ES2200185T3 - Producto alimenticio congelado con peptidos anticongelantes. - Google Patents

Producto alimenticio congelado con peptidos anticongelantes.

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Abstract

PROCESO PARA LA PRODUCCION DE UN PRODUCTO ALIMENTICIO CONGELADO QUE COMPRENDE AFP, EN EL CUAL SE ELIGEN LAS CONDICIONES DE TAL MANERA QUE LOS CRISTALES DE HIELO EN EL PRODUCTO TIENEN UNA RELACION DE ASPECTO COMPRENDIDA ENTRE 1,1 Y 1,9.

Description

Producto alimenticio congelado con péptidos anticongelantes.
Campo técnico de la invención
Esta invención hace trata de un procedimiento para la preparación de un producto alimenticio que contiene AFPs y de productos alimenticios que contienen AFPs.
Antecedentes de la invención
Se ha sugerido que los péptidos anticongelantes (AFPs) mejoran la tolerancia a la congelación de los productos alimenticios.
Se han descrito proteínas anticongelantes en la bibliografía, véase, por ejemplo, por Marilyn Griffith y K. Vanya Ewart en Biotechnology Advances, Vol 13, Núm. 3, páginas 375-402, 1995. Las propiedades anticongelantes generalmente poseen una o más de las siguientes cualidades: histéresis térmica, inhibición de la recristalización del hielo, control de la forma de los cristales de hielo e interacción con nucleadores de hielo.
La histéresis térmica es la propiedad mejor conocida de los AFPs y esta propiedad se usa normalmente para comprobar la presencia de AFPs. La histéresis térmica resulta de una disminución de la temperatura aparente de congelación de una disolución que contiene AFP activo con histéresis térmica sin afectar a la temperatura de fusión. La identificación de las fuentes de AFP mediante ensayos de histéresis térmica se describe ampliamente en la bibliografía, véase por ejemplo, por John G. Duman en Cryobiology 30, 322-328 (1993).
La inhibición de la recristalización del hielo es otra propiedad de los AFPs. También se conoce esta actividad como supresión del crecimiento del cristal de hielo. Esta propiedad puede ser comprobada mediante la comparación en un determinado punto en el tiempo del tamaño del cristal de hielo de los cristales en presencia de AFP y en ausencia de AFP. La aplicación de este procedimiento en el control de los AFPs en peces se describe en la patente de EE.UU. 5.118.792 (DNA Plant Technology Corporation).
Una tercera propiedad de los AFPs es su capacidad de influir en la forma de los cristales de hielo. Esta propiedad procede de la unión selectiva de los AFPs a ciertas caras del cristal de hielo y, por lo tanto, limita el crecimiento del cristal en ciertas direcciones. La presencia de cristales de hielo que tienen una forma de bipirámide hexagonal se considera entonces indicativa de la presencia de AFPs. Este procedimiento, por ejemplo, está descrito para comprobar la actividad de los AFPs extracelulares del centeno de invierno en el documento WO 92/22581 (Universidad de Waterloo).
Una cuarta propiedad de los AFPs es su capacidad de inhibir la actividad de sustancias nucleadoras del hielo. Esta interacción entre AFP y un nucleador de hielo puede, por ejemplo, dar como resultado un aumento de la histéresis térmica. Esta propiedad se analiza, por ejemplo, en el documento WO 96/40973 (Universidad de Notre Dame du Lac).
Se ha sugerido que los AFPs mejoran la tolerancia a la congelación de productos. Muchas aplicaciones se han sugerido en este contexto.
Por ejemplo, se ha sugerido que los AFPs promueven la crioconservación de materiales biológicos (documento WO 91/12718, Agouron Pharmaceuticals, documento WO 91/10361, The Regents of the University of California). También se ha sugerido que los AFPs previenen el deterioro de los liposomas, por ejemplo, en cosméticos o productos farmacéuticos (véase el documento WO 96/20695). Una posible aplicación adicional es para aumentar la tolerancia a la congelación de plantas mediante su inclusión en las mismas (o la producción transgénica de las mismas) de un AFP (véase J. Cell. Biochem. Suppl. Vol. 14e, 1990, página 303 XP002030248, Lee y col., resumen R228). También se han sugerido peces con AFPs para el uso en productos alimenticios, por ejemplo, en yogur helado o helado (documentos EE.UU. 5.620.732 Pillsbury y WO 96/11586, HSC Research and Developmento limited partnership).
