ES2207868T3 - Metodo que usa un calibrador y un dispositivo y kit de ensayo que incluye el calibrador. - Google Patents
Metodo que usa un calibrador y un dispositivo y kit de ensayo que incluye el calibrador.Info
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Abstract
Un método de flujo lateral en un proceso para la determinación de un analito en una muestra, que implica la utilización de reacciones de afinidad bioespecífica, y que comprende las siguientes etapas: i. formar un complejo que comprende: Reactivo I Analito reactivo, donde a. el reactivo y el reactivo I presentan afinidad bioespecífica por el analito, b. el reactivo es detectable analíticamente, c. el analito es el analito o un reactivo relacionado con el analito, y posteriormente ii. determinar la señal detectable procedente del reactivo en el complejo, y iii. obtener la cantidad de analito en la muestra comparando el valor de la muestra con uno o más valores del calibrador, correspondiendo cada uno de ellos a una cantidad estándar de analito, caracterizado porque A) antes de la determinación del valor del calibrador, se ha unido a la matriz (i) el calibrador o (ii) un agente de unión para el calibrador, y cuando se ha unido a la matriz un agente de unión al calibrador, se añade calibrador o el calibrador predepositado en la matriz se libera en la determinación del valor del calibrador, y porque la matriz es insoluble en el medio líquido en el que tiene lugar la unión del reactivo al calibrador, B) el calibrador y el analito tienen la capacidad de unirse bioespecíficamente al reactivo por sitios de unión equivalentes, C) a. la matriz presenta una o más zonas de calibrador (CZ1, CZ2, CZ3 etc.) que se localizan en el mismo flujo de proceso, correspondiendo al menos dos de ellas a diferentes cantidades estándar de analito, y b. (i) cada zona de calibrador comprende el calibrador en una cantidad que corresponde a una cantidad estándar de analito o (ii) cada zona de calibrador contiene un agente de unión al calibrador, correspondiendo la cantidad de agente de unión al calibrador y la cantidad de calibrador a una cantidad estándar de analito, y c. el reactivo se une al calibrador transportando el reactivo a través de las zonas de calibrador. D) el transporte del reactivopara la unión al calibrador de la matriz en las diversas CZ, tiene lugar mediante este flujo de proceso hacia la zona o las zonas de detección (DZ).
Description
Método que usa un calibrador y un dispositivo y
kit de ensayo que incluye el calibrador.
La invención se refiere a un método asociado con
un proceso para la determinación de un analito en una muestra,
implicando dicho proceso la utilización de reacciones de afinidad
bioespecífica. El método incluye las etapas de:
- i.
- formar un complejo que contiene:
- reactivo I- - -analito'- - -reactivo*, donde
- a. el reactivo* y el reactivo I muestran afinidad bioespecífica por el analito', y
- b. el reactivo* se puede detectar analíticamente, posteriormente
- ii.
- determinar la señal detectable del reactivo* en el complejo (valor de la muestra), y
- iii.
- obtener la cantidad de analito en la muestra comparando el valor de la muestra con la correspondiente o las correspondientes señales (valor o valores del calibrador) del reactivo*, que se ha dejado unir por separado a una o más cantidades de un calibrador (cantidades del calibrador), correspondiendo cada una de ellas a una cantidad conocida de analito (cantidad o cantidades estándar).
Analito' es el analito como tal (en la muestra) o
un reactivo relacionado con el analito, es decir, un reactivo de
afinidad bioespecífica añadido, incluido en el complejo en una
cantidad que está relacionada con la cantidad de analito en la
muestra. El reactivo* y el reactivo I pueden unirse al analito' al
mismo tiempo. Esto significa que se unen a sitios de unión separados
en el espacio.
Este tipo de métodos analíticos se ha realizado,
entre otros medios, en las denominadas matrices de flujo, donde los
reactivos que incluyen el analito se transportan en un flujo de
proceso a través de la matriz (= metodología de flujo) hasta una
zona de detección (DZ) donde el reactivo* se captura en una cantidad
relacionada con la cantidad de analito en la muestra. La captura
tiene lugar mediante un reactivo (capturador) que está anclado
firmemente a la matriz en DZ. El capturador puede ser el reactivo I
o un reactivo que tiene afinidad bioespecífica por el reactivo I o
por otro reactivo, que a su vez, opcionalmente a través de uno o más
reactivos adicionales, tiene afinidad bioespecífica por el reactivo
I.
Por reactivos (incluyendo el analito) que
muestran afinidad bioespecífica (reactivos de bioafinidad) se
entienden miembros individuales de los pares de reactivos:
antígeno/hapteno-anticuerpo;
biotina-avidina/estreptavidina; dos cadenas
sencillas complementarias de ácido nucleico, etc. Como anticuerpos
se consideran fragmentos de anticuerpo que se unen a antígenos,
tales como Fab, F(ab)_{2}', anticuerpos Fv
monocatenarios (scFv) etc. No es necesario que los reactivos en
cuestión sean naturales, sino que también pueden ser
moléculas/agentes de unión preparados sintéticamente.
El tipo de métodos de ensayo en cuestión se ha
usado con anterioridad principalmente para reactivos de afinidad
bioespecífica donde al menos una parte de un par de reactivos
empleado ha mostrado una estructura proteica, en particular en
relación con los denominados procedimientos de determinación
inmunoquímicos.
Las reacciones de afinidad bioespecífica se
realizan principalmente en medios acuosos (tales como agua).
Convencionalmente, el calibrador y el analito a
menudo han sido capaces de unirse al reactivo*. Los sitios de unión
en cuestión sobre el calibrador para la unión al reactivo* a menudo
tienen propiedades de unión equivalentes a los correspondientes
sitios de unión en el analito. En la práctica, esto significa que el
calibrador y el analito han tenido sitios de unión que son
estructuralmente iguales o similares, y presentan reacciones
cruzadas entre sí con respecto al reactivo*. Los sitios de unión con
reacciones cruzadas entre sí para/acerca de un reactivo dado son
equivalentes.
En la técnica anterior, la cantidad del
calibrador se ha igualado con la cantidad estándar.
Los valores del calibrador, correspondientes a
diferentes cantidades/concentraciones de analito (cantidades
estándar), a menudo se han recopilado en una curva de
dosis-respuesta (curva de calibración) o un
algoritmo.
La expresión "comparar un valor de la muestra
con el valor o los valores del calibrador" también implica que la
comparación pueda tener lugar con una curva de calibración y/o
algoritmo, correspondiente a varios valores del calibrador.
El calibrador y el analito a menudo han sido la
misma substancia. Hay excepciones. En la determinación de
anticuerpos, a menudo un solo calibrador ha sido operativo para
diversas especificidades de anticuerpo, siempre que la substancia
calibradora se haya seleccionado de forma que presente un dominio
constante del anticuerpo a determinar. Véase, por ejemplo, el
documento de Abbott WO 97/27486.
Se describen zonas de referencia con una cantidad
conocida de analito libre y una cantidad limitada de conjugado para
la detección en Applied Research Systems ARS Holding N.V., documento
WO 95/16914. La zona de referencia y la zona de detección no se
ponen en el mismo flujo de proceso.
Otra invención descrita en Agen Biomedical
Limited, documento WO 97/09620, comprende un sistema de calibración
separado que funciona en paralelo con el sistema de detección, y
donde se usan diferentes conjugados para el analito y la
calibración, respectivamente.
En Applied Research Systems ARS Holding N.V.,
documento WO 92/09892, se describen análogos de analito de unión a
la zona de calibración que se añaden a la muestra. La unión del
analito y sus análogos produce una señal detectable.
La técnica anterior normalmente ha implicado la
determinación de varios valores del calibrador en paralelo con
muestras utilizando cantidades conocidas de analito (cantidades
estándar) de una forma correspondiente a las muestras. A su vez,
esto ha hecho que un 5-20% de todos los ensayos
hayan sido ensayos de calibrador. Reduciendo el número de ensayos
del calibrador, y posiblemente reduciendo también el número de
etapas de reacción en cada ensayo del calibrador, podría ahorrarse
tiempo y consumo de reactivos.
Suelen aparecer problemas dependiendo del
calibrador y de las soluciones de muestra, que tienen propiedades y
contenidos diferentes. Esto es particularmente marcado en ensayos
inmunológicos donde el calibrador se mide a menudo en un tampón, y
el análisis de la muestra se realiza en muestras de plasma o suero.
Una diferencia en los contenidos y en la viscosidad produce
diferentes respuestas (i.a., medidas como "recuperación" y
paralelismo). Además, la viscosidad en un método de flujo adquiere
una importancia extra, ya que influye sobre la velocidad de
migración/flujo. La diferencia puede compensarse, pero al mismo
tiempo hace que el sistema sea más sensible a las alteraciones, y de
esta forma aumenta la variación entre ensayos. Otros problemas
asociados con los ensayos que utilizan flujos son posibles
variaciones de flujo dependiendo de las fluctuaciones de temperatura
y humedad, etc.
Los problemas anteriores se han superado hasta
cierto punto mediante el método de ensayo descrito en el documento
EP-A-253.464, que usa una zona de
ensayo y una zona de referencia en una fase sólida.
Un primer objeto de la invención es mejorar los
métodos de calibración usados en la actualidad en ensayos del tipo
mencionado inicialmente.
Otro objeto de la invención es simplificar el uso
de calibradores, principalmente reduciendo el consumo requerido de
reactivos necesarios y/o reduciendo el número de mediciones para
obtener valores del calibrador.
