ES2228098T3 - Deteccion y determinacion de las etapas de la enfermedad de la arteria coronaria. - Google Patents
Deteccion y determinacion de las etapas de la enfermedad de la arteria coronaria.Info
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Abstract
Un método que tiene un grado clínicamente suficiente de precisión diagnóstica para detectar la presencia y para distinguir entre las etapas no agudas y agudas de la enfermedad de la arteria coronaria en un paciente humano de la población general, siendo las etapas no agudas de la enfermedad de la arteria coronaria la enfermedad de la arteria coronaria asintomática y la angina estable, y siendo las etapas agudas de la enfermedad de la arteria coronaria la angina inestable y el infarto agudo de miocardio, comprendiendo el método realizar la etapa (b) y realizar al menos una de las etapas (a) y (c): (a) ensayar una muestra del paciente para detectar la presencia clínicamente significativa de un primer marcador, cuya presencia por encima de un nivel predeterminado indica, con un grado muy alto de precisión diagnóstica, la presencia de la enfermedad de la arteria coronaria, comprendiendo el primer marcador OxLDL que contiene al menos restos lisina sustituidos por resto de apo B100; (b) ensayar una muestra de un paciente para detectar la presencia clínicamente significativa de un segundo marcador, cuya presencia por encima de un nivel predeterminado indica, con un grado muy alto de precisión diagnóstica, la presencia de una etapa aguda de la enfermedad de la arteria coronaria, comprendiendo el segundo marcador LDL modificada con MDA que contiene al menos 60 restos lisina sustituidos por resto de apo B100; y (c) ensayar una muestra de un paciente para detectar la presencia clínicamente significativa de un tercer marcador, cuya presencia por encima de un nivel predeterminado indica, con un grado alto de precisión diagnóstica, la presencia de un infarto agudo de miocardio, comprendiendo el tercer marcador una proteína cardíaca; (d) siendo el diagnóstico, basado en los resultados de la etapa (b) y al menos una de las etapas (a) y (c): (ü) una enfermedad de la arteria coronaria no aguda si el primer marcador, pero no el segundo ni el tercer marcador, está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado; (üi) una angina inestable si cada uno del primer y segundo marcador, pero no el tercer marcador, está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado; (iv) un infarto agudo de miocardio de origen aterosclerótico si cada uno del primer, segundo y tercer marcador está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado; y (v) un infarto agudo de miocardio de origen no aterosclerótico si ninguno del primer y segundo marcador, pero sí el tercer marcador, está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado.
Description
Detección y determinación de las etapas de la
enfermedad de la arteria coronaria.
La presente invención se refiere al campo de la
enfermedad de la arteria coronaria. Más en concreto, se refiere a
detectar, con un grado clínicamente suficiente de precisión
diagnóstica, si un paciente humano de la población general tiene la
enfermedad de la arteria coronaria ("coronary artery disease",
"CAD") y, si es así, determinar, con una grado clínicamente
suficiente de precisión diagnóstica, cuál es la etapa de la CAD que
tiene el paciente.
Steinberg D., "Lewis A. Conner Memorial
Lecture, Oxidative Modification Of LDL And Atherogenesis",
Circulation, 1997, 95:1062-1071, indica que
las muertes como consecuencia de la enfermedad cardíaca coronaria
continúan siendo más numerosas que cualquier otra causa individual
de muerte en Estados Unidos. Kolata, "A New Generation Of Tests
To Determine Heart Trouble", New York Times News Service
(26 de noviembre, 1995), indica que la mitad de los 600.000
estadounidenses que cada año tienen ataques al corazón no presentan
síntomas antes, y que hasta 30% de los pacientes con enfermedad
cardíaca no presentan factores de riesgo obvios, como presión
sanguínea alta, altos niveles de colesterol, diabetes o historia
familiar de enfermedad cardíaca.
La capacidad para determinar de forma precisa si
un paciente tiene la enfermedad de la arteria coronaria y, si es
así, en qué etapa se encuentra el paciente ha sido un objetivo que
existe desde hace tiempo (y que hasta ahora no se ha logrado) de la
ciencia médica. Se han realizado muchos intentos para proporcionar
anticuerpos monoclonales que reconozcan, en seres humanos y otros
animales, diversas sustancias de lipoproteínas de baja densidad
("LDL") y/u otras sustancias que pueden estar asociadas con la
aterosclerosis y/o trombosis. También se han intentado proporcionar
métodos para determinar posibles marcadores para la aterosclerosis
y la lesión coronaria. Véanse, por ejemplo, las patentes de EEUU nº
5.024.829, 5.026.537, 5.120.834, 5.196.324, 5.223.410, 5.362.649,
5.380.667, 5.396.886, 5.453.359, 5.487.892, 5.597.726, 5.658.729,
5.690.103 y 5.756.067; la solicitud publicada EPO 0484863 A1; la
solicitud no publicada PCT/EP97/03287; la solicitud no publicada
PCT/EP97/03493; la solicitud publicada PCT WO 94/23302; Adams et
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Adams et al., "Cardiac Troponin I. A
Marker With High Specificity For Cardiac Injury",
Circulation, 1993, 88(1):101-106,
indican que la troponina I cardíaca es muy específica para las
lesiones miocárdicas, y que su uso debería facilitar distinguir si
las elevaciones en MBCK son debidas a lesiones del músculo
miocárdico o esquelético.
Holvoet et al., "Oxidized Low Density
Lipoproteins In Patients With Transplant-Associated
Coronary Artery Disease", Arterioscler. Thromb. Vasc.
Biol., enero 1998, 18(1):100-107, indican
que se utilizó un ELISA con el anticuerpo monoclonal
mAb-4E6 para cuantificar los niveles de OxLDL en el
plasma de pacientes control, pacientes transplantados (transplantes
de corazón) por cardiomiopatía dilatada, y pacientes transplantados
(transplantes de corazón) por enfermedad de la arteria
coronaria.
La solicitud publicada PCT WO 94/23302 se refiere
a la inmunodetección (por ejemplo, ELISA) de lipoproteína de baja
densidad modificada oxidativamente, anticuerpos contra ella
(preferiblemente anticuerpos monoclonales) o un complejo
inmunológico de éstos, en un fluido biológico, e indica que los
anticuerpos monoclonales son útiles para detectar una lipoproteína
de baja densidad modificada oxidativamente en plasma humano.
Holvoet et al.,
"Malondialdehyde-Modified Low Density Lipoproteins
In Patients With Atherosclerotic Disease", J. Clin.
Invest., 1995, 95:2611-2619, analizan el
anticuerpo monoclonal mAb-1H11, que se produjo
contra la LDL modificada con MDA, y que se utilizó para detectar
material de reacción cruzada en tejido ateromatoso y en plasma
humanos.
Sin embargo, como se indica en la bibliografía,
en la actualidad no existe ningún método disponible para
determinar, con un grado clínicamente suficiente de precisión
diagnóstica, la presencia de la enfermedad de la arteria coronaria
en un paciente, y si la enfermedad está presente, para distinguir,
con un grando clínicamente suficiente de precisión diagnóstica,
entre las etapas no agudas (es decir, crónicas) y las etapas agudas
de esta enfermedad, siendo las etapas no agudas la angina estable y
probablemente la enfermedad de la arteria coronaria asintomática, y
siendo las etapas agudas la angina inestable y el infarto agudo de
miocardio.
Por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.380.667
(otorgada el 10 de enero, 1995) indica que la mayoría de los
individuos con enfermedad cardíaca son, en gran medida,
asintomáticos hasta su primer ataque al corazón, que los
principales factores de riesgo identificados hasta la fecha en la
técnica anterior no son pronósticos perfectos (en particular para
predecir el riesgo de enfermedad de la arteria coronaria en
cualquier individuo concreto), y que 30-40% de la
población sigue estando mal diagnosticada utilizando los
principales factores de riesgo conocidos (columna 1, líneas
31-39).
Hlatky M.A., "Evaluation Of Chest Pain In The
Emergency Department", N. Eng. J. Med., diciembre 1997,
337(23):1687-1689, indican que después de
identificar a los pacientes en el departamento de urgencias que
tienen un infarto agudo de miocardio claro, es más difícil
identificar al resto de los pacientes; que los síntomas que
sugieren una isquemia del miocardio en reposo que duran más de 15
minutos indican un riesgo a corto plazo relativamente alto,
probablemente debido a su asociación con la placa coronaria rota;
que otros ensayos utilizados en pacientes incluyen los que
identifican un defecto en la perfusión miocárdica, anomalías en el
movimiento de la pared ventricular izquierda, o evidencias sutiles
de necrosis miocárdica mediante ensayos sensibles de proteínas
intracelulares (por ejemplo, la isoenzima CK-MB,
mioglobina, troponina T y troponins I); que incluso un marcador muy
sensible de la necrosis miocárdica no es necesariamente positivo en
todos los pacientes con isquemia miocárdica aguda; y que los
pacientes que se presentan por primer vez con dolor de pecho
normalmente necesitan más ensayos para establecer la probabilidad de
una enfermedad coronaria subyacente y para guiar la terapia
apropiada.
La patente de EEUU nº 5.756.067 (otorgada el 26
de mayo, 1998) indica que los ensayos disponibles en la actualidad
para medir el riesgo de desarrollar aterosclerosis incluyen medir
el contenido plasmático en colesterol, triglicéridos y
lipoproteínas, pero que resulta evidente que estos ensayos no son
concluyentes, porque aproximadamente la mitad de la enfermedad
cardíaca debida a la aterosclerosis se produce en pacientes con
triglicéridos y colesterol plasmáticos dentro de los intervalos
normales de la población, y porque se han encontrado pruebas
angiográficas de aterosclerosis en pacientes con niveles normales
de lípidos.
Sasavage N., "Predicting Coronary Artery
Disease, New Markers Could Identify Patients At Risk", Clin.
Lab. News, marzo 1998, pp. 6-7, sugiere que la
oxidación de lipoproteínas de baja densidad puede hacer que sean más
aterogénicas, que la detección de especies de LDL oxidadas se
encuentra con algunas dificultades técnicas, e indica que la
enfermedad de la arteria coronaria parece ser una enfermedad de
múltiples factores. También indica que los que trabajan en este área
están de acuerdo en que el desarrollo de una nueva generación de
marcadores bioquímicos permitirá a los médicos evaluar mejor el
riesgo del paciente e intervenir con tratamientos para evitar las
consecuencias adversas.
Por tanto, existe una necesidad significativa
para contar con un método que pueda detectar, con un grado
clínicamente suficiente de precisión diagnóstica, la enfermedad de
la arteria coronaria y para distinguir entre sus etapas.