Hasta ahora, sin embargo, el uso de AFPs no se ha aplicado a escala comercial. Los solicitantes son de la opinión de que una de las razones de la falta de implementación comercial es que aunque se han descrito muchos AFPs, la implementación en la práctica en productos comerciales actuales se encuentra con serios problemas.
Los solicitantes han averiguado que una de las razones clave de estos problemas es que a pesar del gran número de AFPs que han sido descritos en la bibliografía sólo un número limitado de AFPs pueden ser aplicados apropiadamente para cada solicitud; también los solicitantes han averiguado que esta selección de AFPs apropiados depende de la aplicación deseada y/o los atributos del producto que se quiere conseguir.
El documento WO 90/13571 describe péptidos anticongelantes producidos químicamente o mediante técnicas de ADN recombinante. Los AFPs pueden ser usados apropiadamente en productos alimenticios tales como helados. El ejemplo 3B muestra formas de cristales de hielo modificadas si una mezcla de agua-hielo se congela en una capa en combinación con un 0,01% en peso de AFP.
EL documento WO 91/10361 describe el uso de polipéptidos anticongelantes o glicopéptidos derivados de fluidos o suero de peces del Ártico y del Antártico.
El documento WO 92/22581 describe AFPs de plantas que pueden ser usadas para el control del crecimiento de cristales de hielo en helados. Este documento también describe un procedimiento para extraer una composición polipeptídica de los espacios extracelulares de plantas mediante infiltración de las hojas con un medio de extracción sin romper las células de la planta.
El documento WO 94/03617 describe la producción de AFPs de levadura y sus posibles usos en helados. El documento WO 96/11586 describe AFPs de peces producidos por microbios.
La presente invención tiene como objetivo proporcionar soluciones a los problemas anteriores. En particular, la invención tiene como objetivo proporcionar productos alimenticios congelados que tienen una textura relativamente blanda aunque quebradiza, manteniendo dicha textura tras un almacenamiento prolongado a bajas temperaturas.
Sorprendentemente, se ha averiguado que los AFPs pueden ser convenientemente incorporados a productos alimenticios congelados para producir las propiedades deseadas del producto siempre que varíen las condiciones de procesamiento, de modo que la forma del cristal de hielo satisfaga los requerimientos específicos.
Según este primer aspecto, la invención hace referencia a un procedimiento para la producción de un producto alimenticio congelado que comprenda AFP, en el que las condiciones se eligen de modo que los cristales de hielo del producto tengan una relación entre dimensiones que abarca de 1,1 a 1,9.
Si los productos alimenticios se congelan, los cristales de hielo se forman por todo el producto. Si los AFPs se incluyen en productos alimenticios que van a ser congelados esto puede causar un cambio en las propiedades de recristalización del hielo. La agregación de los cristales de hielo de los productos que contienen AFPs puede ser la causa de la fragilidad del producto.
Muchos consumidores están a favor de los productos alimenticios relativamente blandos y quebradizos o ingredientes como helados y sorbetes. Por ejemplo, el sorbete blando puede ser usado como un ingrediente atractivo en productos de confitería congelados; a un grupo relativamente grande de consumidores también les gustan los helados quebradizos.
Sorprendentemente hemos averiguado que los AFPs ofrecen la oportunidad de formular productos alimenticios congelados que, por una parte, son relativamente blandos aunque quebradizos y, por otra parte, retienen sus propiedades mejoradas de recristalización de hielo. Los solicitantes han averiguado que, sorprendentemente, esta combinación ventajosa de propiedades puede conseguirse si el producto contiene AFPs y tiene una relación entre dimensiones de los cristales de hielo en el producto entre 1,1 y 1,9.
La relación entre dimensiones de los cristales de hielo se define como la relación entre la longitud y la anchura de los cristales de hielo. Una relación entre dimensiones de entre 1,1 y 1,9 corresponde a cristales de hielo redondeados, que no son alargados. La relación entre dimensiones de los cristales puede ser determinado por cualquier procedimiento apropiado. Un procedimiento preferido se ilustra en los ejemplos. Preferiblemente, la relación se sitúa entre 1,2 y 1,8; y la más preferida entre 1,3 y 1,7.