Un tercer objeto de la invención, en particular
en relación con los métodos de flujo, es permitir la compensación de
las diferencias que puedan existir entre el calibrador y la solución
de muestra y entre los ensayos realizados a diferentes tiempos y/o
en diferentes lugares.
Ahora nos hemos dado cuenta de que estos objetos
pueden conseguirse si el calibrador se une a la matriz antes de
comenzar la determinación del valor del calibrador de acuerdo con un
protocolo relevante. Esto tipo de calibrador se denominará más
adelante calibrador de matriz. Por lo tanto, el primer aspecto
principal de la invención es un método de acuerdo con el
procedimiento mencionado inicialmente, y que tiene el aspecto
característico como se reivindica de que el calibrador, o un
reactivo capaz de unirse al calibrador, se ha unido a una matriz que
es insoluble en el medio líquido en el que tiene lugar la unión del
reactivo* al calibrador, antes de comenzar la determinación de un
valor del calibrador. Normalmente, el calibrador o el agente de
unión al calibrador, como se reivindica, respectivamente, ya se ha
unido a la matriz por el fabricante, de forma que el calibrador de
la matriz se suministra como un componente preparado en un kit. La
unión entre el calibrador y la matriz normalmente es de un tipo
diferente a la obtenida entre el analito' y el reactivo I cuando se
ensaya una muestra.
Los calibradores de matriz proporcionan grandes
ventajas si el transporte del reactivo* al calibrador tiene lugar
por medio de un flujo (flujo de proceso) en la denominada matriz de
flujo a una zona de la matriz, que contiene el calibrador de la
matriz o el agente de unión al calibrador (zona de calibrador,
CZ).
Cuando se une un agente de unión del calibrador a
la matriz, el calibrador puede predepositarse de forma móvil (por
difusión) en la matriz en una zona separada de la zona de detección,
o puede añadirse junto con o por separado de la muestra.
El agente de unión al calibrador normalmente es
un miembro de un par de unión específico (par reactivo), estando el
otro miembro de par de unión acoplado o conjugado con la substancia
calibradora. Tales pares de unión específica son bien conocidos para
los especialistas en la técnica, y como ejemplos se pueden
mencionar:
- pares de unión inmunológica, tales como antígeno-anticuerpo y hapteno-anticuerpo, biotina-avidina o -estrepta- vidina, lectina-azúcar, hormona-receptor hormona, y dúplex de ácido nucleico.
La matriz de flujo define el espacio en el que se
transportan los reactivos. De esta forma, la matriz puede ser la
superficie interna de un canal de flujo sencillo (tal como un
capilar), la superficie interna de una matriz porosa que tiene un
sistema de canales de flujo (matriz porosa) etc., que se extienden a
su través. Este tipo de matrices recibe el nombre de matrices de
flujo. Las matrices pueden existir en forma de monolitos, láminas,
columnas, membranas, canales de flujo sencillos que tienen
dimensiones de capilares, o sistemas agregados de tales canales de
flujo, etc. También pueden existir en forma de partículas
introducidas en columnas, fibras comprimidas etc. La superficie
interna de la matriz, es decir, la superficie de los canales de
flujo, debe ser hidrófila, de forma que los medios acuosos
(principalmente agua) puedan absorberse y transportarse a través de
la matriz. La dimensión interna mínima de los canales de flujo
(medida como un diámetro para canales que tienen una sección
transversal circular) debe ser suficientemente grande como para
permitir el transporte a través de la matriz de los reactivos que se
están usando. La regla empírica es que las matrices adecuadas se
pueden seleccionar entre las que tienen canales de flujo con la
dimensión interna más pequeña en el intervalo de
0,4-1000 \mum, preferiblemente
0,4-100 \mum si la matriz tiene un sistema de
canales de flujo que se comunican entre sí. Los canales de flujo que
tienen una dimensión interna más pequeña en la parte superior del
amplio intervalo (hasta 1000 \mum) son de un gran interés para los
flujos dirigidos por una presión/succión impuesta externamente.
A menudo, las matrices de interés se construyen a
partir de un polímero, por ejemplo, nitrocelulosa, nylon, etc. El
material de la matriz, así como el diseño físico y geométrico de los
canales de flujo, pueden variar a lo largo del flujo, dependiendo de
la parte específica de la matriz que se vaya a usar (Pharmacia AB,
documento WO 96/22532; Medix, documento WO 94/15215).
A lo largo del flujo en la matriz, puede haber
una o más zonas definidas para la aplicación de la muestra,
reactivos, tampón, etc. (A_{S}Z, A_{R}Z, A_{B}z etc.), y una o
más zonas para el calibrador y/o la detección (CZ y DZ,
respectivamente).
En publicaciones de patentes previas se han
descrito diversas matrices de flujo que pueden usarse en este tipo
de ensayos en cuestión. Véase, por ejemplo, Behringwerke, documento
US 4.861.711, Unilever, documento 88/08534, Abbott, documentos US
5.120.643 y 4.740.468, Becton Dickinson, documentos EP 284.232 y
4.855.240; y Pharmacia AB, documento WO 96/22532.
La dirección del flujo es desde una zona de
aplicación de la muestra y/o reactivo y hacia las zonas existentes
de calibrador y de detección (CZ y DZ, respectivamente). Las zonas
precisas del flujo de proceso por las que pasa el flujo se
determinan mediante el protocolo de ensayo en cuestión. Un flujo de
proceso puede empezar desde un punto con una extensión radial y un
frente de flujo en forma de una periferia circular o una parte de la
misma. Un flujo de proceso también puede empezar desde una zona en
forma de una banda y puede tener un frente de flujo recto
perpendicular a la dirección de flujo.
En una variante menos preferida, el flujo de
proceso avanza desde una zona de aplicación para el reactivo*, que
al mismo tiempo es una zona de calibrador o una zona de detección.
En esta variante, el flujo se extiende preferiblemente de forma
radial desde la zona de aplicación, y puede pasar a las zonas de
calibrador y/o zonas de detección adicionales.
El flujo a través de las matrices puede
conseguirse por influencia de fuerzas capilares, por ejemplo,
empezando con una matriz substancialmente seca. Al final del flujo
puede ponerse un cuerpo de succión como ayuda. Los componentes
disueltos pueden transportarse desde la zona de aplicación a la zona
de detección/calibrador por medio de un campo eléctrico
impuesto.
El flujo utilizado preferiblemente es lateral, es
decir, paralelo a la superficie superior de la matriz. También
pueden usarse otros tipos de flujos, tales como flujos en
profundidad en la matriz.
La matriz de flujo usada en la realización
preferida presenta una o más zonas distintas con calibrador (zonas
de calibrador, CZ1, CZ2, CZ3, etc.). Cada zona de calibrador
contiene un calibrador de matriz en una cantidad tal que la señal de
medición del reactivo* (valor del calibrador), detectada en la zona
cuando pasa el flujo, corresponde claramente a una cierta cantidad
de analito en la muestra (cantidad estándar).
El calibrador puede seleccionarse de la misma
forma que se ha indicado previamente para los tipos de ensayo en
cuestión. Usando la metodología de flujo y la disposición para que
la muestra (el analito) se transporte a través de una zona de
calibrador, el calibrador debe seleccionarse de forma que no se una
al analito. Si el calibrador es capaz de unirse al analito, se
imponen requisitos especiales en la posición de la zona de
calibrador en reacción con la zona de aplicación de la muestra.
Véase más adelante.
No es necesario que la cantidad de calibrador que
se ha unido a una zona de calibrador sea igual que la cantidad
estándar correspondiente. Esto se debe a que la actividad de unión
en relación con el reactivo* cambia a menudo, cuando la substancia
calibradora se une a una matriz.
Si se desea determinar anticuerpos con
especificidad diferente pero procedentes de la misma especie, de la
misma clase de Ig o subclase de Ig, se prefiere que el calibrador
presente un sitio de unión que sea único para la especie, la clase
o la subclase. Por regla general, esto significa que un calibrador
para la determinación de anticuerpos presenta un epítopo que está
presente en un dominio constante de los anticuerpos en cuestión, en
el caso de anticuerpos de mamífero, principalmente una parte de
Ig(Fc).
Una sola matriz puede presentar una o más zonas
de detección (DZ1, DZ2, DZ3 etc.) junto con una o más zonas de
calibrador. En la zona de detección, los complejos que contienen
analito* y reactivo* se unen a la matriz a través del capturador
mencionado inicialmente, que está fijado firmemente en una DZ. Si
reactivo I se une a la matriz a través del capturador, el reactivo I
no necesita inmovilizarse en la matriz desde el principio, sino que
puede predepositarse de forma móvil (por difusión) en la matriz, en
un área o zona separada de la zona de detección, o puede añadirse
junto con o por separado de la muestra.
Si hay varias zonas de calibrador y/o de
detección en la misma matriz de flujo, se consiguen las mayores
ventajas con la invención si varias de las zonas están situadas a lo
largo del mismo flujo de proceso.
Si hay varias zonas de detección (DZ1, DZ2, DZ3
etc.) en una sola matriz, éstas puede corresponder a diferentes
analitos. Se puede utilizar el mismo calibrador para analitos que
tengan sitios de unión equivalentes. Si los analitos carecen de
sitios de unión equivalentes, se requiere un calibrador para cada
analito. Si todos los analitos tienen los mismos sitios de unión
equivalentes, se tendrá la situación más sencilla. En este caso,
pueden utilizarse el mismo calibrador, las mismas zonas de
calibrador y el mismo reactivo* para todos los analitos.