Ahora se ha desarrollado una invención que
satisface estas necesidades, y que tiene ventajas y beneficios que
serán evidentes para un experto en la técnica. En general, esta
invención proporciona un método que tiene un grado clínicamente
suficiente de precisión diagnóstica para detectar la presencia y
para distinguir entre las etapas no agudas y agudas de la enfermedad
de la arteria coronaria en un paciente humano de la población
general, siendo las etapas no agudas de la enfermedad de la arteria
coronaria la enfermedad de la arteria coronaria asintomática y la
angina estable, y siendo las etapas agudas de la enfermedad de la
arteria coronaria la angina inestable y el infarto agudo de
miocardio, comprendiendo el método realizar la etapa (b) y realizar
al menos una de las etapas (a) y (c):
(a) ensayar una muestra del paciente para
detectar la presencia clínicamente significativa de un primer
marcador, cuya presencia por encima de un nivel predeterminado
indica, con un grado muy alto de precisión diagnóstica, la
presencia de la enfermedad de la arteria coronaria, comprendiendo el
primer marcador OxLDL que contiene al menos 60 restos lisina
sustituidos por resto de apo B-100;
(b) ensayar una muestra de un paciente para
detectar la presencia clínicamente significativa de un segundo
marcador, cuya presencia por encima de un nivel predeterminado
indica, con un grado muy alto de precisión diagnóstica, la
presencia de una etapa aguda de la enfermedad de la arteria
coronaria, comprendiendo el segundo marcador LDL modificada con MDA
que contiene al menos 60 restos lisina sustituidos por resto de apo
B-100; y
(c) ensayar una muestra de un paciente para
detectar la presencia clínicamente significativa de un tercer
marcador, cuya presencia por encima de un nivel predeterminado
indica, con un grado alto de precisión diagnóstica, la presencia de
un infarto agudo de miocardio, comprendiendo el tercer marcador una
proteína cardíaca;
(d) siendo el diagnóstico, basado en los
resultados de la etapa (b) y al menos una de las etapas (a) y
(c):
- (i)
- la ausencia de la enfermedad de la arteria coronaria si ninguno del primer, segundo y tercer marcador está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado;
- (ii)
- una enfermedad de la arteria coronaria no aguda si el primer marcador, pero no el segundo ni el tercer marcador, está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado;
- (iii)
- una angina inestable si cada uno del primer y segundo marcador, pero no el tercer marcador, está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado;
- (iv)
- un infarto agudo de miocardio de origen aterosclerótico si cada uno del primer, segundo y tercer marcador está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado; y
- (v)
- un infarto agudo de miocardio de origen no aterosclerótico si ninguno del primer y segundo marcador, pero sí el tercer marcador, está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado.
En algunas realizaciones de la invención, se
utilizan las etapas (a) y (b), pero no (c), en otras realizaciones
se utilizan la etapas (b) y (c), pero no (a), y en otras
realizaciones se utilizan las tres etapas (a), (b) y (c).
En algunas realizaciones, el primer marcador es
una primera proteína aterogénica que comprende preferiblemente
OxLDL que contiene al menos 60 restos lisina sustituidos por resto
de apo B-100. En algunas realizaciones, el segundo
marcador es una segunda proteína aterogénica que comprende
preferiblemente LDL modificada con MDA que contiene al menos 60
restos lisina sustituidos por resto de apo B-100.
En algunas realizaciones, el tercer marcador es una proteína
cardíaca, y preferiblemente es troponina (por ejemplo, troponina I)
o CK-MB.
De forma deseable, cada una de las etapas (a) y
(b) utiliza un ensayo inmunológico, que preferiblemente es un
ensayo "sandwich", aunque puede utilizarse un ensayo
competitivo. Preferiblemente, cada ensayo inmunológico utiliza uno
o más anticuerpos monoclonales que tienen una alta afinidad por sus
respectivos marcadores, por ejemplo, una afinidad de al menos
aproximadamente 1 x 10^{10} M^{-1} ("M" indica molaridad o
gmoles/litro; "M^{-1}" indica la recíproca de la molaridad, o
litros por mol). Los anticuerpos monoclonales utilizados pueden
seleccionarse del grupo que consiste en mAb-4E6,
mAb-1H11 y mAb-8A2.
Si el marcador de la etapa (a) es OxLDL que
contiene al menos 60 restos lisina sustituidos por resto de apo
B-100, preferiblemente el ensayo utilizado en la
etapa (a) es capaz de detectar esa sustancia en plasma humano sin
diluir a una concentración de 0,02 miligramos/decilitro (0,02
mg/dl). Si el marcador de la etapa (b) es LDL modificada con MDA
que contiene al menos 60 restos lisina sustituidos por resto de apo
B-100, preferiblemente el ensayo utilizado en la
etapa (b) es capaz de detectar esa sustancia en plasma humano sin
diluir a una concentración de 0,02 miligramos/decilitro (0,02
mg/dl).
En otro aspecto, esta invención proporciona un
método que tiene un grado clínicamente suficiente de precisión
diagnóstica para detectar la presencia y distinguir entre las
etapas no agudas y las etapas agudas de la enfermedad de la arteria
coronaria en un paciente humano de la población general, siendo las
etapas no agudas de la enfermedad de la arteria coronaria la
enfermedad de la arteria coronaria asintomática o la angina
estable, y siendo las etapas agudas de la enfermedad de la arteria
coronaria la angina inestable y el infarto agudo de miocardio,
comprendiendo el método las etapas de:
(a) ensayar una muestra del paciente utilizando
un ensayo inmunológico para detectar la presencia clínicamente
significativa de OxLDL que contiene al menos 60 restos lisina
sustituidos por resto de apo B-100, siendo capaz su
presencia por encima de un nivel predeterminado de indicar, con un
grado muy alto de precisión diagnóstica, la presencia de la
enfermedad de la arteria coronaria, empleando el ensayo al menos un
anticuerpo monoclonal que tiene una alta afinidad por la OxLDL;
(b) ensayar una muestra del paciente utilizando
un ensayo inmunológico para detectar la presencia clínicamente
significativa de LDL modificada con MDA que contiene al menos 60
restos lisina sustituidos por resto de apo B-100,
siendo capaz su presencia por encima de un nivel predeterminado de
indicar, con un grado muy alto de precisión diagnóstica, la
presencia de una etapa aguda de la enfermedad de la arteria
coronaria, empleando el ensayo al menos un anticuerpo monoclonal
que tiene una alta afinidad por la LDL modificada con MDA; y
(c) opcionalmente ensayar una muestra del
paciente para detectar la presencia clínicamente significativa de
un tercer marcador, cuya presencia por encima de un nivel
predeterminado puede indicar, con un grado alto de precisión
diagnóstica, la presencia de un infarto agudo de miocardio.
En otro aspecto, esta invención proporciona un
método que tiene un grado clínicamente suficiente de precisión
diagnóstica para detectar la presencia y distinguir entre las
etapas no agudas y las etapas agudas de la enfermedad de la arteria
coronaria en un paciente humano de la población general, siendo las
etapas no agudas de la enfermedad de la arteria coronaria la
enfermedad de la arteria coronaria asintomática o la angina
estable, y siendo las etapas agudas de la enfermedad de la arteria
coronaria la angina inestable y el infarto agudo de miocardio,
comprendiendo el método las etapas de:
(a) ensayar una muestra del paciente utilizando
un ensayo inmunológico para detectar la presencia clínicamente
significativa de OxLDL que contiene al menos 60 restos lisina
sustituidos por resto de apo B-100, siendo capaz su
presencia por encima de un nivel predeterminado de indicar, con un
grado muy alto de precisión diagnóstica, la presencia de la
enfermedad de la arteria coronaria, empleando el ensayo al menos un
anticuerpo monoclonal que tiene una alta afinidad por la OxLDL;
(b) ensayar una muestra del paciente utilizando
un ensayo inmunológico para detectar la presencia clínicamente
significativa de LDL modificada con MDA que contiene al menos 60
restos lisina sustituidos por resto de apo B-100,
siendo capaz su presencia por encima de un nivel predeterminado de
indicar, con un grado muy alto de precisión diagnóstica, la
presencia de una etapa aguda de la enfermedad de la arteria
coronaria, empleando el ensayo al menos un anticuerpo monoclonal
que tiene una alta afinidad por la LDL modificada con MDA; y
(c) ensayar una muestra del paciente para
detectar la presencia clínicamente significativa de una proteína
cardíaca, cuya presencia por encima de un nivel predeterminado
puede indicar, con un grado alto de precisión diagnóstica, la
presencia de un infarto agudo de miocardio.
La presencia clínicamente significativa
(presencia por encima de un nivel predeterminado) del primer
marcador (por ejemplo, OxLDL que contiene al menos 60 restos lisina
sustituidos por resto de apo B-100) puede indicar,
con un grado muy alto de precisión diagnóstica, la presencia de la
enfermedad de la arteria coronaria. En otras palabras, el ensayo o
prueba de esta invención utilizado para detectar un marcador de la
enfermedad de la arteria coronaria distinguirá, con un grado muy
alto de precisión diagnóstica, entre las siguientes categorías 1 y
2: (1) los que no presentan la enfermedad de la arteria coronaria, y
(2) los que no tienen una de las categorías o etapas de la
enfermedad de la arteria coronaria (es decir, los que tienen una
enfermedad no aguda [crónica], es decir, angina estable o
probablemente la enfermedad de la arteria coronaria asintomática, o
los que tienen síndromes coronarios agudos que se presentan
clínicamente como angina inestable o infarto agudo de miocardio),
pero en sí mismo no es capaz, en general, de distinguir entre las
categorías (o etapas) de la enfermedad de la arteria coronaria.
La presencia clínicamente significativa
(presencia por encima de un nivel predeterminado) del segundo
marcador (por ejemplo, LDL modificada con MDA que contiene al menos
60 restos lisina sustituidos por resto de apo B-100)
puede indicar, con un grado muy alto de precisión diagnóstica, la
presencia de una etapa aguda de la enfermedad de la arteria
coronaria. En otras palabras, el ensayo o prueba de esta invención
utilizado para detectar un marcador de una etapa aguda de la
enfermedad de la arteria coronaria distinguirá entre las siguientes
categorías 1 y 2: (1) los que no presentan una etapa aguda de la
enfermedad de la arteria coronaria (es decir, los que (a) no tienen
la enfermedad de la arteria coronaria o tienen una enfermedad de la
arteria coronaria no aguda, es decir, (b) la enfermedad de la
arteria coronaria asintomática o (c) la angina estable) pero en sí
mismo no es capaz, en general, de distinguir entre estas tres
categorías a, b y c, y (2) los que tienen una de las dos categorías
o etapas de la enfermedad de la arteria coronaria aguda (es decir,
los que tienen (a) angina inestable, o (b) infarto agudo de
miocardio), pero en sí mismo no es capaz, en general, de distinguir
entre las dos categorías agudas.
La presencia clínicamente significativa
(presencia por encima de un nivel predeterminado) del tercer
marcador (por ejemplo, CK-MB o una troponina) puede
indicar, con un grado alto de precisión diagnóstica, la presencia de
un infarto agudo de miocardio. En otras palabras, el ensayo o
prueba de esta invención utilizado para detectar un marcador del
infarto agudo de miocardio distinguirá entre las siguientes
categorías 1 y 2: (1) los que tienen un infarto agudo de miocardio,
y (2) los que no (es decir, los que no tienen una enfermedad de la
arteria coronaria, los que tienen una enfermedad de la arteria
coronaria no aguda, es decir, angina estable o probablemente la
enfermedad de la arteria coronaria asintomática, y los que tienen
angina inestable), pero en sí mismo no es capaz, en general, de
distinguir entre las categorías no AMI.