Preferiblemente, los productos congelados de la invención son quebradizos. Preferiblemente, el espesor mínimo de la capa a la que el comportamiento de la fracción puede ser observado es menor que 10 mm, y lo que más se prefiere es desde 1 a 5 mm. El comportamiento a la fractura puede ser medido tanto mediante la preparación de capas de espesores variados y determinación de a qué mínimo espesor el comportamiento de fractura ocurre como calculado a partir del Módulo de Young como se describe en los ejemplos.
Durante la formulación y la congelación subsiguiente de productos alimenticios varios parámetros pueden influenciar la relación entre dimensiones de los cristales de hielo que van a formarse. Ejemplos de factores que influencian la relación entre dimensiones se indican más abajo. Los solicitantes creen que es correcto que la persona experta elija aquellas condiciones como la relación entre dimensiones de los cristales de hielo que estén dentro del intervalo deseado.
Un factor que influencia la relación entre dimensiones de cristales de hielo es la tasa de congelación del producto. En líneas generales, un incremento en la tasa de congelación conduce a una disminución en la relación entre dimensiones de los cristales de hielo. En este contexto, la temperatura de congelación puede influenciar la tasa de congelación y, por tanto, la relación entre dimensiones de los cristales de hielo. En este contexto, los procedimientos de congelación que incluyen una etapa de endurecimiento a una temperatura por debajo de -30º Fahrenheit son preferidos algunas veces. La temperatura de mantenimiento y el tiempo de mantenimiento pueden influenciar igualmente la relación entre dimensiones, en el que altas temperaturas de almacenamiento y/o largos tiempos de almacenamiento tienden a favorecer la formación de altas relaciones entre dimensiones.
\newpage
Otro factor que influencia la relación entre dimensiones de los cristales de hielo es la movilidad del producto durante la congelación. Por ejemplo, si una mezcla líquida de sorbete o helado va a ser congelada, la congelación inactivamente conducirá a una relación entre dimensiones claramente alta para los cristales de hielo, mientras que la agitación conduce a una menor relación entre dimensiones. El mezclado de alta cizalladura conducirá incluso a menores relaciones entre dimensiones.
Otro factor que influye sobre la relación entre dimensiones de los cristales de hielo es la presencia y cantidades de ingredientes. Por ejemplo, la presencia de ingredientes que tienden a formar una estructura reticular en el producto (por ejemplo, gomas o grasas) puede conducir a una menor relación entre dimensiones que en productos sin estos ingredientes. También otros ingredientes pueden conducir a menores relaciones entre dimensiones, por ejemplo, altos niveles de sólidos como altos niveles de azúcar pueden conducir a bajas relaciones entre dimensiones.
Finalmente la naturaleza y la cantidad de los AFPs presentes pueden conducir a un cambio en las relaciones entre dimensiones. Algunos AFPs parecen favorecer la formación de bajas relaciones entre dimensiones, mientras que otros AFPs parecen inducir altas relaciones entre dimensiones. Un ensayo apropiado para seleccionar estos AFPs se describe en los ejemplos. La variación en la cantidad de AFPs puede conducir a un cambio en las relaciones entre dimensiones.
Según una segunda realización, la invención hace referencia a un procedimiento para la producción de un producto alimenticio congelado que contenga AFP, en el que la formulación, la congelación y las condiciones de almacenamiento sean elegidas de modo que los cristales de hielo en el producto tengan unas relaciones entre dimensiones de desde 1,1 hasta 1,9.
El procedimiento de la invención puede ser aplicado a cualquier producto alimenticio congelado que contenga AFPs. Ejemplos de productos apropiados son salsas, comidas, etc. Los productos alimenticios apropiados son productos de confitería congelados como helados y sorbetes.
Los solicitantes han averiguado que los AFPs para el uso en los procedimientos de la invención pueden proceder de una variedad de fuentes como plantas, pescados, insectos y microorganismos. Ambas especies que se encuentran de modo natural pueden ser usadas o especies que han sido obtenidas a través de modificación genética. Por ejemplo, los microorganismos o plantas pueden ser genéticamente modificados para expresar AFPs y los AFPs pueden ser usados según la presente invención.
Las técnicas de manipulación genética pueden ser usadas para producir AFPs del siguiente modo: una célula huésped apropiada u organismo sería transformado por una construcción genética que contiene el polipéptido deseado. La secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido puede ser insertada en un vector de expresión apropiado que codifique para los elementos necesarios para la transcripción y traducción y de tal manera que puedan ser expresados bajo las condiciones apropiadas (por ejemplo, en la orientación adecuada y con la pauta de lectura correcta y con una diana apropiada y secuencias de expresión). Los procedimientos requeridos para construir estos vectores de expresión son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.