Las zonas de calibrador y las zonas de detección
pueden diseñarse geométricamente de diversas maneras (rectangular,
circular, lineal, en forma de puntos etc.). Las zonas pueden tener
diferentes configuraciones entre sí. Son buenas configuraciones
aquellas en las que un flujo común penetra consecutiva o
simultáneamente en diversas zonas, en particular en zonas de
diferentes tipos (DZ y CZ). Un ejemplo de una penetración
consecutiva consta de zonas paralelas localizadas una después de la
otra en el mismo flujo de proceso. Un ejemplo de penetración
simultánea consta de zonas localizadas próximas entre sí en la misma
periferia circular, donde el flujo de proceso se extiende
radialmente desde el centro del círculo correspondiente. Pueden
usarse combinaciones de estas variantes, es decir, donde además de
zonas en una periferia circular también hay zonas en la periferia de
círculos que son concéntricos con la periferia circular mencionada
en primer lugar. La penetración simultánea también puede conseguirse
con un frente de flujo lineal que tiene zonas de detección y de
calibrador próximas entre sí y a la misma distancia del punto de
partida del flujo de proceso.
Si en el mismo flujo de proceso se localizan
diversas zonas de detección y/o de calibrador, puede obtenerse una
señal de medición para estas zonas en solo ensayo/aplicación de
reactivo. Si hay varias zonas de calibrador en el mismo flujo de
proceso, la curva de dosis-respuesta (curva de
calibración) o algoritmo puede establecerse para los valores
obtenidos para la misma aplicación del reactivo*. Una zona de
calibrador que existe junto con una zona de detección en el mismo
flujo puede funcionar como calibrador interno positivo (PIC).
En una variante, se utiliza una matriz que
presenta al menos una zona de calibrador (CZ1, CZ2, etc.
(calibradores internos positivos)) y al menos una zona de detección
(DZ1, DZ2, etc.) en combinación con uno o más valores de calibrador
obtenidos por separado. No es necesario que los valores de
calibrador obtenidos por separado se refieran a las mismas
condiciones bajo las que se ensaya la muestra. Si los valores de
calibrador separados, la curva de calibración y el algoritmo se
pretenden usar durante un período de tiempo más largo, se hace
referencia a valores principales, curva principal y algoritmo
principal, respectivamente.
El uso de valores de calibrador obtenidos por
separado implica:
- i.
- dejar que la muestra y el reactivo* atraviesen una zona de detección (DZ) y un calibrador interno positivo (PIC, CZ) en una matriz que presenta tanto DZ como CZ,
- ii.
- determinar la señal de medición de una CZ (valor de PIC, CZ) y de una DZ,
- iii.
- comparar el valor de PIC con el correspondiente o los correspondientes valores de calibrador obtenidos por separado, siendo cualquier desviación una medida de las desviaciones entre las condiciones en las que se ha ensayado la muestra y las condiciones estándar que se aplican al valor o valores de calibrador separados,
- iv.
- adaptar la señal medida para la muestra (valor de la muestra) a las condiciones aplicables para los valores de calibrador obtenidos por separado, y después,
- v.
- obtener la cantidad de analito en la muestra comparando la señal de medición adaptada para la muestra con el valor o los valores de calibrador separados.
Como alternativa, se pueden adaptar los valores
de calibrador separados a desviaciones en las condiciones y después
comparar directamente un valor de la muestra medido con los valores
de calibrador adaptados. Esto es equivalente a las etapas (iv) y (v)
anteriores (denominadas al revés en las reivindicaciones). En las
etapas (iv) y (v), por supuesto, se incluye como alternativa adaptar
la curva de calibración o el algoritmo correspondiente para calcular
el nivel de analito comparando el valor de la muestra con cualquiera
de éstos.
Por supuesto, lo que se ha dicho anteriormente
también se aplica al caso en el que un agente de unión para el
calibrador se ha unido a la zona o zonas de calibración de la
matriz.
Una zona de calibrador y de detección en el mismo
flujo de proceso reducirá las fuentes de error anteriores debidas a
las diferencias en la muestra y el calibrador. Un calibrador interno
positivo y varias zonas de calibrador en el mismo flujo de proceso
compensarán completa o parcialmente las variaciones de flujo entre
ensayos separados. La extensión en el resultado de la medición
debería ser inferior, mientras que los factores internos así como
los externos pueden compensarse completa o parcialmente. Se elimina
el problema que surge cuando la muestra y el calibrador tienen
composiciones diferentes. Para ensayos próximos en pacientes, el
calibrador interno podrá proporcionar un límite bien definido con
respecto a lo que constituye una respuesta positiva, y proporcionar
una garantía de calidad de la que se carece actualmente para este
tipo de ensayos.
El anclaje del calibrador a la matriz puede tener
lugar por medio de enlaces covalentes o por adsorción física,
afinidad bioespecífica etc. Al igual que la técnica anterior en este
campo, la invención puede utilizar combinaciones de tipos de unión,
tales como unión covalente a la matriz de un reactivo de afinidad
bioespecífica dirigido al calibrador. Específicamente, pueden
mencionarse estreptavidina unida covalentemente o adsorbida
físicamente en combinación con un calibrador biotinilado, o un
anticuerpo unido de forma similar dirigido al calibrador. El anclaje
del calibrador a la matriz puede tener lugar a través de partículas
que se han depositado en/sobre la matriz, y a las que el calibrador
se une covalentemente, por adsorción física o bioespecíficamente,
etc. Las partículas se unen a la matriz porque su tamaño se ha
seleccionado de forma que no puedan transportarse a través de la
matriz o por adsorción física. Véase, entre otros, Abbott /Syntex,
documento US 4.740.468; Abbott, documento EP 472.376; Hybritech,
documentos EP 437.287 y EP 200.381; Grace & Co, documento EP
420.053; Fuji Photo Film, documento US 4.657.739; y Boehringer
Mannheim, documento WO 94/06012.
El capturador puede unirse a una zona de
detección de acuerdo con los mismos principios que los que se
aplican a un calibrador. En un solo flujo de proceso, un calibrador
y un capturador pueden unirse a sus respectivas zonas de la misma
forma o de formas diferentes. Por supuesto, lo que se ha dicho
anteriormente en relación con el anclaje del calibrador y del
capturador, también es aplicable al anclaje de un agente de unión
para la substancia calibradora. Por ejemplo puede usarse la
combinación mencionada anteriormente de una substancia de calibrador
biotinilado y estreptavidina unida física o covalentemente.
La zona de aplicación de la muestra puede
localizarse corriente arriba o corriente abajo con respecto a las
zonas de calibrador, preferiblemente corriente arriba. En caso de
que el calibrador de la matriz se haya seleccionado de forma que se
una al analito, la zona de aplicación de la muestra debe localizarse
corriente abajo del calibrador de la matriz. En relación con las
zonas de detección, la zona de aplicación de la muestra siempre debe
estar localizada corriente arriba en realizaciones útiles.
En ciertas realizaciones menos preferidas, es
concebible aplicar la muestra en una zona de calibrador o de
detección.
Una zona de aplicación del reactivo* (A_{R*}Z)
siempre debe localizarse corriente arriba de las zonas de
calibrador.
Si hay una zona de detección en el flujo de
proceso, el orden de las zonas de aplicación de reactivos de
afinidad bioespecífica debe asegurar que el analito' se transporte a
su zona de detección antes o simultáneamente con el reactivo*.
Pueden añadirse uno o más reactivos en la misma zona de aplicación.
Si la zona de aplicación es común a la muestra y a al menos un
reactivo, digamos el reactivo*, la aplicación puede realizarse de
forma simultánea, por ejemplo, mezclando una muestra y un reactivo
antes de aplicarse en la zona. Si se desea, la mezcla puede
preincubarse de tal forma que el reactivo se una al analito o a
otros componentes en la muestra, cuando se desee, antes de la
aplicación de la muestra. Al conocer diversos protocolos, el
especialista podrá determinar fácilmente las zonas que necesita y el
posible orden de las mismas.
Si el reactivo I está presente en forma disuelta,
la matriz tiene una zona de aplicación para éste al mismo tiempo que
hay un capturador firmemente fijado en la zona de detección. Si el
capturador requiere reactivos de afinidad bioespecífica adicionales
para unirse al reactivo I (véase la sección "campo técnico"),
hay zonas de aplicación para estos reactivos. Las zonas de
aplicación para el reactivo I, cuando no es un capturador, y para
cualquier reactivo adicional deben colocarse de tal forma que el
reactivo I alcance la zona de detección antes o al mismo tiempo que
el analito'. Si el reactivo I está en forma soluble, el capturador
puede ser preferiblemente un miembro de un par de unión específica,
acoplándose o conjugándose el otro miembro al reactivo I. Son pares
de unión específica ilustrativos pares de unión inmunológica, tales
como antígeno-anticuerpo y
hapteno-anticuerpo, biotina-avidina
o -estreptavidina, lectina-azúcar,
hormona-receptor hormonal, y dúplex de ácido
nucleico.
Si tanto el calibrador como el reactivo I están
en forma soluble para después unirse a la matriz por medio de pares
de unión específica, por supuesto, estos dos pares de unión son
diferentes.