El uso del primer y segundo ensayo (prueba)
juntos en un paciente permite colocar al paciente, con un grado
clínicamente suficiente de precisión diagnóstica, en una de tres
categorías: (1) no tiene la enfermedad de la arteria coronaria
(primer y segundo ensayo negativos); (2) tiene la enfermedad de la
arteria coronaria de tipo no agudo, es decir, la enfermedad de la
arteria coronaria asintomática o la angina estable (primer ensayo
positivo, segundo ensayo negativo); o (3) tiene la enfermedad de la
arteria coronaria de tipo agudo, es decir, angina inestable o
infarto agudo de miocardio (ambos ensayos positivos). El primer y
segundo ensayo pueden utilizarse juntos, por ejemplo, como parte de
una selección o como parte de un examen físico rutinario. Si el
paciente se coloca en la primera categoría, no hay problema. Si el
paciente se coloca en la segunda categoría, el médico puede actuar,
por ejemplo recomendando un cambio en el estilo de vida,
prescribiendo la medicación apropiada, etc. Esto es particularmente
cierto para los pacientes con CAD asintomática, que se colocan en
la segunda categoría, y que pueden no haber tenido indicaciones
previas de la enfermedad de la arteria coronaria. Si el paciente se
coloca en la categoría de la enfermedad coronaria aguda, puede
realizarse el tercer ensayo de esta invención para determinar si el
paciente ha tenido o tiene un infarto agudo de miocardio y, si es
éste el caso, el médico puede recomendar la inmediata
hospitalización y medicación (por ejemplo, con activador del
plasminógeno tisular, "TPA").
El uso del segundo y tercer ensayo (prueba) en un
paciente, sin realizar también el primer ensayo, probablemente se
producirá con menor frecuencia que el uso del primer y segundo
ensayo sin el tercer ensayo. Sin embargo, para un paciente que
tiene síntomas agudos que sugieren un infarto agudo de miocardio
(por ejemplo, dolor de pecho), el médico puede realizar el tercer
ensayo para determinar si el paciente está teniendo, de hecho, un
infarto agudo de miocardio (en cuyo caso, el tercer ensayo, por
ejemplo, para detectar una troponina, será probablemente positivo),
y es probable que también decida realizar el segundo ensayo para
determinar si el infarto agudo de miocardio, si está presente, está
provocado con mayor probabilidad por una aterosclerosis coronaria
(el segundo ensayo, por ejemplo, para la LDL modificada con MDA,
será positivo), o si el infarto agudo de miocardio se produce
probablemente por otra causa. Para los pacientes que presentan los
síntomas clásicos del infarto agudo de miocardio, el uso del
segundo y tercer ensayo juntos es muy ventajoso, y puede que no sea
necesario realizar primero el primer ensayo o realizarlo después de
todo.
Por tanto, según esta invención, si se realizan
los tres ensayos en un paciente, el paciente puede colocarse en una
de las siguientes categorías con un grado clínicamente suficiente
de precisión diagnóstica: (1) no tiene CAD; (2) tiene CAD no aguda
(crónica), es decir asintomática o angina estable; (3) tiene la
primera forma de CAD aguda, es decir, angina inestable; y (4) tiene
la segunda forma de CAD aguda, es decir, (a) infarto agudo de
miocardio ("AMI") debido probablemente a la aterosclerosis, y
(b) AMI que es debido probablemente a una causa diferente de la
aterosclerosis. Las categorías 2, 3 y 4 pueden considerarse como
las etapas de la enfermedad de la arteria coronaria (CAD).
La presencia clínicamente significativa de un
primer marcador en una muestra de un paciente (el primer ensayo es
positivo) indica que el paciente no está en la categoría 1 (no
tiene CAD) y que está en la categoría 2 (CAD asintomática o angina
estable) o 3 (angina inestable) o 4 (AMI). En otras palabras, la
presencia clínicamente significativa del primer marcador en una
muestra de un paciente indica que el paciente tienen la enfermedad
de la arteria coronaria. Si el primer marcador no tiene una
presencia clínicamente significativa en la muestra (el primer
ensayo es negativo), el paciente se encuentra en la categoría 1, en
otras palabras, no tiene CAD. Si el ensayo para el primer marcador
es negativo y el ensayo para el segundo marcador es positivo, esto
indica un problema probable con uno o ambos ensayos, porque la
pareja de resultados de los ensayos es muy improbable, y uno o ambos
ensayos deben repetirse. Por tanto, otra característica beneficiosa
de la invención es que, si se utilizan juntos el primer y segundo
ensayo, un primer ensayo positivo confirmará un segundo ensayo
positivo, y un primer ensayo negativo arrojará una duda
significativa sobre un segundo ensayo positivo y, por tanto, indica
un probable problema en uno o ambos ensayos.
La presencia clínicamente significativa del
primer marcador en una muestra de un paciente acoplada con la
presencia clínicamente significativa del segundo marcador en una
muestra del paciente indica que el paciente no está en la categoría
1 (no tiene CAD) ni 2 (CAD asintomática o angina estable), sino que
está en la categoría 3 (angina inestable) o la categoría 4 (AMI). Si
el primer y segundo marcador no tienen una presencia clínicamente
significativa, el paciente se encuentra en la categoría 1, en otras
palabras, no tiene CAD.
La presencia clínicamente significativa del
primer marcador en una muestra de un paciente, acoplada con la
presencia clínicamente significativa del segundo marcador en una
muestra de un paciente, acoplada con la presencia clínicamente
significativa del tercer marcador en una muestra de un paciente
indica que el paciente no está en la categoría 1 (no tiene CAD) ni
2 (CAD asintomática o angina estable) ni 3 (angina inestable), sino
que está en la categoría 4 (AMI). Si el primer, segundo y tercer
marcador no tienen una presencia clínicamente significativa, el
paciente se encuentra en la categoría 1, en otras palabras, no
tiene CAD. Si el primer y segundo ensayo son negativos pero el
tercer ensayo es positivo, indica un AMI provocado por algo
diferente a la enfermedad aterosclerótica coronaria. Si el segundo
y tercer ensayo son positivos y no se realiza el primer ensayo (por
ejemplo, para un paciente que presenta los síntomas clásicos de
AMI), el paciente está en la categoría 4 y el segundo ensayo
positivo indica que las lesiones cardíacas está provocadas
probablemente por la enfermedad aterosclerótica coronaria. Si el
primer ensayo es negativo pero el segundo es positivo, los
resultados son equívocos y pueden indicar, por ejemplo, un posible
problema con uno o más de los ensayos. Si el primer y tercer ensayo
son positivos pero el segundo es negativo, los resultados son
equívocos y pueden indicar, por ejemplo, un posible problema con los
ensayos o un posible AMI no aterosclerótico.
La tabla I, a continuación, resume los posibles
resultados de los ensayos y las categorizaciones resultantes
(diagnosis) utilizando el método de la invención (un signo positivo
indica que el ensayo para ese marcador es positivo; un signo
negativo indica que el ensayo para ese marcador es negativo):
La "precisión diagnóstica" de un ensayo,
prueba o método se refiere a la capacidad del ensayo, prueba o
método para distinguir entre pacientes que tienen una enfermedad,
trastorno o síndrome, y pacientes que no tienen esa enfermedad,
trastorno o síndrome, basándose en que los pacientes tengan una
"presencia clínicamente significativa" de un analito. Por
"presencia clínicamente significativa" se indica que la
presencia del analito (por ejemplo, masa, como miligramos o
nanogramos, o masa por volumen, como miligramos por decilitro) en
el paciente (de forma típica en una muestra del paciente) es mayor
que el punto de corte (o valor umbral) predeterminado para ese
analito y, por tanto, indica que el paciente tiene la enfermedad,
trastorno o síndrome para el cual la presencia significativamente
alta de ese analito es un marcador.
Las expresiones "grado alto de precisión
diagnóstica" y "grado muy alto de precisión diagnóstica" se
refieren al ensayo para ese analito en el que el punto de corte
predeterminado indica de forma correcta (precisa) la presencia o
ausencia de la enfermedad, trastorno o síndrome. Un ensayo perfecto
tendrá una precisión perfecta. Por tanto, para individuos que
tienen la enfermedad, trastorno o síndrome, el ensayo indica sólo
resultados del ensayo positivos, y no indica que cualquiera de esos
individuos son "negativos" (no hay "falsos negativos"). En
otras palabras, la "sensibilidad" del ensayo (la proporción
real positiva) es 100%. Por otra parte, para los individuos que no
tienen la enfermedad, trastorno o síndrome, el ensayo indica sólo
resultados del ensayo negativos, y no indica que cualquiera de esos
individuos son "positivos" (no hay "falsos positivos").
En otras palabras, la "especificidad" (la proporción real
negativa) es 100%. Véase, por ejemplo, O'Marcaigh A.S., Jacobson
R.M., "Estimating The Predictive Value Of A Diagnostic Test, How
To Prevent Misleading Or Confusing Results", Clin. Ped.,
1993, 32(8):485-491, que analiza la
especificidad, sensibilidad y valores predictivos positivos y
negativos de un ensayo, por ejemplo, un ensayo de diagnóstico
clínico.
Si se cambia el valor del punto de corte o umbral
de un ensayo (o prueba), normalmente se cambia la sensibilidad y
especificidad, pero con una relación cualitativamente inversa. Por
ejemplo, si se disminuye el punto de corte, más individuos en la
población ensayada tendrán, de forma típica, unos resultados del
ensayo por encima del punto de corte o valor umbral. Debido a que se
indica que los individuos que tienen unos resultados del ensayo por
encima del punto de corte tienen la enfermedad, trastorno o
síndrome para el cual se está realizando el ensayo, la disminución
del punto de corte provocará que se indiquen más individuos con
resultados positivos (es decir, que tienen la enfermedad, trastorno
o síndrome). Por tanto, el ensayo indicará una mayor proporción de
individuos que tienen la enfermedad, trastorno o síndrome. Por
consiguiente, aumentará la sensibilidad (proporción real positiva)
del ensayo. Sin embargo, al mismo tiempo, aparecerán más falsos
positivos, porque el ensayo indicará que más personas que no tienen
la enfermedad, trastorno o síndrome (es decir, personas que son
verdaderamente "negativos") tienen unos valores del analito por
encima del punto de corte y, por tanto, se indicarán como positivos
(es decir, tienen la enfermedad, trastorno o síndrome), en lugar de
que el ensayo indique correctamente que son negativos. Por
consiguiente, la especificidad (proporción real negativa) del
ensayo disminuye. De forma similar, el aumento del punto de corte
tiende a disminuir la sensibilidad y aumentar la especificidad. Por
tanto, en la evaluación de la precisión y utilidad de un ensayo,
prueba o método médico propuesto para evaluar un trastorno de un
paciente, deben tomarse en cuenta la sensibilidad y la
especificidad, y ser consciente de dónde se encuentra el punto de
corte en el cual se indican la sensibilidad y especificidad, porque
la sensibilidad y la especifidad pueden variar significativamente a
lo largo del intervalo de puntos de corte.
Sin embargo, existe un indicador que permite la
representación de la sensibilidad y especificidad de un ensayo,
prueba o método a lo largo del intervalo completo de puntos de
corte con un único valor. Este indicador se deriva de una curva de
características de actuación del receptor ("Receiver Operating
Characteristics", "ROC") para el ensayo, prueba o método en
cuestión. Véase, por ejemplo, Shultz, "Clinical Interpretation Of
Laboratory Procedures", capítulo 14, en Teitz, Fundamentals
of Clinical Chemistry, Burtis y Ashwood (eds.), 4ª edición,
1996, W.B. Saunders Company, pp. 192-199; y Zwieg
et al., "ROC Curve Analysis: An Example Showing The
Relationships Among Serum Lipids And Apolipoprotein Concentrations
In Identifying Patients With Coronary Artery Diseases", Clin.
