ES2206523T3

ES2206523T3 - Mutantes de tecf.

Info

Publication number: ES2206523T3
Application number: ES95942271T
Authority: ES
Inventors: Masahiko Kinosaki; Kyoji Yamaguchi; Fumie Kobayashi; Masaaki Goto; Akihiko Murakami; Masatsugu Ueda; Kanji Higashio; Yasushi Yamashita
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-12-27
Filing date: 1995-12-27
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2015-12-27
Also published as: EP0757994A1; NO963552L; US20020165358A1; ZA9510982B; AU4355196A; FI116223B; KR970701206A; NO319022B1; EP1275718A3; DE69531673T2; NO963552D0; WO1996020214A1; FI963313A0; US6399744B1; NZ298142A; DE69531673D1; CA2183856A1; CA2183856C; EP1275718A2; HU220167B

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN MUTANTE DE TCF, QUE TIENE UNA NUEVA SECUENCIA AMINOACIDA, LA CUAL SE OBTIENE POR MUTAGENESIS DE UNO O MAS AMINOACIDOS SITUADOS ENTRE EL EXTREMO N Y EL PRIMER DOMINIO "KRINGLE" DE LA SECUENCIA AMINOACIDA DEL TCF NATIVO, Y PRESENTA AFINIDAD DISMINUIDA A HEPARINA Y/O ELEVADA ACTIVIDAD BIOLOGICA. EL MUTANTE DE TCF DESCRITO, SE PREPARA MEDIANTE MANIPULACION GENETICA DE TCF. LOS MUTANTES DE TCF DE LA PRESENTE INVENCION, TIENEN ACTIVIDAD PROLIFERATIVA Y/O ACTIVIDAD ESTIMULADORA DEL CRECIMIENTO EN LOS HEPATOCITOS, Y SON BENEFICIOSOS COMO AGENTES TERAPEUTICOS PARA VARIAS ENFERMEDADES HEPATICAS Y COMO AGENTES ANTITUMORALES.

Description

Mutantes de TCF.

Campo de la invención

La invención se refiere a mutantes del factor citotóxico de tumores (TCF-II, en lo sucesivo TCF) que comprenden una nueva secuencia de aminoácidos, más específicamente, mutantes de TCF que se obtienen por mutagénesis de uno o más aminoácidos en la secuencia desde el extremo N al primer kringle de TCF nativo (es decir, de tipo silvestre, al que se hace referencia en este documento como "nativo") y muestran una menor afinidad a la heparina y, opcionalmente, mayor actividad biológica.

Los mutantes de TCF de la presente invención que muestran una actividad proliferativa y actividad estimuladora del crecimiento en los hepatocitos son beneficiosos para el tratamiento de diversas enfermedades hepáticas y como agentes antitumorales.

Antecedentes de la invención

El factor citotóxico de tumores (TCF-II) producido en las células del fibroblasto humano es una nueva sustancia antitumoral distinta de cualquier proteína antitumoral presentada hasta el momento. Los presentes inventores han clonado satisfactoriamente la codificación del ADNc de la proteína de la presente invención, han determinado la secuencia total de aminoácidos de la misma y han confirmado la utilidad de la misma (documento WO90/10651). El peso molecular de TCF era de 78.000 \pm 2.000, o 74.000 \pm 2.000 de acuerdo con los resultados de la electroforesis SDS en condiciones no reductoras, mientras que los resultados en condiciones reductoras indicaron una cadena A de 52.000 \pm 2.000, banda común, cadena B de 30.000 \pm 2.000 y/o cadena C de 26.000 \pm 2.000. El TCF es una proteína que tiene una alta afinidad con la heparina o con una sustancia similar a la heparina y muestra una alta actividad antitumoral frente a células de tumores y la actividad proliferativa en células normales. Además, se confirmó que pertenece a una variedad amplia de familias de HGF, un factor de crecimiento para hepatocitos. Por lo tanto, como el TCF no es sólo un factor antitumoral, sino también un factor de crecimiento de los hepatocitos, se sabe que es beneficioso en la regeneración del hígado y después de la hepatectomía.

Se han realizado muchas investigaciones sobre los aspectos de la relación estructura-función del factor de crecimiento del hepatocito (HGF) hasta el momento. Por ahora se han presentado aproximadamente 20 especies de mutantes de eliminación y aproximadamente 50 especies de mutantes de punto (K. Matsumoto, et al., Biochem Biophys. Res. Comm., vol. 181, pág. 691-699; G. Hartmann, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pág 11574-11587 (1992); N.A. Lokker, et. al., EMBO J Vol. 11, pág 2503-2510 (1992); M. Okigaki et. al., Biochemistry, vol. 31, pág. 9555-9561 (1992); N.A. Lokker, et. al., Protein Engineering, vol. 7, pág. 895-903 (1994)), sin embargo hasta ahora no se ha obtenido un mutante que muestre claramente una alta actividad biológica.

Se sabe que la vida medida in vivo de TCF es extremadamente corta, aproximadamente 2 minutos. Por lo tanto, se anticipa que debe administrarse una cantidad relativamente grande de proteína para el tratamiento de diversas enfermedades. Es concebible que el nivel de dosificación de TCF administrado se reducirá aumentando la actividad biológica del mismo o prologando la vida media in vivo del mismo. Aunque se han descrito mutantes de TCF con mayor vida media en la publicación de patente WO94/14845, hasta el presente no se han obtenido mutantes de TCF con una alta actividad biológica, como el HGF descrito anteriormente.

