ES2222228T3 - Metodo, reactivo y cartucho de ensayo destinados a determinar el periodo de tiempo de coagulacion. - Google Patents

Abstract

Un método para la determinación del período de tiempo de coagulación de una muestra de sangre, que comprende poner en contacto una muestra de sangre con una cantidad efectiva de un factor tisular y de un sulfátido, y medir el período de tiempo que transcurre hasta que se observe un grado predeterminado de coagulación.

Description

Método, reactivo y cartucho de ensayo destinados a determinar el período de tiempo de coagulación.

Antecedentes del invento

El presente invento se refiere al campo de la determinación del período de tiempo de coagulación de muestras de sangre, y más específicamente se refiere a la determinación del período de tiempo de coagulación de muestras de sangre procedentes de pacientes que están recibiendo un tratamiento con heparina, particularmente de pacientes a los que se han administrado unas dosis de heparina desde bajas a moderadas, así como de pacientes a los que se han administrado unas dosis altas de heparina.

El ensayo del período de tiempo de coagulación activada (ACT = de Activated Clotting Time) es un ensayo de sangre que vigila la eficacia de una dosificación de heparina. Los niveles de heparina que está vigilando el ensayo de ACT se encuentran generalmente más allá del intervalo del ensayo del período de tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT, de Activated Partial Thromboplastin Time). Algunos ensayos del APTT pueden vigilar unos niveles de heparina en plasma tan altos como el de 1,5 U/ml (que es equivalente a un nivel de heparina en sangre de aproximadamente 0,75 U/ml), mientras que el ensayo de ACT puede vigilar unos niveles de heparina en sangre generalmente tan altos como el de 6 U/ml. El extremo superior del intervalo de heparina en sangre (intervalo alto; HR, de High Range) se usa con frecuencia en una operación quirúrgica de derivación de pulmón a corazón, mientras que unos niveles en sangre situados por debajo de 3 U/ml (intervalo desde moderado a bajo; LR, de Low Range) pero por encima del intervalo efectivo del ensayo de APTT, se usan en situaciones tales como cateterización cardíaca, oxigenación a través de membranas extracorporales (ECMO de Extracorporeal Membrane Oxygenation), hemodiálisis y angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA, de Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty).

Hay diversos sistemas de ensayo del ACT disponibles comercialmente. Éstos difieren típicamente en el componente específico que activa la coagulación, cuya diferencia puede afectar al intervalo de heparina en sangre en el que es seguro y confiable el ensayo. Consiguientemente, estos tipos de sistemas de ensayo son clasificados con frecuencia por el intervalo de heparina y por la correspondiente aplicación quirúrgica o médica. Un ejemplo de dicho sistema de ensayo es conocido como el Hemochron® vendido por la International Technidyne Corporation. El proceso básico para este sistema de ensayo es el siguiente: Una muestra de dos mililitros de sangre se añade a un tubo de ensayo que contiene celite (tierra de diatomeas) y una pequeña barra magnética. El tubo de ensayo se tapa y agita, y luego se coloca en un instrumento que comienza a hacer girar a la barra magnética. Cuando la sangre comienza a coagularse, la barra magnética se decelera o cesa de girar. El instrumento anota entonces la duración del período de tiempo que transcurre hasta que el imán cese de girar, como el período de tiempo de ACT en celite. Una variante de este ensayo es conocida como el ensayo de ACT en vidrio Hemochron®, en el que el tubo de ensayo es de un material plástico y contiene partículas de vidrio con una barra magnética, y la muestra es solamente de 0,4 ml de sangre.

Las patentes de los EE.UU. N^{os} 4.756.684 y 5.039.617 describen un dispositivo integrado que contiene un reactivo seco, previamente dispensado, en una trayectoria capilar que se puede usar para medir la coagulación de muestras de sangre. El cesionario del presente invento vende actualmente un sistema bajo las denominaciones de CoaguChek® Pro y CoaguChek® Plus. Se presentaron ciertos desafíos para diseñar un reactivo destinado a usarse en este sistema para medir la efectividad de la heparina en el intervalo de 3 U/ml y menor. Por ejemplo, el sistema CoaguChek® Plus/Pro debería tener un período de tiempo de ensayo de 300 segundos o menos, mientras que los reactivos de ACT tradicionales tienen un período de tiempo de ensayo hasta de 1.000 segundos.

Además, los activadores que se han usado tradicionalmente en los reactivos de ACT son partículas de celite, caolín o vidrio, todas las cuales son partículas insolubles. Dichos activadores plantean típicamente problemas para el sistema de cartucho y de reactivos que se emplea en el sistema CoaguChek® Plus que usa la muestra de sangre para solubilizar al reactivo y mover al reactivo junto con la sangre a través de las trayectorias del cartucho durante la reacción de activación de la coagulación.

Sumario del invento

Expresado brevemente, el invento se refiere a un método, a un reactivo y a un cartucho de ensayo para la determinación del período de tiempo de coagulación de una muestra de sangre por medio de un reactivo que comprende un factor tisular y un co-factor. Un co-factor preferido es un sulfátido. Este invento se usa de manera preferible para vigilar la efectividad de una terapia con heparina en pacientes a los que se han administrado unas dosis de heparina desde bajas a moderadas, que dan como resultado unos niveles de heparina en sangre de desde aproximadamente 0 a aproximadamente 3 U/ml. Sin embargo, se ha descubierto de un modo sorprendente que el invento puede vigilar la efectividad de una terapia con heparina en pacientes a los que se han administrado unas dosis más altas de heparina, dando como resultado unos niveles de heparina en sangre de hasta aproximadamente 6 U/ml. En una realización alternativa, el sulfátido se puede combinar con un fosfátido, o se puede reemplazar por éste.

