ES2302565T3 - Proteinas de fusion bioactivas de il-12. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBEN PROTEINAS DE FUSION, TALES COMO UN POLIPEPTIDO IL12 BIOACTIVO, QUE COMPRENDEN AL MENOS DOS MONOMEROS DE POLIPEPTIDO (CADENAS DE AMINOACIDOS) UNIDAS MEDIANTE UN ACOPLADOR DE POLIPEPTIDO HETEROLOGO Y QUE SON BIOACTIVAS, ASI COMO SU PRODUCCION. ASIMISMO SE DESCRIBEN LAS CELULAS TUMORALES TRANSDUCIDAS PARA EXPRESAR LAS PROTEINAS DE FUSION Y METODOS PARA EL TRATAMIENTO DE LOS TRASTORNOS CARACTERIZADOS POR TUMORES ESTABLECIDOS.
Description
Proteínas de fusión bioactivas de
IL-12.
Esta solicitud se refiere a proteínas de fusión
bioactivas y a su utilidad en el tratamiento de tumores.
La producción de proteínas terapéuticas, tales
como aquéllas que son diméricas, es a menudo difícil, ineficaz y
cara. La producción de un dímero puede requerir la expresión
separada de los dos componentes, seguida de la unión de los
componentes para formar un dímero funcional. Serían útiles métodos
alternativos de producción de proteínas diméricas funcionales.
Eur. J. Immunol. (1995)
25:137-146, describe la expresión de las dos
subunidades de genes de interleucina-12 (p35 y p40)
a partir de un plásmido en el que p35 y p40 se fusionan mediante un
sitio de entrada ribosómico interno, de modo que p35 y p40 no están
unidas mediante aminoácidos tras la expresión.
J. Bio. Chem. vol. 268, 31,
23455-23459, 1993, da a conocer la construcción de
un ADNc que codifica para una bomba de Na de "una única
subunidad" en la que las subunidades \alpha y \beta de la
bomba se unen mediante un ligador de 17 aminoácidos.
En el presente documento se dan a conocer
proteínas de fusión que comprenden al menos dos monómeros
polipeptídicos (cadenas de aminoácidos) unidos a través de un
ligador polipeptídico y que son bioactivas, así como su producción.
En algunas partes de la descripción, las proteínas de fusión
bioactivas comprenden dos o más polipéptidos que se encuentran como
subunidades o monómeros en una proteína dimérica nativa bioactiva
correspondiente y están unidos a través de residuos de aminoácido
heterólogos (residuos de aminoácido que no están presentes entre
dos subunidades en la proteína nativa). Tal como se encuentra en la
naturaleza, la citocina IL-2 es un heterodímero
compuesto por una subunidad (p40) de 40 kDa unida por un enlace
disulfuro a una subunidad (p35) de 35 kDa. Gillessen. S. et
al., Eur. J. Immunology, 25:200-206 (1995);
Ozmen et al., J. Exp. Med., 180:907-915
(1995); Heinsel et al., Inf. & Immun.,
62(10):4244-4249 (1994). Por ejemplo, la
proteína de fusión es una proteína de fusión
interleucina-12 (IL-12) bioactiva
que comprende dos subunidades, denominadas p35 y p40, unidas
mediante un ligador polipeptídico. También se da a conocer una
proteína de fusión que comprende las subunidades de otros factores
de crecimiento hematopoyéticos diméricos unidos mediante un ligador
polipeptídico, o las subunidades de otras proteínas citocinas
diméricas unidas mediante un ligador polipeptídico. También se da a
conocer una proteína de fusión bioactiva que comprende dos
subunidades que son monómeros bioactivos (por ejemplo,
interleucina-2, GMCSF) en su forma nativa y que se
unen a través de un ligador polipeptídico para producir una
proteína de fusión que es de naturaleza quimérica o híbrida porque
comprende al menos dos componentes o subunidades que no se
encuentran juntas en una proteína nativa (por ejemplo, una proteína
de fusión de interleucina-2/GMCSF).
También se dan a conocer métodos de producción
de tales proteínas de fusión, constructos útiles en su producción y
células huésped que contienen los constructos a partir de los que se
expresan las proteínas de fusión codificadas. Las proteínas de
fusión se expresan en un sistema de expresión apropiado, tal como
mediante un vector de retrovirus que contiene y expresa ADN que
codifica para las subunidades o monómeros y el ligador polipeptídico
de la proteína de fusión deseada en una célula huésped apropiada,
tal como en células de mamífero. También se dan a conocer células
que se han transducido para secretar proteínas de fusión de
IL-12 de la presente invención, y particularmente
células tumorales que se han transducido para secretar una proteína
de fusión de IL-12. También se da a conocer el uso
de las células tumorales transducidas, particularmente en el
tratamiento de tumores.
Estas proteínas de fusión son útiles para los
mismos fines (por ejemplo, usos terapéuticos o diagnósticos) que la
proteína nativa correspondiente. Por ejemplo, pueden usarse las
proteínas de fusión de IL-12 para potenciar la
actividad lítica de los linfocitos T citotóxicos activados por
NK/linfocina, para actuar como un factor de crecimiento para
células NK y T humanas activadas y para estimular la producción de
IFN-\gamma apoyándose en células mononucleares de
sangre periférica (PBMC). La IL-12 es también útil
para tratar una variedad de cánceres. Por ejemplo, la
IL-12 es útil para el acrecentamiento de la
inmunidad antitumoral y, tal como se describe en el presente
documento, pueden usarse células tumorales que secretan o bien la
IL-12 nativa o bien una proteína de fusión de
IL-12 de la presente invención para tratar tumores
establecidos, tal como para prevenir el desarrollo adicional de un
tumor, hacer que remitan tumores establecidos, prolongar la
supervivencia, o una combinación de los mismos. Las proteínas de
fusión tienen ciertas ventajas con respecto a las proteínas nativas
correspondientes porque pueden producirse de manera eficaz y
reproducible mediante los métodos descritos en el presente
documento. Además, estas proteínas de fusión pueden tener también
ventajas con respecto a las proteínas nativas correspondientes en
cuanto a una actividad modificada o potenciada, una
biodisponibilidad más favorable y propiedades farmacocinéticas
mejoradas.
Según un primer aspecto, la invención
proporciona ADN que comprende ADN que codifica para la subunidad p35
de IL-12, preferiblemente de origen humano o de
ratón, que codifica para un ligador polipeptídico y ADN que
codifica para la subunidad p40 de IL-12,
preferiblemente de origen humano o de ratón, en el que el ADN que
codifica para el ligador polipeptídico está situado entre el ADN que
codifica para la subunidad p35 de IL-12 y el ADN
que codifica para la subunidad p40 de IL-12 y en el
que la expresión del ADN da como resultado la producción de una
proteína de fusión IL-12 bioactiva que comprende la
subunidad p35 de IL-12 y la subunidad p40 de
IL-12 unidas mediante el ligador polipeptídico
codificado.
En un segundo aspecto de la invención, se
proporciona una proteína IL-12 bioactiva que
comprende la subunidad p35 de IL-12,
preferiblemente de origen humano o de ratón, y la subunidad p40 de
IL-12, preferiblemente de origen humano o de ratón,
unidas mediante un ligador polipeptídico, que comprende
preferiblemente de 7 a 16 residuos de aminoácido.
Se proporciona, según un tercer aspecto de esta
invención, un método de producción de una proteína
IL-12 bioactiva que comprende las etapas de:
- a)
- proporcionar un vector de expresión que comprende ADN que codifica para la subunidad p35 de IL-12, preferiblemente de origen humano o de ratón, ADN que codifica para un ligador polipeptídico, preferiblemente de 7 a 16 residuos de aminoácido, y ADN que codifica para la subunidad p40 de IL-12, preferiblemente de origen humano o de ratón, en el que el ADN que codifica para el ligador polipeptídico está situado entre el ADN que codifica para la subunidad p35 de IL-12 y el ADN que codifica para la subunidad p40 de IL-12;
- b)
- introducir el vector de expresión en una célula huésped apropiada;
- c)
- mantener la célula huésped que resulta de la etapa b) en condiciones apropiadas para la expresión del ADN presente en el vector de expresión, dando como resultado la producción de una proteína IL-12 bioactiva en la que las dos subunidades se unen mediante el ligador polipeptídico.
En el presente documento se dan a conocer
células tumorales secretoras de IL-12,
preferiblemente seleccionadas de células tumorales
CMS-5 y células tumorales B16, para su uso en el
tratamiento para tratar a un sujeto que tiene un trastorno
caracterizado por un tumor establecido, preferiblemente reduciendo
el tamaño del tumor, más preferiblemente en un 50% o más,
prolongando la supervivencia del sujeto en comparación con un sujeto
no tratado, o ambos.
También se dan a conocer células tumorales que
secretan una proteína IL-12 bioactiva que comprende
la subunidad p35 de IL-12 y la subunidad p40 de
IL-12 unidas mediante un ligador polipeptídico, para
su uso en el tratamiento para tratar a un sujeto que tiene un
trastorno caracterizado por un tumor establecido, o para prevenir el
establecimiento de un tumor en un sujeto mediante la administración
a dicho sujeto tras la iniciación del tumor y antes del
establecimiento del tumor.
También se da a conocer la fabricación de un
medicamento para tratar un tumor, un fibrosarcoma, un melanoma o un
carcinoma de células renales establecidos, de células tumorales
secretoras de IL-12, preferiblemente células
CMS-5, células B16 o células de carcinoma de células
renales.
\vskip1.000000\baselineskip
En los dibujos adjuntos:
La figura 1 muestra las estructuras de
constructos retrovirales a base de SFG para la producción de
interleucina-12 (SD = donador de corte y empalme;
IRES = sitio de entrada ribosómico interno; SA = aceptor de corte y
empalme; LTR = repetición terminal larga).
La figura 2 muestra las secuencias de ácido
nucleico que codifican para las secuencias de ligador en las
proteínas de fusión de interleucina-12 de la
presente invención y las secuencias de p35 de IL-12
y p40 de IL-12 flanqueantes (SEQ ID NO: 1 a 4 y
35), así como las secuencias de aminoácidos codificadas (SEQ ID NO:
5 a 7 y 36).
Las figuras 3A-3U muestran el
mapa de restricción completo y la secuencia de ácido nucleico (SEQ
ID NO: 8 y 9) de pUC19-SFG.
Las figuras 4A-4C muestran la
secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 10 y 11) que codifica para
la subunidad p35 de IL-12 murina y la secuencia de
aminoácidos de la subunidad p35 de IL-12 murina (SEQ
ID NO: 12).
Las figuras 5A-5D muestran la
secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 13 y 14) que codifica para
la subunidad p40 de IL-12 murina y la secuencia de
aminoácidos (SEQ ID NO: 15) de la subunidad p40 de
IL-12 murina.
La figura 6 muestra una curva patrón generada
usando IL-12 murina recombinante.