Por lo tanto, los presentes investigadores han investigado para obtener un mutante de TCF que muestre una alta actividad biológica o una prolongación de la vida media in vivo. Más específicamente, los presentes investigadores han realizado una investigación para obtener el mutante mencionado anteriormente con alta actividad biológica o con una vida media in vivo prolongada que es diferente de TCF nativo con respecto a la secuencia de aminoácidos alterando la codificación de la secuencia de ADN de la secuencia de aminoácidos de TCF nativo y expresando el ADN del mismo. En consecuencia, un objeto de la presente invención es proporcionar un mutante de TCF con una vida media in vivo prolongada debido a la menor afinidad a la heparina y, opcionalmente, también una alta actividad biológica.

Los presentes investigadores han investigado el objeto anterior y han obtenido nuevos mutantes de TCF que tienen secuencias de aminoácidos distintas de las del mutante de TCF descubierto antes de la presente invención y que muestran menor afinidad a la heparina, y, opcionalmente, también una alta actividad biológica. La presente invención proporciona mutantes de TCF que muestran aumentos de más de 10 veces en la actividad específica (actividad biológica por cantidad unitaria de proteína) y menor afinidad a la heparina.

Estos son los primeros mutantes con actividad biológica extremadamente alta obtenidos por mutagénesis de la secuencia de aminoácidos de TCF nativo.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona mutantes de TCF con menor afinidad a la heparina obtenidos por mutagénesis de uno o más restos aminoacídicos en la secuencia de aminoácidos del extremo N al primer kringle de TCF nativo, como se reivindica en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra los perfiles de electroforesis SDS de TCF y de los mutantes de TCF purificados de la presente invención.

La Figura 2 muestra la acción proliferativa de TCF y de los mutantes de TCF purificados de la presente invención en el hepatocito. La actividad relativa (%) del eje vertical se representa como la relación de actividad proliferativa de cada muestra basada en la de 10 ng/ml de TCF como 100%.

Los mutantes RI42A y R6KD132A6AA son construcciones de referencia y no son parte de la presente invención.

La Figura 3 muestra la comparación de la acción proliferativa en hepatocitos entre el mutante purificado RKRR2A-
AAA y el TCF.

La Figura 4 muestra la comparación de la acción proliferativa en hepatocitos entre el mutante purificado KIKTKK-
27AIATAA y el TCF.

La Figura 5 muestra la comparación de la acción proliferativa en las células epiteliales del riñón entre el mutante purificado RKRR2AAAA, el mutante KIKTKK27AIATAA y el TCF.

La Figura 6 muestra la comparación de la acción proliferativa en las células de la médula ósea entre el mutante purificado RKRR2AAAA, el mutante KIKTKK27AIATAA y el TCF.

La Figura 7 muestra los efectos de la dosis de TCF purificado, el mutante RKRR2AAAA y el mutante KIKTKK27-
AIATAA en el nivel en suero de proteína total en ratas.

La Figura 8 muestra los efectos de la dosis de TCF purificado, el mutante RKRR2AAAA y el mutante KIKTKK27-
AIATAA en el nivel en suero de colesterol HDL en ratas.

Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas

Comparando las propiedades de la proteína nativa y un mutante obtenido por mutagénesis en alguna parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína, se puede estimar la función de esa porción. En el caso de una proteína cuya estructura no se conoce con exactitud, a menudo se usa para sustituir un aminoácido, tal como Ala, que no afectará a la estructura estérica, por un aminoácido polar que se supone que está en la superficie de una proteína, para evitar un cambio estructural de la proteína debido a la mutagénesis. Para cambiar en un lugar específico una secuencia de aminoácidos de una proteína por otra, se puede preparar ADNc con mutaciones en lugares específicos mediante el método PCR (reacción en cadena de la polimerasa) usando la codificación del ADNc de TCF nativo como plantilla y la codificación de oligonucleótidos sintéticos para los otros aminoácidos.

El ADNc obtenido como se ha descrito anteriormente se puede insertar en un vector con un promotor de expresión adecuado (citomegalovirus (CMV), SR\alpha (Mole. Cell. Biol. vol. 8; No. 1, pág. 466-472 (1988) y el Solicitud de Patente Japonesa Publicada No Examinada 277479 (1989) y transfectado en células eucarióticas, tales como células de mamíferos. Cultivando estas células, se pueden preparar los mutantes de TCF objetivo con el caldo de cultivo.

Se pueden construir muchos mutantes de TCF introduciendo mutaciones en diferentes lugares o restos. En la presente invención, se prepararon 4 mutantes. Estos mutantes se especifican enumerando la secuencia de aminoácidos antes de la mutagénesis, el número de aminoácido en el extremo N de la parte mutagenizada y la secuencia alterada de aminoácidos después de la mutagénesis con el código de una letra del aminoácido. Por ejemplo, si se sustituye toda la secuencia Arg-Lys-Arg-Arg en la segunda posición a partir del extremo N con Ala, el mutante se representa como RKRR2AAAA. Como ejemplo adicional, el mutante cuya secuencia original Lys-Ile-lys-Thr-Lys-lys en la posición 27º a partir del extremo N se sustituye con Ala-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala y se representa como KIKTKK27AIATAA.

La presente invención se describirá en detalle mediante la descripción de ejemplos. Sin embargo, son sólo ejemplificaciones y el alcance de la invención no se limitará por estos ejemplos.

Ejemplo 1

La mutación en lugar específico se introdujo por el método descrito anteriormente usando el plásmido de expresión de TCF 6.3Kb obtenido por el método descrito en el documento WO92/01053. La E. Coli que comprendía este plásmido se depositó como FERM BP-3479.

I. Preparación del plásmido plantilla pcD TCF001

De acuerdo con el método mostrado a continuación, se introdujo una mutación en la escisión Pstl con número de nucleótido 34 para cambiarlo a una secuencia de nucleótidos que se pudiese escindir. La PCR se realizó usando 8 ng de plásmido pUC TCF (plásmido en el que se insertó el fragmento Sall/sphl de ADNc de TCF en el plásmido pUC18) como plantilla en presencia de una combinación de cebador mutagenizado Pst01 (SEC ID NO. 1) y un cebador no mutagenizado TCF415R (SEC ID NO. 2), y en presencia de una combinación de cebador mutagenizado P002 (SEC ID NO. 3) y un cebador no mutagenizado TCF-Sal-77 (SEC ID NO. 4).