De acuerdo con el aspecto de cartucho de ensayo del invento, el cartucho incluye un alojamiento que comprende una lumbrera de entrada, una unidad de cámara y una lumbrera de salida. El cartucho comprende además preferiblemente una primera unidad capilar para bombear de manera independiente un líquido, tal como una muestra de sangre, desde dicha lumbrera de entrada a dicha unidad de cámara. Además, el cartucho preferido incluye preferiblemente una segunda unidad capilar colocada entre, y conectada operativamente con, dicha unidad de cámara y dicha lumbrera de salida para bombear de manera independiente un líquido desde dicha unidad de cámara a dicha lumbrera de salida. La lumbrera de entrada, la primera unidad capilar (si está presente), la unidad de cámara, la segunda unidad capilar (si está presente), y la lumbrera de salida están presentes en una trayectoria capilar continua. Está contenido dentro de la trayectoria capilar un reactivo que comprende un factor tisular, y un co-factor, de manera preferible un sulfátido. En una realización alternativa, un fosfátido puede ser combinado con un sulfátido, o un fosfátido puede ser el único co-factor.

Deberá señalarse que, tal y como se usan en el presente contexto, los términos de tromboplastina, factor tisular y factor de coagulación III están destinados todos ellos a significar la proteína superficial de células que inicia una coagulación.

Deberá señalarse también que el término de sulfátido se refiere a una clase de derivados sulfatos de cerebrósidos, que tienen la siguiente estructura general:

1

R = residuo de ácido graso.

El término de fosfátido se refiere a una clase de compuestos basados en glicerol, en los que uno de los grupos hidroxilo ha sido reemplazado por un grupo de ácido fosfórico, y los otros grupos hidroxilo han sido reemplazados por ésteres de ácidos grasos. Los fosfátidos son citados también como fosfolípidos, fosfoglicéridos y fosfátidos de glicerol. Para más información acerca de los fosfátidos, véase la obra de Lehninger, Albert L., Biochemistry [bioquíca], 2ª edición, Worth Publishers, NY (1975).

El presente invento, junto con objetivos y ventajas consiguientes, se puede entender mejor con referencia a la siguiente descripción detallada en conexión con las Figuras anejas.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B son vistas en planta y en sección transversal del cartucho de ensayo del presente invento.

La Figura 2 muestra la respuesta básica de muestras heparinizadas a reactivos basados en un TF.

La Figura 3 muestra el efecto de la respuesta de heparina de reactivos basados en un TF con niveles variables de sulfátidos.

La Figura 4 muestra los gráficos generados en una evaluación de los efectos de la temperatura de una muestra sobre el método del presente invento.

Descripción detallada

El invento implica el uso de un factor tisular (TF, de tissue factor) y de un co-factor, preferiblemente un sulfátido, en un método, un reactivo y un cartucho de ensayo para determinar el período de tiempo de coagulación activada de una muestra de sangre. En una realización alternativa, el co-factor puede ser un fosfátido a solas o en combinación con un sulfátido.

El factor tisular (TF), también citado como tromboplastina y factor de coagulación III, es una glicoproteína membranal integral que funciona como un agente iniciador de la coagulación. El TF y sus propiedades como agente iniciador biológico de este proceso hemostático esencial se debaten en el artículo de revista "Initiation of Coagulation by Tissue Factor" [Iniciación de la coagulación por un factor tisular] por R.R. Bach, CRC Crit. Rev. Biochem. (1988), 23: 339-68.

El componente factor tisular del reactivo es preferiblemente un TF humano recombinante (rHTF, de recombinant human TF). La purificación de un rHTF se ha descrito en las citas de Paborsky y colaboradores, Biochemistry (1989) 28: 8072-7 y Rehemtulla y colaboradores, Thromb. Haemost. (1991) 65: 521-7. El rHTF usado para el reactivo del presente invento se adquirió de Serbio (Nº de catálogo 77800). Se pueden usar asimismo otras fuentes de TF, tales como extractos naturales de cerebros, pulmones o plaquetas de mamíferos (seres humanos, conejos, bovinos, caballos, monos, etc.), etc.

La respuesta básica de las muestras heparinizadas a reactivos basados en un TF se muestra en la Figura 2. En particular, los reactivos se formularon tal como se muestra en la Tabla 1, con la excepción de que no estaba presente ningún sulfátido o fosfátido añadido y de que el nivel del TF se hacía variar entre 50 ng/l y 1.000 ng/ml. Estos reactivos basados en un TF se aplicaron a los cartuchos de ensayo tal como antes se ha descrito, y se ensayaron en ellos muestras con diversos niveles de heparina. A unos niveles suficientemente altos de un factor tisular, es baja la sensibilidad del reactivo a la heparina. Según va descendiendo el nivel de un factor tisular, la sensibilidad aumenta, pero con una pérdida de activación de coágulos con muestras que contienen niveles de heparina más altos.

Se encontraron co-factores para un TF que aumentan la sensibilidad a heparina en reactivos basados en un TF. Por ejemplo, los sulfátidos y fosfátidos son co-factores, de los que se encontró que controlan el grado de sensibilidad a heparina producido por el factor tisular. No obstante, los fosfátidos no tienen la consistencia para afectar a la sensibilidad a heparina en el factor tisular, que se encontró para los sulfátidos. La Figura 3 muestra el efecto sobre la respuesta a heparina de diversos niveles de sulfátidos combinados con 400 ng/ml de un TF. En particular los reactivos se produjeron de acuerdo con la Tabla 1 siguiente, con la excepción de que el TF estaba presente a razón de 400 ng/ml y la concentración de sulfátidos se hizo variar entre 0 y 0,4% de la muestra, es decir entre 0 y 4 mg/ml de la muestra.

