ES2237966T3 - Agentes de gnrh no peptidicos, metodos y compuestos intermedios para su preparacion. - Google Patents

Agentes de gnrh no peptidicos, metodos y compuestos intermedios para su preparacion.

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ES2237966T3 ES99968010T ES99968010T ES2237966T3 ES 2237966 T3 ES2237966 T3 ES 2237966T3 ES 99968010 T ES99968010 T ES 99968010T ES 99968010 T ES99968010 T ES 99968010T ES 2237966 T3 ES2237966 T3 ES 2237966T3
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Haresh N. Vazir
David Robert Luthin
Genevieve Deguzman Paderes
Ved P. Pathak
Lance Christopher Christie
Yufeng Hong
Eileen Valenzuela Tompkins
Haitao Li
James Faust
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Abstract

Un compuesto que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en **(Fórmula)** o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

Description

Agentes GnRH no peptídicos, métodos y compuestos intermedios para su preparación.
Campo técnico y aplicabilidad industrial de la invención
Esta invención se refiere en general a compuestos que afectan a la acción de la hormona humana liberadora de gonadotropina (GnRH). Más particularmente, se refiere a antagonistas o agonistas, no peptídicos de la GnRH y a su preparación. Estos agentes no peptídicos sobre la GnRH tienen ventajosas propiedades físicas, químicas y biológicas, y son medicamentos útiles para las enfermedades o procesos patológicos mediados por la modulación del eje hipófisis-gonadal. Los compuestos de la invención evitan los problemas de degradación y biodistribución de los agentes peptídicos.
Antecedentes de la invención
La hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), conocida también como hormona liberadora de la hormona luteinizante (LH-RH), desempeña un papel central en la biología de la reproducción. Se han utilizado una gran variedad de análogos para un número creciente de indicaciones clínicas. El decapéptido GnRH (piro-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH_{2} o p-EHWSYGLRPG-NH_{2}) se produce en las neuronas del hipotálamo basal medial a partir de un precursor más grande por procesos enzimáticos. El decapéptido se libera de una manera pulsátil en el sistema de circulación portal hipofisaria en el que la GnRH interactúa con los receptores de alta afinidad (receptores acoplados a proteínas G, caracterizados por siete dominios transmembranales) en la glándula hipofisaria anterior localizada en la base del cerebro. En la hipófisis, la GnRH desencadena la liberación de dos hormonas gonadotrópicas (gonadotropinas): hormona luteinizante (LH) y hormona estimuladora de folículos (FSH). En los testículos y ovarios, la LH estimula la producción de testosterona y estradiol, respectivamente. La FSH estimula el crecimiento folicular en las mujeres y la formación de esperma en los hombres. Cuando funciona correctamente, la liberación a pulsos y los niveles de concentración de GnRH son críticos para el mantenimiento de la esteroidogénesis gonadal y para las funciones normales de reproducción relacionadas con el crecimiento y desarrollo sexual.
La respuesta hipofisaria a la GnRH varía mucho a lo largo de la vida. La GnRH y las gonadotropinas aparecen por primera vez en el feto aproximadamente a las diez semanas de gestación. La sensibilidad a la GnRH decae, después de un breve aumento durante los tres primeros meses después del nacimiento, hasta el comienzo de la pubertad. Antes de la pubertad, la respuesta de la FSH a la GnRH es mayor que la de la LH. Una vez que empieza la pubertad, la sensibilidad a la GnRH aumenta, y va seguida de la secreción pulsátil de LH. Más tarde, en la pubertad y a lo largo de los años reproductivos, la liberación pulsátil de GnRH tiene lugar durante el día, siendo mayor el grado de respuesta de la LH que el de la FSH. La liberación pulsátil de GnRH da como resultado la liberación pulsátil de LH y FSH y por tanto la liberación de testosterona y estradiol desde las gónadas. Después de la menopausia, las concentraciones de LH y FSH aumentan y los niveles post-menopaúsicos de FSH son más altos que los de LH.
La administración crónica de agonistas y antagonistas de GnRH a los animales o al hombre da como resultado la reducción de los niveles circulantes tanto de LH como de FSH. Los agonistas de GnRH son compuestos que imitan a la GnRH endógena para estimular a los receptores de la glándula hipofisaria, dando como resultado la liberación de LH y FSH. Después de un aumento transitorio de la producción de hormona gonadal o respuesta "flare", la administración crónica de agonistas de GnRH produce una regulación por disminución de los receptores de GnRH. La regulación por disminución de los receptores de GnRH y la desensibilización de la hipófisis da cómo resultado una disminución de los niveles circulantes de LH y FSH. A pesar de la llamarada (flare) hormonal experimentada que exacerba los síntomas, los agonistas de GnRH han sido el tratamiento de elección para la patofisiologías dependientes de los esteroides sexuales. Por ejemplo, los agonistas de GnRH han sido usados para reducir la producción de testosterona, con lo que se reduce el volumen de la próstata en la hiperplaxia prostática benigna (BPH) y se hace más lento el crecimiento tumoral en el cáncer de próstata. Estos compuestos han sido usados también para tratar los cánceres de mama y de ovario.
Recientemente, los antagonistas de GnRH han llegado a estar disponibles para la evaluación clínica. Los antagonistas de GnRH tienen un efecto inmediato sobre la hipófisis sin observar el efecto flare asociado con los agonistas. El uso de antagonistas de GnRH (usualmente decapéptidos) ha sido registrado en la bibliografía para el tratamiento de los cánceres de mama, de ovario y de próstata. Otros usos de los antagonistas, igual que los agonistas, incluyen la endometriosis (incluyendo la endometriosis con dolor), mioma uterino, enfermedades quísticas de ovario y mama (incluyendo la enfermedad poliquística de ovario), hipertrofia prostática, amenorrea (por ejemplo amenorrea secundaria) y pubertad precoz. Estos compuestos pueden ser útiles también en el alivio sintomático del síndrome premenstrual (PMS). Además, los antagonistas pueden ser útiles para regular la secreción de gonadotropinas en los mamíferos machos para detener la espermatogénesis (por ejemplo, como anticonceptivos masculinos), y para el tratamiento de los delincuentes sexuales masculinos. De forma importante, los antagonistas de la GnRH (y los agonistas) han encontrado utilidad en tratamientos en los que se desea una depresión reversible del eje gonadal-hipofisario.
La presencia de receptores de GnRH en las células hipofisarias anteriores y varios tipos de células tumorales ofrece la oportunidad de desarrollar fármacos que actúan sobre estos receptores para tratar tanto los cánceres dependientes de las hormonas como los independientes de las hormonas.
Durante más de 50 años, la privación de andrógenos ha sido la terapia sistemática más efectiva para el tratamiento del carcinoma metastásico de la próstata. La justificación es sencilla, la glándula prostática requiere andrógenos para el crecimiento, mantenimiento y función apropiados. También, el cáncer de próstata y la hiperplaxia prostática benigna son comunes en los hombres y se desarrollan en un entorno de exposición continua a los andrógenos. Por tanto, la utilización de un antagonista de GnRH para interrumpir el eje hipofisario-gonadal reduce la producción de andrógenos y da como resultado la modulación del crecimiento tumoral. Además, los antagonistas de la GnRH pueden tener un efecto directo sobre el crecimiento tumoral mediante el bloqueo de los receptores sobre las células tumorales. Para estos tipos de cáncer que responden tanto a las hormonas sexuales como a la GnRH directamente, los antagonistas deben ser eficaces para retrasar el crecimiento tumoral por dos mecanismos. Puesto que los receptores de GnRH están presentes en muchas células de los cánceres de próstata y de mama, recientemente se ha considerado que los antagonistas de GnRH pueden ser también eficaces en el tratamiento de los tumores no dependientes de hormonas. Ejemplos de publicaciones recientes indican que los receptores de GnRH están presentes en muchas líneas de células cancerosas, incluyendo:
\bullet
Cáncer de próstata: los agonistas de la GnRH ejercen tanto in vitro como in vivo una acción inhibidora directa sobre el crecimiento de las líneas celulares de cáncer de próstata humano tanto el dependiente de andrógenos (LNCaP) como el independiente de andrógenos (DU 145). Montagnani et al., Arch. Ital. Urol. Androl. 1997, 69(4), 257-263. Los antagonistas de GnRH inhiben el crecimiento del cáncer de próstata PC-3 dependiente de andrógenos en los ratones atímicos. Jungwirth et al., Prostate 1997, 32(3), 164-172.
\bullet
Cáncer de ovario: la demostración de receptores de GnRH en los cánceres de ovario humanos proporciona una justificación para el uso de métodos terapéuticos basados en análogos de GnRH en este tumor maligno. Srkalovic et al., Int. J. Oncol. 1998, 12(3), 489-498.
\bullet
Cáncer de mama: el cáncer de mama es el tipo más común de cáncer en las mujeres mayores de 40 años y es la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en las mujeres. La intervención endocrina sistemática representa una opción principal de tratamiento para el caso de cáncer de mama avanzado, especialmente con los cánceres dependientes de estrógenos. Los genes de la hormona liberadora de gonadotropina y su receptor se expresan en la mama humana con enfermedad fibroquística y cáncer. Kottler et al., Int. J. Cancer 1997, 71(4), 595-599.
Hasta ahora, los antagonistas de GnRH disponibles han sido principalmente péptidos análogos de GnRH. Véase por ejemplo, la Publicación Internacional No. WO 93/03058. Los antagonistas peptídicos de las hormonas peptídicas son a menudo bastante potentes; sin embargo, el uso de antagonistas peptídicos está típicamente asociado con problemas porque los péptidos se degradan por las enzimas fisiológicas y a menudo se distribuyen pobremente dentro del organismo a ser tratado. Por tanto, tienen una eficacia limitada como fármacos. Por consiguiente, actualmente existe la necesidad de antagonistas no peptídicos de la hormona peptídica GnRH.
Sumario de la invención
Un objetivo de la invención es desarrollar antagonistas de GnRH no peptídicos de molécula pequeña, que se aprovechan de los dos mecanismos de acción descritos antes. Los agentes de GnRH no peptídicos tienen propiedades físicas, químicas y biológicas ventajosas en comparación con los peptídicos, y serán medicamentos útiles para enfermedades mediadas por el eje hipofisario-gonadal y se dirigen directamente al receptor sobre las células tumorales. Existe la necesidad de desarrollar fármacos que actúan sobre estos receptores para tratar tanto los cánceres dependientes de hormonas como los independientes de las hormonas.
Otro objetivo de la invención es proporcionar compuestos no peptídicos que son agentes sobre la GnRH (agonistas o antagonistas) que se unen a los receptores de GnRH y de este modo modulan su actividad, especialmente aquellos que son potentes antagonistas de GnRH. Otro objetivo de la invención es proporcionar terapias eficaces para individuos que necesitan la regulación terapéutica de la GnRH y proporcionar métodos para la fabricación de medicamentos para tratar enfermedades y procesos patológicos mediados por la regulación de la GnRH.
Tales objetivos han sido alcanzados por los compuestos de GnRH no peptídicos de la invención, que son útiles como productos farmacéuticos para indicaciones mediadas por la regulación de GnRH. Los compuestos de la invención son farmacéuticamente ventajosos en relación con los compuestos peptídicos ya que proporcionan mejor biodistribución y tolerancia a la degradación por las enzimas fisiológicas. La invención proporciona además métodos de síntesis de los compuestos así como compuestos intermedios útiles para fabricar los compuestos.
La invención se refiere a un compuesto que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en
1
2
y
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Los compuestos preferidos de la invención incluyen:
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incluyendo ambos isómeros, cis y trans, en el sustituyente ciclohexilo;
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especialmente el
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isómero
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7 
\newpage
En adición a los compuestos de las fórmulas anteriores, los agentes de GnRH de la invención incluyen las sales farmacéuticamente aceptables de tales compuestos. Tales agentes no peptídicos son farmacéuticamente ventajosos en relación con los agentes peptídicos ya que proporcionan mejor biodistribución y tolerancia a la degradación por las enzimas fisiológicas.
La invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de GnRH de la invención en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Además, la invención se refiere al uso de los agentes de GnRH de la invención para la fabricación de un medicamento para regular la secreción de gonadotropinas en los mamíferos.
Otras características, objetivos y ventajas de la invención quedarán más claras a partir de la siguiente descripción detallada de la invención y de sus realizaciones preferidas.
Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas
Algunos de los compuestos de la invención contienen uno o más centros de asimetría, y por tanto pueden tener enantiómeros, diastereoisómeros, y otras formas estereoisómeras. La invención se considera que incluye todos estos posibles estereoisómeros así como sus formas racémicas y ópticamente puras. Cuando los compuestos descritos aquí contienen dobles enlaces olefínicos, se considera que ellos engloban ambos isómeros geométricos, E y Z.
Las fórmulas químicas indicadas aquí pueden presentar el fenómeno del tautomerismo. Como las fórmulas estructurales que se muestran en esta memoria descriptiva solamente representan una de las posibles formas tautómeras, se debe entender sin embargo, que la invención engloba todas las formas tautómeras.
En adición a los compuestos de las fórmulas anteriores, los agentes de GnRH de la invención incluyen las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de las fórmulas anteriores. Tales agentes no peptídicos son farmacéuticamente ventajosos en relación con los agentes peptídicos ya que proporcionan mejor biodistribución y tolerancia a la degradación por las enzimas fisiológicas.
Adicionalmente, las fórmulas anteriores, se destinan a cubrir, cuando es aplicable, las formas solvatadas así como las no solvatadas de los compuestos. Por tanto, las fórmulas anteriores incluyen los compuestos que tienen la estructura indicada, incluyendo las formas hidratadas así como las no hidratadas.
Como se ha indicado antes, los agentes de GnRH de acuerdo con la invención incluyen también las formas tautómeras y estereoisómeras activas de los compuestos de las fórmulas anteriores, que se pueden obtener fácilmente usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los isómeros ópticamente activos (R) y (S) se pueden preparar mediante una síntesis estereoespecífica, por ejemplo, usando sintones quirales y reactivos quirales, o se pueden resolver las mezclas racémicas usando técnicas convencionales.
Los agentes de GnRH incluyen además formas multivalentes o multiméricas de las formas activas de los compuestos de las fórmulas anteriores. Tales "multímeros" se pueden preparar ligando o poniendo múltiples copias de un compuesto activo en estrecha proximidad una de otra, por ejemplo, usando un soporte proporcionado por un resto portador. Se pueden ensayar multímeros de diferentes dimensiones (esto es, que llevan números variables de copias de un compuesto activo) para llegar a un multímero de tamaño óptimo con respecto a la unión al receptor. La provisión de tales formas multivalentes de compuestos activos que se unen al receptor con un espaciamiento óptimo entre los restos que se unen al receptor puede mejorar la unión al receptor (véase, por ejemplo, Lee et al., Biochem., 1984, 23:4255). El técnico puede controlar la multivalencia y el espaciamiento mediante la selección de un resto portador adecuado o unidades ligantes. Los restos útiles incluyen soportes moleculares que contienen una multiplicidad de grupos funcionales que se pueden hacer reaccionar con grupos funcionales asociados con los compuestos activos de la invención. Se puede usar una variedad de restos portadores para preparar multímeros altamente activos, incluyendo proteínas tales como BSA (seroalbúmina bovina) o HAS, péptidos tales como pentapéptidos, decapéptidos, pentadecapéptidos, y similares, así como compuestos no biológicos seleccionados por sus efectos beneficiosos sobre la absorbabilidad, transporte, y persistencia dentro del organismo diana. Los grupos funcionales sobre el resto portador, tales como los grupos amino, sulfhidrilo, hidroxilo, y alquilamino, se pueden seleccionar para obtener ligamientos estables con los compuestos de la invención, espaciamiento óptimo entre los compuestos inmovilizados, y propiedades biológicas óptimas.