En ciertas realizaciones menos preferidas, los
reactivos de afinidad bioespecífica (incluido el reactivo*) pueden
aplicarse en una zona de calibrador o de detección. Véase la sección
con el título "Flujo de proceso".
Los reactivos utilizados en el método pueden
predepositarse en su zona respectiva o pueden añadirse en relación
con la realización del método de determinación. La predeposición
implica la aplicación del reactivo en cuestión de antemano de tal
forma que no se extienda hacia afuera de su zona de aplicación hasta
que se inicie un flujo de líquido o atraviese la zona.
La predeposición de reactivos puede tener lugar
por métodos conocidos per se. Véase, por ejemplo, (Behringwerke,
documento US 4.861.711; Unilever, documento WO 83/085344; Abbott,
documento US 5.120.643; Becton Dickinson, documento EP 284.232). Es
importante tener en cuenta el hecho de que un reactivo predepositado
debe disolverse fácilmente cuando el líquido pase a través de la
zona de aplicación en cuestión. Para conseguir una disolución
rápida, es común incorporar/codepositar reactivos en/con substancias
que se disuelven rápidamente. Este tipo de substancias a menudo son
hidrófilas, teniendo grupos polares y/o cargados tales como hidroxi,
carboxi, amino, sulfonato, etc. En particular, pueden mencionarse
polímeros hidrófilos que se disuelven rápidamente, por ejemplo, que
tienen estructura de carbohidrato, azúcares sencillos incluyendo
mono-, di- y oligosacáridos y alcoholes de azúcares correspondientes
(manitol, sorbitol etc.). Es una práctica común recubrir primero la
zona de aplicación en cuestión con una capa de la substancia que se
disuelve rápidamente, y después aplicar el reactivo, posiblemente
seguido de una capa adicional de la substancia que se disuelve
rápidamente. Una forma alternativa es incorporar el reactivo en
partículas de una material que se disuelve rápidamente, que después
se deposita en la zona en cuestión de la matriz.
Los sistemas tampón que se requieren pueden
incluirse en soluciones añadidas simultáneamente con las muestras y
reactivos. En técnicas convencionales, la adición del tampón puede
tener lugar en la zona de aplicación que se localiza corriente
arriba de todas las demás zonas de aplicación. A menudo esto es
igual a la zona de aplicación de la muestra. En la presente
invención el tampón puede añadirse, en principio, en una posición
opcional a lo largo del flujo de transporte. Véase más adelante.
En el documento WO 99/36776, se describe una
invención, que en una variante proporciona una realización preferida
de la presente invención. Esta solicitud se incorpora como
referencia en el presente texto. La invención en esta solicitud de
patente separada se basa en el descubrimiento de que cada líquido de
dos zonas posteriores (AZ2 y AZ1) en una matriz de flujo puede
migrar después del otro sin mezclarse. Esto se conseguirá si el
líquido se aplica a la zona (AZ1) localizada corriente abajo antes o
esencialmente de forma simultánea con la aplicación del líquido en
la zona (AZ2) localizada corriente arriba. Este descubrimiento ha
dado lugar a la posibilidad de conseguir una migración por zonas de
cualquier reactivo presente en los líquidos, hacia una zona de
detección. Si la zona de aplicación de la muestra (A_{S}Z) se
localiza corriente abajo de la zona de aplicación del reactivo*
(A_{R*}Z), y si el líquido se aplica a A_{R*}Z y la muestra a
A_{S}Z, el analito puede migrar a la zona de detección antes de
que lo haga el líquido que contiene el reactivo*. Si hay una zona de
aplicación para el líquido solo (tampón) (A_{B}Z) entre A_{R*}Z
y A_{S}Z, se obtiene un lavado de la zona de detección DZ entre la
captura del analito y el reactivo*. Tal zona de tampón intermedia
(A_{B}Z) también puede asegurar que un reactivo (incluyendo el
analito) que se aplica en una zona localizada corriente abajo,
alcance DZ antes que un reactivo, a partir de una zona de aplicación
localizada corriente arriba. Esto último puede ser importante si la
matriz tal cual retrasa el reactivo que se ha aplicado en la zona
localizada corriente abajo.
Los reactivos pueden incluirse en el líquido que
se aplica a una zona. Como alternativa, pueden predepositarse en la
zona donde se va a aplicar el líquido correspondiente, o en una zona
que está localizada entre ésta y en la zona más cercana que se
localiza corriente abajo, para la aplicación de líquido. La muestra
(el analito) normalmente se aplica en forma de líquido.
Esta realización de la invención es
particularmente interesante para métodos secuenciales del tipo en
cuestión en matrices de flujo, es decir, métodos donde la matriz,
además de contener la zona de calibrador también contiene una zona
de detección, y donde la muestra/analito se transporta a la zona de
detección antes que el líquido que contiene el reactivo*.
Normalmente la detectabilidad analítica de un
reactivo se obtiene porque comprende un grupo detectable
analíticamente. Son ejemplos bien conocidos de grupos usados a
menudo grupos enzimáticamente activos (enzima, cofactor, coenzima,
substrato enzimático, etc.), fluoróforos, cromóforos,
quimioluminiscentes, grupos radiactivos, etc. También se incluyen en
esta categoría grupos a detectar por medio de un reactivo de
afinidad bioespecífica, por ejemplo, biotina, hapteno, clase Ig,
subclase Ig y determinantes específicos de especie de Ig etc. En la
invención, han resultado ser particularmente buenas partículas cuyas
superficies se han recubierto con un reactivo de afinidad
bioespecífica. Las partículas pueden contener cualquiera de los
grupos detectables mencionados previamente, tales como grupos
fluoróforos, o pueden colorearse (= conteniendo grupos
cromogénicos). Las partículas útiles suelen tener un tamaño en el
intervalo de 0,001-5 \mum, preferiblemente
0,01-5 \mum. Las partículas pueden ser esféricas
y/o monodispersas o polidispersas. Pueden tener dimensiones
coloidales, denominándose sol (es decir, normalmente esféricas y
monodispersas que tienen un tamaño de intervalo de
0,001-1 \mum). Son grupos de marcaje de partículas
bien conocidos partículas metálicas (tales como sol de oro),
partículas no metálicas (tales como SiO_{2}, carbono, látex y
eritrocitos y bacterias inactivados). En ciertos casos se ha
subrayado que las partículas no deben sedimentar en las condiciones
utilizadas. (Véase Pharmacia AB, documento WO 96/22532).
Véase también Unilever, documento WO 88/08534;
Abbott, documento US 5.120.643; Becton Dikinson, documento EP
284.232.
En relación con el desarrollo de los calibradores
de matriz, hemos descubierto que, sorprendentemente, pueden
obtenerse buenos resultados si se utiliza simultáneamente:
- (a)
- un reactivo* donde el grupo detectable son partículas como las descritas anteriormente, y
- (b)
- una zona de detección en la que el capturador se une a la matriz a través de partículas (partículas de anclaje) que tienen dimensiones que permitirían el transporte de las partículas a través de la matriz.
Hemos conseguido un sistema de funcionamiento
donde las partículas de marcador y las partículas de anclaje tienen
substancialmente las mismas dimensiones, lo que significa con gran
probabilidad que las partículas de marcador pueden ser mayores que
las partículas ancladas y viceversa, siempre que sigan siendo más
pequeñas que los canales de flujo definidos por la matriz. El
sistema puede funcionar con y sin predeposición del reactivo*. Esta
realización se describe con más detalle en una solicitud PCT en
trámite junto con la presente "Analytical method using particles
and test kit for performing the method" (basada en el documento
SE 9704935-7). Esta última solicitud también se
incorpora como referencia. Aplicado a la presente invención, esto
significa que el reactivo* tiene partículas como un grupo detectable
analíticamente de acuerdo con el apartado a anterior, y que
el calibrador y/o el capturador se unen a la matriz a través de
partículas de acuerdo con el apartado b anterior.
La invención puede aplicarse principalmente a
variantes de ensayo no competitivas (sin inhibición), pero también a
variantes de ensayo competitivas (inhibición), si estas implican que
se forma un complejo con un reactivo relacionado con el analito
unido entre el reactivo I y el reactivo*. Los protocolos pueden
realizarse como variantes simultáneas o secuenciales. Por métodos
simultáneos se entiende que el reactivo* y el analito' se
cotransportan durante al menos una parte del transporte hacia la
zona de detección, y preferiblemente alcanzan esta zona de forma
simultánea. Por método secuencial se entiende que el analito',
durante al menos una parte del transporte hacia la zona de
detección, migra delante del reactivo*, y alcanza preferiblemente la
zona de detección antes que el reactivo*. A continuación se
presentan ejemplos ilustrativos. "-" se refiere a un anclaje
firme a la matriz desde el principio. "- - -" se refiere a la
unión por afinidad bioespecífica. Se ha asumido que los reactivos
son monofuncionales con respecto a los sitios de unión que se están
utilizando.