Los fosfátidos y sulfátidos se pueden combinar en unas relaciones optimizadas y pueden obtener aproximadamente la misma sensibilidad en el sistema de ensayo del presente invento que con sulfátidos a solas. Los fosfátidos están disponibles con mayor facilidad y a menor costo que los sulfátidos. Por lo tanto, en una realización alternativa, se utiliza una combinación de un sulfátido y un fosfátido, en que la relación del fosfátido al sulfátido es llevada a un máximo pero que todavía se proporciona una sensibilidad óptima. Sorprendentemente, se encontró que unas relaciones de fosfátido a sulfátido que fluctúan entre aproximadamente 1/3 y aproximadamente 3/1 en peso tienen aproximadamente la misma sensibilidad que el sulfátido a solas. Unos niveles de heparina que fluctúan entre aproximadamente 2 U/ml y aproximadamente 6 U/ml se pueden determinar de una manera eficaz usando una cantidad efectiva de un sulfátido, un fosfátido, o una combinación de éstos. Unos niveles de heparina que fluctúan entre 0 U/ml y aproximadamente 2 U/ml se pueden determinar usando un fosfátido o un fosfátido combinado con un sulfátido, pero se prefiere usar solamente un sulfátido para este intervalo, o un fosfátido combinado con un sulfátido en una relación en peso entre aproximadamente 1/3 y aproximadamente 3/1.

Un co-factor, preferiblemente un sulfátido, y en realizaciones alternativas un fosfátido a solas o en combinación con un sulfátido, es por consiguiente el segundo ingrediente importante en el método, el reactivo y el cartucho de ensayo. Ha de entenderse que el término co-factor (o también cofactor), tal y como se usa en el presente contexto, se refiere a co-factores que se pueden utilizar en combinación con un TF para determinar la efectividad de un intervalo desde moderado a bajo, y también preferiblemente un intervalo alto, de dosificación de heparina de acuerdo con el presente invento, y para conseguir los deseados resultados en menos de aproximadamente 300 segundos. El término co-factor, por lo tanto, no incluye partículas insolubles tradicionalmente usadas como activadores del ACT, tales como partículas de celite, caolín y vidrio.

Los sulfátidos, también conocidos como sulfatos de cerebrósidos y sulfo-glicosil-esfingolípidos, son sustancias de las que se sabe que están presentes en tejidos de mamíferos y membranas celulares, que muestran una actividad pro-coagulante, que puede ser atribuida a reacciones de activación de un contacto. Los sulfátidos han sido estudiados como activadores de trayectorias intrínsecas. Para un debate acerca de las propiedades de los sulfátidos, y de sus propiedades como activadores de la activación de un contacto dependientes del factor XII, véanse las citas de Tans y Griffin, Blood [Sangre] (1982) 59-69, y de Tans y colaboradores, J. Biol. Chem. (1983) 258: 8215-8222.

Un sulfátido preferido para usarse en el presente invento es un sulfátido de cerebro de bovino, adquirido de Life Science Research, Inc., o de Sigma. Un fosfátido preferido para usarse en el presente invento es la fosfatidil-colina extraída de habas de soja, disponible a partir de Sigma.

Los dos componentes del reactivo, el TF y el cofactor (es decir un sulfátido y/o un fosfátido) están presentes en cantidades y proporciones apropiadas en el reactivo para conseguir los deseados resultados cuando una cantidad eficaz del reactivo se pone en contacto con una muestra que contiene heparina. El TF está presente generalmente en el reactivo en una cierta cantidad, de manera tal que cuando se añade a una muestra una cantidad efectiva del reactivo (es decir, una cantidad suficiente para causar la coagulación en el período de tiempo deseado), la muestra comprende entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1.000 ng/ml de TF, de modo preferible entre aproximadamente 100 y aproximadamente 400 ng/ml de TF, y del modo más preferible de aproximadamente100 ng/ml de TF. Los sulfátidos o fosfátidos están presentes generalmente en el reactivo en una cantidad tal que cuando se añade una cantidad eficaz del reactivo a una muestra, la muestra comprende por lo menos aproximadamente 1 mg/ml del cofactor, y preferiblemente entre alrededor de 2 y alrededor de 4 mg/ml, del cofactor, y lo más preferiblemente alrededor de 3 mg/ml del cofactor. Si hay una combinación de un sulfátido y un fosfátido, la concentración total de la combinación de los cofactores presentes en la muestra estará entre 2 y 4 mg/ml, y de modo sumamente preferido en aproximadamente 3 mg/ml.

El cofactor (es decir un sulfátido y/o un fosfátido) y un TF se pueden combinar preliminarmente en un reactivo y usarse en estado húmedo en el método del presente invento. Este reactivo húmedo es acuoso y preferiblemente proporciona los niveles del TF y del cofactor para que se produzcan los niveles del TF y del co-factor en la muestra que se han señalado anteriormente.

Preferiblemente, el TF y el sulfátido y/o el fosfátido se combinan en un reactivo acuoso que ha sido secado sobre la superficie interna de un cartucho de ensayo, tal como el que se describe en la patente de los EE.UU. Nº 5.039.617. Métodos preferidos de producir y secar el reactivo se describen en esta misma patente. De manera preferible, el reactivo resultante es sustancialmente anhidro. Para facilitar la descripción, la cantidad de un componente en un reactivo anhidro se presenta como la cantidad del componente en la formulación acuosa, antes de haberla secado.

Además de los dos componentes esenciales, un TF y un cofactor (preferiblemente un sulfátido y/o un fosfátido) pueden estar presentes otros componentes en la formulación de reactivos. Por ejemplo se usan preferiblemente aditivos conferidores de voluminosidad para obtener facilidad de manipulación. Los preferidos agentes conferidores de voluminosidad incluyen sacarosa y manitol, y están presentes en una cantidad de aproximadamente 40 mg/ml de una muestra.

Preferiblemente, se incluye también un tampón en el reactivo. Actualmente, se prefiere la glicina como tampón y ésta está presente en una cantidad de aproximadamente 30 mg/ml de una muestra. Otros tampones apropiados incluyen tris, bicina y HEPES.

