない。限られた試料のプライマー伸長
分析から、キメラ遺伝子ｍＲＮＡは優性またはＰＲｌｍ
ＲＮＡのみが存在していることがわかる。
Ｔ１データからの結論は、二重ＣａＭＶ５５Ｓブロモ　
ｆｉ　　／ＰＲ−１ａｄたはＰＲ−１ｂセンス構築物で
形質転換された植物に９けるＰＲ−１蛋白のレベルは対
照植物のレベルより数百倍高いことである。アンチ−セ
ンス構築物で形質転換された植物に訃けるＰＲＩの発現
レベルは非常に低い。形質転換に使用したバイナリ−ベ
クター（ｐｃＧＮ７８５１＊ｆｌｐＣＧＮ１５４０　）
ｕ　トラｙｘジェニック植物にシけるＰＲ−１発現のレ
ベルに有意に影響しない。同様に、ベクター内の発現力
セクトの方向もＰＲ−１発現レベルに有意な影響を与え
ない。したがって、センス発現に上るＰＲ−１ａの高い
レベルを示す一つの系と、アンチ−センス発現により低
いレベルのＰＲ−１ａ１！ｒつくる一つの系を以後の開
発のために選択する。
空のカセットヲ持つ対照系も含む。選択した系のＰＲ−
１発現と抗生物質分離の結果を下に示す。
Ｔ２種子系　　　分離　　　　　　　　Ｔ２ＰＲ−１発
現分析Ｃ’１６Ｋａｎ−Ｒ）　　　ＥＬＩＳＡ（ｎル鯉
）１７７４Ａ−ｔｏ　　４０９１５５３　　　　９００
０１７７４Ｂ−３１０９７１４２≦２ １７８９〜ｊ０　　３７１／４５９　　　　５．．６ホ
モ型７３　ａ子系金前の実施例に記載したようにして選
択した系のそれぞれからつくる。分離分析の結果を下に
示す。
Ｔ３種子系　　　　　　分Ｒ（％ｆ（ａｎ　−Ｒ）１７
７４Ａ−１０−１１００ １７７４Ｂ−５−２１００ ホモｍ橿子系についてＰＲ−１発現と耐病性を下記のよ
うに評価する。
葉組織試料を、バイナリ−ベクターｐＣＧＮ１７７９Ｃ
’！たはｐＣＧ１７７９ｆ：）のいずれかで形質転換し
たＴ１植物から取る。キュウリキチナーゼ／リゾチーム
蛋白含ｆｔ、本質的には上記のようにしてＥＬＩＳＡ分
析で定量するが、モノクローナル抗体とポリクローナル
抗体はキュウリキチナーゼ／リゾチーム蛋白に対するも
のである。
１３のＴ１ｒセンス」植物の内の８が非常に大量のキュ
ウリキチナーゼ外来遺伝子生産物をつくる（　）１１１
，０００ｎｆ　／　ｉｄ抽出物）。これも検出できない
量から３１，５００ｎｒ／１）（ａ）抽出物の広い範囲
がみられ、平均は１ｚｓｏｏｎｆ／ｄ抽出物である。
Ｔ１のデータからの結論は、形質転換されたＴ１Ｍ物は
トランスジェニック蛋白を対照植物に存在するエリ数千
倍多くつくることである。
Ｔ３棟子糸は実ｍ例８７に記載したようにして高発現性
Ｔ１植物から誘導され、これらのＴ３種子系は高レベル
のキチナーゼ／リゾチーム発現を保持する。
葉組織試料をバイナリ−ベクター！１）ＣＧＮ１７８２
Ｃ筐たはρＣＧＮ１７８２Ｄのいずれかで形質転換した
Ｔ１植物から取る。タバコ塩基性キチナーゼ蛋白含量を
ジョンソン等、１９８４年（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ１）
（ａ）、、１９８４）により修飾されたイムノプロット
法（トウビン等、１９７９年、Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　１
）（ａ）、。
１９７９）で測定し、次いで５Ｌ）Ｓ−ＰＡＧＥ（レム
リ、１９７０年、Ｒａｅｍｍｌ　ｉ、　１９７　Ｇ　）
　１に行う、使用した抗体はタバコ塩基性キチナーゼ蛋
白に対して標準法でつくり、タバコ塩基性キチナーゼ蛋
白に特異的である。対照ｐよびアンチ−センス植物に比
較して高いレベルの発現４示すρＣＧＮ１７８２Ｃプラ
スミド（センス発現カセットを含む）を持つＴ１植物を
実施例８７に記載したようにＴ３攬子系に進める。この
Ｔ３橿子系をつくるホモ型Ｔ２植物は高いレベルで蛋白
発現を継続する。低レベルの発現を行う１）ＣＧＮ１７
８２Ｄプラスミド（アンチ−センス発現カセットを含む
）によりて形質転換されたＴ１植物も実施例８７に記載
したように１５棟子に進む。
ター／タバコ塩基性グルカナ− 葉組織試料を、バイナリ−ベクターｐＣＧＮ１７８ｉＣ
またはＰＣＧＮ１７８１１）のいずれかで形質転換した
Ｔ１植物から取る。タバコ塩基性グルカナーゼ蛋白含量
を実施例９１Ｂに記載したようにイムノプロット法で測
定する。使用する抗体を標準法でタバコ塩基性グルカナ
ーゼ蛋白に対してりくジ、これはタバコ塩基性グルカナ
ーゼ蛋白に特異的である。対照ｐよびアンチ−センス植
物に比較して高レベルの発現を示すｐＣＧＮ１７８１Ｃ
プラスミド（センス発現カセットを含む）會持つＴ１植
物を実施例８７に記載したようにＴ３種子系に進める。
このＴ’３ｎ子系をつくるホモ型Ｔ２植物は高レベルで
蛋白を発現しつづける。低レベルの発現を行うｐｃＧＮ
１７８１］）プラスミド（アンチ−センス発現カセット
を含む）によりて形質転換されたＴ１植物も実施例８７
に記載したようにＴ’４Ｍ子へ進める。
セクション９　表現型の評価 センストよびアンチ−センス方向でキメラＰＲＰ遺伝子
を発現するタバコの安定でトランスジェニック種子系の
開発をセクション９から８で説明している。−但、種子
系が開発されたら、種々の病気への耐性を定量的に評価
する。
ｔ１子系１７７５Ａ−４−２と１７７５３３−２−１を
ＴＭＶへの耐性について分析する。その実験の結果は、
ＰＲ−１蛋白の高められたレベルまたは低められたレベ
ル、いずれによっても病変サイズまたは病変数に有意な
差はないということである。
α子糸１７５５Ａ−４−２と１７７５Ｂ−２−１を、胞
子ａｍ液を植物の葉に散布し、標準条件下に７日間置く
ことにより、病原菌ベロノスボラ　ニコチアナ（Ｐｅｒ
ｏｎｏｓｐｏｒａ　ｎ１ｃｏｔｉａｎａ）　（青かびべ
と病）への耐性を調べる。植物について、病原菌で感染
した葉表面積のパーセントに基き、青かびへの耐性を計
測する。平均ｊ　４５４　ｎ１７ｍのＰＲ−１蛋白を発
現する１７５５Ａ−４−２系の６植物は９８±５％感染
表面積を示す。平均５７０　ｎｔ／ｌ＃ＰＲ−１蛋白を
発現する１７５５Ｂ−２−１の６植物は４５僑±２６優
の感染表面積を示す、５５９０便／ｄＰＲ−１蛋白をつ
くる非形質転換キサンチ。
エヌシ（Ｘａｎｔｈｉ、　ｎｃ）タバコからの６４１Ｉ
物ハ９９嘩±１俤の感染表面積を示す。
この結果ＨｌＰＲ−ｌａのアンチ−センス発現によりト
ランスジェニック植物とべと病Ｖこ対する有意で有用な
耐性が得られることを示す。
参考文献 アデルマン等、ＤＮＡ　２巻、１８３−１９３頁（１９
８３年）（Ａｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　１）（ａ）．，ＤＮ
Ａ２：１８３−１９３（１９８３））アレン、ジー、「
シーケンシング　オブ　プロティン　アンド　ペプチド
」、ラボラトリー　テクニクス　イン　バイオケミスト
リー　アンh　モレキュラー　バイオロジー　９巻、テ
ィー、エス．ワーク　アンド　アール．エイチ．ボード
ン編、エルゼビア　ノースホラン■h　バャIケミカル　
プレス、アムステルダム（１９８１年）（Ａｌｌｅｎ，
Ｇ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
　ａｎｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｉｎ：Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　Ｔｅｃ■獅奄曹浮■刀@ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｖｏｌ．９，ｅｄ．Ｔ．Ｓ．Ｗ■盾窒求ａｎｄ　Ｒ
．Ｈ．Ｂｏｒｄｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｏｒｔｈ−
Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃ１）（ａ）　Ｐｒｅ
ｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａ香i１９８１）） アレグザンダー、メソーヅ　イン　エンザイモロジー　
１５４巻、４１−６４頁（１９８７年）（Ａｌｅｘａｎ
ｄｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
　１５４：４１−６４（１９８７））バーカー等、プラ
ント　モレキュラー　バイオロジー２巻、３３５−３５
０頁（１９８３年）（Ｂａｒｋｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）
．，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２：３３５−３５
０（１９８３））ベバン、エム．ダブリュー．アンド　
チルトン、エム．ディー，アニュアル　レビュ　オブ　
ゼネティックス１６巻、３５７頁（１９８２年j （Ｂｅｖａｎ，Ｍ．Ｗ．　ａｎｄ　Ｃｈｉｌｔｏｎ，Ｍ
．−Ｄ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１６，３５７
（１９８２））ボリバー等、ジーン２巻、９５−１１３
（１９７７年）（Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　１）（ａ）．
，Ｇｅｎｅ２：９５−１１３（１９７７））ボリバー等
、ジーン４巻、１２１−１３６頁（１９７８年）（Ｂｏ
ｌｉｖａｒ，Ｇｅｎｅ４：１２１−１３６（１９７８）
）バカリー、学位論文、ユニバーシティー　オブ　カリ
フォルニア　サン　シェゴ　１９８５年（Ｂｕｃｋｌｅ
ｙ，ＰＨ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，ＵＣ　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇ
ｏ　１９８５）チヤン　アンド　コーテン、ジャーナル
　オブ　バクテリオロジー１３４巻、１１４１−１１５
６頁（１９７８年）（Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ
，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１−１１５
６（１９７８））コウフリー、ブイ．ケイ．ａンド　ウ
ィドホルム、ジェイ．エム．，プラント　セル　レポー
ト　４巻、２８９−２９２頁（１９８５年）（Ｃｈｏｗ
ｈｕｒｙ，Ｖ．Ｋ．　ａｎｄ　Ｗｉｄｈｏｌｍ，Ｊ．Ｍ
．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　４，２８
９−２９２（１９W５）） チュウ等、シエンティカ　シニカ　１８巻、６５９頁（
１９７５年）（Ｃｈｕ　ｅｔ　１）（ａ）．，Ｓｃｉｅ
ｎｔｉａ　Ｓｉｎｉｃａ　１８，６５９（１９７５））
コーネリセン、ビー．ジェイ．シー．等、イーエムビー
オー　ジャーナル　５巻（１号）、３７頁（１９８６年
）（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ，Ｂ．Ｊ．Ｃ．ｅｔ　１）
（ａ）．，ＥＭＢＯ　Ｊ．，Ｖｏｌ．５（１），３７（
１９８６））クリエ　アンド　ネスター、ジャーナル　
オブ　バクテリオロジー　１２６巻　１５７−１６５頁
（１９７６年）（Ｃｕｒｒｉｅｒ　ａｎｄ　Ｎｅｓｔｅ
ｒ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１２６：１５７−１６５（１９７６
））ドブロク、エム．等、イーエムビーオー　ジャーナ
ル　６巻、２５１３頁（１９８７巻）（ｄｅ　Ｂｌｏｃ
ｋ，Ｍ．ｅｔ　１）（ａ）．，ＥＭＢＯ　Ｊ６、２５１
３（１９８７））ドグレブ等、ジャーナル　オブ　モレ
キュラー　アンド　アプライド　ジェネティックス　１
巻、４９９−５１２頁（１９８２年）（ｄｅ　Ｇｒｅｖ
ｅ　ｅｔ　１）（ａ）．，　Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇ
ｅｎｅｔ．１：４９９−５１２（１９８２））エカー　
アンド　デイビス、プロシーディングズ　オブ　ナショ
ナル　アカデミー　オブ　サイエンシズ　オブ　ユナイ
テッド　スティッ　Iブ　アメリカ　８４巻、５２０３
−５２０６頁（１９８７年）（Ｅｃｋｅｒ　ａｎｄ　Ｄ
ａｖｉｓ，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
，ＵＳＡ８４：５２０３−５２０６（１９８７））エバ
ンス　ディー．エイ．アンド　ブラボ等、ハンドブック
　オブ　プラント　セル　カルチャー　１巻、マクミラ
ン　パブリッシング　カ塔pニー　１９８３年、１２４
頁（Ｅｖａｎｓ　Ｄ．Ａ．　ａｎｄ　Ｂｒａｖｏ　ｅｔ
　１）（ａ）．，　ｉｎ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐ
ｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　ＣｕｌｔｕｒｅCＶｏｌ．１，Ｍ
ａｃＭｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，　１９８３，ｐ
．１２４）ファシオティ等、バイオ／テクノロジー　３
巻、２４１−２４６（１９８５年）（Ｆａｃｃｉｏｔｔ
ｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　
３：２４１−２４６（１９８５））ファシオティ　アン
ド　ピレ、プラント　サイエンス　レターズ、１５巻、
１−７頁（１９７９年）（Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ　ａｎｄ
　Ｐｉｌｅｔ，Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ，１５：１−７（１９７９））フロム、エム．イ
ー．等、メソーズ　イン　エンジモロジー　ウ、アール
．アンド　グロスマン　エル．アカデミック　プレス、
オルランドAフロリダ、１５３巻、３０７頁（１９８７
年）（Ｆｒｏｍｍ，Ｍ．Ｅ．　ｅｔ　１）（ａ）．，　
Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｅ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，
ｅｄｓ．Ｗｕ，Ｒ．　ａｎｄ　Ｇｒｏｓ唐高≠氏CＬ．
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌ
ｏｒｉｄａ，Ｖｏｌ．１５３，３０７，（１９８７））
ガンボルグ、オー．エル．等、エクスペリメンタル　セ
ル　リサーチ　５０巻、１５１−１５８頁（１９６８年
）（Ｇａｍｂｏｒｇ，Ｏ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５
０，１５１−１５８（１９６８j） ガードナー等、ヌクレイック　アシッズ　リサーチ　９
巻、２８７１−２８８８頁（１９８１年）（Ｇａｒｄｎ
ｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒ
ｅｓ．９：２８７１−２８８８）１９８１））ガーフィ
ンケル　アンド　ネスター、ジャーナル　オブ　バクテ
リオロジー　１４４巻、７３２−７４２頁（１９８０年
）（Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　ａｎｄ　Ｎｅｓｔｅｒ，Ｊ．
Ｂａｃｔ．１４４：７３２−７４３（１９８０））グレ
イ、ディー．ジェイ．アンド　コンガー等、プラント　
ティッシュー　オーガン　カルチャー　４巻、１２３−
１３３頁（１９８５年）（Ｇｒａｙ，Ｄ．Ｊ．　ａｎｄ
　Ｃｏｎｇｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）．，Ｐｌａｎｔ　Ｔ
ｉｓｓｕｅ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕｌｔ．，４，１２３−１
３３i１９８５）） カブラー、ユー、アンド　ホフマン、ビー．ジェイ．，
ジーン　２５巻、２６３頁（１９８３年）（Ｇｕｂｌｅ
ｒ，Ｕ．　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｇｅｎ
ｅ　２５，２６３（１９８３））グロバー、ディー．エ
ム．，ＤＮＡクローニング、アイアールエル　プレス、
オクスフォード（１９８５年）（Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ
．，ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏ
ｘｆｏｒｄ（１９８５））ガイスリー　アンド　レン，
「ジ　アガロース　モノグラフ」，マリン　コロイズ　
ディビジョン　エフエムシー　コーポレーション（１９
V５年） （Ｇｕｉｓｅｌｅｙ　ａｎｄ　Ｒｅｎｎ，”Ｔｈｅ　Ａ
ｇａｒｏｓｅ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ”，Ｍａｒｉｎｅ　
Ｃｏｌｌｏｉｄｓ　Ｄｉｖｉ唐奄盾氏@ＦＭＣ　Ｃｏｒ
ｐ．，（１９７５））ガイレンステン，ユー．アンド　
エーリッヒ，エイチ．プロシーディングズ　オブ　ナシ
ョナル　アカデミー　オブ　サイエンシズ　オブ　■i
ィテッド　スティツ　オブ　アメリカ　８５巻、７６５
２−７６５６頁（１９８８年）（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ
．Ｕ．ａｎｄ　Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５，７６５２
−７U５６（１９８８）） ホール等　プロシーディングズ　オブ　ナショナル　ア
カデミー　オブ　サイエンシズ　オブ　ユナイテッド　
スティツ　オブ　アメリカ　V５巻、３１９６−３２０
０（１９７８年）（Ｈａｌｌ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＮＡ
Ｓ　ＵＳＡ　７５：３１９６−３２００（１９７８））
ハナハン，ディー．，ジャーナル　オブ　モレキュラー
　バイオロジー　１６６巻、５５７−５８０頁（１９８
３年）（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．１６６，５５７−５８０（１９８３））ハニング，ジ
ー．イー．アンド　コンガー等、セオリティカル　アン
ド　アプライド　ゼネティックス　６３巻、１５５−１
５９頁（１９８Q年） （Ｈａｎｎｉｎｇ，Ｇ．Ｅ．　ａｎｄ　Ｃｏｎｇｅｒ　
ｅｔ　１）（ａ）．，　Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ
ｅｔ．，６３，１５５−１５９（１X８２）） ハーシュ　アンド　ベーリンガー，プラスミド　１２巻
、１３９−１４１頁（１９８４年）（Ｈｉｒｓｃｈ　ａ
ｎｄ　Ｂｅｒｉｎｇｅｒ，　Ｐｌａｓｍｉｄ　１２：１
３９−１４１（１９８４））ホ．エス．等、ジーン７７
巻、５１−５９頁（１９８９年）（Ｈｏ，Ｓ．ｅｔ　１
）（ａ）．，Ｇｅｎｅ　７７，５１−５９（１９８９）
）ホルスターズ等、モレキュラー　アンド　ジェネラル
　ジェネティックス　１６３巻　１８１−１８７頁（１
９７８年）（Ｈｏｌｓｔｅｒｓ　ｅｔ　１）（ａ）．，
　Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６３：１８１−１８
７（１９７８））ホーン　アンド　コリンズ，ジーン　
１１巻、２９−２９８頁（１９８０年）（Ｈｏｈｎ　ａ
ｎｄ　Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｇｅｎｅ　１１：２９１−２９
８）１９８０））ホーシュ，アール．等、サイエンス　
２２７巻、１Q２９−１２３２頁（１９８５年）（Ｈｏ
ｒｓｃｈ，Ｒ．ｅｔ　１）（ａ）．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ
　２２７，１２２９−１２３２（１９８５））ジョンソ
ン，ディー．等、ジーン　アナリシス　テクニック　１
巻、３−８）１９８４年）（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ
　１）（ａ）．，　Ｇｅｎｅ　Ａｎ１）（ａ）．Ｔｅｃ
ｈｎ．，　Ｖｏｌ．１：３−８）１９８４））ヨルゲン
セン等、モレキュラー　アンド　ゼネラル　ゼネティッ
ク　１７７巻、６５頁（１９７９年）（Ｊｏｒｇｅｎｓ
ｅｎ　ｅｔ　１）（ａ）．，　Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．１７７：６５（１９７９））ジュアニン等、モレ
キュラー　アンド　ゼネラル　ゼネティックス　２０１
巻、３７０−３７４頁（１９８５年）（Ｊｏｕａｎｉｎ
　ｅｔ　１）（ａ）．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．
２０１：３７０−３７４（１９８５））カオ　ケイ．エ
ヌ．アンド　ミハイルク等、プランタ　１２６巻、１０
５−１１０頁（１９７５年）（Ｋａｏ　Ｋ．Ｎ．　ａｎ
ｄ　Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ　ｅｔ　１）（ａ）．，Ｐｌａ
ｎｔａ　１２６，１０５−１１０（１９７５））クライ
ン，ティー．エム．等、ネイチャー３２７巻、７０頁（
１９８７年）（Ｋｌｅｉｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ　１）（ａ）
．，Ｎａｔｕｒｅ　３２７，７０（１９８７））クライ
ン，エイ．エス．等、プランタ　１５２巻、１０５−１
１４頁（１９８１年）（Ｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ　１
）（ａ）．，Ｐｌａｎｔａ　１５２，１０５−１１４（
１９８１））クナウフ　アンド　ネスター　プラスミド
８巻、４５頁（１９８２年）（Ｋｎａｕｆ　ａｎｄ　Ｎ
ｅｓｔｅｒ，Ｐｌａｓｍｉｄ　８：４５（１９８２））
ラグリミニ，エル．エム等、プロシーディングズ　オブ
　ナショナル　アカデミー　オブ　サイエンシズ　オブ
　ユナイテッド　スティツ■@Iブ　アメリカ　８４巻、
７５４２頁（１９８７年）（Ｌａｇｒｉｍｉｎｉ，Ｌ．
Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８４，７５４２（１９８７））ルカス，ジ
ェイ．等、イーエムビーオー　ジャーナル　４巻　２７
４５頁（１９８５年）（Ｌｕｃａｓ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．
，ＥＭＢＯ　Ｊ．４，２７４５（１９８５））レムリ，
イー．，ネイチャー２２７巻、６８０−６８５（１９７
０年）（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｅ．，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ
．２２７：６８０−６８５（１９７０））マニアティス
，ティー．等、モレキュラー　クローニング　コールド
　スプリング　ハーバー　ラボラトリー，ニューヨーク
（１９８２年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．
，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ■ｂ盾窒≠拍ｒｙ，Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）；）マツダイラ，ピー．，
ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー　２
６１巻　１００３５−１００３８）１９８７年）（Ｍａ