Las figuras 7A-7D muestran
representaciones gráficas del efecto de la inmunoterapia de ratones
que portan tumor CMS-5 con células
CMS-5 secretoras de IL-12 y
GM-CSF, de tipo natural. El tratamiento se empezó o
bien en el día 7 (7A y 7B) o bien en el día 14 (7C y 7D) tras la
inducción del tumor. Los criterios de valoración son o bien la
supervivencia (7A y 7C) o bien la supervivencia libre de tumor (7B y
7D). Los tumores o bien no se trataron (a) o bien se trataron con
células CMS-5 secretoras de GM-CSF
(b), células CMS-5 secretoras de
IL-12 (c) o células CMS-5 de tipo
natural (d).
La figura 8 es una representación gráfica de la
incidencia de la regresión de tumores CMS-5
establecidos mediante un tipo de inmunoterapia. Se trataron los
tumores tal como sigue: la columna 1 no recibió inmunoterapia; la
columna 2 se trató con células tumorales de tipo natural; la columna
3 se trató con células tumorales secretoras de
GM-CSF; y la columna 4 se trató con células
tumorales secretoras de IL-12.
La figura 9 es una representación gráfica de la
regresión tumoral en ratones tratados con IL-12
sistémica. El cuadrado en blanco y sombreado, triángulo, círculo y
diamante representan 5 ratones individuales tratados con
IL-12 sistémica a 0,1 \mug/d administrada 5 días a
la semana durante 4 semanas.
Las figuras 10A-10B muestran
representaciones gráficas de la supervivencia superior que resulta
de la inmunoterapia con células CMS-5 secretoras de
IL-12 en comparación con la administración de
IL-12 sistémica o ningún tratamiento (nil). La
figura 10A representa los resultados usando un inóculo tumoral de 2
x 10^{5} células. La figura 10B representa los resultados usando
un inóculo tumoral de 4 x 10^{5} células.
Las figuras 11A-11B muestran
representaciones gráficas de la comparación de la eficacia
(proporción de ratones que sobreviven) de las células
CMS-5 que secretan diferentes formas de
IL-12 como inmunoterapia para tumores
CMS-5 establecidos. La figura 11A muestra los
resultados usando tumores iniciados mediante 2 x 10^{5} células
CMS-5 empezando el tratamiento en el día 14 (20
ratones por grupo reunidos a partir de dos experimentos). La figura
11B muestra los resultados usando tumores iniciados mediante 4 x
10^{5} células CMS-5 empezando el tratamiento en
el día 14 (1 grupo de 10 ratones). Los tumores o bien no se trataron
(a) o bien se trataron con células CMS-5 de tipo
natural (b), células CMS-5 secretoras de
GM-CSF (c), células CMS-5 secretoras
de IL-12 nativa (d) o células CMS-5
secretoras de proteína de fusión de IL-12 (e).
Las figuras 12A-12C son
ilustraciones gráficas de los resultados de la inmunoterapia de
tumores B16 (melanoma) con células tumorales secretoras de
citocinas. Para el modelo tumoral preexistente, se iniciaron tumores
con 4 x 10^{5} células B16 y se comenzó la inmunoterapia en el
día 7 (figura 12A) o en el día 14 (figura 12B). Para el modelo de
inducción (figura 12C), se administraron 5 x 10^{5} células
irradiadas como una vacuna 14 días antes de la inducción del tumor
con 1 x 10^{6} células B16. Los tumores o bien no se trataron (a)
o bien se trataron con células B16 de tipo natural (b), células B16
secretoras de GM-CSF (c), células B16 secretoras de
IL-12 nativa (d) o células B16 secretoras de
proteína de fusión de IL-12 (e).
Las figuras 13A-13B son
ilustraciones gráficas de los efectos sobre la inmunoterapia de la
administración de IL-12 mediante diferentes tipos
de células en ratones con tumores de carcinoma de células renales
(RENCA) preexistentes. La figura 13A muestra los resultados cuando
los tumores RENCA se trataron o bien con células tumorales
CMS-5 de tipo natural irradiadas
(C-wt) o bien con células tumorales
CMS-5 transducidas para secretar o bien
IL-12 nativa
(C-nIL-12) o bien la proteína de
fusión de IL-12
(C-scIL-12). La figura 13B muestra
los resultado cuando los tumores RENCA se trataron o bien con una
combinación de células CMS-5 y RENCA de tipo
natural (C-wt + R-wt), una
combinación de células RENCA secretoras de proteína de fusión de
IL-12 y células CMS-5 de tipo
natural (C-wt +
R-IL-12) o bien con una combinación
de células CMS-5 secretoras de proteína de fusión
de IL-12 y células RENCA de tipo natural
(C-IL-12 +
R-wt).
Las figuras 14A-14B son una
representación gráfica de los efectos sobre la inmunoterapia de
tumores CMS-5 preexistentes con células tumorales
RENCA secretoras de proteína de fusión de IL-12. La
figura 14A muestra los resultados cuando los tumores
CMS-5 se trataron o bien con células RENCA de tipo
natural o bien con células RENCA transducidas para secretar la
proteína de fusión de IL-12. La figura 14B muestra
los resultados cuando los tumores CMS-5 se trataron
o bien con una combinación de células RENCA de tipo natural y
CMS-5 de tipo natural (C-wt +
R-wt), una combinación de células RENCA secretoras
de proteína de fusión de IL-12 y células
CMS-5 de tipo natural (C-wt +
R-IL-12) o bien con una combinación
de células CMS-5 secretoras de proteína de fusión
de IL-12 y células RENCA de tipo natural
(C-IL-12 +
R-wt).
\vskip1.000000\baselineskip
En el presente documento se describen proteínas
de fusión bioactivas que comprenden al menos dos subunidades
ligadas o unidas mediante una ligador de aminoácidos intermedio, un
método de producción de las proteínas de fusión bioactivas,
constructos útiles para producir las proteínas de fusión que pueden
expresarse en células huésped, y células huésped que contienen los
constructos.
En una descripción, las proteínas de fusión
bioactivas comprenden: 1) al menos dos monómeros o subunidades
polipeptídicas que corresponden a las subunidades polipeptídicas
presentes en una proteína dimérica nativa que tiene una
bioactividad especificada y 2) al menos un ligador polipeptídico que
une las subunidades de tal modo que la proteína de fusión
resultante es bioactiva. Si la proteína de fusión resultante es
dimérica (incluye dos subunidades o monómeros), los dos componentes
pueden ser subunidades que se encuentran en la misma proteína
dimérica nativa (por ejemplo, dos subunidades de
IL-12); subunidades que se encuentran en dos
proteínas diméricas nativas diferentes (por ejemplo, una subunidad
de IL-12 y una subunidad de IL-3) o
monómeros que son bioactivos de manera individual (por ejemplo,
IL-12, GMCSF). Las proteínas de fusión multiméricas
que comprenden tres o más subunidades unidas mediante ligadores
polipeptídicos pueden comprender, por ejemplo, tres o más de las
subunidades que se encuentran en la misma proteína dimérica nativa
(por ejemplo, tres o más subunidades de IL-12),
tres o más subunidades que se encuentran en proteínas diméricas
nativas diferentes (por ejemplo, dos subunidades de
IL-12 y una subunidad de IL-3), tres
o más monómeros bioactivos (por ejemplo, tres monómeros de
IL-2, dos monómeros de IL-2 y un
monómero de GMCSF) o una combinación de subunidades de las
proteínas diméricas nativas y monómeros bioactivos (por ejemplo, dos
subunidades de IL-12 y un monómero de GMCSF). En
cada caso, un ligador polipeptídico está presente entre dos
subunidades (por ejemplo, el orden es
subunidad-ligador-subunidad-ligador-subunidad).
Tal como se usa en el presente documento, los términos subunidad y
monómero se usan de manera intercambiable para referirse a los
componentes de una proteína dimérica o multimérica y al único
componente de una proteína monomérica. El orden de las subunidades
en la proteína de fusión de la presente invención puede ser
p35-ligador-p40 o
p40-ligador-p35. En cualquier caso,
el ligador polipeptídico está situado entre las dos subunidades.
Una proteína de fusión bioactiva de la presente invención que
incluye subunidades que se encuentran en la misma proteína dimérica
nativa "imita" o es similar a lo que se denomina en el
presente documento como una proteína dimérica nativa correspondiente
en cuanto a su bioactividad, pero difiere de la proteína dimérica
nativa correspondiente en que la proteína de fusión incluye residuos
de aminoácido del ligador que no se encuentran en la proteína
nativa correspondiente (residuos de aminoácido heterólogos) entre
cada par de subunidades polipeptídicas. Una proteína nativa
correspondiente es una que incluye las subunidades presentes en la
proteína de fusión y que muestra la actividad biológica también
mostrada por la proteína de fusión.
En la proteína de fusión de
IL-12 bioactiva de la presente invención, las dos
subunidades, denominadas p35 y p40, de una proteína
IL-12 nativa de mamífero (por ejemplo, proteína
IL-12 de ser humano, ratón, rata, perro, gato,
mono, chimpancé o cerdo) están unidas a través de un ligador
polipeptídico. En este caso, la proteína nativa correspondiente es
la proteína IL-12 nativa de mamífero. De manera
similar, en el caso de otra proteína de fusión bioactiva, tal como
IL-3, la proteína nativa correspondiente es
IL-3. Los residuos de aminoácido de las subunidades
de la proteína de fusión bioactiva pueden ser iguales que los de las
subunidades de la proteína nativa correspondiente o pueden ser
diferentes, siempre que la proteína de fusión resultante muestre la
bioactividad deseada. Por ejemplo, la(s)
subunidad(es)
puede(n) tener una secuencia de aminoácidos diferente de la de la subunidad correspondiente de una proteína nativa (es decir, la secuencia de la subunidad nativa puede diferir en que uno o más residuos de aminoácido se ha(n) delecionado o sustituido por un residuo de aminoácido que se produce de manera natural o que no se produce de manera natural, se han incorporado residuos de aminoácido adicionales, o se ha modificado un residuo de aminoácido). La bioactividad deseada es una actividad similar a la de la proteína nativa correspondiente (por ejemplo, produce una respuesta fisiológica que resulta también de la actividad de la proteína nativa correspondiente). La bioactividad de una proteína de fusión (por ejemplo, la duración de su efecto, la magnitud de la respuesta resultante) puede ser mayor o menor que la de la proteína nativa correspondiente.
puede(n) tener una secuencia de aminoácidos diferente de la de la subunidad correspondiente de una proteína nativa (es decir, la secuencia de la subunidad nativa puede diferir en que uno o más residuos de aminoácido se ha(n) delecionado o sustituido por un residuo de aminoácido que se produce de manera natural o que no se produce de manera natural, se han incorporado residuos de aminoácido adicionales, o se ha modificado un residuo de aminoácido). La bioactividad deseada es una actividad similar a la de la proteína nativa correspondiente (por ejemplo, produce una respuesta fisiológica que resulta también de la actividad de la proteína nativa correspondiente). La bioactividad de una proteína de fusión (por ejemplo, la duración de su efecto, la magnitud de la respuesta resultante) puede ser mayor o menor que la de la proteína nativa correspondiente.