Un agente de diseminación se usa preferiblemente con el fin de facilitar el revestimiento de la superficie interna del cartucho de ensayo. Un agente de diseminación preferido es gelatina, tal como una gelatina de piel de porcino, presente en una cantidad de aproximadamente 10 mg/ml de una muestra.

Un agente tensioactivo, tal como Triton® X-100, se incluye preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 0,1 mg/ml de una muestra. Se pueden usar también otros agentes tensioactivos convencionales.

Preferiblemente, se añaden también colorantes a la formulación, de manera tal que durante la fabricación del cartucho se pueda llevar a cabo una comprobación de control de la calidad, para determinar si se ha añadido el reactivo al cartucho. Los colorantes apropiados incluyen Sulforrodamina B y Azul de Bromofenol, presentes en una cantidad de aproximadamente 2 mg/ml de una muestra.

Un agente estabilizador, tal como albúmina de suero bovino (BSA, de Bovine Serum Albumin) u otras albúminas de mamíferos, se añade preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 10 mg/ml de una muestra.

Puesto que el reactivo se prepara preferiblemente con rapidez, y luego se seca en un cartucho que está cerrado herméticamente dentro de una bolsa, no se necesitan agentes conservantes. No obstante, si el reactivo se ha de almacenar en estado húmedo durante cualquier período de tiempo, se pueden usar conservantes convencionales.

Una formulación preferida para el reactivo, juntamente con un cierto número de variantes, se expone en la Tabla 1.

TABLA 1

2

Tal como antes se ha señalado, con el fin de eliminar la manipulación de reactivos por parte del usuario del dispositivo y de estabilizar los reactivos, el reactivo es suministrado preferiblemente dentro de cartuchos de ensayo, con lo que el mezclamiento con el reactivo se realiza en el cartucho. Los reactivos pueden estar presentes de modo bien sea difusivo o no difusivo en la superficie del cartucho, es decir adheridos, absorbidos, adsorbidos o enlazados covalentemente, de manera tal que el reactivo pueda resultar disuelto en el fluido o pueda permanecer fijado a la superficie. Cuando los reactivos están unidos de modo difusivo (enlazados no covalentemente y de manera débil) se pueden adaptar una diversidad de situaciones. Una situación es aquella en la que el frente de líquido disuelve a la totalidad del reactivo, de manera tal que el frente de líquido recibe una alta concentración del reactivo, y la mayor parte de la reacción se realiza en el frente de líquido. Una segunda situación sería aquella en la que haya un exceso de un reactivo de solubilidad limitada. En esta situación, el reactivo puede estar presente en el medio líquido en una concentración sustancialmente uniforme. Una tercera situación es aquella en la que se tiene una deficiencia de un reactivo de solubilidad limitada, de manera tal que solamente la porción temprana del fluido tendrá una concentración relativamente constante de reactivo. Se prefiere dispersar un líquido que contenga los reactivos disueltos sobre la superficie de una cámara para reactivos. El líquido es diseminado sobre la superficie de la cámara y secado bajo un aire con baja humedad.

Con el fin de asegurar la reproducibilidad de distribución, se pueden emplear diversas técnicas para introducir el reactivo dentro de la cámara. Cuando el cartucho se produce en forma de dos piezas que se adaptan entre sí, el reactivo puede ser proyectado, pintado, introducido en la cámara en forma de un líquido, liofilizado o evaporado, adsorbido, conjugado covalentemente, o por modos similares. El reactivo activo se puede combinar con diversos estabilizadores, excipientes, tampones u otros aditivos implicados con la reacción.

Para intensificar el mezclamiento, se pueden emplear diversos medios mecánicos o ultrasónicos, con el fin de agitar la muestra y los reactivos, en donde los medios de mezclamiento pueden ser internos o externos. Se pueden emplear vibradores, transductores ultrasónicos, barras magnéticas u otros medios mecánicos de mezclamiento, disruptores de la circulación, desviadores o barreras para el mezclamiento, directores de la circulación o similares. La manera particular en la que se proporciona una agitación, si es que se proporciona, variará de una manera amplia dependiendo del grado de agitación que se necesite, del diseño del cartucho, y de factores similares.

El reactivo no necesita ser revestido o unido a la superficie del cartucho, sino que se puede proporcionar como una esponja o gel soluble o, alternativamente, en estado absorbido en una esponja, una membrana, un papel (p.ej. un papel de filtro) o un gel insoluble, que se introduce en la unidad de reacción. De esta manera, el fluido puede pasar a través de la estructura de espuma, disolviendo al reactivo de manera tal que se forme la mezcla de reacción.

El reactivo se puede proporcionar en una forma líquida dentro de microcápsulas. El reactivo líquido sería entonces liberado desde las microcápsulas aplicando una presión a las paredes de la unidad de reacción, dando como resultado una rotura de las microcápsulas y una liberación del reactivo líquido.

Para llevar a cabo el método del presente invento, una muestra de sangre se pone en contacto con una cantidad eficaz del reactivo antes descrito. Se mide el período de tiempo que transcurre hasta que se observe en la muestra de sangre un grado deseado o previamente determinado de coagulación. Como se ha señalado anteriormente, el método es preferiblemente automatizado en los dispositivos descritos. Alternativamente, la coagulación se puede observar visualmente, o por cualquier otra técnica, y el período de tiempo se puede registrar manualmente.

El sistema de ensayo de ACT en CoaguChek® Pro mide los períodos de tiempo de coagulación activada, tanto normales como prolongados, usando una sangre venosa o arterial recientemente extraída. Los resultados de un ensayo de ACT en CoaguChek® Pro se presentan visualmente de manera automática en unidades equivalentes a las obtenidas con un sistema de ensayo de ACT comercialmente disponible.