El reactivo I (= capturador) y el reactivo*
tienen afinidad bioespecífica por el analito (= analito'). x es el
número de moles del reactivo I en la matriz. y es el número de moles
de analito' (= moles de reactivo*) que se han capturado en la matriz
a través del reactivo I. Complejo formado:
Matriz[-Reactivo
I]_{x-y}[-Reactivo I - - - Analito' - - -
Reactivo*]_{y}
El reactivo II (= capturador) tiene afinidad
bioespecífica por el reactivo I, que a su vez tiene afinidad
bioespecífica por el analito (= analito'). El reactivo* tiene
afinidad bioespecífica por el analito. x es el número de moles del
reactivo II en la matriz. y es el número de moles de analito' (=
moles de reactivo*) que se han capturado en la matriz a través del
reactivo II- - -reactivo I. z + y es el número de moles de reactivo
I que se han capturado en la matriz por el reactivo II. Complejo
formado:
Matriz[-Reactivo
II]_{x-z-y}[-Reactivo II- -
-Reactivo I]_{z}-[-Reactivo II- - -Reactivo I- - -Analito'-
-
-Reactivo*]_{y}
El reactivo I es un análogo de analito (=
capturador) y tiene sitios de unión que son equivalentes a los
sitios de unión en el analito. El analito' es un reactivo que tiene
afinidad bioespecífica por el analito y por el reactivo I. El
reactivo* tiene bioactividad bioespecífica por el analito'. El
analito' se incluye en el complejo formado en una cantidad que está
relacionada con la cantidad de analito en la muestra. x es el número
de moles de reactivo I en la matriz. y es el número de moles de
analito' (= número de moles de reactivo*) que se ha capturado en la
matriz a través del reactivo I. Complejo formado:
Matriz[-Reactivo
I]_{x-y}[-Reactivo I- - -Analito'- -
-Reactivo*]_{y}
La invención está adaptada principalmente para la
determinación de reactivos de afinidad bioespecífica (analitos) de
los tipos mencionados inicialmente. Se obtienen grandes ventajas
para analitos que existen en múltiples formas, que tienen como
denominador común al menos un sitio de unión con propiedades de
unión equivalentes.
Para métodos no competitivos (sándwich), el
analito puede ser un anticuerpo dirigido contra un antígeno
(incluyendo alergeno), o hapteno (protocolos de ensayo A y B
anteriores). En este caso, el reactivo I es el antígeno o el hapteno
contra el que se dirige el anticuerpo, y el reactivo* es un
anticuerpo dirigido contra el analito. Como alternativa, el
reactivo* es el antígeno o el hapteno, y el reactivo I es un
anticuerpo dirigido contra el analito. Para métodos no competitivos,
el analito también puede ser un antígeno, siendo el reactivo* y el
reactivo I anticuerpos dirigidos contra el antígeno. Como ejemplos
de analito-antígeno puede mencionarse
inmunoglobulinas, posiblemente de una clase de Ig o subclase de Ig
particular. Cuando el analito es un anticuerpo o una
inmunoglobulina, el reactivo* y el reactivo, respectivamente, pueden
presentar afinidad bioespecífica hacia un determinante Ig que es
específico para una clase de Ig tal como IgA, IgD, IgE, IgG o IgM
y/o para una subclase si está presente (por ejemplo, IgG1, IgG2,
IgG3 o IgG4), y/o para ciertas especies. Esto significa que el
reactivo* y el reactivo I, respectivamente, normalmente son
anticuerpos que presentan algunas de estas especificidades cuando el
analito es un anticuerpo o una inmunoglobulina.
Pueden aplicarse variantes competitivas
principalmente a analitos de bajo peso molecular. En el protocolo de
ensayo C anterior, el analito puede ser un antígeno/hapteno, en cuyo
caso el reactivo I es el antígeno/hapteno unido a la matriz, el
analito' es un anticuerpo dirigido contra el antígeno/hapteno, y el
reactivo* es un anticuerpo dirigido contra el analito'.
Ha resultado particularmente interesante para los
inventores poder medir analitos cuya presencia y/o cantidad está
relacionada con enfermedades autoinmunes y alergias. Es
particularmente interesante medir anticuerpos
anti-alergeno de clase IgE o IgG, en el caso de esta
última dando importancia preferiblemente a algunas de las subclases
mencionadas. La medición de anticuerpos específicos
anti-alergeno puede emplearse para diagnosticar
alergias mediadas por IgE.
Las muestras relevantes pueden ser de origen
biológico, por ejemplo, de diferentes fluidos corporales (sangre
entera, suero, plasma, saliva, orina, lágrimas, líquido
cefalorraquídeo, etc.), extractos de tejidos biológicos, de medios
de cultivos celulares, procedimientos de procesamiento en
biotecnología, de productos alimentarios, del medio ambiente
(muestras de análisis medioambientales) etc. Las muestras pueden
pretratarse para ajustarse, por ejemplo, a la matriz, al protocolo
de ensayo implicado, etc.
Este aspecto de la invención se refiere a un
dispositivo de ensayo donde el calibrador de matriz constituye un
punto central. El calibrador de matriz se usa en métodos analíticos
para transferir valores de señal medidos (valores de muestra) para
un reactivo detectable analíticamente complejado (= Reactivo*) a
cantidades reales de analito en un muestra, en relación con la
realización de un método analítico que utiliza reacciones de
afinidad bioespecífica. Como en el aspecto del método, el reactivo*
se compleja en una cantidad que está relacionada con la cantidad de
analito en una muestra. Los tipos más importante de métodos
analíticos para los que puede usarse el dispositivo son aquellos
para los que se usa el método de la invención, es decir, métodos
donde se forman complejos que comprenden reactivo I- - -Analito'- -
-Reactivo*. Reactivo I, analito', reactivo* y - - - tienen los
mismos significados que en el aspecto del método.
El dispositivo se caracteriza porque muestra:
a) una matriz de flujo en la que hay un área de
flujo de proceso para el transporte del reactivo*, comprendiendo
este área
- i.
- una o más zonas de calibrador (CZ1, CZ2, etc.) que comprenden un calibrador, o un agente de unión para el calibrador, que está anclado firmemente a la matriz, siendo diferentes las cantidades de calibrador o de agente de unión al calibrador, respectivamente, para al menos dos zonas de calibrador, y presentando el calibrador sitios de unión a los que puede unirse el reactivo*, cuando el reactivo* se transporta a través de una zona de calibrador, y
- ii.
- una zona de aplicación para el reactivo* (A_{R*}Z) localizado corriente arriba de dicha una o más zonas de calibrador.
Si la zona o zonas de calibrador en lugar del
calibrador contienen un agente de unión a la substancia calibradora,
el dispositivo también contiene preferiblemente:
b) un calibrador que se predeposita de forma
móvil (por difusión) en o corriente abajo de A_{S}Z.
Preferiblemente, el dispositivo se incluye en un kit que
comprende:
c) reactivo* que puede predepositarse en
A_{R*}Z.
El flujo del proceso también puede contener (a)
una zona de detección (DZ) localizada corriente abajo o que coincide
con A_{R*}Z, y en la que hay un capturador firmemente fijado a
través del cual el reactivo* puede unirse a DZ, y (b) una zona de
aplicación para la muestra (A_{S}Z) localizada corriente arriba o
que coincide con dicha DZ. A_{R*}Z puede localizarse corriente
arriba o corriente abajo o coincidir con A_{S}Z (si está
presente), preferiblemente está corriente arriba o corriente abajo.
Si A_{S}Z y DZ están presentes en el mismo flujo de proceso como
zonas de calibrador, A_{S}Z se localiza preferiblemente corriente
arriba y DZ se localiza preferiblemente corriente abajo de las zonas
de calibrador existentes.
En realizaciones preferidas, el reactivo
firmemente anclado (capturador) tiene afinidad bioespecífica por el
analito o por un reactivo relacionado con el analito que puede
detectarse analíticamente. El reactivo relacionado con el analito es
principalmente relevante para variantes de ensayo competitivas.
La substancia calibradora se selecciona de la
misma forma que en el aspecto del método de la invención. En los
casos en los que la substancia calibradora seleccionada presenta
afinidad bioespecífica por el analito, la zona de calibrador
correspondiente debe localizarse corriente arriba de A_{S}Z.
Tras la descripción del aspecto de método de la
invención serán evidentes detalles adicionales con respecto a los
calibradores, zonas, reactivos, matrices, flujos de proceso,
protocolos de ensayo, y muestras, etc.
A continuación, la invención se ilustrará con
varios ejemplos que muestran diversas realizaciones preferidas de la
misma. La invención se define por las reivindicaciones adjuntas y
que se describen en la descripción.
Se adsorbió fenildextrano (grado de substitución:
1 grupo fenilo por cada cinco unidades de monosacárido = 20%, Pm de
dextrano 40.000, Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) en
partículas de poliestireno (0, 49 \mum de Bangs Laboratories,
Estados Unidos) por incubaciones con agitación con fenildextrano
disuelto en agua desionizada a 1) 5 mg/ml, suspensión de partículas
al 10%, TA, 1 hora, 2) 5 mg/ml, suspensión de partículas al 5%, TA,
1 hora, 3) 20 mg/ml, suspensión de partículas al 1%, TA durante una
noche, durante 15 h. Posteriormente, las partículas se lavaron dos
veces con agua desionizada. Las suspensiones de partículas se
centrifugaron entre cada incubación y lavado (12.100 xg, 25 min,
Beckman, J-21, JA-20, 10.000 rpm).
La suspensión de partículas finalmente se sonicó (baño ultrasónico,
Branson 5210, 5 min).
Se acopló IgE humana a partículas de poliestireno
recubiertas con fenildextrano con CDAP (bromuro de
1-ciano-4-dimetilaminopiridinio
(Kohn J y Wilchek M, FEBS Letters 154(1), (1983)
209-210).