Adicionalmente, los agentes de GnRH de la invención incluyen las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de las fórmulas anteriores. El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a las formas salinas que son farmacológicamente aceptables y sustancialmente no tóxicas para el sujeto al que se administra el agente de GnRH. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácido o sales de adición de base convencionales formadas a partir de ácidos orgánicos o inorgánicos o bases inorgánicas, no tóxicos. Ejemplos de sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfámico, ácido fosfórico, y ácido nítrico, y las derivadas de ácidos orgánicos tales como ácido p-toluenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido etano-disulfónico, ácido isetiónico, ácido oxálico, ácido p-bromofenilsulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido acético, ácido fenilacético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido esteárico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido ascórbico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido glutámico, ácido salicílico, ácido sulfanílico, y ácido fumárico. Ejemplos de sales de adición de base incluyen las derivadas de hidróxidos de amonio (por ejemplo un hidróxido de amonio cuaternario tal como hidróxido de tetrametilamonio), las derivadas de bases inorgánicas tales como hidróxidos de metales alcalinos o alcalino-térreos (por ejemplo, sodio, potasio, litio, calcio o magnesio), y las derivadas de bases orgánicas tales como aminas, bencilaminas, piperidinas, y pirrolidinas.
Se pueden emplear una variedad de ensayos y técnicas conocidos para determinar el nivel de actividad de diferentes formas de los compuestos en el sistema de la GnRH. Los ensayos de unión del ligando se usan para determinar la interacción con el receptor de interés. Cuando la unión es de interés, se puede usar un receptor marcado, en el que la marca es un fluorescente, enzima, radioisótopo o similares que registra un cambio cuantificable después de la unión del receptor. Alternativamente, el técnico puede proporcionar un anticuerpo frente al receptor, en el que el anticuerpo está marcado, lo que puede permitir la amplificación de la señal. También se puede determinar la unión mediante el desplazamiento competitivo de un ligando unido al receptor, en el que el ligando está marcado con una marca detectable. Cuando la actividad agonista y/o antagonista es de interés, se puede estudiar un organismo o célula intactos y se puede medir el cambio de una función celular o del organismo en respuesta a la unión del compuesto de interés. Para detectar la respuesta celular hay disponibles varios dispositivos, tales como un microfisiómetro disponible de Molecular-Devices, Redwood City, California. Los ensayos in vitro e in vivo útiles para medir la actividad antagonista de GnRH son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Bowers et al., "LH suppression in cultured rat pituitary cells treated with 1 ng of LHRH" Endocrinology, 1980, 106: 675-683 (in vitro) and Corbin et al., "Antiovulatory activity (AOA) in rats", Endocr. Res. Commun. 1975, 2: 1-23 (in vivo). Los protocolos de ensayo particulares que se pueden usar se describen más adelante.
Por ejemplo, los antagonistas del receptor de GnRH se pueden evaluar funcionalmente midiendo el cambio en las tasas de acidificación extracelular como sigue. La capacidad de los compuestos para bloquear la tasa de acidificación extracelular mediada por GnRH en células HEK293 que expresan los receptores de GnRH humanos se determina como una medida de la actividad antagonista del compuesto in vitro. Aproximadamente 100.000 células/cámara se inmovilizan en medio de suspensión de agarosa (Molecular Devices) y se perfunden con medio MEM sin tamponar utilizando el microfisiómetro Cytosensor®Microphysiometer (Molecular Devices). Se deja que se equilibren las células hasta que la tasa de acidificación basal permanece estable (aproximadamente una hora). Se realizan las curvas de control dosis-respuesta para GnRH (10^{-11} M a 10^{-7} M). Se deja incubar a los compuestos 15 minutos antes de la estimulación con GnRH, y se evalúan en cuanto a la actividad antagonista. Después de incubación con los compuestos de ensayo, se obtienen las curvas dosis-respuesta repetidas para GnRH en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de los compuestos de ensayo. Se realiza el análisis de regresión de Schild sobre los compuestos para determinar si los compuestos antagonizan los aumentos mediados por la GnRH en las tasas de acidificación extracelular a través de una interacción competitiva con el receptor de GnRH.
En otro ensayo, se puede medir la acumulación de fosfatos de inositol totales mediante la extracción de las células con ácido fórmico, seguido por la separación de los fosfatos sobre columnas Dowex. Las células se escinden usando tripsina en dos placas de 12 pocillos y se pre-marcan con ^{3}H-mioinositol (0,5 Ci - 2 mCi por ml) durante 16-18 horas en medio libre de inositol. Se aspira después el medio y se lavan las células o con HBSS 1X, HEPES 20 mM (pH 7,5) o con DMEM libre de suero, HBSS 1X, HEPES 20 mM (pH 7,5) que contiene el agonista, y después se añade LiCl 20 mM y se incuban las células durante el tiempo deseado. Se aspira el medio y se detiene la reacción por la adición de ácido fórmico 10 mM enfriado con hielo, lo que sirve también para extraer los lípidos celulares. Se separan los fosfatos de inositol por cromatografía de cambio iónico en columnas Dowex, que se lavan después con 5 ml de mioinositol 10 mM y ácido fórmico 10 mM. Se lavan después las columnas con 10 ml de formiato de sodio 60 mM y bórax 5 mM, y se eluyen los fosfatos de inositol totales con 4,5 ml de formiato de amonio 1 M, ácido fórmico 0,1 M.
Los agentes de GnRH de la invención preferidos incluyen los que tienen un valor K_{i} de aproximadamente 10 \muM o menor. Los agentes de GnRH de la invención especialmente preferidos son los que tienen un valor K_{i} en el intervalo nanomolar.
Los compuestos preferidos de la invención se muestran en la siguiente tabla:
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Las composiciones farmacéuticas según la invención comprenden una cantidad reductora de la GnRH eficaz de al menos un agente de GnRH según la invención y un excipiente o diluyente inerte o farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se pueden preparar en una forma farmacéutica unitaria apropiada para el modo de administración deseado, por ejemplo, parenteral u oral.
Para tratar enfermedades o procesos patológicos mediados por el agonismo o antagonismo de la GnRH, se administra una composición farmacéutica de la invención en una formulación adecuada preparada combinando una cantidad terapéuticamente eficaz (esto es, una cantidad moduladora de la GnRH efectiva para conseguir la eficacia terapéutica), de al menos un agente de GnRH de la invención (como un ingrediente activo) con uno o más excipientes o diluyentes farmacéuticamente adecuados. Tales formulaciones se pueden preparar según procedimientos convencionales, por ejemplo, mezclando, granulando y comprimiendo o disolviendo apropiadamente los ingredientes de las maneras conocidas. Opcionalmente, se pueden emplear en una composición farmacéutica uno o más ingredientes activos diferentes, tales como diferentes antagonistas de GnRH.
El excipiente farmacéutico puede ser sólido o líquido. Ejemplos de excipientes sólidos incluyen lactosa, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio, ácido esteárico, y similares. Ejemplos de excipientes líquidos son jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, agua y similares. Similarmente, el excipiente o diluyente puede incluir materiales de liberación retardada o controlada conocidos en la técnica, tales como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solos o en combinación con una cera, etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilmetacrilato, o similares.
Se pueden emplear una variedad de formas farmacéuticas. Por ejemplo, si se usa un excipiente sólido, la preparación puede estar en forma de comprimidos, cápsulas de gelatina dura, polvos, pelets, pastillas o comprimidos para chupar. La cantidad de excipiente sólido puede variar ampliamente, con una cantidad que varía por ejemplo desde aproximadamente 25 mg hasta aproximadamente 1 g. Se usa un excipiente líquido, la preparación puede estar en forma de un jarabe, emulsión, cápsula de gelatina blanda, solución o suspensión inyectable estéril, en una ampolla o vial, o una suspensión líquida no acuosa.
Para obtener una forma farmacéutica soluble en agua, estable, se puede disolver una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto que tiene una de las fórmulas anteriores en una solución acuosa de un ácido orgánico o inorgánico, tal como solución 0,3 M de ácido succínico o más preferiblemente, ácido cítrico. Si no se dispone de una forma salina soluble, se puede disolver el agente en uno o más codisolventes adecuados. Ejemplos de codisolventes adecuados incluyen alcohol, propilenglicol, polietilenglicol 300, polisorbato 80, glicerina, y similares en concentraciones que varían de 0% a 60% del volumen total. En un ejemplo de realización, un compuesto que tiene una de las fórmulas anteriores se disuelve en DMSO y se diluye con agua. La composición puede estar también en la forma de una solución de una forma salina de un compuesto que tiene una de las fórmulas anteriores en un vehículo acuoso apropiado, tal como agua, o solución salina isotónica o soluciones de dextrosa.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar usando técnicas convencionales, por ejemplo, procedimientos de mezcla, disolución, granulación, grageado, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento, o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de una manera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes o productos auxiliares seleccionados para facilitar la elaboración de los compuestos activos en preparaciones farmacéuticas. La formulación apropiada se selecciona según la vía de administración elegida.
Para preparar preparaciones inyectables, los agentes de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en soluciones tampón fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hanks, solución de Ringer, o solución tampón salina fisiológica. Para la administración transmucosal, se usan en la formulación penetrantes apropiados para que sea penetrada la barrera y pueden ser seleccionados entre los conocidos en la técnica.
Para administración oral, los agentes se pueden formular fácilmente combinando el ingrediente o ingredientes activos con excipientes farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica. Tales excipientes permiten que los compuestos de la invención sean formulados como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones, y similares, para ingestión oral por el paciente a ser tratado. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener combinando uno o más agentes con un excipiente sólido, opcionalmente triturando la mezcla resultante en gránulos, y elaborando la mezcla de gránulos después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados incluyen agentes de carga tales como azúcares (por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol) y preparaciones de celulosa (por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes, tales como PVP reticulada, agar, o ácido algínico o una de sus sales tales como alginato de sodio.
Los núcleos de las grageas se recubren con cubiertas adecuadas. Para este propósito, se pueden usar soluciones concentradas de azúcar que pueden contener opcionalmente goma arábiga, PVP, gel Carbopol™, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones lacantes, y/o uno o más disolventes orgánicos adecuados. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de las grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis del compuesto activo.
Las formas farmacéuticas que son adecuadas para la administración oral incluyen cápsulas con cierre a presión hechas de gelatina, así como las cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de gelatina dura (push-fit) pueden contener el ingrediente o ingredientes activos en mezcla con uno o más agentes de carga tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubrificantes tales como talco o estearato de magnesio, y opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, se puede disolver o suspender el compuesto activo en un líquido adecuado, tal como aceite graso, parafina líquida, o polietilenglicol líquido. Además, se pueden añadir estabilizantes. Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o comprimidos para chupar formulados de una manera convencional.
Para la administración por inhalación, los compuestos para uso según la presente invención se pueden suministrar convenientemente en la forma de una presentación en pulverización de aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono, u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis se puede determinar mediante una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas o cartuchos de gelatina, por ejemplo, para uso en un inhalador o insuflador, se pueden formular conteniendo una mezcla en polvo del agente y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Los agentes se pueden formular para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en embolada o por perfusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden preparar en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas, o en envases multi-dosis con la adición de un conservante. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones inyectables oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas.
Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstitución con un disolvente adecuado, por ejemplo agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. Los compuestos se pueden formular también como composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases convencionales de supositorios tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
En adición a las formulaciones descritas antes, los compuestos pueden ser formulados también como una preparación retardada. Tales formulaciones que actúan a largo plazo se pueden administrar por implantación (por ejemplo subcutáneamente o intramuscularmente) o por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, se pueden formular los compuestos con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de cambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.
Un ejemplo de vehículo farmacéutico para los compuestos hidrófobos de la invención es un sistema de codisolventes que comprende alcohol bencílico, un tensioactivo no polar, un polímero orgánico miscible en agua, y una base acuosa. El sistema de codisolventes puede ser el sistema codisolvente VPD (VPD es una solución de 3% p/v de alcohol bencílico, 8% p/v del tensioactivo no polar polisorbato 80, y 65% p/v de polietilenglicol 300, llevado a volumen con etanol absoluto). El sistema codisolvente VPD (VPD:5W) comprende VDP diluido 1:1 con una solución de dextrosa al 5% en agua. Este sistema codisolvente disuelve bien los compuestos hidrófobos, y la formulación resultante produce baja toxicidad tras la administración sistémica. Como se puede ver, las proporciones de un sistema codisolvente adecuado se pueden variar dependiendo de las características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes del codisolvente puede ser variada: por ejemplo, se pueden usar otros tensioactivos no polares de baja toxicidad en lugar del polisorbato 80; el tamaño de la fracción de polietilenglicol puede ser variado; se pueden añadir uno o más de otros polímeros biocompatibles (por ejemplo, PVP) o reemplazar el polietilenglicol; y otros azúcares o polisacáridos pueden reemplazar a la dextrosa.
Alternativamente, se pueden emplear otros sistemas de preparación para los compuestos farmacéuticos hidrófobos. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos conocidos de vehículos o excipientes de liberación para fármacos hidrófobos y se pueden usar para formular preparaciones adecuadas. Se pueden emplear también ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilsulfóxido, aunque esto puede causar un aumento de la toxicidad. Adicionalmente, se puede conseguir la administración usando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el agente terapéutico. Hay disponibles diferentes materiales de liberación sostenida y son conocidos por los expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida, dependiendo de su naturaleza química, pueden liberar los compuestos durante un periodo que va desde unas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y de la estabilidad biológica del agente terapéutico, se pueden emplear fácilmente técnicas adicionales para estabilización proteínica.
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender también vehículos o excipientes de fase sólida o gel. Ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como polietilenglicoles.
Alguno de los compuestos de la invención se pueden proporcionar como sales con contra-iones farmacéuticamente compatibles. Las sales farmacéuticamente aceptables se pueden formar con muchos ácidos, incluyendo los ácidos clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, y similares. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros disolventes protónicos que lo son las correspondientes formas de base libre.
Se podrá apreciar que las dosis reales de los agentes usados en las composiciones de la invención variarán según el complejo particular que usa, la particular composición formulada, el modo de administración, y el sitio particular, hospedante y enfermedad que se trata. Las dosis óptimas para un conjunto dado de condiciones pueden ser determinadas por los expertos en la técnica usando ensayos convencionales de determinación de la dosis en vista de los datos experimentales para un compuesto dado. Para la administración oral, un ejemplo de dosis diaria empleada generalmente va desde aproximadamente 0,001 hasta aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal, con tratamientos repetidos a intervalos apropiados. La administración de profármacos se puede dosificar a niveles de peso que son químicamente equivalentes a los niveles de peso de los compuestos totalmente activos.
Ejemplos de preparaciones farmacéuticas específicas de acuerdo con la invención se proporcionan a continuación.