ｔｓｕｄａｉｒａ，Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
ｖｏｌ２６１巻、１００３５−１００３８）１９８７）
）メシング等、ヌクレイック　アシズ　リサーチ　９巻
、３０９−３２１頁（１９８１年）（Ｍｅｓｓｉｎｇ　
ｅｔ　１）（ａ）．，Ｎｕｃ■戟@Ａｃ奄р刀@Ｒｅｓ．
９：３０９−３２１（１９８１））メソーズ　イン　エ
ンジモロジー，６８，１００，１０１および１１８巻（
１９７９，１９８３および１９８６年）（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ　６
８，１００，１０１　ａｎｄ　１１８（１９７９，１９
８３　ａｎｄ@１９８６）；）メトロ，ジェイ．ピー．
等、フィジオロジカル　アンド　モレキュラー　プラン
ト　パソロジー　３３巻、１−９頁（１９８８年）（Ｍ
ｅｔｒａｕｘ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ　１）（ａ）．，Ｐｈｙｓ
ｉｏｌｏｇｉｃ１）（ａ）　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｐｌａｎｔ　ＰａｔｈｏｌｏｇｙC３３，１−９（
１９８８））ミラー，ジェイ．エイチ．，エクスペリメ
ンツ　イン　モレキュラー　ゼネティックス，コールド
　スプリング　ハーバー　ラボラトリー，Rールド　ス
プリング　ハーバー（１９７２年）（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ
．Ｈ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂ盾秩@Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ（１９７２））ムラシゲ，ティ
ー．アンド　スクーグ，エフ．，フイジオロギア　プラ
ンタルム　１５巻、４７３頁（１９６２年）（Ｍｕｒａ
ｓｈｉｇｅ　Ｔ．　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ，Ｆ．，Ｐｈｙ
ｓｉｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ　１５，４７３
（１９６２））ネグルチュウ，アイ．等、プラント　モ
レキュラー　バイオロジー　８巻、３６３頁（１９８７
年）（Ｎｅｇｒｕｔｉｕ，Ｉ．ｅｔ　１）（ａ）．，Ｐ
ｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８，３６３（１９８７）
）ノランダー等、ジーン２６巻、１０１−１０６頁（１
９８３年）（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　１）（ａ）．
，Ｇｅｎｅ２６：１０１−１０６（１９８３））オカヤ
マ　アンド　バーグ，モレキュラー　アンド　セル　バ
イオロジー　２巻、１６１−１７０頁（１９８２年）（
Ｏｋａｙａｍａ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．　ａｎｄ
　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２：１６１−１７０（１９８２
））オニール等，ヌクレイック　アシズ　リサーチ，１
５巻、８６６１−８６７７頁（１９８７年）（Ｏ’Ｎｅ
１）（ａ）　ｅｔ　１）（ａ）．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ　Ｒｅｓ．１５：８６６１−８６７７（１９８７））
ペアレント，ジェイ．ジー．アンド　アセリン，カナデ
ィアン　ジャーナル　オブ　ボタニー６２巻、５６４頁
（１９８４年）（Ｐａｒｅｎｔ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄ　Ａｓ
ｓｅｌｉｎ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｏｔ，６２，５６４（１９
８４））パスズコウスキー，ジェイ．等、イーエムビー
オー　ジャーナル　３巻、２７１７頁（１９８４年）（
Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．ｅｔ　１）（ａ）．，ＥＭ
ＢＯ　Ｊ．３、２７１７（１９８４））プフィツナー　
ユー．エム．等、ヌクイック　アシズ　リサーチ　１５
巻（１１号）４４４９頁（１９８７年）（Ｐｆｉｔｚｎ
ｅｒ　Ｕ．Ｍ．　ｅｔ　１）（ａ）．，Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄ．Ｒｅｓ．，１５（１１），４４９９（１９８７）
）ピアポイント，ダブリュー．エス．等、フィジオロジ
カル　プラント　パソロジー　３１巻、２９１頁（１９
８７年）（Ｐｉｅｒｐｏｉｎｔ，Ｗ．Ｓ．ｅｔ　１）（
ａ）．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌ．
３１，２９１（１９８７））ポトリカス，アイ．等、モ
レキュラー　アンド　ゼネラル　ゼネティックスス　１
９９巻、１６９頁（１９８５年）（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，
Ｉ．ｅｔ　１）（ａ）．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ
．１９９，１６９（１９８５））レドルフィ　アンド　
ネス，ジャーナル　オブ　プラント　パソロジー　８９
巻、２４５−２５４頁（１９８３年）（Ｒｅｄｏｌｆｉ
　ａｎｄ　Ｎｅｔｈ，Ｊ　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌ８
９：２４５−２５４，（１９８３））ライヒ，ティー．
ジェイ．等、バイオ／テクノロジー　４巻，１００１頁
（１９８６年）（Ｒｅｉｃｈ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ　１）（ａ
）．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４，１００１（
１９８６））特許文献欧州特許第Ａ１２９６６Ｂ号明細
書 （ＥＰ−Ａ　１２９６６８；　） 欧州特許第Ａ２２５４５２号明細書 （ＥＰ−Ａ　２２５４５２） 欧州特許第Ａ２４０５５２号明細書 （ＨＰ−Ａ　２ｄ０３３２） 欧州特許第Ａ　０２４９４５２号明細書（ＥＰ−Ａ　０
２４９４５２） タブリエー　オー　８７１０７２９９ （ＷＯ８７１０７２９９） アメリカ％許＠　４７９５８５５号明細書（０８Ｐ　　
４，７９５，８５５） ジービー　２１５９１７３ （ＧＢ　　２ｔｓ９１７３）

Claims (58)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）（ａ）植物において第二のＤＮＡ配列の構成的転
    写をプロモートする第一のＤＮＡ配列、 および （ｂ）誘導性植物発病関連蛋白のコード配列、または、
    誘導性植物発病関連蛋白のコード 配列に実質的な配列相同性を持つコード配 列を含む第二のＤＮＡ配列で、その第二の ＤＮＡ配列が上記の第一のＤＮＡ配列に関 してセンスまたはアンチセンス方向のいず れかにあるもの を含むキメラＤＮＡ配列。
  2. （２）第一のＤＮＡ配列が第二のＤＮＡ配列に関して異
    質の起源のものである請求項１記載のキメラＤＮＡ配列
    。
  3. （３）第一のＤＮＡ配列がタバコリブロースビス−ホス
    フェートカルボキシラーゼ （ＲＶＢＩＳＣＯ）の小サブユニットのプロモータであ
    る請求項２記載のキメラＤＮＡ配列。
  4. （４）第一のＤＮＡ配列が二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモー
    ターを含む請求項２記載のキメラＤＮＡ配列。
  5. （５）第二のＤＮＡ配列が、ＰＲ−１Ａ、ＰＲ−１Ｂ、
    ＰＲ−１Ｃ、ＰＲ−Ｒメイジャー、ＰＲ−Ｒマイナー、
    ＰＲ−Ｐ、ＰＲ−Ｑ、ＰＲ−２、ＰＲ−Ｎ、ＰＲ−Ｏ、
    ＰＲ−Ｏ′、ＳＡＲ８．２ａ、ＳＡＲ８．２ｂ、キュウ
    リキチナーゼ／リゾチーム、キュウリ塩基性ペルオキシ
    ダーゼ、タバコ塩基性グルカナーゼおよびタバコ塩基性
    キチナーゼからなる群から選ばれた植物発病関連蛋白を
    コードする請求項１記載のキメラＤＮＡ配列。
  6. （６）第二のＤＮＡ配列が、ＰＲ−１Ａ、ＰＲ−１Ｂ、
    ＰＲ−１Ｃ、ＰＲ−Ｒメイジャー、ＰＲ−Ｒマイナー、
    ＰＲ−Ｐ、ＰＲ−Ｑ、、ＰＲ−Ｏ、ＰＲ−Ｏ′、ＳＡＲ
    ８．２ａ、ＳＡＲ８．２ｂ、キュウリキチナーゼ／リゾ
    チーム、タバコ塩基性グルカナーゼおよびタバコ塩基性
    キチナーゼからなる群から選ばれた植物発病関連蛋白を
    コードする請求項１記載のキメラＤＮＡ配列。
  7. （７）第二のＤＮＡ配列が、ＰＲ−Ｒメイジャー、ＰＲ
    −Ｒマイナー、ＰＲ−Ｐ、ＰＲ−Ｑ、ＰＲ−２、ＰＲ−
    Ｎ、ＰＲ−Ｏ、ＰＲ−Ｏ′、ＳＡＲ８．２ａ、ＳＡＲ８
    ．２ｂ、キェウリキチナーゼ／リゾチーム、キュウリ塩
    基性ペルオキシダーゼ、タバコ塩基性グルカナーゼおよ
    びタバコ塩基キチナーゼからなる群から選ばれた植物発
    病関連蛋白をコードする請求項１記載のキメラＤＮＡ配
    列。
  8. （８）第二のＤＮＡ配列が第一のＤＮＡ配列に関して、
    第一のＤＮＡ配列が第二のＤＮＡ配列のセンスストラン
    ドの転写をプロモートす るような方向にある請求項１記載のキメラＤＮＡ配列。
  9. （９）第二のＤＮＡ配列が第一のＤＮＡ配列に関して、
    第一のＤＮＡ配列が第二のＤＮＡ配列のアンチセンスス
    トランドの転写をプロモートするような方向にある請求
    項１記載のキメラＤＮＡ配列。
  10. （１０）（ａ）植物において第二のＤＮＡ配列の構成的
    転写をプロモートする第一のＤＮＡ配列、 および （ｂ）誘導性の植物発病関連蛋白をコードするか、また
    は誘導性の植物発病関連蛋白のコ ード配列と実質的な配列相同性を持つ配列 をコードする第二のＤＮＡ配列 を含むキメラＤＮＡ配列。
  11. （１１）第一のＤＮＡ配列が第二のＤＮＡ配列に関して
    異質の起源を持つ請求項１０記載のキメラＤＮＡ配列。
  12. （１２）請求項１ないし１１のいずれかのキメラＤＮＡ
    配列を含む組換えＤＮＡ分子。
  13. （１３）ベクター分子である請求項１２記載の組換えＤ
    ＮＡ分子。
  14. （１４）ＰＣＧＮ１７０３を含む請求項１２記載の組換
    えＤＮＡ分子。
  15. （１５）請求項１ないし１１のいずれかに記載のキメラ
    ＤＮＡ配列を含む植物、植物組織、植物零余子または植
    物種子。
  16. （１６）タバコリブロースビスホスフェートカルボキシ
    ラーゼ（ＲＶＢＩＳＣＯ）の小サブユニットのプロモー
    タを含む第一のＤＮＡ配列、およびＰＲ−１Ａ発病関連
    蛋白のコード配列を含む第二のＤＮＡ配列で、第二のＤ
    ＮＡ配列が第一のＤＮＡ配列に関して、第一のＤＮＡ配
    列が第二のＤＮＡ配列のアンチセンスス トランドの転写をプロモートするような方向にあるもの
    を含む植物、植物組織、植物零余子または植物種子。
  17. （１７）植物がタバコである請求項１５記載の植物、植
    物組織、植物零余子または植物種子。
  18. （１８）誘導さたれレベルの植物発病関連蛋白を構成的
    に発現するか、または耐病性の表現型を与えるレベルの
    発病関連蛋白を構成的に発現するトランスジェニック植
    物。
  19. （１９）耐病性表現型を与える植物発病関連蛋白をコー
    ドするＤＮＡ配列のセンスまたはアンチセンスストラン
    ドを構成的に転写するトランスジェニック植物。
  20. （２０）ＳＡＲ８．２ａをコードする実質的に純粋なｃ
    ＤＮＡ配列、またはＳＡＲ８．２ａをコードするｃＤＮ
    Ａと実質的な配列相同性を持つＤＮＡ配列。
  21. （２１）１９８９年３月２２日に寄託されたＡＴＣＣ受
    入番号４０５８４のプラスミドｐＣＩＢ／ＳＡＲ８．２
    ａ。
  22. （２２）ＳＡＲ８．２ｂをコードする実質的に純粋なｃ
    ＤＮＡ配列、またはＳＡＲ８．２ｂをコードするｃＤＮ
    Ａと実質的な配列相同性を持つＤＮＡ配列。
  23. （２３）１９８９年３月２２日に寄託されたＡＴＣＣ受
    入番号４０５８５のプラスミドｐＣＩＢ／ＳＡＲ８．２
    ｂ。
  24. （２４）ＰＲ−Ｐをコードする実質的に純粋なｃＤＮＡ
    配列、またはＰＲ−ＰをコードするｃＤＮＡと実質的な
    配列相同性を持つＤＮＡ配列。
  25. （２５）１９８９年３月２４日に寄託されたＡＴＣＣ受
    入番号４０５８８のプラスミドｐＢＳｃｈｔ２８。
  26. （２６）ＰＲ−２をコードする実質的に純粋なｃＤＮＡ
    配列、またはＰＲ−２をコードするｃＤＮＡと実質的な
    配列相同性を持つＤＮＡ配列。
  27. （２７）１９８９年１０月１９日に寄託されたＡＴＣＣ
    受入番号４０６９１のプラスミドｐＢＳＧＬ１１７。
  28. （２８）ＰＲ−Ｎをコードする実質的に純粋なｃＤＮＡ
    配列、またはＰＲ−ＮをコードするｃＤＮＡと実質的な
    配列相同性を持つＤＮＡ配列。
  29. （２９）１９８９年１０月１９日に寄託されたＡＴＣＣ
    受入番号４０６８９のプラスミドｐＢＳＧＬ１４８。
  30. （３０）ＰＲ−Ｏをコードする実質的に純粋なｃＤＮＡ
    配列、またはＰＲ−ＯをコードするｃＤＮＡと実質的な
    配列相同性を持つＤＮＡ配列。
  31. （３１）１９８９年１０月１９日に寄託されたＡＴＣＣ
    受入番号４０６９０のプラスミドｐＢＳＧＬ１３４。
  32. （３２）ＰＲ−２′をコードする実質的に純粋なｃＤＮ
    Ａ配列、またはＰＲ−２′をコードするｃＤＮＡと実質
    的な配列相同性を持つＤＮＡ配列。
  33. （３３）１９８９年１０月１９日に寄託されたＡＴＣＣ
    受入番号４０６８５のプラスミドｐＢＳＧＬ１３５。
  34. （３４）キェウリのペルオキシダーゼをコードする実質
    的に純粋なｃＤＮＡ配列、またはキュウリペルオキシダ
    ーゼをコードするｃＤＮＡと実質的な配列相同性を持つ
    ＤＮＡ配列。
  35. （３５）１９８９年１０月１９日に寄託されたＡＴＣＣ
    受入番号４０６８６のプラスミドｐＢＰＥＲ１。
  36. （３６）１９８９年１０月１９日寄託されたＡＴＣＣ受
    入番号４０６８７のプラスミドｐＢＰＥＲＢ２４。
  37. （３７）「配列６」の、または「配列６」で示される配
    列と実質的な配列相同性を持つ、実質的に純粋なＤＮＡ
    配列。
  38. （３８）「配列９」の、または「配列９」で示される配
    列と実質的な配列相同性を持つ、実質的に純粋なＤＮＡ
    配列。
  39. （３９）「配列１０」の、または「配列１０」で示され
    る配列と実質的な配列相同性を持つ、実質的に純粋なＤ
    ＮＡ配列。
  40. （４０）（ａ）植物において第二のＤＮＡ配列の構成的
    転写をプロモートする第一のＤＮＡ配列を 好適な起源から調製し； （ｂ）感染した病原体、または感染および非感染の植物
    組織からＤＮＡライブラリーを調 製し、したがって、そのライブラリーは誘 導された、または誘導および非誘導のＤＮ Ａ集団を含み、これから誘導性の植物発病 関連蛋白のコード配列、または誘導性の植 物発病関連蛋白のコード配列と実質的な配 列相同性を持つコード配列、を含む第二の ＤＮＡ配列を分離し； （ｃ）ステップ（ａ）の第一のＤＮＡ配列をステップ（
    ｂ）の第二のＤＮＡ配列と、その第二のＤＮＡ配列がそ
    の第一のＤＮＡ配列に関して センスまたはアンチセンスいずれかの方向 にあるように操作的に連結すること を含む請求項１記載のキメラＤＮＡ配列の製造法。
  41. （４１）第一のＤＮＡ配列が第二のＤＮＡ配列に関して
    異質の起源を持つ請求項４０記載の方法。
  42. （４２）第一のＤＮＡ配列がタバコリブロースビスホス
    フェートカルボキシラーゼの小サ ブユニットをコードする遺伝子から調製される請求項４
    １記載の方法。
  43. （４３）第一のＤＮＡ配列がＣａＭＶゲノムから調製さ
    れ、二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含む請求項４１
    記載の方法。
  44. （４４）植物組織が生物学的誘導体を使って全身耐性ま
    たは限局的獲得耐性を誘導される請求項４０記載の方法
    。
  45. （４５）第二のＤＮＡ配列が、ＰＲ−１Ａ、ＰＲ−１Ｂ
    、ＰＲ−１Ｃ、ＰＲ−Ｒメイジャー、ＰＲ−Ｒマイナー
    、ＰＲ−Ｐ、ＰＲ−Ｑ、ＰＲ−２、ＰＲ−Ｎ、ＰＲ−Ｏ
    、ＰＲ−Ｏ′、ＳＡＲ８．２ａ、ＳＡＲ８．２ｂ、キュ
    ウリキチナーゼ／リゾチーム、キェウリ塩基性ペルオキ
    シダーゼ、タバコ塩基性グルカナーゼおよびタバコ塩基
    性キチナーゼからなる群から選ばれた植物発病関連蛋白
    をコードする請求項４０記載の方法。
  46. （４６）第一と第二のＤＮＡ配列の連結を、第二のＤＮ
    Ａ配列が第一のＤＮＡ配列に関して第一のＤＮＡ配列が
    第二のＤＮＡ配列のセンス ストランドの転写をプロモートするような方向で行う請
    求項４０記載の方法。
  47. （４７）第一と第二のＤＮＡ配列の連結を、第二のＤＮ
    Ａ配列が第一のＤＮＡ配列に関して、第一のＤＮＡ配列
    が第二のＤＮＡ配列のアンチセンスストランドの転写を
    プロモートするような方向で行う請求項４０記載の方法
    。
  48. （４８）（ａ）植物において第二のＤＮＡ配列の構成的
    転写をプロモートする第一のＤＮＡ配列を 好適な起源から調製すること； （ｂ）感染された病原体または感染または非感染植物組
    織からＤＮＡライブラリーを調製 し、したがって、そのライブラリーが誘導 された、または誘導および非誘導ＤＮＡ集 団両方を含み、それから誘導性植物発病関 連蛋白、または誘導性植物発病関連蛋白の コード配列と実質的な配列相同性を持つ配 列をコードするＤＮＡ配列を分離すること および （ｃ）ステップ（ａ）の第一のＤＮＡ配列とステップ（
    ｂ）の第二のＤＮＡ配列を、第一のＤＮＡ配列が第二の
    ＤＮＡ配列の転写をプロモー トするように操作的に連結すること を含む請求項１０記載のキメラＤＮＡ配列の製造方法。
  49. （４９）植物において第二のＤＮＡ配列の構成的転写を
    プロモートする第一のＤＮＡ配列、および、誘導性の植
    物発病関連蛋白のコード配列または誘導性の植物発病一
    連蛋白のコード配列と実質的な配列相同性を持つコード
    配列を含む第二のＤＮＡ配列を含み、第二のＤＮＡ配列
    が第一のＤＮＡ配列に関してセンスまたはアンチセンス
    方向いずれかにあるようなキメラＤＮＡ配列を使って植
    物細胞または組織を形質転換することを含む、耐病性表
    現型を示す植物に再生する能力を持つトランスジェニッ
    ク植物細胞または植物組織の製造方法。
  50. （５０）植物細胞または植物組織が、植物胚または全植
    物の部分である請求項４９記載のトランスジェニック植
    物細胞または植物組織の製造方法。
  51. （５１）請求項４９記載の形質転換植物組織または植物
    細胞から全植物を再生させることを含む耐病性表現型を
    示すトランスジェニック植物の製造方法。
  52. （５２）請求項１ないし１１のいずれかに記載のキメラ
    ＤＮＡ配列を使って形質転換を実施する請求項４９ない
    し５１のいずれかに記載の方法。
  53. （５３）請求項１記載の第一のＤＮＡ配列を含むキメラ
    ＤＮＡ配列を使って植物組織または細胞を形質転換する
    ことを含む耐病性表現型を持つ植物の製造方法。
  54. （５４）植物選択性遺伝子マーカーである第二のＤＮＡ
    キメラＤＮＡ配列が、配列を更に含む請求項５３記載の
    方法。
  55. （５５）請求項５３記載の方法により製造された耐病性
    植物。
  56. （５６）請求項４９ないし５２のいずれかに記載の方法
    により製造された耐病性植物。
  57. （５７）（ａ）誘導の、および非誘導の集団からの一本
    鎖ｃＤＮＡで、その誘導の、および非誘導の集団からの
    一本鎖ｃＤＮＡは相反対のＤＮＡ極性を持ち、非誘導の
    集団からのｃＤＮＡはビオチン親和性タグを持つものを
    提供する こと； （ｂ）ステップ（ａ）の一本鎖ｃＤＮＡ集団をたがいに
    ハイブリダイズすること、および （ｃ）非誘導の集団からのｃＤＮＡとハイブリダイズし
    ない誘導の集団からの一本鎖ｃＤＮＡをエンリッチする
    ためにビオチン−アビジ ンクロマトグラフィーによいステップ（ｂ）のハイブリ
    ダイゼイション混合物を分離す ること を含むｃＤＮＡ集団の分別スクリーニングおよびエンリ
    ッチメント方法。
  58. （５８）（ａ）生物学的誘導体を使って全身獲得耐性ま
    たは限局性獲得耐性を誘導した組織を提供 すること、および （ｂ）耐病性蛋白をコードするｃＤＮＡクローンを分離
    すること を含む耐病性蛋白をコードするｃＤＮＡのクローニング
    方法。
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Families Citing this family (1145)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5521153A (en) * 1987-10-02 1996-05-28 Ciba-Geigy Corporation Synergistic antifungal protein and compositions containing same
US5614395A (en) * 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
US5034323A (en) * 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
EP0418695A1 (de) * 1989-09-13 1991-03-27 Ciba-Geigy Ag Regulatorische DNA-Sequenz
IL97020A (en) * 1990-01-30 2000-12-06 Mogen Int Recombinant polynucleotides comprising a chitinase gene and a glucanase gene
WO1991018984A2 (en) * 1990-06-07 1991-12-12 Mogen International N.V. New antifungal preparations, process for making such preparations, process for obtaining plants with decreased susceptibility to fungi
DE59109267D1 (de) * 1990-06-15 2005-04-07 Syngenta Participations Ag Neue Signalsequenzen
FR2665177B1 (fr) * 1990-07-24 1994-09-02 Sanofi Sa Gene recombinant codant pour une proteine a activite endochitinase et/ou lysozyme.