Después de retirar los cebadores de la mezcla de reacción por tamizado molecular con microcon 100 (Amicon), se mezclaron los productos. Y se realizó la segunda PCR usando el cebador TCFSal-77 y TCF415R. El producto obtenido se digirió con las enzimas de restricción BstPl y Pstl. Usando un kit de unión (Takara-shuzo), el fragmento se ligó con el mayor fragmento de BstPl-Pstl de TCF pUC BstPl/Pstl preparado de antemano. La E. Coli DH5\alpha se transformó usando una parte de la mezcla de reacción de unión. La E. Coli transformada se cultivó en caldo L que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y se seleccionó el plásmido objetivo entre las colonias resistentes a ampicilina. Este plásmido se digirió con las enzimas de restricción Sall y Sphl, mezcladas con un gran fragmento de pCDNAl nuevo (en el que se mutagenizó un lugar de multi-clonación de pCDNAl y había un lugar de clonación Hindlll-Sall-BamHI-Sphl-Notl) Sall/Sphl preparado de antemano y se insertó usando un kit de unión. La E. Coli MC1061/p3 (Invitrogen) se transformó usando la mezcla de reacción. La E. Coli transformada se cultivó en caldo L que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y 7,5 \mug/ml de tetraciclina.

Los ADN de los plásmidos se prepararon con las colonias resistentes a ampicilina-tetraciclina obtenidas y se determinó la secuencia de nucleótidos de las mismas mediante un secuenciador de ADN (Perkin-Elmer). Se obtuvo el plásmido pcD TCF001 con la estructura objetivo y los mutantes de TCF se prepararon usando el plásmido obtenido.

II. Construcción de un vector de expresión para los mutantes de TCF y preparación de la E. Coli transformada i. Construcción del vector de expresión de RKRR2AAAA y preparación de la E. Coli transformada

Se construyó un vector de expresión para la codificación del ADNc de RKRR2AAAA con 2 etapas de PCR. En la primera etapa, se usó una combinación de cebador mutagenizado 2RKRRF (SEC ID NO. 5) y cebador no mutagenizado TCF977 R (SEC ID NO. 6) y una combinación de cebador mutagenizado 2RKRR R (SEC ID NO. 7) y cebador no mutagenizado TCFSall-77 (SEC ID NO. 4).

Se usaron cuatro nanogramos de pcD TCF001 como plantilla en ambas reacciones. Después de las reacciones, las dos mezclas de reacción se mezclaron y se purificaron con microcon 100. La veinteava parte se usó como plantilla en la segunda PCR. Se usaron TCFSal-77 y TCF977 R como cebadores. La mezcla de reacción se purificó con microcon 100 y se digirió con enzimas de restricción BstPl y EcoRV. Usando el kit de unión, el fragmento se insertó en el fragmento grande de un vector de expresión que contenía SR\alpha escindido anteriormente con la BstPl y EcroRV. La E. Coli DH5\alpha se transformó con la mezcla de reacción de unión y se obtuvo un clon objetivo con las células resistentes a ampicilina por el mismo método descrito anteriormente. El ADN del plásmido se preparó con el clon obtenido y la secuencia de ADN del mismo se determinó mediante un secuenciador de ADN (Perkin-Elmer). Este plásmido se escindió con las enzimas de restricción EcoRV y BstPl y se insertó en el fragmento de pUC TCF digerido anteriormente por las enzimas de restricción EcoRV y BstPl, seguido de la transformación de E. Coli DH5\alpha con el mismo.

La E. Coli que comprendía este plásmido se depositó como pUC TCF2 en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana el 10 de Noviembre de 1994 y tiene un número de depósito FERM BP 5266. (El número de depósito original fue FERM P-14624 pero la E. Coli se traspasó el 25 de Octubre de 1995 al depósito basado en el Tratado de Budapest.).

ii. Construcción del vector de expresión de KIKTKK27AIATAA y preparación de la E. Coli transformada

Se construyó un plásmido de expresión para la codificación del ADNc del mutante KIKTKK27AIATAA con 2 etapas de PCR. En la primera etapa, se usó una combinación de cebador mutagenizado 27KIKTKX F (SEC ID NO. 8) y cebador no mutagenizado TCF977 R (SEC ID NO. 6) y una combinación de cebador mutagenizado 27KIKTKX F (SEC ID NO. 9) y cebador no mutagenizado TCFSal-77 (SEC ID NO. 4). Se usaron cuatro nanogramos de pcD TCF001 como plantilla en ambas reacciones. Después de las reacciones, las dos mezclas de reacción se mezclaron y se purificaron con microcon 100. La veinteava parte se usó como plantilla en la segunda PCR. Se usaron TCFSal-77 y TCF977 R como cebadores.