Composición parenteral: para preparar una composición farmacéutica de esta invención adecuada para administración por inyección, se disuelven en DMSO 100 mg de una sal farmacéuticamente aceptable, soluble en agua, de un compuesto que tiene una de las fórmulas anteriores y después se mezcla con 10 ml de solución salina al 0,9% estéril. La mezcla resultante se incorpora a una forma farmacéutica unitaria adecuada para administración por inyección.
Composición oral: para preparar una composición farmacéutica administrable oralmente, se mezclan 100 mg de un compuesto que tiene una de las fórmulas anteriores con 750 mg de lactosa. La mezcla resultante se incorpora a una forma farmacéutica unitaria adecuada para administración oral, tal como una cápsula de gelatina dura.
Síntesis de reactivos y compuestos de GnRH A. Ejemplo del bloque de construcción
Bloques de construcción basados en naftaleno: se prepara un agente acilante útil mediante alquilaciones secuenciales de Friedel-Crafts y se muestra a continuación:
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El compuesto 2 se puede preparar como sigue:
Se añadió 2,5-dimetil-2,5-hexanodiol (200 gramos, 1,37 mol) como una porción sólida a 3 litros de ácido clorhídrico concentrado en un matraz Erlenmeyer grande. El diol se disolvió rápidamente en el ácido clorhídrico y el producto deseado 2,5-dicloro-2,5-dimetilhexano precipitó en la solución según se iba formando. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 4 horas. Se añadió un litro de acetato de etilo al 50% en hexano y se separó la capa orgánica y se lavó varias veces con agua (hasta que fue neutra al papel de pH). Se separaron los disolventes orgánicos en vacío a temperatura ambiente. El 2,5-dicloro-2,5-dimetilhexano crudo se disolvió en hexano y se pasó a través de un lecho de gel de sílice (relación 10:1) y se eluyó con hexano. Esta etapa de filtración final da un sólido blanco después de la separación del disolvente orgánico en vacío. La recuperación de 2,5-dicloro-2,5-dimetilhexano puro fue de 230 gramos, 92% de rendimiento. ^{1}H NMR(CDCl_{3}, \delta): 1,96 (4H, s); 1,61 (12H,s).
Usando un procedimiento similar el 2,4-dimetil-2,4-pentanodiol se convirtió en 2,4-dicloro-2,4-dimetilpentano. ^{1}H NMR(CDCl_{3}, \delta): 2,42 (2H, s); 1,73 (12H, s).
1,1,4,4,6-Pentametil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno 4: A una solución de 2,5-dicloro-2,5-dimetilhexano 2 (10 g, 54.7 mmol) en tolueno (270 ml, 0,2 M) se añade lentamente tricloruro de aluminio (5,47 g, 41 mmol) como un sólido a lo largo de un periodo de 15 minutos. La reacción es completa después de 10 minutos como se determina por TLC en hexano. El tricloruro de aluminio sin reaccionar se sofoca lentamente con agua durante 10 minutos. Se añade tolueno adicional (250 ml) para extraer el producto de la capa acuosa. Se pasa la capa orgánica a través de un lecho de gel de sílice (40 g) y se eluye con tolueno. Se evapora la capa orgánica en vacío hasta sequedad para dar 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno 4 (11 g, 97% de rendimiento). NMR 1,29 (s, 6H), 1,28 (s, 6H), 1,69 (s, 4H), 2,32 (s, 3H), 7,22 (d, 1H), 7,12 (s, 1H), 6,97 (dd, 1H).
5-[(3,5,5,8,8-Pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoato de metilo 6: A una solución que contiene 1,1,4,4,6-pentametil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno 4 (20 g, 99 mmol) y 5-(clorometil)-2-furoato de metilo 5 (17,28 g, 99 mmol) en cloruro de metileno (500 ml, 0,2 M), se añade lentamente tricloruro de aluminio (16,46 g, 124 mmol) como un sólido a la temperatura de reflujo de cloruro de metileno. Se mantiene la solución a reflujo durante dos horas más. Se hace seguimiento de la reacción por TLC en solución de acetato de etilo al 10% en hexano. Se enfría la reacción a temperatura ambiente y el tricloruro de aluminio sin reaccionar se sofoca con agua durante 15 minutos. Se extrae el producto crudo con cloruro de metileno y se pasa a través de gel de sílice (80 g) y se eluye con cloruro de metileno. Se evapora el disolvente en vacío hasta un jarabe. Se purifica el producto crudo con gel de sílice (300 g) a través de una columna de filtración. El 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoato de metilo 6 se eluye con acetato de etilo al 2% en hexano para obtener 15,4 g (46% de rendimiento). NMR 1,25 (s, 6H), 1,28 (s, 6H), 1,67 (s, 4H), 2,23 (s, 3H), 3,89 (s, 3H), 3,97 (s, 2H), 5,95 (d, 1H), 7,09 (m, 3H).
Ácido 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoico 7: A una solución que contiene 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoato de metilo 6 (15,1 g, 44 mmol) en MeOH (175 ml) y agua (175 ml), se añade una solución de NaOH (3,53 g, 88,3 mmol) en agua (29 ml). Se agita la mezcla de reacción durante la noche. Una vez completada como se comprueba por TLC, se acidifica la solución con HCl 1 M hasta pH 2. Se extrae el producto crudo en una capa orgánica usando acetato de etilo y se concentra para obtener el ácido 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoico 7 (15,0 g, 99% de rendimiento). NMR 1,26 (s, 6H), 1,28 (s, 6H), 1,68 (s, 4H), 2,24 (s, 3H), 4,00 (s, 2H), 6,01 (d, 1H), 7,10 (s, 2H), 7,23 (d, 1H).
Cloruro de 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoilo 8: A una solución que contiene ácido 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoico 7 (20,15 g, 61,77 mmol) en cloruro de metileno (310 ml) se añade cloruro de tionilo (45 ml, 617 mmol). Se mantiene la reacción a reflujo durante 5 horas y se añade otro lote de cloruro de tionilo (45 ml, 617 mmol). Se agita la reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se concentra la solución hasta un jarabe y se pasa a través de un lecho de gel de sílice (50 g), se lava con hexano al 3% y se concentra en vacío para dar cloruro de 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoilo 8 (17 g, 80% de rendimiento). NMR 1,26 (s, 6H), 1,28 (s, 6H), 1,68 (s, 4H), 2,25 (s, 3H), 4,00 (s, 2H), 6,11 (d, 1H), 7,10 (s, 1H), 7,11 (s, 1H), 7,41 (d, 1H).
Se pueden preparar bloques de construcción adicionales en estas condiciones de reacción que contienen una variedad de grupos funcionales.
B. Ejemplos de acilación
El siguiente esquema muestra varios ejemplos que pueden usar el procedimiento sintético general para acilaciones que se da a continuación.
Ejemplos de reactivos de acoplamiento a Y 
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Las aminas se disuelven o suspenden en diclorometano, dicloroetano, acetato de etilo, acetonitrilo, o similares (concentración 0,2 M) seguido por la adición del reactivo cloruro de ácido (1,00 equivalentes mmol). Se añade a la mezcla trietilamina (5,00 equivalentes mmol) y se agita la reacción a temperatura ambiente durante 12-48 horas. Se separan los disolventes en vacío. Se purifica el producto por cromatografía en columna sobre gel de sílice y se eluye con un disolvente de elución apropiado (por ejemplo, hexano:acetato de etilo 3:1). Se separan los disolventes en vacío para dar el producto acilado.
Como una alternativa, la mezcla de reacción se diluye con diclorometano (cinco veces la cantidad de diclorometano usado) y se lava con bicarbonato de sodio saturado. La capa orgánica se seca sobre sulfato de magnesio y se filtra. Se purifica el producto por cromatografía en columna sobre gel de sílice y se eluye con un disolvente de elución apropiado (por ejemplo, hexano:acetato de etilo 3:1). Se separan los disolventes en vacío para dar el producto acilado.
Usando el protocolo general de reacción, se pueden preparar fácilmente gran número de los compuestos y se pueden ensayar en cuanto a sus actividades como materiales puros o impuros. El protocolo de reacción trabaja sobre anilinas, aminas, bencilaminas, hidrazinas, hidrazidas, alcoholes y similares.
Ejemplos específicos que muestran una variedad de estructuras aciladas según un procedimiento general se muestran a continuación:
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C. Síntesis y acilación de compuestos que contienen guanidina
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Etapa 1
Preparación del compuesto protegido por 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometilación
Las etapas 1(A) y 1(B) alternativas que siguen proporcionan dos procedimientos generales de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometilación.
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Etapa 1(A)
A una solución de diamina (2,00 equivalentes mmol) en THF (0,7 M) se añade una solución de 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoxicarbonil)carboxamidina) (1,00 equivalentes mmol) en THF (0,7 M). La solución se agita a temperatura ambiente durante 3 horas (h), o hasta que no se puede observar más transformación por TLC (cromatografía en capa fina). Se separa el disolvente a presión reducida para dar un residuo siruposo, que se recoge en acetato de etilo (\sim1,5 veces la cantidad de volumen de THF usado en la reacción o el volumen de disolvente necesario para disolver la cantidad de residuo obtenido) y se lava con agua hasta pH neutro. La capa orgánica se lava con salmuera, se seca sobre MgSO_{4}, y se concentra. Se purifica el producto por cromatografía en columna sobre gel de sílice y se eluye con un disolvente de elución apropiado (que puede ser determinado fácilmente, por ejemplo, usando MeOH al 5% en diclorometano como punto de partida). Se separan los disolventes en vacío para obtener la amina ligada a 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometilo. En adición se pueden usar otros reactivos para colocar una unidad de N,N'-diBoc-guanidina protegida sobre las diaminas, tal como 1,3-bis(terc-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudourea (CAS No. 107819-90-0). Alternativamente, se puede añadir 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoxicarbonil)carboxamidina) directamente como un sólido, en lugar de como una solución como se ha descrito antes.
Etapa 1(B)
A una solución de diamina (1,00 equivalentes mmol) en THF (0,07 M) se añade en porciones como un sólido (durante un periodo de tiempo de 10 minutos) 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoxi-carbonil)carboxamidina) (1,00 equivalentes mmol). La solución se agita a temperatura ambiente durante 0,5 horas. Se separa el disolvente a presión reducida para dar un residuo siruposo, que se recoge en acetato de etilo (0,5 veces la cantidad de volumen de THF usado en la reacción o el volumen de disolvente necesario para disolver la cantidad de residuo obtenido) y se lava dos veces con agua. Se separan las capas, y se purifica el producto por cromatografía en columna sobre gel de sílice y se eluye con acetato de etilo al 100% para separar todas las impurezas no polares y después con alcohol isopropílico al 100% para dar el producto puro. Se separan los disolventes en vacío para obtener el producto deseado. Las condiciones típicas de TLC son metanol/cloroformo/ácido acético 15:85:0,1. Los rendimientos típicos varían de 40% a 44% del compuesto protegido deseado.
Etapa 2
Aminación reductora (opcional)
La aminación reductora se puede realizar de una manera adecuada. Para la aminación reductora de aldehídos y cetonas con triacetoxiborohidruro de sodio, véase en general: Abdel-Magid et al., J. Org. Chem., 1996, 61:3849. Dos procedimientos alternativos de aminaciones reductoras se describen a continuación.
Etapa 2(A)
Se disuelven en metanol (0,09 M), 3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaldehído (1,00 equivalentes mmol) y amina ligada a 1-(N,N'-di-Boc)-guanidinometilo (1,00 equivalentes mmol). Después, se añade solución de ácido acético glacial al 1% en metanol (10% del volumen de metanol usado) seguido por NaCNBH_{3} (1,00 equivalentes mmol) y los contenidos de la reacción se agitan durante la noche. Se analiza la reacción por TLC para revelar tres componentes (aldehído, el producto deseado, y el derivado de guanidina de partida). La reacción se termina añadiendo agua (50% del volumen de metanol usado), se extrae con diclorometano (10 veces el volumen de metanol usado) y se lava con bicarbonato de sodio saturado. Se seca la capa orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra. Se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluye con un disolvente de elución apropiado (por ejemplo, acetato de etilo en hexano 3:1 para separar el aldehído sin reaccionar, seguido por la elución con acetato de etilo en hexano 1:1), obteniendo el producto deseado de la aminación reductora. En algunos casos, calentando a reflujo durante 2 horas se facilitará la reacción de formación de imina. Véase también, Abdel-Magid et al., J. Org. Chem., 1996, 61:3849, que describe la aminación reductora de aldehídos y cetonas con triacetoxiborohidruro de
sodio.
Etapa 2(B)
Se disuelven en metanol (0,09 M), 3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaldehído (1,00 equivalentes mmol) y amina ligada a 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometilo (1,00 equivalentes mmol). Después, se añade NaBH_{4} (1,00 equivalentes mmol) (en etanol mediante los procedimientos adicionales a pequeña escala dados más adelante, o cuidadosamente como un sólido) y se agitan los contenidos de la reacción durante la noche. Se analiza la reacción por TLC para revelar tres componentes (aldehído, el producto deseado y el derivado de guanidina de partida). Se termina la reacción por la adición de agua (50% del volumen de metanol usado), se extrae con diclorometano (10 veces el volumen de metanol usado), y se lava con bicarbonato de sodio saturado. Se seca la capa orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra. Se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluye con un disolvente de elución apropiado (como puede ser determinado fácilmente por un experto o, por ejemplo, con acetato de etilo en hexano 3:1 para separar el aldehído sin reaccionar, seguido por la elución con acetato de etilo en hexano 1:1), para obtener el producto deseado de la aminación reductora. En algunos casos, calentando a reflujo durante 2 horas se facilitará la reacción de formación de imina.
Etapa 3
Acilación
Se disuelven en diclorometano (\sim0,2 a 0,05 M, dependiendo de las solubilidades de los sustratos), los productos de la aminación reductora (1,00 equivalentes mmol), seguido por la adición de trietilamina (2,00 equivalentes mmol) y el reactivo cloruro de 2-furoilo 8 (1,00 equivalentes mmol). Se agitan los contenidos de la reacción durante la noche a temperatura ambiente (RT). Se diluye la mezcla de reacción con diclorometano (5 veces la cantidad de diclorometano usado), y se lava con bicarbonato de sodio saturado. Se seca la capa orgánica sobre sulfato de magnesio y se filtra. Se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluye con un disolvente de elución apropiado (por ejemplo, acetato de etilo en hexano 3:1). Se separan los disolventes en vacío para dar el producto acilado.
Etapa 4
Desprotección del grupo básico
Se disuelve el producto de la etapa de acilación (1,00 equivalentes mmol), en una solución de TFA al 25-50% en diclorometano (0,02 M), y se agitan los contenidos de la reacción a temperatura ambiente (15-20 minutos; la solución se pone de color naranja rojizo claro). Se agitan los contenidos de la reacción durante 1 hora y 20 minutos adicionales o hasta que la desprotección de BOC es completa. Se termina la reacción por concentración en vacío, seguida por la adición de agua/acetonitrilo (0,006 M) y liofilización durante la noche. Se purifica el compuesto final por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Se separan los disolventes en vacío (los rendimientos varían de 30% a 50%) para dar el producto.
En Miel et al., Tetrahedron Letters, 1997, 38: 7865-7866, se describe un procedimiento alternativo para separar las N,N'-bis-BOC-guanidinas usando tetracloruro de estaño, que puede dar las correspondientes sales de cloruro de guanidinio.