DE4031758A1 (de) * 1990-10-06 1992-04-09 Bayer Ag Resistenz-gene
US6262338B1 (en) 1990-10-06 2001-07-17 Bayer Aktiengesellschaft Resistance genes
FR2674538B1 (fr) * 1991-03-25 1994-11-18 Sanofi Elf Adn recombinant codant pour une nouvelle proteine a activite beta 1,3-glucanase bacteries contenant cet adn, cellules vegetales et plantes transformees.
DK61691D0 (da) * 1991-04-08 1991-04-08 Danisco Genetiske konstruktioner
GB9110544D0 (en) * 1991-05-15 1991-07-03 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
WO1992020801A1 (en) * 1991-05-24 1992-11-26 Universidad Politecnica De Madrid Novel antipathogenic peptides and compositions containing same
GB9115909D0 (en) * 1991-07-23 1991-09-04 Nickerson Int Seed Recombinant dna
AU5085993A (en) * 1992-09-28 1994-04-26 Monsanto Company Method of controlling plant pathogenic fungi
US6107544A (en) * 1993-01-08 2000-08-22 Novartis Finance Corporation Method for breeding disease resistance into plants
US6232525B1 (en) 1993-01-08 2001-05-15 Novartis Finance Corporation Mutant plants and uses therefor
AU689767B2 (en) * 1993-01-08 1998-04-09 Syngenta Participations Ag Method for breeding disease resistance into plants
DE4442179C2 (de) * 1994-11-26 1996-12-12 Inst Pflanzengenetik & Kultur Pathogenresistente Pflanzen und Verfahren zu ihrer Herstellung
US6100451A (en) * 1995-05-18 2000-08-08 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Pathogen-inducible regulatory element
US5981843A (en) * 1995-05-18 1999-11-09 Board Of Trustee Of The University Of Kentucky Elicitin-mediated plant resistance
US5851766A (en) * 1995-05-31 1998-12-22 Novartis Finance Corporation Process for isolating chemically regulatable DNA sequences
US5773696A (en) 1996-03-29 1998-06-30 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
GB9607517D0 (en) * 1996-04-11 1996-06-12 Gene Shears Pty Ltd The use of DNA Sequences
AUPN953296A0 (en) * 1996-04-29 1996-05-23 Cooperative Research Centre For Tropical Plant Pathology Fungus resistant transgenic plants
DE19621572A1 (de) * 1996-05-29 1997-12-04 Max Planck Gesellschaft Lokalisierter Zelltod in Pflanzen
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
ES2229513T3 (es) * 1997-06-04 2005-04-16 Syngenta Participations Ag Sistema de rastreo de plaguicidas.
US7087420B1 (en) 1997-07-17 2006-08-08 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
FR2767537B1 (fr) * 1997-08-20 2001-07-13 Rhone Poulenc Agrochimie Gene codant pour l'androctonine, vecteur le contenant et plantes transformees obtenues resistantes aux maladies
PL343635A1 (en) * 1998-03-31 2001-08-27 Mogen Internat Nv Salicylic acid pathway genes and their use for the induction of resistance in plants
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
US6677503B1 (en) * 1999-06-23 2004-01-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sunflower anti-pathogene proteins and genes and their uses
AU6795000A (en) * 1999-08-18 2001-03-13 Curagen Corporation Defense-related signaling genes and methods of use
US6667427B1 (en) 1999-10-14 2003-12-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sclerotinia-inducible promoters and their uses
CA2331674A1 (en) 2000-01-28 2001-07-28 Southern Illinois University Isolated polynucleotides and polypeptides relating to loci underlying resistance to soybean cyst nematode and soybean sudden death syndrome and methods employing same
DE60143959D1 (de) 2000-08-25 2011-03-10 Basf Plant Science Gmbh En kodieren
DE10063986A1 (de) * 2000-12-21 2002-06-27 Max Planck Gesellschaft Pflanzen mit verbesserter Widerstandskraft
US20030017566A1 (en) * 2001-01-18 2003-01-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize peroxidase genes and their use for improving plant disease resistance and stalk strength
WO2002096923A1 (en) 2001-05-30 2002-12-05 Chromos Molecular Systems, Inc. Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes
ATE539084T1 (de) 2001-11-07 2012-01-15 Syngenta Participations Ag Promotoren zur regulierung der genexpression in pflanzenwurzeln
KR100436750B1 (ko) * 2002-05-03 2004-06-22 학교법인고려중앙학원 고추 한별 품종 유래의 ｃａｓａｒ 82ａ 단백질을코딩하는 유전자 염기서열 및 마커로의 이용
CA2511824A1 (en) 2002-12-26 2004-07-22 Syngenta Participations Ag Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
PL1633876T3 (pl) 2003-06-17 2009-01-30 Sembiosys Genetics Inc Sposoby wytwarzania insuliny w roślinach
AR048669A1 (es) 2004-03-03 2006-05-17 Syngenta Ltd Derivados biciclicos de bisamida
BRPI0508518A (pt) 2004-03-08 2007-08-14 Syngenta Participations Ag proteìna e promotor de semente de milho rica em glutamina
CN101023175B (zh) 2004-04-20 2012-02-29 辛根塔参与股份公司 用于在植物繁殖组织中表达基因产物的调控序列
GB0418047D0 (en) 2004-08-12 2004-09-15 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
GB0422401D0 (en) 2004-10-08 2004-11-10 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
WO2007009775A2 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions comprising tebuconazole
DK2333086T3 (en) 2005-07-21 2015-04-07 Inst Superior Agronomia Use of a lupinus protein
SI1763998T1 (sl) 2005-09-16 2007-10-31 Syngenta Participations Ag Fungicidni sestavki
US8349345B2 (en) 2005-09-29 2013-01-08 Syngenta Crop Protection Llc Fungicidal compositions
RU2403714C2 (ru) 2005-09-29 2010-11-20 Зингента Партисипейшнс Аг Фунгицидная композиция, содержащая ципродинил
EP1776864A1 (en) 2005-10-20 2007-04-25 Syngenta Participations AG Fungicidal compositions
UY30090A1 (es) 2006-01-16 2007-08-31 Syngenta Participations Ag Insecticidas novedosos
WO2007090623A2 (en) 2006-02-09 2007-08-16 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
AR061603A1 (es) 2006-06-16 2008-09-10 Syngenta Ltd Derivados de etenilcarboxamidas microbicidas
AU2007298999B2 (en) 2006-09-18 2013-11-07 Basf Se Pesticidal mixtures comprising an anthranilamide insecticide and a fungicide
US7825297B2 (en) 2006-12-22 2010-11-02 Donald Danforth Plant Science Center Expression of antifungal plant proteins in transgenic plants
ES2325523B1 (es) 2007-03-22 2010-06-24 Sumitomo Chemical Company, Limited Composicion agricola para controlar o prevenir enfermedades de las plantas provocadas por microbios patogeos de las plantas.
DE102008059357A1 (de) 2007-03-22 2009-04-23 Sumitomo Chemical Co. Ltd. Agrochemische Zusammensetzung zur Bekämpfung oder Prophylaxe von durch pflanzenpathogene Mikroben verursachten Pflanzenkrankheiten
JP5256753B2 (ja) 2007-03-29 2013-08-07 住友化学株式会社 イソオキサゾリン化合物とその有害生物防除用途
CN108402068B (zh) 2007-04-12 2021-12-03 巴斯夫欧洲公司 包含氰基亚磺酰亚胺基化合物的农药混合物
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
RS52042B (sr) 2007-04-25 2012-04-30 Syngenta Participations Ag Fungicidne smeše
JP2008291012A (ja) 2007-04-27 2008-12-04 Sumitomo Chemical Co Ltd アミド化合物ならびにその植物病害防除用途
JP2008291013A (ja) 2007-04-27 2008-12-04 Sumitomo Chemical Co Ltd アミド化合物およびその植物病害防除用途
US7999136B2 (en) 2007-04-27 2011-08-16 Sumitomo Chemical Company, Limited Amide compound and use thereof
BRPI0810498A2 (pt) 2007-04-27 2014-10-14 Sumitomo Chemical Compay Ltd Composto amida e seu uso
BRPI0813957A2 (pt) 2007-06-29 2015-01-06 Sumitomo Chemical Co Agente de controle de doença de planta, e método de controle de doença de planta
WO2009010260A2 (en) 2007-07-16 2009-01-22 Syngenta Participations Ag Condensed anthranilamide insecticides
GB0716414D0 (en) 2007-08-22 2007-10-03 Syngenta Participations Ag Novel insecticides
EA020203B1 (ru) 2007-09-20 2014-09-30 Басф Се Композиции и агенты, содержащие фунгицидный штамм и активное соединение
JP2010540495A (ja) 2007-09-26 2010-12-24 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア ボスカリド及びクロロタロニルを含む三成分殺菌組成物
EP2053046A1 (en) 2007-10-26 2009-04-29 Syngeta Participations AG Novel imidazole derivatives
EP2053044A1 (en) 2007-10-26 2009-04-29 Syngenta Participations AG Novel imidazole derivatives
EP2053045A1 (en) 2007-10-26 2009-04-29 Syngenta Participations AG Novel imidazole derivatives
BRPI0820400A2 (pt) 2007-11-20 2015-05-19 Sumitomo Chemical Co Composto de piridina, composição pesticida e método de controle de pragas.
ES2647767T3 (es) 2007-12-03 2017-12-26 Syngenta Participations Ag Generación por ingeniería genética de proteínas enzimáticamente susceptibles
JP5347463B2 (ja) 2007-12-26 2013-11-20 住友化学株式会社 除草用組成物
GB0800762D0 (en) 2008-01-16 2008-02-27 Syngenta Participations Ag Novel pyridazine derivatives
FR2928070A1 (fr) 2008-02-27 2009-09-04 Sumitomo Chemical Co Composition agricole, utilisation d'un compose pour sa production et procede pour matriser ou prevenir les maladies des plantes.
EP2253206B1 (en) 2008-03-21 2014-01-01 Sumitomo Chemical Company, Limited Plant disease control composition
JP5365041B2 (ja) 2008-03-25 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除組成物および植物病害防除方法
JP5365047B2 (ja) 2008-03-28 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除組成物および植物病害防除方法
JP5369854B2 (ja) 2008-04-21 2013-12-18 住友化学株式会社 有害節足動物防除組成物および縮合複素環化合物
KR20110036633A (ko) 2008-07-29 2011-04-07 바스프 에스이 제초 효과를 갖는 피페라진 화합물
EP2183969A3 (en) 2008-10-29 2011-01-05 Basf Se Method for increasing the number of seedlings per number of sowed grains of seed
TWI526535B (zh) 2008-09-12 2016-03-21 住友化學股份有限公司 噻唑菌胺對於基因轉殖植物在植物病害之防治方法的用途
WO2010032874A1 (ja) 2008-09-19 2010-03-25 住友化学株式会社 農業用組成物
JP5355053B2 (ja) 2008-09-19 2013-11-27 住友化学株式会社 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法
TWI489941B (zh) 2008-09-19 2015-07-01 Sumitomo Chemical Co 種子處理劑及保護植物的方法
JP2010100611A (ja) 2008-09-26 2010-05-06 Sumitomo Chemical Co Ltd ピリジン化合物及びその有害生物の防除用途
BRPI0919576A2 (pt) 2008-10-02 2015-08-18 Basf Se Composto de piperazina, e, método para controlar vegetação indesejada
JP2010090089A (ja) 2008-10-10 2010-04-22 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法
JP2010090090A (ja) 2008-10-10 2010-04-22 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法
WO2010046423A2 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Basf Se Use of sulfonylurea herbicides on cultivated plants
AR075466A1 (es) 2008-10-22 2011-04-06 Basf Se Uso de herbicidas tipo auxina en plantas cultivadas
JP5365161B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5365158B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5417814B2 (ja) 2008-11-25 2014-02-19 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5359223B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-04 住友化学株式会社 植物病害防除用組成物及び植物病害の防除方法
JP5365160B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法
JP5365159B2 (ja) 2008-11-25 2013-12-11 住友化学株式会社 有害生物防除用組成物及び有害生物の防除方法
JP2010168362A (ja) 2008-12-24 2010-08-05 Sumitomo Chemical Co Ltd 含硫黄化合物およびその用途
JP5212350B2 (ja) 2008-12-24 2013-06-19 住友化学株式会社 含ハロゲン有機硫黄化合物およびその用途
AU2010206619A1 (en) 2009-01-22 2011-07-28 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
ES2524819T3 (es) 2009-01-27 2014-12-12 Basf Se Procedimiento de tratamiento de semillas
AU2010209008B2 (en) 2009-01-30 2014-07-17 Sumitomo Chemical Company, Limited Coated seed
WO2010089244A1 (en) 2009-02-03 2010-08-12 Basf Se Method for dressing seeds
US9012719B2 (en) 2009-02-06 2015-04-21 Syngenta Participations Ag Modification of multidomain enzyme for expression in plants
AR075573A1 (es) 2009-02-11 2011-04-20 Basf Se Dimethomorph como protector de plaguicidas con efectos fitotoxicos
WO2010092031A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Basf Se Pesticidal mixtures
US20110319263A1 (en) 2009-02-11 2011-12-29 Basf Se Pesticidal mixtures
BRPI1005355A2 (pt) 2009-02-11 2016-02-10 Basf Se misturas, composição pesticida, método para o controle de pragas e/ou para aprimorar a saúde de plantas, método para a proteção do material de propagação de planta contra pragas e material de propagação de planta
WO2010092014A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Basf Se Pesticidal mixtures
JP2010222343A (ja) 2009-02-26 2010-10-07 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物
JP2010222342A (ja) 2009-02-26 2010-10-07 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物
AR075717A1 (es) 2009-03-04 2011-04-20 Basf Se Compuestos de 3- aril quinazolin -4- ona para combatir plagas de invertebrados
GB0903955D0 (en) 2009-03-06 2009-04-22 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
WO2010103065A1 (en) 2009-03-11 2010-09-16 Basf Se Fungicidal compositions and their use
GB0904315D0 (en) 2009-03-12 2009-04-22 Syngenta Participations Ag Novel imidazole derivatives
JP2010235603A (ja) 2009-03-13 2010-10-21 Sumitomo Chemical Co Ltd ピリダジノン化合物及びその用途
EP2408301B1 (en) 2009-03-16 2013-05-15 Basf Se Fungicidal compositions comprising fluopyram and metrafenone
HUE030498T2 (en) 2009-03-20 2017-05-29 Basf Se A method of treating sowing with an encapsulated pesticide
PE20120536A1 (es) 2009-03-26 2012-05-05 Basf Se Combinacion de un agente fungicida sintetico y bacillus subtilis qst 173 para el control de hongos fitopatogenos
EP2414353A1 (en) 2009-04-01 2012-02-08 Basf Se Isoxazoline compounds for combating invertebrate pests
AU2010233985B2 (en) 2009-04-02 2015-11-19 Basf Se Method for reducing sunburn damage in plants
GB0906515D0 (en) 2009-04-15 2009-05-20 Syngenta Participations Ag Fungical compositions
AU2010256356B2 (en) 2009-06-05 2015-07-16 University Of Florida Research Foundation, Inc. Isolation and targeted suppression of lignin biosynthetic genes from sugarcane
WO2010142779A1 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Basf Se Antifungal 1,2,4-triazolyl derivatives having a 5- sulfur substituent
WO2010146032A2 (de) 2009-06-16 2010-12-23 Basf Se Fungizide mischungen
WO2010146115A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Basf Se Triazole compounds carrying a sulfur substituent
PE20120625A1 (es) 2009-06-18 2012-05-20 Basf Se Mezclas fungicidas
WO2010146116A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Basf Se Triazole compounds carrying a sulfur substituent
US20120108422A1 (en) 2009-06-18 2012-05-03 Basf Se Antifungal 1,2,4-triazolyl Derivatives
US20120088660A1 (en) 2009-06-18 2012-04-12 Basf Se Antifungal 1,2,4-triazolyl Derivatives
WO2010146113A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Basf Se Antifungal 1, 2, 4-triazolyl derivatives having a 5- sulfur substituent
AU2010261822A1 (en) 2009-06-18 2012-01-19 Basf Se Triazole compounds carrying a sulfur substituent
DK2443102T3 (da) 2009-06-19 2013-07-08 Basf Se Herbicidale benzoxazinoner
EP3213635A1 (en) 2009-06-25 2017-09-06 Basf Se Use of agrochemical mixtures for increasing the health of a plant
WO2010149758A1 (en) 2009-06-25 2010-12-29 Basf Se Antifungal 1, 2, 4-triazolyl derivatives
EP2451804B1 (en) 2009-07-06 2014-04-30 Basf Se Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
WO2011003776A2 (de) 2009-07-09 2011-01-13 Basf Se Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung
WO2011003775A2 (de) 2009-07-09 2011-01-13 Basf Se Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung
AU2010326672A1 (en) 2009-07-10 2011-08-04 Syngenta Participations Ag Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
BR112012001001A2 (pt) 2009-07-14 2016-11-16 Basf Se compositos azol das formulas i e ii, compostos das formulas i e i, compostos de formula ix, composição agricola, uso de um composto farmaceutica, metodo para tratar infecções de câncer ou virus para combater fungos zoopatigênicos ou humanopatogenicos
JP2013500246A (ja) 2009-07-24 2013-01-07 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 無脊椎動物系害虫防除用ピリジン誘導体化合物
CA2767283C (en) 2009-07-28 2017-06-20 Basf Se Pesticidal suspo-emulsion compositions
KR20120107068A (ko) 2009-07-28 2012-09-28 바스프 에스이 다년생 식물의 저장 조직에서 유리 아미노산의 수준을 증가시키는 방법
BR112012002164B1 (pt) 2009-07-30 2021-04-20 Merial, Inc compostos inseticidas de 4-amino-tieno[2,3-d]-pirimidina e métodos para seu uso
UA107938C2 (en) 2009-08-12 2015-03-10 Syngenta Participations Ag Heterocycles with microbicidal properties
KR20120089644A (ko) 2009-08-12 2012-08-13 신젠타 파티서페이션즈 아게 살미생물성 헤테로사이클
WO2011018486A2 (en) 2009-08-14 2011-02-17 Basf Se Herbicidally active composition comprising benzoxazinones
ES2464844T3 (es) 2009-08-25 2014-06-04 Syngenta Participations Ag N-alcoxicarboxamidas y su utilización como microbiocidas
WO2011036074A1 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Basf Se Aminoquinazoline compounds for combating invertebrate pests
NZ598965A (en) 2009-09-25 2013-03-28 Basf Se Method for reducing pistillate flower abortion in plants using at least one strobilurin
CN102548416B (zh) 2009-09-29 2013-11-13 巴斯夫欧洲公司 农药混合物
MX2012002637A (es) 2009-09-29 2012-03-14 Basf Se Mezclas de plaguicidas.
MX2012002726A (es) 2009-09-30 2012-04-11 Basf Se Sales de amina poco volatiles de pesticidas anionicos.
WO2011042378A1 (de) 2009-10-09 2011-04-14 Basf Se Substituierte cyanobutyrate mit herbizider wirkung
US8357635B2 (en) 2009-10-16 2013-01-22 Syngenta Crop Protection Llc Microbiocides
WO2011048120A1 (en) 2009-10-22 2011-04-28 Syngenta Participations Ag Synergistic fungicidal composition containing a n-2-(pyrazolyl) ethylphenylcarboxamide
WO2011051212A1 (de) 2009-10-28 2011-05-05 Basf Se Verwendung heteroaromatischer verbindungen als herbizide
DE102010042867A1 (de) 2009-10-28 2011-06-01 Basf Se Verwendung heterozyklischer Verbindungen als Herbizide
DE102010042866A1 (de) 2009-10-30 2011-05-05 Basf Se Substituierte Thioamide mit herbizider Wirkung
CN102686583A (zh) 2009-11-02 2012-09-19 巴斯夫欧洲公司 除草的四氢邻苯二甲酰亚胺类
US8329619B2 (en) 2009-11-03 2012-12-11 Basf Se Substituted quinolinones having herbicidal action
CN102595879B (zh) 2009-11-06 2014-08-06 巴斯夫欧洲公司 4-羟基苯甲酸和选定农药的结晶配合物
WO2011057989A1 (en) 2009-11-11 2011-05-19 Basf Se Heterocyclic compounds having herbicidal action
WO2011057942A1 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Basf Se Insecticidal methods using pyridine compounds
MX2012005501A (es) 2009-11-13 2012-07-10 Basf Se Compuestos 3- (3, 4- dihidro-2h-benzo [1, 4] -oxazin-6-il)-1h-piri midin-2, 4-diona como herbicidas.
WO2011058036A1 (en) 2009-11-13 2011-05-19 Basf Se Tricyclic compounds having herbicidal action
AU2010321038C1 (en) 2009-11-17 2015-04-30 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Fluorinated oxa or thia heteroarylalkylsulfide derivatives for combating invertebrate pests
GB0920892D0 (en) 2009-11-27 2010-01-13 Syngenta Participations Ag Plant growth regulation
CN102665407A (zh) 2009-11-27 2012-09-12 先正达参股股份有限公司 植物生长调节
WO2011064188A1 (en) 2009-11-27 2011-06-03 Basf Se Insecticidal methods using nitrogen-containing heteroaromatic compounds
GB0920893D0 (en) 2009-11-27 2010-01-13 Syngenta Participations Ag Plant growth regulation
WO2011067184A1 (de) 2009-12-01 2011-06-09 Basf Se 3- (4, 5 -dihydroisoxazol- 5 -yl) benzoylpyrazolverbindungen und ihre mischungen mit safenern
WO2011067209A2 (en) 2009-12-02 2011-06-09 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2011067205A1 (en) 2009-12-02 2011-06-09 Basf Se Pesticidal mixtures of triazamate with strobilurines
ES2546100T3 (es) 2009-12-04 2015-09-18 Merial, Inc. Compuestos pesticidas bis-organosulfurados
GB0921343D0 (en) 2009-12-04 2010-01-20 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
GB0921346D0 (en) 2009-12-04 2010-01-20 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
GB0921344D0 (en) 2009-12-04 2010-01-20 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
WO2011069912A1 (de) 2009-12-07 2011-06-16 Basf Se Triazolverbindungen, ihre verwendung sowie sie enthaltende mittel
WO2011069955A1 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Basf Se Sulfonimidamide compounds for combating animal pests
US8748342B2 (en) 2009-12-08 2014-06-10 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2011069894A1 (de) 2009-12-08 2011-06-16 Basf Se Triazolverbindungen, ihre verwendung sowie sie enthaltende mittel
NZ600886A (en) 2009-12-08 2013-06-28 Basf Se An agrochemical pesticidal mixture for increasing the yield and health of a plant
WO2011069916A1 (de) 2009-12-08 2011-06-16 Basf Se Triazolverbindungen, ihre verwendung als fungizide sowie sie enthaltende mittel
MX2012006141A (es) 2009-12-10 2012-06-28 Basf Se Mezclas de plaguicidas.