La mezcla de reacción se purificó con microcon 100 y se digirió con enzimas de restricción BstPl y EcoRV. Usando el kit de unión, el fragmento se insertó en el fragmento grande de un vector de expresión que contenía SR-\alpha escindido anteriormente con la BstPl y EcroRV. La E. Coli DH5\alpha se transformó con la mezcla de reacción de unión y se obtuvo un clon objetivo con las células resistentes a ampicilina por el mismo método descrito anteriormente. El ADN del plásmido se preparó con el clon obtenido y la secuencia de ADN del mismo se determinó mediante un secuenciador de ADN. Este plásmido se escindió con las enzimas de restricción EcoRV y BstPl y se incorporó en el fragmento de pUC TCF digerido anteriormente por las enzimas de restricción EcoRV y BstPl, seguido de la transformación de E. Coli DH5\alpha con el mismo. La E. Coli que comprendía este plásmido se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana el 10 de Noviembre de 1994 y tiene un número de depósito FERM BP 5265. (El número de depósito original fue FERM P-14623 pero la E. Coli se traspasó el 25 de Octubre de 1995 al depósito basado en el Tratado de Budapest.).

iii. Construcción del vector de expresión de K54AA y preparación de la E. Coli transformada

Se construyó un plásmido de expresión para la codificación del ADNc del mutante K54A con 2 etapas de PCR. En la primera etapa, se usó una combinación de cebador mutagenizado 54K F (SEC ID NO. 10) y cebador no mutagenizado TCF977 R (SEC ID NO. 6) y una combinación de cebador mutagenizado 54K R (SEC ID NO. 11) y cebador no mutagenizado TCFSal-77 (SEC ID NO. 4). Se usaron cuatro nanogramos de pcD TCF001 como plantilla en ambas reacciones. Después de las reacciones, las dos mezclas de reacción se mezclaron y se purificaron con microcon 100.

La veinteava parte se uso como plantilla en la segunda PCR. Se usaron TCFSal-77 y TCF977 R como cebadores. El producto de reacción se purificó con microcon 100 y se digirió con enzimas de restricción BstPl y EcoRV. Usando el kit de unión, el fragmento se insertó en el fragmento grande de un vector de expresión de TCF que contenía SR\alpha escindido anteriormente con la BstPl y EcroRV. La E. Coli DH5\alpha se transformó con la mezcla de reacción de unión y se obtuvo un clon objetivo con las células resistentes a ampicilina por el mismo método descrito anteriormente. El ADN del plásmido se preparó con el clon obtenido y la secuencia de ADN del mismo se determinó mediante un secuenciador de ADN.

iv. Construcción del vector de expresión de RGKD132AGAA y preparación de la E. Coli transformada como ejemplo de referencia, que no es parte de la presente invención

Se construyó un plásmido de expresión para la codificación del ADNc del mutante RGKD132AGAA con 2 etapas de PCR. En la primera etapa, se usó una combinación de cebador mutagenizado 132RGKD F (SEC ID NO. 12) y cebador no mutagenizado TCF977 R (SEC ID NO. 6) y una combinación de cebador mutagenizado 132RGKD F (SEC ID NO. 13) y cebador no mutagenizado TCFSal-77 (SEC ID NO. 4). Se usaron cuatro nanogramos de pcD TCF001 como plantilla en ambas reacciones. Después de las reacciones, las dos mezclas de reacción se mezclaron y se purificaron con microcon 100.

La veinteava parte se uso como plantilla en la segunda PCR. Se usaron TCFSal-77 y TCF977 R como cebadores. El producto de reacción se purificó con microcon 100 y se digirió con enzimas de restricción BstPl y EcoRV. Usando el kit de unión, el fragmento se insertó en el fragmento grande de un vector de expresión de TCF que contenía SR\alpha escindido anteriormente con la BstPl y EcroRV. La E. Coli DH5\alpha se transformó con la mezcla de reacción de unión y se obtuvo un clon objetivo con las líneas celulares resistentes a ampicilina por el mismo método descrito anteriormente. El ADN del plásmido se preparó con el clon obtenido de la misma forma descrita anteriormente y la secuencia de base de la misma se determinó mediante un secuenciador de ADN.

v. Construcción del vector de expresión de R142A y preparación de la E. Coli transformada como ejemplo de referencia, que no es parte de la presente invención

Se construyó un plásmido de expresión para la codificación del ADNc del mutante R142A con 2 etapas de PCR. En la primera etapa, se usó una combinación de cebador mutagenizado 142R F (SEC ID NO. 14) y cebador no mutagenizado TCF977 R (SEC ID NO. 6) y una combinación de cebador mutagenizado 142R R (SEC ID NO. 15) y cebador no mutagenizado TCFSal-77 (SEC ID NO. 4). Se usaron cuatro nanogramos de pcD TCF como plantilla en ambas reacciones. Después de completar reacciones, las dos mezclas de reacción se mezclaron y se purificaron con microcon 100.

Después, La veinteava parte de la mezcla se uso como plantilla en la segunda PCR. Se usaron TCFSal-77 y TCF977 R como cebadores. El producto de reacción se purificó con microcon 100 y se digirió con enzimas de restricción BstPl y EcoRV. Usando el kit de unión, el fragmento se insertó en el fragmento grande de un vector de expresión de TCF que contenía SR\alpha escindido anteriormente con la BstPl y EcroRV. La E. Coli DH5\alpha se transformó con la mezcla de reacción de unión y se obtuvo un clon objetivo con las líneas celulares resistentes a ampicilina por el mismo método descrito anteriormente. El ADN del plásmido se preparó con el clon obtenido y la secuencia de ADN del mismo se determinó mediante un secuenciador de ADN.

vi. Construcción del vector de expresión de R42A y preparación de la E. Coli transformada como ejemplo de referencia, que no es parte de la presente invención

Se construyó un plásmido de expresión para la codificación del ADNc del mutante R42A con 2 etapas de PCR. En la primera etapa, se usó una combinación de cebador mutagenizado 42R F (SEC ID NO. 15) y cebador no mutagenizado TCF977 R (SEC ID NO. 6) y una combinación de cebador mutagenizado 42R R (SEC ID NO. 17) y cebador no mutagenizado TCFSal-77 (SEC ID NO. 4). Se usaron cuatro nanogramos de pcD TCF como plantilla en ambas reacciones.

Después de completar la reaccion, las dos mezclas de reacción se mezclaron y se purificaron con microcon 100.