El compuesto 9 se puede preparar según las etapas descritas anteriormente con la exclusión de la etapa #2, como se muestra en el siguiente esquema:
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15 
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Preparación de los reactivos
Los reactivos útiles para sintetizar los compuestos pueden ser obtenidos o preparados según métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la preparación de las aminas libres a partir de las formas salinas comunes y la preparación de las soluciones stock de reactivos, pueden ser útiles para reacciones a pequeña escala. Véase también Abdel-Magid et al., "Reductive amination of aldehides and ketones with sodium triacetoxyborohydride", J. Org. Chem., 1996, 61: 3849.
Las soluciones metanólicas de las bases libres se pueden preparar a partir del hidrocloruro, dihidrocloruro, hidrobromuro u otras sales cuando la base libre es soluble en metanol. En este procedimiento, una vez que se añade el metóxido de sodio, se debe tener cuidado para evitar la exposición al aire, ya que las bases libres aminas, particularmente las aminas primarias, absorben dióxido de carbono del aire para formar sales. Se puede preparar una cantidad de 10 ml de una solución 0,1 M de una base libre en metanol como sigue. Se pesa 1,0 mmol de una sal monohidrocloruro en un matraz Erlenmeyer tarado con una barra de agitación, y se añaden 7 ml de metanol. A la suspensión en agitación, se añaden 229 ml (1,00 mmol, 1 equivalente) de metóxido de sodio en metanol (al 25% en peso, 4,37 M), se tapa el matraz, y se agita la mezcla vigorosamente durante 2 horas. La suspensión cambiará algunas veces de apariencia ya que se forma un precipitado lechoso fino, de cloruro de sodio. Se filtra la suspensión a través de un embudo de vidrio fritado medio de 15 ml, se lava el filtro con 1-2 ml de metanol, se transfiere el filtrado a un vial de 20 ml, y se diluye hasta 10 ml con metanol. La cantidad teórica de cloruro de sodio es aproximadamente 59 mg, pero usualmente la recuperación no es cuantitativa, debido a la poca solubilidad en metanol. Para una sal dihidrocloruro, se requiere un segundo equivalente de metóxido de sodio (458 ml).
Una solución 0,5 M de borohidruro de sodio se puede preparar como sigue. Se agita borohidruro de sodio (520 mg, 13,8 mmol) en etanol anhidro puro (no desnaturalizado) (25 ml) durante \sim2-3 minutos. Se filtra la suspensión a través de un embudo de vidrio fritado medio para separar una pequeña cantidad de sólido sin disolver (típicamente aproximadamente 5% de la masa total de borohidruro, o 25 mg). El filtrado debe aparecer como una solución incolora que desprende solamente algo de hidrógeno. Esta solución debe ser usada inmediatamente ya que se descompone significativamente a lo largo de un periodo de unas horas, dando como resultado la formación de un precipitado gelatinoso. El borohidruro de sodio es higroscópico, por lo que se debe evitar la exposición al aire preparando la solución inmediatamente después de pesar el sólido. El borohidruro de sodio tiene una solubilidad de aproximadamente 4% en etanol a temperatura ambiente. Esto corresponde a un poco más de 0,8 M. Sin embargo, a veces queda sin disolver un pequeño porcentaje del sólido independientemente de la concentración a ser preparada, incluso después de agitar durante \geq 5 minutos.
Para realizar a pequeña escala la síntesis de los compuestos de la invención, se pueden llevar a cabo las reacciones descritas más adelante para preparar varios reactantes útiles en el esquema de reacción descrito anteriormente. Como con el resto de la memoria descriptiva, todas las temperaturas están en grados Celsius y todas las partes y porcentajes están en peso, a menos que se indique otra cosa.
Diferentes materiales de partida y otros reactivos se pueden comprar de proveedores comerciales, tales como Aldrich Chemical Company o Lancaster Synthesis Ltd. y usar sin purificación posterior, a menos que se indique otra cosa. El tetrahidrofurano (THF) y la N,N-dimetilformamida (DMF) se compran de Aldrich en frascos SureSeal® y se usan tal como se reciben. Todos los disolventes se purifican utilizando métodos estándar de la técnica, a menos que se indique otra cosa.
Las reacciones que se indican más adelante se realizan bajo una presión positiva de nitrógeno o con un tubo de secado, a temperatura ambiente (a menos que se indique otra cosa), en disolventes anhidros, y los matraces de reacción se equipan con un septo de goma para la introducción de sustratos y reactivos por medio de una jeringa. El material de vidrio se seca en estufa y/o se seca con calor. Se lleva a cabo la cromatografía analítica en capa fina sobre placas de vidrio recubiertas con gel de sílice 60 F 254 (Analtech (0,25 mm)) y se eluye con las relaciones apropiadas de disolventes (v/v). Las reacciones se analizan por TLC y se terminan cuando se considera que se ha consumido el material de partida.
Las placas inclinadas se visualizan con un reactivo de p-anisaldehído por pulverización o reactivo de ácido fosfomolíbdico (Aldrich Chemical, al 20% en peso en etanol) y se activan con calor. Los tratamientos se hacen típicamente doblando el volumen de reacción con el disolvente de reacción o disolvente de extracción y lavando después con las soluciones acuosas indicadas usando el 25% en volumen del volumen de extracción (a menos que se indique otra cosa). Las soluciones del producto se secan sobre Na_{2}SO_{4} anhidro antes de la filtración, y la evaporación de los disolventes se hace bajo presión reducida en un evaporador rotatorio y se anotan como disolventes separados en vacío. La cromatografía rápida en columna (Still et al., A. J. Org. Chem., 1978, 43:2923) se realiza usando gel de sílice rápido grado Baker (47-61 mm) y una relación gel de sílice:material crudo de aproximadamente 20:1 a 50:1, a menos que se indique otra cosa. La hidrogenolisis se hace a la presión indicada o a presión ambiental.
Los espectros ^{1}H-NMR se registran en un instrumento Bruker operando a 300 MHz, y los espectros ^{13}C-NMR se registran operando a 75 MHz. Los espectros NMR se obtienen como soluciones en CDCl_{3} (registrados en ppm), usando cloroformo como el estándar de referencia (7,25 ppm y 77,00 ppm) o en CD_{3}OD (3,4 y 4,8 ppm y 49,3 ppm), o un estándar interno de tetrametilsilano (0,00 ppm) cuando es apropiado. Según sea necesario se usan otros disolventes de NMR. Cuando se registran multiplicidades de picos, se usan las siguientes abreviaturas: s = singlete, d = doblete, t = triplete, m = multiplete, br = ensanchado, dd = doblete de dobletes, dt = doblete de tripletes. Las constantes de acoplamiento, cuando se dan, se expresan en Hertz.
Los espectros infrarrojos se registran en un espectrofotómetro Perkin-Elmer TF-IR como aceites netos, como pastillas de KBr o como soluciones en CDCl_{3}, y cuando se registran están en números de onda (cm^{-1}). Los espectros de masas se obtienen usando LSIMS o electronebulización. Todos los puntos de fusión están sin corregir.
Preparación del bloque de construcción 1-H-pirazol-1-carboxamidina
16
La 1-H-pirazol-1-carboxamidina se prepara según Bernatowick et al., J. Org. Chem., 1992, 57:2497-2502 (y sus referencias) y se protege con dicarbonato de di-terc-butilo para dar 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoxicarbonil)carboxamidina) según Drake et al., Synth. 1994, 579-582.
Preparación de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-4-aminometilciclohexano
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A una solución de 1,4-bis-aminometil-ciclohexano 22 (20 g, 0,14 mol) en THF (200 ml) se añade una solución de 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoxicarbonil)carboxamidina) 21 (22,0 g, 0,07 mol) en THF (100 ml). (Nótese que la 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoxicarbonil)carboxamidina) no necesita ser disuelta en THF; sino que puede ser añadida neta como un sólido al proceso). Se agita la solución a temperatura ambiente durante 3 horas. Se separa el disolvente a presión reducida para dar un residuo siruposo, que se recoge en acetato de etilo (500 ml) y se lava con agua hasta pH neutro. Se lava la capa orgánica con salmuera, se seca sobre MgSO_{4}, y se concentra. Se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluye con MeOH al 5% en diclorometano. Se separan los disolventes en vacío para obtener 11,6 g (43% de rendimiento) de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-4-aminometil-ciclohexano (Compuesto 23). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 11,5 (br s, 1H), 8,35 (br s, 1H), 3,26 (dt, 2H), 2,52 (dd, 2H), 1,82-0,97 (m, 28H, con singlete a 1,5).
Una preparación alternativa de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-4-aminometil-ciclohexano es como sigue. A una solución de cis/trans 1,4-bis-aminometil-ciclohexano (9,0 g, 63,3 mmol) en THF (903 ml, 0,07 M) se añade en porciones como un sólido (a lo largo de un periodo de 10 minutos) 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoxicarbonil)carboxamidina) (19,6 g, 63,3 mmol). Se agita la solución a temperatura ambiente durante 0,5 horas. Se separa el disolvente a presión reducida para dar un residuo siruposo, que se recoge en acetato de etilo (500 ml) y se lava dos veces con agua. Se separan las capas y se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluye con acetato de etilo al 100% para separar todas las impurezas no polares, seguido por elución con alcohol isopropílico al 100% para dar el producto puro. Se separan los disolventes en vacío para obtener 10,2 g (42% de rendimiento) de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-4-aminometil-ciclohexano. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 11,5 (br s, 1H), 8,35 (br s, 1H), 3,26 (dt, 2H), 2,52 (dd, 2H), 1,82-0,97 (m, 28H, con singlete a 1,5).
Aminación reductora
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Se disuelven en metanol (10 ml), 3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftaldehído (0,2021 g, 0, 88 mmol) y 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-4-aminometil-ciclohexano (Compuesto 23, 0,337 g, 0,88 mmol). Después, se añade una solución al 1% de ácido acético glacial en metanol (100 \mul) seguida por NaCNBH_{3} (55,4 mg, 0, 88 mmol, 1,0 equivalentes) y se agitan los contenidos de la reacción durante la noche. Se analiza la reacción por TLC para revelar tres componentes (aldehído, el producto deseado y el derivado de guanidina de partida). Se termina la reacción por la adición de agua (\sim5 ml), se extrae con diclorometano (\sim100 ml), y se lava con bicarbonato de sodio saturado. Se seca la capa orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra, se concentra y se somete a cromatografía en columna eluyendo con acetato de etilo en hexano 3:1 para separar el aldehído sin reaccionar, seguido por elución con acetato de etilo en hexano 1:1, dando el producto deseado (Compuesto 25, ciclohexilo, mezcla cis/trans). Se separan los disolventes en vacío (los rendimientos generales típicos varían de 50 a 80%).
Preparación del derivado acilado seguido por la desprotección de la guanidina
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Se disuelve en diclorometano (10-15 ml) el producto de la aminación reductora 25, (1,0 equivalentes), seguido por la adición de trietilamina (2 equivalentes) y el reactivo cloruro de 2-furoilo (1,0 equivalentes). Se agitan los contenidos de la reacción durante la noche a temperatura ambiente. Se diluye la mezcla de reacción con diclorometano (50 ml), y se lava con bicarbonato de sodio saturado. Se seca la capa orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se purifica por cromatografía en columna y se eluye usando acetato de etilo en hexano 3:1. Se separan los disolventes en vacío para dar el compuesto 26.
Se disuelve el producto de la reacción de acilación 26 (1,0 equivalentes), en una solución de TFA al 50% en diclorometano (20-25 ml), y se agitan los contenidos de la reacción a temperatura ambiente (15-20 minutos; la solución se pone de color naranja rojizo claro). Se agitan los contenidos de la reacción durante 1 hora y 20 minutos adicionales hasta que la desprotección es completa. Se termina la reacción por concentración en vacío, seguida por la adición de agua/acetonitrilo (\sim50 ml) y liofilización durante la noche. Se purifica el compuesto final por métodos de HPLC. Se separan los disolventes en vacío para dar el compuesto 27.
La siguiente discusión se refiere a la preparación de ejemplos de los compuestos (e)-(k). Los compuestos (e)-(k) se pueden usar como se ha descrito antes para producir los correspondientes compuestos desprotegidos (guanidilo libre), por medio de hidrólisis en condiciones ácidas.
Preparación de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-3-aminometil-ciclohexano
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A una solución de cis/trans-1,3-bis-aminometil-ciclohexano (7,5 g, 52,8 mmol) en THF (30 ml) se añade una solución de 1,3-bis(terc-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudourea (7,65 g, 26,3 mmol) en THF (40 ml) en el espacio de 0,5 horas. Se agita la solución a temperatura ambiente durante 5 horas. Se separa el disolvente a presión reducida y se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice usando como eluyente una mezcla de cloruro de metileno/metanol, para obtener 2,2 g (22% de rendimiento) de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-3-aminometil-ciclohexano (Compuesto (e)). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 11,53 (br s, 1H), 8,40 (br s, 1H), 3,28-3,30 (m, 2H), 2,54-2,61 (m, 2H), 1,81 (br s, 2H), 1,27-1,58 (m, 26H), 0,89 (m, 1H), 0,65 (m, 1H).
Alternativamente, el compuesto (e) se puede preparar como sigue. A una solución de cis/trans 1,3-bis-aminometil-ciclohexano (10,0 g, 70,3 mmol) en THF (1000 ml, 0,07 M) se añade en porciones como un sólido (a lo largo de un periodo de 10 minutos) 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoxicarbonil)carboxamidina) (21,8 g, 70,3 mmol). Se agita la solución a temperatura ambiente durante 0,5 horas. Se separa el disolvente a presión reducida para dar un residuo siruposo, que se recoge en acetato de etilo (500 ml) y se lava dos veces con agua. Se separan las capas y se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluye con acetato de etilo al 100% para separar todas las impurezas no polares, seguido por elución con alcohol isopropílico al 100% para dar el producto puro. Se separan los disolventes en vacío para obtener 11,4 g (41% de rendimiento) de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-3-aminometil-ciclohexano. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 11,53 (br s, 1H), 8,40 (br s, 1H), 3,28-3,30 (m, 2H), 2,54-2,61 (m, 2H), 1,81 (br s, 2H), 1,27-1,58 (m, 26H), 0,89 (m, 1H), 0,65 (m, 1H).
Preparación de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-4-aminometil-benceno 
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A una solución de p-xililendiamina (6,44 g, 47,4 mmol) en THF (30 ml) se añade una solución de 1,3-bis(terc-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudourea (6,63 g, 22,9 mmol) en THF (40 ml) en el espacio de 0,5 horas. Se agita la solución a temperatura ambiente durante 5 horas. Se separa el disolvente a presión reducida y se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice usando como eluyente una mezcla de cloruro de metileno/metanol, para obtener 8,0 g (92% de rendimiento) de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-4-aminometil-benceno (Compuesto (f)). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 11,54 (br s, 1H), 8,56 (br s, 1H), 7,29 (s, 4H), 4,60 (d, 2H), 3,86 (s, 2H), 1,64 (br s, 2H), 1,52 (s, 9H), 1,48 (s, 9H).
