ES2201718T3

ES2201718T3 - Generacion de productos genicos multiples a partir de proteinas quimericas de fusion, mediante corte con endoproteasas.

Info

Publication number: ES2201718T3
Application number: ES99923745T
Authority: ES
Inventors: Johannes Adrianus Gaken; Farzin Farzaneh; Stephen James Russell
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 1998-05-21
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2004-03-16
Anticipated expiration: 2019-05-21
Also published as: JP2002515251A; GB9810999D0; CA2333144A1; WO1999060135A1; WO1999060135A8; ATE236259T1; DE69906509D1; KR20010052383A; NZ508863A; EP1080206B1; CN1308679A; AU753785B2; ID27206A; EP1080206A1; AU4050899A

Abstract

Construcción de ácido nucleico para la expresión de dos o más polipéptidos individuales biológicamente activos en una célula, que comprende una primera secuencia que codifica un primer polipéptido y una segunda secuencia que codifica un segundo polipéptido, estando separadas dichas primera y segunda secuencias por una secuencia de engarce que codifica un sitio de corte de endoproteasa.

Description

Generación de productos génicos múltiples a partir de proteínas quiméricas de fusión, mediante corte con endoproteasas.

Campo de la invención

La presente invención concierne a materiales y procedimientos relacionados con la expresión de genes. Particular, pero no exclusivamente, se refiere a los procedimientos para la expresión de múltiples productos de genes como un único cistrón, al uso terapéutico de tales procedimiento, y a equipos para llevar a cabo los procedimientos.

Antecedentes de la invención

La transferencia y expresión de múltiples genes exógenos es un requisito importante en un rango de protocolos de terapia génica, incluyendo la terapia génica inmune del cáncer. No obstante, la relativa ineficiencia de los procedimientos de transferencia de genes, impide el uso de múltiples vectores para la transferencia y expresión de múltiples productos de genes. En principio, la expresión de varios genes en un único vector puede conseguirse mediante la inclusión en el vector de múltiple casetes de expresión, cada uno con sus secuencias independientes promotoras y/o de terminación de la transcripción. Una desventaja principal de este tipo de estrategia es el fenómeno de la interferencia de promotores, la cual es particularmente aguda en vectores retrovirales (Emerman y Temin, 1984, Cell 39, 449-467; Emerman y Temin, 1986, Nucleic Acids Res. 14, 9381-9396; Vile et al., 1994, Gene Ther. 1, 307-316). Como una estrategia alternativa, el reciente desarrollo de vectores retrovirales que contienen sitios internos de entrada de ribosomas (IRES) ha permitido la expresión de mensajeros policistrónicos (Morgan et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20, 1293-1299; Zitvogel et al., 1994, Hum. Gene Ther. 5, 1493-1506). No obstante, estos vectores son eficientes al máximo cuando contienen sólo un único IRES, limitando su conveniencia a la expresión de sólo dos genes. La presencia de múltiples elementos IRES resulta en la inestabilidad del vector, probablemente a causa de sucesos de recombinación. En la experiencia de los inventores, este es el caso incluso en vectores con dos secuencias IRES derivadas de diferentes especies virales (por ejemplo, virus de la polio y virus de la encefalomiocarditis, ECMV) con poca homología de secuencia de nucleótidos. Por tanto, tales vectores son inapropiados para el suministro y expresión de múltiples productos de genes. En consecuencia, los presentes inventores se han percatado de que es necesaria una estrategia nueva para la expresión de múltiples productos de genes a partir de un único cistrón, el cual codifica múltiples productos como una única proteína de fusión, la cual puede cortarse y procesarse, después de su síntesis, en sus componentes constituyentes, biológicamente activos.

En las células eucariotas muchos productos de genes (por ejemplo, las prohormonas, los precursores de neuropéptidos, etc.) se sintetizan inicialmente como moléculas precursoras, las cuales son procesadas posteriormente a su traducción mediante corte proteolítico (ver referencias, Barr, 1991, DNA Cell Biol. 10, 319-328; Steiner et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 23.435-23.438, para una revisión). Se han identificado un cierto número de endoproteasas (PC2, PC3, PC4, PACE4) específicas de tejidos, las cuales se expresan en la isleta pancreática, la glándula pituitaria, y otras células endocrinas, (Smeekens y Steiner, 1990, J. Biol. Chem. 265, 2997-3000; Smeekens et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 340-344; Nakayama et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 5897-5900; Kiefer et al., 1991, DNA Cell Biol. 10, 757-769) por su homología con la Kex2, la primera endoproteasa de procesamiento eucariota identificada en levaduras (Julius et al., 1984, Cell 37, 1075-1089; Mizuno et al., 1988, Biochem. Biophys. Res. Commun. 156, 246-254). Por contra, la furina, que es una endoproteasa ubicada en el aparato de Golgi (Shapiro et al., 1997, J. Histochem. Cytochem. 45, 3-12) se expresa en una amplia variedad de tejidos (Schalken et al., 1987, J. Clin. Invest. 80, 1545-1549), y está altamente conservada entre las especies eucariotas (Barr et al., 1991, Cell 66, 1-3). La furina representa una endoproteasa celular general capaz de procesar un grupo diverso de proteínas precursoras secretadas a través de la vía constitutiva. La mayoría de las prohormonas y precursores neuroendócrinos son procesados en residuos Lys-Arg o Arg-Arg, mientras que los precursores de las proteínas secretadas a través de vías no reguladas o constitutivas tienen un sitio de corte por furina más complejo con la secuencia Arg.X.Arg/Lys.Arg (Bresnahan et al., 1990, J. Cell Biol. 111, 2815-2859; Hosaka et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 12.127-12.130). La evidencia directa de la actividad proteolítica de la furina se obtuvo mediante experimentos de co-transfección con cADN para la furina y el precursor del factor von Villebrand (pro-vWF) introducido en células COS. La presencia de furina resultó en la completa maduración del pro-vWF en su sitio de procesamiento Arg-Ser-Lys-Arg natural, y mostró la importancia de la Arg en la posición P4 (van de Ven et al., 1990, Mol. Biol. Rep. 14, 265-275; Wise et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9378-9382). Un cierto número de estudios han mostrado que la incorporación de sitios de reconocimiento de furina en proteínas recombinantes resulta en la secreción eficiente de estas proteínas a partir de células transducidas. Estos estudios incluyen la secreción de un péptido que codifica el fragmento Fc de la IgG1, como un resultado de su fusión al dominio N-terminal de la pro-calcitonina (Liu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8957-8961). De forma similar, la secreción de insulina humana activa madura puede conseguirse, en células que expresan solamente la vía constitutiva de secreción, como un resultado de la incorporación de sitios de reconocimiento de furina en la pro-insulina recombinante (Groskreutz et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 6241-6245).

La expresión de múltiples productos de genes es un requisito en un cierto número de aplicaciones biológicas. Un cierto número de técnicas ya disponibles permite este objetivo pero con limitaciones. Estas incluyen la transferencia de genes secuencial usando vectores, cada uno de los cuales codifica un único o múltiples genes como unidades de expresión reguladas independientemente. Alternativamente, el uso de secuencias IRES colocadas entre diferentes secuencias codificantes permite la expresión de transcritos policistrónicos, en los que cada unidad codificante se traduce a continuación en el producto proteico correspondiente.