Después, La veinteava parte de la mezcla se uso como plantilla en la segunda PCR. Se usaron TCFSal-77 y TCF977 R como cebadores. La mezcla de reacción se purificó con microcon 100 y se digirió con enzimas de restricción BstPl/EcoRV. Usando el kit de unión, el fragmento se insertó en el fragmento grande de un vector de expresión de TCF que contenía SR\alpha escindido anteriormente con la BstPl y EcroRV. La E. Coli DH5\alpha se transformó con la mezcla de reacción de unión y se obtuvo un clon objetivo con las líneas celulares resistentes a ampicilina de la misma forma descrita anteriormente. El ADN del plásmido se preparó con el clon obtenido y la secuencia de ADN del mismo se determinó mediante un secuenciador de ADN.

III. Preparación y purificación de plásmidos de expresión para los mutantes de TCF

Se cultivaron seis especies de E. Coli transformada que comprendían los plásmidos de expresión anteriores en caldo de cultivo L (400 ml) que contenía 50 \mug/ml de ampicilina en un incubador con agitación a 37ºC durante una noche, al que se le añadió Spectinomicina (Sigma) hasta una concentración final de 0,3 mg/ml cuando el OD600 del caldo cultivado se llevó a un valor de 1,0. De acuerdo con el método de Maniatis (Molecular cloning 2nd ed. ppl.21-1-52 (1989), Cold Spring Harbor Laboratory), el ADN del plásmido se aisló por el método de SDS alcalina y las 6 especies de plásmidos de expresión de mutantes de TCF se purificaron con el método centrifugación con gradiente de densidad de cesio.

IV. Transfection del plásmido de expresión del mutante TCF en una célula animal

Todos los plásmidos de expresión mutantes se transfectaron en Células de Ovario de Hamster Chino (CHO). Las células CHO (2x10^{6}) se suspendieron en 0,8 ml de medio IMDM (Gibco) que contenía suero de ternera fetal al 10% (FCS) (Gibco), en el cual se suspendió además una solución de 200 \mug de vector de expresión y 10 \mug de plásmido de expresión resistente a la Blasticidina pSB2 bsr (Funakoshi) disuelto previamente en 25 \mul de TE (Tris-HCl 10 mM (pH 8,0)-EDTA 1 mM). Este suspensión recibió electroporación en condiciones de 330V y 960 \muF. Después de dejarla a temperatura ambiente durante 10 minutos, se suspendió en 10 ml de IMDM que contenía medio FCS al 10% y se cultivó a 37ºC en un incubador de CO_{2} (CO_{2} al 5%) durante 2 días. Dos días después, se recogió el sobrenadante y se analizó la cantidad del mutante de TCF expresado mediante inmunoensayo con enzimas (EIA) (N. Shima, et al., Gastro-enterologia Japonica, Vol. 25, No. 4, pág 477-482 (1991)) usando un anticuerpo monoclonal anti-TCF. Se usó como muestra para analizar la actividad biológica. Las células se recogieron del fondo de los matraces por tratamiento con tripsina (Gibco) y se contó el número de células viables. Se introdujeron aproximadamente 10.000 células/pozo en placas de 96 pocillos (Nunc) y se cultivaron en 200 \mul/pozo de medio IMDM que contenía FCS al 10% y 5 \mug/ml de Blastcidina durante 2-3 semanas. De dos a tres semanas después, se tomaron muestras de 50 \mul de cada pozo y se investigaron en la expresión del mutante TCF por EIA. Los clones de las células que expresan los mutantes TCF se desarrollaron en placas de 12 pozos y matraces de 25 cm^{2}. Las líneas celulares que producían el mutante de TCF se establecieron en células CHO por la operación anterior.

V. Cultivo a gran escala de células productoras del mutante de TCF

Las células que producían el mutante se recogieron de matraces de 75 cm^{2} por tratamiento con tripsina cuando se unieron y se traspasaron a 10 matraces de 225 cm^{2} que contenían 100 ml del medio y se cultivaron durante una semana. Después, se recogió el sobrenadante cultivado. Repitiendo esta operación una o dos veces, se obtuvo 1-21 del caldo cultivado.

VI. Purificación de los mutantes de TCF

Se purificó en tres pasos, como se describe a continuación.

i. Heparin-Sepharose CL-6B

Se retiraron del medio los precipitados de uno - dos litros de medio cultivado de células CHO que expresaban mutantes TCF por centrifugación (2.000 rpm x 10 min) y filtrando el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 \mum (German Science). El mutante TCF se adsorbió a 4 ml/min en una columna de heparina-Sepharose CL-6B (25 mm x 120 mm, pharmacia) equilibrada con Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 0,3M y Tween 20 al 0,01%. La columna se lavó con aproximadamente 500 ml de tampón de equilibrio y el mutante TCF se eluyó con Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 2M y Tween 20 al 0,01%. La solución eluida se fraccionó en partes de 4 ml mediante un recolector de fracciones y se recogieron las fracciones que mostraban absorción a 280 nm.

ii. Mono S FPLC

La fracción que contenía el mutante de TCF eluido con NaCl 2M se dializó contra solución fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía NaCl 0,15M, seguida de centrifugación (12.000 rpm x 90 min.) para retirar el precipitado. El sobrenadante que contenía el mutante de TCF se pasó a través de una columna Mono S (5 mm x 50 mm, Pharmacia) equilibrada con solución tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía NaCl 0,15M y Tween 20 al 0,01% con un caudal de 1 ml/min para que el mutante TCF se absorbiera en la columna. Después de lavar la columna con aproximadamente 30 ml de tampón de equilibrio, el mutante de TCF se eluyó cambiando la velocidad de caudal a 0,5 ml/min con un gradiente lineal de NaCl hasta 1,0 M durante 60 minutos. La solución eluida se fraccionó en 5 ml mediante un fraccionador y se analizó la absorción a 280 nm y la EIA de las fracciones que contenían el mutante de TCF y se recogieron.