Chem., 1992, 38(8):1425-1428.
Una curva ROC es un diagrama x-y
de la sensibilidad en el eje y, en una escala de cero a uno (es
decir, 100%), frente a un valor igual a uno menos la especificidad
en el eje x, en una escala de cero a uno (es decir, 100%). En otras
palabras, es un diagrama de la proporción de verdaderos positivos
frente a la proporción de falsos positivos para ese ensayo, prueba
o método. Para construir la curva ROC para el ensayo, prueba o
método en cuestión, los pacientes se evalúan utilizando un método
perfectamente preciso o "de categoría oro", que es
independiente del ensayo, prueba o método en cuestión, para
determinar si los pacientes son verdaderos positivos o negativos
para la enfermedad, trastorno o síndrome (por ejemplo, la
angiografía coronaria es un ensayo de categoría oro para la
presencia de la aterosclerosis coronaria). Los pacientes también se
ensayan utilizando el ensayo, prueba o método en cuestión, y para
puntos de corte variables, se indica que los pacientes son positivos
o negativos según el ensayo, prueba o método. La sensibilidad
(proporción real positiva) y el valor igual a uno menos la
especificidad (este valor es igual a la proporción de falsos
positivos) se determina para cada punto de corte, y cada par de
valores x-y se representa como un único punto en el
diagrama x-y. La "curva" que conecta estos
puntos es la curva ROC.
El área bajo la curva ("AUC") es el
indicador que permite la representación de la sensibilidad y
especificidad de un ensayo, prueba o método a lo largo del
intervalo completo de puntos de corte con un único valor. El AUC
máxima es uno (un ensayo perfecto) y el área mínima es la mitad.
Cuando más se acerque el AUC a uno, mejor será la precisión del
ensayo.
Un "grado alto de precisión diagnóstica"
significa un ensayo o prueba (como el ensayo de la invención para
determinar la presencia clínicamente significativa del tercer
analito, indicando, con ello, la presencia de un infarto agudo de
miocardio) en el que la AUC (área bajo la curva ROC para el ensayo
o prueba) es al menos 0,70, de forma deseable al menos 0,75, de
forma más deseable al menos 0,80, preferiblemente al menos 0,85,
más preferiblemente al menos 0,90, y lo más preferible al menos
0,95.
Un "grado muy alto de precisión diagnóstica"
significa un ensayo o prueba (como el ensayo de la invención para
determinar la presencia clínicamente significativa del primer
analito, que indica la presencia de una enfermedad de la arteria
coronaria, o el ensayo para determinar la presencia clínicamente
significativa del segundo analito, que indica con ello la presencia
de una etapa aguda de la enfermedad de la arteria coronaria) en el
que el AUC (área bajo la curva ROC para el ensayo o prueba) es a
menos 0,875, de forma deseable al menos 0,90, de forma más deseable
al menos 0,925, preferiblemente al menos 0,95, más preferiblemente
al menos 0,975, y lo más preferible al menos 0,98.
Un "grado clínicamente suficiente de precisión
diagnóstica" significa un método (como el método de la
invención) que (1) en un primer ensayo se puede ensayar para un
primer marcador, cuya presencia por encima de un nivel
predeterminado puede indicar, con un grado muy alto de precisión
diagnóstica, la presencia de la enfermedad de la arteria coronaria,
(2) en un segundo ensayo se puede ensayar para un segundo marcador,
cuya presencia por encima de un nivel predeterminado puede indicar,
con un grado muy alto de precisión diagnóstica, la presencia de una
etapa aguda de la enfermedad de la arteria coronaria, y (3) en un
tercer ensayo se puede ensayar para un tercer marcador, cuya
presencia por encima de un nivel predeterminado puede indicar, con
un grado alto de precisión diagnóstica, la presencia de un infarto
agudo de miocardio; en el que al menos se realiza el segundo
ensayo, y se realizan ambos o cualquiera del primer y tercer
ensayo.
El método de la presente invención proporciona un
grado de precisión diagnóstica clínica para detectar la presencia y
distinguir entre las etapas no agudas (crónicas) y agudas de la
enfermedad de la arteria coronaria en un paciente humano de la
población general, que es significativamente mayor que cualquier
otro método previamente conocido. Sin embargo, las ventajas de esta
invención incluyen no sólo la mayor precisión global que posibilitan
sus ensayos, sino que el uso de los ensayos conjuntamente
proporciona, con rapidez, toda la información que el médico necesita
acerca del paciente, para permitir un posible tratamiento salvador
de la vida. Por tanto, el médico sabrá, utilizando el método de
esta invención, para un paciente concreto, si el paciente no tiene
la enfermedad de la arteria coronaria; o, si ya se conoce la
presencia de la enfermedad, si las medidas que se están poniendo
para tratarla son adecuadas o inadecuadas; o si el paciente tiene
la enfermedad pero no lo sabía, y si se necesita un cambio en la
dieta y/o hábitos de ejercicio y/o medicación y/u otro tratamiento,
pero no sobre una base de urgencia; o si el paciente tiene un
problema coronario que pone en peligro su vida y debe tratarse
sobre una base de urgencia. Otra ventaja es que los infartos agudos
de miocardio debidos a la aterosclerosis coronaria pueden
distinguirse de los debidos a otras causas, cuyo conocimiento
afectará al tratamiento de modo significativo. Otra ventaja es que
en algunos casos, los ensayos confirmarán la validez entre sí y,
con ello, ofrecen mayor confianza al médico en el diagnóstico y
tratamiento.
Las lipoproteínas son complejos de múltiples
componentes de proteínas y lípidos. Cada tipo de lipoproteína tiene
un peso molecular, tamaño, composición química, densidad y papel
físico característico. La proteína y el lípido se mantienen juntos
mediante fuerzas no covalentes.
Las lipoproteínas pueden clasificarse basándose
en su densidad, según se determina mediante ultracentrifugación.
Por tanto, pueden distinguirse cuatro clases de lipoproteínas:
lipoproteínas de densidad alta ("HDL"), lipoproteínas de
densidad intermedia ("IDL"), lipoproteínas de densidad baja
("LDL"), y lipoproteínas de densidad muy baja
("VLDL").
Los componentes de proteína purificados de una
partícula de lipoproteína se denominan apolipoproteínas (apo). Cada
tipo de lipoproteína tiene una composición de apolipoproteínas
característica. En LDL, la proteína apolipoproteína importante es
apo B-100, que es uno de los polipéptidos
monocatenarios más largos que se conoce y consiste en 4536
aminoácidos. De estos aminoácidos, los restos lisina (existen 356
de estos restos lisina) pueden sustituirse o modificarse mediante
aldehídos (por ejemplo, malondialdehído).
La oxidación de los lípidos en LDL (in
vitro, por ejemplo, mediante oxidación inducida por cobre, o
in vivo) da como resultado la generación de aldehídos
reactivos, que entonces pueden interaccionar con los restos lisina
de apo B-100. El resultado de esta sustitución o
modificación de la lisina es que la lipoproteína de baja densidad
oxidada resultante ("OxLDL"), que también es una lipoproteína
de baja densidad modificada con malonaldehído ("LDL modificada
con MDA"), ya no es reconocida por el receptor de LDL sobre la
superficie de los fibroblastos, sino por los receptores captadores
sobre la superficie de los macrófagos. Al menos 60 de las 356
lisinas (o restos lisina) de apo B-100 deben ser
sustituidas para ser reconocidas por los receptores captadores. La
captación de esta OxLDL por los macrófagos produce la generación de
células de espuma, que se considera una etapa inicial de la
aterosclerosis.
Las células endoteliales bajo estrés oxidante
(por ejemplo, en pacientes con infarto agudo de miocardio) y las
plaquetas sanguíneas activadas también producen aldehídos, que
interaccionan con los restos lisina en apo B-100,
dando como resultado la generación de LDL modificada con aldehído,
que también es reconocido por los receptores captadores. Sin
embargo, los lípidos en esta LDL modificada con aldehído no están
oxidados. La actividad enzimática en macrófagos (por ejemplo,
mieloperoxidasa) produce la oxidación de los restos de lípidos y
proteínas de la LDL. Todas estas vías producen una modificación de
tipo aldehído del resto de proteína de la LDL.
El primer marcador puede ser cualquier marcador
cuya presencia clínicamente significativa indica, con un grado muy
alto de precisión diagnóstica, la presencia de la enfermedad de la
arteria coronaria. De forma deseable, el primer marcador es una
proteína aterogénica. Preferiblemente, la proteína aterogénica
comprende OxLDL que contiene al menos 60, de forma deseable hasta
aproximadamente 90, de forma más deseable hasta aproximadamente 120,
preferiblemente hasta aproximadamente 180, más preferiblemente
hasta aproximadamente 210, y lo más preferible probablemente hasta
aproximadamente 240 restos lisina sustituidos por resto de apo
B-100.
El segundo marcador puede ser cualquier marcador
cuya presencia clínicamente significativa indica, con un grado muy
alto de precisión diagnóstica, la presencia de una etapa aguda de
la enfermedad de la arteria coronaria. De forma deseable, el
segundo marcador es una proteína aterogénica. Preferiblemente, la
proteína aterogénica comprende LDL modificada con MDA que contiene
al menos 60, de forma deseable hasta aproximadamente 90, de forma
más deseable hasta aproximadamente 120, preferiblemente hasta
aproximadamente 180, más preferiblemente hasta aproximadamente 210,
y lo más preferible probablemente hasta aproximadamente 240 restos
lisina sustituidos por resto de apo B-100.
El tercer marcador puede ser cualquier marcador
cuya presencia clínicamente significativa indica, con un grado alto
de precisión diagnóstica, la presencia de un infarto agudo de
miocardio. El marcador químico de categoría oro para el infarto
agudo de miocardio ha sido CK-MB, pero puede estar
desplazándose hacia las troponinas (por ejemplo, troponina I,
troponina T). Véase, por ejemplo, Adams et al., "Cardiac
Troponin I, A Marker With High Specificity For Cardiac Injury",
Circulation, 1993, 88(1): 101-106;
Antman et al., "Cardiac-Specific Troponin I
Levels To Predict The Risk Of Mortality In Patients With Acute
Coronary Syndromes", N. Eng. J. Med., 1996,
335(18):1342-1349; Hamm et al.,
"Emergency Room Triage Of Patients With Acute Chest Pain By Means
Of Rapid Testing For Cardiac Troponin T Or Troponin I", N.
Eng. J. Med., 1997, 337(23):1648-1653;
Ohman et al., "Cardiac Troponin T Levels For Risk
Stratification In Acute Myocardial Ischemia", N. Eng. J.
Med., 1996, 335(18):1333-1341; y Van de
Werf, "Cardiac Troponins In Acute Coronary Syndromes", N.
Eng. J. Med., 1996, 335(18):1388-1389.