No obstante, cada uno de estos procedimientos tiene un cierto número de desventajas. El uso de múltiples plásmidos lleva mucho tiempo, ineficiente, y usualmente depende de la disponibilidad de diferentes procedimientos de selección para cada uno de los genes codificados. La incorporación de múltiples casetes de expresión pude resultar en interferencia de promotores, en la que la expresión de un casete influye (usualmente suprime) la expresión del (de los) otro(s) casete(s) de expresión en el vector (Emerman y Temin, 1984, Cell 39, 449-467; Emerman y Temin, 1986, Nucleic Acid Res. 14, 9381-9396). La incorporación de un único IRES resulta en la expresión eficiente de dos genes, pero la incorporación de dos o más secuencias IRES para la expresión de dos o más genes hace tales vectores inestables. Más aún, ninguno de estos procedimientos permite la expresión coordinada de los genes codificados, y, por tanto, son totalmente inapropiados para situaciones en la que se precisan proporciones equimolares (es decir, 1:1) o incluso otras proporciones molares específicas (por ejemplo, 2:1) de dos o más productos de genes. Esta es una consideración particularmente importante para los estudios de transferencia de genes en los que la actividad biológica deseada es el producto de subunidades heterogéneas (por ejemplo, la expresión de la subunidad p40 de IL-2 en exceso molar respecto de la subunidad p35 resulta en la inhibición de la actividad estimulante inmune de la IL-2 (Chen et al., 1997, J. Immunol. 159, 351-359; Mattner et al., 1997, Infect. Immun. 65, 4734-4737).

Dos estudios previos han usado los sitios de corte de la furina, no para la producción de múltiples proteínas a partir de un único cistrón, sino para la secreción de proteínas que normalmente son intracelulares (Liu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8957-8961 o para la producción de péptidos que normalmente son secretados, pero sólo por tipos celulares específicos (Method et al., 1997, J. Biol. Chem. 272, 12.994-12.999). En el primer estudio, tal como se ha mencionado más arriba, se fusionó un fragmento Fc de anticuerpo, a través de un sitio de corte de furina, con el péptido señal de la pro-calcitonina, lo que resultó en la secreción del fragmento Fc (Liu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8957-8961). En el segundo estudio, se fusionó la angiotensina II, a través del sitio de reconocimiento de la furina, a una porción de pro-renina que contenía su péptido señal, permitiendo por tanto la secreción de la angiotensina II por parte de células que carecen del sistema de modificación necesario para la producción del péptido maduro (Method et al., 1997, J. Biol. Chem. 272, 12.994-12.999).

He et al. (Gene 175, 121-125 (1996)) usaron un sitio interno de entrada de ribosomas del virus de la encefalomiocarditis, entre dos secuencias de enfriamiento (cooling sequences), para formar un fragmento de ADN dicistrónico, y mostraron que las dos secuencias se expresaban en la línea celular humana.

Resumen de la invención

Los presentes inventores se han percatado de que los sitios de corte por endoproteasas, por ejemplo, los sitios de reconocimiento de la furina, podrían utilizarse para producir múltiples productos de genes a partir de proteínas de fusión quiméricas, mediante corte endoproteolítico, para genera las proteínas constituyentes, cada una con su propia actividad biológica específica, estando cada una individualmente, en complejo entre ellas, o en asociación con otros componentes celulares. Además, los presentes inventores se han dado cuenta de que esta tecnología permite la expresión de dos o más polipéptidos (proteínas), siendo estos los constituyentes de la proteína de fusión quimérica, en cualesquiera proporción molar, u otras proporciones según esté especificado por la frecuencia de repetición de una proteína o secuencia peptídica determinada en la proteína de fusión. Más aún, el sitio de corte endoproteolítico incorporado en la proteína quimérica podría diseñarse para que fuera la diana de endoproteasas ubicuas (por ejemplo, la furina) y generar por tanto las proteínas constituyentes en muchos tipos celulares diferentes. Alternativamente, el sitio de corte podría diseñarse para que fuera una diana para endoproteasas específicas de células, y generar por tanto las proteínas constituyentes en células diana específicas, las cuales expresan tales endoproteasas. Éste último proporciona un mecanismo novedoso para la expresión específica en tejido de proteínas, el cual podría usarse como una estrategia, bien conjunta o separadamente de los medios descritos previamente para conseguir la expresión específica en tejido (es decir, suministro orientado y transcripción específica de tejido).

Los presentes inventores han expresado, a modo de ejemplo, la IL-2 y B7.1, la IL-4 y la B7.1, la IL-4 y la IL-2, la IL-12 (compuesta por dos subunidades, la p35 y la p40), o la IL-12 y la IL-2 (compuesta de tres subunidades, la p35 y la p40 de la IL-12 más la IL-2) como una proteína de fusión, separada en cada caso por un engarce que abarca una secuencia diana para furina. En estos ejemplos, el sitio de corte para furina usado fue Gly.Gly.Arg.Gly.Arg.Gly para los vectores que codifican la B7.1/IL-2 (Figuras 2 A, B y C), Gly.Gly.Arg.Tyr.Arg.Arg.Gly.Gly para los vectores que codifican la IL-4 (Figuras 2 D y E), o el Gly.Arg.Pro.Lys.Arg.Pro para los vectores que codifican la IL-12 (Figuras 2 F y G). Estas secuencias incluyen un sitio consenso de corte para furina (en estos ejemplos Arg.Gly.Arg.Arg o Arg.Pro.Lys.Arg) y residuos glicina y prolina adicionales para hacer este sitio más asequible espacialmente. Los sitios de corte para furina usualmente se parecen a la secuencia consenso Arg.X.Y.Arg, en donde X puede ser cualquiera aminoácido, por ejemplo, glicina, lisina, valina, tirosina, glutamina o prolina, e Y es preferiblemente lisina o arginina. La expresión de un tercer gen, la S desaminasa de la blasticidina, a través de una secuencia IRES de ECMV, permite el aislamiento de las células transducidas exitosamente, en cada una de las cuales los constituyentes del gen de fusión se expresan como material biológicamente activo en la ubicación subcelular apropiada. La expresión de IL-2 e IL-4 humanas biológicamente activas se ha confirmado mediante ensayos CTLL y ELISA, y para la IL-12 mediante la activación de linfocitos humanos y ELISA. La expresión de la B7.1 humana biológicamente activa se ha confirmado mediante análisis FACS usando un anticuerpo monoclonal o el ligando natural CTLA4, y por medio de su capacidad para co-estimular la producción de IL-2 por parte de la línea celular T de Jurkat.

Por tanto, en su forma más general, la presente invención proporciona materiales y procedimientos para generar múltiples productos de genes a partir de un único cistrón que codifica múltiples productos como una única proteína de fusión, la cual puede cortarse y procesarse, después de su síntesis, en sus componentes constituyentes biológicamente activos.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico para la expresión de dos o más polipéptidos en una célula diana como una proteína de fusión, comprendiendo dicha construcción una primera secuencia que codifica un primer polipéptido y una segunda secuencia que codifica un segundo polipéptido, estando separadas dichas primera y segunda secuencias por una secuencia engarce que incluye un sitio de corte para endoproteasa.