Preparación de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-3-aminometil-benceno
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A una solución de m-xililendiamina (7,14 g, 52,5 mmol) en THF (30 ml) se añade una solución de 1,3-bis(terc-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudourea (7,57 g, 26,1 mmol) en THF (40 ml) en el espacio de 0,5 horas. Se agita la solución a temperatura ambiente durante 5 horas. Se separa el disolvente a presión reducida y se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice usando como eluyente una mezcla de cloruro de metileno/metanol, para obtener 7,9 g (80% de rendimiento) de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-3-aminometil-benceno (Compuesto (g)). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 11,54 (br s, 1H), 8,58 (br s, 1H), 7,19-7,34 (m, 4H), 4,62 (d, 2H), 3,86 (s, 2H), 1,83 (br s, 2H), 1,52 (s, 9H), 1,48 (s, 9H).
Preparación de 1-(N,N'-diBoc)-guanidino-4-aminobutano 
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A una solución de 1,4-diaminobutano (4,15 g, 47,1 mmol) en THF (30 ml) se añade una solución de 1,3-bis(terc-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudourea (6,83 g, 23,6 mmol) en THF (40 ml) en el espacio de 0,5 horas. Se agita la solución a temperatura ambiente durante 5 horas. Se separa el disolvente a presión reducida y se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice usando como eluyente una mezcla de cloruro de metileno/metanol, para obtener 3,0 g (40% de rendimiento) de 1-(N,N'-diBoc)-guanidino-4-aminobutano (Compuesto (h)). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 11,49 (br s, 1H), 8,35 (br s, 1H), 3,42-3,47 (m, 2H), 2,72-2,76 (t, 2H), 0,86-1,65 (m, 24H).
Un procedimiento alternativo para preparar el compuesto (h) es como sigue. A una solución de 1,4-diaminobutano (6,0 g, 68,1 mmol) en THF (972 ml, 0,07 M) se añade en porciones como un sólido (a lo largo de un periodo de 10 minutos) 1-H-pirazol-1-(N,N-bis(terc-butoxicarbonil)carboxamidina) (21,5 g, 68,1 mmol). Se agita la solución a temperatura ambiente durante 0,5 horas. Se separa el disolvente a presión reducida para dar un residuo siruposo, que se recoge en acetato de etilo (500 ml) y se lava dos veces con agua. Se separan las capas y se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluye con acetato de etilo al 100% para separar todas las impurezas no polares y después con alcohol isopropílico al 100% para dar el producto puro. Se separan los disolventes en vacío para obtener 10,0 g (44% de rendimiento) de 1-(N,N'-diBoc)-guanidino-4-aminobutano. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 11,49 (br s, 1H), 8,35 (br s, 1H), 3,42-3,47 (m, 2H), 2,72-2,76 (t, 2H), 0,86-1,65 (m, 24H).
Preparación de 1-N,N-dimetilaminometil-4-aminometilbenceno
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A una solución de 1-N,N-dimetilaminometil-4-carbonitrilo-benceno (4,8 g, 30 mmol) en THF se añade una solución de complejo de tetrahidrofurano-borano 1 M (90 ml). Se calienta la mezcla a temperatura de reflujo durante 16 horas bajo nitrógeno. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añade una solución 1 M de HCl en metanol (100 ml). Se calienta la mezcla de reacción a reflujo durante 3 horas. El producto, que precipita, se recoge por filtración, se lava con éter dietílico y se seca en vacío para dar 5,9 g (83% de rendimiento) del producto como la sal hidrocloruro (Compuesto (i)). ^{1}H NMR (DMSO-d_{6}) \delta 8,65 (br s, 3H), 7,55 (dd, 4H), 4,25 (s, 2H), 3,98 (s, 2H), 2,62 (s, 2H).
Preparación de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-2-aminometilbenceno
25
A una solución de o-xililendiamina (7,14 g, 52,5 mmol) en THF (30 ml) se añade una solución de 1,3-bis(terc-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudourea (7,57 g, 26,1 mmol) en THF (40 ml) en el espacio de 0,5 horas. Se agita la solución a temperatura ambiente durante 5 horas. Se separa el disolvente a presión reducida y se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice usando como eluyente una mezcla de cloruro de metileno/metanol, para obtener 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-3-aminometil-benceno (Compuesto (j)).
Alternativamente, el compuesto (j) se puede preparar de manera análoga a la preparación alternativa descrita antes para el compuesto (e).
Preparación de 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-2-aminometil-ciclohexano 
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26
A una solución de cis/trans-1,2-bis-aminometil-ciclohexano (7,5 g, 52,8 mmol) en THF (30 ml) se añade una solución de 1,3-bis(terc-butoxicarbonil)-2-metil-2-tiopseudourea (7,65 g, 26,3 mmol) en THF (40 ml) en el espacio de 0,5 horas. Se agita la solución a temperatura ambiente durante 5 horas. Se separa el disolvente a presión reducida y se purifica el producto por cromatografía en columna de gel de sílice usando como eluyente una mezcla de cloruro de metileno/metanol, para obtener 1-(N,N'-diBoc)-guanidinometil-2-aminometil-ciclohexano (Compuesto (k)).
Alternativamente, el compuesto (k) se puede preparar de manera análoga a la preparación alternativa descrita antes para el compuesto (e).
D. Compuestos de pirimidina
Las pirimidinas pueden ser utilizadas según los siguientes procedimientos:
28
Un procedimiento general para la preparación de los compuestos que contienen pirimidina es como sigue. A una solución de la 1,3-diamina 29 en THF, se añade el compuesto 28 y los contenidos se mantienen a reflujo durante 12 horas. Se separan los disolventes en vacío y el aducto deseado se purifica por cromatografía en columna. El compuesto 31 puro se acila según el procedimiento general dado antes para obtener el compuesto 11.
Como los expertos podrán apreciar, una variedad de compuestos según la invención se pueden preparar basándose en las instrucciones anteriores. Las reacciones químicas descritas antes tienen aplicabilidad general para la preparación de los agentes de GnRH de la invención. Así, se pueden preparar similarmente otros agentes de GnRH por modificación adecuada como podrá ser apreciado fácilmente por los expertos en la técnica, por ejemplo mediante la protección de los grupos que interfieren, adaptando para uso con otros agentes convencionales y/o por modificaciones rutinarias de las condiciones de reacción.
Farmacología in vitro, unión de radioligandos
Las membranas celulares preparadas a partir de células 293 de riñones embrionarios humanos transfectadas de forma estable con cDNA del receptor de GnRH humano se suspendieron en tampón de ensayo de unión que contiene: HEPES 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, y seroalbúmina bovina al 0,1%. Se incubaron las membranas (5-50 \mug de proteínas totales por pocillo que contiene aproximadamente 10-100 fmol del receptor de GnRH) por duplicado en placas de 96 pocillos en un volumen total de 200 \mul con ^{125}I-GnRH-A (aproximadamente 0,05 nM) y los compuestos de ensayo durante una hora a temperatura ambiente. Todos los compuestos se diluyeron en DMSO al 1% (concentración final de ensayo) en tampón del ensayo de unión. La unión no específica se determinó en presencia de GnRH 100 nM. Se terminaron las reacciones por filtración rápida sobre filtros Packard GF/C empapados con polietilenimina al 0,1%, en 96 pocillos. Se lavaron los filtros tres veces con tampón con PBS, se secaron y se contaron sobre un Packard Topcount por recuento mediante centelleo líquido.
Las condiciones de ensayo fueron idénticas para evaluar las actividades del compuesto en otras especies. Se utilizó un número similar de receptores de GnRH para el ensayo en cada especie. Para la unión al receptor de GnRH en ratas, se prepararon las membranas a partir de la hipófisis de rata y se utilizaron aproximadamente 25-30 \mug/pocillo de las proteínas totales de la membrana. Para la unión al receptor de GnRH bovino, se prepararon las membranas a partir de la hipófisis bovina y se utilizaron a 40-50 \mug/pocillo. Para la unión al receptor de GnRH en ratón, se prepararon las membranas a partir de células 293 que expresan establemente receptores de GnRH de ratón y se utilizaron a aproximadamente 25-30 \mug/pocillo. Los valores IC_{50} para los péptidos control y los compuestos de ensayo se calcularon utilizando el software GraphPad Prism™. El resultado de un experimento de unión de radioligandos se muestra en la Figura 1. La Tabla 1 muestra los valores medios de múltiples experimentos de las afinidades de diferentes compuestos peptídicos y no peptídicos para los receptores de GnRH de cuatro especies.
Figura 1. Efectos de los compuestos sobre la unión de ^{125}I-GnRH-A a los receptores de GnRH expresados en células HEK-293. Se examinó la capacidad de GnRH (cuadrados) y 9 (triángulos) para desplazar la unión de ^{125}I-GnRH-A (aproximadamente 0,05 nM) a los receptores de GnRH. Los valores mostrados corresponden a un experimento representativo realizado por duplicado.
Se sintetizaron diferentes compuestos según el esquema de reacción general descrito en términos generales anteriormente. Los compuestos crudos se ensayaron usando el ensayo competitivo de unión de radioligandos descrito antes. Los resultados del ensayo competitivo de unión de GnRH se muestran en la tabla (cada compuesto se ensaya a concentraciones de 1 o 10 \muM).
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TABLA 1 
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29 
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Medida de los fosfatos de inositol totales
Para evaluar la actividad de los compuestos como agonistas o antagonistas, se empleó un ensayo para medir la acumulación de los fosfatos de inositol totales. Se pusieron sobre placas de 24 pocillos (aproximadamente 200.000 células/pocillo) células 293 que contienen el receptor hGnRH, usando medio DMEM. Al día siguiente, se cargaron las células con [^{3}H]mioinositol (0,5 Ci/ml) durante 16-18 horas en medio libre de inositol. Se aspiró el medio y se lavaron las células con DMEM libre de suero. Se aspiró el medio y después se trataron las células con los compuestos de ensayo o con vehículo durante 30 minutos a 37ºC. Se añadió después a las células la concentración semi-máxima de GnRH (1 nM) o vehículo y se dejó equilibrar a 37ºC durante 45 minutos. Se reemplazó el medio con ácido fórmico 10 mM enfriado en hielo, que paró la reacción y sirvió también para extraer los lípidos celulares. Se separaron los fosfatos de inositol por cromatografía de cambio iónico sobre columnas Dowex, que se lavaron con 2,5 ml de mioinositol 10 mM y ácido fórmico 10 mM. Se lavaron después las columnas con 5 ml de formiato de sodio 60 mM y bórax 5 mM, y se eluyeron los fosfatos de inositol totales con 5 ml de formiato de amonio 1 M y ácido fórmico 0,1 M. Los eluatos de la columna se añadieron a viales de centelleo líquido que contienen 15 ml de mezcla de centelleo y se contaron mediante recuento por centelleo líquido. El resultado de un experimento típico se muestra en la Figura 2.
Figura 2. Efectos de los compuestos sobre la acumulación de los fosfatos de inositol totales estimulada por GnRH en células HEK-293 que expresan el receptor hGnRH. Se examinó la capacidad del antagonista péptidico, Antide, y del compuesto 9 no péptidico para bloquear los aumentos de los fosfatos de [^{3}H]inositol estimulados por GnRH. Ninguno de los compuestos solos estimuló un aumento de los fosfatos de [^{3}H]inositol totales (no se muestra), pero ambos compuestos fueron capaces de inhibir la estimulación mediada por la concentración semi-máxima del péptido de GnRH. La GnRH sola dependiendo de la dosis aumentó la acumulación del fosfato de [^{3}H]inositol con una EC_{50} de aproximadamente 0,8 nM. En el experimento mostrado, se determinaron los valores K_{b} de Antide, y del compuesto 9 por el método de Cheng and Prusoff (Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108, 1973). Los valores mostrados corresponden a un experimento realizado por duplicado.
Farmacología in vivo, estudios de eficacia en animales
Protocolo experimental: Se castraron ratas machos Sprague-Dawley (225-250 g) y se dejaron 10 días de recuperación tras la operación. Diez días después de la castración los animales fueron equipados con sondas permanentes en la vena y arteria femorales para facilitar las perfusiones remotas y el muestreo de sangre. El día del experimento, se dejó que los animales se aclimataran a la sala del procedimiento mientras estaban en su jaula. Se tomaron muestras de sangre basal de todos los animales. Después del muestreo basal, se administraron intravenosamente o vehículo (DMSO al 10%, cremofor al 10% en solución salina), o Antide (1,0 \mug) o el compuesto 11 (10 mg/kg). Se tomaron muestras de sangre a los 10, 60, 90, 120, 180, 240 minutos después de las inyecciones. Se centrifugó la sangre, se recogió el suero y se almacenó en un congelador a -70º hasta su análisis. Se analizaron las muestras de suero usando un kit DSL-4600 ACTIVE de ensayo inmunorradiométrico con tubo recubierto de LH procedente de Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Resultados y discusión: La separación de las gónadas elimina la retroalimentación negativa de testosterona en el hipotálamo, dando como resultado GnRH elevada y consecuentemente LH elevada. La Figura 3 ilustra los niveles plasmáticos tanto de LH como de testosterona en las ratas testigos y en las castradas 10 días después de la cirugía. En estas ratas, se podría esperar que un antagonista de GnRH reduzca las elevaciones de los niveles de LH mediados por GnRH. Antide, un antagonista peptídico de GnRH, reduce la LH en el modelo de rata castrada (Figura 4). El compuesto 11, un antagonista de GnRH de molécula pequeña, también reduce la LH en el modelo de rata castrada (Figura 4).
Estudios farmacocinéticos
Protocolo experimental: Se prepararon las ratas con catéteres intravenosos insertados en la vena cava superior mediante la incisión en la vena yugular derecha externa y se dejó que se recuperaran. Se disolvieron los fármacos en una mezcla de 10% de DMSO, 10% de cremofor, y 80% de solución salina y se administraron i.v. a una dosis de 10 mg/kg. Se tomaron muestras de sangre a los tiempos indicados, y se extrajeron los compuestos de 0,2 ml de plasma con cloruro de butilo que contiene un estándar interno. Se analizaron las muestras por HPLC con una columna Beta-Basic C18 4 x 50 mm usando un gradiente de 40-80% de acetonitrilo en tampón de fosfato de amonio 10 mM a un caudal de 1 ml/min. La detección de la muestra se hizo por absorbancia en UV a 260 nm.
Resultados y discusión: El compuesto 11, que tiene excelente afinidad en el receptor de GnRH en la rata, tuvo una semivida en el plasma de rata de aproximadamente tres horas y tuvo una concentración en plasma de 100-200 nM cuatro horas después de la inyección i.v. (Figura 5).
La unión de los péptidos de referencia a los receptores de GnRH de la rata, ratón, bovino y humano está de acuerdo con lo publicado en la bibliografía. Los compuestos no peptídicos de la invención muestran marcadas diferencias según la especie en su perfil de unión. Varios de estos compuestos presentan alta afinidad (< 100 nM) frente al receptor de GnRH humano. Funcionalmente, todos estos compuestos no peptídicos ensayados en cuanto a su actividad en un ensayo de fosfato de inositol actúan como antagonistas de la acumulación de fosfato de inositol total estimulada por GnRH en las células que contienen receptores de GnRH humanos recombinantes. La administración intravenosa del compuesto 11 redujo los niveles plasmáticos de LH en ratas machos castradas, un modelo para los niveles plasmáticos de LH elevados crónicamente. Este compuesto tiene una semivida de tres horas y la concentración plasmática guarda correlación con la eficacia. Considerados juntos, estos datos dan a entender que estos compuestos no peptídicos deben tener utilidad como antagonistas del receptor de GnRH.