El preferido cartucho de ensayo se muestra en la Figura 1A. El dispositivo comprende un alojamiento configurado de manera tal que se puede introducir dentro de un instrumento destinado a la determinación de resultados de ensayos. Por ejemplo, se proporciona una muesca 11 en el alojamiento 10 para permitir la retención del dispositivo (p.ej. un pestillo activado por un resorte) en el instrumento en el que se habrá de llevar a cabo el análisis. El alojamiento estará construido de manera tal que se asegure una suficiente estabilidad mecánica para resistir una manipulación mecánica y proporcionar las necesarias características para la circulación del medio de ensayo y la detección de la señal detectable. Una lumbrera de entrada 20 se proporciona para el acceso de una muestra de sangre al capilar interno del dispositivo. Un primer pasaje capilar 30 transporta sangre hasta la cámara 40 para reactivos, que contiene el reactivo 45. En la realización mostrada, el alojamiento 10 es provisto con superficies despejadas en la situación del capilar 30 con el fin de que esta sección de la trayectoria capilar se pueda utilizar para medir el movimiento (y la cesión de movimiento) de la sangre, usando un detector del modelo de manchitas. La muestra de sangre, ahora mezclada con el reactivo 45, sale de la cámara 40 y entra en la unidad 50 de circulación capilar, que conecta a la cámara 40 con la abertura de salida 60. La unidad 50 de circulación capilar es una trayectoria capilar convoluta larga, que proporciona una suficiente longitud de la trayectoria para que la circulación sea mantenida durante un período de tiempo suficiente para medir el período de tiempo de coagulación activada (ACT).

En la Figura 1B se muestra una vista en sección transversal de la forma de realización mostrada en la Figura 1A. Esta vista en sección transversal está tomada a lo largo de las líneas B-B de la Figura 1A. La construcción del alojamiento 10 a base de dos placas, 12 y 14, es evidente en esta vista en sección transversal. La placa 12 es esencialmente una placa plana que ha sido soldada sobre la placa 14, que contiene en su superficie superior unas acanaladuras y otras depresiones que formarán las cámaras y los capilares interiores del dispositivo. Las dos piezas de material plástico, 12 y 14, han sido soldadas conjuntamente después de haber sido alineadas apropiadamente (p.ej. puestas en coincidencia). El término "poner en coincidencia" se usa aquí en el sentido de referirse a una alineación apropiada de las depresiones presentes en las superficies de las dos piezas, que se usan para formar las cámaras y los capilares interiores. Una apropiada coincidencia puede ser ayudada mediante un moldeo por inyección de las dos piezas que se usan para proporcionar en una pieza salientes, que se acoplan dentro de agujeros o depresiones (distintos de las depresiones que forman capilares o cámaras) en la segunda pieza.

Una única depresión convoluta, usada para formar canales y cámaras capilares, está presente en la superficie de la placa 12. La vista en sección transversal, mostrada en la Figura 1, corta a través de la depresión en seis lugares separados, algunos de los cuales (51, 52, 53, 54 y 55) son parte de la unidad 50 de circulación capilar, mientras que el sitio restante dará como resultado la formación del capilar de iniciación 30 y de la cámara de reacción 40 de mayor tamaño, cuando las placas 12 y 14 son soldadas conjuntamente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan a manera de ilustración y explicación, y como tales no han de ser considerados como que limitan el alcance del presente invento.

Ejemplo 1 Investigación de la sensibilidad de la medición del ACT en un CoaguChek® Pro sobre la concentración de heparina

El Ejemplo 1 se llevó a cabo de acuerdo con la realización sumamente preferida del presente invento. En particular, la Tabla 2 enumera en lista los niveles de los diversos componentes en el reactivo para ACT en CoaguChek® Pro, aplicado a cartuchos de ensayo, tales como los que antes se han descrito. Los cartuchos se produjeron para usarse con los monitores de CoaguChek® Pro antes descritos.

TABLA 2

3

Estudios de precisión, realizados con estos cartuchos en monitores CoaguChek® tanto Pro como Plus, se muestran en la Tabla 3. Se usaron en estos ensayos testigos de sangre, así como partes alícuotas de sangre heparinizada. Los resultados de los ensayos, presentados visualmente por ambos conjuntos de monitores, fueron los tiempos reales detectados para la formación de los coágulos.

TABLA 3

4

Ejemplo 2 Efecto de la temperatura de la muestra sobre el ensayo de ACT en CoaguChek® Pro

Se realizó una evaluación de los efectos de la temperatura de la muestra sobre el ensayo de ACT en CoaguChek® Pro y los resultados se mostraron en la Figura 4. Aunque la especificación se ajusta a 12º hasta 32ºC, la evaluación demostró que no había ningún efecto sobre el rendimiento de los cartuchos CoaguChek® Pro para ACT en un intervalo de temperaturas desde 2º a 37ºC.

Ejemplo 3 Efecto de la aprotinina sobre el ensayo CoaguChek® Pro ACT

Otro estudio evaluó el efecto de la aprotinina sobre el ensayo de ACT en CoaguChek® Pro. Mientras que la aprotinina constituye una preocupación mayor para situaciones que requieren el ensayo de ACT en un intervalo completo (hasta de 6 U/ml), la potencia conocida de la aprotinina en el ensayo convencional de ACT en celite requiere que un ensayo de ACT se evalúe en cuanto a los efectos de la aprotinina. La Tabla 4 contiene los resultados de la evaluación --
los niveles de aprotinina usados en los relevantes procesos quirúrgicos están por debajo de 200 KUI/ml (= kilo - unidades internacionales por mililitro) y este estudio usó un nivel de 500 KUI/ml que está significativamente más allá del nivel esperado en una situación quirúrgica.

TABLA 4

5

Ejemplo 4 Efecto del hematocrito sobre un ensayo de ACT en CoaguChek® Pro

La Tabla 5 muestra los resultados de estudios realizados para determinar si unas variaciones del hematocrito afectarán al ensayo de ACT en CoaguChek® Pro. Las muestras con hematocritos bajos y altos ajustados dieron unos resultados de los ensayos situados dentro de las especificaciones establecidas con las muestras de hematocritos sin ajustar (normales). Por lo tanto, no se ha encontrado que los niveles de hematocrito influyan sobre los resultados de ACT en CoaguChek® Pro.