El ligador polipeptídico presente en la proteína
de fusión puede ser de cualquier longitud y composición apropiadas
para unir las dos subunidades de tal manera que la proteína de
fusión resultante tenga la actividad biológica deseada y conserve
su integridad como dímero o multímero. La longitud y composición
apropiadas de un ligador pueden determinarse empíricamente para la
proteína de fusión específica que va a producirse. Generalmente, el
ligador polipeptídico será de al menos 7 residuos de aminoácido,
aunque puede ser más corto (por ejemplo, de 2 a 6 residuos de
aminoácido). Normalmente el ligador será de menos de 30 residuos de
aminoácido de longitud, tal como de 7 a 25 residuos de aminoácido o
de 7 a 20 residuos de aminoácido de longitud. En una realización,
el ligador polipeptídico es de 7 a 16 residuos de aminoácido y en
realizaciones específicas es de 7, 11, 15 ó 16 residuos de
aminoácido. Los ligadores específicos usados para producir proteínas
de fusión de IL-12 bioactivas se representan en la
figura 2 y se describen en el ejemplo 4. En realizaciones
específicas, los ligadores polipeptídicos se muestran a modo de
ejemplo mediante las secuencias (Gly_{4}Ser)_{3};
(Gly_{4}Ser)_{3}Ser; (Gly_{4}Ser)_{2}Ser y
Gly_{6}Ser, y estos ligadores pueden usarse para unir las
subunidades de las proteína de fusión de IL-12 de
la presente invención. Alternativamente pueden usarse otros
ligadores polipeptídicos para unir dos subunidades de
IL-12 para producir una proteína de fusión de
IL-12
bioactiva.
bioactiva.
El ADN que codifica para la proteína de fusión
bioactiva puede ser ADNc o ADN genómico y puede provenir de una
variedad de animales, particularmente mamíferos. Por ejemplo, el ADN
puede ser ADN de ser humano, ratón, rata, perro, gato, mono,
chimpancé, cerdo o hurón. El ADN puede codificar para una subunidad
completa o entera (por ejemplo, una subunidad p35 completa de
IL-12 y una subunidad p40 completa de
IL-12) o para un fragmento o una parte de
una(s) subunidad(es), siempre que la proteína de
fusión codificada tenga la actividad biológica deseada cuando se
expresa. Las secuencias de ácido nucleico de ADN que codifica para
las subunidades p35 y p40 de IL-12 de ratón se
representan en las figuras 4 y 5, respectivamente. Se han publicado
las secuencias de ácido nucleico del ADN que codifica para las
subunidades p35 y p40 de IL-12 humanas (Gubler et
al. en Proceedings of the National Academy of Sciences, USA,
88:4143 (1991); Figura 4A-4C y
5A-5D). Puede usarse todo o una parte del ADN de
IL-12 para producir la proteína de fusión de
IL-12 objeto, siempre que la proteína de fusión
codificada sea bioactiva (tenga actividad de
IL-12).
Puede usarse cualquier sistema de expresión
apropiado para expresar una proteína tal como un sistema de
expresión en mamífero, bacteriano, en levadura o en insecto, para
expresar las proteínas de fusión de la presente invención. Por
ejemplo, tal como se describe en el presente documento, se ha usado
un vector viral (por ejemplo, uno retroviral) que expresa el ADN
(por ejemplo ADNc) que codifica para la proteína de fusión deseada
en una célula huésped de mamífero. Tal como se describe también en
el presente documento, se han construido retrovirus que contienen
ADNc que codifica para las subunidades p35 y p40 de
IL-12 y un ligador polipeptídico intermedio (una
proteína de fusión de IL-12) y se han transfectados
en células de empaquetamiento (por ejemplo, células de
empaquetamiento BOSC23). Se infectaron células diana (por ejemplo,
línea celular de fibrosarcoma CMS-5) con
sobrenadantes que contenían virus y se cultivaron; se sometieron a
ensayo los medios acondicionados por las células infectadas para
determinar la actividad de IL-12 usando un bioensayo
de proliferación de esplenocitos cebados con
interleucina-2 y concanavalina-A.
Pueden usarse líneas celulares productoras o de empaquetamiento
distintas de BOSC23 para producir retrovirus infecciosos que
contienen el ADN que codifica para la proteína de fusión. Además,
pueden usarse células diana distintas de una línea celular de
fibrosarcoma, tal como las líneas celulares de carcinoma de células
renales o de melanoma B16, para producir la proteína de fusión. La
bioactividad de IL-12 pudo demostrarse en las
células infectadas con los retrovirus, tal como se describe en el
ejemplo 4.
Se han construido retrovirus específicos para la
expresión de una proteína de fusión de IL-12
(ejemplo 1 y figura 1) y se ha demostrado que las células
infectadas con los retrovirus producen proteínas de fusión de
IL-12 bioactivas (véase el ejemplo 4). Todos los
retrovirus utilizados incluían la estructura principal retroviral
de SFG cuya secuencia se muestra en la figura 3. Los vectores
designados pSFG.IL-12.p35 y
pSFG.IL-12.p40 incluyen, respectivamente, el ADNc
para la subunidad p35 de IL-12 o el ADNc para la
subunidad p40 de IL-12. El vector designado
pSFG.IL-12.p35-IRES-p40
incluye el ADNc que codifica para la subunidad p35 de
IL-12 y el ADNc que codifica para la subunidad p40
de IL-12, separados por una secuencia de sitio de
entrada ribosómico interno. El vector designado
pSFG.IL-12p40-IRES-p35
incluye los mismos componentes que el plásmido
pSFG.IL-12p35-IRES-p40,
pero los dímeros están en el orden inverso, tal como se indica. Los
vectores designados
pSFG.IL-12.p35-ligador-p40
y
pSFG.IL-12.p40-ligador-p35
incluyen los ADNc que codifican para cada subunidad de
IL-12 ligada mediante el ligador
(Gly_{4}Ser)_{2}Ser y (Gly_{4}Ser)_{3}Ser
respectivamente. Los vectores designados
pSFG.IL-12.p35-ligador-\Deltap40
y
pSFG.IL-12.p40-ligador-\Deltap35
incluyen los ADNc ligados en los que se delecionaron del segundo
ADNc las secuencias que codifican para una supuesta secuencia líder
de 22 aminoácidos. El vector designado
pSFG.hIL-12.p40.ligador.\Deltap35 es una forma
humana de la proteína de fusión de IL-12 y es
análogo a la forma murina de
pSFG.IL-12.p40.ligador.\Deltap35 excepto en que
el ligador es más corto debido a una deleción que se produjo durante
la clonación (véase la figura 2, constructo E). Tal como se
describe en el ejemplo 4, se mostró la bioactividad de
IL-12 en el medio acondicionado de células
infectadas con los retrovirus.
También se dan a conocer células huésped
procariotas y eucariotas transfectadas mediante los vectores
descritos. Por ejemplo, las células que pueden transfectarse con
los vectores de la presente invención incluyen, pero no se limitan
a, células bacterianas tales como células de E. coli, de
insecto (baculovirus), células de levadura o de mamífero tales como
células de ovario de hámster chino (CHO). Las células tumorales que
se transducen para secretar las proteína de fusión de
IL-12 de la presente invención son particularmente
útiles.
Por tanto, los vectores de expresión descritos
en el presente documento pueden usarse para transformar, transfectar
o transducir células huésped, o bien eucariotas (de levadura,
aviares, de insecto o de mamífero) o bien procariotas (células
bacterianas), usando procedimientos convencionales usados para
producir otras proteínas bien conocidas. Pueden emplearse
procedimientos similares, o modificaciones de los mismos, para
preparar proteínas recombinantes según la presente invención por
medios microbianos o tecnología de cultivo de tejidos. Por ejemplo,
pueden transducirse células 3T3 derivadas de fibroblastos con los
vectores de la presente invención para expresar y secretar las
proteínas de fusión de IL-12 de la presente
invención. Las células tumorales y células 3T3 son útiles en el
contexto de la presente invención, ya que las células transducidas
para secretar IL-12 o proteínas de fusión de
IL-12 de la presente invención son una fuente útil
de la proteína o proteína de fusión (por ejemplo, para
purificación). Las células tumorales transducidas para secretar
IL-12 o proteínas de fusión de
IL-12 también tienen una utilidad particular como
agentes antitumorales tal como se describe en el presente
documento.
Las células tumorales que van a transducirse
pueden seleccionarse del individuo que va a tratarse o de otro
individuo; además, las células tumorales que van a transducirse
pueden ser del mismo tipo que las células tumorales del tumor que
va a tratarse o las células tumorales pueden ser de un tipo
diferente del tumor que va a tratarse. Por ejemplo, un tumo
CMS-5 puede tratarse con células tumorales
CMS-5, células tumorales de carcinoma de células
renales (RENCA), o células tumorales B16 que secretan
IL-12 o una proteína de fusión de
IL-12 de la presente invención. Alternativamente, el
tumor puede tratarse con una combinación de células secretoras de
IL-12, secretoras de proteína de fusión de
IL-12 y de tipo natural del mismo o diferente tipo
celular. Por ejemplo, un tumor RENCA puede tratarse con una
combinación de células RENCA de tipo natural y células
CMS-5 secretoras de proteína de fusión de
IL-12 o con una combinación de células
CMS-5 secretoras de IL-12 nativa y
células tumorales RENCA secretoras de proteína de fusión de
IL-12.
En el presente documento se dan a conocer
células tumorales transducidas que expresan IL-12
nativa o proteínas de fusión de IL-12 de la
presente invención y su uso para tratar tumores. Es decir, las
células tumorales transducidas que expresan y secretan
IL-12 o proteínas de fusión de IL-12
son útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer
o para tratar tumores establecidos y proporcionan un medio para
invertir tumores (reducir su tamaño o provocar su regresión
completa) o prevenir el crecimiento adicional de un tumor
establecido. Tal como se describe en el presente documento, las
células tumorales transducidas que expresan IL-12 o
proteínas de fusión de IL-12 de la presente
invención provocan la regresión de tumores establecidos, previenen
el establecimiento de tumores, prolongan la supervivencia o una
combinación de los mismos en animales a los que se les administran
en una dosis terapéuticamente apropiada.