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Agonistas y antagonistas peptídicos usados como compuestos de referencia:
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Los datos de los compuestos a seguir se obtuvieron como sigue:
Cultivo celular
Las células GH_{3} transfectadas de forma estable con el receptor de GnRH de rata (GGH_{3}) fueron proporcionadas por el Dr. William Chin (Harvard Medical School, Boston, MA). Estas células han sido ampliamente caracterizadas previamente (Kaiser et al., 1997). Se cultivaron estas células en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) bajo en glucosa que contiene: 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 0,6 g/l de G418 y suero fetal bovino (FBS) al 10% inactivado por calor.
El cDNA del receptor GnRH humano fue clonado en el plásmido vector de expresión, pcDNA 3 (In vitrogen), y fue transfectado de forma estable a las células HEK 293 (hGnRH-R/293). Esta línea celular fue proporcionada por el Dr. Stuart Sealfon, Mount Sinai Medical School, New York, NY. Se cultivaron estas células en DMEM suplementado con 0,2 g/l de G418, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina y FBS al 10%. Ambas célula, las GGH_{3} y las hGnRH-R/293 se utilizaron tanto para la medida del fosfato de inositol total como para la evaluación por microfisiometría de la eficacia del compuesto.
Preparación del radioligando
Como radioligando se usó el agonista análogo de GnRH radioyodado, [des-Gly^{10}, D-Ala^{6}]GnRH-etilamida (^{125}I-GnRH-A). Se añadió un \mug de GnRH-A diluido en ácido acético 0,1 M a un tubo de vidrio de borosilicato recubierto con Iodogen® (Pierce) que contiene 35 \mul de tampón fosfato 0,05 M (pH 7,4-7,6) y 1 mCi de Na[^{125}I]. Se agitó la mezcla de reacción en vórtice y se incubó durante 1 minuto a temperatura ambiente. Después de un minuto, se agitó la mezcla de reacción en vórtice y se dejó incubar durante un minuto adicional. Se añadieron al tubo de reacción 2 ml de ácido acético 0,5 M/BSA al 1% y se añadió la mezcla a un cartucho C18 Sep-Pak. Se lavó el cartucho con subsiguientes lavados de 5 ml de H_{2}O y 5 ml de ácido acético 0,5 M y después se eluyó con 5 x 1 ml de CH_{3}CN al 60%/ácido acético 0,5 M al 40%. Se diluyó el eluato con 3x volúmenes del tampón A de HPLC (TFA al 0,1% en H_{2}O) y se cargó sobre una columna C18. El producto yodado se eluyó durante 20-25 minutos con un gradiente de CH_{3}CN al 25-100% conteniendo TFA al 0,1%. Las fracciones radiactivas (750 \mul/fracción) se recogen en tubos limpios de polipropileno que contienen 100 \mul de BSA al 10%. Se evaluaron las fracciones en cuanto a su actividad biológica por la unión al radioligando. La actividad específica del radioligando fue aproximadamente 2200 Ci/mmol.
Microfisiometría
El Cytosensor®Microphysiometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) es un sistema a tiempo real, no invasivo, basado en semiconductores no radiactivos para monitorizar las respuestas celulares a diferentes estímulos. Está basado en un sensor de sílicio sensible al pH, el sensor potenciométrico fotodirigible que forma parte de una cámara de flujo a microvolumen en la cual se inmovilizan las células cultivadas (Pitchford et al., 1995; Parce et al., 1989; Owicki, et al., 1994).
Referencias adicionales
Owicki, J. C., L.J. Bousse, D.G. Hafeman, G. L. Kirk, J.D. Olson, H.G. Wada, and J. W. Parce. The light-addressable potentiometric sensor: principles and biological applications. Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 23: 87-113, 1994.
Parce, J.W., J. C. Owicki, K. M. Kereso, G. B. Sigal, H. G. Wada, V. C. Muir, L.J. Bousse, K. L. Ross, B. I. Sikie, H. M. McConnell. Detection of cell-affecting agents with a silicon biosensor. Science 246: 243-247, 1989.
Pitchford S., K. DeMoor, and B.S. Glaeser. Nerve growth factor stimulates rapid metabolic responses in PCI2 cells. Am. J. Physiol. 268(Cell Physiol. 37): C936-C943, 1995.
Se sembraron las células GGH_{3} en medio esencial mínimo con baja amortiguación (MEM, Sigma) que contiene NaCl 25 mM y BSA al 0,1% a una densidad de 500.000 células/cápsula sobre la membrana de policarbonato (3 \mum de porosidad) de las copas de las cápsulas de células (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las copas de las cápsulas se transfieren a las cámaras del sensor donde se mantienen las células muy próximas a un sensor de sílicio dentro de una cámara del sensor, que mide pequeños cambios de pH en el microvolumen de la cámara del sensor. El medio con baja amortiguación se bombeó continuamente a través de las células a una velocidad de aproximadamente 100 \mul/min desde uno de los dos reservorios de fluidos. Una válvula de selección determinó cuál era el reservorio desde el que el fluido era perfundido a las células.
El microfisiómetro Cytosensor®Microphysiometer genera una señal de voltaje, que es una función lineal del pH, cada segundo. Con el fin de medir las tasas de acidificación, se interrumpió periódicamente el flujo a la cámara del sensor que contiene las células, permitiendo que los metabolitos ácidos excretados se acumulen en el fluido extracelular de las células. En estos experimentos, las células se mantuvieron a 37ºC en un ciclo de flujo de dos minutos siendo las células perfundidas con el medio durante 80 segundos seguido por 40 segundos en los que el flujo del medio se paró. Durante este intervalo de 40 segundos, se midieron las tasas de acidificación durante un intervalo de 30 segundos. De esta forma, se calculó una única tasa de acidificación cada dos minutos. El dispositivo Cytosensor®Microphysiometer contiene ocho de tales unidades sensoras, que permiten que se realicen ocho experimentos simultáneos. Cada unidad fue programada individualmente utilizando un ordenador ligado al sistema.
Las células GGH_{3} se equilibraron inicialmente en el medio MEM con baja amortiguación durante un periodo de 30-60 min durante los cuales se monitorizaron las tasas de acidificación basales (medidas como \muV/s), en ausencia de cualquier estímulo. Cuando la tasa basal de acidificación cambió menos de un diez por ciento durante un periodo de veinte minutos, se iniciaron los experimentos. Se realizaron experimentos de evolución temporal para determinar el tiempo óptimo para la exposición al agonista antes de la medida de la tasa de acidificación y la duración de la exposición necesaria para obtener respuestas de picos de acidificación a diferentes agonistas. A partir de estos experimentos de evolución temporal, se determinó qué células debían ser expuestas a los agonistas peptídicos de GnRH al menos un minuto antes de la recogida de los datos de la tasa de acidificación. Los picos de las tasas de acidificación usualmente aparecen en los dos primeros minutos del ciclo de exposición. Con el fin de capturar el pico de respuesta a GnRH, se expusieron las células al agonista durante un total de cuatro minutos. Se expusieron las células a los compuestos durante 20-60 min antes de una estimulación de cuatro minutos con GnRH (1,0 nM-10 \muM) sola o en combinación con las diferentes concentraciones de ensayo de cada compuesto. Todos los compuestos se ensayaron en una concentración final de DMSO al 1% en el medio MEM con baja amortiguación descrito antes.
Perfil de selectividad
Con el fin de determinar la especificidad de la unión de los compuestos a los receptores GnRH, se ensayaron los compuestos en diferentes ensayos de unión y funcionales en cuanto actividad. La Tabla 2 que sigue muestra la actividad del compuesto 20 en otros ensayos.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 Evaluación de la afinidad de unión o evaluación funcional del compuesto 20 en diferentes ensayos
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La Figura 6 muestra el efecto del compuesto 136 sobre los aumentos estimulados por GnRH en la tasa de acidificación extracelular en células GGH_{3}. La GnRH produjo un incremento dependiente de la dosis en la tasa de acidificación extracelular de las células GGH_{3}. El compuesto 136 causó un aumento directo en las curvas dosis-respuesta para GnRH sin disminuir la respuesta máxima a GnRH. Esto da a entender que este compuesto es un competitivo antagonista de GnRH en este receptor. Los valores que se muestran proceden de un experimento.
Un ejemplo de referencia de los métodos de preparación de los compuestos es como sigue:
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36
3600 
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4-(3-Metilfenoxi)-2-butanona 
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37
Se añadió diisopropil-etil-amina a m-cresol (4,0 g, 37 mmol), metil-vinil-cetona (3,2 ml, 37 mmol) en cloroformo (25 ml). Se calentó la mezcla a reflujo durante 16 horas, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se evaporó. El residuo tenía 50% de producto y 50% de material de partida. Se separó el material de partida como t-butildimetil-silil-éter. Se aisló el producto a través de un tapón de filtración. Rendimiento 4,5 g (68%).
2- Metil-4-(3-metilfenoxi)-2-butanol
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A una solución de bromuro de metil-magnesio en éter (50 ml), preparado a partir de Mg (572 mg, 23,56 mmol) y MeI (3,34 g, 23,56 mmol), se añadió 4-(3-metilfenoxi)-2-butanona (2,1 g, 11,78 mmol) en 10 ml de éter. Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 30 minutos, tras lo cual se sofocó con agua y ácido clorhídrico diluido. Se separó la capa orgánica, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró a través de un tapón de sílice. Jarabe incoloro, 1,91 g (83%).
4,4,7-Trimetil-cromano
39
A cloruro de aluminio (1,3 g, 9,79 mmol) en 40 ml de disulfuro de carbono, se añadió 2-metil-4-(3-metilfenoxi)-2-butanol (1,9 g, 9,79 mmol) en 10 ml de disulfuro de carbono. Se calentó la mezcla a reflujo durante 2 horas. Se evaporó el disolvente, se diluyó el residuo con 50 ml de acetato de etilo, y 10 ml de agua. Se separó la capa orgánica, se secó sobre sulfato de sodio y se purificó a través de una columna rápida. Jarabe amarillo claro, 1,5 g (87%).
5-[(4,4,7-Trimetil-3,4-dihidro-2H-cromen-6-il)metil]-2-furoato de etilo y 5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-cromen-8-il)metil]-2-furoato de etilo
40
A cloruro de cinc (950 mg, 6,97 mmol) en nitrometano (20 ml), se añadió una mezcla de 4,4,7-trimetil-cromano (1,23 g, 6,97 mmol) y 5-clorometil-2-furoato de etilo (656 mg, 3,48 mmol) en nitrometano (15 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas. Se evaporó a sequedad y se trituró con acetato de etilo-agua (1:1, 100 ml). El tratamiento de la capa orgánica de la manera usual y la filtración por tapón usando hexano:acetato de etilo (9:1) dieron la mezcla de estos dos compuestos. 1,34 g (46% basado en cromano)
N-(2,4,6-Trimetoxifenil)-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-cromen-6-il)metil]-2-furamida y N-(2,4,6-trimetoxifenil)-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-cromen-8-il)metil]-2-furamida
41
A una mezcla de 5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-cromen-6-il)metil]-2-furoato de etilo y 5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-cromen-8-il)metil]-2-furoato de etilo (1,34 g, 3,74 mmol) en THF-MeOH-H_{2}O (7:5:5, 20 ml) se añadió monohidrato de hidróxido de litio (784 mg, 18,7 mmol). Se agitó la mezcla durante 4 horas a temperatura ambiente. Se evaporó la mezcla a sequedad, se diluyó con 30 ml de acetato de etilo y 50 ml de agua. Después de acidificación con HCl diluido, se separó la capa de acetato de etilo, se secó y se evaporó para dar una mezcla de los correspondientes ácidos, 1,03 g (cuantitativo). Los ácidos no pudieron ser separados ni usando cromatografía en columna ni por cristalización.
A la mezcla de ácidos (200 mg, 0,66 mmol) en diclorometano (30 ml), se añadió cloruro de tionilo (392 mg, 3,3 mmol). Se mantuvo la mezcla a reflujo durante 1 hora y se evaporó. Se disolvió el residuo en hexano-acetato de etilo (9:1, 20 ml) y se filtró a través de un tapón de gel de sílice (0,5 cm x 1,0 cm).
Al residuo en 10 ml de acetato de etilo, se añadió hidrocloruro de 2,4,6-trimetoxifenil-amina (145 mg, 0,66 mmol) seguido por diisopropil-etil-amina (256 mg, 1,98 mmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas. Se sofocó la reacción con agua (10 ml) y se separó la capa de acetato de etilo. La combinación de purificación en columna y HPLC dio 15 mg y 21 mg de los dos componentes (12%).
La biodisponibilidad de los compuestos de la invención se muestra en la siguiente Tabla.
La farmacología in vivo de algunos compuestos de la invención se ensayó como sigue:
Experimentos in vivo: general
Se compraron ratas Sprague-Dawley machos adultos, de Harlan Sprague Dawley (San Diego). Se pusieron dos animales por jaula y se mantuvieron en una sala de temperatura controlada (22 \pm 2ºC) con un fotoperiodo de 2 horas de luz/12 horas de oscuridad (las luces se encendieron a las 6,00 h). Se les proporcionó alimento de rata (dieta Teklad de ratas) y agua de bebida ad libitum.
Modelos animales para determinar la actividad de los antagonistas de GnRH Modelo de rata macho castrada Justificación
La separación quirúrgica de las gónadas separa la testosterona circulante y elimina la retroalimentación negativa de testosterona en el hipotálamo. Como resultado se eleva la GnRH y consecuentemente se eleva la LH (Figura #1). Se podría esperar que un antagonista de GnRH reduzca las elevaciones de los niveles de LH mediados por GnRH. Antide, un antagonista peptídico de GnRH, reduce los niveles de LH en ratas castradas (Figura #8). Este modelo parece adecuado para evaluar los antagonistas de GnRH de molécula pequeña.
Protocolo
Se castraron ratas machos Sprague-Dawley (200-225 g) por el método escrotal bajo anestesia con halotano. Se dejó que los animales se recuperaran durante 14 días tras la operación antes del estudio. Trece días después de la castración, se anestesiaron los animales con halotano y se les equipó con una cánula permanente en la vena yugular. Detalles del procedimiento de canulación han sido descritos previamente {Harms and Ojeda, 1974}. El día del estudio, se dejó que los animales se aclimataran a la sala del procedimiento mientras permanecían en su jaula. Se tomaron muestras de sangre basal de todos los animales. Inmediatamente después del muestreo basal, se administraron o vehículo o los compuestos de ensayo por diferentes vías. Las vías de administración empleadas fueron intravenosa (iv), intramuscular (im), intraperitoneal (ip), subcutánea (sc) y oral (po). Las muestras de sangre se pasaron a tubos que contienen heparina en múltiples puntos de tiempo después del tratamiento. Se centrifugó la sangre inmediatamente, se recogió el plasma y se almacenó en un congelador a -20º hasta su análisis. Se analizaron las muestras de plasma usando un kit DSL-4600 ACTIVE de ensayo inmunorradiométrico con tubo recubierto de LH, procedente de Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Formulaciones del compuesto
Formulación #1 (señalada con superíndice 1): DMSO al 10%, cremofor EL al 10% y solución salina fisiológica al 80%.
Formulación #2 (señalada con superíndice 2): cremofor EL al 10% y solución salina fisiológica al 90%.
Resultados
Véanse las figuras 9-11 y la Tabla.