El sitio de corte para endoproteasa podría ser cualquier secuencia de aminoácidos que es reconocida por una endoproteasa. Los ejemplos de endoproteasas incluyen la PC2, la PC3, la PC4, la PACE4 y la Kex2. Preferiblemente, las endoproteasa es la furina, la cual reconoce un sitio de corte que tiene la secuencia de aminoácidos Arg.X.Y.Arg, en donde X es cualquier residuo aminoácido e Y es preferiblemente lisina o arginina. Se encuentra claramente dentro de las capacidades de la persona especialista proporcionar sitios de corte alternativos, los cuales son reconocidos y/o apuntados por otras endoproteasas, las cuales podrían tener ubicaciones subcelulares alternativas deseadas.

Con objeto de que el sitio de corte de endoproteasas sea más asequible espacialmente a las endoproteasas, es preferible que la secuencia de engarce comprenda además una secuencia espaciadora. Tal secuencia espaciadora podría ser simplemente uno o más codones apropiados adicionales (por ejemplo, codones que codifican la glicina) colocados en cualquier lado del los nucleótidos que codifican el sitio de corte de la endoproteasa. El sitio de corte podría codificarse mediante cualquier secuencia de ADN que especifique una secuencia de aminoácidos apropiada para el corte con endoproteasas, y preferiblemente flanqueada con un número pequeño (2, 3, 4, etc.) de aminoácidos adicionales apropiados para hacer el sitio de corte más asequible a las endoproteasas. Cuando el sitio de corte es un sitio de corte para furina, éste podría codificarse mediante cualquier secuencia de ADN apropiada para el corte con furina (por ejemplo, Arg.X.Y.Arg, tal como se describió más arriba). Como un ejemplo, la secuencia del engarce podría ser AGG-GGT-CGA-CGC. Este sitio de corte podría estar flanqueado en cada extremo por codones adicionales codificando residuos glicina como secuencia espaciadora, por ejemplo, GGC-GGC-AGG-GGT-CGA-CGC-GGC-GGC, la cual codifica Gly.Gly.Arg.Gly.Arg.Arg.Gly.Gly. La secuencia de engarce podría comprender también la secuencia consenso MGN-NNN (excluyendo TRR)-ARR-MGN o MGN-NNN (excluyendo TRR)-MGN-MGN, tal como fue definido por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC, Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2ª edición, Portland Press, 1992, pp. 122-126).

La construcción de ácido nucleico podría ser de ADN, cADN, ARN, lineal o circular, de hebra única o doble, de tal forma que los dos o más polipéptidos estén codificados como un transcrito monocistrónico. Preferiblemente, la construcción forma parte de un vector que puede usarse para transfectar o infectar una célula huésped. Los vectores y células huésped que comprenden tal construcción de ácido nucleico constituyen un aspecto ulterior de la presente invención.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento in vitro o ex vivo para expresar dos o más polipéptidos en un célula diana, comprendiendo dicho procedimiento los pasos de,

a): construir una construcción de ácido nucleico tal como se ha definido más arriba; y

b): transfectar dicha célula diana con dicha construcción de ácido nucleico, de forma que dicha construcción de ácido nucleico se exprese para producir una proteína de fusión, la cual comprende dichos primer y segundo polipéptidos unido por un sitio de corte de endoproteasa, cortándose dicho sitio de corte mediante una endoproteasa dentro de la célula diana para generar los polipéptidos individuales primero y segundo biológicamente activos.

Preferiblemente, la construcción de ácido nucleico es parte de un vector de ácido nucleico, en particular un vector viral, por ejemplo, un vector retroviral. El vector retroviral podría transfectarse dentro de una línea celular de empaquetado retroviral. Estas células podrían usarse entonces para infectar la célula diana.

La construcción y el procedimiento de la presente invención podrían usarse como herramientas de investigación para estudiar la expresión y actividad de dos o más polipéptidos en una célula diana. Esto podría proporcionar la producción múltiples subunidades proteicas o complejos de proteínas, los cuales, después de aislarlos de las células diana, podrían usarse con propósitos industriales, de diagnóstico, o terapéuticos. Alternativamente, podrían usarse las células dianas por sí mismas para tales propósitos, incluyendo la generación de vacunas celulares (por ejemplo, vacunas contra células tumorales), que son transformadas con vectores que codifican tales proteínas quiméricas que expresan uno o más productos biológicamente activos (por ejemplo, la IL-12, la cual está compuesta por dos subunidades diferentes). El procedimiento podría usarse también para la expresión ectópica de múltiples proteínas en células que normalmente no expresan estas proteínas. El procedimiento principalmente proporciona la capacidad ventajosa de generar dos o más proteínas en proporciones molares especificadas. Esto tiene implicaciones particulares con respecto a la expresión de proteínas que tienen múltiples subunidades (por ejemplo, la IL-12), las cuales requieren la expresión de las subunidades independientes en cantidades equimolares. Más aún, las subunidades expresadas en cantidades molares diferentes pueden producir un efecto antagonista con respecto a la combinación de proteínas.

En una aplicación ulterior de la tecnología proporcionada en ésta, el sitio o sitios de reconocimiento y/o corte de endoproteasas incorporados podrían serlo para su corte mediante endoproteasas, incluyendo las endoproteasas específicas de un tejido, proporcionando así un mecanismo novedoso (distinto del suministro apuntado o de la transcripción específica de un tejido) para el procesamiento específico de tejido de proteínas únicas, o proteínas quiméricas compuestas de múltiples componentes, las cuales podrían ser inactivas antes de su corte proteolítico y activarse a resultas de este corte proteolítico, permitiendo de este modo una expresión específica de tejido de la actividad o actividades biológicas codificadas por los componentes individuales de la proteína quimérica, o por su acción concertada, juntos o con otros componentes celulares.

Alternativamente, la tecnología acorde con la presente invención podría usarse para el tratamiento de enfermedades en las que pueden apuntarse tipos celulares para la producción de dos o más polipéptidos. Tales tratamientos podrían incluir la terapia génica, para tratar un paciente que es incapaz de sintetizar los polipéptidos activos, o que es incapaz de sintetizarlos con el nivel normal o en asociación, proporcionando de ese modo el efecto proporcionado por los polipéptidos del tipo salvaje, es decir, los polipéptidos codificados por sí mismos o los productos de sus modificaciones ulteriores. Esto se describe con más detalle más abajo.

Breve descripción de las figuras

Los aspectos y realizaciones de la presente invención se describirán ahora sólo mediante ejemplos, con referencia a las figuras anexas. Otros aspectos y realizaciones serán evidentes para los especialistas en la técnica.

Figura 1, muestra un esquema general de la vía de secreción constitutiva, y de la vía de acción sobre proteínas quiméricas propuesta para la endoproteasa furina.

Figura 2, muestra una representación esquemática de los 7 vectores retrovirales que contienen diferentes combinaciones de construcciones "fusagenes" de IL-2, IL-4, p35 de IL-12, p40 de IL-12, y B7.1.

Figura 3, muestra la expresión sobre superficie celular de la B7.1 sobre células AM12 infectadas con pWZLB7
/IL2M, pWZLIL4/B7M, y pWZLIL2/B7M, detectadas mediante citometría de flujo usando CTLA4-Ig y FITC-Ig.