WO2011069930A2 (en) 2009-12-10 2011-06-16 Basf Se Pesticidal mixtures
US20120291159A1 (en) 2009-12-18 2012-11-15 Basf Se Azoline Compounds for Combating Invertebrate Pests
WO2011073143A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Basf Se Substituted cyanobutyrates having herbicidal action
JP2013514293A (ja) 2009-12-18 2013-04-25 シンジェンタ パーティシペーションズ アクチェンゲゼルシャフト 有害生物の対処および防除方法
GB0922376D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Syngenta Participations Ag Novel compounds
EP2516424B1 (en) 2009-12-22 2013-12-18 Syngenta Participations AG Pyrazole derivatives
WO2011082913A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions containing isopyrazam, azoxystrobin and cyproconazole
JP5940457B2 (ja) 2010-01-18 2016-06-29 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 殺有害生物剤及び２−プロピルヘプチルアミンのアルコキシレートを含む組成物
JP2013518084A (ja) 2010-02-01 2013-05-20 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 有害動物を駆除するための置換されたケトン性イソオキサゾリン化合物および誘導体
WO2011095459A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Syngenta Participations Ag Pyridazine derivatives, process for their preparation and their use as fungicides
WO2011095461A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Syngenta Participations Ag Pyridazine derivatives, processes for their preparation and their use as fungicides
WO2011098417A1 (en) 2010-02-10 2011-08-18 Basf Se Substituted cyanobutyrates having herbicidal action
WO2011101303A2 (de) 2010-02-16 2011-08-25 Basf Se Zusammensetzung umfassend ein pestizid und ein alkoxylat von iso-heptadecylamin
US8536215B2 (en) 2010-02-18 2013-09-17 Syngenta Crop Protection Llc Pyrazole microbiocides
EP2539338A1 (en) 2010-02-24 2013-01-02 Syngenta Participations AG Novel microbicides
BR112012021238A2 (pt) 2010-02-25 2016-06-21 Syngenta Ltd misturas pesticidas contendo derivados de isoxazolina e um fungicida
NZ601446A (en) 2010-02-25 2014-03-28 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures containing isoxazoline derivatives and insecticide or nematoicidal biological agent
EP2363023A1 (en) 2010-03-04 2011-09-07 Basf Se Synergistic fungicidal and insecticidal mixtures
WO2011110583A2 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Basf Se Fungicidal mixtures comprising triazole derivatives
KR20130051927A (ko) 2010-03-17 2013-05-21 바스프 에스이 살충제 및 분지형 노닐 아민의 알콕실레이트를 포함하는 조성물
AR081526A1 (es) 2010-03-23 2012-10-03 Basf Se Piridazinas sustituidas que tienen accion herbicida
WO2011117210A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Basf Se Substituted pyridines having herbicidal action
CA2791612A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Basf Se Pyridothiazines having herbicidal action
WO2011117213A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Basf Se Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
WO2011117286A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Basf Se Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
CN102858780A (zh) 2010-03-23 2013-01-02 巴斯夫欧洲公司 具有除草作用的取代哒嗪
CN102822179A (zh) 2010-03-23 2012-12-12 巴斯夫欧洲公司 具有除草作用的吡嗪并噻嗪
WO2011117198A2 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Basf Se Pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
WO2011117195A1 (en) 2010-03-23 2011-09-29 Basf Se Substituted pyridines having herbicidal action
CN102843908A (zh) 2010-03-24 2012-12-26 先正达参股股份有限公司 杀虫混合物
US20130023412A1 (en) 2010-03-26 2013-01-24 Basf Se Fungicidal Mixtures Based on Azolopyrimidinylamines
EP2371219A1 (en) 2010-04-01 2011-10-05 Basf Se Herbicidal acylhydrazides
CN102946734A (zh) 2010-04-20 2013-02-27 巴斯夫欧洲公司 包含唑嘧菌胺和四唑肟衍生物的杀真菌混合物
WO2011134867A1 (en) 2010-04-26 2011-11-03 Basf Se Herbicidal azolopyrimidines
JP2011246436A (ja) 2010-04-28 2011-12-08 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物
WO2011134539A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Basf Se Use of oxylipins as safeners and safening herbicidal compositions comprising oxylipins
KR20130067263A (ko) 2010-04-30 2013-06-21 신젠타 파티서페이션즈 아게 곤충이 매개한 바이러스성 감염 감소 방법
WO2011138345A2 (en) 2010-05-06 2011-11-10 Basf Se Fungicidal mixtures based on gallic acid esters
WO2011144593A1 (en) 2010-05-18 2011-11-24 Basf Se Pesticidal mixtures comprising insecticides and pyraclostrobin
EP2575471B1 (en) 2010-05-28 2014-11-19 Basf Se Pesticidal mixtures
ES2567266T3 (es) 2010-05-28 2016-04-21 Basf Se Mezclas de pesticidas
EP2576515B1 (en) 2010-05-28 2014-04-16 Syngenta Participations AG Pyrazolecarboxamide derivatives and their use as microbiocides
EP2576555A1 (en) 2010-05-31 2013-04-10 Syngenta Participations AG 1, 8 -diazaspiro [4.5]decane- 2, 4 -dione derivatives useful as pesticides
CA2798253A1 (en) 2010-05-31 2011-12-08 Syngenta Participations Ag Pesticidal compositions
CN103002740B (zh) 2010-05-31 2016-11-09 先正达参股股份有限公司 杀虫组合物
CN103037696A (zh) 2010-05-31 2013-04-10 巴斯夫欧洲公司 增加植物健康的方法
EP2576511A1 (en) 2010-05-31 2013-04-10 Syngenta Participations AG Spiroheterocyclic pyrrolidine derivatives based pesticides
EP2576554A1 (en) 2010-05-31 2013-04-10 Syngenta Participations AG 1, 8 -diazaspiro [4.5]decane- 2, 4 -dione derivatives useful as pesticides
BR112012030408A2 (pt) 2010-05-31 2015-09-29 Syngenta Participations Ag método de melhoramento de culturas
EP2392210A1 (en) 2010-06-04 2011-12-07 Syngenta Participations AG Methods for increasing stress tolerance in plants
BR112012031088A8 (pt) 2010-06-09 2017-10-10 Syngenta Participations Ag Misturas pesticidas incluindo os derivados da isoxazolina
WO2011154494A2 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures comprising isoxazoline derivatives
BR112012031093A8 (pt) 2010-06-09 2017-10-10 Syngenta Participations Ag Misturas de pesticidas incluindo derivados da isoxazolina
JP2013529615A (ja) 2010-06-24 2013-07-22 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 除草剤組成物
WO2011161132A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2011161131A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Basf Se Herbicidal mixtures
EP2402344A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazole fused bicyclic compounds
EP2402338A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2402339A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2409570A3 (en) 2010-06-29 2013-11-13 Basf Se Fungicidal mixtures based on pyrazolopyridine compounds
EP2402343A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazole-fused bicyclic compounds
EP2402345A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazole fused bicyclic compounds
EP2402336A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
RS54643B1 (sr) 2010-06-29 2016-08-31 Fmc Corporation Derivat 6-acil-1,2,4-triazin-3,5-diona i herbicidi
EP2402340A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2401915A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
EP2402335A1 (en) 2010-06-29 2012-01-04 Basf Se Pyrazolopyridine compounds
WO2012001040A1 (en) 2010-07-02 2012-01-05 Syngenta Participations Ag Novel microbiocidal dioxime ether derivatives
WO2012007426A1 (en) 2010-07-13 2012-01-19 Basf Se Azoline substituted isoxazoline benzamide compounds for combating animal pests
CN103003268A (zh) 2010-07-19 2013-03-27 先正达参股股份有限公司 作为杀微生物剂的异噁唑、异噻唑、呋喃以及噻吩化合物
US20130210836A1 (en) 2010-07-19 2013-08-15 Syngenta Crop Protection Llc Microbicides
DK2595995T3 (en) 2010-07-22 2016-02-29 Basf Se Herbicidal isoxazolo [5,4-b] pyridines
TW201211005A (en) 2010-07-29 2012-03-16 Syngenta Participations Ag Novel microbiocidal dioxime ether derivatives
WO2012016989A2 (en) 2010-08-03 2012-02-09 Basf Se Fungicidal compositions
WO2012019981A1 (en) 2010-08-09 2012-02-16 Basf Se Fungicidal mixtures
DE102011080568A1 (de) 2010-08-16 2012-02-16 Basf Se Substituierte Cyanobutyrate mit herbizider Wirkung
WO2012022729A2 (en) 2010-08-20 2012-02-23 Basf Se Method for improving the health of a plant
BR112013003029A2 (pt) 2010-08-24 2016-09-13 Basf Se “mistura agroquímica, composição agroquímica, método para aumentar sinergicamente a saúde de uma planta e usos de uma mistura”
BR112013005869A2 (pt) 2010-09-13 2019-09-24 Basf Se ''método para controlar pragas invertebradas, uso de um composto, método, material de propagação vegetal e composição agrícola''
JP2013542918A (ja) 2010-09-13 2013-11-28 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 無脊椎有害生物を防除するためのピリジン化合物ｉ
BR112013005484B1 (pt) 2010-09-13 2018-05-15 Basf Se Método para controlar pragas invertebradas, método para proteger material de propagação de planta e composição agrícola
ES2534745T3 (es) 2010-09-14 2015-04-28 Basf Se Composición que contiene un insecticida de piripiropeno y un adyuvante
MX355432B (es) 2010-09-14 2018-04-18 Basf Se Composiciones que contienen un insecticida de piripiropeno y una base.
CN103124723A (zh) 2010-09-23 2013-05-29 先正达参股股份有限公司 新颖的杀微生物剂
WO2012043372A1 (ja) 2010-09-29 2012-04-05 東海ゴム工業株式会社 水系ホース用ゴム組成物およびそれを用いて得られる水系ホース
KR20130143047A (ko) 2010-10-01 2013-12-30 바스프 에스이 살충제로서의 이민 치환된 2,4-디아릴-피롤린 유도체
AR083112A1 (es) 2010-10-01 2013-01-30 Syngenta Participations Ag Metodo para controlar enfermedades fitopatogenas y composiciones fungicidas utiles para dicho control
CN103237789A (zh) 2010-10-01 2013-08-07 巴斯夫欧洲公司 亚胺化合物
CN103221409B (zh) 2010-10-01 2016-03-09 巴斯夫欧洲公司 除草的苯并*嗪酮类
BR112013008319A2 (pt) 2010-10-07 2016-06-14 Basf Se uso de uma estrobilurina (composto a) e método para aumentar a resistência do glúten em cereais de inverno
EP2443923A1 (de) 2010-10-25 2012-04-25 Basf Se Zusammensetzung umfassend ein Pestizid und ein Polycarboxylatether
BR112013008445A2 (pt) 2010-10-11 2016-06-28 Basf Se ''composição,processo para a produção de composição,uso do éter de policarboxilato,semente,métodos de controle de fungos fitopatogênicos,de revestimento de semente e de controle de infestação de ácaro''
US8980792B2 (en) 2010-10-21 2015-03-17 Syngenta Participations Ag Compositions comprising abscisic acid and a fungicidally active compound
EP2447261A1 (en) 2010-10-29 2012-05-02 Basf Se Pyrrole, furane and thiophene derivatives and their use as fungicides
EP2447262A1 (en) 2010-10-29 2012-05-02 Basf Se Pyrrole, furane and thiophene derivatives and their use as fungicides
EP2460404A1 (en) 2010-12-01 2012-06-06 Basf Se Compositions containing identical polyamine salts of mixed anionic pesticides
CA2815742A1 (en) 2010-11-12 2012-05-18 Syngenta Participations Ag Novel microbiocides
WO2012066122A1 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Syngenta Participations Ag 2 - (pyridin- 2 -yl) -quinazoline derivatives and their use as microbicides
WO2012069601A1 (en) 2010-11-25 2012-05-31 Syngenta Participations Ag Substituted quinazolines as fungicides
BR112013012621A2 (pt) 2010-11-25 2016-07-12 Syngenta Participations Ag heterociclos microbicidas
EP2462807A1 (en) 2010-12-08 2012-06-13 Basf Se Pesticidal mixtures comprising pyraclostrobin
CN103260410A (zh) 2010-12-08 2013-08-21 巴斯夫欧洲公司 农药混合物
CN103237451A (zh) 2010-12-08 2013-08-07 巴斯夫欧洲公司 杀真菌混合物
US20130253012A1 (en) 2010-12-10 2013-09-26 Basf Se Pyrazole Compounds for Controlling Invertebrate Pests
EP2651220A1 (en) 2010-12-15 2013-10-23 Syngenta Participations AG Pesticidal mixtures
EP2465350A1 (en) 2010-12-15 2012-06-20 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2012080419A1 (en) 2010-12-15 2012-06-21 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures
CA2818034C (en) 2010-12-15 2019-06-18 Basf Se Herbicidal compositions comprising a benzoxazinone compound and an n-acylsulfamoylphenylurea safener
BR112013014913A2 (pt) 2010-12-20 2016-07-19 Basf Se misturas pesticidas, composição pesticida ou parasiticida, método para proteger os vegetais do ataque ou da infestação por insetos, para o controle dos insetos, para o controle dos fungos fitopatogênicos prejudiciais, para a proteção dos vegetais dos fungos fitopatogênicos prejudiciais, para a proteção do material de propagação dos vegetais, para a proteção dos animais contra a infestação ou infecção por parasitas, para o tratamento dos aminais infectados ou infectados por parasitas e utilização
CN103298346A (zh) 2010-12-22 2013-09-11 巴斯夫欧洲公司 用于增加植物健康的农用化学品混合物
WO2012085081A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Basf Se Sulfoximinamide compounds for combating invertebrate pests ii
JP2014501742A (ja) 2010-12-23 2014-01-23 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 除草活性を有する置換ピリジン
JP5842594B2 (ja) 2010-12-27 2016-01-13 住友化学株式会社 ピリダジノン化合物、それを含有する除草剤及び有害節足動物防除剤
US20130296436A1 (en) 2010-12-27 2013-11-07 Sumitomo Chemical Company, Limited Amidine compounds and use thereof for plant disease control
WO2012093100A1 (en) 2011-01-05 2012-07-12 Syngenta Participations Ag Pyrazol-4-yl carboxamide derivatives as microbiocides
EP2474226A1 (en) 2011-01-07 2012-07-11 Basf Se Herbicidally active composition comprising cyanobutyrates
EP2476313A1 (en) 2011-01-14 2012-07-18 Basf Se Synergistic pesticidal compositions comprising a dithiocarbamate and an insecticide
EP2481284A3 (en) 2011-01-27 2012-10-17 Basf Se Pesticidal mixtures
EP2484210A1 (en) 2011-02-08 2012-08-08 Basf Se Pesticidal compositions
BR112013020213A2 (pt) 2011-02-09 2016-08-02 Syngenta Participations Ag compostos inseticidas
WO2012107475A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2012107477A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
US8822377B2 (en) 2011-02-11 2014-09-02 Basf Se Herbicidal compositions comprising topramezone and pinoxaden
MX2013007481A (es) 2011-02-16 2013-08-15 Basf Se Metodo para controlar hongos fitopatogenos.
EP2678328B1 (en) 2011-02-21 2015-01-21 Syngenta Participations AG Novel carboxamide microbiocides
CA2825609C (en) 2011-02-28 2019-04-09 Basf Se Composition comprising a pesticide, a surfactant and an alkoxylate of 2-propylheptylamine
JP2011137030A (ja) 2011-03-01 2011-07-14 Sumitomo Chemical Co Ltd 有害生物防除組成物及び有害生物の防除方法。
WO2012117021A2 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Syngenta Participations Ag Novel microbiocidal oxime ethers
MY161279A (en) 2011-03-07 2017-04-14 Sumitomo Chemical Co Method for controlling weeds in paddy rice cultivation
WO2012127009A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Basf Se Compositions containing polymeric, ionic compounds comprising imidazolium groups
WO2012130823A1 (en) 2011-03-30 2012-10-04 Basf Se Suspension concentrates
TWI634840B (zh) 2011-03-31 2018-09-11 先正達合夥公司 植物生長調節組成物及使用其之方法
WO2012136724A1 (en) 2011-04-06 2012-10-11 Basf Se Substituted pyrimidinium compounds for combating animal pests
AR085872A1 (es) 2011-04-08 2013-10-30 Basf Se Derivados heterobiciclicos n-sustituidos utiles para combatir parasitos en plantas y/o animales, composiciones que los contienen y metodos para combatir dichas plagas
WO2012143395A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Syngenta Participations Ag 4,5-dihydro-isoxazole derivatives as fungicides
WO2012143468A1 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Basf Se 3,4-disubstituted pyrrole 2,5-diones and their use as fungicides
WO2012150162A1 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Basf Se A method for enhancing the performance of a pesticide with guanidines
EP2524596A1 (en) 2011-05-18 2012-11-21 Basf Se Seed treatment uses
WO2012159891A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Syngenta Participations Ag Endosperm-specific plant promoters and uses therefor
BR112013029907A2 (pt) 2011-06-01 2016-08-09 Basf Se “método de controle de vegetação indesejada e uso de uma base”
WO2012168210A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Basf Se Seed treatment formulation aid containing polymeric sticker and silicon oil
CN103596959A (zh) 2011-06-09 2014-02-19 巴斯夫欧洲公司 具有除草活性的取代吡啶类
WO2012168241A1 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Basf Se Substituted pyrazines having herbicidal activity
EP2532661A1 (en) 2011-06-10 2012-12-12 Syngenta Participations AG Novel insecticides
EA201400026A1 (ru) 2011-06-17 2014-05-30 Басф Се Применение тетрацианодитиинов в качестве фунгицидов
EA201400027A1 (ru) 2011-06-17 2014-04-30 Басф Се Композиции, содержащие фунгицидные замещенные дитиины и дополнительные активные вещества
AR087008A1 (es) 2011-06-22 2014-02-05 Syngenta Participations Ag Derivados de n-oxi-pirazolo-triazepina-diona
KR20140031950A (ko) 2011-06-29 2014-03-13 니혼노야쿠가부시키가이샤 농원예용 살충제 조성물 및 그 사용 방법
EP2540718A1 (en) 2011-06-29 2013-01-02 Syngenta Participations AG. Novel insecticides
BR112013033580A2 (pt) 2011-06-30 2016-08-16 Syngenta Participations Ag heterociclos microbicidas
WO2013000941A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Syngenta Participations Ag Microbiocidal heterocycles
WO2013007550A1 (en) 2011-07-08 2013-01-17 Syngenta Participations Ag Fungicide mixtures
DK2731935T3 (en) 2011-07-13 2016-06-06 Basf Agro Bv FUNGICIDE SUBSTITUTED 2- [2-HALOGENALKYL-4- (PHENOXY) -PHENYL] -1- [1,2,4] TRIAZOL-1-YLETHANOL COMPOUNDS
WO2013010946A2 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Basf Se Pesticidal methods using substituted 3-pyridyl thiazole compounds and derivatives for combating animal pests i
CN103814017A (zh) 2011-07-15 2014-05-21 巴斯夫欧洲公司 杀真菌的苯基烷基取代的2-[2-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基]-1-[1,2,4]三唑-1-基乙醇化合物
EP2731934A1 (en) 2011-07-15 2014-05-21 Basf Se Fungicidal alkyl- and aryl-substituted 2-[2-chloro-4-(dihalo-phenoxy)-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds
EA201400137A1 (ru) 2011-07-15 2014-06-30 Басф Се Фунгицидные алкилзамещенные 2-[2-хлоро-4-(4-хлорофенокси)фенил]-1-[1,2,4]триазол-1-ил-этанольные соединения
WO2013011010A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Syngenta Participations Ag Fungizide mixtures
CA2842346A1 (en) 2011-08-02 2013-02-07 Basf Se Aqueous composition comprising a pesticide and a base selected from an alkali salt of hydrogencarbonate
CN103827092A (zh) 2011-08-12 2014-05-28 巴斯夫欧洲公司 N-硫代邻氨基苯甲酰胺化合物及其作为农药的用途
WO2013024003A1 (en) 2011-08-12 2013-02-21 Basf Se N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
EP2742036A1 (en) 2011-08-12 2014-06-18 Basf Se N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
KR20140064849A (ko) 2011-08-12 2014-05-28 바스프 에스이 아닐린 유형 화합물
WO2013024006A1 (en) 2011-08-12 2013-02-21 Basf Se Anthranilamide compounds and their use as pesticides
CA2842858A1 (en) 2011-08-12 2013-02-21 Basf Se N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
JP2014522873A (ja) 2011-08-12 2014-09-08 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア アントラニルアミド化合物および殺虫剤としてのその使用
AU2012296886A1 (en) 2011-08-15 2014-02-20 Basf Se Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-ethoxy-ethyl}-1H- [1,2,4]triazole compounds
AR087538A1 (es) 2011-08-15 2014-04-03 Basf Se Compuestos fungicidas de 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-fenoxi)-fenil]-2-alcoxi-2-alquinil/alquenil-etil}-1h-[1,2,4]triazol sustituidos
EP2559688A1 (en) 2011-08-15 2013-02-20 Basf Se Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-butoxy-ethyl}-1h [1,2,4]triazole compounds
CN103827096A (zh) 2011-08-15 2014-05-28 巴斯夫欧洲公司 杀真菌的取代的1-{2-[2-卤代-4-(4-卤代苯氧基)苯基]-2-烷氧基己基}-1h-[1,2,4]三唑化合物
EP2744791B1 (en) 2011-08-15 2015-10-28 Basf Se Fungicidal substituted 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-phenoxy)-phenyl]-2-alkoxy-3-methyl-butyl}-1h-[1,2,4]triazole compounds
UY34257A (es) 2011-08-15 2013-02-28 Basf Se Compuestos fungicidas de 1-{2-[2-halo-4-(4-halogen-fenoxi)-fenil]-2-alquiniloxi-etil}-1h-[1,2,4]triazol sustituidos
BR112014002499A2 (pt) 2011-08-15 2017-02-21 Basf Se “compostos, processos para a preparação de compostos de fórmula i, composições agroquímicas e usos de compostos de fórmula i ou viii”
CN103717577B (zh) 2011-08-15 2016-06-15 巴斯夫欧洲公司 杀真菌的取代的1-{2-环基氧基-2-[2-卤代-4-(4-卤代苯氧基)苯基]乙基}-1h-[1,2,4]三唑化合物
US20140243196A1 (en) 2011-08-18 2014-08-28 Basf Se Carbamoylmethoxy- and Carbamoylmethylthio- and Carbamoylmethylamino Benzamides for Combating Invertebrate Pests
CN103889960A (zh) 2011-08-18 2014-06-25 巴斯夫欧洲公司 用于防治无脊椎动物害虫的氨基甲酰基甲氧基-和氨基甲酰基甲硫基-及氨基甲酰基甲基氨基苯甲酰胺
US20140243197A1 (en) 2011-08-18 2014-08-28 Basf Se Carbamoylmethoxy- and carbamoylmethylthio- and carbamoylmethylamino benzamides for combating invertebrate pests
UY34279A (es) 2011-08-23 2013-04-05 Syngenta Participations Ag Compuestos heterocíclicos activos como microbiocidas, intermediarios, composiciones y usos
EP2747564B1 (en) 2011-08-25 2015-04-01 Basf Se Herbicidal compositions comprising chloroacetamides
CN104023535A (zh) 2011-09-02 2014-09-03 巴斯夫欧洲公司 农药活性的3-芳基喹唑啉-4-酮衍生物在土壤施用方法中的用途
CN103987261A (zh) 2011-09-02 2014-08-13 巴斯夫欧洲公司 包含芳基喹唑啉酮化合物的农业混合物
JP2014529618A (ja) 2011-09-02 2014-11-13 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ アリールキナゾリノン化合物を含む殺虫活性混合物
UA115430C2 (uk) 2011-09-13 2017-11-10 Басф Агрокемікал Продактс Б.В. Спосіб боротьби з паразитними бур'янами за допомогою сумішей, що включають гербіцидні інгібітори ацетолактатсинтази й регулятори росту рослин
US20140187426A1 (en) 2011-09-16 2014-07-03 Syngenta Participations Ag Crop enhancement
TW201325454A (zh) 2011-09-16 2013-07-01 Syngenta Participations Ag 植物生長調控
CN108142434A (zh) 2011-10-07 2018-06-12 先正达参股股份有限公司 用于保护有用植物或植物繁殖材料的方法
BR112014009086A2 (pt) 2011-10-18 2017-05-09 Syngenta Participations Ag derivados pirazol microbicidas
BR112014009037A2 (pt) 2011-10-18 2017-05-09 Syngenta Participations Ag derivados pirazol microbicidas
RS57157B1 (sr) 2011-11-11 2018-07-31 Gilead Apollo Llc Acc inhibitori i njihove primene
AR088857A1 (es) 2011-11-14 2014-07-10 Basf Se Compuestos de 1,2,5-oxadiazol sustituido y su uso como herbicidas
CA2853340A1 (en) 2011-11-16 2013-05-23 Basf Se Substituted 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides ii
BR112014011685A2 (pt) 2011-11-18 2017-05-30 Basf Se composto, utilização de um composto e método
AU2012344112B9 (en) 2011-11-29 2017-02-02 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal triazinone derivatives
TWI572282B (zh) 2011-11-30 2017-03-01 先正達合夥公司 含有螺雜環吡咯啶二酮的殺有害生物混合物
IN2014CN04928A (ja) 2011-12-05 2015-09-18 Basf Agrochemical Products Bv
WO2013092460A1 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Syngenta Participations Ag Cyclic bisoxime microbicides
WO2013092244A1 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Basf Se Herbicidal triazines
JP2015502966A (ja) 2011-12-21 2015-01-29 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ Ｎ−チオ−アントラニルアミド化合物、及び殺有害生物剤としてのそれらの使用
WO2013092943A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Basf Se Isothiazoline compounds for combating invertebrate pests
EP2802212B1 (en) 2012-01-12 2015-12-30 Basf Se Herbicidal isoxazolo[5,4-b]pyridines
EA026738B1 (ru) 2012-01-17 2017-05-31 Зингента Партисипейшнс Аг Пестицидные смеси, содержащие спирогетероциклические пирролидиндионы
BR112014017562B1 (pt) 2012-01-17 2020-11-03 Syngenta Participations Ag. mistura pesticida, método de controle de insetos, ácaros, nematódeos ou moluscos e método de proteção de uma semente contra o ataque de pragas
WO2013107794A2 (en) 2012-01-17 2013-07-25 Syngenta Participations Ag Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones
EP2804481A2 (en) 2012-01-17 2014-11-26 Syngenta Participations AG Pesticidal mixtures including spiroheterocyclic pyrrolidine diones
WO2013113789A1 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Basf Se N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
WO2013113787A1 (en) 2012-02-03 2013-08-08 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
WO2013120729A1 (en) 2012-02-13 2013-08-22 Syngenta Participations Ag Plant growth regulation
WO2013124250A2 (en) 2012-02-20 2013-08-29 Basf Se Fungicidal substituted thiophenes
US20150018215A1 (en) 2012-03-01 2015-01-15 Basf Se Use of an agrochemical composition with herbicidal action in cereals
WO2013127846A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in corn
WO2013127855A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in cereals
BR112014021525A2 (pt) 2012-03-01 2017-07-18 Basf Se usos de uma composição, método para controlar vegetação indesejada e método para dessecação e/ou desfolhação de plantas de soja
WO2013127862A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with herbicidal action in rapeseed
WO2013127818A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in soybeans
WO2013127768A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Syngenta Participations Ag Pyridine carboxamide pesticides
WO2013127848A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in corn
WO2013127863A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with herbicidal action in corn
WO2013127821A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in rapeseed
WO2013127843A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in sunflowers
WO2013127857A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in cereals
EP2819511A1 (en) 2012-03-01 2015-01-07 Basf Se Adjuvants based on optionally alkoxylated reaction products of glycerol carbonate and alkylamines
WO2013127845A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in sunflowers
WO2013127859A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in soybeans
WO2013127820A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal, herbicidal and plant health improving action in rapeseed
IN2014DN07226A (ja) 2012-03-01 2015-04-24 Basf Se
WO2013127780A1 (en) 2012-03-01 2013-09-06 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
EP2820015A1 (en) 2012-03-02 2015-01-07 Syngenta Participations AG Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2013127784A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
US20150065481A1 (en) 2012-03-02 2015-03-05 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
JP6174057B2 (ja) 2012-03-12 2017-08-02 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ ピリピロペン殺虫剤の水性懸濁濃厚製剤の調製方法
KR102055551B1 (ko) 2012-03-12 2019-12-13 바스프 에스이 피리피로펜 살충제 ｉ 함유 액체 농축 제형
MX360700B (es) 2012-03-12 2018-11-14 Basf Se Formulacion concentrada liquida que contiene un insecticida de piripiropeno ii.