Rata macho intacta Justificación
La testosterona es una hormona regulada por el eje hipotalámico-hipofisario-gonadal. La GnRH se segrega en pulsos desde el hipotálamo y estimula la glándula hipofisaria anterior para liberar las hormonas gonadotrópicas LH y FSH. La testosterona se produce cuando los testículos son estimulados por la LH. La cantidad de testosterona segregada aumenta aproximadamente en proporción directa a la cantidad de LH disponible (Guyton, 1986). Se espera que un antagonista de GnRH reduzca el nivel de testosterona mediante la inhibición de la LH.
Protocolo 1
Se enjaularon individualmente ratas machos Sprague-Dawley (250-275 g) y se dejaron aclimatar durante 1 semana antes del estudio. El día del estudio se administró a los animales o vehículo o compuesto de ensayo por diferentes vías de administración, incluyendo ip, sc, o po. Se obtuvieron muestras de sangre mediante punción cardiaca bajo anestesia con halotano a partir de los animales individuales a puntos de tiempo predeterminados post-tratamiento. Las muestras de sangre se pasaron a tubos que contienen heparina. Se centrifugó la sangre inmediatamente, se recogió el plasma y se almacenó en un congelador a -20º hasta su análisis. Se analizaron las muestras de plasma usando un kit DSL-4000 ACTIVE de ensayo inmunorradiométrico con tubo recubierto de testosterona, procedente de Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Protocolo 2
Se enjaularon individualmente ratas machos Sprague-Dawley (250-275 g) y se dejaron aclimatar durante 1 semana antes del estudio. Se desarrolló una técnica que permite el muestreo repetido desde la vena yugular usando catéteres micro-renathane (MRE) implantados 7 días antes del estudio. Los detalles del procedimiento quirúrgico han sido descritos previamente {Harms and Ojeda, 1974}. El día del estudio, se dejó que los animales se aclimataran a la sala del procedimiento mientras permanecían en su jaula. Se tomaron muestras de sangre basal de todos los animales. Inmediatamente después del muestreo basal, se administraron o vehículo o los compuestos de ensayo por diferentes vías. Las vías de administración empleadas fueron intravenosa (iv), intramuscular (im), y oral (po). Las muestras de sangre se pasaron a tubos que contienen heparina a múltiples puntos de tiempo después del tratamiento. Se centrifugó la sangre inmediatamente, se recogió el plasma y se almacenó en un congelador a -20º hasta su análisis. Se analizaron las muestras de plasma usando un kit DSL-4000 ACTIVE de ensayo inmunorradiométrico con tubo recubierto de testosterona, procedente de Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Protocolo de referencia 3
Estudio de administración repetida del compuesto No. 134
Se enjaularon por parejas ratas machos Sprague-Dawley (250-275 g) y se dejaron aclimatar durante 1 semana antes del estudio. Se administraron diariamente tratamientos con vehículo o im, o sc, o po entre las 8:00 y las 9:00 horas am durante siete días. El día 8 entre las 8:00 y las 9:00 am, se obtuvieron muestras de sangre mediante punción cardiaca bajo anestesia con halotano. Se completó el procedimiento en 45-60 segundos. A lo largo de los 7 días siguientes un grupo de animales continuó recibiendo tratamiento con vehículo mientras que otro grupo de animales no recibió ningún tratamiento. Después del séptimo día de este régimen de tratamiento, se recogieron muestras como se ha descrito antes. Los niveles de testosterona no fueron diferentes entre los animales tratados con vehículo y los animales sin tratar.
Diariamente se realizó la administración im del compuesto 134 (100 mg/kg) o del vehículo entre las 8:00 y las 9:00 am durante siete días. Después del séptimo día de tratamiento, se recogieron muestras como se ha descrito antes.
Todas las muestras de sangre se recogieron en tubos que contienen heparina. Se centrifugó la sangre inmediatamente, se recogió el plasma y se almacenó en un congelador a -20º hasta su análisis al día siguiente. Se analizaron las muestras de plasma usando un kit DSL-4000 ACTIVE de ensayo inmunorradiométrico con tubo recubierto de testosterona, procedente de Diagnostic Systems Laboratories, Inc.
Resultados
Véase la Tabla 2 y las Figuras 12-14.
Leyendas de las figuras
Figura 7: El gráfico de barras muestra los niveles basales de LH y testosterona en ratas castradas (CX) y en ratas intactas. La LH está elevada en las ratas CX. La testosterona está ausente en las ratas CX.
Figura 8: La representación lineal muestra los niveles de LH expresados como porcentaje de la LH basal en los animales tratados con vehículo y con Antide. El Antide (2,0 y 20 ug; sc) reduce la LH en las ratas CX.
Figura 9: La representación lineal muestra los niveles de LH expresados como porcentaje de la LH basal en los animales tratados con vehículo y con compuesto. El compuesto 134 (1,0, 5,0 & 10 mg/kg; iv) produce una reducción dosis-dependiente de la LH en las ratas CX.
Figura 10: La representación lineal muestra los niveles de LH expresados como porcentaje de la LH basal en los animales tratados con vehículo y con compuesto. El compuesto 134 (20 o 100 mg/kg; ip) reduce la LH en las ratas CX.
Figura 11: La representación lineal muestra los niveles de LH expresados como porcentaje de la LH basal en los animales tratados con vehículo y con compuesto. El compuesto 134 (20 mg/kg; im) reduce la LH en las ratas CX.
En lo que sigue, RC significa compuesto de referencia.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Compuestos de GnRH en modelo de ratas castradas
42
\hskip0,2cm NS = sin reducción
\hskip0,2cm ND = no determinado
Leyendas de las figuras
Representación del Protocolo 1
Figura 12: El gráfico de barras muestra los niveles de testosterona en los animales tratados con vehículo y con compuesto 6 horas post-inyección ip. El compuesto 136 reduce los niveles de testosterona en comparación con los animales tratados con vehículo * =p<0,05, prueba t.
Representación del Protocolo 2
Figura 13: La representación lineal muestra los niveles de testosterona en ratas tratadas con vehículo y con compuesto 134 a lo largo de una evolución temporal de 12 horas y en el punto de tiempo de 24 horas. El vehículo y el compuesto 134 fueron administrados por sonda oral. La dosis más alta del compuesto 134 redujo la testosterona a lo largo del estudio.
Representación del Protocolo de referencia 3
Figura 14: El gráfico de barras muestra los niveles de testosterona niveles para los animales tratados con vehículo, compuesto 134 y los testigos. Las barras abiertas representan los niveles de testosterona pretratamiento y las barras sólidas representan los niveles de testosterona después de 7 días de tratamiento repetido. El compuesto 134 redujo significativamente los niveles de testosterona en comparación con los animales del pretratamiento, y los animales tratados con vehículo y los testigos. *=p<0,05, prueba t.
TABLA 2 Compuestos de GnRH en ratas machos intactas
43
\hskip0,2cm NS = sin reducción
\hskip0,2cm ND = no determinado
Notas del procedimiento
Ha sido documentado que algunos de los procedimientos comúnmente usados en los estudios endocrinos en animales, tales como la anestesia, dieta, cirugía, pueden afectar a los niveles hormonales que se están estudiando (B.E. Howland, et al., Experentia, 1974). La hormona luteinizante y la testosterona son sensibles a los factores estresantes. Numerosos informes son contradictorios acerca de los efectos de los factores estresantes sobre el eje HPG aún cuando se utilicen las mismas especies y los mismos estresantes. Por ejemplo, se ha publicado que las ratas machos que se someten a sujeción o inmovilización tienen concentraciones de LH bajas, (Kruhlich et al., 1974; DuRuisseau et al., 1978), normales (Tache et al., 1980; Charpenet et al., 1982; Collu et al., 1984), o elevadas (Briski et al., 1984). Similarmente, se ha publicado que los niveles plasmáticos de testosterona cambian después de la exposición a situaciones de estrés, pero una vez más los datos aparecen contradictorios y por tanto difíciles de interpretar. Por ejemplo, se ha publicado que durante el ejercicio físico intenso los niveles plasmáticos de testosterona aumentan (Dessipris et al., 1976), decrecen (Sutton et al., 1973) o permanecen sin cambios (Lamb, 1975). Los efectos de la inmovilización sobre las concentraciones de testosterona han sido más consistentes con la mayoría de las investigaciones que indican una disminución en los valores circulantes (Tache et al., 1980; Charpenet et al., 1982; Collu et al., 1984). Se acepta, sin embargo, que los estresantes provocan cambios en la testosterona circulante y el tipo de estrés usado, la duración y la gravedad causan diferentes cambios en las concentraciones de testosterona inducidos por el estrés. Considerando la susceptibilidad de la LH y la testosterona al estrés, en esta invención se han optimizado los protocolos para evaluar la LH y la testosterona en condiciones que minimizan el estrés.
Los compuestos según la invención y los compuestos de referencia que han sido preparados se muestran en las tablas adjuntas.
Los compuestos se pueden preparar con los experimentos generales proporcionados antes. A continuación se dan ejemplos específicos.
Compuestos que contienen pirimidina 
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44
Preparación de 2-cloro-N-[(2R)-tetrahidro-2-furanmetil]-4-pirimidinamina 1 y 4-cloro-N-[(2R)-tetrahidro-2-furanmetil]-2-pirimidinamina 2
En un matraz de fondo redondo de 250 ml se pusieron 2,4-dicloropirimidina (5,0 g, 33,56 mmol) y 200 ml de THF. Se añadieron a esta solución trietilamina (14,0 ml, 100,68 mmol) y [R]-tetrahidrofurfurilamina. Se agitó la solución durante la noche. La mezcla de reacción se vertió sobre agua y se extrajo con cloruro de metileno. La capa orgánica separada se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio, y se concentró en un evaporador rotatorio. El compuesto crudo se purificó por cromatografía en gel de sílice con hexano/ acetato de etilo (4:1 v/v a 1:1 v/v) para dar el compuesto 2 (1,3 g) y el compuesto 1 (3,98 g).
Preparación de N-[3-(aminometil)bencil]-2,2,2-trifluoroacetamida 3
A una solución de m-xileno-diamina (28,76 g, 211,15 mmol) en THF (300 ml, 0,7 M) se añadió gota a gota una solución de trifluoroacetato de etilo (10 g, 70,38 mmol) en THF (50 ml, 1,4 M). Se agitó la solución a temperatura ambiente durante la noche. Se hizo seguimiento de la reacción por TLC. Se concentró el disolvente y se acidificó el residuo a pH 2 con HCl 4 N y se disolvió en agua y se lavó con acetato de etilo. La capa acuosa separada se alcalinizó a pH 11 usando NH_{4}OH y se extrajo el compuesto con diclorometano. La capa orgánica separada se lavó con agua/salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró para dar el compuesto 3 (8,71 g, 53% de rendimiento).
Síntesis de 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanil-metil]amino}-4-pirimidinil)amino]metil}bencil)-2-furamida 9 (RC)
45
Preparación de 3-(aminometil)bencilcarbamato de etilo 5
A una solución de N-[3-(aminometil)bencil]-2,2,2-trifluoroacetamida 3 (10,6 g, 43,1 mmol) se añadió cloroformiato de etilo (1 equivalente) seguido por trietilamina. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 30 min. Se extrajo el producto crudo con cloruro de metileno y se concentró para dar 3-{[(trifluoroacetil)amino]metil}-bencilcarbamato de etilo 4. Este producto crudo se disolvió en metanol (100 ml) y K_{2}CO_{3} 2 N (100 ml) y se agitó durante la noche. Se alcalinizó la mezcla de reacción a pH 14 con NaOH al 20%, se extrajo con cloruro de metileno, se lavó con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio para dar el compuesto 5 (5,2 g).
Preparación de 3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)amino]metil}bencilcarbamato de etilo 6
A una solución de 3-(aminometil)bencilcarbamato de etilo 5 y 4-cloro-N-[(2R)-tetrahidro-2-furanmetil]-2-pirimidinamina 2 en clorobenceno, se añadió trietilamina. Se mantuvo a reflujo la mezcla de reacción durante la noche. Se enfrió la solución a temperatura ambiente y se cargó sobre una columna de gel de sílice y se eluyó con hexano/acetato de etilo (1:1 v/v) para dar 3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)amino]metil}bencilcarbamato de etilo 6 (73% de rendimiento).
Se disolvió el 3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)-amino]metil}bencilcarbamato de etilo 6 en etilenglicol e hidróxido de potasio (1:1 v/v). Se calentó la solución a 100ºC durante la noche. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente y se extrajo con cloroformo, se lavó con salmuera, y se secó sobre sulfato de magnesio para dar N^{4}-[3-(aminometilbencil]-N^{2}-[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]-2,4-pirimidindiamina 7 (82% de rendimiento).
Preparación de 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)amino]metil}bencil)-2-furamida 9
Se disolvió 3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)-amino]metil}bencilcarbamato de etilo 6 en etilenglicol e hidróxido de potasio (1:1 v/v). Se calentó la solución a 100ºC durante la noche. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente y se extrajo con cloroformo, se lavó con salmuera, y se secó sobre sulfato de magnesio para dar N^{4}-[3-(aminometilbencil]-N^{2}-[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]-2,4-pirimidindiamina 7 (82% de rendimiento). Este producto, 7, (182 mg, 580 mmol) y el reactivo cloruro de 2-furoilo 8 se disolvieron en diclorometano seguido por trietilamina. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se purificó el compuesto crudo sobre columna de gel de sílice y se eluyó con acetato de etilo/hexano (4:1 v/v) para dar 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(3-{[(2-{[(2R)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-4-pirimidinil)-amino]metil}bencil)-2-furamida 9 (159,1 mg). ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 1,19 (s, 6H), 1,26 (s, 6H), 1,65 (m, 5H), 1,92 (m, 3H), 2,23 (s, 3H), 3,45 (m, 1H), 3,5 (m, 1H), 3,7 (m, 1H), 3,9 (m, 3H), 4,05 (m, 1H), 4,50 (d, 2H), 4,58 (d, 2H), 5,01 (brd, 1H), 5,30 (brd, 1H), 5,71 (d, 1h), 6,03 (d, 1H), 6,61 (t, 1H), 6,99 (s, 1H), 7,06 (s, 1H), 7,07 (s, 1H), 7,28 (m, 4H), 7,80 (d, 1H). MS: 622,4 (M+1).
Síntesis de 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(3-[[(4-{[(2S)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-2-pirimidinil)amino]metil}bencil)-2-furamida 12 (RC)
46
Preparación de N-[3-(aminometil)bencil]-5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-fura-mida 11
A una solución de N-[3-(aminometil)bencil]-2,2,2-trifluoroacetamida 3 y el reactivo cloruro de 2-furoilo 8, se añadió trietilamina. Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Se purificó la mezcla cruda por cromatografía en gel de sílice eluyendo con hexano/acetato de etilo (4:1 v/v) para dar 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(3-{[(trifluroacetil)amino]metil}bencil)-2-furamida 10. El compuesto purificado se disolvió en metanol (100 ml) y carbonato de potasio en agua (2 M, 100 ml). Se calentó la reacción a 70ºC durante la noche. Se enfrió la solución a temperatura ambiente, se alcalinizó con NaOH al 20% hasta pH 14, se extrajo con cloruro de metileno, se lavó con salmuera, y se secó sobre sulfato de magnesio para dar N-[3-(aminometil)-bencil]-5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furamida 11 (4,97 g, 85,1% de rendimiento).