TABLA 5

6

TABLA 5

7

Ejemplo 5 Ensayo de la sensibilidad de un sistema de ensayo a mayores niveles de dosificacion

Se siguió el protocolo del Ejemplo 1, excepto que se ensayaron muestras que contenían hasta 6 y más U/ml de heparina. Se descubrió con sorpresa que, además de su utilidad para determinar la eficacia de una dosificación de heparina desde baja a moderada, el presente invento se puede usar también para determinar la efectividad de una dosificación de heparina HR hasta de aproximadamente 6 U/ml.

Ejemplo 6 Ensayo de composiciones alternativas de co-factores

Se siguió el protocolo del Ejemplo 1, excepto que se usó un fosfátido en vez de un sulfátido, o se usó mezclado con un sulfátido. El peso combinado del sulfátido y del fosfátido se mantuvo en el mismo nivel que si el sulfátido estuviese presente a solas (es decir, un peso igual del sulfátido se restó de la cantidad del fosfátido añadido). Se utilizaron relaciones variables en peso del fosfátido al sulfátido en unas composiciones de reactivos con TF. Con unos niveles de heparina desde moderados hasta altos, de desde aproximadamente 2 U/ml hasta de aproximadamente 6 U/ml, se encontró que unas composiciones que contenían un fosfátido en vez de un sulfátido, o una combinación de un sulfátido y un fosfátido, tienen una efectividad y una sensibilidad aproximadamente iguales. Para una dosificación de heparina en el intervalo bajo de aproximadamente 0 a aproximadamente 2 U/ml, se prefiere usar o bien un sulfátido a solas o una combinación de un fosfátido y un sulfátido en una relación en peso entre aproximadamente 1/3 y aproximadamente 3/1.

Aunque se han descrito realizaciones preferidas y ejemplares del presente invento, el presente invento se puede practicar de una manera distinta a como se ha descrito específicamente en el presente contexto y todavía pueden entrar dentro del alcance del presente invento como se expone en las siguientes reivindicaciones.

Claims (61)

1. Un método para la determinación del período de tiempo de coagulación de una muestra de sangre, que comprende poner en contacto una muestra de sangre con una cantidad efectiva de un factor tisular y de un sulfátido, y medir el período de tiempo que transcurre hasta que se observe un grado predeterminado de coagulación.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra de sangre procede de un paciente que está recibiendo un tratamiento con heparina, y el período de tiempo de coagulación se usa para determinar la efectividad de dicho tratamiento.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el paciente ha recibido unas dosis de heparina desde bajas hasta moderadas.

4. El método de la reivindicación 2, en el que el paciente ha recibido unas dosis de heparina desde moderadas hasta altas.

5. El método de la reivindicación 2, en el que la heparina está presente en la muestra de sangre en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0 y aproximadamente 3 U/ml.

6. El método de la reivindicación 2, en el que la heparina está presente en la muestra de sangre en una cantidad comprendida entre aproximadamente 3 U/ml y aproximadamente 6 U/ml.

7. El método de la reivindicación 1, en el que dicho factor tisular es un factor tisular humano recombinante.

8. El método de la reivindicación 1, en el que dicho sulfátido es un sulfátido de cerebro de bovino.

9. El método de la reivindicación 1, en el que dicho factor tisular está presente en una cantidad suficiente en un reactivo, de manera tal que cuando una cantidad efectiva de dicho reactivo es puesta en contacto con una muestra de sangre para coagular a la muestra, dicha muestra comprende entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1.000 ng/ml de un factor tisular.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicha muestra, después de un contacto con dicho reactivo, comprende aproximadamente 100 ng/ml de un factor tisular.

11. El método de la reivindicación 1, en el que dicho sulfátido está presente en una cantidad suficiente en un reactivo, de manera tal que cuando se añade una cantidad efectiva de dicho reactivo a una muestra de sangre para coagular a la muestra, dicha muestra comprende entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4 mg/ml de un sulfátido.

12. El método de la reivindicación 11, en el que dicha muestra, después de un contacto con dicho reactivo, comprende aproximadamente 3 mg/ml de un sulfátido.

13. El método de la reivindicación 1, en el que dicho factor tisular y dicho sulfátido se combinan en un reactivo antes de ponerlo en contacto con la muestra.

14. El método de la reivindicación 13, en el que dicho reactivo comprende además un tampón y un estabilizador.

15. Un reactivo para la determinación del período de tiempo de coagulación de una muestra de sangre, que comprende un factor tisular y un sulfátido.

16. El reactivo de la reivindicación 15, en el que dicho reactivo es anhidro.

17. El reactivo de la reivindicación 15, en el que dicho factor tisular está presente en una cantidad suficiente en dicho reactivo, de manera tal que cuando se añade una cantidad efectiva de dicho reactivo a una muestra de sangre para coagular a la muestra, la muestra comprende entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1.000 ng/ml de un factor tisular.

18. El reactivo de la reivindicación 17, en el que una muestra, después de un contacto con una cantidad eficaz de dicho reactivo, comprende aproximadamente 100 ng/ml de un factor tisular.

19. El reactivo de la reivindicación 15, en el que dicho sulfátido está presente en una cantidad suficiente en dicho reactivo, de manera tal que cuando se añade una cantidad efectiva de dicho reactivo a una muestra de sangre para coagular a la muestra, la muestra comprende entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4 mg/ml de un sulfátido.

20. El reactivo de la reivindicación 19, en el que la muestra, después de un contacto con una cantidad efectiva de dicho reactivo, comprende aproximadamente 3 mg/ml de sulfátido.