Por ejemplo, las células tumorales que secretan
IL-12 o la proteína de fusión de
IL-12 de la presente invención pueden formularse
con un medio fisiológicamente aceptable para preparar una
composición farmacéutica. El medio fisiológico particular puede
incluir, pero no se limita a, agua, solución salina tamponada,
polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol
líquido) y disoluciones de dextrosa. La concentración óptima del/de
los principio(s)
activo(s) en el medio elegido puede determinarse empíricamente, según procedimientos bien conocidos por los químicos médicos, y dependerá de la formulación farmacéutica final deseada. Los métodos de introducción de las células tumorales secretoras de IL-12 o secretoras de proteína de fusión de IL-12 incluyen, pero no se limitan a, intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutáneo, oral e intranasal. Las células tumorales que secretan IL-12 nativa o una proteína de fusión de IL-12 pueden administrarse en o cerca del sitio de un tumor que va a tratarse o en cualquier otro sitio del cuerpo, siempre que la IL-12 o la proteína de fusión de IL-12 produzca el efecto terapéutico deseado (regresión de tumores establecidos, prevención del establecimiento de tumores o supervivencia prolongada). Tal como se describe en el presente documento, la proximidad del sitio del tumor y el sitio de administración no es necesaria para la eficacia del tratamiento. Otros métodos de introducción adecuados pueden incluir también dispositivos recargables o biodegradables y dispositivos poliméricos de liberación lenta. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento también pueden administrarse como parte de una terapia de combinación con otros agentes. Los regímenes de tratamiento dependerán de la dosis, la vía de administración, la frecuencia con la que se administra la composición, el tipo, el tamaño y la fase del tumor que va a tratarse, y la edad, salud y otras características físicas del individuo que va a tratarse.
activo(s) en el medio elegido puede determinarse empíricamente, según procedimientos bien conocidos por los químicos médicos, y dependerá de la formulación farmacéutica final deseada. Los métodos de introducción de las células tumorales secretoras de IL-12 o secretoras de proteína de fusión de IL-12 incluyen, pero no se limitan a, intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutáneo, oral e intranasal. Las células tumorales que secretan IL-12 nativa o una proteína de fusión de IL-12 pueden administrarse en o cerca del sitio de un tumor que va a tratarse o en cualquier otro sitio del cuerpo, siempre que la IL-12 o la proteína de fusión de IL-12 produzca el efecto terapéutico deseado (regresión de tumores establecidos, prevención del establecimiento de tumores o supervivencia prolongada). Tal como se describe en el presente documento, la proximidad del sitio del tumor y el sitio de administración no es necesaria para la eficacia del tratamiento. Otros métodos de introducción adecuados pueden incluir también dispositivos recargables o biodegradables y dispositivos poliméricos de liberación lenta. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento también pueden administrarse como parte de una terapia de combinación con otros agentes. Los regímenes de tratamiento dependerán de la dosis, la vía de administración, la frecuencia con la que se administra la composición, el tipo, el tamaño y la fase del tumor que va a tratarse, y la edad, salud y otras características físicas del individuo que va a tratarse.
Por ejemplo, se administra una cantidad (dosis)
terapéuticamente eficaz de las células tumorales transducidas
(opcionalmente formuladas con un medio fisiológicamente apropiado) a
un individuo que tiene un tumor que ha de tratarse (por ejemplo,
disminuir su tamaño o prevenir que aumente de tamaño). Las células
tumorales transducidas también pueden administrarse en una dosis
terapéuticamente apropiada a un individuo para prevenir el
establecimiento de un tumor. Por ejemplo, las células tumorales
transducidas pueden administrarse a un individuo que necesita
tratamiento antineoplásico (por ejemplo, un individuo con un tumor
establecido o un individuo en el que ha de prevenirse el
establecimiento de un tumor). Alternativamente, la proteína de
fusión de IL-12 de la presente invención puede
administrarse directamente al individuo en una dosis
terapéuticamente eficaz; la proteína de fusión de
IL-12 puede combinarse opcionalmente con un medio
fisiológicamente aceptable tal como se describió anteriormente.
Tal como se describe en el presente documento,
se evaluó la eficacia de las células tumorales secretoras de
IL-12 como inmunoterapia antitumoral en ratones con
cargas tumorales establecidas. Se usaron los tumores
CMS-5 inmunógenos (fibrosarcoma) y B16 no
inmunógenos (melanoma); también se utilizaron tumores RENCA tal como
se describe en el presente documento.
Tal como se muestra en los ejemplo
6-8, el trabajo descrito en el presente documento
demuestra que para el tratamiento inmunoterápico de tumores
CMS-5 palpables establecidos de 14 días, la
inmunoterapia con células tumorales secretoras de
IL-12 y secretoras de proteína de fusión de
IL-12 prolongaba la supervivencia induciendo la
regresión de los tumores. Además, la inmunoterapia con células
tumorales secretoras de IL-12 inducía la regresión
incluso cuando la carga tumoral palpable tenía un promedio de más
del 5% de masa corporal. Aunque IL-12 tiene una
actividad antitumoral frente a los tumores CMS-5
cuando se administra por vía sistémica, para ratones con cargas
tumorales más grandes en el comienzo del tratamiento había una
ventaja en la supervivencia significativa de la inmunoterapia con
células tumorales secretoras de IL-12 con respecto
al tratamiento con IL-12 sistémica. Esto muestra
que existe una ventaja administrando la IL-12
mediante células tumorales transducidas en lugar de sólo como
tratamiento con citocinas sistémicas. Los datos a partir de las
células tumorales transducidas para expresar un proteína de fusión
de IL-12
(SFG.IL-12.p40.ligador.\Deltap35) indican que las
formas humana y murina de la proteína de fusión tienen una
actividad específica al menos igual a la de la molécula nativa en
un bioensayo in vitro.
Los resultados descritos en el presente
documento muestran que la vacunación con células B16 secretoras de
IL-12 alteraban la historia natural del crecimiento
de tumores B16 establecidos posteriormente y parece que éstos
también pueden potenciar los mecanismos inmunológicos que pueden
modular el crecimiento tumoral. Las células B16 secretoras de
IL-12 son útiles como inmunoterapia para tumores B16
establecidos, ya que prolongan de manera eficaz la supervivencia.
Estos resultados muestran que existen mecanismos innatos inducibles
que pueden modular la historia natural de tumores establecidos en
el ratón, y que las células secretoras de IL-12 son
más potentes para inducirlos que las células secretoras de
GM-CSF. Estos resultados, que se describen de
manera más completa en los ejemplos a continuación, muestran que la
células tumorales secretoras de IL-12 tienen
eficacia como inmunoterapia para tumores establecidos.
La presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitativos de ningún
modo.
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En la figura 1 se muestra esquemáticamente la
estructura general de los plásmidos utilizados en estos estudios.
En la figura 2 se facilitan las secuencias confirmadas de los
ligadores en cada una de las proteínas de fusión.
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Los plásmidos que contenían los ADNc para las
subunidades p35 y p40 de IL-12 murinas
(pBS.IL-12.p35 y pBS.IL-12.p40) se
proporcionaron por Hoffmann-La Roche (Nutley, NJ).
La numeración de pares de bases en este documento corresponde a los
mapas de los insertos de estos dos plásmidos (figuras 4 y 5). El
plásmido que contenía la estructura principal retroviral de SFG se
proporcionó por el Dr. Dan Ory (Whitehead Institute, Cambridge, MA)
como pSFG-TPA, un plásmido pUC que contenía la
estructura retroviral de SFG entre los sitios HindIII y EcoR1 con un
ADNc activador de plasminógenos de tejido entre los sitios NcoI y
BamHI únicos en el retrovirus SFG. En la figura 3 se muestra un
mapa de secuencias de nucleótidos de la estructura principal
retroviral de SFG.
Se proporcionó el ADNc de
IL-12p35 en pBluescript con las secuencias que
rodean la ATG de iniciación de la traducción optimizado para dar
ACCATGG según las reglas de Kozak. Se escindió el fragmento de ADNc
de IL-12p35 como un fragmento
NcoI-EcoR1, habiéndose rellenado la proyección de
EcoR1 usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa 1 de E.
coli. Se ligó este fragmento usando la ADN ligasa de T4 en los
sitios NcoI-BamHI de pSFG, habiéndose rellenado la
proyección de BamHI usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa
1 de E. coli. El plásmido resultante se designa
pSFG.IL-12.p35.
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Se proporcionó el ADNc de
IL-12p40 en pBluescript. Se escindió el fragmento
NcoI-BamHI que contenía el ADNc de
IL-12p40 y se ligó en los sitios
NcoI-BamHI de pSFG para producir
pSFG.IL-12.p40.
La estrategia general para construir los
vectores retrovirales a base de SFG para la expresión de proteína
de fusión de IL-12 es tal como sigue: se
sintetizaron dos oligonucleótidos que codifican para la cadena
sentido y antisentido de un fragmento de ligador
(Gly_{4}Ser)_{3} y secuencias de ADNc de
IL-12 contiguas que van a unirse (con secuencias
terminales para la creación de proyecciones cohesivas que pueden
ligarse) usando un sintetizador de ADN
"PCR-mate" 391 (Applied Biosystems, Foster
City, CA). La secuencia del ligador (Gly_{4}Ser)_{3} era
la de Huston et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85:5879-5883 (1988)).
Para las dos proteínas de fusión que usan los
ADNc de IL-12 completos, se diseñaron los
oligonucleótidos que van a clonarse en un único sitio de enzima de
restricción en el extremo 3' del primer ADNc, reconstruyendo el
extremo 3' del primer ADNc y permitiendo que un fragmento
NcoI-NcoI que engloba la secuencia de ligador y
ADNc completo se clone en el sitio NcoI del plásmido SFG que
contiene el otro ADNc.
La estrategia de clonación fue similar para las
dos proteínas de fusión con una deleción de 66 pb que codifican
para los primeros 22 aminoácidos del segundo ADNc. Se diseñaron los
oligonucleótidos del ligador que van a clonarse en los únicos
sitios de enzimas de restricción que se encuentran en 3' de 66 pb de
las bases traducidas del segundo ADNc en el constructo de proteína
de fusión. Esto permitió que se escindiera un fragmento para la
clonación que reconstruía el extremo 3' del primer ADNc unido al
ligador y contenía el ligador unido al codón 23 del segundo
ADNc.
Se determinó la secuencia del ligador y las
regiones de ADNc contiguas en los plásmidos usando un kit
"Sequenase" (Amersham, Cleveland, OH).
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Los oligonucleótidos eran: sentido,
5'-CCGCC.GGT.GGC.GGT.GGC.TCG.GGC.GGT.GGT.GGG.TCG.GGT.
GGC.GGC.GGA.TCT.TCCATGGAGCT-3' (SEQ ID NO: 16); y antisentido, 5'-CCATGGA.AGA.TCC.GCC.GCC.
ACC.CGA.CCC.ACC.ACC.GCC.CGA.GCC.ACC.GCC.ACC.GGCGGAGCT-3' (SEQ ID NO: 17).
GGC.GGC.GGA.TCT.TCCATGGAGCT-3' (SEQ ID NO: 16); y antisentido, 5'-CCATGGA.AGA.TCC.GCC.GCC.
ACC.CGA.CCC.ACC.ACC.GCC.CGA.GCC.ACC.GCC.ACC.GGCGGAGCT-3' (SEQ ID NO: 17).