CN104168770B (zh) 2012-03-13 2016-06-01 巴斯夫欧洲公司 含有啶南平杀虫剂的液体浓缩物配制剂iii
WO2013135672A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
EP2825533B1 (en) 2012-03-13 2016-10-19 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
US20150051078A1 (en) 2012-03-21 2015-02-19 Basf Se Glyphosate tank mix adjuvant comprising a base selected from a carbonate and/or a phosphate
UY34689A (es) 2012-03-21 2013-09-30 Basf Se Adyuvante de mezcla en tanque sólido particulado que comprende una base seleccionada de un carbonato y/o un fosfato
AR090385A1 (es) 2012-03-21 2014-11-05 Basf Se Adyuvante de mezcla en tanque liquido o particulado que comprende una base seleccionada de una mezcla de carbonato e hidrogenocarbonato
UY34690A (es) 2012-03-21 2013-09-30 Basf Se Adyuvante de mezcla de tanque que comprende un poliglucosido de alquilo y una base
EP2641901A1 (en) 2012-03-22 2013-09-25 Syngenta Participations AG. Novel microbiocides
WO2013144228A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 Basf Se Pesticidal methods using heterocyclic compounds and derivatives for combating animal pests
US20150065347A1 (en) 2012-03-29 2015-03-05 Basf Se Co-crystals of dicamba and a co-crystal former b
CN104202981B (zh) 2012-03-30 2018-01-30 巴斯夫欧洲公司 防治动物害虫的n‑取代的吡啶亚基化合物和衍生物
WO2013144223A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Basf Se N-substituted pyrimidinylidene compounds and derivatives for combating animal pests
WO2013149940A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Basf Se Acrylamide compounds for combating invertebrate pests
EP2647626A1 (en) 2012-04-03 2013-10-09 Syngenta Participations AG. 1-Aza-spiro[4.5]dec-3-ene and 1,8-diaza-spiro[4.5]dec-3-ene derivatives as pesticides
WO2013149903A1 (en) 2012-04-03 2013-10-10 Basf Se N- substituted hetero - bicyclic furanone derivatives for combating animal
WO2013150115A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 Basf Se N- substituted hetero - bicyclic compounds and derivatives for combating animal pests
US20150305336A1 (en) 2012-04-05 2015-10-29 Basf Se Soluble liquid formulations of quinclorac ammonium salts
EP2649879A1 (en) 2012-04-10 2013-10-16 Basf Se Pesticidal mixtures containing fluxapyroxad
WO2013156431A1 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyridyl- and pyrimidyl- substituted thiazole and thiadiazole derivatives
WO2013156433A1 (en) 2012-04-17 2013-10-24 Syngenta Participations Ag Insecticidally active thiazole derivatives
BR112014026787A2 (pt) 2012-04-27 2017-06-27 Basf Se compostos de n-(tetrazol-5-il) e n-(triazol-5 il)hetarilcarboxamida substituída e uso dos mesmos como herbicidas.
BR112014026823A2 (pt) 2012-04-27 2017-06-27 Basf Se compostos de n-(tetrazol-5-il) e n-(triazol-5-il)arilcarboxamida substituída e seu uso como herbicidas.
EP2841427A2 (en) 2012-04-27 2015-03-04 Basf Se Substituted n-(tetrazol-5-yl)- and n-(triazol-5-yl)pyridin-3-yl-carboxamide compounds and their use as herbicides
CN104428297A (zh) 2012-04-27 2015-03-18 巴斯夫欧洲公司 取代的n-(四唑-5-基)-和n-(三唑-5-基)芳基羧酰胺化合物及其作为除草剂的用途
CA2868385A1 (en) 2012-05-04 2013-11-07 Basf Se Substituted pyrazole-containing compounds and their use as pesticides
EP2659777A1 (en) 2012-05-04 2013-11-06 Syngenta Participations AG. New use of a pesticide
WO2013167633A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Basf Se Acrylamide compounds for combating invertebrate pests
WO2013167651A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Syngenta Participations Ag Crop enhancement
US9533968B2 (en) 2012-05-24 2017-01-03 Basf Se N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
BR112014029531A2 (pt) 2012-06-01 2017-06-27 Basf Se composto de piridina, composição e método para controlar vegetação indesejada
EP2858981A1 (en) 2012-06-06 2015-04-15 Basf Se Pyrazolopyrans having herbicidal and pharmaceutical properties
EP2671881A1 (en) 2012-06-07 2013-12-11 Syngenta Participations AG. Pesticidally active pyridyl- and pyrimidyl- substituted thiazole derivatives
GB201210398D0 (en) 2012-06-11 2012-07-25 Syngenta Participations Ag Crop enhancement
BR112014030412A2 (pt) 2012-06-14 2017-06-27 Basf Se método para combater ou controlar pragas, método para proteger culturas, compostos, processo para a preparação de compostos, uso de um composto, composição agrícola ou veterinária e semente.
EP3646731A1 (en) 2012-06-20 2020-05-06 Basf Se Pesticidal mixtures comprising a pyrazole compound
CA2873822C (en) 2012-06-21 2020-09-22 Basf Se An aqueous composition comprising dicamba, and a fatty alcohol alkoxylate as a drift control agent
EP2863743B1 (en) 2012-06-21 2018-04-11 Basf Se Adjuvant comprising a 2-propylheptylamine alkoxylate, sugar-based surfactant, and drift-control agent and humectant
MX2015000245A (es) 2012-07-03 2015-08-12 Basf Se Formulacion acuosa altamente concentrada que comprende un plaguicida anionico y una base.
EP2869699A1 (en) 2012-07-09 2015-05-13 BASF Corporation Drift control agent comprising polypropylene glycol and a triblock polymer
EP2684879A1 (en) 2012-07-09 2014-01-15 Basf Se Substituted mesoionic compounds for combating animal pests
WO2014009293A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Basf Se New substituted thiadiazoles and their use as fungicides
BR112015000648A2 (pt) 2012-07-13 2017-10-03 Basf Se Uso de um composto, composições agrícolas para o controle de fungos fitopatogênicos, semente e método para controle de fungos fitopatogênicos
WO2014023531A1 (en) 2012-08-07 2014-02-13 Syngenta Participations Ag Trifluoromethylpyridine carboxamides as pesticides
EP2700635A1 (en) 2012-08-20 2014-02-26 Basf Se 5-Trifluoromethylpyrazole amides having herbicidal activity
EP2700634A1 (en) 2012-08-20 2014-02-26 Basf Se 5-difluoromethylpyrazole amides having herbicidal activity
WO2014033242A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with herbicidal action in rice
WO2014033241A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 Basf Se Use of an agrochemical composition with fungicidal and plant health improving action in rice
CN104812901B (zh) 2012-09-13 2018-08-10 美国印第安纳大学研究和技术公司 赋予植物抗病性的组合物和系统及其使用方法
MX2015003659A (es) 2012-09-21 2015-09-21 Basf Se Insecticida piretroide para la protección de plantas y semillas.
WO2014053405A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se Pesticidally active mixtures comprising anthranilamide compounds
WO2014053403A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se Method of controlling insecticide resistant insects
WO2014053398A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se Pesticidal mixtures comprising jasmonic acid or a derivative thereof
KR20150067270A (ko) 2012-10-01 2015-06-17 바스프 에스이 안트라닐아미드 화합물을 포함하는 살충적으로 활성인 혼합물
WO2014053407A1 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se N-thio-anthranilamide compounds and their use as pesticides
WO2014053401A2 (en) 2012-10-01 2014-04-10 Basf Se Method of improving plant health
AR093772A1 (es) 2012-10-01 2015-06-24 Basf Se Metodo para controlar insectos resistentes a insecticidas moduladores de rianodina
JP2015532274A (ja) 2012-10-01 2015-11-09 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 栽培植物へのｎ−チオ−アントラニルアミド化合物の使用
US20150257383A1 (en) 2012-10-12 2015-09-17 Basf Se Method for combating phytopathogenic harmful microbes on cultivated plants or plant propagation material
WO2014060177A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
WO2014060176A1 (en) 2012-10-16 2014-04-24 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2014079728A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079841A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079804A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079774A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079766A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079772A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079770A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
CN104936445B (zh) 2012-11-22 2017-07-04 巴斯夫公司 农药混合物
CN105101797A (zh) 2012-11-22 2015-11-25 巴斯夫公司 农药混合物
EP2922399B1 (en) 2012-11-22 2020-02-26 Basf Corporation Pesticidal mixtures
WO2014079820A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Use of anthranilamide compounds for reducing insect-vectored viral infections
WO2014079752A1 (en) 2012-11-23 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014079813A1 (en) 2012-11-23 2014-05-30 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2014082879A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds
US20150307459A1 (en) 2012-11-27 2015-10-29 Basf Se Substituted 2-[phenoxy-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol Compounds and Their Use as Fungicides
US20160029630A1 (en) 2012-11-27 2016-02-04 Basf Se Substituted 2-[phenoxy-phenyl]-1-[1,2,4]triazol-1-yl-ethanol compounds and their use as fungicides
WO2014082880A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Basf Se Substituted [1,2,4] triazole compounds
EP2738171A1 (en) 2012-11-30 2014-06-04 Syngenta Participations AG. Pesticidally active tricyclic pyridyl derivatives
MX2015007116A (es) 2012-12-04 2015-11-30 Basf Se Nuevos derivados de 1,4-ditiina sustituida y su uso como fungicidas.
AU2013357564A1 (en) 2012-12-14 2015-07-02 Basf Se Malononitrile compounds for controlling animal pests
EP2746277A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds
EP2746275A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2746262A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds for combating phytopathogenic fungi
EP2746263A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Alpha-substituted triazoles and imidazoles
EP2746255A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
WO2014095534A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2746266A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
WO2014095555A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2746276A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
WO2014095672A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds and their use as fungicides
WO2014095381A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Basf Se Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds
EP2746264A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
CN105164111B (zh) 2012-12-19 2018-11-20 巴斯夫欧洲公司 取代[1,2,4]三唑及其作为杀真菌剂的用途
EP2746274A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds
EP2745691A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted imidazole compounds and their use as fungicides
WO2014095547A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Basf Se New substituted triazoles and imidazoles and their use as fungicides
EP2746256A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds
EP2746279A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Fungicidal imidazolyl and triazolyl compounds
EP2746278A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EA030875B1 (ru) 2012-12-20 2018-10-31 Басф Агро Б.В. Композиции, содержащие триазольное соединение
EP2746257A1 (en) 2012-12-21 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2746260A1 (en) 2012-12-21 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2746259A1 (en) 2012-12-21 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2746258A1 (en) 2012-12-21 2014-06-25 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
CN105007739A (zh) 2012-12-21 2015-10-28 巴斯夫欧洲公司 用于防治无脊椎动物害虫的环棒麦角素及其衍生物
US20150368236A1 (en) 2012-12-27 2015-12-24 Basf Se 2-(pyridin-3-yl)-5-hetaryl-thiazole compounds carrying an imine or imine-derived substituent for combating invertebrate pests
CN105007729B (zh) 2012-12-31 2017-09-08 巴斯夫欧洲公司 包含cornexistin的除草组合物
WO2014118099A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Basf Se Fungicidal naphthoquinones and derivatives
WO2014118142A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2014118143A1 (en) 2013-02-04 2014-08-07 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
WO2014124850A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
WO2014128136A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Basf Se Anthranilamide compounds and their use as pesticides
BR112015020194A2 (pt) 2013-03-07 2017-07-18 Basf Se co-cristais, processo para a preparação dos co-cristais, formulação agrícola, métodos para controle de pragas, para melhoria da saúde das plantas e para a proteção de material de propagação de planta contra pragas e material de propagação de planta
WO2014154530A1 (en) 2013-03-25 2014-10-02 Syngenta Participations Ag Microbiocidal pyrazole derivatives
EP2783569A1 (en) 2013-03-28 2014-10-01 Basf Se Compositions comprising a triazole compound
MX2015013568A (es) 2013-03-28 2016-02-05 Syngenta Participations Ag Metodos para controlar las plagas resistentes a neonicotinoides.
CN105324374B (zh) 2013-04-19 2018-12-04 巴斯夫欧洲公司 用于对抗动物害虫的n-取代酰基-亚氨基-吡啶化合物和衍生物
EP2999712B1 (en) 2013-04-30 2018-11-21 Donald Danforth Plant Science Center Antifungal plant proteins, peptides, and methods of use
EP2994139B1 (en) 2013-05-10 2019-04-10 Gilead Apollo, LLC Acc inhibitors and uses thereof
JP6417402B2 (ja) 2013-05-10 2018-11-07 ギリアド アポロ， エルエルシー Ａｃｃ阻害剤及びその使用
JP6426714B2 (ja) 2013-05-15 2018-11-21 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 置換型ｎ−（テトラゾール−５−イル）−およびｎ−（トリアゾール−５−イル）アリールカルボキサミド化合物ならびに除草剤としてのそれらの使用
WO2014184058A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se Substituted 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides
WO2014184014A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)carboxamide compounds and their use as herbicides
WO2014184019A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Basf Se N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)carboxamide compounds and their use as herbicides
WO2014187846A1 (en) 2013-05-23 2014-11-27 Syngenta Participations Ag Tank-mix formulations
CN105246900A (zh) 2013-05-24 2016-01-13 巴斯夫欧洲公司 具有除草活性的取代吡啶化合物
EP2813499A1 (en) 2013-06-12 2014-12-17 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2815649A1 (en) 2013-06-18 2014-12-24 Basf Se Fungicidal mixtures II comprising strobilurin-type fungicides
EP2815647A1 (en) 2013-06-18 2014-12-24 Basf Se Novel strobilurin-type compounds for combating phytopathogenic fungi
BR112015032381A2 (pt) 2013-06-26 2017-07-25 Basf Se métodos para o aprimoramento da eficácia dos herbicidas aniônicos e para o controle da vegetação indesejada, utilização de aminocarboxilatos e composição
CA2917262A1 (en) 2013-07-02 2015-01-08 Syngenta Participations Ag Pesticidally active bi- or tricyclic heterocycles with sulfur containing substituents
ES2651367T3 (es) 2013-07-15 2018-01-25 Basf Se Compuestos plaguicidas
WO2015007451A1 (en) 2013-07-15 2015-01-22 Syngenta Participations Ag Microbiocidal heterobicyclic derivatives
WO2015007564A1 (en) 2013-07-18 2015-01-22 Basf Se Substituted n-(1,2,4-triazol-3-yl)arylcarboxamide compounds and their use as herbicides
EP2835052A1 (en) 2013-08-07 2015-02-11 Basf Se Fungicidal mixtures comprising pyrimidine fungicides
WO2015021991A1 (en) 2013-08-16 2015-02-19 Cheminova A/S Combination of 2-methylbiphenyl-3-ylmethyl (z)-(1r)-cis-3-(2-chloro-3,3,3-trifluoroprop-1-enyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate with at least one insecticide, acaricide, nematicide and/or fungicide.