Otra sustancia que puede utilizarse probablemente como tercer
marcador es un marcador para la trombosis coronaria activa o
incipiente. Por tanto, debe entenderse que un "marcador cuya
presencia por encima de un nivel predeterminado puede indicar, con
un grado alto de precisión diagnóstica, la presencia de un infarto
agudo de miocardio", incluye marcadores de la trombosis coronaria
activa e incipiente, incluso antes de que se formen y/o liberen las
sustancias indicativas de muerte o lesiones del tejido cardíaco. En
términos generales, el tercer marcador será, de forma típica, una
"proteína cardíaca", que tal como se utiliza en la presente,
significa una proteína (por ejemplo, una enzima) que se produce
como resultado, o está asociada de otra manera, con lesiones
isquémicas al corazón, o que es un precursor o derivado de
esa
proteína.
proteína.
El ensayo de la presencia clínicamente
significativa de los marcadores puede utilizar cualquier ensayo,
metodología y equipo, con la condición de que puedan lograrse los
beneficios de esta invención, por ejemplo, ensayos químicos y
ensayos inmunológicos, como ensayos competitivos y "sandwich".
Los "ensayos competitivos" son muy conocidos y puede
utilizarse cualquier ensayo competitivo en esta invención, con la
condición de que puedan lograrse los beneficios de esta invención.
Los "ensayos de sandwich" son muy conocidos y puede utilizarse
cualquier ensayo "sandwich" en esta invención, con la condición
de que puedan lograrse los beneficios de esta invención.
En un ensayo inmunológico puede utilizarse
cualquier anticuerpo que tenga una afinidad adecuadamente alta por
la especie diana, y preferiblemente los anticuerpos son anticuerpos
monoclonales. Tal como se utiliza en la presente, "afinidad
alta" significa una constante de afinidad (constante de
asociación) de al menos aproximadamente 5 x 10^{8} M^{-1} (en
la que "M" indica la molaridad o moles por litro, y
"M^{-1}" indica la recíproca de la molaridad, o litros por
mol), de forma deseable al menos aproximadamente 1 x 10^{9}
M^{-1}, preferiblemente al menos aproximadamente 1 x 10^{10}
M^{-1}, y lo más preferible al menos aproximadamente 1 x 10^{11}
M^{-1}. Tal como se utiliza en la presente, "afinidad baja"
(en contradicción con la afinidad alta) significa una constante de
afinidad (constante de asociación) de menos de aproximadamente 1 x
10^{7} M^{-1}, de forma deseable menos de aproximadamente 1 x
10^{6} M^{-1}, y preferiblemente menos de aproximadamente 1 x
10^{5} M^{-1}. Las constantes de afinidad se determinan según
el método apropiado descrito en Holvoet, Collen et al., J.
Clin. Invest., 1994, 93:89-98.
Los anticuerpos preferidos utilizados en este
primer y segundo ensayo de esta invención se unen con OxLDL y/o LDL
modificada con MDA, cuyos restos de apo B-100
contienen al menos 60, de forma deseable hasta aproximadamente 90,
de forma más deseable hasta aproximadamente 120, preferiblemente
hasta aproximadamente 180, más aproximadamente hasta
aproximadamente 210, y lo más preferible probablemente hasta
aproximadamente 240 restos lisina sustituidos por resto de apo
B-100. El intervalo de sustitución de lisina será,
en general, de 60 hasta aproximadamente 240 restos lisina
sustituidos por resto de apo B-100, y a veces desde
60 hasta aproximadamente 180 restos lisina sustituidos por resto de
apo B-100.
Cada anticuerpo monoclonal utilizado en el primer
y segundo ensayo es, de forma deseable, muy específico para un
epitopo conformacional que está presente cuando al menos 60,
preferiblemente hasta aproximadamente 120 restos lisina están
sustituidos y, en virtud de ello, puede distinguirse el primer y
segundo marcador del primer y segundo ensayo. Los anticuerpos que
reconocen los epitopos presentes cuando menos de aproximadamente 60
lisinas por resto de apo B-100 están sustituidas o
modificadas son menos específicos pero aún son útiles (por ejemplo,
pueden emplearse como el anticuerpo secundario en un ensayo ELISA de
"sandwich").
Los anticuerpos preferidos utilizados en la
presente son los anticuerpos monoclonales mAb-4E6,
mAb-1h11 y mAb-8A2. Sus constantes
de afinidad para la LDL nativa, LDL modificada con MDA y OxLDL son
como siguen (las unidades son litros por mol, que es igual a la
recíproca de la molaridad o M^{-1}):
El anticuerpo monoclonal mAb-4E6
es producido por el hibridoma Hyb4E6, depositado en el BCCM con el
nº de registro de depósito LMBP 1660 CB, el 24 de abril, 1997, o
una fecha cercana. El anticuerpo monoclonal mAb-1H11
es producido por el hibridoma Hyb1H11, depositado en el BCCM con el
nº de registro de depósito LMBP 1659 CB, el 24 de abril, 1997, o
una fecha cercana. El anticuerpo monoclonal mAb-8A2
es producido por el hibridoma Hyb8A2, depositado en el BCCM con el
nº de registro de depósito LMBP 1661 CB, el 24 de abril, 1997, o una
fecha cercana.
El BCCM es el Belgian Coordinated Collections of
Microorganisms autorizado por el Tratado de Budapest del 28 de
abril, 1977, On The International Recognition Of The Deposit Of
Microorganisms For The Purposes Of Patent Procedure ("Tratado de
Budapest"). Su dirección es c/o The University of Gent, K.L.
Ledeganckstraat, 35, B-9000, Gante, Bélgica.
Los tres depósitos se realizaron en el BCCM bajo
las condiciones prescritas por el Tratado de Budapest. Según The
United States Code Of Federal Regulations (véase 37 CFR \NAK
1.808) y Manual Of Patent Examination ("MPEP") de The
United States Patent And Trademark Office (véase \NAK 2410.01),
todas las restricciones impuestas por el depositario sobre la
disponibilidad al público del material depositado (excepto lo
permitido por el MPEP) se eliminarán de forma irrevocable tras la
concesión de cualquier patente otorgada a partir de esta solicitud,
o de cualquier continuación de solicitud basada en ella.
Como se describió anteriormente, estos tres
anticuerpos monoclonales se obtuvieron de la siguiente forma
(véanse las solicitudes PCT/EP97/03287, presentada el 20 de junio,
1997, y PCT/EP97/03493, presentada el 1 de julio, 1997 [ambas
designan a EEUU y otros países, y nombran como inventores a Paul
Holvoet y Désiré Collen]).
Se inmunizaron ratones Balb/c mediante inyección
intravenosa e intraperitoneal de OxLDL o LDL modificada con MDA. El
OxLDL se obtuvo mediante incubación in vitro de LDL
(concentración final de apo B-100, 700 \mug/ml)
con cloruro de cobre (concentración final, 640 \muM) durante 16
horas a 37ºC. La LDL modificada con MDA se preparó mediante
incubación de LDL (concentración final de apo
B-100, 700 \mug/ml) con una disolución de MDA 0,25
M durante 3 horas a 37ºC. El número de lisinas sustituidas, medidas
mediante el ensayo TBARS, es, de forma típica, 210 por molécula de
apo B-100 para OxLDL, y 240 para la LDL modificada
con MDA. Los hibridomas se obtuvieron mediante fusión inducida por
PEG de linfocitos del bazo derivados de ratones inmunizados con
células de mieloma P3-X63/Ag-6.5.3
según técnicas convencionales (Holvoet, Collen et al., J.
Clin. Invest., 1994, 93:89-98). La selección de
hibridomas que producen anticuerpos específicos se realizó con ELISA
utilizando placas de microvaloración revestidas con LDL modificada
con MDA o LDL oxidada con cobre. Se obtuvieron trescientos ocho
hibridomas después de la inmunización de los ratones con OxLDL
(211) o LDL modificada con MDA (97). El Hyb4E6 produjo anticuerpos
específicos para el LDL modificado con MDA y oxidado con cobre
(mAb-4E6), y el Hyb1H11 produjo anticuerpos
específicos de LDL modificada con MDA (mAb-1H11)
sólo. Los ratones inmunizados con LDL en un método similar
produjeron el hibridoma Hyb8A2, que produce el anticuerpo
mAb-8A2.
El ensayo preferido es un ensayo inmunoabsorbente
de enzimas ligados ("ELISA"). Por ejemplo, en el caso de un
ensayo ELISA competitivo, un sustrato sólido revestido con OxLDL o
LDL modificado con MDA puede ponerse en contacto durante un periodo
de tiempo predeterminado con el anticuerpo monoclonal
mAb-4E6 y una muestra de la cual se cree o se sabe
que contiene OxLDL y/o LDL modificada con MDA, después de lo cual
el anticuerpo no unido y la muestra se retiran y se visualiza y/o
cuantifica una reacción de unión entre el anticuerpo y OxLDL y/o
LDL modificada con MDA unida al sustrato. La cuantificación en un
ensayo ELISA competitivo es indirecta, porque la unión entre el
anticuerpo y el analito en la muestra no se mide, sino que se mide
la cantidad de anticuerpo que se une a la cantidad conocida de
OxLDL o LDL modificada con MDA que reviste el sustrato (se une a
él). Cuanto más anticuerpo unido a la cantidad conocida de OxLDL o
LDL modificada con MDA que reviste el sustrato, menor analito había
en la muestra.
Un ensayo competitivo típico que utiliza el
anticuerpo monoclonal mAb-4E6 es como sigue. Se
basa en la inhibición por LDL oxidada con cobre de la unión de
mAb-4E6 a las paredes revestidas de placas de
microvaloración. Por tanto, un patrón de OxLDL (o LDL modificada
con MDA) y muestras de plasma se diluyen en PBS (disolución salina
tamponada con fosfato) que contiene EDTA 1 mM, vitamina E 20
\muM, hidroxitolueno butilado 10 \muM, dipiridamol 20 \muM, y
teofilina 15 mM para evitar la activación de las plaquetas y la
oxidación de LDL in vitro. Se mezclan volúmenes iguales de
una disolución de mAb-4E6 purificado diluido
(concentración final, 7,5 ng/ml) y de la disolución patrón diluida o
de muestras de plasma diluidas (la LDL oxidada con cobre se añade
como ligando competitivo a una concentración final que varía desde
50 a 500 ng/ml), y se incuba durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Entonces se añaden partes alícuotas de 200 \mul a los
pocillos revestidos con LDL modificada con MDA u OxLDL. Las partes
alícuotas se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente.
Después de lavar, los pocillos se incuban durante 1 hora con IgG de
conejo conjugada con peroxidasa de rábano producida contra
inmunoglobulinas de ratón y se vuelve a lavar. Se realiza la
reacción de la peroxidasa (véase Holvoet, Collen et al.,
J. Clin. Invest., 1995, 95:2611-2619) y se
lee la absorbancia (A) a 492 nm. Los controles sin ligando
competitivo y los blancos sin anticuerpo pueden incluirse de modo
rutinario. El porcentaje de inhibición de la unión de
mAb-4E6 al ligando inmovilizado puede
calcularse
como:
como:
\frac{A^{492nm} \ del \ control -
A^{492nm} \ de \ la \ muestra}{A^{492nm} \ del \ control - A^{492nm}
\ del \
blanco}
y las curvas patrón pueden
obtenerse realizando una gráfica del porcentaje de inhibición
frente a la concentración de ligando competitivo. El límite inferior
de detección es 0,020 mg/dl en plasma humano sin
diluir.