Un número de sistemas de expresión puede usarse para expresar la secuencia codificante polipeptídica estable al calor. Estos incluyen, pero no están limitados a los mismos, bacterias, sistemas celulares de levaduras de insectos, sistemas de cultivos celulares y plantas todas transformadas con los vectores de expresión apropiados.
Una amplia variedad de plantas y de sistemas celulares de plantas puede ser transformada con las construcciones de ácido nucleico de los polipéptidos deseados. Las realizaciones preferidas incluyen, pero no están limitadas a las mismas, maíz, tomate, tabaco, zanahorias, fresas, semillas de colza y azúcar de remolacha.
Para el propósito de la invención, los AFPs preferidos derivan de peces. Se prefieren especialmente el uso a partir de plantas (por ejemplo, proteínas obtenidas directamente de plantas o estas proteínas producidas transgénicamente por otros organismos), especialmente derivadas del centeno de invierno o hierbas perennes.
Para algunas fuentes naturales los AFPs pueden consistir en una mezcla de dos o más AFPs diferentes.
Esos AFPs son elegidos preferiblemente con propiedades significativas de inhibición de la recristalización. Un ensayo adecuado para la determinación de las propiedades de recristalización se indica en los ejemplos. Preferiblemente los AFPs según la invención proporcionan un tamaño de partícula de hielo tras la recristalización- preferiblemente como se mide según los ejemplos- de menos de 20 \mum, más preferiblemente desde 5 hasta 15 \mum. Se cree que el pequeño tamaño de los cristales de hielo combinados con la relación entre dimensiones específica es especialmente ventajoso para obtener las características estructurales deseadas.
Una realización de la invención muy ventajosa hace referencia a formulaciones de producto que son elegidas de modo que en la preparación del producto pueden ser usadas condiciones de congelación estables, manteniendo aún la relación entre dimensiones como se define anteriormente.
Ejemplos de dichos productos alimenticios son: mezclas de confitería congeladas como mezclas de helado, mezclas de sorbetes que se pretende almacenar a temperatura ambiente o en el refrigerador. Productos apropiados para estas formas son, por ejemplo: una mezcla de polvo que es empaquetada, por ejemplo, en una bolsa o en saquitos. Dicha mezcla es capaz de formar la base de producto alimenticio congelado, por ejemplo, después de la adición de agua y opcionalmente otros ingredientes y de modo opcional, la aireación.
Otro ejemplo de mezcla apropiada podría ser una mezcla de líquido (opcionalmente aireada) que, si es necesario tras la adición de más componentes y de otra aireación opcional, puede ser congelada.
La clara ventaja de las mezclas mencionadas anteriormente es que la presencia del ingrediente de AFP permite que las mezclas sean congeladas bajo condiciones estables, por ejemplo, en una tienda o en el frigorífico doméstico.
Muy convenientemente, estas mezclas son empaquetadas en contenedores cerrados (por ejemplo, cartones, bolsas, cajas, contenedores de plástico, etc.). Para porciones sencillas el tamaño del paquete será generalmente de desde 10 hasta 1000 g. Para múltiples porciones de tamaño de paquetes de hasta 500 kg puede ser apropiado. Generalmente el tamaño del paquete será entre 10 g hasta 5000 g.
Como se indica anteriormente, los productos preferidos en los que los AFPs son usados son productos de confitería congelados como helados o polos. Preferiblemente el nivel de AFPs se sitúa de 0,0001 a 0,5% en peso basado en el producto final. Si se usan mezclas secas o concentrados, la concentración debe ser más alta para asegurarse de que el nivel en el producto final congelado se encuentra dentro de los intervalos anteriormente mencionados.
Sorprendentemente, se ha averiguado que las composiciones de la invención pueden contener cantidades muy bajas de AFPs manteniendo aún así la buena calidad.
Hasta ahora la creencia general ha sido que claramente que se necesitan altos niveles de AFPs para obtener una mejora razonable de las propiedades de recristalización. La razón para esto es que se cree comúnmente que los AFPs actúan en partes significativas de la superficie de los cristales de hielo y por lo tanto necesitan estar presentes a altas cantidades, por ejemplo, 0,01% en peso o más para conseguir un efecto razonable.