Se aparearon estos dos oligonucleótidos, se
fosforilaron usando la polinucleótido cinasa de T4, y se ligaron en
el sitio Sac1 de pBS.IL-12.p35 que se había
desfosforilado usando fosfatasa intestinal de ternero. Se escindió
el fragmento NcoI-NcoI del plásmido resultante que
contenía el ADNc de IL-12p35 y el ligador orientado
correctamente y se ligó en el sitio NcoI desfosforilado de
pSFG.IL-12p40 para crear
pSFG.IL-12.p35-ligador.p40 (la
orientación correcta de este fragmento ligado se demuestra mediante
un digesto de Sac1).
Se secuenció este plásmido usando los dos
cebadores siguientes:
5'-CAGAGTGAAAATGAAGCT-3' (SEQ ID NO:
18) y 5'-GAAGCTCTGCATCCTGCT-3' (SEQ
ID NO: 19), correspondientes a los pb 601-618 y
613-630 del ADNc de IL-12p35. La
secuenciación demostró que se había producido una deleción durante
la clonación dando como resultado una pérdida de 15 pb de las
secuencias de ligador, pero manteniendo un marco de lectura intacto.
La secuencia del ligador en este plásmido se facilita en la figura
2.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos eran: sentido,
5'-GGGTCCGATCC.GGT.GGC.GGT.GGC.TCG.GGC.GGT.GGT.GGG.
TCG.GGT.GGC.GGC.GGA.TCT.TCCATG-3' (SEQ ID NO: 20); y antisentido, 5'-GATCCATGGA.AGA.TCC.GCC.
GCC.ACC.CGA.CCC.ACC.ACC.GCC.CGA.GCC.ACC.GCC.ACC-GGATCGGACCCTGCA-3' (SEQ ID NO: 21).
TCG.GGT.GGC.GGC.GGA.TCT.TCCATG-3' (SEQ ID NO: 20); y antisentido, 5'-GATCCATGGA.AGA.TCC.GCC.
GCC.ACC.CGA.CCC.ACC.ACC.GCC.CGA.GCC.ACC.GCC.ACC-GGATCGGACCCTGCA-3' (SEQ ID NO: 21).
Se aparearon estos dos oligonucleótidos y se
ligaron en los sitios Sse83871 y BamHI de
pBS.IL-12.p40. Se escindió el fragmento
NcoI-NcoI del plásmido resultante que contiene el
ADNc de IL-12p40 y el ligador orientado
correctamente y se ligó en el sitio NcoI desfosforilado de
pSFG.IL-12p35 para crear
pSFG.IL-12.p40.ligador.p35 (la orientación correcta
de este fragmento ligado se demostró mediante un digesto de
Xcm1).
Se secuenció este plásmido usando los dos
cebadores siguientes:
5'-CTATTACAATTCCTCATG-3' (SEQ ID NO:
22) y 5'-GAGGGCAAGGGTGGCCAA-3' (SEQ
ID NO: 23), correspondiente a los pares de bases
997-1014 del ADNc de IL-12p40 y los
pares de bases 91-74 del ADNc de
IL-12p35 (un cebador antisentido). La secuenciación
confirmó que la secuencia del ligador y las secuencias de ADNc de
IL-12 contiguas eran tal como se esperaba.
El posterior mapeo con enzimas de restricción de
pSFG.IL-12.p40.ligador.p35 tras completar los
estudios de transfección y expresión reveló que contenía
probablemente un concatémero de fragmentos NcoI-NcoI
de la etapa final de clonación.
Los oligonucleótidos eran: sentido,
5'-T.TGC.TGG.AGC.TCC.GCC.GGT.GGC.GGT.GGC.TCG.GGC.GGT.
GGT.GGG.TCG.GGT.GGC.GGC.GGA.TCT.ATG.TGG-3' (SEQ ID NO: 24) y antisentido, 5'-CACAT.AGA.TCC.
GCC.GCC.ACC.CGA.CCC.ACC.ACC.GCC.CGA.GCC.ACC.GCC.ACC.GGCGGAGCTCCAGCAAA-3' (SEQ ID NO: 25).
GGT.GGG.TCG.GGT.GGC.GGC.GGA.TCT.ATG.TGG-3' (SEQ ID NO: 24) y antisentido, 5'-CACAT.AGA.TCC.
GCC.GCC.ACC.CGA.CCC.ACC.ACC.GCC.CGA.GCC.ACC.GCC.ACC.GGCGGAGCTCCAGCAAA-3' (SEQ ID NO: 25).
Se aparearon estos dos oligonucleótidos, se
fosforilaron usando la polinucleótido cinasa de T4, y se ligaron en
pBS.IL-12.p40 a partir del que se había escindido el
fragmento Xcm1-Xcm1 en 5' de 30 pares de bases. Se
escindió el fragmento Sac1-Sac1 del plásmido
resultante y se ligó en el sitio Sac1 de
pBS.IL-12.p35 que se había desfosforilado usando
fosfatasa intestinal de ternero (la orientación correcta del
fragmento ligado se demostró mediante un digesto de
NcoI-EcoR1). Se escindió el fragmento
NcoI-EcoR1 del vector resultante, habiéndose
rellenado la proyección de EcoR1 usando el fragmento Klenow de la
ADN polimerasa 1 de E. coli, y se ligó en los sitios BamHI
relleno con Klenow y NcoI de pSFG para crear
pSFG.IL-12.p35.ligador.\Deltap40.
Se secuenció este plásmido usando los siguientes
cebadores: 5'-CAGAGTGAAAATGAAGCT-3'
(SEQ ID NO: 18) y
5'-GAAGCTCTGCATCCTGCT-3' (SEQ ID
NO: 19), correspondientes a los pares de bases
601-618 y 613-630 del ADNc de
IL-12p35; y
5'-GTCATCTTCTTCAGGCGT-3' (SEQ ID
NO: 34), un cebador antisentido correspondiente a los pares de bases
217-200 del ADNc de IL-12p40. La
secuenciación confirmó que la secuencia del ligador y las secuencias
de ADNc de IL-12 contiguas eran tal como se
esperaba.
Los oligonucleótidos eran: sentido,
5'-CTG.GCC.TGC.AGG.GTC.CGA.TCC-GGT.GGC.GGT.GGC.TCG.GGC.
GGT.GGT.GGG.TCG.GGT.GGC.GGC.GGA.TCT-AGG.GTC.ATT.CCA.GTC.T-3' (SEQ ID NO: 26) y antisentido, 5'-CTGGAATGACCCT.AGA.TCC.GCC.GCC.ACC.CGA.CCC.ACC.ACC.GCC.CGA.GCC.ACC.GCC.ACC.GGA
TCGGACCCTGCAGGCCAGAGA-3' (SEQ ID NO: 27).
GGT.GGT.GGG.TCG.GGT.GGC.GGC.GGA.TCT-AGG.GTC.ATT.CCA.GTC.T-3' (SEQ ID NO: 26) y antisentido, 5'-CTGGAATGACCCT.AGA.TCC.GCC.GCC.ACC.CGA.CCC.ACC.ACC.GCC.CGA.GCC.ACC.GCC.ACC.GGA
TCGGACCCTGCAGGCCAGAGA-3' (SEQ ID NO: 27).
Se aparearon estos dos oligonucleótidos, se
fosforilaron usando la polinucleótido cinasa de T4 y se ligaron en
el sitio Pf1M1 en pBS.IL-12.p35 que se había
desfosforilado usando fosfatasa intestinal de ternero. La
orientación de este fragmento ligado se confirmó mediante un digesto
de Sse83871/EcoR1. Se escindió el fragmento
Sse83871-EcoR1 del plásmido resultante, habiéndose
rellenado la proyección de EcoR1 usando el fragmento Klenow de la
ADN polimerasa 1 de E. coli, y se ligó en sitios Sse83871 y
BamHI relleno con Klenow de pSFG.IL-12.p40 para
crear pSFG.IL-12.p40.ligador.\Deltap35.
Se secuenció este plásmido usando el cebador
5'-GCAAAGGCGGGAATGTCT-3' (SEQ ID NO:
28), correspondiente a los pares de bases 960-977
del ADNc de IL-12.p40. La secuencia del segundo
codón de ligador era difícil de leer, pero se determinó su
secuencia secuenciando el ligador clonado en el plásmido intermedio
usando los cebadores antisentido
5'-AGGAATAATGTTTCAGTT-3' (SEQ ID NO:
29) y 5'-CAGCAGTGCAGGAATAAT-3' (SEQ
ID NO: 30) correspondientes a los pares de bases
224-207 y 233-216 del ADNc de
IL-12p35 respectivamente. La secuenciación confirmó
que la secuencia del ligador y las secuencias de ADNc de
IL-12 contiguas eran tal como se esperaba.
Se proporcionó el fragmento del sitio de entrada
ribosómico interno (IRES) del virus de la encefalomiocarditis
(VECM) por el Dr. Michael Sadelain (Whitehead Institute, Cambridge,
MA), y era tal como se describió previamente (Ghattas et
al., Mol. Cell. Biol., 11:5848-5859 (1991)).
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron células de empaquetamiento BOSC23
(Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
90:8382-8396 (1993)) del Dr. Dirk Lindemann
(Whitehead Institute, Cambridge, MA). Se les realizó un pase en
medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con
suero de ternero al 10%, penicilina 50 U/ml y estreptomicina 50
\mug/ml.
Se obtuvieron células tumorales
CMS-5 (DeLeo et al., J. Exit. Med.,
146:720-734 (1977)) de Jason Salter (Whitehead
Institute, Cambridge, MA). Se les realizó un pase en DMEM
complementado con suero de ternero fetal al 10%, penicilina 50 U/ml
y estreptomicina 50 \mug/ml. Se usó el mis mo medio para la
recogida del medio acondicionado con CMS-5.
Se obtuvieron esplenocitos C57BL/6 para los
ensayos de IL-12 moliendo un bazo a través de un
tamiz (Falcon 2350, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y
recogiendo las células en medio de IL-12 (tal como
se detalla en Schoenhaut et al. (J. Immunol.,
148:3433-3440 (1992)) complementado con suero de
ternero fetal al 2%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron en placa células BOSC23 2 x
10^{6} células por placa de cultivo de tejidos de 6 cm y se
transfectaron mediante transfección de CaPO_{4} con los diversos
constructos tal como se describió previamente (Pear et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8382-8396 (1993)).