Figura 4, muestra estudios de bloqueo con anticuerpo de la actividad del TCGF (factor del crecimiento de la célula T) en sobrenadantes procedentes de células GP+envAM12 y GP+E86 transducidas con pWZLIL2/B7M. Se añadieron 1 \mug/ml de los anticuerpos irrelevante (UPC10) o neutralizante anti-IL-2 (5334.2) a diluciones 1:4 de los sobrenadantes. Se midió la incorporación de ^{3}H-timidina y se comparó con las mismas diluciones sin anticuerpos.

Figura 5A, muestra la respuesta proliferativa de las células CTLL a las citoquinas presentes en el sobrenadante procedente de células AM12 transducidas con pWZLIL4/B7M.

Figura 5B, muestra la respuesta proliferativa de las células CTLL a las citoquinas presentes en el sobrenadante procedente de células AM12 transducidas con pWZLIL4/IL2M, mediada en ausencia o presencia de anticuerpos neutralizantes de IL-2 y/o IL-4 a 1 \mug/ml. Los resultados se presentan como c.p.m. de ^{3}H-timidina incorporada después de un pulso de 4 horas.

Figura 6, muestra el ensayo de coestimulación de Jurkat con células empaquetadoras GP+E86 y GP+envAm12, transducidas con el vector pWZLIL2/B7M, como células estimulantes. Las barras indican la producción de IL-2 en respuesta a PHA-P y células empaquetadoras GP+envAM12, o GP+E86, como células estimulantes, en presencia de células Jurkat, y en ausencia o presencia de anticuerpos (a 1 \mug/ml) tal como se ha indicado. Abreviaturas: AM12 = GP + envAM12.

Figura 7, muestra la Tabla 1, la cual ilustra la producción de citoquinas por parte de las células transducidas, cuantificada mediante ELISA o ensayo CTLL para la medición de actividad biológica.

Figura 8, muestra la Tabla 2, la cual ilustra la expresión de B7 e IL-2, tal como se midió mediante citometría de flujo, en clones de células NIH/3T3, 32Dp210, K562 y OIB.

Figura 9, muestra la Tabla 3, la cual ilustra la expresión de IL-2 y B7.1 en células tumorales humanas.

Figura 10, muestra la Tabla 4, la cual ilustra la actividad biológica de las citoquinas (IL-2 e IL-12) en células Cos 7 transducidas con el vector Fusagene.

Descripción detallada de la invención

La construcción de ácido nucleico de la presente invención podría proporcionarse como un aislado, en forma aislada y/o purificada. El ácido nucleico podría ser total o parcialmente sintético y podría incluir ADN genómico, cADN o ARN.

La construcción de ácido nucleico podría comprender un cierto número de secuencias codificando polipéptidos, estando separada cada secuencia por una secuencia engarce que codifica un sitio de corte de endoproteasa ubicua o específica de tejido. La construcción podría ser fácilmente preparada por la persona capacitada usando la información y referencias en ésta, y las técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, ver Sambrook, Fritsch y Maniatis, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y Ausubel et al., "Short Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1992). Estas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar muestras de tales ácidos nucleicos, por ejemplo, a partir de fuentes genómicas, (ii) la síntesis química, o (iii) preparar secuencias de cADN. Las modificaciones de la secuencia de ácido nucleico podrían hacerse, por ejemplo, usando la mutagénesis dirigida contra un sitio, para conducir a la expresión de polipéptidos modificados o para tener en consideración la preferencia de codón en la célula diana usada para expresar la construcción.

Con objeto de obtener la expresión de la construcción de ácido nucleico, las secuencias pueden incorporarse en un vector que tiene secuencias de control operativamente unidas a los ácidos nucleicos que controlan su expresión. Los vectores apropiados pueden escogerse o construirse, conteniendo secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según sean apropiadas. Los vectores podrían ser plásmidos, virus, fagos, o fagémidos según sea apropiado. Para más detalles consultar, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, en la mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células, y en la expresión de genes, y en el análisis de proteínas, se describen en detalle en "Current Protocols in Molecular Biology", editores Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992.

Los dos o más polipéptidos pueden expresarse en la célula diana transformando el vector en células diana mediante transfección o infección. En tales células, en las que el vector es funcional, se expresa la proteína de fusión, que es el producto de expresión del la construcción de ácido nucleico, generando dos o más polipéptidos mediante el corte de la proteína de fusión dentro de la célula.

La presente invención permite que los polipéptidos sean procesados dentro de las célula, de tal forma que su actividad biológica normal o se mantiene o se modifica. Preferiblemente, al menos uno de los dos o más polipéptidos será capaz de ser secretado desde la célula en una forma activa.

Las células procariotas o eucariotas podrían usarse con este propósito, tal como se sabe en la técnica, por ejemplo, cepas de E. coli, levaduras, y células eucariotas tales como células COS o CHO. No obstante, de acuerdo con la presente invención, la célula diana podría ser una que carece de la expresión de ciertos polipéptidos, o en donde la expresión de otros polipéptidos podría afectar otros procesos biológicos. Además, las células diana podrían escogerse de forma que uno de los dos o más polipéptidos puede secretarse desde las células hacia el tejido que las rodea. Esto tendrá muchas implicaciones moleculares, por ejemplo, la terapia génica del cáncer. Aunque la presente invención podría utilizarse con cualquier tipo de célula, las líneas celulares sugeridas incluyen los fibroblastos, las epiteliales, las musculares, las neuronales, las parénquimas, las endócrinas, y las células derivadas de la médula ósea de varios tipos y orígenes.

Dependiendo de la célula diana, la secuencia de engarce que codifica el sitio de corte de endoproteasas podría tener que modificarse para garantizar que el sitio de corte es reconocido por una endoproteasa común en ese tipo de célula diana. Esto se halla dentro de las capacidades de la persona formada usando la información y referencias contenidas en ésta y el conocimiento general común. Se prefiere que la endoproteasa sea la furina, la cual se expresa en una amplia variedad de tejidos, y está altamente conservada entre especies eucariotas. Sin embargo, el uso sitios de corte de endoproteasas específicas de tejido, en vez de la furina, permitirá un nivel extra de especificidad, resultando en la producción de los componentes biológicamente activos deseados en tejidos específicos. Esto introduce un nivel extra de apuntamiento (además del suministro y transcripción específicos del tejido), y proporciona un procedimiento adicional para el suministro de compuestos citotóxicos y/o genes de convertasas de drogas.

La introducción de la construcción de ácido nucleico en una célula diana podría tener lugar in vivo o ex vivo a modo de terapia génica. Esto se discute más abajo.

Los polipéptidos codificados por la construcción de ácido nucleico podrían ser porciones activas, fragmentos, o derivados de polipéptidos o genes. Una "porción activa" de un polipéptido o gen es un péptido que es menos que dicho polipéptido del tipo salvaje de longitud completa, pero que retiene su actividad biológica esencial. Los polipéptidos se escogerán dependiendo de su función y de la célula diana concreta. Por ejemplo, podrían escogerse polipéptidos que normalmente no se expresan en la célula diana, o polipéptidos que pueden secretarse desde la célula diana hacia el tejido que la rodea. Por ejemplo, la construcción podría codificar compuestos citotóxicos o convertasas de drogas. La actividad biológica esencial requerida por los polipéptidos podría determinarse mediante ensayo rutinario de los polipéptidos expresados mediante, por ejemplo, la interacción de otras proteínas unidoras, por ejemplo, anticuerpos.