La desalificación y el cambio de tampón de hIgE
se realizaron por exclusión molecular (PD-10,
Pharmacia Biotech AB, Suecia) en NaHCO_{3}, 0,1 M, pH 8,5. Se
activaron 278 mg de partículas de poliestireno (como anteriormente)
en solución al 2% en acetona al 30% (en volumen) con 4,2 ml de CDAP
(0,44 M) y 3,4 ml de TEA (trietilamina 0,2 M,
Riedel-de Haen, Alemania). Se añadió CDAP durante la
agitación durante 60 s y TEA durante 120 s. Las partículas se
lavaron con acetona al 30% (en volumen) y se centrifugaron a 12.100
xg (25 minutos, Beckman, J-21,
JA-20, 10.000 rpm). Se acoplaron 25 mg de hIgE a las
partículas activadas en incubación con agitación durante una noche a
-4ºC. Después, las partículas se centrifugaron antes de la
desactivación con ácido glutámico 0,05 M y ácido aspártico 0,05 M en
tampón NaHCO_{3}. La incubación se realizó con agitación durante
una noche a -4ºC. Las partículas acopladas se lavaron con
NaHCO_{3} 0,1 M y dos veces con tampón borato 20 mM, pH 8,5. La
concentración de partículas se determinó espectrofotométricamente a
A_{600} nm con partículas no tratadas como referencia. La
concentración de la proteína acoplada se determinó estando presente
IgE humana radiactiva durante el acoplamiento.
Se extrajo una parte (peso) de polen de abedul
(Allergon, Suecia) con 10 partes (volumen) de tampón fosfato 0,1 M
(indicado como 1/10), pH 7,4. La extracción duró 2 horas en una mesa
de agitación a +4ºC. El extracto se centrifugó a 4.000 rpm durante
1,75 h. Después de la filtración, la solución se aplicó a una
columna PD-10 y se eluyó en NaHCO_{3} 0,1 M, pH
8,5 (indicado como 1/14).
El extracto t3 (1/14) se acopló con CDAP (Kohn y
Wilchek, FEBS Letters 154(1) (1983) 209-210)
a partículas de poliestireno recubiertas con fenildextrano. Las
partículas de poliestireno (400 mg, recubiertas con fenildextrano
como se ha indicado anteriormente) en acetona al 30% (en volumen),
suspensión de partículas al 2%, se activaron con 600 mg de CDAP (100
mg/ml en acetona al 30%) y 0,48 ml de trietilamina 0,2 M
(Riedel-de Haen, Alemania). Se añadió CDAP con
agitación y se añadió TEA gota a gota durante 90 segundos y
agitación durante 120 s en total. La reacción se inactivó por la
adición de acetona al 30% (4 veces el volumen) y se centrifugando a
12.400 xg durante 35 minutos. Las partículas se lavaron una vez con
agua desionizada. Se añadieron 32 ml del extracto t3 en NaHCO_{3}
0,1 M, pH 8,5, a 80 mg de las partículas activadas y el acoplamiento
se continuó durante 1 hora en una mesa de agitación. Después, las
partículas se centrifugaron antes de desactivarse con ácido
aspártico 0,05 M o ácido glutámico 0,05 M en NaHCO_{3} 0,1 M, pH
8,5. La incubación sobre la mesa de agitación se realizó durante una
noche a +4ºC. Las partículas se lavaron mediante centrifugación en
1) NaHCO_{3} 0,1 M, NaCl 0,3 M, pH 8,5; 2) acetato de Na 0,1 M,
NaCl 0,3 M, pH 5; 3) NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,5; y 4) borato de Na 20
mM, pH 8,5.
La concentración de partículas se determinó
espectrofotométricamente a 600 nm con partículas de poliestireno no
recubiertas como referencia.
Se adsorbió anti-hIgE monoclonal
en partículas de carbono (sp 100 de Degussa, Alemania). Véase
Pharmacia AB, documento WO 96/22532. La suspensión preparada se
diluyó con tampón hasta 400 \mug de partículas de carbono por
ml.
En láminas de nitrocelulosa con soporte de
poliéster (Whatman, 8 \mum, 5 cm de anchura) se aplicaron un 4% de
las partículas acopladas a t3 mencionadas anteriormente con Linear
Striper (IVEK Corporation) con un flujo de 1 \mul/s y 1 \mul/cm
como una zona recta. Las láminas se secaron durante 1 hora, a 30ºC,
y después se cortaron en ángulos rectos con respecto a la zona en
tiras de 0,5 cm de anchura (Matrix 1201 Membrane Cutter, Kinematics
Automation).
En láminas de nitrocelulosa con soporte de
poliéster (Whatman, 8 \mum, 5 cm de anchura) se depositaron
partículas hIgE se depositaron como zonas de calibrador paralelas
con Linear Striper (IVEK Corporation, Estados Unidos). El flujo fue
de 1\mul/s y 1 \mul/cm. Las láminas destinadas para tiras que
sólo tienen zonas de calibrador se recubrieron con seis zonas
paralelas. Las concentraciones de hIgE en las zonas fueron de 0,
0,84; 3,4; 14; 54,2 y 217 ng de hIgE/0,5 cm. Antes de realizar la
deposición, las partículas de hIgE se diluyeron en tampón borato (20
mM, pH 8,5, Dextran T5000 al 4,2% p/p, sorbitol al 5,8% p/p). Todas
las zonas también comprendían partículas recubiertas con
fenildextrano al 1% para producir la misma cantidad de partículas en
cada zona. En una lámina de microcelulosa separada, se depositó una
zona con partículas de hIgE (14 ng de hIgE/0,5 cm, PIC = calibrador
interno positivo), y en una zona paralela partículas t3 como se ha
indicado anteriormente (zona de detección). La deposición tuvo lugar
con el mismo parámetro que para las partículas de hIgE. Las láminas
se secaron durante 1 hora a 30ºC y después se cortaron,
perpendicularmente con respecto a las zonas, en tiras de 0,5 cm de
anchura (Singulator: Matrix 1201 membrane cutter, Kinematic
automation, Estados Unidos).
Se montaron tiras sobre una superficie de
plástico plana. En la parte superior (0,5 cm), en la cavidad, se
puso una membrana de succión (3 cm de anchura, Whatman, 17 Chr).
Para obtener una presión constante, se pusieron pesos de metales en
las membranas de succión. A 10 mm del borde inferior se montó una
tira Inplastor de 2 mm de anchura (película de poliéster
pre-encolada). La tira Inplastor prevendría el flujo
excesivo de los líquidos aplicados sobre una porción de la membrana.
En el extremo inferior de la tira se aplicaron 30 \mul de muestra
o tampón como alternativa. Después de la succión del volumen de
muestra, se aplicaron los siguientes componentes en el orden dado:
15 \mul de tampón, 15 \mul de conjugado de partículas de carbono
como anteriormente y 30+30 \mul de tampón. El tampón fue:
NaPO_{4} 0,1 M, BSA al 3%, NaN_{3} al 0,05%, sacarosa al 3%,
NaCl al 0,5%, fenildextrano al 0,25%, gammaglobulina bovina al
0,05%, pH 7,5. El grado de oscurecimiento de las zonas de reacción
se midió como absorbancia con ultroscan (Ultroscan XL, Enhanced
Laser Densitometer, LKB).
A) Determinación de la actividad sobre la curva
del calibrador de IgE depositado frente a calibradores de IgE
(24ºC) introducidos como muestras en tiras separadas con anticuerpo
anti-hIgE en la zona de unión
| Cantidad depositada de IgE | KU/L Calculado | Abs (x1000)* | |
| 1 | 0,84 | 0,27 | 46 |
| 2 | 3,4 | 0,48 | 109 |
| 3 | 14 | 0,71 | 266 usados más adelante como calibrador interno |
| positivo | |||
| 4 | 54,2 | 2,7 | 619 |
| 5 | 217 | 66,3 | 1882 |
| * = absorbancia en la zona de reacción después de que se haya unido el conjugado de las partículas de carbono. |
B) Determinación del anticuerpo IgE específico de
abedul en muestras de pacientes procesadas a 18, 24 y 37ºC, con o
sin calibrador interno positivo (PIC) para ajustar la curva patrón
(realizada a 24ºC).
| Resultados (KU/L) con y sin curva de calibrador corregida: | ||||||
| Corregida | No corregida | |||||
| 18ºC | 24ºC | 37ºC | 18ºC | 24ºC | 37ºC | |
| Muestra 1 | 1,3 | 1,1 | 1,4 | 0,83 | 1,1 | 1,8 |
| Muestra 2 | 6,9 | 5,5 | 6,7 | 5,1 | 8,6 | 20 |
Los resultados demuestran que es posible
compensar la variación en los ensayos separados usando calibradores
internos positivos. Además, los resultados demuestran que es posible
usar calibradores predepositados.
La realización mostrada en este ejemplo puede
modificarse de forma que se cumplan uno o más de los siguientes
criterios, (a) se haya predepositado el reactivo* en una zona de
aplicación y/o (b) haya una zona de aplicación de la muestra
localizada corriente abajo o corriente arriba de la zona de
aplicación del reactivo*, (c) haya zonas que permiten la adición
simultánea del reactivo* y la muestra.
Se acopló covalentemente estreptavidina (Amersham
Pharmacia Biotech AB, Suecia) a partículas de poliestireno con
fenildextrano adsorbido con CDAP (bromuro de
1-ciano-4-dimetilaminopiridinio)
(Kohn J y Wilchek M, FEBS Letters 154 (1) (1983)
209-210), de acuerdo con la descripción del ejemplo
1 anterior para hIgE. Las partículas acopladas se lavaron tres veces
con NaPO_{4} 50 mM, NaN_{3} al 0,05%, pH 7,4. La concentración
de partículas se determinó espectrofotométricamente a A600 nm con
partículas no tratadas como referencia.