En el caso de un ensayo ELISA "sandwich", el
mAb-4E6 (para LDL modificada con MDA y OxLDL) o
mAb-1H11 (para la LDL modificada con MDA) puede
unirse a un sustrato sólido y posteriormente ponerse en contacto con
una muestra que se va a ensayar. Después de la eliminación de la
muestra, la unión entre el anticuerpo específico y OxLDL y/o LDL
modificada con MDA capturada de la muestra puede visualizarse y/o
cuantificarse mediante un medio de detección. Los medios de
detección pueden ser un anticuerpo secundario menos específico
marcado, que reconoce una parte diferente del resto apo
B-100 del analito capturado (por ejemplo,
mAb-8A2).
Un ensayo "sandwich" típico que utiliza los
anticuerpos monoclonales mAb-4E6 y
mAb-8A2 es como sigue. Se basa en la unión de
material inmunorreactivo a los pocillos de placas de
microvaloración revestidas con el anticuerpo monoclonal
mAb-4E6 y la detección del material inmunorreactivo
unido con el uso del anticuerpo monoclonal mAb-8A2
marcado con peroxidasa. Esta versión del ELISA resulta más adecuada
para el uso en un laboratorio clínico porque supera la necesidad de
preparar disoluciones patrón de LDL modificada con aldehído y/o
oxidada in vitro.
Las preparaciones patrón y las muestras de plasma
se diluyen en PBS que contiene antioxidantes y agentes
antiplaquetas según se describió anteriormente en conexión con el
ELISA competitivo, se aplican partes alícuotas de 180 \mul de
plasma diluido 80 veces y de disoluciones patrón que contienen entre
10 y 0,01 nM de LDL modificada con MDA a los pocillos de placas de
microvaloración revestidas con mAb-4E6 (200 \mul
de una disolución de IgG 4 \mug/ml) y se incuban durante 2 horas
a temperatura ambiente. Después de lavar, los pocillos se incuban
durante 1 hora con mAb-8A2 conjugado con peroxidasa
de rábano, IgG (concentración final de IgG, 65 ng/ml), y se lavan
de nuevo. La reacción de peroxidasa se realiza como se describió
anteriormente en conexión con el ELISA competitivo. La absorbancia
medida a 492 nm se correlacionará con el valor logarítmico de la
concentración de LDL modificada con MDA en el intervalo entre 1,5
nM y 0,3 nM.
Los ensayos para el tercer marcador (por ejemplo,
CK-MB, troponina I) son conocidos. Véase, por
ejemplo, Adams et al., Circulation, 1993,
88(1):101-106; Antman et al., N.
Eng. J. Med., 1996, 335(18):1342-1349;
Hamm et al., N. Eng. J. Med., 1997,
337(23):1648-1653; Ohman et al., N.
Eng. J. Med., 1996, 335(18):1333-1341; y
Van de Werf, N. Eng. J. Med., 1996,
335(18):1388-1389.
Tal como se utiliza en la presente, "un
paciente humano de la población general" debe entenderse en
general como cualquier ser humano, y no está limitado a seres
humanos que se han admitido oficialmente en hospitales, o que
tienen o no enfermedades, trastornos o síndromes específicos. Puede
haber uno o más subgrupos de la población general para los cuales
el método de la invención no resulta deseable; sin embargo, este
uno o más subgrupos (si existen) no se conocen en la
actualidad.
La "muestra del paciente" utilizada en la
presente puede ser cualquier muestra que permite lograr los
beneficios de esta invención. De forma típica, la "muestra del
paciente" será una muestra de fluido, de forma típica sangre
completa o un fluido derivado de sangre completa (como plasma o
suero). Las muestras de fluidos (en particular sangre completa,
plasma o suero), en oposición a las muestras de tejidos, tienen la
ventaja de obtenerse y ensayarse de forma rápida y fácil, lo cual es
particularmente importante en un entorno clínico en el que el
tiempo puede ser fundamental. Además los médicos están
acostumbrados a extraer muestras de fluidos (en particular, sangre)
de los pacientes, y algunos de los marcadores pueden no estar
presentes o estar presentes en una cantidad insuficiente en las
muestras de
tejidos.
tejidos.
La sangre completa puede contener sustancias, por
ejemplo, células, que interfieren con los ensayos utilizados en el
método de la invención y, por tanto, la sangre completa es una
muestra menos preferida. La muestra preferida es plasma, que es
sangre completa de la cual se han eliminado las células (glóbulos
rojos sanguíneos, glóbulos blancos sanguíneos y plaquetas), por
ejemplo, mediante centrifugación. El suero es plasma del cual se ha
eliminado el fibrinógeno (por ejemplo, provocando la coagulación y
después retirando el material coagulado) y también es menos
preferido que el plasma.
Como se indicó anteriormente, cualquier ensayo,
metodología y equipo puede utilizarse, con la condición de que se
logren los beneficios de esta invención. Así, por ejemplo, la
invención no está limitada al uso de la tecnología de las placas de
microvaloración. Si, por ejemplo, los ensayos del método de esta
invención implican utilizar anticuerpos, estos anticuerpos pueden
utilizarse en una amplia variedad de sistemas de ensayo
inmunológicos autómaticos, que incluyen sistemas de inmunoensayos
quimioluminiscentes, sistemas de inmunoensayo de micropartículas
enzimáticas, sistemas de inmunoensayo de polarización de
fluorescencia y sistemas de radioinmunoensayo.
El método de esta invención se utilizó en
conexión con casi trescientos pacientes de la población general
(que, en este caso, no incluían individuos con transplante de
corazón), como se describe a continuación. En términos generales,
el análisis estadístico de los resultados indica que, de los
posibles marcadores ensayados, el mejor marcador para el primer
ensayo es OxLDL, el mejor marcador para el segundo ensayo es LDL
modificada con MDA, y el mejor marcador para el tercer ensayo es
troponina I.
Se estudiaron un total de 286 individuos
conectados con el University Hospital Of Leuven, como empleados o
como individuos, que se llevaron al departamento de urgencias y/o
se admitieron en el hospital: 105 pacientes con síndromes
coronarios agudos, 64 pacientes con CAD estable, y 117
controles.
Los individuos se clasificaron de modo que tenían
un síndrome coronario agudo (es decir, tenían una etapa aguda de la
enfermedad de la arteria coronaria) si tenían un malestar isquémico
en el pecho con una elevación o depresión del segmento ST de más de
0,5 mm, o una inversión de la onda T de más de 1 mm. De los
individuos que tenían una etapa aguda de la enfermedad de la
arteria coronaria, los que presentaban unos niveles elevados de
creatina-quinasa (CK-MB) (y al menos
3% de la CK total) en el momento de la admisión, o en las muestras
tomadas a las 6 u 8 horas después la admisión se clasificaron de
modo que tenían AMI. Como alternativa, los individuos con una etapa
aguda que no tenían estos niveles elevados de CK-MB
se clasificaron de modo que tenían angina inestable.
Se consideró que los individuos con CAD
documentada de modo angiográfico y sin signos clínicos de isquemia
en el mes previo tenían CAD estable (es decir, en este caso, angina
estable).
Se utilizaron 117 individuos (72 hombres/45
mujeres; media de edad = 55 años) sin una historia de enfermedad
cardiovascular aterosclerótica como controles. Se seleccionaron del
laboratorio y del personal clínico del hospital, y de una población
de individuos admitidos en el hospital que no tenían una historia
de enfermedad cardiovascular aterosclerótica.
Se tomaron muestras de sangre venosa en un estado
en ayunas de los controles y de individuos con angina estable. En
los individuos con síndromes coronarios agudos, las muestras
sanguíneas se tomaron tras su admisión antes del inicio del
tratamiento. Las muestras sanguíneas se recogieron en citrato 0,01
M, que contiene EDTA 1 mM, vitamina E 20 \muM, hidroxitolueno
butilado 10 \muM, dipiridamol 20 \muM, y teofilina 15 mM, para
evitar la activación de plaquetas y la oxidación de la LDL in
vitro. Las muestras sanguíneas se centrifugaron a 3.000 g
durante 15 minutos a temperatura ambiente en la hora después de su
recogida, y el plasma resultante se conservó a -20ºC hasta que se
realizaron los ensayos.
La LDL se aisló del plasma reunido de donantes
normolipidémicos en ayunas mediante ultracentrifugación de gradiente
de densidad (Havel et al., J. Clin. Invest., 1955,
34:1345-1353). La LDL modificada con MDA y la LDL
oxidada con cobre se prepararon como se describe en Haberland et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982,
79:1712-1716; y Steinbrecher, J. Biol. Chem.,
1987, 262(8):3603-3608, y se utilizaron como
patrones. La caracterización de la LDL modificada implica la medida
de las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico ("TBARS"),
la determinación de la movilidad electroforética en geles de
agarosa al 1%, la cuantificación del colesterol y los ácidos grasos
mediante HPLC en una columna de fase inversa C-18 de
Nova-Pak (Waters Associates, Milford,
Massachusetts), la cuantificación de las proteínas mediante un
ensayo de Lowry, y de los fosfolípidos mediante un ensayo enzimático
(Biomérieux, Marcy, Francia). Véase Holvoet, Collen et al.,
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 1998,
18(1):100-107, y Holvoet, Collen et
al., J. Clin. Invest., 1995,
95:2611-2619. La moléculas de apo
B-100 de la LDL modificada con MDA y la LDL oxidada
con cobre in vitro contenían una media de 244 y 210 lisinas
sustituidas, respectivamente. Como se indicó anteriormente, aunque
el grado de sustitución de lisinas de la LDL modificada con MDA y
la LDL oxidada con cobre in vitro es muy similar, el resto
de lípido de la LDL modificada con MDA no se oxida.
Se utilizó un ensayo ELISA basado en
mAb-4E6 para la cuantificación de OxLDL en el
plasma (véase Holvoet, Collen et al., Arterioscler.
Thromb. Vasc. Biol., 1998,
18(1):100-107; Holvoet, Collen et al.,
Thromb. Haemost., 1996,
76(5):663-669; Holvoet y Collen,
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 1997,
17(11):2376-2382; y Holvoet, Collen et
al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 1998,
18:415-422). Este anticuerpo monoclonal permite la
detección de LDL modificada con MDA o LDL oxidada con cobre 0,025
mg/dl en presencia de LDL nativa 500 mg/dl. Los niveles plasmáticos
de la LDL modificada con MDA se midieron en un ensayo ELISA basado
en mAb-1H11 (véase Holvoet, Collen et al.,
J. Clin. Invest., 1995, 95:2611-2619). Este
anticuerpo monoclonal permite la detección de LDL modificada con
MDA 0,025 mg/dl, pero no de LDL oxidada con cobre, en presencia de
LDL nativa 500 mg/dl. Debido a que las especificidades de los dos
anticuerpos dependen del grado de modificación de la proteína,
todas las concentraciones de lipoproteínas se expresan en términos
de proteína.