Sorprendentemente se ha averiguado ahora también que los productos congelados mejoran las propiedades de recristalización y el incremento de la tolerancia a la temperatura puede ser entonces obtenido si se usan bajos niveles de AFPs.
Sorprendentemente se ha averiguado que el nivel de AFPs puede ser tan bajo como 0,1 hasta 50 ppm mientras que todavía proporciona propiedades de recristalización apropiadas y tolerancia a la temperatura en productos de confitería congelados. Aunque los solicitantes no quieren por ningún medio estar ligados a ninguna teoría, la razón para esto puede ser que la interacción entre los sólidos de la confitería congelada y los AFPs proporciona un excelente mecanismo para inhibir el crecimiento del cristal. Más convenientemente el nivel de AFPs se sitúa entre 1 hasta 40 ppm, y especialmente se prefiere desde 2 hasta 10 ppm.
Para el propósito de la invención el término producto de confitería congelado incluye dulces lácteos congelados tales como helados, yogur congelado, sorbetes, batidos y natillas congeladas, granizados y purés de fruta congelados. Para algunas solicitudes el uso de los AFPs en productos alimenticios fermentados congelados es menos preferido.
Preferiblemente el nivel de sólidos en los productos de confitería congelados (por ejemplo, azúcar, grasa, condimentos, etc.) es más que un 30% en peso, y más preferiblemente desde 40 hasta 70% en peso.
En una realización muy preferida de la invención las formulaciones de confitería blandas pero quebradizas son usadas para crear un contraste de texturas en los productos de confitería congelados. Preferiblemente, estos productos de confitería congelados contienen como elementos discretos en sus estructuras las composiciones que contienen AFPs según la invención. Por ejemplo, un centro relativamente duro de helado puede ser recubierto con una fina capa de la composición de la invención proporcionando la misma una capa exterior relativamente blanda aunque frágil rodeando el núcleo del helado. Otra realización puede ser la incorporación de la formulación de la invención como inclusiones en productos de confitería congelados. Una tercera realización sería alternar capas de helado con la formulación de la invención para crear capas finas blandas aunque quebradizas alternando con capas del helado.
Ejemplo I Aislamiento de AFPs del centeno de invierno
El centeno de invierno (variedad Halo) se cortó en enero (la media de temperatura en ese mes fue de 3,5ºC asegurándose la apropiada aclimatación fría de las plantas). El tejido se transportó rápidamente al laboratorio para la manipulación posterior y se lavó a conciencia con agua para eliminar la suciedad.
Se homogeneizó 400 g de los recortes a temperatura ambiente en un mezclador Waring con 800 g de agua hasta que el tejido de la hoja se rompió completamente. El zumo rico en AFP se recolectó mediante filtración adicional a través de 4 capas de muselina.
El zumo rico en AFP se sometió entonces a un tratamiento de temperatura hirviendo el zumo durante 10 minutos. Esto causó la precipitación de la proteína mientras que el AFP para el uso según la invención permanecía en la disolución. El sobrenadante se separó del precipitado mediante centrifugación a 15.000 g durante 20 minutos o mediante otra filtración adicional a través de muselina.
Los AFPs pueden ser aislados del sobrenadante mediante congelación en seco.
Ejemplo II Aislamiento de AFPs de hierbas
La mezcla de tejidos de hierbas (que contienen Poa trivialis, Lolium perenne, Holcus lanatus y Bromus sterilis) se cortó en enero (la temperatura media en ese mes fue de 3,5ºC asegurándose la apropiada aclimatación fría de las plantas). El tejido se transportó rápidamente al laboratorio para el posterior manejo y se lavó a conciencia con agua para eliminar la suciedad.
Se colocaron 500 g de recortes de las hierbas en un horno microondas a 650 watios y se calentaron a potencia máxima durante 5 minutos, elevando la temperatura de 85ºC a 100ºC. Los recortes de hierbas fueron entonces enfriados a temperatura ambiente.
Tras la etapa de calentamiento, el zumo rico de AFP se separó de los recortes mediante filtración. La masa fue agitada continuamente durante 5 minutos en presencia de un volumen igual de agua y entonces fue exprimido a través de tres capas de muselina.
El sobrenadante puede ser congelado en seco para aislar el AFP.