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iii. Heparina 5-PW FPLC

A la fracción que contenía el mutante de TCF obtenida usando cromatografía en columna Mono S, se añadió una cantidad dos veces mayor de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenía Tween 20 al 0,01%. La solución se pasó a través de una columna Heparin 5-PW (5 mm x 75 mm TOSOH) a 1 ml/min, equilibrada con Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 0,3M y Tween 20 al 0,01% para absorber al mutante TCF-II en la misma. Cambiando la velocidad de flujo a 0,5 ml/min, el mutante de TCF se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de hasta 2,0M durante 60 minutos.

La solución eluida se fraccionó en 5 ml mediante un fraccionador. Se analizó la absorción a 280 nm y la EIA de las fracciones que contenían el mutante de TCF y se recogieron. La solución del mutante de TCF se dializó frente a PBS que contenía 0,01% de Tween 20 (TPBS) para obtener el producto final purificado. La cantidad de proteína en el producto final purificado se determinó por el método de Lowry. La secuencia de aminoácidos del mutante de TCF RKRR2AAAA y la del mutante KIKTKK27AIATAA se representaron en el Nº. de Id. de Sec. 18 y en el SEC ID NO. 19 respectivamente.

VII. Electroforesis con Gel SDS-Poliacrilamida en el mutante de TCF purificado

Se aplicó electroforesis con gel de SDS poliacrilamida al mutante de TCF purificado (200 ng). En la figura 1 se mostró la representación esquemática de la electroforesis del mutante de TCF RKRR2AAAA y KIKTKKK27AIATAA, que mostró una aumento de 10 veces en la actividad biológica como se describe a continuación, y de TCF nativo. Los resultados en condiciones reductoras (en presencia de \beta-mercaptoetanol) y condiciones no reductoras (en ausencia de \beta-mercaptoetanol) no mostraron ninguna diferencia entre los tres. Además, no hubo ninguna banda excepto las esperadas en la estructura de ambos mutantes de TCF.

Ejemplo 2 Afinidad de TCF y mutante de TCF a la heparina i. Heparin-Sepharose CL-6B

Se retiraron del medio de cultivo los precipitados de células CHO que expresaban mutantes TCF por centrifugación (1.200 g x 10 min) y filtrando el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 m. El sobrenadante filtrado se cargó en una columna de heparina-Sepharose CL-6B (5 mm x 5 mm, pharmacia) equilibrada con TPBS para absorber el mutante de TCF. Después de lavar con 3 ml de TPBS, el mutante TCF se eluyó con 1 ml de TPBS que contenía NaCl 0,2-0,3M, aumentando la concentración de sal por etapas. La concentración de mutante de TCF en el eluato se analizó por EIA y la concentración de sal del eluato se definió como la afinidad del mutante a la heparina.

ii. Heparina 5-PW FPLC

El caldo cultivado de células CHO que expresaban cada mutante de TCF (30-60 ml) se centrifugó (1.000 g x 10 min), se pasó a través de un filtro de 0,22 \mum para retirar el precipitado y se aplicó a una columna de Heparina 5-PW equilibrada con solución tampón de Tris-HCl 20 mM que contenía Tween 20 al 0,01% a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min para absorber el mutante TCF. Después de lavar la columna con aproximadamente 20 ml de solución tampón de equilibrio y cambiar la velocidad de flujo a 0,5 ml/min, el mutante de TCF se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de hasta 1,5M durante 45 minutos. Cada una de las fracciones de 0,5 ml se recogió con un colector de fracciones y se cuantificó la concentración del mutante de TCF en cada fracción mediante EIA y la concentración de sal de la elución se definió como la afinidad del mutante a la heparina.

En la Tabla 1 se muestran los resultados de estos análisis de afinidad de estos mutantes de TCF a la heparina. La concentración de elución de NaCl en heparina-Sepharose representa la concentración a la que le se eluye el mutante de TCF en la máxima cantidad. La relación relativa de concentración de elución se defina como (la concentración de elución de NaCl de TCF mutante/la de TCF nativo). N.D. signfica "no determinada". En el análisis con heparina-Sepharose, RKRR2AAAA, KIKTKK27AIATAA y R42A mostraron una afinidad a la heparina significativamente menor. Además, en el análisis con heparina 5-PW, se observó que la afinidad de los mutantes a la heparina se redujo aproximadamente un 70% respecto de la de TCF nativo.

TABLA 1

1

Ejemplo 3 Actividad proliferativa de TCF y de los mutantes de TCF en hepatocitos in vitro

La actividad proliferativa se investigó con el siguiente método: De acuerdo con el método de Segren (Method in cell biology, Vol. 13, pág. 29 (1976) Academic Press, New York), se aisló el hepatocito de ratas Wister (aproximadamente 200 g de peso corporal). las células (1,0 x 10^{4}/50 \mul/pozo) se introdujeron en los pocillos de placas de 96 pocillos (Falcon) y se cultivaron a 37ºC durante una noche usando medio E de Williams (Flow Laboratory) que contenía suero de ternera fetal al 10% en dexametasona 10 \muM (en los sucesivo denominado medio). Después de 24 horas, se añadieron 10 \mul de medio de base que contenía TCF o mutante de TCF a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37ºC durante 22 horas más. Después de 22 horas, se añadió a las mismas ^{3}H-timidina (Amersham) para hacer 1 \muCi/pocillo, manteniendo el cultivo otras dos horas. Después de eso, las células se lavaron dos veces con PBS y se recogieron por tratamiento con tripsina al 0,5% seguido de recogida de las células en un filtro de vidrio con un recogedor de células. La radioactividad incorporada en cada pocillo se midió con Matrix 96 (Packard) como cantidad de síntesis de ADN. Los resultados se muestran en la figura 2. El mutante K54A tenía una actividad biológica 1,4 veces mayor que el TCF nativo en una concentración de antígeno de TCF de 2,5 ng/ml. Los ejemplos de referencia RGKD132AGAA y R142A (que no son parte de la presente invención) tenían una actividad biológica 2,0 y 1,6 veces mayor respectivamente en este ensayo.