21. El reactivo de la reivindicación 15, en el que dicho reactivo comprende además un tampón y un estabilizador.

22. Un cartucho de ensayo para la determinación del período de tiempo de coagulación de una muestra de sangre, que comprende:

un alojamiento que contiene una lumbrera de entrada, una unidad de cámara, y una lumbrera de salida, estando presentes dicha lumbrera de entrada, dicha unidad de cámara y dicha lumbrera de salida en una trayectoria capilar continua; y un reactivo en dicha trayectoria capilar, que comprende un factor tisular y un sulfátido.

23. El cartucho de ensayo de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho factor tisular es un factor tisular humano recombinante y dicho sulfátido es un sulfátido de cerebro de bovino.

24. El cartucho de ensayo de la reivindicación 22, en el que dicho factor tisular está presente en una cantidad suficiente en dicho reactivo, de manera tal que cuando una cantidad efectiva de dicho reactivo se pone en contacto con una muestra de sangre para coagular a la muestra, dicha muestra comprende entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1.000 ng/ml de un factor tisular.

25. El cartucho de ensayo de la reivindicación 24, en el que una muestra, después de un contacto con una cantidad efectiva de dicho reactivo, comprende aproximadamente 100 ng/ml de un factor tisular.

26. El cartucho de ensayo de la reivindicación 22, en el que dicho sulfátido está presente en una cantidad suficiente en dicho reactivo, de manera tal que cuando una cantidad efectiva de dicho reactivo se pone en contacto con una muestra de sangre para coagular a la muestra, dicha muestra comprende entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4 mg/ml de un sulfátido.

27. El cartucho de ensayo de la reivindicación 26, en el que dicha muestra, después de un contacto con una cantidad efectiva de dicho reactivo, comprende aproximadamente 3 mg/ml de un sulfátido.

28. El cartucho de ensayo de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho reactivo comprende además un tampón y un estabilizador.

29. Un cartucho de ensayo para la determinación del período de tiempo de coagulación de una muestra de sangre, que comprende:

un alojamiento que contiene una lumbrera de entrada, una unidad de cámara, una lumbrera de salida, una primera unidad capilar para bombear independientemente un líquido desde dicha lumbrera de entrada hasta dicha unidad de cámara, y una segunda unidad capilar colocada entre, y conectada operativamente con, dicha unidad de cámara y dicha lumbrera de salida para bombear independientemente un líquido desde dicha unidad de cámara hasta dicha unidad de salida; en que dicha lumbrera de entrada, dicha primera unidad capilar, dicha unidad de cámara, dicha segunda unidad capilar y dicha lumbrera de salida están presentes en una trayectoria capilar continua; y

un reactivo en dicha trayectoria capilar, que comprende un factor tisular y un sulfátido.

30. Un método para la determinación de la efectividad de un tratamiento con heparina en un paciente que lo recibe, que comprende poner en contacto una muestra de sangre procedente de un paciente que está recibiendo un tratamiento con heparina con una cantidad efectiva de un factor tisular y de por lo menos un co-factor seleccionado entre el conjunto que consta de un sulfátido y un fosfátido, y medir el período de tiempo que transcurre hasta que se observa un grado predeterminado de coagulación.

31. El método de la reivindicación 30, en el que el paciente ha recibido unas dosis de heparina desde bajas hasta moderadas.

32. El método de la reivindicación 30, en el que el paciente ha recibido unas dosis de heparina desde moderadas hasta altas.

33. El método de la reivindicación 30, en el que la heparina está presente en la muestra de sangre en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0 y aproximadamente 3 U/ml.

34. El método de la reivindicación 30, en el que la heparina está presente en la muestra de sangre en una cantidad comprendida entre aproximadamente 3 U/ml y aproximadamente 6 U/ml.

35. El método de la reivindicación 30, en el que dicho factor tisular es un factor tisular humano recombinante.

36. El método de la reivindicación 30, en el que dicho fosfátido es fosfatidil-colina.

37. El método de la reivindicación 30, en el que dicho factor tisular está presente en una cantidad suficiente en dicho reactivo, de manera tal que cuando se añade una cantidad efectiva de dicho reactivo a una muestra de sangre para coagular a la muestra, dicha muestra comprende entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1.000 ng/ml de un factor tisular.

38. El método de la reivindicación 37, en el que dicha muestra, después de un contacto con una cantidad efectiva de dicho reactivo, comprende aproximadamente 100 ng/ml de un factor tisular.

39. El método de la reivindicación 30, en el que por lo menos un compuesto seleccionado entre dicho fosfátido y dicho sulfátido está presente en una cantidad suficiente en dicho reactivo, de manera tal que cuando se añade una cantidad efectiva de dicho reactivo a una muestra de sangre para coagular a la muestra, la muestra comprende una cantidad total combinada de dicho fosfátido y de dicho sulfátido comprendida entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4 mg/ml.

40. El método de la reivindicación 39, en el que dicha muestra de sangre, después de un contacto con una cantidad efectiva de dicho reactivo comprende una cantidad total combinada de dicho fosfátido y de dicho sulfátido de aproximadamente 3 mg/ml.

41. El método de la reivindicación 39, en el que dicho factor tisular y dicho por lo menos un co-factor seleccionado entre el conjunto que consta de un fosfátido y un sulfátido, se combinan en un reactivo antes de poner en contacto la muestra.

42. El método de la reivindicación 41, en el que dicho reactivo comprende además un tampón y un estabilizador.

43. Un reactivo para la determinación de la efectividad y de un tratamiento con heparina en un paciente que lo recibe, que comprende un factor tisular y por lo menos un co-factor seleccionado entre el conjunto que consta de un fosfátido y un sulfátido.

44. El reactivo de la reivindicación 43, en el que dicho reactivo es anhidro.

45. El reactivo de la reivindicación 43, en el que dicho factor tisular está presente en una cantidad suficiente en dicho reactivo, de manera tal que cuando una cantidad efectiva de dicho reactivo es añadida a una muestra de sangre para coagular a la muestra, dicha muestra comprende entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1.000 ng/ml de un factor tisular.