Ejemplo III
Una premezcla para preparar helado se hizo mezclando lo siguiente:
Ingrediente \hskip-4mm % en peso
Polvo de leche descremada 11,39
Sacarosa 3,14
Maltodextrina (MD40) 4,00
Sirope de maíz 63DE 20,71
Aceite de mantequilla 9,00
Monoglicérido (palmitato) 0,45
Vainilla 0,01
Goma garrofín 0,07
Goma guar 0,05
Carragenano 0,02
Celulosa microcristalina 0,24
Gelatina 0,14
AFP (del ejemplo I*) 0,01 o cero (control)
Agua equilibrar
*Nota: el AFP se añade como una disolución concentrada, el porcentaje se refiere a cantidad de AFP.
Esta mezcla se puede almacenar convenientemente a temperatura ambiente, por ejemplo, en un contenedor de plástico.
La mezcla puede ser batida con un mezclador convencional de casa hasta un desgaste de aproximadamente un 100%, seguido mediante una congelación estable en un congelador casero.
Después de un almacenamiento de dos meses la composición según la invención tenía una textura marcadamente mejor que la muestra control.
Ejemplo IV
Una premezcla líquida para la preparación de helado se preparó mezclando lo siguiente:
Ingrediente \hskip-4mm % en peso
Polvo de leche descremada 10,00
Sacarosa 13,00
Maltodextrina (MD40) 4,00
Goma garrofín 0,14
Aceite de mantequilla 8,00
Monoglicérido (palmitato) 0,30
Vainilla 0,01
AFP (del ejemplo I*) 0,01 o cero (control)
Agua equilibrar
*Nota: el AFP se añade como una disolución concentrada, el porcentaje se refiere a cantidad de AFP
Ejemplo V
Los helados se prepararon mediante congelación y aireación hasta un desgaste de un 70% de la formulación según el ejemplo IV:
Las muestras de ambos productos fueron equilibradas a -18ºC en un armario frigorífico de ambiente Prolan durante aproximadamente 12 horas. Las placas microscópicas se prepararon pegando una fina capa de helado del centro de las láminas de cristal delgado.
Cada capa se transfiere a una temperatura controlada en el portaobjetos del microscopio (a -18ºC) donde las imágenes de los cristales de hielo (alrededor de 400 cristales de hielo individuales) se recogieron y se retransmiten a través de una vídeo cámara para almacenar la imagen y en sistemas de análisis.
Las imágenes almacenadas de cristal de hielo fueron resaltadas manualmente mediante el dibujo alrededor del perímetro resaltando de este modo, entonces, el cristal entero. Las imágenes de los cristales resaltados fueron entonces medidos usando la aplicación de análisis de imagen que cuenta el número de píxeles requeridos para completar la línea recta más larga (longitud), la línea recta más corta (anchura), la relación entre dimensiones (longitud/anchura).
Se calculó la media de relación entre dimensiones para los cristales.
Para la muestra control, la relación entre dimensiones fue de 1,45.
Para la muestra que contiene AFP la relación entre dimensiones fue de 1,7.
Ejemplo VI
La fragilidad del helado del ejemplo IV se determinó mediante cálculos del comportamiento al fraccionamiento del helado. Usando un ensayo de curvatura de 3 puntos se calculó el Módulo de Young.
El Módulo de Young se midió preparando tiras de helado, equilibrándolas durante 18 horas en un armario congelador y transfiriéndolas a una temperatura de armario. Las tiras fueron colocadas en un estructura curvada de 3 puntos como se describen en el Handbook of Plastics Test Methods (2nd Edition), ed R.P. Brown, George Gowin Ltd, 1981. El ensayo de la muestra se llevó a cabo inmediatamente a una velocidad de deformación de 50 mm/min. A partir de la curva de esfuerzo-deformación, la pendiente inicial se midió y se usó para calcular el Módulo de Young según la siguiente ecuación:
Módulo \ Young \ (Pa)= \frac{pendiente \cdot L}{4 \cdot B \cdot W}
Donde L = envergadura del haz (110 mm), B = amplitud de la muestra, W = altura de la muestra. Usualmente ocho muestras fueron analizadas para obtener una madia de valor de Módulo de Young.
Usando los cálculos descritos por Williams & Cawood en Polymer Testing 9 15-26 (1990) se puede calcular la resistencia de la fractura.
Los resultados fueron los siguientes: Para la muestra control un espesor de 966 m se calculó como el necesario para obtener una capa frágil. Para la muestra que contiene AFP la fragilidad (comportamiento a la fractura) se encontró ya a una espesor de 3 mm. Esto muestra claramente la fragilidad mejorada de los productos de la invención. Los productos con AFP fueron relativamente duros.