Se midió el colesterol total, el colesterol HDL,
y los triglicéridos mediante métodos enzimáticos (Boehringer
Mannheim, Meylon, Francia). Los valores del colesterol LDL se
calcularon con la fórmula Friedewald. Los niveles de troponina I se
midieron en un inmunoanalizador Beckman ACCESS utilizando
anticuerpos monoclonales disponibles en el mercado (Sanofi,
Toulouse, Francia). Los niveles de proteínas reactivas a C se
midieron en un inmunoensayo comercial (Boehringer, Bruselas,
Bélgica), y se midieron los niveles plasmáticos del dímero D en un
ensayo ELISA como se describió previamente (véase Declerk, Holvoet,
Collen et al., Thromb. Haemost., 1987,
58(4):1024-1029). La proteína C reactiva es
un marcador de la inflamación. El dímero D es un marcador para los
síndromes trombó-
ticos.
ticos.
Los valores obtenidos se muestran en la tabla III
a continuación ("n" indica el número de individuos que se sabe
que pertenecen a cada categoría independientemente).
Los datos cuantitativos representan la media
\pm las desviaciones estándar.
"AMI" es un infarto agudo de miocardio.
Los niveles plasmáticos de OxLDL eran
0,85\pm0,54 mg/dl (media \pm desviación estándar) en los 117
controles, y eran 3,1 veces mayores (p<0,001) en los 64
pacientes con angina de pecho estable, 3,8 veces mayores
(p<0,001) en los 42 pacientes con angina de pecho inestable, y
3,5 veces mayores (p<0,001) en los 63 pacientes con AMI (como
comparación, un grupo de 79 pacientes con transplante de corazón
sin CAD tiene OxLDL de 1,27\pm0,061 mg/dl, o 1,5 veces mayor que
los 117 controles, y un grupo de 28 pacientes con transplante de
corazón con CAD estable tiene OxLDL de 2,49\pm0,18 mg/ml, o 2,9
veces mayor que los controles; las razones para la diferencia
aparente entre los valores para los individuos no CAD que tienen o
no un transplante de corazón no se sabe con certeza). Estos
resultados demuestran que el ensayo o prueba de esta invención
utilizado para detectar un marcador de la enfermedad de la arteria
coronaria en un paciente de la población general distingue, con un
grado muy alto de precisión diagnóstica, entre las siguientes
categorías 1 y 2: (1) los que no tienen la enfermedad de la arteria
coronaria, y (2) los que tiene una de las categorías o etapa de la
enfermedad de la arteria coronaria, pero por sí mismo no es capaz de
distinguir, con un grado suficiente de precisión, entre las
categorías (o etapas) de la enfermedad de la arteria coronaria.
Los niveles plasmáticos de la LDL modificada con
MDA son 0,39\pm0,15 mg/dl en los 117 controles, pero sólo eran
1,2 veces mayores en los 64 pacientes con angina de pecho estable,
pero eran 2,7 veces mayores (p<0,001) en los 42 pacientes con
angina de pecho inestable, y 3,1 veces mayores (p<0,001) en los
63 pacientes con AMI (como comparación, un grupo de 79 pacientes
con transplante de corazón sin CAD tenía LDL modificada con MDA de
0,38\pm0,016 mg/dl, o esencialmente la misma que los 117
controles, y un grupo de 28 pacientes con transplante de corazón
con CAD estable tiene LDL modificada con MDA de 0,39\pm0,038
mg/dl, o también esencialmente la misma que los controles). Estos
resultados demuestran que el ensayo o prueba de esta invención para
detectar un marcador de una etapa aguda de la enfermedad de la
arteria coronaria distinguirá entre las siguientes categorías 1 y 2:
(1) los que no tienen una etapa aguda de la enfermedad de la
arteria coronaria (es decir, los que (a) no tienen la enfermedad de
la arteria coronaria, o tienen la enfermedad de la arteria
coronaria no aguda, es decir, (b) la enfermedad de la arteria
coronaria asintomática, o (c) angina estable) pero en sí mismo no
será capaz de distinguir, en general, con un grado suficiente de
precisión, entre estas tres categorías a, b y c, y (2) los que
tienen una de las dos categorías o etapas de la enfermedad de la
arteria coronaria aguda (es decir, los que tienen (a) angina
inestable, o (b) infarto agudo de miocardio), pero en sí mismo no
es capaz de distinguir, en general, con un grado suficiente de
precisión, entre las dos categorías.
Los niveles plasmáticos de troponina I eran
0,0092\pm0,011 ng/ml en los 117 controles, pero sólo 3,8 veces
mayores en los 64 pacientes con angina estable, pero eran 40 veces
mayores (p<0,001) en los 42 pacientes con angina inestable, y
141 veces mayores (p<0,001) en los 63 pacientes con AMI. En
concordancia con los datos previamente publicados, se descubrió que
la troponina I era un marcador del infarto agudo de miocardio
(véase Adams et al., Circulation, 1993,
88(1):101-106; y Antman et al., N.
Eng. J. Med., 1996,
335(18):1342-1349).
Los niveles plasmáticos de la proteína C reactiva
eran 3,38\pm1,79 mg/dl en los 117 controles, pero sólo 1,9 veces
mayores en los 64 pacientes con angina estable, pero eran 5,1 veces
mayores (p<0,001) en los 42 pacientes con angina inestable, y
5,4 veces mayores en los 63 pacientes con AMI (p<0,001). En
concordancia con los datos previamente publicados, se descubrió que
la proteína C reactiva era un marcador de los síndromes coronarios
agudos (véase Muldoon et al., Ryan et al., Oltrona
et al., y Liuzzo et al., cartas y respuestas de los
autores, N. Engl. J. Med., 1995, 332(6):
398-400).
Los niveles plasmáticos del dímero D eran
166\pm162 \mug/dl en los 117 controles, pero eran sólo 1,8 veces
mayores en los 64 pacientes con angina estable, pero eran 2,2 veces
mayores (p<0,001) en los 42 pacientes con angina inestable, y
3,6 veces mayores en los 63 pacientes con AMI (p<0,001). En
concordancia con los datos previamente publicados, se descubrió que
el dímero D era un marcador de los síndromes coronarios agudos
(Hoffmeister, Circulation, 1995,
91(10):2520-2527).
Los datos también se analizaron para determinar
la sensibilidad y especificidad de la OxLDL (punto de corte de 1,4
mg/dl), la LDL modificada con MDA (punto de corte de 0,7 mg/dl), y
la troponina I (punto de corte de 0,07 ng/ml) para las etapas
individuales de la enfermedad de la arteria coronaria. En otras
palabras, por debajo del punto de corte, el individuo se clasifica
como que no tiene la etapa de la CAD en cuestión, y en el punto de
corte o por encima de éste, el individuo se clasifica como que
tiene esta etapa de CAD. Las sensibilidades y especificidades se
muestran en la tabla IV como sigue:
Los datos se compararon utilizando ANOVA de
Kruskal-Wallis no paramétrico, seguido del ensayo de
la comparación múltiple de Dunnet utilizando el programa estadístico
Prism (Graph Pad Soft, San Diego, California). Los niveles
plasmáticos de OxLDL y de LDL modificada con MDA en pacientes con
niveles normales o elevados de troponina I, proteína C reactiva o
dímero D, y en pacientes con y sin una enfermedad vascular
periférica se compararon mediante un ensayo de
Mann-Whitney. Los parámetros discontinuos se
compararon mediante un análisis de
Chi-cuadrado.
Se utilizó un modelo de regresión logística para
describir, de forma univariable, la relación entre CAD (sí o no, es
decir, si el individuo tiene CAD o no) y varias covariantes. Para
los individuos que tenían CAD, la relación entre la estabilidad de
la CAD (estable o inestable) y las covariantes se comprobó mediante
modelos de regresión logística. Para los individuos que tenían una
CAD inestable, la relación entre la angina inestable o AMI y las
covariantes se comprobó mediante modelos de regresión logística. Las
relaciones entre (1) la angina estable o inestable, (2) la angina
estable o AMI, y (3) la angina estable, la angina inestable, o AMI
y las covariantes se estudió mediante modelos de regresión
logística (de multigrupo para la última). Para la variables
continuas se utilizaron funciones polinómicas a trozos cúbicas para
establecer el modelo de relación entre los covariantes y la
respuesta. Esto permite especificar las funciones no lineales de
los predictores en el modelo. Se ajustó un modelo de regresión
logística múltiple, que incluye todas las variables
univariablemente significativas y sus factores de confusión. Los
factores de confusión se comprobaron mediante un coeficiente de
correlación de Spearman. La medida de la discriminación predictiva
utilizada para caracterizar la actuación del modelo es el área bajo
la curva de características de actuación del receptor (ROC). El
programa informático utilizado era F.E. Harell, Jr., "Design, S
Functions For Biostatistical/Epidemiologic Modeling, Testing,
Estimation, Validation, Graphics, And Prediction" (disponible en
statlib.cmu.edu; pedir "send design from S", 1994);
S-plus® 4.0 Release 3 para Windows (Mathsoft Inc.,
Cambridge, Massachusetts, EEUU); y el programa informático
SAS/STAT, versión 6.12, SAS Institute Inc. (Cary, Carolina del
Norte, EEUU).
La tabla V, a continuación, muestra los
resultados de los análisis de regresión logística simple para
describir la capacidad de cada uno de los parámetros para
distinguir entre los individuos sin enfermedad de la arteria
coronaria y los que tienen la enfermedad de la arteria
coronaria.
El área bajo la curva ROC ("AUC") es 0,992
para OxLDL, que es una puntuación casi perfecta (1 es la AUC
máxima). Esto indica que la presencia clínica de OxLDL por encima
de un nivel predeterminado puede indicar, con un grado muy alto de
precisión diagnóstica, la presencia de la enfermedad de la arteria
coronaria, en oposición a la ausencia de CAD. De hecho, el grado
muy alto de precisión diagnóstica está por encima del AUC mínima
más preferida de 0,98. El único otro valor de AUC que se acerca a
este valor para OxLDL es el valor de AUC de la LDL modificada con
MDA, que es 0,826, pero incluso éste está por debajo del mínimo de
0,875 para un "grado muy alto de precisión diagnóstica". Los
demás valores de AUC son sustancialmente menores. Por ejemplo, el
colesterol total, que durante la última década aproximadamente ha
sido el marcador clásico para determinar si alguien presenta un
riesgo o está en riesgo de CAD, es sólo 0,623, que es una
"precisión bastante baja" (véase Zweig et al., "ROC
Curve Analysis: An Example Showing The Relationships Among Serum
Lipid And Apolipoprotein Concentrations In Identifying Patients
With Coronary Artery Disease", Clin. Chem., 1992,
38(8):1425-1428, que cita a Swets,
"Measuring The Accuracy Of Diagnostic Systems",
Science, 1988, 240:1285-1293).
La tabla VI, a continuación, muestra los
resultados de los análisis de regresión logística simple para
describir la capacidad de cada uno de los parámetros para
distinguir entre una etapa aguda de enfermedad de la arteria
coronaria (es decir, angina inestable o infarto agudo de miocardio)
y una etapa no aguda.
El área bajo la curva ROC ("AUC") es 0,967
para la LDL modificada con MDA, lo cual es una puntuación muy alta.
Esto indica que la presencia clínica de LDL modificada con MDA por
encima de un nivel predeterminado puede indicar, con un grado muy
alto de precisión diagnóstica, la presencia de una etapa aguda de la
enfermedad de la arteria coronaria (en oposición a una etapa no
aguda). De hecho, el grado muy alto de precisión diagnóstica está
por encima del nivel mínimo de AUC preferido de 0,95. El único otro
valor de AUC que se acerca a este valor para la LDL modificada con
MDA es el valor de AUC para la troponina I, que es 0,848. El resto
de los valores de AUC son sustancialmente menores.