En láminas de nitrocelulosa con soporte de
poliéster (Whatman, 8 \mum, anchura de 5 cm) se aplicaron con
Linear Striper (IVEK Corporation) zonas de:
- 1)
- partículas con estreptavidina acoplada diluidas hasta un contenido de partículas del 1% en NaPO_{4} 10 mM, sacarosa al 5%, dextrano T5000 al 5%, NaN_{3} al 0,01%, pH 7,4;
- 2)
- partículas con t3 acoplado, preparadas de acuerdo con el ejemplo 1, diluidas hasta un contenido de partículas del 4% en NaPO_{4}, sacarosa al 10%, NaN_{3} al 0,05%, pH 7,4. El flujo de deposición fue de 2,5 \mul/cm y la velocidad fue de 20 mm/seg.
Los depósitos se secaron durante 1 hora a 30ºC, y
las láminas se cortaron en tiras de 0,5 cm de anchura (Matrix 1201
Membrane Cutter, Kinematics Automation).
Se acoplaron anticuerpos contra hIgE que se
habían escindido con pepsina en fragmentos fab'2 a partículas de
poliestireno fluorescentes que tenían grupos aldehído sobre su
superficie (Molecular Probes C-17177
TransFluoSpheres, microesferas de aldehído-sulfato,
0,1 \mum, 633/720, 2% de sólidos). Después se acoplaron 23 mg de
anticuerpo a 66 mg de partículas en tampón NaPO_{4} 50 mM, pH 6,5,
durante una noche a temperatura ambiente, tras lo cual se añadieron
205 \mul de NaCNBH_{4} (5 M) para reducir el acoplamiento
durante 3 horas a temperatura ambiente. La centrifugación se realizó
a 20.800 x g (50 min en Eppendorf 5417R, 14.000 rpm), y después se
realizó la desactivación en ácido glutámico 0,05 M y ácido aspártico
0,05 M en agua desionizada, pH 6,5, durante una noche con agitación
a temperatura ambiente. Después de la centrifugación a 20.800 x g
durante 50 min, se realizó el bloqueo con BSA al 0,2% en NaPO_{4}
50 mM, pH 7,4, con NaN_{3} al 0,05%, y la incubación tuvo lugar a
+4ºC. Después se realizó otra centrifugación a 20.800 x g durante 50
min seguido de dos lavados con tampón de bloqueo que después también
se usó para el almacenamiento. La concentración de partículas se
determinó en un fluorímetro (Perkin-Elmer LS50B) con
una curva patrón preparada con la partícula original. La proteína
acoplada durante el acoplamiento se determinó por medio de la
presencia de anti-hIgE radiactiva durante dicho
acoplamiento.
La biotinilación de hIgE se realizó de acuerdo
con las condiciones recomendadas por el proveedor (Pierce). Se
desalificó hIgE por exclusión molecular con PD-10
(Amersham Pharmacia Biotech AB) en KPO_{4} 0,15 M, NaCl 0,15 M, pH
7,8. A 0,95 ml (0,59 mg) de hIgE se le añadieron 0,010 ml de
biotin-LC-Sulfo-NHS
(3,59 mM, Pierce). Después, se realizó una incubación a temperatura
ambiente durante 1 hora, tras lo cual la reacción de acoplamiento se
inactivó por la adición de 40 \mul de glicina 2 M. Después, la
mezcla se aplicó a una columna de exclusión molecular
PD-10 equilibrada con NaPO_{4} 50 mM, NaCl 0,15 M,
pH 7,4. Los rendimientos y la concentración final se calcularon a
partir de la radiactividad como hIgE marcada con
I-125 incluida en el acoplamiento. La concentración
de hIgE se analizó por inmunocromatografía y UniCAP tIgE (Pharmacia
& Upjohn Diagnostics AB, Suecia).
En filtros de aplicación de 5x5 mm (Whatman
F075-14) se distribuyeron 0,006 ml de IgE
biotinilada (1,6 ng) diluida en NaPO_{4} 50 mM, NaCl 0,15 M, BSA
al 6%, lactosa al 5%, dextrano T5000 al 5%, pH 7,4. Los filtros se
secaron a 30ºC durante 1 hora.
Se montaron tiras en una superficie inclinada
aproximadamente 16º con respecto al plano de la mesa de trabajo. Se
pusieron membranas de succión (3,5 cm de anchura, Schleicher &
Schuell, GB004) a una distancia de 0,5 cm del extremo superior de la
membrana. Para obtener una presión constante, se pusieron pesos de
metal en las membranas de succión. Después, se pipetearon membranas
y reactivos sucesivamente como se describe más adelante. Cada
volumen de muestra y reactivo se succionó en la membrana antes de
pipetear el siguiente volumen.
- 1)
- 30 \mul de NaPO_{4} 50 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,4.
- 2)
- Se puso un filtro con IgE biotinilada predepositada en la parte inferior de la tira.
- 3)
- Se pipetearon 30 \mul de suero de paciente en cada filtro.
- 4)
- Se añadieron al filtro 20 \mul de tampón de ensayo (Na-PO_{4} 0,1, NaCl 0,15 M, sacarosa al 10%, BEA al 3%, gammaglobulina bovina al 0,05%, NaN_{3} al 0,05%, pH 7,4).
- 5)
- Se retiró el filtro de aplicación.
- 6)
- Se diluyeron 20 \mul de conjugado de detección (75 \mug/ml) en tampón de ensayo.
- 7)
- 2 x 30 \mul de tampón de ensayo.
- 8)
- La fluorescencia de la zona de detección se midió como un área de respuesta (Vmm) con un fluorómetro de láser rojo de exploración (635 nm).
Se seleccionaron tres sueros t3 positivos y se
analizaron por triplicado con tres lotes de conjugados diferentes.
Como curva de calibración almacenada se usaron las áreas de señal
obtenidas con nitrocelulosa recubierta con diferentes
concentraciones de partículas de IgE (descritas en el ejemplo 1
anterior) procesadas con el conjugado 2.
La corrección con PIC significa que la señal para
la zona de reacción para t3 se multiplicó por PICexp/PICobs antes de
la lectura frente a la curva de calibración almacenada (curva
principal). PICexp se definió como la media de las señales PIC
obtenidas en el ensayo con el conjugado 2.
| Lectura frente a la curva principal de señal no corregida | ||||
| Suero | Conc (KU/L) de Conjugado 1 | Media del Conjugado 2 | Conjugado 3 por | Entre CV (%) |
| triplicado | ||||
| 1 | 0,75 | 3,0 | 1,4 | 68 |
| 2 | 5,7 | 29,1 | 18,7 | 66 |
| 3 | 2,5 | 10,8 | 6,8 | 62 |
| Lectura frente a la curva principal para la señal corregida con PIC | ||||
| Suero | Conc (KU/L) de Conjugado 1 | Media del Conjugado 2 | Conjugado 3 por | Entre CV (%) |
| triplicado | ||||
| 1 | 2,5 | 3,5 | 1,9 | 29 |
| 2 | 14,2 | 19,5 | 20,7 | 19 |
| 3 | 3,6 | 5,3 | 6,1 | 26 |
Entre CV (%) se calcula como la variación de las
tres medias obtenidas para los diferentes conjugados. Los resultados
demuestran que la idea de una substancia calibradora predepositada
en la zona de aplicación es funcional y que el uso de la misma como
PIC proporciona adicionalmente una menor variación entre
ensayos.
Claims (28)
1. Un método de flujo lateral en un proceso para
la determinación de un analito en una muestra, que implica la
utilización de reacciones de afinidad bioespecífica, y que comprende
las siguientes etapas:
- i.
- formar un complejo que comprende:
- Reactivo I- - -Analito'- - -Reactivo*, donde
- a.
- el reactivo* y el reactivo I presentan afinidad bioespecífica por el analito,
- b.
- el reactivo* es detectable analíticamente,
- c.
- el analito' es el analito o un reactivo relacionado con el analito, y posteriormente
- ii.
- determinar la señal detectable procedente del reactivo* en el complejo, y
- iii.
- obtener la cantidad de analito en la muestra comparando el valor de la muestra con uno o más valores del calibrador, correspondiendo cada uno de ellos a una cantidad estándar de analito,
caracterizado porque
A) antes de la determinación del valor del
calibrador, se ha unido a la matriz (i) el calibrador o (ii) un
agente de unión para el calibrador, y cuando se ha unido a la matriz
un agente de unión al calibrador, se añade calibrador o el
calibrador predepositado en la matriz se libera en la determinación
del valor del calibrador, y porque la matriz es insoluble en el
medio líquido en el que tiene lugar la unión del reactivo* al
calibrador,
B) el calibrador y el analito tienen la capacidad
de unirse bioespecíficamente al reactivo* por sitios de unión
equivalentes,
C)
- a.
- la matriz presenta una o más zonas de calibrador (CZ1, CZ2, CZ3 etc.) que se localizan en el mismo flujo de proceso, correspondiendo al menos dos de ellas a diferentes cantidades estándar de analito, y
- b.