Veinticuatro horas tras la transfección, se sustituyó el medio por
5 ml de medio reciente. Se recogieron los sobrenadantes que
contenían virus 24 horas más tarde, se filtraron a través de un
filtro de 0,45 \mum y se añadió polibreno hasta una concentración
final de 8 \mug/ml. Se usaron 2,5 ml de sobrenadante que contenía
virus para infectar células CMS-5 inmediatamente
durante 4 horas (en la preparación para esta infección se habían
cultivado en placa células CMS-5 a 5 x 10^{4}
células/placa de cultivo de tejidos de 6 cm el día anterior) y se
congelaron los 2,5 ml restantes a -70ºC. Al día siguiente, se
descongelaron los 2,5 ml congelados de sobrenadante que contenía
virus y se usaron para una segunda infección de 4 horas de las
células CMS-5. Para recoger el medio acondicionado
que contenía IL-12 se sustituyó el medio al día
siguiente por 5 ml de medio reciente que se recogió 24 horas más
tarde. Se filtraron estos medios acondicionados a través de un
filtro de 0,2 \mum y se congelaron a -70ºC para someterlos a
ensayo más tarde para determinar la bioactividad de
IL-12. Se añadieron 5 ml de medio reciente a las
células CMS-5 y se recogió un segundo conjunto de
medios acondicionados 24 horas más tarde que también se filtraron y
congelaron para someterlos a ensayo más tarde. Entonces se lisaron
las células CMS-5 infectadas y se preparó el ADN
genómico para el análisis posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron los niveles de
interleucina-12 bioactiva usando un ensayo de
proliferación de esplenocitos cebados con
concanavalina-A e interleucina-2,
tal como se describe en Schoenhaut et al. (J. Immunol.,
148:3433-3440 (1992)). La concanavalina A se obtuvo
comercialmente de Boehringer (Mannheim, Alemania) y la
interleucina-2 humana recombinante comercialmente de
Chiron Therapeutics (Emeryville, CA). Para recoger las células para
la medición de la incorporación de [^{3}H]timidina en el
ADN celular, se usaron un colector de células Skatron (Sterling,
VA) y filtros Filtermats (nº 7031). Para someter a ensayo la
actividad inhibidora en los medios acondicionados, el volumen de
muestra de 50 \mul comprendía 25 \mul de 1000 pg/ml de
IL-12 murina recombinante y 25 \mul de la muestra
de prueba. Se sometieron a prueba las muestras de los medios
acondicionados por duplicado a diversas diluciones en el intervalo
de 1:1 a 1:1000. Se construyó una curva patrón para cada bioensayo
usando IL-12 murina recombinante en el intervalo de
20-10.000 pg/ml. Se obtuvo la IL-12
murina recombinante de Hoffmann-La Roche (Nutley,
NJ). Para calcular la concentración de IL-12
bioactiva en las muestras de prueba en pg/ml, se aproximó la parte
lineal de la curva patrón usando la función de ajuste de curva del
software "KaleidaGraph 2.1.1" y se usó la fórmula resultante
para los cálculos. Se verificó que los medios acondicionados tenían
inmunorreactividad de hIL-12 mediante el ensayo
ELISA de hIL12 (kit comercial, R & D Systems).
Se evaluó la capacidad de los siguientes
constructos (figura 1) para expresar una proteína de fusión de
IL-12 bioactiva:
\vskip1.000000\baselineskip
- A.
- pSFG.IL-12.p35.ligador.p40;
- B.
- pSFG.IL-12.p40.ligador.p35;
- C.
- pSFG.IL12-p35.ligador.\Deltap40;
- D.
- pSFG.IL12-p40.ligador.\Deltap35; y
- E.
- pSFG.hIL-12.p40.ligador.p35.
\newpage
Las secuencias para los ligadores en cada
constructo fueron tal como sigue, según se confirma mediante la
secuenciación (se facilitan algunas secuencias de
IL-12 confirmadas adyacentes para orientación):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
No era detectable ninguna actividad biológica de
IL-12 en los medios acondicionados mediante células
CMS-5 transfectadas de manera simulada, y células
CMS-5 infectadas con el retrovirus SFG solo, o
mediante un retrovirus (MFG) relacionado que porta el gen
lac-z. Sin embargo, los medios acondicionados
mediante estas células contenían una actividad inhibidora
significativa a diluciones de 1:2 y 1:10, inhibiendo hasta el 95% de
la actividad biológica de 500 pg/ml de rmIL-12
(tabla 1, y otros datos no mostrados). A pesar de estos antecedentes
de actividad inhibidora en los medios acondicionados, la producción
de IL-12 bioactiva demostró ser todavía
demostrable.
Los constructos para la expresión de las
subunidades individuales de la proteína IL-12
(pSFG.IL-12.p35 y pSFG.IL-12.p40)
no dieron como resultado ninguna bioactividad detectable por sí
mismos. Sin embargo, la co-transfección de células
BOSC23 con estos constructos juntos dio como resultado la secreción
de IL-12 bioactiva por las células
CMS-5 infectadas. De manera similar las células
CMS-5 infectadas con el retrovirus
SFG.IL-12.p35 y 24 horas más tarde con el
retrovirus SFG.IL-12.p40 también produjeron
IL-12 bioactiva (tabla 1).
Los constructos dicistrónicos diseñados para
expresar las dos subunidades de IL-12 usando la
secuencia de IRES dieron como resultado niveles similares de
producción de IL-12 bioactiva (a pesar de un nivel
indetectable de infección viral tal como se determina mediante
análisis de hibridación de tipo Southern (véase a continuación))
(tabla 1). La capacidad de los retrovirus que contienen IRES para
dar como resultado la producción de IL-12 bioactiva
se ha confirmado generando retrovirus clonales estables que producen
líneas celulares que usan estos dos constructos.
Todos los constructos de proteína de fusión de
IL-12 dieron como resultado la producción
significativa de IL-12 bioactiva por células
CMS-5 infectadas. De particular interés era el
constructo SFG.IL-12.p40.ligador.\Deltap35, para
el que la bioactividad de IL-12 era demostrable en
medio acondicionado no diluido (a pesar de los antecedentes de
actividad inhibidora sustancial) y para el que una dilución de
1:1000 de medio acondicionado contenía una bioactividad equivalente
a 301 pg/ml de rmIL-12 (tabla 1). Todos los
constructos dieron como resultado una bioactividad de
IL-12 valorable a pesar de una actividad inhibidora
no específica significativa en los medios acondicionados también.
La actividad biológica de hIL-12 se confirmó en
Hoffman-LaRoche (Nutley, NJ, laboratorio del Dr. M.
Gately), y se determinó que la actividad específica de la proteína
de fusión de hIL-12 era aproximadamente equivalente
a la actividad específica de la IL-12 humana nativa
recombinante.
Estos datos indican que la actividad de agonista
de IL-12 estaba presente en los medios
acondicionados mediante células infectadas con los constructos
retrovirales de proteína de fusión. Se supone que esto resulta de la
bioactividad de las proteínas de fusión respectivas secretadas.
Se demostró que las proteínas de fusión estaban
presentes usando inmunotransferencia de tipo Western. Se recogieron
los MA libres de suero de células CMS-5 de tipo
natural o células CMS-5 que expresan
IL-12 nativa o la proteína de fusión de
IL-12 (SFG.IL-12.p35.IRES.p40 o
SFG.IL-12.p40.ligador.\Deltap35), se filtraron
(0,2 \mum) y se almacenaron a -70ºC. Se concentraron los MA
20-30 veces, e hicieron correr 20 \mug de muestra
de proteína total sobre geles de poliacrilamida al 10% con o sin
\beta-mercaptoetanol al 10%. El anticuerpo
primario era un anticuerpo
anti-rmIL-12 de cabra policlonal
(obsequio de D. Presky, Hoffman-La Roche, NJ). Se
usó el sistema de detección "Renaissance" (NEN Dupont). Un
análisis preliminar indicó que resultaba una señal 4 veces mayor
del MA que contenía la proteína de fusión de IL-12
de una sola cadena
(SFG.IL-12.p40.ligador.\Deltap35), y por tanto se
cargaron 5 \mug de muestra de proteína total de este MA. Los
carriles control fueron MA de células de tipo natural sin o con
adición de 50 ng de rmIL-12.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el análisis de hibridación de tipo
Southern del ADN genómico de las poblaciones de células
CMS-5 infectadas para demostrar la presencia de una
banda de hibridación de acuerdo con la infección de estas células
por retrovirus de la estructura esperada, y para determinar la
eficacia de la infección viral (mediante la determinación del
número de copias retrovirales por genoma).
A partir de estos digestos de Nhe1 del ADN
genómico, se predijo una banda de hibridación derivada de retrovirus
de 985 pb más el tamaño del inserto clonado en los sitios
NcoI-BamHI de SFG (véase la figura 1). El tamaño de
los diversos fragmentos clonados fue: ADNc de
IL-12.p35, 0,6 kb; ADNc de
IL-12.p40, 1,0 kb; IRES, 0,7 kb; ligador, 0,05 kb;
la supuesta secuencia líder delecionada en dos constructos fue de
0,066 pb.
Los sobrenadantes de células BOSC23 dieron como
resultado números de copias virales de entre 0,1 y 1,4 copias/genoma
(principalmente 0,1-0,3 copias/genoma) para todos
los constructos excepto para los constructos que contenían IRES, en
los que no se observó ninguna banda de hibridación del tamaño
esperado (3,2 kb) (tabla 2).
De interés particular son los resultados
comparativos para los constructos de retrovirus de proteínas de
fusión de IL-12 en estas poblaciones de células
infectadas. Aunque el retrovirus
pSFG.IL-12.p35.ligador.p40 estaba presente a 1,4
copias/genoma, esto se correspondía con un nivel relativamente bajo
de producción de IL-12 bioactiva (tabla 2). Sin
embargo, el retrovirus
SFG.IL-12.p40.ligador.\Deltap35 dio como resultado
un nivel relativamente alto de bioactividad de
IL-12, aunque estaba presente a 0,2
copias/genoma.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron retrovirus SFG generados mediante
líneas celulares de empaquetamiento con CRE o CRIP para la
transducción de células tumorales. La cantidad de citocina
secretada in vitro por las células tumorales usadas en estos
estudios fue (en ng/ml/48 h/10^{6} células irradiadas [todas
recogidas en 10 ml]): células infectadas con
SFG.GM-CSF empaquetado con CRIP, B16>250,
CMS-5>250; células infectadas con
SFG.p35.IRES.p40.IL-12 empaquetado con CRE, B16
1-3, CMS-5 60-400;
células infectadas con
SFG.IL-12.p40.ligador.\Deltap35 empaquetado con
CRE, CMS-5 490-950; células
infectadas con SFG.IL-12.p35.IRES.p40 empaquetado
con CRIP, B16 90; y células infectadas con
SFG.IL-12-p40.ligador.\Deltap35
empaquetado con CRIP, B16 170 y RENCA 45. Se irradiaron las células
tumorales para evitar la formación de tumores adicionales a partir
de las mismas tras la inyección en ratones, y se caracterizó la
secreción de citocinas para las mismas células irradiadas. Se
determinaron las concentraciones de GM-CSF de los
medios acondicionados (MA) mediante ELISA (Endogen, Cambridge) y los
niveles de IL-12 mediante un bioensayo basado en la
proliferación de los esplenocitos cebados con
concanavalina-A e interleucina-2
(Schoenhaut et al. J. Immunol 148:3433 (1992)).