Otros procedimientos para determinar la actividad biológica son bien conocidos por las personas formadas en la técnica. Los ejemplos de tales procedimiento incluyen: la conversión de sustrato a producto (por ejemplo, enzimas); la generación de un producto (por ejemplo, hormona) y la medición del producto, bien directamente o a través de su actividad biológica (por ejemplo, crecimiento estimulado de las células que responden); unión u otras interacciones con proteínas u otras dianas tales como secuencias de ADN o ARN (por ejemplo, proteínas unidoras de ADN); nivel alterado de la producción de ARN o proteínas específicas (factores de transcripción); cambios medidos colorimétricamente causados por niveles reducidos de producto (enzimas); tinción de la propia proteína, su ligando de unión, u otros productos de su actividad.

La construcción de ácido nucleico de la presente invención, que codifica los dos o más auténticos polipéptidos biológicamente activos, podría usarse en un procedimiento de terapia génica para tratar un paciente que es incapaz de sintetizar los polipéptidos activos, o es incapaz de sintetizar tales polipéptidos, en células o tejidos específicos, en absoluto o en las cantidades requeridas o en las proporciones molares apropiadas, proporcionando de ese modo los efectos manifestados por tales polipéptidos del tipo salvaje, modificados o novedosos; o permitiendo que las células diana produzcan y/o secreten los polipéptidos en el medio que las rodea.

Los vectores tales como los vectores virales se han usado en la técnica previa para introducir genes en una amplia variedad de diferentes células diana. Típicamente los vectores se exponen a las células diana, de forma que pueda tener lugar la transfección en una proporción suficiente de las células para proporcionar un efecto terapéutico o profiláctico a partir de la expresión del polipéptido deseado. El ácido nucleico transfectado podría retenerse en la célula de forma transitoria o permanente, bien como un episoma, o como un polinucleótido que se replica de forma autónoma, o ser incorporado en el genoma nuclear o mitocondrial de las células, por ejemplo, células tumorales, proporcionando de ese modo efectos transitorios o de larga duración. En caso de expresión transitoria o de efectos transitorios el tratamiento podría repetirse periódicamente.

Una variedad de vectores, ambos vectores virales y vectores plasmídicos, son conocidos en la técnica, ver la patente estadounidense nº 5.252.479 y la WO-93/07.282. En particular, un cierto número de virus han sido usados como vectores de transferencia de genes, incluyendo los papovavirus, tales como el SV40, los virus de la viruela vacuna, los herpesvirus, incluyendo el HSV y el EBV, y los retrovirus. Muchos protocolos de terapia génica de la técnica previa usaron retrovirus desactivados de ratón.

Como una alternativa al uso de vectores virales, otros procedimientos conocidos para introducir ácido nucleico en células incluyen la electroporación, la coprecipitación con fosfato cálcico, técnicas mecánicas tales como la microinyección, la transferencia mediada por liposomas, mediante proyectiles de alta velocidad, y toma directa de ADN, y transferencia de ADN mediada por receptor, o incluso mediante fusión con protoplastos o células.

Tal como se ha mencionado más arriba, el propósito de la terapia génica usando ácido nucleico que codifique dos o más polipéptidos, o porciones activas de los mismos, pre o pre-pro-proteínas inactivas, es incrementar la cantidad del producto de expresión del ácido nucleico en las células en las que el nivel de los polipéptidos del tipo salvaje está ausente o presente sólo en niveles reducidos. Alternativamente, el objetivo podría ser modificar células diana de forma que produjeran determinados polipéptidos que usualmente no son producidos en esas células. Tal tratamiento podría ser terapéutico en el tratamiento de células que son, por ejemplo, cancerosas, o profiláctico en el tratamiento de individuos que se sabe son deficitarios en determinados polipéptidos. El tratamiento podría consistir también en la vacunación profiláctica o terapéutica (por ejemplo, mediante vacunas con células tumorales modificadas de este modo), o para la expresión de una convertasa de droga activa o convertasas de drogas inactivas, las cuales se activan después de tal procesamiento proteolítico.

Por tanto, la presente invención también proporciona construcciones, tal como se ha discutido más arriba, para su uso en tratamiento médico, y el uso de las construcciones en la preparación de un medicamento para el tratamiento de células cancerosas.

Materiales y procedimientos Clonación de los vectores fusión

Se construyeron dos vectores de fusión hIL2/hB7.1, uno contenía un cADN de hIL-2 de longitud completa y uno de hB7.1 de longitud completa, y un segundo vector que contenía hIL-2 de longitud completa y un cADN que sólo codificaba el producto maduro de la hB7.1. En ambos vectores, las secuencias codificantes de la IL-2 y B7.1 se separaron mediante un sitio de corte de furina, flanqueado en cada extremo por dos residuos glicina adicionales para hacer más asequible espacialmente el sitio de corte. Esta secuencia (GGC-GGC-AGG-GGT-CGA-CGC-GGC-GGC) contenía un sitio de reconocimiento SalI (indicado en negrita), y codifica Gly.Gly.Arg.Gly.Arg.Arg.Gly.Gly. Usando cebadores de PCR apropiados se amplificaron las secuencias de cADN de IL-2 y B7.1 en un cierto número de fragmentos, los cuales se secuenciaron individualmente para confirmar la ausencia de mutaciones. Estos fragmentos se ligaron para generar vectores retrovirales que contenían las secuencias de repetición terminal largas (LTR) del virus de la leucemia Moloney de ratón (MoMLV) y la hIL-2 de longitud completa (nucleótidos 48 a 507) fusionadas a través de un sitio de furina, o a hB7.1 de longitud completa (nucleótidos 318 a 1184), o a la hB7.1 madura (nucleótidos 396 a 1184), tal como se ilustra en la Figura 2, usando un esqueleto de plásmido derivado de pUC. Estrategias similares, evidentes para aquéllos especialistas en la técnica, se emplearon para la construcción de otros vectores ilustrados en la Figura 2C a Figura 2G.

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Producción de los vectores retrovirales Fusagene

Los plásmidos generados se transfectaron en la línea celular empaquetadora retroviral ecotrópica (GP+E-86), el sobrenadante del cultivo de las cuales, después de su selección en 4-8 \mug/ml de blasticidina S, se usó para infectar células de la línea celular empaquetadora anfotrópica (GP+env-Am12). El sobrenadante del cultivo de clones individuales de las células GP+envAM12 se usó para infectar diferentes células diana esencialmente tal como se ha descrito previamente (Gäken et al., 1997).

Análisis de la producción de citoquinas y de la expresión de B7.1 Producción de citoquina

El nivel de IL-2 e IL-4 se midió, bien usando ELISA, usando los anticuerpos JES6-1A12 y 11B11 para, respectivamente, la captura y detección de la IL-2; bien JES6-5H4 y BVD6-24G2 (Pharmigen San Diego, CA) para la captura y detección de la IL-4. En ensayo biológico de estas citoquinas se basó en la incorporación de ^{3}H-timidina por parte de células CTLL. Este ensayo se realizó en presencia de 1 \mug/ml de uno de los dos, o un anticuerpo irrelevante (ascites clarificados del clon UPC10, IgG2a de ratón) o anticuerpos neutralizantes contra la IL-2 (purificado, clon 5334.2, IgG2a de ratón, R&D Systems), o IL-4 (11B11).