Adicionalmente, se determinaron los mutantes que tenían menor afinidad a la heparina con el método Lowery. Después, la actividad biológica se comparó con respecto a la concentración de proteína que mostraba el 50% de la máxima actividad proliferativa (ED50) (Figuras 3 y 4).

Como resultado, 2 especies de proteínas, es decir, RKRR2AAAA y KIKTKK27AIATAA mostraron actividades biológicas 10 veces mayores por cantidad unitaria de proteína en comparación con la de TCF nativo.

Ejemplo 4 Actividad proliferativa de TCF y de los mutantes de TCF en células epiteliales del riñón

La actividad proliferativa en células epiteliales del riñón se determinó con el siguiente método:

Se introdujeron células OK derivadas de la línea de células epiteliales del riñón de American Opossim en cada pocillo de las placas de 96 pocillos para hacer 1,0 x 10^{4}/100 \mul/pocillo y se cultivaron en medio DMEM que contenía suero de ternera fetal al 10% a 37ºC durante una noche. Después, cada pocillo se lavó 2-3 veces con medio DMEM que no contenía suero. El medio de cada pocillo se sustituyó con medio DMEM que no contenía suero y el cultivo se mantuvo a 37ºC durante 2 días más. Después, el medio de cada pocillo se sustituyó otra vez con 50 \mul de medio DMEM fresco que no contenía suero y, con 50 \mul de adición de TCF o mutante de TCF diluido con medio DMED que contenía albúmina de suero bovino al 0,2%, el cultivo se mantuvo durante 24 horas más. Después de 24 horas, se añadió al mismo ^{3}H-timidina para hacer 1 \muCi/pocillo y el mantuvo se mantuvo durante 2 horas más. Después, las células se lavaron dos veces con PBS y se recogieron por tratamiento con tripsina al 0,5%, seguido de recogida de células con un filtro de vidrio con un recogedor de células. La radioactividad incorporada en cada pocillo se midió con Matrix 96, y se determinó como la cantidad de síntesis de AND. Los resultados se muestran en la Figura 5.

Como resultado, se observa que las actividades biológicas por cantidad unitaria de proteína del RKRR2AAAA y del KIKTKK27AIATAA en las células epiteliales del riñón aumentó en más de 2 veces en comparación con la de TCF nativo.

Ejemplo 5 Actividad proliferativa de TCF y de los mutantes de TCF en células de la médula ósea in vitro

La actividad proliferativa en células de la médula ósea se determinó con el siguiente método:

Se introdujeron células NFS-60 de una línea celular de la médula ósea de un ratón en cada pocillo de las placas de 96 pocillos para hacer 5,0 x 10^{4}/100 células/50 \mul/pocillo en medio RPMI que contenía suero de ternera fetal al 10%, y con adición de TCF o mutante de TCF diluido con el medio, se cultivaron a 37ºC durante 24 horas. Después de 24 horas, se añadieron 10 \mul de MTT 5 mg/ml (Sigma) a cada pocillo y el cultivo se mantuvo durante 3 horas más. Después, se añadieron 100 \mul de SSDS al 10%/cloruro de amonio 10 mM a cada pocillo y se dejó a temperatura ambiente durante una noche. Después de eso, se midió la absorbencia óptica a 590 nm con un Immunoreader NJ-2000 (Intermed) como actividad proliferativa.

Los resultados se muestran en la Figura 6. Como resultados, se observa que las actividades biológicas por cantidad unitaria de proteína del RKRR2AAAA y del KIKTKK27AIATAA en las células de la médula ósea se reducen de 1/2 a 1/20 de la de TCF nativo.

Ejemplo 6 Actividad biológica in vivo de TCF y de los mutantes de TCF

La actividad biológica in vivo se analizó por el siguiente método:

Se administró TCF o mutante de TCF disuelto en PBS que contenía Tween 20 al 0,01% de forma intravenosa a través de la cola (2 ml/kg x 2 veces al día) a ratas Wister de semanas machos durante 4 días.

Al día siguiente de la última administración, se tomaron muestras de sangre de la vena cava caudal bajo anestesia con éter y el suero de la misma de recogió por centrifugación (3.000 rpm x 10 min.) y, en el caso del plasma, inmediatamente después de tomar la muestra de sangre, se añadió a la misma citrato sódico (la concentración final fue 0,38%) seguido de centrifugación (3.000 rpm x 10 min.) para dar el plasma. Después de obtener el suero o el plasma, se conservó en un congelador a -30ºC, y se analizaron el nivel en suero de proteína total, albúmina, capacidad de unión al hierro no saturado, colesterol total, colesterol libre, colesterol HDL y fosfolípidos mediante un autoanalizador de suero (Hitachi 7150 Autoanalyzer) y se analizó el nivel en plasma de protrombina y fibrinógeno con un autoanalizador de coagulación de sangre KC40 (Amerung). Para estos análisis se usaron los siguientes kits:

Proteína total: Autosera™, Albúmina: Autosera™,

Capacidad de unión a hierro no saturado: Clinimate™ UIBC,

Colesterol total: Autosera™ CHO-2, Colesterol libre: Autosera™ F-CHO-2, colesterol HDL: HDL-C\cdot2 "DAIICHI", Fosfolípidos: Autosera™ PL-2,

(Todos los kits anteriores son productos de DaiiChi-Pure Chemicals Co,. Ltd.).