EP2839745A1 (en) 2013-08-21 2015-02-25 Basf Se Agrochemical formulations comprising a 2-ethyl-hexanol alkoxylate
WO2015036059A1 (en) 2013-09-16 2015-03-19 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
CA2923101A1 (en) 2013-09-16 2015-03-19 Basf Se Fungicidal pyrimidine compounds
WO2015040116A1 (en) 2013-09-19 2015-03-26 Basf Se N-acylimino heterocyclic compounds
CN115136961B (zh) 2013-10-03 2024-11-19 先正达参股股份有限公司 杀真菌组合物
BR112016007065A2 (pt) 2013-10-10 2017-08-01 Basf Se composto, composição, utilização de um composto e método para o controle da vegetação
WO2015052173A1 (en) 2013-10-10 2015-04-16 Basf Se Tetrazole and triazole compounds and their use as herbicides
WO2015052178A1 (en) 2013-10-10 2015-04-16 Basf Se 1,2,5-oxadiazole compounds and their use as herbicides
AR097995A1 (es) 2013-10-14 2016-04-27 Syngenta Participations Ag Método para sembrar filas de cultivos
UA121106C2 (uk) 2013-10-18 2020-04-10 Басф Агрокемікал Продактс Б.В. Застосування пестицидної активної похідної карбоксаміду у способах застосування і обробки насіння та ґрунту
WO2015055764A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Syngenta Participations Ag 3-methanimidamid-pyridine derivatives as fungicides
EP2868197A1 (en) 2013-11-05 2015-05-06 Basf Se Herbicidal compositions
EP2868196A1 (en) 2013-11-05 2015-05-06 Basf Se Herbicidal compositions
EP2873668A1 (en) 2013-11-13 2015-05-20 Syngenta Participations AG. Pesticidally active bicyclic heterocycles with sulphur containing substituents
HUE042086T2 (hu) 2013-11-20 2019-06-28 Adama Celsius B V Amsterdam Nl Schaffhausen Branch Elõkevert mikroemulzió készítmény
EP2881388A1 (en) 2013-12-09 2015-06-10 Basf Se Pyrazolone compounds having herbicidal activity
EP2881387A1 (en) 2013-12-09 2015-06-10 Basf Se Pyrazolone compounds having herbicidal activity
EP3080092B1 (en) 2013-12-12 2019-02-06 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
WO2015091649A1 (en) 2013-12-18 2015-06-25 Basf Se N-substituted imino heterocyclic compounds
WO2015091645A1 (en) 2013-12-18 2015-06-25 Basf Se Azole compounds carrying an imine-derived substituent
CN105829324B (zh) 2013-12-20 2018-12-14 先正达参股股份有限公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性经取代的5,5-二环杂环
US20170000132A1 (en) 2013-12-23 2017-01-05 Syngenta Participations Ag Benzoxaborole fungicides
WO2015104422A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Basf Se Dihydrothiophene compounds for controlling invertebrate pests
AR100304A1 (es) 2014-02-05 2016-09-28 Basf Corp Formulación de recubrimiento de semillas
EP2907807A1 (en) 2014-02-18 2015-08-19 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
PL3122732T3 (pl) 2014-03-26 2018-08-31 Basf Se Podstawione związki [1,2,4]triazolowe i imidazolowe jako fungicydy
EP2924027A1 (en) 2014-03-28 2015-09-30 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole fungicidal compounds
WO2015150541A1 (en) 2014-04-03 2015-10-08 Basf Se Diaminotriazine compound useful as herbicide
EP2930174A1 (en) 2014-04-07 2015-10-14 Basf Se Diaminotriazine derivatives as herbicides
CA2955955C (en) 2014-04-17 2024-04-30 Basf Se Combination of (thio)phosphoric acid triamides and herbicides
JP6538077B2 (ja) 2014-04-23 2019-07-03 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 除草剤としてのジアミノトリアジン化合物
US9701659B2 (en) 2014-05-19 2017-07-11 Syngenta Participations Ag Insecticidally active amide derivatives with sulfur-substituted phenyl or pyridine groups
EP2949216A1 (en) 2014-05-30 2015-12-02 Basf Se Fungicidal substituted alkynyl [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2949649A1 (en) 2014-05-30 2015-12-02 Basf Se Fungicide substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
EP2952512A1 (en) 2014-06-06 2015-12-09 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds
EP2952507A1 (en) 2014-06-06 2015-12-09 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds
EP2952506A1 (en) 2014-06-06 2015-12-09 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole and imidazole compounds
PL3151669T3 (pl) 2014-06-06 2021-04-19 Basf Se Zastosowanie podstawionych oksadiazoli do zwalczania fitopatogennych grzybów
AR100743A1 (es) 2014-06-06 2016-10-26 Basf Se Compuestos de [1,2,4]triazol sustituido
EA201892682A1 (ru) 2014-06-25 2019-04-30 Басф Агро Б.В. Пестицидные композиции
EP2962567A1 (en) 2014-07-01 2016-01-06 Basf Se Ternary mixtures comprising biopesticides and at least two chemical insecticides
WO2016008740A1 (en) 2014-07-14 2016-01-21 Basf Se Pesticidal compositions
WO2016016131A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Syngenta Participations Ag Pesticidally active cyclic enaminones
EP2979549A1 (en) 2014-07-31 2016-02-03 Basf Se Method for improving the health of a plant
CA2956405A1 (en) 2014-07-31 2016-02-04 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
CN107074846B (zh) 2014-08-12 2020-05-19 先正达参股股份有限公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性杂环衍生物
WO2016034615A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 BASF Agro B.V. Aqueous insecticide formulation containing hyperbranched polymer
WO2016071168A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Basf Se Pesticidal mixtures
US10219515B2 (en) 2014-11-07 2019-03-05 Basf Se Agrochemical adjuvant containing 2-oxo-1,3-dioxolan-4 carboxylates
WO2016077624A1 (en) 2014-11-12 2016-05-19 Nmc, Inc. Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same
EP3028573A1 (en) 2014-12-05 2016-06-08 Basf Se Use of a triazole fungicide on transgenic plants
EP3029025A1 (en) 2014-12-05 2016-06-08 Basf Se Method for combating soybean rust comprising treating soybean with (2e)-2-methoxyimino-2 [2 [[(e)-[(2e)-2-alkoxyimino-1-methyl-alk-3-enylidene]amino]oxymethyl]phenyl]-n-methyl-acetamides
EP3031325A1 (en) 2014-12-10 2016-06-15 Basf Se Method for combating soybean rust comprising treating soybean with (2E)-2-[2-[[1-(2,4-substi-tuted-phenyl)pyrazol-3-yl]oxymeth¬yl]-3-sub¬stituted-phenyl]-2-methoxyimino-n-methyl-acet-amides
ES2806598T3 (es) 2014-12-11 2021-02-18 Syngenta Participations Ag Derivados tetracíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
WO2016091674A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Basf Se Use of cyclaniliprole on cultivated plants
WO2016091675A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Basf Se Method for improving the health of a plant
EP3047731A1 (en) 2015-01-21 2016-07-27 Basf Se Method for combating soybean rust comprising treating soybean with (2E)-2-[3-substituted-2 [[(E)-[(2E)-2-alkoxyimino-1-methyl-2-phenyl-ethylidene]amino]oxymethyl]phenyl]-2-methoxy-imino-N-methyl-acetamides
CN107205390A (zh) 2015-01-29 2017-09-26 巴斯夫欧洲公司 除草的苯基吡啶类
US10420341B2 (en) 2015-01-30 2019-09-24 Basf Se Herbicidal phenylpyrimidines
WO2016120182A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Syngenta Participations Ag Pesticidally active amide heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
CN107207443A (zh) 2015-02-06 2017-09-26 巴斯夫欧洲公司 作为硝化抑制剂的吡唑化合物
EP3070079A1 (en) 2015-03-19 2016-09-21 Basf Se Herbicidal fluoromethanesulfonamides
EP3070080A1 (en) 2015-03-19 2016-09-21 Basf Se Herbicidal fluoromethanesulfonamides
JP6662901B2 (ja) 2015-03-27 2020-03-11 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺微生物性二環式複素環式誘導体
BR112017020457C8 (pt) 2015-03-31 2020-09-08 Basf Se composição, método para tratar plantas, controlar fungos fitopatogênicos e/ou crescimento indesejável de plantas e/ou infestação indesejável de insetos ou ácaros e/ou para regular o crescimento de plantas, e método para produzir uma composição
BR112017021450B1 (pt) 2015-04-07 2021-12-28 Basf Agrochemical Products B.V. Métodos de controle de pragas, método de melhoria da saúde vegetal e semente revestida
ES2806459T3 (es) 2015-04-24 2021-02-17 Syngenta Participations Ag Derivados policíclicos activos como plaguicidas con heterociclos con anillos de cinco miembros sustituidos con azufre
CN108040481B (zh) 2015-04-24 2020-10-30 先正达参股股份有限公司 具有硫取代的五元环杂环的杀有害生物活性多环衍生物
WO2016174042A1 (en) 2015-04-27 2016-11-03 BASF Agro B.V. Pesticidal compositions
MX2017014459A (es) 2015-05-12 2018-03-16 Basf Se Compuestos de tioeter como inhibidores de la nitrificacion.
EP3103798A1 (en) 2015-06-09 2016-12-14 Basf Se Herbicidal fluoromethanesulfonamides
US10798946B2 (en) 2015-06-16 2020-10-13 Basf Agrochemical Products B.V. Method for managing flea beetles of the family chrysomelidae in Brassica crops
JP2018524337A (ja) 2015-07-01 2018-08-30 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 硫黄含有置換基を有する有害生物防除に活性な四環式誘導体
WO2017001314A1 (en) 2015-07-01 2017-01-05 Syngenta Participations Ag Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur containing substituents
EP3111763A1 (en) 2015-07-02 2017-01-04 BASF Agro B.V. Pesticidal compositions comprising a triazole compound
PL3316692T3 (pl) 2015-07-02 2021-10-11 BASF Agro B.V. Kompozycje owadobójcze zawierające związek triazolowy
DK3319434T3 (da) 2015-07-10 2019-07-29 Basf Agro Bv Herbicidsammensætning, der omfatter cinmethylin og pethoxamid
AU2016294453B2 (en) 2015-07-10 2020-09-17 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and specific inhibitors of protoporphyrinogen oxidase
WO2017009054A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and metazachlor
JP6875368B2 (ja) 2015-07-10 2021-05-26 ビーエーエスエフ アグロ ベー．ブイ． シンメチリン及びアセトクロール又はプレチラクロールを含む除草剤組成物
AU2016292399B2 (en) 2015-07-10 2020-06-25 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and dimethenamid
EA201890267A1 (ru) 2015-07-10 2018-07-31 Басф Агро Б.В. Гербицидная композиция, содержащая метазахлор и хинолинкарбоновые кислоты
EP3162209A1 (en) 2015-10-27 2017-05-03 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and imazamox
SI3319433T1 (sl) 2015-07-10 2020-02-28 BASF Agro B.V. Herbicidni sestavek, ki obsega cinmetilin in inhibitorje sinteze lipidov ne-accaza specifične
CN107835639B (zh) 2015-07-10 2021-10-26 巴斯夫农业公司 包含环庚草醚和胺硝草的除草组合物
WO2017009142A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 BASF Agro B.V. Herbicidal composition comprising cinmethylin and specific pigment synthesis inhibitors
KR20180035888A (ko) 2015-08-12 2018-04-06 신젠타 파티서페이션즈 아게 살미생물 헤테로바이사이클릭 유도체
EP3135113A1 (en) 2015-08-31 2017-03-01 Basf Se Use of herbicidal compositions for controlling unwanted vegetation
WO2017050685A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Syngenta Participations Ag Pesticidally active polycyclic derivatives with 5-membered sulfur containing heterocyclic ring systems
BR112018005888A2 (pt) 2015-09-25 2018-10-16 Syngenta Participations Ag derivados heterocíclicos ativos em termos pesticidas com substituintes contendo enxofre.
EP3356343B1 (en) 2015-09-28 2020-03-18 Syngenta Participations AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
CN108137533A (zh) 2015-10-05 2018-06-08 巴斯夫欧洲公司 防治植物病原性真菌的吡啶化合物
WO2017067839A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives
WO2017067837A1 (en) 2015-10-23 2017-04-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives
EP3371177A1 (en) 2015-11-02 2018-09-12 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
EP3165094A1 (en) 2015-11-03 2017-05-10 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
US20180317490A1 (en) 2015-11-04 2018-11-08 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
EP3165093A1 (en) 2015-11-05 2017-05-10 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2017080870A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
EP3167716A1 (en) 2015-11-10 2017-05-17 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
CA3003794A1 (en) 2015-11-12 2017-05-18 Basf Se Herbicidal compositions comprising isoxazolo[5,4-b]pyridines
US20180354921A1 (en) 2015-11-13 2018-12-13 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2017081310A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
JP2018537457A (ja) 2015-11-19 2018-12-20 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 植物病原菌を駆除するための置換オキサジアゾール
MX2018006235A (es) 2015-11-19 2018-08-01 Basf Se Oxadiazoles sustituidos para combatir hongos fitopatogenos.
BR112018010347A2 (pt) 2015-11-23 2018-12-04 Syngenta Participations Ag derivados heterocíclicos ativos em termos pesticidas com substituintes contendo enxofre e ciclopropila
PL3380479T3 (pl) 2015-11-25 2023-05-08 Gilead Apollo, Llc Triazolowe inhibitory acc i ich zastosowania
AU2016361412A1 (en) 2015-11-25 2018-05-24 Gilead Apollo, Llc Pyrazole ACC inhibitors and uses thereof
EA201890949A1 (ru) 2015-11-25 2018-12-28 Джилид Аполло, Ллс СЛОЖНОЭФИРНЫЕ ИНГИБИТОРЫ АЦЕТИЛ-КоА-КАРБОКСИЛАЗЫ И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
EP3383849B1 (en) 2015-12-01 2020-01-08 Basf Se Pyridine compounds as fungicides
WO2017093120A1 (en) 2015-12-01 2017-06-08 Basf Se Pyridine compounds as fungicides
US10723695B2 (en) 2015-12-15 2020-07-28 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives
CN108473444A (zh) 2015-12-17 2018-08-31 巴斯夫欧洲公司 苯甲酰胺化合物及其作为除草剂的用途
US10750742B2 (en) 2015-12-22 2020-08-25 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
CA3010154A1 (en) 2016-01-22 2017-07-27 Basf Se Biodegradable polyester capsules comprising an aqueous core and a pesticide
WO2017134066A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
EP3202267A1 (en) 2016-02-05 2017-08-09 Basf Se Pesticidal mixtures
EP3205208A1 (en) 2016-02-09 2017-08-16 Basf Se Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or fusaricidins and chemical pesticides
EP3205209A1 (en) 2016-02-09 2017-08-16 Basf Se Mixtures and compositions comprising paenibacillus strains or metabolites thereof and other biopesticides
CN108713016B (zh) 2016-02-18 2021-10-08 先正达参股股份有限公司 杀有害生物活性吡唑衍生物
UY40429A (es) 2016-02-24 2023-10-13 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Compuestos antiparasitarios de isoxazolina, formulaciones inyectables de acción prolongada que los comprenden, métodos y usos de los mismos
CN108697087B (zh) 2016-03-10 2021-08-20 先正达参股股份有限公司 杀微生物的喹啉(硫代)羧酰胺衍生物
WO2017153200A1 (en) 2016-03-10 2017-09-14 Basf Se Fungicidal mixtures iii comprising strobilurin-type fungicides
BR112018070411A2 (pt) 2016-04-07 2019-02-05 Syngenta Participations Ag derivados heterocíclicos com substituintes contendo enxofre ativos em termos pesticidas
WO2017178408A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Syngenta Participations Ag Microbiocidal silicon containing aryl derivatives
EP3245872A1 (en) 2016-05-20 2017-11-22 BASF Agro B.V. Pesticidal compositions
WO2017202768A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Basf Se Herbicidal uracilpyrid
WO2017207368A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 BASF Agro B.V. Fungicidal compositions
CA3026316A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Basf Se Benzoxaborole compounds
EP3269246A1 (en) 2016-07-13 2018-01-17 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2018011112A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Basf Se Fungicidal mixtures comprising a carboxamide
BR112018076700A2 (pt) 2016-07-20 2019-04-02 Basf Se composições herbicida e seu uso e método de controle da vegetação indesejada
US11180470B2 (en) 2016-07-25 2021-11-23 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
CN109561685A (zh) 2016-07-25 2019-04-02 巴斯夫欧洲公司 除草的嘧啶化合物
WO2018019758A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
WO2018019721A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
WO2018019755A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
BR112018077111A2 (pt) 2016-07-26 2019-04-02 Basf Se uso de compostos de pirimidina, compostos de pirimidina, mistura herbicida, composições herbicidas, método para controlar vegetação indesejada e uso das composições
EP3490381A1 (en) 2016-07-27 2019-06-05 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
WO2018019767A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
WO2018019770A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
AU2017303138A1 (en) 2016-07-28 2019-01-03 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
EP3275877A1 (en) 2016-07-28 2018-01-31 Basf Se Herbicidal pyridine compounds
EP3506759A1 (en) 2016-09-01 2019-07-10 Basf Se Fungicidal mixtures comprising a formamidine
WO2018041729A2 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
WO2018050508A1 (en) 2016-09-13 2018-03-22 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2018054711A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Basf Se Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi
WO2018054721A1 (en) 2016-09-26 2018-03-29 Basf Se Pyridine compounds for controlling phytopathogenic harmful fungi
WO2018059997A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2018065182A1 (en) 2016-10-04 2018-04-12 Basf Se Reduced quinoline compounds as antifuni agents
WO2018069110A1 (en) 2016-10-10 2018-04-19 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2018069106A1 (en) 2016-10-10 2018-04-19 Basf Se Pesticidal mixture
BR122022025232B1 (pt) 2016-10-10 2023-10-31 Basf Se Mistura pesticida, composição pesticida, métodos para controlar pragas fitopatogênicas, para melhorar a saúde de plantas e para a proteção do material de propagação vegetal contra pragas e material de propagação vegetal
US20190307127A1 (en) 2016-10-10 2019-10-10 Basf Se Pesticidal Mixtures
WO2018073110A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Basf Se Quinoline compounds as fungicides
BR112019008492B1 (pt) 2016-10-27 2024-01-30 Syngenta Participations Ag Compostos derivados heterocíclicos ativos em termos pesticidas com substituintes contendo enxofre e hidroxilamina, composição pesticida, método para controle de pragas e método para a proteção de material de propagação de plantas do ataque por pragas
EP3541779B1 (en) 2016-11-15 2020-12-23 Syngenta Participations AG Microbiocidal phenylamidine derivatives
WO2018091389A1 (en) 2016-11-17 2018-05-24 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
WO2018095795A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Syngenta Participations Ag Pesticidally active polycyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2018095811A1 (en) 2016-11-28 2018-05-31 Basf Se Diaminotriazine compounds
EP3329777A1 (en) 2016-11-30 2018-06-06 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2018101824A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 Universiteit Van Amsterdam Plants comprising pathogen effector constructs
US10961248B2 (en) 2016-12-01 2021-03-30 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2018108612A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Basf Se Herbicidal compositions comprising isoxazolo[5,4-b]pyridines
EP3554242A1 (en) 2016-12-15 2019-10-23 Syngenta Participations AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
CN110072853B (zh) 2016-12-16 2023-07-25 巴斯夫欧洲公司 除草的苯基三唑啉酮类
EP3555050A1 (en) 2016-12-16 2019-10-23 Basf Se Pesticidal compounds
WO2018116072A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 Pi Industries Ltd. Heterocyclic compounds
EP3339297A1 (en) 2016-12-20 2018-06-27 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
EP3338552A1 (en) 2016-12-21 2018-06-27 Basf Se Use of a tetrazolinone fungicide on transgenic plants
WO2018134127A1 (en) 2017-01-23 2018-07-26 Basf Se Fungicidal pyridine compounds
US10820589B2 (en) 2017-02-01 2020-11-03 Basf Se Emulsifiable concentrate
BR112019014905A2 (pt) 2017-02-02 2020-03-03 Basf Se Método para controlar a vegetação indesejada, composição e uso do agente do mobilizador de solo
WO2018149754A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Basf Se Pyridine compounds
TWI793104B (zh) 2017-02-21 2023-02-21 瑞士商先正達合夥公司 具有含硫取代基的殺有害生物活性雜環衍生物
WO2018166822A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Basf Se Herbicidal azines
US10952436B2 (en) 2017-03-20 2021-03-23 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
WO2018177781A1 (en) 2017-03-28 2018-10-04 Basf Se Pesticidal compounds
WO2018178057A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives with improved plant safety properties
US11040962B2 (en) 2017-04-05 2021-06-22 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
US11142519B2 (en) 2017-04-05 2021-10-12 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
WO2018185187A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
US20200187500A1 (en) 2017-04-06 2020-06-18 Basf Se Pyridine compounds
WO2018189001A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Basf Se Fungicide mixtures for use in rice
US11109591B2 (en) 2017-04-24 2021-09-07 Taminco Bvba Single phase liquids of alkanolamine salts of dicamba
WO2018197315A1 (en) 2017-04-25 2018-11-01 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2018202540A1 (en) 2017-05-02 2018-11-08 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
JP7214657B2 (ja) 2017-05-08 2023-01-30 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 硫黄含有フェニル及びピリジル置換基を有するイミダゾピリミジン誘導体
WO2018206419A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Syngenta Participations Ag Microbiocidal heterobicyclic derivatives
WO2018215304A1 (en) 2017-05-22 2018-11-29 Syngenta Participations Ag Tetracyclic pyridazine sulphur containing compounds and their use as pesticides
EP3412150A1 (en) 2017-06-06 2018-12-12 Basf Se Mixtures of meptyldinocap with sdhi fungicides
AU2018283422A1 (en) 2017-06-14 2019-12-19 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
US11071300B2 (en) 2017-06-19 2021-07-27 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
AR112112A1 (es) 2017-06-20 2019-09-18 Basf Se Compuestos de benzamida y su uso como herbicidas
EP3641544B1 (en) 2017-06-23 2025-08-06 Basf Se Pesticidal mixtures comprising a pyrazole compound
CN110891949B (zh) 2017-07-05 2023-05-23 先正达参股股份有限公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性杂环衍生物
BR112019027320B1 (pt) 2017-07-05 2024-01-23 BASF Agro B.V. Misturas fungicidas, composição fungicida, métodos para controlar fungos fitopatogênicos prejudiciais, para melhorar a saúde de plantas, para a proteção de material de propagação de planta e semente revestida
WO2019007717A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 Basf Se PESTICIDE MIXTURES
WO2019007719A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 Basf Se PESTICIDE MIXTURES
EP3649128A1 (en) 2017-07-07 2020-05-13 Syngenta Participations AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
US11659837B2 (en) 2017-07-10 2023-05-30 Basf Se Mixtures comprising an urease inhibitor (UI) and a nitrification inhibitor such as 2-(3,4-dimethyl-1H-pyrazol-1-yl)succinic acid (DMPSA) or 3,4-dimethyl pyrazolium glycolate (DMPG)
EP3427587A1 (en) 2017-07-10 2019-01-16 Basf Se Pesticidal mixtures
AR112342A1 (es) 2017-07-21 2019-10-16 Basf Se Compuestos de benzamida y su uso como herbicidas
WO2019020540A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Basf Se PESTICIDE MIXTURES
EP3665167B1 (en) 2017-08-11 2022-11-30 Syngenta Participations AG Pesticidally active pyrazole derivatives
US11252963B2 (en) 2017-08-11 2022-02-22 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
AR112672A1 (es) 2017-08-11 2019-11-27 Syngenta Participations Ag Derivados de tiofeno activos como plaguicidas
AR112673A1 (es) 2017-08-11 2019-11-27 Syngenta Participations Ag Derivados de pirazol activos como plaguicidas
EP3447048A1 (en) 2017-08-23 2019-02-27 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
EP3675638A1 (en) 2017-08-29 2020-07-08 Basf Se Pesticidal mixtures
WO2019053016A1 (en) 2017-09-13 2019-03-21 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE DERIVATIVES OF QUINOLINE (THIO) CARBOXAMIDE
CN111148736A (zh) 2017-09-13 2020-05-12 先正达参股股份有限公司 杀微生物的喹啉（硫代）甲酰胺衍生物
ES2896598T3 (es) 2017-09-13 2022-02-24 Syngenta Participations Ag Derivados de quinolina (tio)carboxamida microbiocidas
EP3681866B1 (en) 2017-09-13 2022-01-05 Syngenta Participations AG Microbiocidal quinoline (thio)carboxamide derivatives
WO2019053015A1 (en) 2017-09-13 2019-03-21 Syngenta Participations Ag MICROBIOCIDE DERIVATIVES OF QUINOLINE (THIO) CARBOXAMIDE
ES2906980T3 (es) 2017-09-13 2022-04-21 Syngenta Participations Ag Derivados de quinolina (tio)carboxamida microbiocidas
BR112020004754A2 (pt) 2017-09-13 2020-09-15 Syngenta Participations Ag derivados de (tio)carboxamida de quinolina microbiocidas