Expresión de hB7-1

La expresión de B7.1 se midió mediante citometría de flujo, usando o el contrareceptor CTLA4, o anticuerpo monoclonal de ratón (clon BB1, IgM, PharMingen) conjugado con FITC. El CTLA4 se aisló a partir de sobrenadante de cultivo de tejido de células J558L productoras de CTLA4Ig, un obsequio del Dr. Christian Döhring, Basel Institute for Immunology, Basel, Suiza (Döhring et al., 1994), y se usó en conjunción con una IgG anti-humana de cabra conjugada con FITC (Sigma). La actividad fisiológica de la hB7.1 se confirmó mediante un ensayo de co-estimulación de células T mediado por CD28. Las células expresando hB7.1 se co-cultivaron en presencia o ausencia de un anti-CD25 monoclonal (clon 33B.1, IgG2a de rata, Immunotech) con las células T Jurkat que habían recibido la activación del complejo receptor de célula T/CD3 en presencia de 2-4 \mug/ml de PHA-P, seguida por la verificación de la producción de IL-2 mediante ELISA, tal como se ha descrito más arriba.

Resultados Construcción del vector IL-2/B7.1 humana

Se construyeron dos vectores retrovirales en los que las secuencias codificantes de la B7.1 e IL-2 se clonaron juntas, con un sitio de reconocimiento de furina entre los dos cADN (Figura 2). Los vectores contenían las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Moloney de ratón (MoMLV), las cuales controlan la transcripción de un único ARN mensajero policistrónico. En ambos vectores, la secuencia codificante de la IL-2 está seguida o por la secuencia codificantes de la B7.1 madura que carece del péptido señal (pWZLIL2/B7M, ver Figura 2A), o por la secuencia codificante completa de la B7.1 que contiene el péptido señal (pWZLIL2/B7F, ver Figura 2B). La secuencia IL-2/B7.1 está seguida por el sitio interno de entrada de ribosomas (IRES) del virus de la encefalomiocarditis (ECMV), el cual permite la traducción del gen blast que confiere resistencia frente a la blasticidina S. En ambos vectores, el péptido señal de la IL-2 es responsable del transporte de la proteína quimérica IL-2/B7.1 hacia el retículo endoplasmático (ER). La proteína quimérica codificada por estos vectores debería ser transportada hacia el aparato de Golgi, anclando el domino transmembrana de B7.1 la proteína a la membrana. Esto permitirá el corte de la proteína quimérica por parte de la furina en el aparato de Golgi, lo que resultará en la generación de un B7.1 unida a membrana citoplasmática y una IL-2 secretada.

En un vector control, pWZLB7/IL2M (Figura 2C), se invirtió la posición relativa del cADN de la IL-2 y B7.1. En este vector, se usa el péptido señal de B7.1, en vez del IL-2, para el transporte hacia el interior del ER. En esta configuración, la presencia de la región transmembrana de la B7.1 impide la entrada de la porción C-terminal de la proteína de fusión (que contiene la región citoplasmática de la B7.1, el sitio de corte de furina, y la IL-2 madura) en el lúmen del ER. Por tanto, el corte del sitio de furina no puede tener lugar puesto que el sitio de reconocimiento de la furina permanece fuera de Golgi.

Vectores que codifican la IL-4/IL-2 e IL-4/B7.1

Para investigar la aplicabilidad general de esta estrategia, se usó la misma estrategia para construir otras proteínas de fusión. El vector pWZLIL4/B7M codifica una proteína quimérica IL-4/B7.1. que contiene el sitio de furina entre la B7.1 y la IL-4 (Figura 2D). El vector pWZLIL4/IL2M codifica una proteína quimérica IL-4/IL-2 separada de nuevo por un sitio de corte de furina (Figura 2E). Estos vectores deberían codificar citoquinas secretadas y una B7.1 anclada en membrana.

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Cada uno de los plásmidos descritos se introdujo en células empaquetadoras retrovirales, y a continuación de su selección en función de su resistencia blast, se aislaron ambas líneas celulares, productoras de retrovirus anfotrópicas y ecotrópicas. Estos vectores se usaron para la transducción de células diana y el análisis de la expresión y actividad funcional de los genes de fusión codificados.

Vectores que codifican la IL-12 (p40 y p35), e IL-2/IL-12

Se construyeron otros dos vectores (ver Figuras 2 F y G). El vector F contiene el cADN de la p40 y p35 de IL-12, con un sitio de reconocimiento de furina entre los cADN. El vector G es un vector triple, con dos cADN de IL-12 (p35 y p40) y la secuencia codificante de la IL-2, que tiene dos sitios de furina separando las tres secuencias codificantes.

En ambos vectores F y G, el único péptido señal está presente en el fragmento p40. El péptido señal de la p40 e IL-2 se suprimió para evitar la probable interferencia debida a la presencia de múltiples péptidos señal en la proteína de fusión quimérica.

La presencia de la secuencia de reconocimiento de la furina permite el corte de la proteína quimérica en sus productos constituyentes.

Las construcciones de expresión celular que contienen la secuencia de reconocimiento de la furina muestran evidencia clara de producción de citoquinas, tal como se midió mediante ELISA (Figura 7, Tabla 1). Cuando la secuencia diana de la furina está presente entre IL-2 e IL-4 ambas citoquinas se secretan al medio de cultivo. De forma similar, en los vectores que codifican la IL-2/B7.1 o IL-4/B7.1 quimérica, con un sitio de furina intercalado, hay expresión de la B7.1 sobre la superficie celular, tal como se midió mediante análisis FACS (Figura 3). No obstante, una pequeña fracción de loa proteína quimérica permanece sin cortar. Esto se demuestra por la detección sobre la superficie celular de las citoquinas (Figura 8, Tabla 2), y por la detección basada en ELISA de la IL-2/IL-4 quimérica en ensayos en los que se usaron anticuerpos contra la IL-2 para la captura y anticuerpos contra la IL-4 para la detección, o viceversa (no se muestran los datos). Estos últimos experimentos demostraron que el nivel de producto no cortado dependía del tipo celular, reflejando probablemente su nivel endógeno de expresión de furina. Interesantemente, si ambas, la porción B7.1 y la IL-2 contenían péptidos señal, se liberaba sustancialmente menos citoquina (más de 80 veces) (Tabla 1). El mecanismo preciso de esta producción reducida de citoquinas no está claro, pero es probable que se deba a la interferencia, bien con la inserción de la proteína de fusión en el ER, o con su corte subsiguiente con furina en el aparato de Golgi. La generación de una B7.1 anclada en membrana y de una citoquina secretada a partir de las células infectadas con estos vectores depende de la presencia del sitio de corte de la furina. En ausencia del sitio de la furina no hay secreción de citoquinas hacia el medio de cultivo (no se muestran los datos). Similarmente, si el sitio de corte de la furina se coloca en una configuración que previene su entrada en el lúmen del ER, impidiendo así su acceso a la furina en el aparato de Golgi, no hay liberación de citoquinas. Esto se demuestra claramente en células transducidas con pWZLB7/IL2M (ver Figura 2C), en el cual el sitio de reconocimiento de la furina está unido al dominio citoplasmático de la molécula de B7.1 (Tabla 1). En esta configuración, el sitio de reconocimiento de furina permanece en el citoplasma, no entra en el lúmen del ER, y no consigue acceder a la furina en el aparato de Golgi. No obstante, hay una evidencia clara de expresión en superficie de la B7, tal como se determinó mediante análisis FACS (Figura 3).