Ejemplo VII
Este ejemplo describe una metodología para seleccionar aquellos AFPs que favorecen la formación de formas de cristales de hielo como se prefieren en la invención.
El crecimiento de cristal de hielo bajo circunstancias normales se sitúa a lo largo del eje a del cristal. Si los AFPs están presentes el crecimiento cambia. Esta selectividad en influenciar la forma del cristal puede ser explicada por el hecho de que los AFPs tienden a unirse a ciertas partes del cristal de hielo y mediante esto se inhibe el crecimiento del cristal de hielo en ciertas direcciones. La unión puede, por ejemplo, tomar lugar en planos del prisma (perpendicular al eje a) o en planos Piramidales (proyectando fuera de estos planos).
Los solicitantes han averiguado que los AFPs que favorecen la formación de las relaciones entre dimensiones según la presente invención pueden escogerse mediante la selección de aquellos AFPs que tienden a unirse en el plano piramidal. La metodología para seleccionar estas uniones específicas de AFPs puede ser mediante cualquier metodología aplicada. Un análisis apropiado usa el llamado ``Experimento de crecimiento de una "semiesfera" de un solo cristal de hielo'' basado en la técnica descrita por Knight C.A., C.C. Cheng y A.L. DeVries, Biophys. J. 59 (1991) 409-418, Adsorption of -helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes.
Un pocillo de precipitación de plástico 51 bien aislado se rellenó con agua desionizada, y se colocó en un armario a temperatura controlada de -1ºC. Entonces se permitió que se congelara lentamente desde la parte superior. Después de dos días un cristal sencillo de hielo aproximadamente de 4 cm de espesor cubría el pocillo de precipitación. La orientación cristalográfica del cristal se determinó usando procedimientos de difracción de rayos X para cristales simples. Se cortaron cubos de hielo, de aproximadamente 2 cm de dimensión, a partir del cristal grande sencillo, de modo que una superficie fuera paralela al plano del prisma, y otra paralela al plano basal. De este modo fueron producidos cristales de hielo sencillos orientados.
Se usaron unos aparatos consistentes en un dedo frío de latón (aproximadamente de 1 cm de diámetro) encima del cual una semilla de cristal orientada se congeló. La semilla fue primeramente hundida de modo que la semilla del cristal pudiera ajustarse alrededor de él. Entonces se hizo circular un fluido refrigerante a través del dedo y la semilla se congeló rápidamente a su paso.
El dedo, con la semilla de cristal, fue entonces introducido en un pocillo de precipitación aislado de 100 ml que contiene una disolución del material bajo investigación. La temperatura inicial de la disolución estaba a temperatura ambiente (-18ºC) y el único enfriamiento fue proporcionado por el dedo frío. Inicialmente la semilla de cristal se fundió parcialmente, pero entonces creció en una hemiesfera de cristal simple. Después de varias horas (6-8) se formó una hemiesfera con un diámetro de 5-7 cm.
El experimento se llevó a cabo con varias soluciones de AFPs. Las soluciones de AFPs usadas tenían una concentración de AFP de 10^{-3} mg/ml.
La hemiesfera entonces fue retirada del dedo frío, y llevada a una cabina con temperatura controlada a -15ºC. La superficie fue raspada y se dejó en la cabina al menos toda la noche (16 horas o más). Se circuló aire a través de la cabina por medio de un ventilador integral. Durante este tiempo ocurrió la evaporación de las capas superficiales del hielo. La superficie de la hemiesfera de hielo se convirtió en una superficie de espejo blanda. Sin embargo, en las hemiesferas que contienen AFP se veían ásperos parches en la superficie. Estos correspondían a los parches donde el AFP se había unido a la superficie de la hemiesfera. Las grandes moléculas de AFP impiden que las moléculas de hielo se evaporen, y así una áspera capa de moléculas de AFP se construye en la superficie, en superficies donde ocurre la unión preferencial de hielo. Como la orientación de la hemiesfera es conocida, y la distancia angular entre estos parches ásperos y las direcciones basal y del prisma pueden ser medidas por medio de un goniómetro óptico, la naturaleza del plano de unión puede ser fácilmente determinada.