AU2018332263B2 (en) 2017-09-18 2023-02-09 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2019057660A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Basf Se INDOLE AND AZAINDOLE COMPOUNDS HAVING 6-CHANNEL SUBSTITUTED ARYL AND HETEROARYL CYCLES AS AGROCHEMICAL FUNGICIDES
EP3692038A1 (en) 2017-10-06 2020-08-12 Syngenta Participations AG Pesticidally active pyrrole derivatives
US11459318B2 (en) 2017-10-06 2022-10-04 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrrole derivatives
WO2019076778A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Syngenta Participations Ag HETEROCYCLIC DERIVATIVES HAVING PESTICIDAL ACTIVITY HAVING SUBSTITUENTS CONTAINING SULFUR AND SULFONIMIDAMIDES
WO2019086474A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Syngenta Participations Ag Pesticidally active mesoionics heterocyclic compounds
CA3081961A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 Basf Se Tank-mix
ES3039446T3 (en) 2017-11-21 2025-10-21 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
EP3713418B1 (en) 2017-11-22 2021-08-04 Basf Se Benzoxaborole compounds
WO2019101551A1 (en) 2017-11-23 2019-05-31 Basf Se Herbicidal phenylethers
CA3080276A1 (en) 2017-11-23 2019-05-31 Basf Se Herbicidal pyridylethers
CA3080432A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
US11541428B2 (en) 2017-12-03 2023-01-03 Seedx Technologies Inc. Systems and methods for sorting of seeds
WO2019106641A2 (en) 2017-12-03 2019-06-06 Seedx Technologies Inc. Systems and methods for sorting of seeds
WO2019106639A1 (en) 2017-12-03 2019-06-06 Seedx Technologies Inc. Systems and methods for sorting of seeds
US10934265B2 (en) 2017-12-04 2021-03-02 Syngenta Participations Ag Microbiocidal phenylamidine derivatives
US20200392138A1 (en) 2017-12-13 2020-12-17 Syngenta Participations Ag Pesticidally active mesoionic heterocyclic compounds
WO2019121352A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
WO2019121373A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
US11758907B2 (en) 2017-12-20 2023-09-19 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for controlling harmful organisms in crops
WO2019121374A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
WO2019121408A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Herbicidal pyrimidine compounds
ES3039587T3 (en) 2017-12-21 2025-10-22 Basf Se Pesticidal compounds
WO2019122345A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
WO2019122347A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Basf Se N-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)-benzamide compounds and their use as herbicides
EP3508480A1 (en) 2018-01-08 2019-07-10 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
US11414438B2 (en) 2018-01-09 2022-08-16 Basf Se Silylethynyl hetaryl compounds as nitrification inhibitors
WO2019138018A1 (en) 2018-01-15 2019-07-18 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2019141552A1 (en) 2018-01-18 2019-07-25 Basf Se Herbicidal triazine compounds
WO2019150219A2 (en) 2018-01-30 2019-08-08 Pi Industries Ltd. Novel oxadiazoles
WO2019162309A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
WO2019162308A1 (en) 2018-02-21 2019-08-29 Basf Se Benzamide compounds and their use as herbicides
EP3530118A1 (en) 2018-02-26 2019-08-28 Basf Se Fungicidal mixtures
EP3530116A1 (en) 2018-02-27 2019-08-28 Basf Se Fungicidal mixtures comprising xemium
CA3089374A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Basf Se Use of alkoxypyrazoles as nitrification inhibitors
WO2019166252A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Basf Se Fungicidal mixtures comprising fenpropidin
EP3758491A1 (en) 2018-02-28 2021-01-06 Basf Se Use of pyrazole propargyl ethers as nitrification inhibitors
IL276745B2 (en) 2018-02-28 2023-10-01 Basf Se Use of N-functional alkoxy pyrazole compounds as nitrification inhibitors
EP3533331A1 (en) 2018-03-02 2019-09-04 Basf Se Fungicidal mixtures comprising pydiflumetofen
EP3533333A1 (en) 2018-03-02 2019-09-04 Basf Se Fungicidal mixtures comprising pydiflumetofen
EP3536150A1 (en) 2018-03-06 2019-09-11 Basf Se Fungicidal mixtures comprising fluxapyroxad
BR112020018403A2 (pt) 2018-03-09 2020-12-22 Pi Industries Ltd. Compostos heterocíclicoscomo fungicidas
EP3539384A1 (en) 2018-03-15 2019-09-18 Basf Se 3-components mixtures comprising fluxapyroxad
BR112020022659A2 (pt) 2018-05-08 2021-02-02 Syngenta Crop Protection Ag métodos de aplicação de um ou mais determinados compostos de heteroaril-1,2,4-triazol e heteroaril-tetrazol para o controle de danos em plantas, seu material de propagação e produtos derivados de plantas
EP3793360A4 (en) 2018-05-16 2022-02-16 University of Florida Research Foundation Methods and compositions for substituted 2,5-diketopiperazine analogs
WO2019219689A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfoximine containing substituents
WO2019229088A1 (en) 2018-05-30 2019-12-05 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2019229089A1 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
PY1943991A (es) 2018-06-06 2020-03-09 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos con sustituyentes que contienen azufre activos como plaguicidas
UA130471C2 (uk) 2018-06-06 2026-02-25 Сінгента Кроп Протекшн Аг Пестицидно активні гетероциклічні похідні із замісниками, що містять сульфоксимін
WO2020002472A1 (en) 2018-06-28 2020-01-02 Basf Se Use of alkynylthiophenes as nitrification inhibitors
PY1950234A (es) 2018-06-29 2020-08-25 Syngenta Participations Ag Compuestos de azol-amida pesticidamente activos
PL3817553T3 (pl) 2018-07-02 2022-12-19 Basf Se Mieszaniny szkodnikobójcze
WO2020007646A1 (en) 2018-07-02 2020-01-09 Basf Se Pesticidal mixtures
PY1953918A (es) 2018-07-13 2020-10-30 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos heteroatomáticos bicíclicos activos como plaguicidas
PL3826982T3 (pl) 2018-07-23 2024-04-02 Basf Se Zastosowanie podstawionych związków tiazolidynowych jako inhibitora nitryfikacji
PL3826983T3 (pl) 2018-07-23 2024-09-09 Basf Se Zastosowanie podstawionych 2-tiazolin jako inhibitorów nitryfikacji
WO2020025658A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
PY1960131A (es) 2018-08-07 2020-11-20 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos heteroatomáticos bicíclicos activos como pesticidas
WO2020030454A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Basf Se Use of fungicidal active compound i derivative and mixtures thereof in seed application and treatment methods
WO2020030754A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active mesoionic bicyclic heteroaromatic compounds
WO2020035565A1 (en) 2018-08-17 2020-02-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active mesoionic bicyclic heteroaromatic compounds
CN112601457A (zh) 2018-08-27 2021-04-02 巴斯夫欧洲公司 苯唑草酮的含水组合物
PY1974629A (es) 2018-09-13 2021-01-11 Syngenta Participations Ag Compuestos de azol-amida pesticidamente activos
PY1974248A (es) 2018-09-13 2020-08-21 Syngenta Participations Ag Compuestos de azol-amida pesticidamente activos
US11992012B2 (en) 2018-09-18 2024-05-28 Basf Se Diaminotriazine compounds
EP3853207B1 (en) 2018-09-19 2022-10-19 Syngenta Crop Protection AG Microbiocidal quinoline carboxamide derivatives
WO2020058010A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Basf Se Pesticidal mixtures comprising a mesoionic compound
AU2019348280A1 (en) 2018-09-28 2021-04-22 Basf Se Method of controlling pests by seed treatment application of a mesoionic compound or mixture thereof
US20210392895A1 (en) 2018-10-01 2021-12-23 Pi Industries Limited Novel oxadiazoles
PY1981410A (es) 2018-10-01 2020-04-07 Pi Industries Ltd Nuevos oxadiazoles
PY1980182A (es) 2018-10-02 2020-08-21 Syngenta Participations Ag Compuestos de benceno y azina-amida activos como plaguicidas
CN112839513A (zh) 2018-10-03 2021-05-25 巴斯夫欧洲公司 苯唑草酮微乳液组合物
WO2020070132A1 (en) 2018-10-06 2020-04-09 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives
US12012399B2 (en) 2018-10-06 2024-06-18 Syngenta Participations Ag Microbiocidal quinoline dihydro-(thiazine)oxazine derivatives
WO2020078794A1 (en) 2018-10-19 2020-04-23 Basf Se Ternary mixtures containing fenpropimorph, azoles and a multiside fungicide
PY1986700A (es) 2018-10-19 2020-08-28 Syngenta Participations Ag Compuestos de azol-amida pesticidamente activos
WO2020078795A1 (en) 2018-10-19 2020-04-23 Basf Se Ternary mixtures containing fenpropimorph, succinate dehydrogenase inhibitors and azoles
WO2020078797A1 (en) 2018-10-19 2020-04-23 Basf Se Ternary mixtures containing fenpropimorph, succinate dehydrogenase inhibitors and one other compound
TW202035404A (zh) 2018-10-24 2020-10-01 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含亞碸亞胺的取代基之殺有害生物活性雜環衍生物
EP3643175A1 (en) 2018-10-24 2020-04-29 Basf Se Ternary pesticidal mixtures containing metyltetraprole and fenpropimorph
EP3643705A1 (en) 2018-10-24 2020-04-29 Basf Se Pesticidal compounds
BR112021007905A2 (pt) 2018-11-02 2021-08-03 Nihon Nohyaku Co., Ltd. composição de controle de organismo prejudicial e método para uso da mesma
JP2022509019A (ja) 2018-11-05 2022-01-20 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 殺有害生物的に活性なアゾール－アミド化合物
US12459934B2 (en) 2018-11-28 2025-11-04 Basf Se Pesticidal compounds
AR117291A1 (es) 2018-12-14 2021-07-28 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos heterocíclicos de cianamida con actividad pesticida
WO2020120694A1 (en) 2018-12-14 2020-06-18 Syngenta Participations Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
EA202191587A1 (ru) 2018-12-18 2021-10-20 Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. Гербицидные комбинации
EP3897141A1 (en) 2018-12-18 2021-10-27 BASF Agrochemical Products B.V. Herbicidal combinations
WO2020126583A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicidal combinations
EA202191586A1 (ru) 2018-12-18 2021-10-19 Басф Агрокемикэл Продактс Б.В. Гербицидная композиция
EP3897137B1 (en) 2018-12-18 2025-07-30 BASF Agrochemical Products B.V. Herbicidal combinations
WO2020126582A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicidal combinations
GB201821036D0 (en) 2018-12-21 2019-02-06 Syngenta Participations Ag Nematicidal compositions
WO2020127345A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Syngenta Participations Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
JP2022515896A (ja) 2018-12-31 2022-02-22 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
WO2020141135A1 (en) 2018-12-31 2020-07-09 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
EP3680223A1 (en) 2019-01-10 2020-07-15 Basf Se Mixture comprising an urease inhibitor (ui) and a nitrification inhibitor (ni) such as an ni mixture comprising 2-(3,4-dimethyl-1h-pyrazol-1-yl)succinic acid (dmpsa) and dicyandiamide (dcd)
WO2020164994A1 (en) 2019-02-13 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
WO2020164993A1 (en) 2019-02-13 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyrazole derivatives
WO2020169526A1 (en) 2019-02-18 2020-08-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active cyanamide heterocyclic compounds
EP3696175A1 (en) 2019-02-18 2020-08-19 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active azole-amide compounds
EP3698632A1 (en) 2019-02-21 2020-08-26 Basf Se Pesticidal mixtures
EP3698633A1 (en) 2019-02-25 2020-08-26 Basf Se Pesticidal mixtures
EP3698634A1 (en) 2019-02-25 2020-08-26 Basf Se Pesticidal mixtures
TW202100015A (zh) 2019-02-28 2021-01-01 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含硫取代基之殺有害生物活性雜環衍生物
TW202045011A (zh) 2019-02-28 2020-12-16 瑞士商先正達農作物保護公司 具有含硫取代基之殺有害生物活性雜環衍生物
CN113825753A (zh) 2019-03-08 2021-12-21 先正达农作物保护股份公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性的杂环衍生物
ES2953140T3 (es) 2019-03-08 2023-11-08 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de azol-amida activos de manera plaguicida
CN113631552A (zh) 2019-03-20 2021-11-09 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物活性的唑酰胺化合物
US12552766B2 (en) 2019-03-20 2026-02-17 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active azole amide compounds
JP2022525809A (ja) 2019-03-22 2022-05-19 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺虫剤としてのｎ－［１－（５－ブロモ－２－ピリミジン－２－イル－１，２，４－トリアゾール－３－イル）エチル］－２－シクロプロピル－６－（トリフルオロメチル）ピリジン－４－カルボキサミド誘導体及び関連化合物
TWI853009B (zh) 2019-03-29 2024-08-21 瑞士商先正達農作物保護公司 殺有害生物活性之二-醯胺化合物
KR20210145788A (ko) 2019-04-01 2021-12-02 닛산 가가쿠 가부시키가이샤 피리다지논 화합물 및 제초제
KR20210149113A (ko) 2019-04-05 2021-12-08 신젠타 크롭 프로텍션 아게 살충 활성 디아진-아미드 화합물
UA128680C2 (uk) 2019-04-08 2024-09-25 Пі Індастріз Лімітед Оксадіазольні сполуки для контролю фітопатогенних грибів або попередження ураження ними
AR118612A1 (es) 2019-04-08 2021-10-20 Pi Industries Ltd Compuestos de oxadiazol para controlar o prevenir hongos fitopatogénicos
WO2020208509A1 (en) 2019-04-08 2020-10-15 Pi Industries Limited Novel oxadiazole compounds for controlling or preventing phytopathogenic fungi
MX2021012290A (es) 2019-04-11 2021-11-12 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de diazina-amida activos como pesticidas.
EP3730489A1 (en) 2019-04-25 2020-10-28 Basf Se Heteroaryl compounds as agrochemical fungicides
EP3744174A1 (en) 2019-05-27 2020-12-02 Basf Se Use of metyltetraprol and mixtures of metyltetraprol for combating phytopathogenic fungi on cotton
WO2020254530A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Syngenta Crop Protection Ag 7-sulfonyl-n-(1,3,4-thiadiazol-2-yl)-quinoxaline-6-carboxamide derivatives and the respective -benzimidazole-5-, -imidazo[4,5-b]pyridine-5-, -3h-furo[3,2b]pyridine-5-, -quinoline-2-, and -naphthalene-2-carboxamide derivatives as pesticides
WO2021009311A1 (en) 2019-07-17 2021-01-21 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
EP3766879A1 (en) 2019-07-19 2021-01-20 Basf Se Pesticidal pyrazole derivatives
AR119774A1 (es) 2019-08-19 2022-01-12 Pi Industries Ltd Compuestos de oxadiazol que contienen un anillo heteroaromático de 5 miembros para controlar o prevenir hongos fitopatogénicos
EP4017851A1 (en) 2019-08-23 2022-06-29 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active pyrazine-amide compounds
BR112022002280A2 (pt) 2019-09-03 2022-04-26 Basf Se Composição para controlar deriva de pulverização, composição aquosa, método para reduzir deriva de pulverização, uso da composição aquosa, e, kit de peças
UY38885A (es) 2019-09-20 2021-04-30 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de azetidinil-, pirrolidinil-,piperdinil- o piperazinil-piridinil carbonilo pesticidamente activos
US12503461B2 (en) 2019-09-20 2025-12-23 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur and sulfoximine containing substituents
AU2020372700A1 (en) 2019-11-01 2022-05-12 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
AR120374A1 (es) 2019-11-08 2022-02-09 Pi Industries Ltd Compuestos de oxadiazol que contienen anillos de heterociclilo fusionados para controlar o prevenir hongos fitopatogénicos
MX2022005893A (es) 2019-11-15 2022-06-14 Basf Corp Metodos de uso de una composicion que comprende un plaguicida anionico y un amortiguador.
ES3056809T3 (en) 2019-12-04 2026-02-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic amino compounds
WO2021122645A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active azole-amide compounds
WO2021130143A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 Basf Se Enzyme enhanced root uptake of agrochemical active compound
US20230120895A1 (en) 2019-12-31 2023-04-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
AR120982A1 (es) 2020-01-06 2022-04-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
WO2021144354A1 (en) 2020-01-15 2021-07-22 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active bicyclic heteroaromatic compounds
BR112022013894A2 (pt) 2020-01-16 2023-01-10 Basf Se Mistura, composição agroquímica, método para aumentar a eficiência de uso de fertilizante e uso da mistura
CA3163984A1 (en) 2020-01-16 2021-07-22 Basf Se Mixtures comprising nitrification inhibitors and carriers
WO2021148330A1 (en) 2020-01-20 2021-07-29 Syngenta Crop Protection Ag Method for reducing insect-vectored virus infections in grass plants
GB202000994D0 (en) 2020-01-23 2020-03-11 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
BR112022014313A2 (pt) 2020-01-24 2022-09-20 Syngenta Crop Protection Ag Compostos heteroaromáticos bicíclicos fundidos ativos em termos pesticidas
JP2023513047A (ja) 2020-01-30 2023-03-30 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物的に有効な縮合二環式芳香族複素環式アミノ化合物
CN115210218B (zh) 2020-02-11 2025-05-16 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物活性的环胺化合物
CN115209737B (zh) 2020-02-27 2025-08-15 先正达农作物保护股份公司 杀真菌组合物
JP2023515979A (ja) 2020-02-27 2023-04-17 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物的に活性なジアジン－ビスアミド化合物
WO2021175822A1 (en) 2020-03-02 2021-09-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally amidine-substituted benzoic acid amide compounds
WO2021180598A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
BR112022018267A2 (pt) 2020-03-13 2022-10-25 Syngenta Crop Protection Ag Métodos de controle ou prevenção de infestação de plantas pelo microrganismo fitopatogênico corynespora cassiicola
EP4117438A1 (en) 2020-03-13 2023-01-18 Syngenta Crop Protection AG Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
WO2021180976A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola, cercospora sojina and/or cercospora kikuchii
US20230112306A1 (en) 2020-03-13 2023-04-13 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of soybean plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
BR112022018280A2 (pt) 2020-03-13 2022-10-25 Syngenta Crop Protection Ag Métodos de controle ou prevenção de infestação de plantas pelo microrganismo fitopatogênico corynespora cassiicola
WO2021197885A1 (en) 2020-04-01 2021-10-07 Basf Se Ternary mixtures containing fenpropimorph, azoles and strobilurins
BR112022019796A2 (pt) 2020-04-01 2022-11-16 Basf Se Misturas fungicidas, composição pesticida, uso da mistura e método para controlar pragas fitopatogênicas
BR112022020134A2 (pt) 2020-04-06 2022-11-22 Basf Corp Composição agroquímica aquosa, métodos para produzir a composição agroquímica, para controlar vegetação indesejada e para reduzir a deriva de pulverização e composição adjuvante
CN115443273A (zh) 2020-04-08 2022-12-06 先正达农作物保护股份公司 杀微生物喹啉二氢-(噻嗪)噁嗪衍生物
AR121734A1 (es) 2020-04-08 2022-07-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbicidas de tipo dihidropirrolopirazina de quinolina
AR121733A1 (es) 2020-04-08 2022-07-06 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbiocidas de tipo dihidro-(tiazina)oxazina de quinolina
WO2021213929A1 (en) 2020-04-20 2021-10-28 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active substituted 1,3-dihydro-2h-imidazo[4,5-c]pyridin-2-one derivatives with sulfur containing substituents
WO2021219513A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 Basf Se Pesticidal compounds
JP7746286B2 (ja) 2020-04-30 2025-09-30 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
BR112022022240A2 (pt) 2020-05-04 2022-12-20 Syngenta Crop Protection Ag Composições fungicidas
WO2021224409A1 (en) 2020-05-06 2021-11-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
AR122199A1 (es) 2020-06-04 2022-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
PY2143082A (es) 2020-06-04 2022-02-23 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
PY2142066A (es) 2020-06-04 2022-05-09 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AR122485A1 (es) 2020-06-04 2022-09-14 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AR122187A1 (es) 2020-06-04 2022-08-24 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
EP4161268A1 (en) 2020-06-04 2023-04-12 Syngenta Crop Protection AG Fungicidal compositions
US20230232821A1 (en) 2020-06-15 2023-07-27 Basf Se A stable, solvent-free, self-emulsifiable concentrate
AU2021305962A1 (en) 2020-07-06 2023-03-09 Pi Industries Ltd. A pesticidally active mixture comprising thietanyloxy compound, oxides or salts thereof
WO2022013417A1 (en) 2020-07-17 2022-01-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
WO2022017975A1 (en) 2020-07-18 2022-01-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
AR123052A1 (es) 2020-07-27 2022-10-26 Pi Industries Ltd Una mezcla pesticidamente activa que comprende el compuesto de pirazolopiridina antranilamida, sus óxidos o sales de los mismos
TW202226947A (zh) 2020-08-18 2022-07-16 印度商皮埃企業有限公司 用於對抗植物病原真菌的新型雜環化合物
US20240026372A1 (en) * 2020-08-31 2024-01-25 Basf Se Plant yield improvement
KR20230058667A (ko) 2020-08-31 2023-05-03 신젠타 크롭 프로텍션 아게 황 함유 치환체를 갖는 살충 활성 헤테로사이클릭 유도체
BR112023003835A2 (pt) 2020-09-01 2023-04-04 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos com substituintes contendo enxofre ativos em termos pesticidas
CN116075226A (zh) 2020-09-02 2023-05-05 先正达农作物保护股份公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性的杂环衍生物
EP4208447A1 (en) 2020-09-02 2023-07-12 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
UY39411A (es) 2020-09-09 2022-04-29 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de indazolil pirazolo[3,4-c] piridina pesticídicamente activos con sustituyentes que contienen azufre
UY39423A (es) 2020-09-15 2022-03-31 Pi Industries Ltd Nuevos compuestos de picolinamida para combatir hongos fitopatógenos
AR123502A1 (es) 2020-09-15 2022-12-07 Pi Industries Ltd Nuevos compuestos de picolinamida para combatir hongos fitopatógenos
US20230371512A1 (en) 2020-10-05 2023-11-23 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2022073797A1 (en) 2020-10-08 2022-04-14 Basf Se Mixtures containing cyclobutrifluram
UY39505A (es) 2020-11-09 2022-06-30 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones de mezcla fungicida que comprenden un compuesto derivado de la picolinamida como ingrediente activo
WO2022101265A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
EP4255189B1 (en) 2020-12-01 2024-10-30 Basf Se Mixtures containing metarylpicoxamid
WO2022128554A1 (en) 2020-12-15 2022-06-23 Basf Se Mixtures containing n-methoxy-n-[[4-[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]phenyl]methyl]cyclopropanecarboxamide
US20240049725A1 (en) 2020-12-21 2024-02-15 Syngenta Crop Protection Ag Compositions comprising cyclotides and other insecticidal peptides and uses thereof
WO2022136440A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidal hexatoxin polypeptides and methods of use thereof
EP4018830A1 (en) 2020-12-23 2022-06-29 Basf Se Pesticidal mixtures
PY2203251A (es) 2021-01-21 2023-01-18 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
JP2024506253A (ja) 2021-01-23 2024-02-13 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物的に有効な芳香族複素環式化合物
AU2022212381A1 (en) 2021-01-27 2023-08-10 Basf Se Diaminotriazine compounds
KR20230137323A (ko) 2021-01-27 2023-10-04 바스프 에스이 디아미노트리아진 화합물
EP4288398A1 (en) 2021-02-02 2023-12-13 Basf Se Synergistic action of dcd and alkoxypyrazoles as nitrification inhibitors
WO2022171709A1 (en) 2021-02-11 2022-08-18 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
EP4294187A1 (en) 2021-02-19 2023-12-27 Syngenta Crop Protection AG Insect and acarina pest control
US20240315245A1 (en) 2021-02-19 2024-09-26 Syngenta Crop Protection Ag Insect and acarina pest control
CN114958832B (zh) * 2021-02-25 2024-05-24 中国农业科学院棉花研究所 一种同步改良棉花纤维长度和强度性状的分子育种方法
CN116887676A (zh) 2021-02-26 2023-10-13 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物组合物
AR124935A1 (es) 2021-03-01 2023-05-24 Syngenta Crop Protection Ag Formulaciones plaguicidas
WO2022200364A1 (en) 2021-03-25 2022-09-29 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
EP4066643A1 (en) 2021-03-30 2022-10-05 Basf Se Pesticidal mixtures
BR112023019828A2 (pt) 2021-03-30 2023-11-07 Syngenta Crop Protection Ag Compostos de amina cíclica pesticidamente ativos
PY2222114A (es) 2021-03-31 2023-01-19 Syngenta Crop Protection Ag Derivados microbiocidas de quinolin/quinoxalin-benzotiazina
AR125342A1 (es) 2021-04-16 2023-07-05 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de amina cíclica activos como plaguicidas
CA3214731A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 Matthias Weiss Microbiocidal quinoline/quinoxaline isoquinoline derivatives
UY39755A (es) 2021-05-05 2022-11-30 Pi Industries Ltd Nuevos compuestos heterocíclicos condensados para combatir hongos fitopatógenos.