Actividad biológica de los productos del gen de fusión Ensayos de proliferación de CTLL en sobrenadantes de líneas celulares infectadas con pWZLIL2/BM7 y pWZLIL2/B7F

Para determinar la actividad biológica de las citoquinas secretadas, se midió su efecto sobre la proliferación (incorporación de ^{3}H-timidina) de las células CTLL dependientes de citoquinas. Las células transducidas con el vector pWZLB7/IL2M produjeron significativamente más factor de crecimiento de células T (CTGF) que aquéllas transducidas con pWZLB7/IL2F. Esto es consistente con las mediciones basadas en ELISA de los niveles de citoquinas (ver Tabla 1).

Con objeto de confirmar que la IL-2 en los sobrenadantes de células empaquetadoras inducía la proliferación de las células CTLL, se realizaron estudios con anticuerpos bloqueadores. Las proliferación de las CTLL en respuesta a sobrenadantes pudo bloquearse con un anticuerpos neutralizante de IL-2, pero mucho menos eficientemente con el anticuerpo irrelevante (Figura 4).

Similarmente, se determinó la bioactividad de IL-2 e IL-4 producidas por células transducidas con pWZLIL4/B7M o pWZLIL4/IL2M sobre células CTLL (Figura 5). Estas células responden mucho más a la IL-2 que a la IL-4, por tanto, la adición de anticuerpo neutralizante de IL-2 tiene un pequeño efecto sobre la proliferación de las células CTLL. Sin embargo, incluso en presencia de anticuerpo neutralizante de la IL-2, la adición de IL-4 disminuye la incorporación de timidina, indicando la bioactividad de ambas, la IL-2 y la IL-4, producidas por estas células.

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Ensayo de coestimulación de Jurkat, usando un como células estimulantes células empaquetadoras GP+E86 y GP+env Am12, transducidas con el vector pWZLIL2/B7M

Para probar que las moléculas de B7.1 expresadas sobre la superficie de células transducidas era biológicamente activa, se realizó un ensayo de coestimulación de Jurkat. El co-cultivo de células Jurkat con las células transducidas con pWZLIL2/B7M en PHA-P resultó en niveles incrementados de IL-2 en el sobrenadante del cultivo (Figura 6). Esta activación de células Jurkat, mediada por la producción de IL-2, era dependiente de B7.1, y no pudo bloquearse mediante la inhibición del receptor de IL-2 (CD25). Por tanto, las células transducidas con pWZLIL2/B7M expresaron moléculas de B7.1 biológicamente activas, capaces de coestimular la activación de células Jurkat tratadas con PHA-P.

Actividad biológica de la IL-2: Activación de las células T por el sobrenadante de células Cos 7 transducidas con los vectores que contienen IL-12

La actividad biológica de la IL-12 en células transducidas con el vector F (ver Figura 2, F), y de la IL-12 más IL-2 en células transducidas con el vector G se confirmó tal como se describe más abajo.

La actividad biológica de la IL-12 se determinó mediante inducción del crecimiento en células T humanas activadas. Este crecimiento se midió mediante la incorporación de timidina radiactiva en el ADN celular. Se realizó un ensayo de acuerdo con Coligan et al., en "Current Protocols in Immunology", capítulo 6.16, Lymphoblast Proliferation Assay for IL-1. La actividad biológica de la IL-2 se midió usando un ensayo de CTLL estándar tal como se ha descrito más arriba. La Tabla 4 muestra el nivel de IL-12 e IL-2 biológicamente activas secretado en el medio de cultivo de células transducidas con los vectores F y G.

Transducción de células diana

Para investigar la expresión de tanto de la B7.1 como de la IL-2 en diferentes células, se infectó un panel de células de cultivos de tejidos, y se midió la expresión de B7.1 e IL-2. Las siguientes líneas celulares se infectaron con el vector de fusión pWZLIL2/B7M y se ensayaron en busca de la expresión sobre su superficie de B7.1 y la secreción de IL-2 al medio de cultivo: fibroblastos NIH/3T3 de ratón, células mieloides 32Dp210 de ratón, K562 de leucemia eritroide humana, y OIB, una adenocarcinoma ovárico humano. Para determinar la presencia de productos de fusión no cortados, las células se ensayaron también mediante análisis FACS según la presencia de IL-2 sobre la superficie celular (ver Tabla 2). El vector IL-2-B7.1 se ha usado también para infectar otras 3 líneas celulares, a saber, la línea celular A431 de tumor endometrial humano, y dos líneas celulares ováricas humanas, SKOV-3 y OVCA-432. Se ensayaron un total de 40 clones y todos fueron positivos para la expresión superficial de la B7.1 y la secreción de la IL-2 al sobrenadante (ver Tabla 3).

Las células Cos 7 se transfectaron mediante electroporación (Sambrook, Eritsch y Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Discusión

El sistema vector descrito aquí utiliza la presencia de un sitio de reconocimiento de furina para expresar ambas proteínas, secretada y unida a membrana, biológicamente activas, a partir de un único cistrón. Tal como se ha demostrado, tales vectores podrían ser plásmidos, o bien vectores basados en virus de ADN o ARN. El uso de sitios de corte de endoproteasas permite la expresión de un transcrito monocistrónico que es traducido en un producto de fusión quimérico, el cual se procesa a continuación mediante corte por endoproteasa para producir los componentes constituyentes. Por tanto, la proporción molar de los productos de la proteína estará determinada por la frecuencia de su representación en el vector. Si el vector contiene una secuencia de IL-2 y una secuencia de IL-4, las dos citoquinas se expresarán en una proporción equimolar; si hay dos secuencias codificantes de IL-2 y una de IL-4, las dos citoquinas se expresarán en la proporción molar 2:1 correspondiente. Más aún, el hecho de que siete construcciones que contienen diferentes combinaciones de genes resultaran todas en la producción de proteínas biológicamente activas indica que esta estrategia tiene una amplia aplicabilidad.