En un procedimiento inicial se iniciaron los
tumores de fibrosarcoma con 2 x 10^{5} células tumorales
CMS-5 inyectadas por vía subcutánea en el lomo de
ratones BALB/C singénicos, y se comenzó la inmunoterapia (células
tumorales secretoras de IL-12 o secretoras de
GM-CSF, de tipo natural irradiadas) o bien 7 o bien
14 días más tarde. En este experimento, se dividieron los ratones
en múltiples grupos de 5 a 10 ratones que recibieron o bien 1, 2 o
bien 3 dosis semanales de inmunoterapia a o bien 1 x 10^{6} o bien
5 x 10^{6} células/dosis. Sin embargo, el análisis primario se
dividió sólo por el tipo de células utilizadas como inmunoterapia y
el día en el que empezó el tratamiento, independientemente de otras
variables del programa.
Los ratones tratados con células tumorales
secretoras de IL-12 irradiadas mostraron una
supervivencia libre de tumores a largo plazo significativamente
mejor en comparación con los ratones no tratados o los ratones
tratados con células tumorales secretoras de GM-CSF
o de tipo natural, para programas de tratamiento que empiezan o
bien 7 o bien 14 días tras la exposición al tumor (figuras 7A y 7B,
p<0,05 para todas las comparaciones con la inmunoterapia con
células tumorales secretoras de IL-12). Cuando se
comenzaba la inmunoterapia 7 días tras el trasplante tumoral, gran
parte de las ventajas de supervivencia de los ratones tratados con
células tumorales secretoras de IL-12 se debía a la
prevención del desarrollo de tumores tardíos (figura 7C, p<0,05
para todas las comparaciones mediante la prueba del rango
logarítmico). Cuando la inmunoterapia se comenzaba 14 días tras el
trasplante tumoral, gran parte de las ventajas de supervivencia se
debía a la regresión de tumores establecidos (figuras 7C, 7D y 8,
p<0,005 en comparación con ratones que recibían inmunoterapia de
células tumorales secretoras de GM-CSF o de tipo
natural). El tamaño de los tumores palpables que remitieron en
ratones que recibieron inmunoterapia con células tumorales
secretoras de IL-12 oscilaba desde 1 hasta 8,5 mm
de diámetro promedio, y llegaron a no ser palpables
20-43 días (30 días de media) tras el trasplante
tumoral. El número de animales por grupo era respectivamente: 7A y
7B, 137, 40, 40, 38; y 7C y 7D, 18, 39, 40, 40. Los valores de p
facilitados son para la diferencia mínima significativa entre el
tratamiento con células secretoras de IL-12 y otros
grupos. Para determinar el efecto global, se reunieron los datos de
otros grupos que recibieron células de inmunoterapia similar
mediante varios programas.
Los análisis de subgrupos de tratamientos que
comenzaron en el día 14 sugerían que la supervivencia superior de
la inmunoterapia con células tumorales que secretaban
IL-12 resultaba de programas con más de una dosis
semanal de inmunoterapia (p = 0,1), dosis de 5 x 10^{6} en lugar
de 1 x 10^{6} células secretoras de IL-12
(p<0,02). Por eso, en todos los experimentos posteriores que
utilizan células tumorales transducidas, los regímenes de
inmunoterapia comprendían la dosis celular más alta administrada
semanalmente durante 4 semanas.
Se realizaron todos los análisis basándose en la
invención para tratar en el momento de la distribución aleatoria de
los ratones en grupos. Se calcularon los datos estadísticos
descriptivos para los principales criterios de valoración. Excepto
cuando se indique lo contrario, las diferencias en el criterio de
valoración de la supervivencia se evaluaron mediante la prueba de
suma de rangos de Wilcoxon. Para los análisis de supervivencia, las
muertes ocasionales inmediatamente tras la anestesia y el
tratamiento se trataron como acontecimientos censurados. Se usó la
prueba de chi cuadrado para medir la asociación de variables
categóricas. Cuando los valores de p resumen las comparaciones
entre múltiples grupos, sólo se facilita el valor de p más grande.
Se realizaron los análisis usando software de JMP en un ordenador
Power Macintosh 6100/60.
Con el fin de determinar si la inmunoterapia con
células tumorales secretoras de IL-12 era eficaz
contra cargas tumorales más grandes, se establecieron tumores con 4
x 10^{5} células tumorales, que, en comparación con 2 x 10^{5}
células, daban como resultado una incidencia tumoral mayor (tasas de
palpabilidad en el día 14 de 98/100 frente a 83/100
respectivamente), un tamaño tumoral medio más grande (6,7 \pm 3,0
frente a 3,7 \pm 2,4 mm de diámetro en el día 14,
respectivamente) y una supervivencia media más corta sin tratamiento
(31 frente a 37 días). Tras el establecimiento de estos tumores más
grandes, el 70% (7/10) de los ratones que portaban tumor tratados
con inmunoterapia con células tumorales secretoras de
IL-12 a partir del día 14 sobrevivieron con una
regresión tumoral completa, en comparación con los 0/10 ratones
tratados con células tumorales de tipo natural (p \leq
0,001).
La administración sistémica de
IL-12 (por vía intraperitoneal) a los ratones que
portaban tumores iniciados mediante 2 x 10^{5} células
CMS-5 también daba como resultado la regresión de
los tumores establecidos (figura 9) y mejoraba la supervivencia
(4/5 a los 90 días para ratones tratados con 0,1 \mug/d, en
comparación con 0/5 para ratones tratados con placebo). Para los
ratones con tumores establecidos a partir de 2 x 10^{5} células,
una dosis de IL-12 de 0,1 \mug/d (supervivencia de
4/5) era superior a 1 (supervivencia de 3/5), 0,01 (supervivencia
de 1/5) y 0,001 \mug/d, para regímenes que empezaban o bien 7 o
bien 14 días tras el trasplante tumoral.
Por tanto era posible que la regresión de los
tumores en ratones que recibieron inmunoterapia con células
secretoras de IL-12 no dependiera de la liberación
local de IL-12 en el sitio de las células tumorales
irradiadas administradas como inmunoterapia, sino más bien de un
efecto sistémico de la IL-12. Esto se evaluó
comparando diferentes programas que empezaban el día 14 que
combinaban inmunoterapia de células tumorales o bien secretoras de
IL-12 o bien de tipo natural y terapia sistémica o
bien con IL-12, placebo o bien nada. En los ratones
con tumores iniciados mediante 2 x 10^{5} células
CMS-5, había una tendencia por una supervivencia
global y media a ser mejor para la inmunoterapia con células
tumorales secretoras de IL-12 que para la terapia
sistémica con IL-12 (figura 10A). Esta tendencia
era estadísticamente significativa para ratones con tumores
iniciados mediante 4 x 10^{5} células (figura 10B, p = 0,006
comparando grupos que recibieron IL-12 sistémica (o
bien sola o bien en combinación con células de tipo natural) frente
a ratones que recibieron inmunoterapia con células tumorales
secretoras de IL-12 (o bien sola o bien con terapia
sistémica con diluyente)). Las comparaciones de grupos más
pequeños, tratados de manera uniforme (n = 10/grupo, tumores
iniciados mediante 4 x 10^{5} células) indicaban que combinar la
administración de células de tipo natural con IL-12
sistémica no era diferente a la terapia sistémica con
IL-12 sola (p = 0,85) y parecía inferior a la
vacunación con células tumorales secretoras de
IL-12 solas (p = 0,04) o administrada con terapia
sistémica con placebo (p = 0,19).
En el modelo tumoral CMS-5
preexistente, la inmunoterapia con células tumorales
CMS-5 que expresaban la proteína de fusión de
IL-12
SFG.IL-12.p40.ligador.\Deltap35 era tan eficaz
como el tratamiento con células tumorales que producen
IL-12 nativa (figuras 11A y 11B). Para los ratones
con tumores iniciados mediante o bien 2 x 10^{5} o bien 4 x
10^{5} CMS-5, la supervivencia era superior al 90%
para los grupos de ratones tratados con células
CMS-5 que secretan cualquier forma de
IL-12 en comparación con menos del 40% para los
ratones que no recibieron ningún tratamiento, o tratamiento con
células secretoras de GM-CSF o de tipo natural (p
\leq 0,02).
Con el fin de evaluar la eficacia de la
inmunoterapia con células tumorales secretoras de
IL-12 en otro modelo tumoral, se estudió el
melanoma B16 no inmunógeno. Se transdujeron células tumorales B16
para producir la IL-12 nativa a 90 ng/ml/48
h/10^{6} células irradiadas o la IL-12 de una sola
cadena (SFG.IL-12.p40.ligador.\Deltap35) a 170
ng/ml/48 h/10^{6} células irradiadas. Se iniciaron tumores B16 con
4 x 10^{5} células y se comenzó la inmunoterapia de tumores
establecidos o bien en el día 7 (palpabilidad tumoral del 25%) o
bien el día 14 (palpabilidad tumoral del 93%, diámetro tumoral
medio 5,74 \pm 3,23, n = 56)). Se analizó este procedimiento tras
31 días de seguimiento, cuando sólo sobrevivieron 1/60 (2%) de los
ratones que se trataron con células de tipo natural, células
secretoras de GM-CSF o nada como inmunoterapia.
Aunque los ratones tratados con células secretoras de
IL-12 tenían de manera análoga una mala
supervivencia global, su supervivencia media se prolongó
significativamente en comparación con la de los ratones control
tratados con células de tipo natural cuando el tratamiento
comenzaba en el día 7 (figura 12A, 24 frente a 18 días, p = 0,01) y
el día 14 (figura 12B, 28 frente a 18 días, p = 0,0005). De manera
similar, la supervivencia media se prolongó con el tratamiento con
células tumorales secretoras de proteína de fusión de
IL-12 cuando se comenzaba el tratamiento en el día
7 (21 frente a 18 días, p = 0,08) y el día 14 (24 frente a 18 días,
p = 0,006). En 3/4 ocasiones, las células tumorales secretoras de
IL-12 fueron superiores a las células secretoras de
GM-CSF (con respecto a los valores de p 0,01, 0,14,
0,003, 0,02).
Dado el potente efecto de las células B16
secretoras de GM-CSF para inducir inmunidad
antitumoral cuando se usan como vacuna antes de la exposición
tumoral, pero su falta de efecto sobre el crecimiento tumoral cuando
se administran tras el establecimiento tumoral, se compararon los
efectos de las células B16 secretoras de GM-CSF y
secretoras de IL-12 como vacunas en un modelo de
exposición a tumor B16. Las células B16 secretoras de
IL-12 utilizadas en estudios iniciales secretaban
IL-12 nativa a 1-3 ng/ml/48
h/10^{6} células irradiadas. Las células B16 secretoras de
GM-CSF inducían inmunidad antitumoral cuando se
usaban como vacunas antes del trasplante tumoral (figura 12C,
supervivencia del 80% en el día 100).