46. El reactivo de la reivindicación 45, en el que dicha muestra, después de un contacto con una cantidad efectiva de dicho reactivo, comprende aproximadamente 100 ng/ml de un factor tisular.

47. El reactivo de la reivindicación 43, en el que dicho por lo menos un co-factor seleccionado entre el conjunto que consta de un fosfátido y un sulfátido está presente en una cantidad suficiente en dicho reactivo, de manera tal que cuando una cantidad efectiva de dicho reactivo se añade a una muestra de sangre para coagular a la muestra, dicha muestra comprende un total combinado de dicho fosfátido y de dicho sulfátido combinados que está comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4 mg/ml.

48. El reactivo de la reivindicación 47, en el que dicha muestra, después de un contacto con una cantidad efectiva de dicho reactivo comprende un total combinado de dicho fosfátido y dicho sulfátido de aproximadamente 3 mg/ml.

49. El reactivo de la reivindicación 43, en el que dicho reactivo comprende además un tampón y un estabilizador.

50. Un cartucho de ensayo para la determinación de la efectividad de un tratamiento con heparina en un paciente que lo recibe, que comprende:

un alojamiento que contiene una lumbrera de entrada, una unidad de cámara y

una lumbrera de salida, estando presentes dicha lumbrera de entrada, dicha unidad de cámara y dicha lumbrera de salida en una trayectoria capilar continua; y un reactivo en dicha trayectoria capilar que comprende un factor tisular y por lo menos un co-factor seleccionado entre el conjunto que consta de un fosfátido y un sulfátido.

51. El cartucho de ensayo de acuerdo con la reivindicación 50, en el que dicho factor tisular es un factor tisular humano recombinante, dicho sulfátido es un sulfátido de cerebro de bovino y dicho fosfátido es fosfatidil-colina.

52. El cartucho de ensayo de la reivindicación 50, en el que dicho factor tisular está presente en una cantidad suficiente en dicho reactivo, de manera tal que cuando un a cantidad efectiva de dicho reactivo se pone en con tacto con una muestra de sangre para coagular a la muestra, dicha muestra comprende entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1.000 ng/ml de un factor tisular.

53. El cartucho de ensayo de la reivindicación 52, en el que dicha muestra, después de un contacto con una cantidad efectiva de dicho reactivo, comprende aproximadamente 100 ng/ml de un factor tisular.

54. El cartucho de ensayo de la reivindicación 50, en el que por lo menos un co-factor tomado entre dicho conjunto que consta de un fosfátido y un sulfátido está presente en una cantidad suficiente en dicho reactivo, de manera tal que cuando una cantidad efectiva de dicho reactivo se pone en contacto con una muestra de sangre para coagular a la muestra, dicha muestra comprende un total combinado de dicho fosfátido y dicho sulfátido comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4 mg/ml.

55. El cartucho de ensayo de la reivindicación 54, en el que dicha muestra, después de un contacto con una cantidad efectiva de dicho reactivo, comprende un total combinado de dicho fosfátido y dicho sulfátido de aproximadamente 3 mg/ml.

56. El cartucho de ensayo de acuerdo con la reivindicación 64, en el que dicho reactivo comprende además un tampón y un estabilizador.

57. Un reactivo destinado a usarse en la determinación de la efectividad de un tratamiento con heparina en pacientes que lo reciben, que comprende un sulfátido y un fosfátido, en el que la relación en peso de dicho fosfátido a dicho sulfátido es desde aproximadamente 1/3 hasta aproximadamente 3/1, y que comprende además un factor tisular.

58. Un reactivo destinado a usarse en la determinación de la efectividad de un tratamiento con heparina en pacientes que reciben una cantidad suficiente de heparina para tener unos niveles de heparina en sangre comprendidos entre aproximadamente 0 U/ml y aproximadamente 6 U/ml, que comprende un sulfátido y un fosfátido, en el que la relación en peso de dicho fosfátido a dicho sulfátido es de aproximadamente 1/3 a aproximadamente 3/1, y que comprende además un factor tisular.

59. Un cartucho de ensayo para la determinación de la efectividad de un tratamiento con heparina en pacientes que lo reciben, que comprende:

un alojamiento que comprende una lumbrera de entrada, una unidad de cámara, una lumbrera de salida, una primera unidad capilar para bombear independientemente un líquido desde dicha unidad de cámara a dicha lumbrera de salida; y una segunda unidad capilar colocada entre, y conectada operativamente con, dicha unidad de cámara y dicha lumbrera de salida para bombear de manera independiente un líquido desde dicha unidad de cámara a dicha lumbrera de salida, en el que dicha lumbrera de entrada, dicha primera unidad capilar, dicha unidad de cámara, dicha segunda unidad capilar y dicha lumbrera de salida están presentes en una trayectoria capilar continua; y

un reactivo en dicha trayectoria capilar, que comprende un factor tisular y un fosfátido.

60. Un reactivo destinado a usarse en la determinación de la efectividad de un tratamiento con heparina en pacientes que reciben una cantidad suficiente de heparina para tener un nivel de heparina en sangre comprendido entre aproximadamente 0 U/ml y aproximadamente 6 U/ml, que comprende un factor tisular y un co-factor, en el que, cuando una cantidad efectiva de dicho reactivo se pone en contacto con una muestra de sangre procedente de un paciente que tiene un nivel de heparina en sangre comprendido entre aproximadamente 0 U/ml y aproximadamente 6 U/ml, se alcanza un grado predeterminado de coagulación en menos de aproximadamente 300 segundos.

61. El reactivo de la reivindicación 60, en el que dicho co-factor comprende por lo menos un compuesto del conjunto que consta de un sulfátido y un fosfátido.