La tabla VII, a continuación, muestra los
resultados de los análisis de regresión logística simple para
describir la capacidad de cada uno de los parámetros para
distinguir entre la angina inestable y el infarto agudo de
miocardio.
El área bajo la curva ROC ("AUC") es 0,777
para la troponina I que, según Swets (mencionado en Zweig et
al., Clin. Chem., 1992,
38(8):1425-1428, anteriormente), indica una
precisión útil para algunos fines. Este valor de AUC de 0,777
indica que la presencia clínica de la troponina I por encima de un
nivel predeterminado puede indicar, con un grado alto de precisión
diagnóstica, la presencia de un infarto agudo de miocardio (en
oposición a la angina inestable). De hecho, el grado alto de
precisión diagnóstica está muy por encima de la AUC mínima preferida
de 0,70. El siguiente valor más alto de AUC es el valor de AUC para
la proteína C reactiva, que es 0,637. El resto de los valores de
AUC, incluyendo los de OxLDL y LDL modificada con MDA, son
sustancialmente menores, y se encuentran apenas por encima del
valor mínimo de AUC de 0,5.
La tabla VIII, a continuación, muestra los
resultados de los análisis de regresión logística simple para
describir la relación entre cada uno de los parámetros y distinguir
entre la enfermedad de la arteria coronaria (bien la enfermedad de
la arteria coronaria asintomática o bien la angina estable) y la
angina inestable.
\vskip1.000000\baselineskip
La AUC para la LDL modificada con MDA es 0,007
(casi el valor perfecto de 1), lo cual demuestra que la utilización
de LDL modificada con MDA como marcador puede distinguir, con un
grado muy alto de precisión diagnóstica, entre la enfermedad de la
arteria coronaria estable y la angina inestable. Ningún otro
parámetro se equipara tanto con la precisión de la LDL modificada
con MDA.
La tabla IX, a continuación, muestra los
resultados de los análisis de regresión logística simple para
describir la relación entre cada uno de los parámetros y distinguir
entre la enfermedad de la arteria coronaria (bien la enfermedad de
la arteria coronaria asintomática o bien la angina estable) y el
infarto agudo de miocardio.
La AUC para la LDL modificada con MDA es 0,967,
lo cual demuestra que la utilización de la LDL modificada con MDA
como marcador puede distinguir, con un grado muy alto de precisión
diagnóstica, entre la enfermedad de la arteria coronaria estable y
el infarto agudo de miocardio. La troponina I, con un valor de AUC
de 0,921, es buena pero no casi tan perfecta. El siguiente valor más
alto de AUC es 0,763, para la proteína C reactiva, pero es
significativamente menor que los valores de AUC de la LDL
modificada con MDA y la troponina I.
Todos estos resultados demuestran que la presente
invención proporciona un método que tiene un grado clínicamente
suficiente de precisión diagnóstica, para detectar la presencia y
distinguir entre las etapas no agudas y agudas de la enfermedad de
la arteria coronaria para un paciente humano de la población
general, siendo las etapas no agudas de la enfermedad de la arteria
coronaria la enfermedad de la arteria coronaria asintomática o la
angina estable, y siendo las etapas agudas de la enfermedad de la
arteria coronaria la angina inestable y el infarto agudo de
miocardio.
A los expertos en la técnica les resultarán
evidentes las variaciones y modificaciones, y las reivindicaciones
pretenden cubrir todas las variaciones y modificaciones que se
encuentren dentro del alcance y espíritu verdadero de la
invención.
Por ejemplo, los puntos de corte para los
diversos marcadores dependerán de los marcadores utilizados y de
los ensayos empleados. Cuando se utilizan los métodos descritos en
la presente, el punto de corte puede ser 1,4 mg/dl
(miligramos/decilitro) para OxLDL, 0,7 mg/dl para LDL modificada con
MDA, y 0,07 ng/ml (nanogramos/mililitro) para la troponina I. Sin
embargo, si por ejemplo, se incluye un detergente no iónico como
Tween 20 (monolaurato de polioxietilensorbitán, Sigma Chemical
Company) en la disolución tampón (la disolución de PBS) con la que
se incuba el material que contienen LDL (por ejemplo, plasma,
patrón o control) (por ejemplo, en una concentración en la
disolución tampón de hasta aproximadamente 1% p/v [peso/volumen],
parece que un valor en el intervalo desde aproximadamente 0,2% p/v
a 0,6% p/v es óptimo), los valores de OxLDL y LDL modificada con
MDA pueden aumentar significativamente, en cuyo caso los
respectivos puntos de corte deben aumentar. Sin querer limitarse
por ninguna teoría, se cree que un detergente no iónico separa la
porción de proteína de la porción de lípido de OxLDL y LDL
modificada con MDA, que los anticuerpos monoclonales preferidos
mAb-4E6 y mAb-1H11 se dirigen a
epitopos sobre la porción de proteína, y que la eliminación de la
porción de lípido de la porción de proteína elimina el impedimento
estérico y permite que el anticuerpo se una a más sitios sobre la
misma porción de proteína, aumentando, con ello, la cantidad total
de anticuerpo que se une a una cantidad dada de OxLDL o LDL
modificada con MDA. Por tanto, se ha observado que el uso de Tween
20 en una concentración de 0,25 p/v a 0,6% p/v en el tampón con una
muestra de plasma recién extraída aumenta la cantidad registrada de
OxLDL en la muestra en un factor de más de 10, cuando se compara
con la no utilización de Tween 20 en el tampón para la misma
cantidad de muestra del mismo plasma. Esto resulta deseable,
porque, en términos generales, si se tiene un amplio intervalo para
un marcador cuya presencia por encima de un valor predeterminado en
un ensayo indica la presencia de una enfermedad, trastorno o
síndrome, se aumenta la precisión del ensayo.
Claims (11)
1. Un método que tiene un grado clínicamente
suficiente de precisión diagnóstica para detectar la presencia y
para distinguir entre las etapas no agudas y agudas de la
enfermedad de la arteria coronaria en un paciente humano de la
población general, siendo las etapas no agudas de la enfermedad de
la arteria coronaria la enfermedad de la arteria coronaria
asintomática y la angina estable, y siendo las etapas agudas de la
enfermedad de la arteria coronaria la angina inestable y el infarto
agudo de miocardio, comprendiendo el método realizar la etapa (b) y
realizar al menos una de las etapas (a) y (c):
(a) ensayar una muestra del paciente para
detectar la presencia clínicamente significativa de un primer
marcador, cuya presencia por encima de un nivel predeterminado
indica, con un grado muy alto de precisión diagnóstica, la
presencia de la enfermedad de la arteria coronaria, comprendiendo el
primer marcador OxLDL que contiene al menos 60 restos lisina
sustituidos por resto de apo B-100;
(b) ensayar una muestra de un paciente para
detectar la presencia clínicamente significativa de un segundo
marcador, cuya presencia por encima de un nivel predeterminado
indica, con un grado muy alto de precisión diagnóstica, la
presencia de una etapa aguda de la enfermedad de la arteria
coronaria, comprendiendo el segundo marcador LDL modificada con MDA
que contiene al menos 60 restos lisina sustituidos por resto de apo
B-100; y
(c) ensayar una muestra de un paciente para
detectar la presencia clínicamente significativa de un tercer
marcador, cuya presencia por encima de un nivel predeterminado
indica, con un grado alto de precisión diagnóstica, la presencia de
un infarto agudo de miocardio, comprendiendo el tercer marcador una
proteína cardíaca;
(d) siendo el diagnóstico, basado en los
resultados de la etapa (b) y al menos una de las etapas (a) y
(c):
- (i)
- la ausencia de la enfermedad de la arteria coronaria si ninguno del primer, segundo y tercer marcador está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado;
- (ii)
- una enfermedad de la arteria coronaria no aguda si el primer marcador, pero no el segundo ni el tercer marcador, está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado;
- (iii)
- una angina inestable si cada uno del primer y segundo marcador, pero no el tercer marcador, está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado;
- (iv)
- un infarto agudo de miocardio de origen aterosclerótico si cada uno del primer, segundo y tercer marcador está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado; y
- (v)
- un infarto agudo de miocardio de origen no aterosclerótico si ninguno del primer y segundo marcador, pero sí el tercer marcador, está presente por encima de su respectivo nivel predeterminado.
2. El método de la reivindicación 1, en el que se
realiza la etapa (c).
3. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se realiza la etapa (a).
4. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (a) utiliza un
primer ensayo inmunológico para indicar la presencia clínicamente
significativa del primer marcador y/o la etapa (b) utiliza un
segundo ensayo inmunológico para indicar la presencia clínicamente
significativa del segundo marcador.
5. El método de la reivindicación 4, en el que el
primer ensayo inmunológico es un primer ensayo "sandwich" para
indicar la presencia clínicamente significativa del primer marcador
y/o el segundo ensayo inmunológico es un segundo ensayo
"sandwich" para indicar la presencia clínicamente significativa
del segundo marcador.
6. El método de la reivindicación 4, en el que el
primer ensayo inmunológico utiliza un primer anticuerpo monoclonal
que tiene una alta afinidad por el primer marcador y/o el segundo
ensayo inmunológico utiliza un segundo anticuerpo monoclonal que
tiene una alta afinidad por el segundo marcador.
7. El método de la reivindicación 6, en el que el
primer anticuerpo monoclonal tiene una afinidad por el primer
marcador de al menos aproximadamente 1 x 10^{10} M^{-1} y/o el
segundo anticuerpo monoclonal tiene una afinidad por el segundo
marcador de al menos aproximadamente 1 x 10^{10} M^{-1}.
8. El método de la reivindicación 6 ó 7, en el
que el anticuerpo monoclonal utilizado en el ensayo de la etapa (a)
se selecciona del grupo que consiste en mAb-4E6 y
mAb-8A2 y/o el anticuerpo monoclonal utilizado en el
ensayo de la etapa (b) se selecciona del grupo que consiste en
mAb-4E6, mAb-1H11 y
mAb-8A2; siendo producidos los anticuerpos
monoclonales mAb-4E6, mAb-1H11 y
mAb-8A2, respectivamente, por los hibridomas
Hyb4E6, Hyb1H11 e Hyb8A2, que se depositaron el 24 de abril, 1997,
en el Belgian Coordinated Collections Of Microorganisms, con el
número de registro, respectivamente, de LMBP 1660 CB, LMBP 1659 CB y
LMBP 1661 CB.
9. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el tercer marcador se
selecciona del grupo que consiste en una troponina y
CK-MB.
10. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que en la etapa (a) la muestra
ensayada es una muestra de fluido, en la etapa (b) la muestra
ensayada es una muestra de fluido y/o en la etapa (c) la muestra
ensayada es una muestra de fluido.
11. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que en la etapa (a) la muestra
ensayada es una muestra de sangre completa, plasma o suero, en la
etapa (b) la muestra ensayada es una muestra de sangre completa,
plasma o suero y/o en la etapa (c) la muestra ensayada es una
muestra de sangre completa, plasma o suero.
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|---|---|---|---|
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