Se evaluó el efecto sobre la supervivencia del
suministro de IL-12 por las células tumorales de
diferente origen del tumor que va a tratarse en tumores de
carcinoma de células renales (RENCA). Se iniciaron tumores RENCA
con 4 x 10^{5} células, y se comenzó la inmunoterapia de los
tumores establecidos en el día 14. En un procedimiento, se trataron
los grupos de ratones o bien con células tumorales
CMS-5 o bien con células CMS-5 de
tipo natural irradiadas transducidas para secretar o bien la
IL-12 nativa o bien la proteína de fusión
SFG.IL-12.p40.ligador.\Deltap35 (figura 13A). En
otro procedimiento, se trataron grupos adicionales de ratones con
una combinación de células de tipo natural RENCA y
CMS-5 irradiadas, una combinación de células
tumorales RENCA secretoras de IL-12 y
CMS-5 de tipo natural irradiadas o una combinación
de células tumorales CMS-5 secretoras de
IL-12 y células tumorales RENCA de tipo natural
irradiadas (figura 13B).
En el primer procedimiento, la inmunoterapia
tanto con células tumorales CMS-5 que secretan la
IL-12 nativa como con proteína de fusión de
IL-12 prolongaba la supervivencia media (valores de
p de p = 0,02 y p = 0,06, respectivamente). En el segundo
procedimiento, los ratones tratados con una combinación de células
tumorales RENCA irradiadas y células tumorales
CMS-5 secretoras de IL-12 mostraban
una tendencia hacia una supervivencia aumentada.
Adicionalmente, se iniciaron tumores
CMS-5 con 4 x 10^{5} células, y se comenzó la
inmunoterapia de los tumores establecidos en el día 14. En un
procedimiento, se trataron los tumores CMS-5
establecidos o bien con células tumorales RENCA de tipo natural
irradiadas o bien con células tumorales RENCA transducidas para
secretar o bien la IL-12 nativa o bien la proteína
de fusión de IL-12
SFG.IL-12.p40.ligador.\Deltap35 (figura 14A). En
otro procedimiento, se trataron grupos adicionales de ratones con
una combinación de células de tipo natural RENCA y
CMS-5 irradiadas, una combinación de células
tumorales RENCA secretoras de IL-12 y
CMS-5 de tipo natural irradiadas o una combinación
de células tumorales RENCA de tipo natural irradiadas y células
tumorales CMS-5 secretoras de IL-12
(figura 14B).
En el primer procedimiento, la inmunoterapia con
células RENCA que secretan la proteína de fusión de
IL-12 prolongaba moderadamente la supervivencia de
los ratones en comparación con los ratones tratados con células
RENCA de tipo natural; el efecto concordaba con la dosis inferior de
IL-12 suministrada por las células RENCA
transducidas. En el segundo procedimiento, tanto los ratones
tratados con una combinación de células CMS-5
secretoras de IL-12 y células RENCA de tipo natural
como los ratones tratados con una combinación de células
CMS-5 secretoras de IL-12 y células
RENCA de tipo natural mostraron una supervivencia significativamente
prolongada (valores de p de p = 0,004 y 0,04) en comparación con
los ratones tratados con células RENCA de tipo natural y
CMS-5 de tipo natural.
Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán
determinar usando nada más que la experimentación rutinaria, muchos
equivalentes a las realizaciones específicas de la invención
descritas en el presente documento. Las siguientes reivindicaciones
pretenden abarcar tales equivalentes.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Whitehead Institute for Biomedical Research
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 9 Cambridge Center
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Cambridge
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO/PROVINCIA: MA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL/ZIP: 02142
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 617-258-5104
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- FAX: 617-256-S294
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE/INVENTOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Graham J. Lieschke
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 5 Rollins Court
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Cambridge
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO/PROVINCIA: MA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL/ZIP: 02139
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE/INVENTOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Richard C. Mulligan
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2 Sandy Pond Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Lincoln
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO/PROVINCIA: MA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL/ZIP: 01773
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENTION: Proteínas de fusión bioactivas y su uso en el tratamiento de tumores
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 36
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds, P.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Two Militia Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Lexington
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Massachusetts
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 02173
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/385.335
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 08-FEB-1995
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Granahan, Patricia
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.227
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: WHI95-01A.PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 617-861-6240
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: 617-861-9540
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
-
105
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
-
106
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
-
107
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6350 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6350 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 713 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 713 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 215 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1060 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1060 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 335 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 61 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 61 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 62 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 70 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 67 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 67 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 82 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 82 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares base
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DISPOSICIÓN EN HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
-
128
Claims (24)
1. ADN que comprende ADN que codifica para la
subunidad p35 de IL-12, ADN que codifica para un
ligador polipeptídico y ADN que codifica para la subunidad p40 de
IL-12, en el que el ADN que codifica para el ligador
polipeptídico está situado entre el ADN que codifica para la
subunidad p35 de IL-12 y el ADN que codifica para la
subunidad p40 de IL-12 y en el que la expresión del
ADN da como resultado la producción de una proteína de fusión de
IL-12 bioactiva que comprende la subunidad p35 de
IL-12 y la subunidad p40 de IL-12
unidas mediante el ligador polipeptídico codificado.
2. ADN según la reivindicación 1, en el que la
subunidad p35 de IL-12 y la subunidad p40 de
IL-12 son de origen humano o de ratón y el ligador
polipeptídico se selecciona del grupo que consiste en: las SEQ ID
NO: 5-7.
3. ADN según la reivindicación 1, que codifica
para una proteína IL-12 bioactiva, en el que la
proteína IL-12 bioactiva comprende la subunidad p35
de IL-12 nativa y la subunidad p40 de
IL-12 nativa unidas mediante un ligador
polipeptídico.
4. ADN según la reivindicación 3, en el que el
ligador polipeptídico se selecciona del grupo que consiste en: las
SEQ ID NO: 5-7.
5. Proteína IL-12 bioactiva que
comprende la subunidad p35 de IL-12 y la subunidad
p40 de IL-12 unidas mediante un ligador
polipeptídico.
6. Proteína de fusión de IL-12
bioactiva según la reivindicación 5 y codificada por el ADN según la
reivindicación 1, 2 ó 3.
7. Proteína IL-12 bioactiva
según la reivindicación 5, en la que la subunidad p35 de
IL-12 y la subunidad p40 de IL-12
son de origen humano o de ratón y el ligador polipeptídico es de 7
a 16 residuos de aminoácido.
8. Proteína IL-12 bioactiva
según la reivindicación 7, en la que el ligador polipeptídico se
selecciona del grupo que consiste en: las SEQ ID NO:
5-7.
9. Vector de expresión que comprende el ADN
según la reivindicación 1.
10. Vector de expresión según la reivindicación
9, que es un vector retroviral.
11. Vector de expresión según la reivindicación
10, que comprende la estructura principal retroviral de
pUC19-SFG, tal como se expone en la figura 3.
12. Vector de expresión según la reivindicación
11, que comprende un inserto, entre los sitios de enzimas de
restricción NcoI y BamHI de la estructura principal retroviral de
pUC19-SFG, que codifica para los siguientes
polipéptidos: la subunidad p35 de IL-12; un ligador
(Gly_{4}Ser)_{2}Ser; y la subunidad p40 de
IL-12.
13. Vector de expresión según la reivindicación
11, que comprende un inserto, entre los sitios de enzimas de
restricción NcoI y BamHI de la estructura principal retroviral de
pUC19-SFG, que codifica para los siguientes
polipéptidos: la subunidad p40 de IL-12; un ligador
(Gly_{4}Ser)_{3}; y la subunidad p35 de
IL-12.
14. Vector de expresión según la reivindicación
11, que comprende un inserto, entre los sitios de enzimas de
restricción NcoI y BamHI de la estructura principal retroviral de
pUC19-SFG, que codifica para los siguientes
polipéptidos: la subunidad p35 de IL-12; un ligador
(Gly_{4}Ser)_{3}; y la subunidad p40 de
IL-12 con los primeros 22 aminoácidos
delecionados.
15. Vector de expresión según la reivindicación
11, que comprende un inserto, entre los sitios de enzimas de
restricción NcoI y BamHI de la estructura principal retroviral de
pUC19-SFG, que codifica para los siguientes
péptidos: la subunidad p40 de IL-12; un ligador
(Gly_{4}Ser)_{3}; y la subunidad p35 de
IL-12 con los primeros 22 aminoácidos
delecionados.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Método de producción de una proteína
IL-12 bioactiva que comprende las etapas de:
a) proporcionar un vector de expresión que
comprende ADN que codifica para la subunidad p35 de
IL-12, ADN que codifica para un ligador
polipeptídico y ADN que codifica para la subunidad p40 de
IL-12, en el que el ADN que codifica para el
ligador polipeptídico está situado entre el ADN que codifica para la
subunidad p35 de IL-12 nativa y el ADN que codifica
para la subunidad p40 de IL-12 nativa;
b) introducir el vector de expresión en una
célula huésped apropiada; y
\newpage
c) mantener la célula huésped que resulta de la
etapa (b) en condiciones apropiadas para la expresión del ADN
presente en el vector de expresión, dando como resultado la
producción de una proteína IL-12 bioactiva en la
que las dos subunidades están unidas mediante el ligador
polipeptídico.
17. Método según la reivindicación 16, en el que
la subunidad p35 de IL-12 y la subunidad p40 de
IL-12 son de origen humano o de ratón y el ligador
polipeptídico es de 7 a 16 residuos de aminoácido.
18. Método según la reivindicación 17, en el que
el ligador polipeptídico se selecciona del grupo que consiste en:
las SEQ ID NO: 5-7.
19. Método según la reivindicación 16, en el que
el vector de expresión es un vector retroviral.
20. Método según la reivindicación 19, en el que
el vector de expresión comprende la estructura principal retroviral
de pUC19-SFG, tal como se expone en la figura
3.
21. Método según la reivindicación 20 que
comprende un inserto, entre los sitios de enzimas de restricción
NcoI y BamHI de la estructura principal retroviral de
pUC19-SFG, que codifica para los siguientes
polipéptidos: la subunidad p35 de IL-12; un ligador
(Gly_{4}Ser)_{2}Ser; y la subunidad p40 de
IL-12.
22. Método según la reivindicación 20, que
comprende un inserto, entre los sitios de enzimas de restricción
NcoI y BamHI de la estructura principal retroviral de
pUC19-SFG, que codifica para los siguientes
polipéptidos: la subunidad p40 de IL-12; un ligador
(Gly_{4}Ser)_{3}; y la subunidad p35 de
IL-12.
23. Método según la reivindicación 20, que
comprende un inserto, entre los sitios de enzimas de restricción
NcoI y BamHI de la estructura principal retroviral de
pUC19-SFG, que codifica para los siguientes
polipéptidos: la subunidad p35 de IL-12; un ligador
(Gly_{4}Ser)_{3}; y la subunidad p40 de
IL-12 con los primeros 22 aminoácidos
delecionados.
24. Método según la reivindicación 20, que
comprende un inserto, entre los sitios de enzimas de restricción
NcoI y BamHI de la estructura principal retroviral de
pUC19-SFG, que codifica para los siguientes
péptidos: la subunidad p40 de IL-12; un ligador
(Gly_{4}Ser)_{3}; y la subunidad p35 de
IL-12 con los primeros 22 aminoácidos
delecionados.
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