La variación en el nivel de IL-2 producida en diferentes líneas celulares es probable que sea un reflejo de la variación de los niveles de furina y/o eficiencias de los diferentes procesos implicados en la expresión de genes, y/o la estabilidad de los productos. El nivel de producción de IL-2 por parte de las células NIH/3T3 es mucho más inferior al observado en células 32Dp210, K562 y OIB. Esto es corroborado por los niveles más elevados de IL-2 detectable mediante FACS sobre la superficie de estas células NIH/3T3. La presencia de IL-2 sobre la superficie celular no es debida a una unión inespecífica de la IL-2 a las células, puesto que cuando las células productoras de IL-2 se mezclaron con células no productoras las dos poblaciones discretas fueron detectables mediante análisis FACS (no se muestran los resultados). Por tanto, la IL-2 sobre la superficie celular está probablemente todavía fusionada a la B7, indicando el ineficiente procesamiento de la proteína quimérica por parte del nivel de furina endógena de estas células. Este nivel reducido, o ineficiencia, del procesamiento mediado por furina se ha observado también en células COS. Sólo una pequeña fracción de pro-factor von Willebran (Wise et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9378-9382) y de la pro-insulina I de rata (Smeekens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8822-8826), las cuales son normalmente procesadas ambas por la furina en sus productos biológicamente activos, se produjeron en estas células. La cotransfección de células COS con vectores que codifican la furina resultó en una secreción de proteína incrementada en ambos sistemas (Wise et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9378-9382; Smeekens et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8822-8826). Por tanto, en células con niveles endógenos bajos de furina, la introducción de vectores de expresión de furina podría incrementar los niveles de furina, resultando de ese modo en el corte incrementado de las proteínas quiméricas que incorporen un sitio de corte de furina. Más aún, los cambios en el propio sitio de corte de la furina podrían mejorar la eficiencia. En las células de ovario de hámster chino, la secuencia de aminoácidos Arg-X-Lys-Arg permite un 50% de corte de la proteína precursora, mientras que Arg-X-Arg-Arg resulta en sólo un 30% de corte (Watanabe et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:8270-8274). Finalmente, el uso de sitios de corte de endoproteasas específicas de tejidos, en vez de la furina expresada ubicuamente, introducirá un ulterior nivel de especificidad, resultando en la producción de los componentes biológicamente activos deseados en tejidos específicos. Esto introduce un nivel extra de apuntamiento (además del suministro y transcripción selectiva para tejidos), y es probable que sea una estrategia particularmente atractiva en un cierto número de aplicaciones, incluyendo la terapia génica de alteraciones específicas de un tejido u órgano, sean hereditarias o de otro tipo, o para el suministro de diferentes proteínas o polipéptidos citotóxicos, citostáticos, o promotores de la diferenciación, o de proteínas con actividades catalíticas que les permiten convertir pro-drogas en drogas activas (convertasas de drogas) de manera específica para un tipo celular o tejido. El uso de tales sitios de reconocimiento de endoproteasas específicas de tejidos con objeto de conseguir el procesamiento y activación específicos de tejidos de proteínas quiméricas de otro modo inactivas, es otra ventaja de la presente invención.

Además de la actividad demostrada de la estrategia de fusión en vectores basados en plásmidos y retrovirus, ya descrita, los presentes inventores han obtenido también evidencia de actividad en vectores basados en adenovirus. El casete B7.1/IL-2 ha sido clonado en un vector de adenovirus (el vector Ad 5 con E1 suprimido). Este vector se usó para infectar una línea celular establecida (HeLa) y células de la leucemia mieloide aguda (AML) aisladas a partir de tres pacientes de AML. El análisis de cada una de estas poblaciones ha demostrado un elevado nivel de expresión de la B7.1 sobre superficie, y la producción de IL-2 secretada hacia el sobrenadante de cultivo de las células infectadas en exceso de 20 ng/10^{6} células/24 horas.

Claims

1. Construcción de ácido nucleico para la expresión de dos o más polipéptidos individuales biológicamente activos en una célula, que comprende una primera secuencia que codifica un primer polipéptido y una segunda secuencia que codifica un segundo polipéptido, estando separadas dichas primera y segunda secuencias por una secuencia de engarce que codifica un sitio de corte de endoproteasa.

2. Construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende una secuencia espaciadora ubicada en cualquiera de los dos lados de la secuencia de engarce que codifica el sitio de corte de endoproteasa.

3. Construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la secuencia espaciadora comprende ácido nucleico que codifica al menos dos aminoácidos.

4. Construcción de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de engarce comprende una secuencia de ácido nucléico que codifica Arg.X.Y.Arg, donde X es cualquier residuo aminoácido e Y es lisina o arginina.

5. Construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la secuencia de engarce comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica Arg.Gly.Arg.Arg, Arg.Pro.Lys.Arg, o Arg.Tyr.Arg.Arg.

6. Construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de engarce comprende AGG-GGT-CGA-CGC, CGG-CCT-AAG-AGG, o AGG-TAC-CGC-AGG.

7. Construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde la secuencia de engarce y la secuencia espaciadora codifican Gly.Gly.Arg.Gly.Arg.Arg.Gly.Gly, Gly.Arg.Pro.Lys.Arg.Pro, o Gly.Gly.Arg.Tyr.Arg.Arg.Gly.Gly.

8. Vector que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

9. Célula hospedadora que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 8 o una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Procedimiento ex vivo o in vitro para expresar dos o más polipéptidos en una célula, que comprende las etapas de,

a): construir una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

b): transfectar dicha célula con dicha construcción de ácido nucleico, de tal manera que dicha construcción de ácido nucleico se expresa para producir una proteína de fusión que comprende un primer y segundo polipéptidos unidos mediante un sitio de corte de endoproteasas, capaz de ser cortado por una endoproteasa dentro de la célula para generar los polipéptidos primero y segundo individuales biológicamente activos.

11. Procedimiento ex vivo o in vitro de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la construcción de ácido nucleico es parte de un vector de ácido nucleico.

12. Procedimiento ex vivo o in vitro de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el vector es un vector viral.

13. Procedimiento ex vivo o in vitro de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el vector viral es un vector retroviral o un vector basado en adenovirus.

14. Procedimiento ex vivo o in vitro de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en donde el vector viral se transfecta primero en una línea celular empaquetadora para producir virus, los cuales se usan a continuación para transfectar o infectar la célula.

15. Procedimiento para producir dos o más polipéptidos que comprende las etapas de,

b): transfectar una célula con dicha construcción de ácido nucleico, de tal manera que dicha construcción de ácido nucleico se expresa para producir una proteína de fusión que comprende un primer y segundo polipéptidos unidos mediante un sitio de corte de endoproteasas, capaz de ser cortado por una endoproteasa dentro de la célula para generar los polipéptidos primero y segundo individuales biológicamente activos; y

c): aislar dichos dos o más polipéptidos, a partir de la célula, individualmente o en combinación.

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16. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el primer y segundo polipéptidos son subunidades de una proteína.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el primer y segundo polipéptidos son subunidades de la IL-12.

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17 que además comprende una o más etapas adicionales de preparación de los polipéptidos para propósitos industriales, de diagnóstico o terapéuticos.

19. Procedimiento ex vivo o in vitro para producir una vacuna celular que comprende las etapas de,

a): construir una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el primer y/o segundo polipéptidos son capaces de invocar una respuesta inmune;

b): insertar dicha construcción de ácido nucleico en un vector de ácido nucleico;

c): transformar una célula con dicho vector, de tal manera que el primer y/o segundo polipéptidos o se secretan o se expresan y exhiben sobre la superficie de la célula.

20. Procedimiento ex vivo o in vitro de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la célula es una célula tumoral.

21. Procedimiento ex vivo o in vitro de acuerdo con la reivindicación 19 ó reivindicación 20, en donde el primer y segundo polipéptidos son subunidades de la IL-12.

22. Construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un vector de acuerdo con la reivindicación 8, para utilizar en un procedimiento de tratamiento del cuerpo animal o humano.

23. Utilización de una construcción de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, ó de un vector de acuerdo con la reivindicación 8, en la preparación de un medicamento para utilizar en un procedimiento de terapia génica.