Este ensayo puede ser usado para seleccionar aquellos AFPs que tienden a unirse a planos piramidales. Por ejemplo, los AFPs del ejemplo I y II tienden a unirse a planos piramidales. También un gran número de otros extractos de plantas tiende a producir una unión piramidal.
Los expertos en la técnica podrán usar el ensayo anterior para determinar aquellos AFPs que tienden a favorecer la formación de altas relaciones entre dimensiones de cristales de hielo. Para analizar si son apropiados en productos congelados de la invención, el producto actual puede ser fabricado y la relación entre dimensiones de los cristales en el producto puede ser determinada.
\newpage
Ejemplo VIII Ensayo para la determinación del tamaño de cristales de hielo tras la recristalización
Una muestra de una disolución que contiene AFP en agua se ajusta a un nivel de sacarosa de un 30% en peso (si el nivel al comienzo de la muestra es mayor que un 30% esto se hace mediante dilución, si el nivel de comienzo es menor la sacarosa se añade hasta un nivel del 30%).
Generalmente el ensayo puede ser aplicado a cualquier composición apropiada que comprenda AFP y agua. Generalmente el nivel de AFP en dichos ensayos no es muy crítico y puede, por ejemplo, encontrarse desde un 0,0001 hasta un 0,5% en peso, más preferiblemente entre 0,0005 hasta 0,1% en peso, y la opción más preferida de todas entre 0,001 hasta 0,05% en peso, por ejemplo, 0,01% en peso.
Se coloca una gota de 3 \mul en un capa para cubrir de 22 mm. Un capa para cubrir de 16 mm de diámetro se coloca entonces en la parte superior y un peso de 200 g se coloca en la muestra para asegurarse del espesor uniforme de la slide. Los extremos de la capa para cubrir son sellados con barniz transparente para uñas.
La capa se coloca en un portaobjetos del microscopio Linkham THM 600 a temperatura congelada. El portaobjetos se enfría rápidamente (50ºC por minuto) hasta -40ºC para producir una gran población de cristales pequeños. La temperatura del portaobjetos se eleva entonces rápidamente (50ºC por minuto) hasta -6ºC y se mantiene a esta temperatura.
La fase de hielo se observa a -6ºC usando un microscopio Leica Aristoplan. Las condiciones de luz polarizada en unión con la lámina lambda son usadas para aumentar el contraste de los cristales de hielo. El estado de la fase congelada (tamaño de los cristales) se recoge mediante una fotomicrografía de 35 mm a T=0 y a T=1 hora. En la misma un tamaño de partícula medio (determinación visual, media numérica) inferior a 20 \mum, más preferiblemente entre 5 y 15 \mum, indica los AFPs preferidos para el uso en productos según la invención.

Claims (9)

1. Un procedimiento para la producción de un producto alimenticio congelado que comprende polipéptidos anticongelantes, en el que las condiciones se eligen de modo que los cristales de hielo del producto tengan una relación entre dimensiones definida como la longitud dividida por la anchura, de 1,1 a 1,9.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que las condiciones para influenciar la relación entre dimensiones se seleccionan entre el grupo constituido por: tasa de congelación, movilidad del producto durante la congelación, temperatura y tiempo de almacenamiento, formulación del producto y naturaleza y cantidad de polipéptidos anticongelantes y combinaciones de las mismas.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el producto alimenticio congelado es un producto de confitería congelado.
4. Un producto de confitería congelado que comprende de 0,0001 a 0,5% en peso de polipéptidos anticongelantes, teniendo dicho producto una relación entre dimensiones del cristal de hielo de 1,1 a 1,9.
5. Producto de confitería congelado según la reivindicación 4, en el que los péptidos anticongelantes se unen preferentemente a planos piramidales de los cristales de hielo.
6. Producto de confitería congelado que tiene un contraste de textura, comprendiendo dicho producto elementos discretos de un producto de confitería de la reivindicación 4.
7. Producto de confitería congelado según la reivindicación 6, que comprende capas delgadas de helado alternadas con capas delgadas de sorbete, en el que las capas de sorbete comprenden de 0,0001 a 0,5% en peso de polipéptidos anticongelantes y tienen una relación entre dimensiones del cristal de hielo de 1,9 a 3,0.
8. Mezcla de helado apropiada para su uso en la preparación de un producto de confitería congelado de la reivindicación 4.
9. Mezcla de helado según la reivindicación 8, en la que la preparación comprende la aireación y la congelación en reposo.
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