Tiempo de Protrombina: Orthobrain thromboplastin (Ortho Diagnostic System Inc.), Fibrinógeno: Sun assay Fib (Nitto Boseki Co., Ltd.). Como ejemplos típicos, en las Figuras 7 y 8 se ejemplifican los efectos de los mismos en los niveles en suero de la proteína total y en el nivel en suero de colesterol HDL respectivamente. De acuerdo con los resultados de los análisis estadísticos de ensayos de línea paralela, con respecto al aumento de la proteína total, el RKRR2AAAA mostró una aumento de 1,66 veces en la actividad específica y el KIKTKK27AIATAA mostró un aumento de 1,62 veces en la actividad específica, en comparación con el nativo.

\newpage

Disponibilidad industrial

La presente invención proporción un nuevo mutante de TCF. Los mutantes de TCF de la presente invención tienen una actividad proliferativa y una actividad que estimula el crecimiento en los hepatocitos y son beneficiosos para el tratamiento de diversas enfermedades hepáticas y como agentes antitumorales.

Referencias a microbios PUC-TCF27

Organización del depósito:: Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana. Ministerio de Comercio e Industria.

Dirección:: 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japón

Fecha de depósito:: 10 de noviembre de 1994 (El organismo fue depositado originalmente en el Instituto de Microorganismos el 10 de noviembre de 1994 y se le asignó el número de depósito FERM P-14623, y se transfirió a un depósito basado en el Tratado de Budapest el 25 de octubre de 1995).

Número de depósito:: FERM BP-5265

PUC-TCF2

Dirección:: 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japón

Fecha de depósito:: 10 de noviembre de 1994 (El organismo fue depositado originalmente en el Instituto de Microorganismos el 10 de noviembre de 1994 y se le asignó el número de depósito FERM P-14624, y se transfirió a un depósito basado en el Tratado de Budapest el 25 de octubre de 1995).

Número de depósito:: FERM BP-5266

PcTCF(S)/MC1061/P3

Dirección:: 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japón

Fecha de depósito:: 13 de julio de 1990 (El organismo fue depositado originalmente en el Instituto de Microorganismos el 13 de julio de 1990 y se le asignó el número de depósito FERM P-11605, y se transfirió a un depósito basado en el Tratado de Budapest el 10 de julio de 1991).

Número de depósito:: FERM BP-3479

SEC. ID Nº: 1

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 31

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador Pst01

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: GCCAG CCCTG CTGCT CCAGC ATGTC CTCCT G

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 25

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador TCF415 R

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: TGCCA CTCTT AGTGA TAGAT ACTGT

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 3

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 34

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador P002

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: TTTTA AAAGG AAGTC CTTTA TTCCT AGTAC ATCT

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 4

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 32

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador TCFSal-77

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: GGTCG ACTAG GCACT GACTC CGAAC AGGAT TC

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 5

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 33

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador 2RKRR F

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: CCCTA TGCAG AGGGA CAAGC GGCAG CTGCC ATT

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 6

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 23

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador TCF977 R

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: ATACC TGAGA ATCCC AACGC TGA

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 7

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 33

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador 2RKRR R

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: GAATT CATGA ATTGT ATTGG CAGCT GCCGC TTG

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 1

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 35

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador 27KIKTKK F

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: GGCAA TAGCA ACCGC AGCTG TGAAT ACTGC AGACC

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 9

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 38

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador 27KIKTKK R

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: CAGCT GCGGT TGCTA TTGCC AGTGC TGGAT CTATT TTG

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 10

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 28

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador 54K F

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: CCATT CACTT GCGCG GCTTT TGTTT TTG

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 11

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 28

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador 54K R

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: CAAAA ACAAA AGCCG CGCAA GTGAA TGG

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 12

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 36

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador 132RGKD F

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: GAACA CAGCT ATGCG GGTGC AGCCC TACAG GAAAA C

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 13

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 36

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador 132RGKD R

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: GTTTT CCTGT AGGGC TGCAC CCGCA TAGCT GTGTT C

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 14

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 26

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador 142R F

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: GAAAA CTACT GTGCA AATCC TCGAG G

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 15

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 26

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador 142R R

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: CCTCG AGGAT TTGCA CAGTA GTTTT C

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 16

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 27

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador 42R F

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: CAATG TGCTA ATGCA TGTAC TAGGA AT

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 17

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 31

: TIPO: ácido nucleico

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico, ADN sintético

: CARACTERÍSTICAS: cebador 42R R

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA: ATTCC TAGTA CATGC ATTAG CACAT TG

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 18

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 723

: TIPO: aminoácido

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: proteína

: CARACTERÍSTICAS: R K R R 2 A A A A

: SECUENCIA:

2

3

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. ID Nº: 19

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD: 723

: TIPO: aminoácido

: CADENA: 1

: TOPOLOGÍA: lineal

: TIPO DE MOLÉCULA: proteína

: CARACTERÍSTICAS: K I K T K K 27 A I A T A A

7

8

80

9

90

10

100

11

110

Claims

1. Un mutante del factor citotóxico de tumores (TCF-II) que se puede obtener por mutagénesis de Arg2-Lys-Arg-Arg5 de TCF-II natural en Ala-Ala-Ala-Ala.

2. Un mutante del factor citotóxico de tumores (TCF-II) que se puede obtener por mutagénesis de Lys27-Ile-Lys-Thr-Lys-Lys32 de TCF-II natural en Ala-Ile-Ala-Thr-Ala-Ala.

3. Un mutante del factor citotóxico de tumores (TCF-II) que se puede obtener por mutagénesis de Lys54 de TCF-II natural en Ala.

4. Un mutante del factor citotóxico de tumores (TCF-II) que se puede obtener por mutagénesis de Arg42 de TCF-II natural en Ala.

5. Un mutante del factor citotóxico de tumores (TCF-II), como el codificado por el plásmido de expresión depositado con el Número de Acceso FERM BP-5265.

6. Un mutante del factor citotóxico de tumores (TCF-II), como el codificado por el plásmido de expresión depositado con el Número de Acceso FERM BP-5266.