JP2024517342A (ja) 2021-05-14 2024-04-19 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 種子処理組成物
JP2024516912A (ja) 2021-05-14 2024-04-17 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 昆虫、ダニ目及び線虫有害生物の防除
CA3219022A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Barbara Nave Use of ethynylpyridine compounds as nitrification inhibitors
EP4341248A1 (en) 2021-05-21 2024-03-27 Basf Se Use of an n-functionalized alkoxy pyrazole compound as nitrification inhibitor
EP4094579A1 (en) 2021-05-28 2022-11-30 Basf Se Pesticidal mixtures comprising metyltetraprole
CA3221102A1 (en) 2021-06-02 2022-12-08 Michel Muehlebach Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfoximine containing substituents
US20240287047A1 (en) 2021-06-09 2024-08-29 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active diazine-amide compounds
BR112023027004A2 (pt) 2021-06-21 2024-03-12 Basf Se Estrutura de metal-orgânica, uso da estrutura de metal-orgânica, composição para uso na redução da nitrificação, mistura agroquímica e métodos de redução da nitrificação, de tratamento de fertilizante ou composição de fertilizante e de preparação de uma estrutura de metal-orgânica
WO2022268813A1 (en) 2021-06-24 2022-12-29 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2022268815A1 (en) 2021-06-24 2022-12-29 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
KR20240024926A (ko) 2021-06-24 2024-02-26 신젠타 크롭 프로텍션 아게 살충제로서의 2-[3-[1[(퀴나졸린-4-일)아미노]에틸]피라진-2-일]티아졸-5-카르보니트릴 유도체 및 유사한 화합물
WO2023280999A1 (en) 2021-07-07 2023-01-12 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023006634A1 (en) 2021-07-27 2023-02-02 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
EP4377312A1 (en) 2021-07-29 2024-06-05 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally active fused bicyclic heteroaromatic compounds
EP4380363A1 (en) 2021-08-05 2024-06-12 Syngenta Crop Protection AG Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
US20250145640A1 (en) 2021-08-10 2025-05-08 Syngenta Crop Protection Ag 2,2-difluoro-5h-[1,3]dioxolo[4,5-f]isoindol-7-one derivatives as pesticides
CN117813005A (zh) 2021-08-13 2024-04-02 先正达农作物保护股份公司 杀真菌组合物
IL309501A (en) 2021-08-19 2024-02-01 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling pests resistant to diamide and compounds therefor
AR127103A1 (es) 2021-09-22 2023-12-20 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
WO2023046853A1 (en) 2021-09-23 2023-03-30 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
KR20240089416A (ko) 2021-10-14 2024-06-20 신젠타 크롭 프로텍션 아게 이미다조[1,2-a]피리딘 유도체
UY39992A (es) 2021-10-25 2023-05-15 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos activos como plaguicidas con sustituyentes que contienen azufre
US20250042875A1 (en) 2021-10-27 2025-02-06 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridazinone compounds
AR127682A1 (es) 2021-11-19 2024-02-21 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas de aureobasidina
UY40040A (es) 2021-11-26 2023-06-15 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas que comprenden compuestos de carbamato y flufenoxadiazam o metarylpicoxamid
WO2023105064A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
US20250049033A1 (en) 2021-12-10 2025-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridazinone compounds
WO2023105065A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023110710A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
EP4197333A1 (en) 2021-12-15 2023-06-21 Syngenta Crop Protection AG Method for controlling diamide resistant pests & compounds therefor
EP4198023A1 (en) 2021-12-16 2023-06-21 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
AR127972A1 (es) 2021-12-17 2024-03-13 Pi Industries Ltd Novedosos compuestos de piridina carboxamida bicíclica sustituida fusionada para combatir hongos fitopatogénicos
WO2023111215A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyridine-substituted benzothiazine derivatives
US20250143299A1 (en) 2022-02-01 2025-05-08 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests in vegetables
WO2023148343A1 (en) 2022-02-04 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
UY40139A (es) 2022-02-07 2023-08-31 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de imidazo[1,2-a]piridin-2-il]-1-pirazolo[3,4-c]piridina activos como pesticidas con susti
WO2023148368A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
JP2025505242A (ja) 2022-02-10 2025-02-21 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 昆虫、ダニ目及び線虫有害生物の防除
US20250197358A1 (en) 2022-02-17 2025-06-19 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
UY40202A (es) 2022-04-01 2023-10-31 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de pirazolopiridina activos como pesticidas con sustituyentes que contienen azufre
WO2023203038A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 Syngenta Crop Protection Ag Insect, acarina and nematode pest control
WO2023203066A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Basf Se Synergistic action as nitrification inhibitors of dcd oligomers with alkoxypyrazole and its oligomers
US20250344697A1 (en) 2022-04-26 2025-11-13 Syngenta Crop Protection Ag Enantiomerically enriched fungicides for the control of resistant phytopathogenic fungi
AR129265A1 (es) 2022-05-12 2024-08-07 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de alcoxi-heteroaril-carboxamida o tioamida
JP2025520650A (ja) 2022-06-21 2025-07-03 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物的に活性な縮合二環式芳香族複素環式化合物
AR129873A1 (es) 2022-07-11 2024-10-09 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
WO2024022910A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Syngenta Crop Protection Ag 1-[1-[2-(pyrimidin-4-yl)-1,2,4-triazol-3-yl]ethyl]-3-[2,4-dichloro-5-phenyl]urea derivatives and similar compounds as pesticides
CA3263381A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Basf Se PYRAZOLO PESTICIDE COMPOUNDS
WO2024033374A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Syngenta Crop Protection Ag Novel arylcarboxamide or arylthioamide compounds
CN119768055A (zh) 2022-08-16 2025-04-04 先正达农作物保护股份公司 杀真菌组合物
JP2025532590A (ja) 2022-09-16 2025-10-01 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物的に活性な環状アミン化合物
UY40448A (es) 2022-09-30 2024-04-30 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas adecuadas para el control de enfermedades causadas por hongos fitopatógenos, especialmente Phakopsora pachyrhizi, en plantas útiles, especialmente soja
JP2026512642A (ja) 2022-10-25 2026-04-20 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 硫黄含有置換基を有する殺有害生物的に活性な複素環式誘導体
WO2024089216A1 (en) 2022-10-27 2024-05-02 Syngenta Crop Protection Ag Novel sulfur-containing heteroaryl carboxamide compounds
CN120112528A (zh) 2022-10-31 2025-06-06 先正达农作物保护股份公司 具有含硫取代基的杀有害生物活性的杂环衍生物
WO2024110554A1 (en) 2022-11-23 2024-05-30 Syngenta Crop Protection Ag N-[(1 -[2-[6-(pyridazin-3-yl]-1,2,4-triazol-3-yl]ethyl]-quinazolin-4-amine and n-[1-[3-(6-(pyridazin-3-yl)pyrazin-2-yl]ethyl]-8-quinazolin-4-amine derivatives as pesticides
CN120225508A (zh) 2022-11-24 2025-06-27 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物活性的环胺化合物
WO2024121262A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal compound based on pyrazole derivatives
WO2024121261A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal compound based on pyrazole derivatives
WO2024121264A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal compound based on pyrazole derivatives
WO2024121263A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidal compound based on pyrazole derivatives
WO2024126388A1 (en) 2022-12-12 2024-06-20 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulfur containing substituents
JP2025541335A (ja) 2022-12-14 2025-12-18 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト イミダゾ［１，２－ａ］ピリジン誘導体
JP2026500298A (ja) 2022-12-15 2026-01-06 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物剤として有用である新規な二環式カルボキサミド化合物
AU2023393591A1 (en) 2022-12-16 2025-06-05 Syngenta Crop Protection Ag Benzimidazole derivatives
WO2024133426A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Syngenta Crop Protection Ag Method for controlling diamide resistant pests and compounds therefor
WO2024133551A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridazine compounds
AR131541A1 (es) 2023-01-07 2025-04-09 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de carboxamida novedosos
CN120897668A (zh) 2023-01-10 2025-11-04 先正达农作物保护股份公司 杀真菌组合物
PY2404178A (es) 2023-01-23 2024-11-12 Syngenta Crop Protection Ag Derivados heterocíclicos activos como pesticidas con sustituyentes que contienen azufre
JP2026506646A (ja) 2023-02-13 2026-02-25 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物的に活性な二環式化合物
CN120882309A (zh) 2023-03-14 2025-10-31 先正达农作物保护股份公司 对杀昆虫剂具有抗性的有害生物的控制
WO2025201636A1 (en) 2023-03-31 2025-10-02 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
CN120957990A (zh) 2023-04-13 2025-11-14 先正达农作物保护股份公司 咪唑并[1,2-a]吡啶衍生物
WO2024213651A1 (en) 2023-04-13 2024-10-17 Syngenta Crop Protection Ag Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives
AR132351A1 (es) 2023-04-13 2025-06-18 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de imidazo[1,2-a]pirazina
AR132352A1 (es) 2023-04-13 2025-06-18 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de imidazo[1,2-a]pirazina
CN121002016A (zh) 2023-04-13 2025-11-21 先正达农作物保护股份公司 咪唑并[1,2-a]吡啶衍生物
AR132354A1 (es) 2023-04-13 2025-06-18 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de pirazolo[1,5-a]piridina
AR132353A1 (es) 2023-04-13 2025-06-18 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de pirazolo[1,5-a]piridina
TW202446263A (zh) 2023-04-13 2024-12-01 瑞士商先正達農作物保護股份公司 殺真菌組成物
PY2426847A (es) 2023-04-13 2025-03-20 Syngenta Crop Protection Ag Derivados bicíclicos de imidazo
WO2025214612A1 (en) 2023-04-14 2025-10-16 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
WO2024218261A1 (en) 2023-04-18 2024-10-24 Syngenta Crop Protection Ag Method and composition for treating plant propagation materials
WO2024217995A1 (en) 2023-04-20 2024-10-24 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active dihydropyridinone derivatives
EP4701419A1 (en) 2023-04-28 2026-03-04 Syngenta Crop Protection AG Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
EP4720053A1 (en) 2023-05-25 2026-04-08 Basf Se Lactam pesticidal compounds
EP4467535A1 (en) 2023-05-25 2024-11-27 Basf Se Lactam pesticidal compounds
WO2025261608A1 (en) 2023-06-29 2025-12-26 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
WO2026002399A1 (en) 2023-07-07 2026-01-02 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
PY2457454A (es) 2023-07-21 2025-04-22 Syngenta Crop Protection Ag Derivados de bencimidazol
WO2025022007A1 (en) 2023-07-27 2025-01-30 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active quinazoline compounds
WO2025022008A1 (en) 2023-07-27 2025-01-30 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active quinazoline compounds
WO2026017247A1 (en) 2023-07-28 2026-01-22 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
CN121568607A (zh) 2023-08-04 2026-02-24 先正达农作物保护股份公司 控制或预防植物被植物病原性微生物多主棒孢菌侵染的方法
WO2025031989A1 (en) 2023-08-04 2025-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
WO2025031990A1 (en) 2023-08-04 2025-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of soybean plants by the phytopathogenic microorganism corynespora cassiicola
AR133450A1 (es) 2023-08-07 2025-10-01 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
PY2467000A (es) 2023-08-07 2025-05-23 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
WO2025032129A1 (en) 2023-08-08 2025-02-13 Syngenta Crop Protection Ag Novel aminoindane and aminotetraline compounds
IL326323A (en) 2023-08-30 2026-04-01 Syngenta Crop Protection Ag Insecticidally active oxoindole compounds
CN121773110A (zh) 2023-08-31 2026-03-31 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物活性苯并异噻唑化合物
CN121843932A (zh) 2023-08-31 2026-04-10 先正达农作物保护股份公司 杀有害生物活性吲唑化合物
AR133732A1 (es) 2023-09-08 2025-10-29 Pi Industries Ltd Nuevos compuestos de 1,2,4-oxadiazoles como fungicida
WO2025056674A1 (en) 2023-09-14 2025-03-20 Basf Se Nitrification inhibitor formulation to prevent crystallization on solid mineral fertilizer
TW202513532A (zh) 2023-09-15 2025-04-01 瑞士商先正達農作物保護股份公司 用於製備鏡像異構物富集的脂肪族胺之方法
WO2025068511A1 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
AR134032A1 (es) 2023-10-04 2025-11-26 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para el control de la infestación de plantas por insectos
AR134019A1 (es) 2023-10-04 2025-11-26 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por insectos
AR133996A1 (es) 2023-10-04 2025-11-19 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por insectos
PY2486159A (es) 2023-10-04 2025-04-29 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por hongos fitopatógenos
AR133997A1 (es) 2023-10-04 2025-11-19 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por insectos
AR133995A1 (es) 2023-10-04 2025-11-19 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por hongos fitopatógenos
AR134011A1 (es) 2023-10-04 2025-11-26 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por hongos fitopatógenos
PY2485811A (es) 2023-10-04 2025-07-22 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y metodos para controlar la infestacion de plantas por insectos
AR134020A1 (es) 2023-10-04 2025-11-26 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones y métodos para controlar la infestación de plantas por insectos
PY2494082A (es) 2023-10-26 2025-05-05 Syngenta Crop Protection Ag Composiciones fungicidas
AU2024366771A1 (en) 2023-10-27 2026-04-16 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active cyclic amine compounds
WO2025104032A1 (en) 2023-11-14 2025-05-22 Syngenta Crop Protection Ag Novel carboxamide compounds
WO2025109114A1 (en) 2023-11-24 2025-05-30 Syngenta Crop Protection Ag Novel carboxamide compounds
WO2025114133A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2025114531A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Basf Se Carbamate-based solvents for agrochemical applications
WO2025132349A1 (en) 2023-12-19 2025-06-26 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active quinazoline compounds
WO2025132828A1 (en) 2023-12-20 2025-06-26 Basf Se Sulfoxides for agrochemical applications
WO2025132754A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active quinazoline compounds
PY24113579A (es) 2023-12-21 2025-07-30 Syngenta Crop Protection Ag Compuestos de quinazolina con actividad plaguicida
PY24116120A (es) 2024-01-03 2025-07-30 Pi Industries Ltd Compuestos de pirazol para combatir hongos fitopatógenos
PY24116080A (es) 2024-01-03 2025-08-04 Pi Industries Ltd Amidas heterociclicas biciclicas para combatir hongos fitopatógenos
WO2025149637A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Syngenta Crop Protection Ag Novel carboxamide compounds
PY2501648A (es) 2024-01-12 2025-10-31 Syngenta Crop Protection Ag Nuevos compuestos de carboxamida
TW202539512A (zh) 2024-03-20 2025-10-16 瑞士商先正達農作物保護股份公司 硫代雙環衍生物
WO2025219337A1 (en) 2024-04-15 2025-10-23 Syngenta Crop Protection Ag Use of strigolactone derivatives and analogues as nitrification inhibitors
WO2025247783A1 (en) 2024-05-29 2025-12-04 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active dihydro-benzoxazinone compounds
WO2025248032A1 (en) 2024-05-31 2025-12-04 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active indazole compounds
WO2025252732A1 (en) 2024-06-04 2025-12-11 Syngenta Crop Protection Ag Nitrogen-containing 6-membered bicyclic derivatives with microbiocidal activity
WO2025252553A1 (en) 2024-06-04 2025-12-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
WO2025252556A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
WO2025252786A1 (en) 2024-06-05 2025-12-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidal compositions
WO2025252655A1 (en) 2024-06-06 2025-12-11 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active pyridopyrimidone compounds
WO2025257023A1 (en) 2024-06-12 2025-12-18 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2025257024A1 (en) 2024-06-12 2025-12-18 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2025256333A1 (en) 2024-06-13 2025-12-18 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active aminoheterocycle derivatives
WO2025257413A1 (en) 2024-06-13 2025-12-18 Syngenta Crop Protection Ag Pecticidally active dihydroazole derivatives
WO2025257072A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Syngenta Crop Protection Ag Pesticidally active 2-oxobenzimidazole compounds
EP4667451A1 (en) 2024-06-21 2025-12-24 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
WO2026008750A1 (en) 2024-07-05 2026-01-08 Syngenta Crop Protection Ag Novel carboxamide compounds
WO2026022001A1 (en) 2024-07-25 2026-01-29 Syngenta Crop Protection Ag Composition
EP4692056A1 (en) 2024-08-06 2026-02-11 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
EP4691242A1 (en) 2024-08-06 2026-02-11 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
WO2026037928A1 (en) 2024-08-16 2026-02-19 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling or preventing infestation of plants by the phytopathogenic microorganism phyllachora maydis
EP4703353A1 (en) 2024-09-03 2026-03-04 Syngenta Crop Protection AG Pesticidally-active 2,2-dihalocyclopropyl compounds
WO2026073866A1 (en) 2024-10-01 2026-04-09 Syngenta Crop Protection Ag Methods of controlling an insect of the family pentatomidae
WO2026073570A1 (en) 2024-10-01 2026-04-09 Syngenta Crop Protection Ag Composition
WO2026078083A1 (en) 2024-10-11 2026-04-16 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0590301A2 (en) * 1986-07-25 1994-04-06 Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College Method for protecting plants from disease and infestation by gene insertion, and vectors and plant cells containing said genes
AU1626288A (en) * 1987-04-02 1988-11-02 Genelabs Incorporated Equal-abundance transcript composition and method
ES2074999T3 (es) * 1987-05-20 1995-10-01 Ciba Geigy Ag Plantas de zea mays y plantas de zea mays transgenicas regeneradas de protoplastos o celulas derivadas de protoplastos.
ZA885916B (en) * 1987-09-15 1989-04-26 Gen Hospital Corp Pathogenesis-related proteins in plants
PT89915B (pt) * 1988-03-08 1994-10-31 Ciba Geigy Ag Processo para a preparacao de sequencias de dna regulaveis quimicamente
WO1990007001A1 (en) * 1988-12-16 1990-06-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Overexpression of chitinase in transgenic plants
EP0418695A1 (de) * 1989-09-13 1991-03-27 Ciba-Geigy Ag Regulatorische DNA-Sequenz

Also Published As

Publication number Publication date
EP0392225A3 (en) 1991-09-25
HU901820D0 (en) 1990-07-28
CA2012778A1 (en) 1990-09-24
EP0392225A2 (en) 1990-10-17
DE69034081D1 (de) 2003-07-03
DK0392225T3 (da) 2003-09-22
KR100212691B1 (ko) 1999-08-02
KR900014597A (ko) 1990-10-24
EP0392225B1 (en) 2003-05-28
DE69034081T2 (de) 2004-02-12
HUT60770A (en) 1992-10-28
NZ233053A (en) 1993-10-26
AU5218390A (en) 1990-09-27
ES2199931T3 (es) 2004-03-01
IL93844A0 (en) 1990-12-23
ATE241699T1 (de) 2003-06-15
IL93844A (en) 2004-05-12
AU642865B2 (en) 1993-11-04
CA2012778C (en) 2005-08-09

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