- (i) cada zona de calibrador comprende el calibrador en una cantidad que corresponde a una cantidad estándar de analito o (ii) cada zona de calibrador contiene un agente de unión al calibrador, correspondiendo la cantidad de agente de unión al calibrador y la cantidad de calibrador a una cantidad estándar de analito, y
- c.
- el reactivo* se une al calibrador transportando el reactivo* a través de las zonas de calibrador.
D) el transporte del reactivo* para la unión al
calibrador de la matriz en las diversas CZ, tiene lugar mediante
este flujo de proceso hacia la zona o las zonas de detección
(DZ).
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque el calibrador se ha unido a la matriz
antes de la determinación del valor del calibrador.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque un agente de unión para el calibrador se
ha unido a la matriz antes de la determinación del valor del
calibrador.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó
3, caracterizado porque dicho agente de unión para el
calibrador es un miembro de un par de unión específica, y porque el
otro miembro del par de unión específica se acopla o se conjuga con
el calibrador.
5. El método de acuerdo con las reivindicaciones
1-4, caracterizado porque la matriz de flujo
es una matriz de flujo lateral.
6. El método de acuerdo con la reivindicación
1-4 ó 5, caracterizado porque
- a.
- las zonas de calibrador separadas (CZ) se localizan en flujos del proceso separados, y
- b.
- el transporte de reactivo* para la unión al calibrador en una zona de calibrador CZ tiene lugar mediante el flujo de proceso respectivo.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque
- a.
- el flujo de proceso y los flujos de proceso, respectivamente, carecen de una zona de detección, y
- b.
- el complejo se forma en una zona de detección en un flujo de proceso que carece de una zona de calibrador y que está presente en una matriz del mismo tipo que las zonas de calibrador.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la
matriz es una matriz de flujo y porque, a lo largo de un solo flujo
de proceso, hay
- a.
- una o más zonas de calibrador (CZ), presentando cada una de ellas un calibrador de matriz o un agente de unión al calibrador de matriz,
- b.
- una o más zonas de detección, de las que ninguna coincide con ninguna zona de calibrador, y en las que el capturador está anclado firmemente y es el reactivo I o un reactivo de afinidad bioespecífica, que puede unirse directa o indirectamente al reactivo I bioespecíficamente,
- c.
- una zona de aplicación para el reactivo*, A_{R*}Z, que se localiza corriente arriba de dicha CZ y DZ y en la que puede haberse predepositado el reactivo*, y
- d.
- una zona de aplicación para la muestra (A_{S}Z) que se localiza
- i.
- corriente arriba de o coincidiendo con una zona de detección,
- ii.
- corriente abajo o corriente arriba de o coincidiendo con A_{R*}Z (A_{S}Z/A_{R*}Z), o
- iii.
- corriente arriba, corriente abajo de o coincidiendo con una zona de calibrador, donde preferiblemente la zona de aplicación de la muestra (A_{S}Z) se localiza corriente arriba de las zonas de detección y de calibrador, y porque se añade reactivo* a A_{R*}Z si el reactivo* no está predepositado, o se añade tampón a A_{R*}Z si el reactivo* está predepositado, y la muestra se añade a A_{S}Z, opcionalmente premezclado con el reactivo* si A_{S}Z y A_{R*}Z coinciden, de forma que el analito y el reactivo* alcanzan DZ al mismo tiempo, o de forma que el analito alcanza DZ antes que el reactivo*.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8,
caracterizado porque la zona o zonas de calibrador (KZ)
presentan un agente de unión al calibrador, y porque el calibrador
se predeposita corriente arriba de la zona o zonas de
calibrador.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 8
ó 9, caracterizado porque el flujo de proceso comprende dos o
más de dichas zonas de calibrador.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 8
ó 9, caracterizado porque el flujo de proceso comprende una o
dos de dichas zonas de calibrador, y porque el nivel de analito en
la muestra se obtiene:
- a.
- teniendo acceso a uno o más valores del calibrador obtenidos por separado, y
- b.
- comparando un valor del calibrador para una zona de calibrador (Calibrador Interno Positivo = PIC), que está localizado en el mismo flujo de proceso que dicha zona de detección, con uno o más de los valores del calibrador obtenidos por separado,
- c.
- adaptando la señal de medición desde la zona de detección a la desviación de la señal de medición para PIC a partir de valores del calibrador separados, y posteriormente
- d.
- obteniendo el nivel de analito en la muestra comparando la señal de medición adaptada de la zona de detección con uno o más de los valores del calibrador obtenidos por separado, o viceversa con respecto a lo que se ha adaptado y comparado en las etapas c y d.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 8-11, caracterizado
porque
- a.
- A_{S}Z es (i) común a A_{R*}Z (= A_{S}Z/A_{R*}Z) o (ii) se localiza corriente arriba de A_{R*}Z, y
- b.
- como alternativa (i) la muestra se premezcla con el reactivo* antes de añadirse a la zona común A_{S}Z/A_{R*}Z, o la muestra se añade a la zona común A_{S}Z/A_{R*}Z que contiene el reactivo* predepositado, y como alternativa (ii) la muestra se añade a A_{S}Z que se localiza corriente arriba de A_{R*}Z que, a su vez, comprende el reactivo* predepositado.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 5-12, caracterizado porque
el reactivo* tiene partículas como grupo detectable analíticamente,
y/o el calibrador o agente de unión al calibrador y/o capturador, si
hay una zona de detección, se anclan a la matriz a través de
partículas.
14. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, caracterizado porque
el analito es un anticuerpo dirigido contra el reactivo I o contra
el reactivo*, y
- a.
- el reactivo* es un anticuerpo dirigido contra el analito y el reactivo I es un antígeno/hapteno, cuando el analito es un anticuerpo dirigido contra el reactivo I, y
- b.
- el reactivo* es un antígeno o un hapteno y el reactivo I un anticuerpo dirigido contra el analito, cuando el analito es un anticuerpo dirigido contra el reactivo*.
15. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, caracterizado porque
el analito es un antígeno, y el reactivo* y el reactivo I son
anticuerpos dirigidos contra el analito.
16. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, caracterizado porque
el método se realiza como parte del diagnóstico de una alergia o
enfermedad autoinmune.
17. Un dispositivo para transformar valores de
señal medidos de un reactivo detectable analíticamente complejado (=
reactivo*) en cantidades reales de analito en una muestra, en
relación con la realización de un método de análisis que utiliza
reacciones de afinidad bioespecífica para la determinación de la
cantidad de analito en una muestra, para formar complejos que
comprenden el reactivo* en una cantidad relacionada con la cantidad
de analito en la muestra, caracterizado porque presenta:
una matriz de flujo en la que hay un área de
flujo de proceso para el transporte del reactivo*, y porque en este
área hay
- i.
- una o más zonas de calibrador (CZ1, CZ2, etc.) que comprenden un calibrador, o agente de unión al calibrador, que está anclado firmemente a la matriz, siendo las cantidades de calibrador o de agente de unión al calibrador, respectivamente, diferentes para al menos dos zonas de calibrador, y presentando el calibrador sitios de unión a los que puede unirse el reactivo*, cuando el reactivo* se transporta a través de una zona de calibrador hacia la zona o zonas de detección (DZ), y
- ii.
- una zona de aplicación para el reactivo* (A_{R*}Z) corriente arriba de dicha una o más zonas de calibrador.
18. El dispositivo de acuerdo con la
reivindicación 17, caracterizado porque un agente de unión al
calibrador está anclado firmemente en la matriz y porque el
dispositivo comprende un calibrador predepositado corriente arriba
de la zona de calibrador, por ejemplo en A_{S}Z.
19. El dispositivo de acuerdo con la
reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque el dispositivo
comprende el reactivo* predepositado en A_{R*}Z.
20. El dispositivo de acuerdo con la
reivindicación 17, 18 ó 19, caracterizado porque el flujo de
proceso comprende una zona de detección (DZ) que se localiza
corriente abajo o que coincide con A_{R*}Z y comprende un
capturador anclado firmemente a través del cual el reactivo* puede
unirse a DZ, y una zona de aplicación de la muestra (A_{S}Z) que
se localiza corriente arriba o que coincide con dicha DZ.
21. El dispositivo de acuerdo con la
reivindicación 20, caracterizado porque A_{R*}Z se localiza
corriente arriba, corriente abajo o coincide con A_{S}Z, donde se
prefieren localizaciones corriente arriba o corriente abajo.
22. El dispositivo de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 20-21, caracterizado
porque el reactivo (capturador) anclado firmemente tiene afinidad
bioespecífica por el analito o por un reactivo relacionado con el
analito.
23. El dispositivo de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 20-21, caracterizado
porque el reactivo anclado firmemente (capturador) tiene afinidad
bioespecífica por un segundo reactivo que, a su vez, tiene afinidad
bioespecífica por el analito o por un reactivo relacionado con el
analito.
24. El dispositivo de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 20-23, caracterizado
porque dicha una o más zonas de calibrador se localizan corriente
arriba de DZ.
25. El dispositivo de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 20-24, caracterizado
porque A_{S}Z se localiza corriente arriba de todas las zonas de
calibrador.
26. Un kit de ensayo, caracterizado porque
el kit comprende un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 17-25.
27. El kit de acuerdo con la reivindicación 26,
caracterizado porque el kit comprende el reactivo*.
\newpage
28. El kit de acuerdo con la reivindicación 26 ó
27, caracterizado porque el kit comprende el calibrador
cuando dicho dispositivo tiene el agente de unión al calibrador
unido a la matriz.
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