Preparación de 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)-metil]-N-(3-[[(4-{[(2S)tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-2-pirimidinil)amino]metil}bencil)-2-furamida 12
A una solución de N-[3-(aminometil)-bencil]-5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furamida 11 en clorobenceno se añadieron 2-cloro-N-[(2S)-tetrahidro-2-furanmetil]-4-pirimidinamina y trietilamina. Se mantuvo a reflujo la mezcla de reacción durante la noche. Después, la mezcla enfriada se purificó por cromatografía en gel de sílice seguida por HPLC, para dar 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(3-([(4-{[(2S)-tetrahidro-2-furanilmetil]amino}-2-pirimidinil)amino]metil}bencil)-2-furamida 12. ^{1}H NMR(CDCl_{3}): \delta 1,01 (s, 6H), 1,25 (s, 6H), 1,43 (m, 1H), 1,56 (s, 4H), 1,70-1,98 (m, 3H), 2,13 (s, 3H), 3,24 (m, 1H), 3,61 (m, 1H), 3,63-3,80 (m, 2H), 3,82 (s, 2H), 3,87-4,06 (m, 1H), 4,37-4,60 4,37 (d, 2H), 4,60 (d, 2H), 5,73 (d, 1H), 5,92 (d, 1H), 6,3 (brd, 1H), 6,75 (brd, 1H), 6,92 (s, 1H), 6,98 (d, 1H), 7,0 (s, 1H), 7,09-7,26 (m, 4H), 7,4 (s, 1H), 9,5 (brd, 1H). MS (APCI): 622,3 (M+1).
Ejemplos de referencia de compuestos que contienen heterocíclicos
47
4-(3-Metilfenoxi)-2-butanona
48
Se añadió diisopropil-etil-amina a m-cresol (4,0 g, 37 mmol), metil-vinil-cetona (3,2 ml, 37 mmol) en cloroformo (25 ml). Se calentó la mezcla a reflujo durante 16 h, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se evaporó. El residuo tiene 50% de producto y 50% de material de partida. El material de partida se separó como t-butildimetil-silil-éter. Se aisló el producto a través de un tapón de filtración usando gel de sílice, hexano al 50% /acetato de etilo. Rendimiento 4,5 g (68%). Como un procedimiento alternativo de purificación, se evaporó la mezcla de reacción cruda, se disolvió en DMF (0,2 M) y se añadieron 0,5 equivalentes de imidazol y 0,5 equivalentes de tBDMSCI. Se agitó la reacción durante 3 horas a temperatura ambiente y después se separaron los disolventes en vacío. Se añadieron al residuo 75 ml de acetato de etilo y 75 ml de agua (relación 1/1). Se separó la capa de acetato de etilo y se secó sobre Na_{2}SO_{4}. Se separaron los disolventes en vacío. El material crudo se puso sobre un lecho de gel de sílice y el m-cresol sililado se separó con hexano. Se obtuvo el producto eluyendo con acetato de etilo al 5-10% en hexano. Se separaron los disolventes en vacío para dar el producto deseado. ^{1}H(CDCl_{3}): 7,15 (t, 1H), 6,65-6,80 (m, 2H), 4,25 (t, 2H), 2,75 (t, 2H), 2,25 y 2,35 (2s, 3H cada uno).
2-Metil-4-(3-metilfenoxi)-2-butanol
49
A una solución de bromuro de metil-magnesio en éter (50 ml), preparado a partir de Mg (572 mg, 23,56 mmol) y MeI (3,34 g, 23,56 mmol), se añadió 4-(3-metilfenoxi)-2-butanona (2,1 g, 11,78 mmol) en 10 ml de éter. Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 30 minutos, tras lo cual se sofocó con agua y ácido clorhídrico diluido. Se separó la capa orgánica, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró a través de un tapón de sílice para dar un jarabe incoloro, 1,91 g (83%). Análisis espectral de masas usando APCI positivo 177 (M+-OH).
4,4,7-Trimetil-cromano
50
A cloruro de aluminio (1,3 g, 9,79 mmol) en 40 ml de disulfuro de carbono, se añadió 2-metil-4-(3-metilfenoxi)-2-butanol (1,9 g, 9,79 mmol) en 10 ml de disulfuro de carbono. Se calentó la mezcla a reflujo durante 2 horas. Se evaporó el disolvente, se diluyó el residuo con 50 ml de acetato de etilo, y 10 ml de agua. Se separó la capa orgánica, se secó sobre sulfato de sodio y se purificó por cromatografía en columna para dar un jarabe amarillo claro, 1,5 g (87%). ^{1}H(CDCl_{3}): 7,05 (br d, 1H), 6,87 (dd, 1H), 6,69 (d, 1H), 4,20 (t, 2H), 2,35 (s, 3H), 1,80 (t, 2H), 1,40 (s, 6H).
5-[(4,4,7-Trimetil-3,4-dihidro-2H-cromen-6-il)metil]-2-furoato de etilo, y 5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-cromen-8-il)metil]-2-furoato de etilo
51
A cloruro de cinc (950 mg, 6,97 mmol) en nitrometano (20 ml), se añadió una mezcla de 4,4,7-trimetil-cromano (1,23 g, 6,97 mmol) y 5-clorometil-2-furoato de etilo (656 mg, 3,48 mmol) en nitrometano (15 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas. Se evaporó la reacción a sequedad y se trituró con acetato de etilo:agua (1:1, 100 ml). El tratamiento de la capa orgánica de la manera usual y la filtración por tapón usando hexano:acetato de etilo (9:1) dieron la mezcla de estos dos compuestos. 1,34 g (46% basado en cromano).
N-(2,4,6-trimetoxifenil)-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-cromen-6-il)metil]-2-furamida y N-(2,4,6-trimetoxifenil)-5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-cromen-8-il)metil]-2-furamida
52
A una mezcla de 5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-cromen-6-il)metil]-2-furoato de etilo y 5-[(4,4,7-trimetil-3,4-dihidro-2H-cromen-8-il)metil]-2-furoato de etilo (1,34 g, 3,74 mmol) en THF-MeOH-H_{2}O (7:5:5, 20 ml) se añadió monohidrato de hidróxido de litio (784 mg, 18,7 mmol). Se agitó la mezcla durante 4 horas a temperatura ambiente. Se evaporó la mezcla a sequedad, se diluyó con 30 ml de acetato de etilo y 50 ml de agua. Después de acidificación con HCl diluido, se separó la capa de acetato de etilo, se secó y se evaporó en vacío para dar una mezcla de los correspondientes ácidos, 1,03 g (cuantitativo). Estos ácidos no pudieron ser separados ni usando la típica cromatografía en columna ni por cristalización. A la mezcla de los ácidos (200 mg, 0,66 mmol) en diclorometano (30 ml), se añadió cloruro de tionilo (392 mg, 3,3 mmol). Se mantuvo la mezcla a reflujo durante 1 hora y se evaporó. Se disolvió el residuo en hexano-acetato de etilo (9:1, 20 ml) y se filtró a través de un tapón de gel de sílice (0,5 cm x 1,0 cm). Al residuo en 10 ml de acetato de etilo, se añadió hidrocloruro de 2,4,6-trimetoxifenil-amina (145 mg, 0,66 mmol) seguido por diisopropil-etil-amina (256 mg, 1,98 mmol). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas. Se sofocó la reacción con agua (10 ml) y se separó la capa de acetato de etilo. La combinación de purificación en columna y HPLC dio 15 mg y 21 mg de los dos componentes (12%). Se separaron los isómeros usando cromatografía HPLC de fase reversa. Isómero lineal. ^{1}H(CDCl_{3}): 7,46 (br s, 1H), 7,23 (br s, 1H), 7,14 (br s, 1H), 7,02 (s, 2H), 6,63 (s, 1H), 6,15 (s, 2H), 6,0 (d, 1H), 4,17 (t, 2H), 3,93 (s, 3H), 3,81, 3,80 (2s, 3H cada uno), 2,21 (s, 3H), 1,81 (t, 2H), 1,29 (s, 6H). M+ a 466,2. Isómero angular: AXC07302: 7,25 (br s, 1H), 6,91 (d, 1H), 6,88 (d, oculto, 1H), 6,53 (d, 1H), 5,95 (s, 2H), 5,72 (d, 1H), 3,96 (t, 2H), 3,8 (s, 3H), 3,6 (s, 6H), 2,07 (s, 3H), 1,59 (t, 2H), 1,11 (s, 6H). M+ a 466,1
Ejemplos de referencia de compuestos aromáticos
53
54
Compuesto 183 (RC)
Se disolvieron en nitrometano (120 ml, 0,2 M), timol (1,0 equivalente, 33,3 mmol) y 5-(clorometil)-2-furoato de metilo (1,0 equivalente, 33,3 mmol). Se añadió bajo nitrógeno a la solución anterior tricloruro de aluminio (1,0 equivalente, 33,3 mmol) disuelto en 25 ml de nitrometano y se calentó lentamente a reflujo durante 10 min. Se retiró el calor y se dejó bajo nitrógeno durante la noche. Se sofocó la reacción con 100 ml de agua y se extrajo con diclorometano. La mezcla cruda se evaporó a sequedad y se cargó sobre una columna tapón de cromatografía (relación, 1 g de crudo/100 g de gel de sílice). Se eluyó la columna con acetato de etilo al 7 y 11% en hexano para dar el producto deseado (2,9 g, 30%). Se hidrolizó el éster a ácido por hidróxido de litio en THF/MeOH/H_{2}O (35/25/25).
Una solución que contiene el ácido 5-(4-hidroxi-5-isopropil-2-metilbencil)-2-furoico (1,0 equivalente, 3,6 mmol, 0,5 M), y 2,6-dimetoxianilina (1,0 equivalente, 3,6 mmol) se disolvieron en DMF. A esta mezcla, se añadieron HATU (1,0 equivalente, 3,6 mmol) y diisopropil-etil-amina (1,0 equivalente, 3,6 mmol) y se agitó durante la noche. Se calentó la mezcla durante 10 min a 45ºC. Se puso la solución en acetato de etilo (3x volumen) y se lavó con agua. Se evaporó la capa orgánica hasta un jarabe y se eluyó sobre una columna tapón de cromatografía (1:100 g de crudo/g de gel de sílice) con acetato de etilo al 30 y 50% en hexano para dar: N-(2,6-dimetoxifenil)-5-(4-hidroxi-5-isopropil-2-metilbencil)-2-furamida (820 mg, 55% de rendimiento). ^{1}H NMR (CDCl_{3}) 7,22 ppm (1H, t, J=8,68 Hz), 7,08 ppm (1H, d, J=3,40 Hz), 6,99 ppm (1H,s), 6,64 ppm (2H, d, J=8,68 Hz), 6,61 ppm (1H, s), 5,97 ppm (1H, d, J=3,40 Hz), 3,95 ppm, (2H,s), 3,85 ppm, (6H,s), 3,17 ppm, (1H, pentete, J=6,8 Hz) 2,23 ppm, (3H,s), 1,25 ppm (3H,s), y 1,23 ppm (3H,s).
Se disolvió t-butóxido de potasio (1,05 equivalentes, 0,128 mmol) en MeOH (24 \mul). A la solución de la anterior furamida (1,0 equivalente, 0,122 mmol, 1M) en DMF, se añadió solución de t-butóxido y se agitó durante 30 min. Se añadió 2-bromoetil-metil-éter (1,0 equivalente, 0,122 mmol) (MeOH al 20% /DMF, 1M) y se agitó a temperatura ambiente durante 48 horas y se purificó por HPLC de fase reversa (método: 90 min acetonitrilo al 35-75% en TFA acuoso al 0,1%) para dar 8,5 mg (15% de rendimiento). ^{1}H NMR (CDCl_{3}): 7,04 ppm (1H, J=8,31 Hz, t), 6,85 ppm (1H, J=3,40, d), 6,80 ppm (1H, s), 6,53 ppm (1H, s), 6,48 (2H, J=8,31 Hz, d), 5,76 (1H, J=3,40 Hz, d), 3,88 (2H, J=3,40/4,53 Hz, dd), 3,78 (2H, s), 3,58 (6H, s), 3,54 (2H, J=3,40/4,54 Hz, dd), 3,20 (3H, s), 3,07 (1H, J=7,2 Hz, pentete), 2,04 (3H, s), 0,97 (3H, s), 0,95 (3H,s).
Compuesto A (RC)
Se sintetizó 1,1,6-trimetil-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno a partir de la referencia: John J. Parlow Tetrahedron Vol 49 (13) 2577. Se conectó entonces con 5-(clorometil)-2-furoato de metilo por reacción de Friedel-Crafts como se ha establecido previamente para dar dos regio-isómeros principales. El isómero deseado se separó después de hidrólisis usando tres a cinco recristalizaciones sucesivas en un sistema de acetona al 10%/heptano (1 g/10 ml). Después se convirtió el ácido en cloruro de ácido con cloruro de tionilo como se ha indicado previamente.
A una solución de cloruro de 5-[(3,8,8-trimetil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furoilo (1,0 equivalente, 0,32 mmol, 0,2 M) en 2 ml de acetato de etilo, se añadió la sal mono-HCl de 2,4,6-trimetoxi-anilina (1,0 equivalente, 0,32 mmol). Se añadió trietil-amina (exceso) a esta mezcla y se agitó durante la noche. Se secó el producto crudo en vacío y se purificó a través de una columna tapón de cromatografía (relación masa cruda /gel de sílice, 1:100) eluyendo con solución de acetato de etilo al 20 y 30 por ciento en hexano. En algunos casos, se separaron los regio-isómeros por recristalización en acetato de etilo al veinticinco por ciento en hexano (1 g de compuesto en 75 ml de volumen) para dar N-(2,4,6-trimetoxifenil)-5-[(3,8,8-trimetil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-2-furamida (120 mg, 82% de rendimiento). ^{1}H N-MR (CDCl_{3}) 7,28 ppm (1H, ancho), 7,12 (1H, s), 7,08 (1H, J=3,40 Hz, d), 6,89 (1H, s), 6,19 (2H, s), 6,00 (1H, J=3,40 Hz, d), 3,97 (2H, s), 3,83 (3H, s), 3,82 (6H, s) 2,73 (2H, J=6,05 Hz, t), 2,25 (3H, s), 1,84-1,76 (2H, multiplete), 1,69-1,63 (2H, multiplete), 1,59 (3H, s), 1,26 (6H,s). Análisis elemental: esperado C(72,55), H(7,18), N(3,02); real C(72,67), H(7,22), N(2,98).
Compuesto 228 (RC)
56
Compuesto II. A una solución de 3,5-dimetoxianilina (Compuesto I, 1,53 g, 10 mmol) en DCM (20 ml) se añadió cloruro de metanosulfonilo (0,88 ml, 10 mmol). Se añadió gota a gota TEA (1,40 ml, 10 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 15 h. Se llevó producto crudo a sequedad y se purificó por cromatografía rápida (acetato de etilo al 30% /hexano), dando el compuesto II (2,10 g, 91%) como un sólido blanco. ^{1}H NMR \delta (300Hz, CDCl_{3}) 2,96 (s, 3H), 3,71 (s, 6H), 6,20 (d, 1H, J=3Hz), 6,34 (d, 2H, J=3Hz), 6,76 (s, 1H). APCI-MS m/z 232 (M+H)^{+}.
Compuesto III. A una solución de (CH_{3})_{4}NNO_{3} (1,12 g, 7,89 mmol) en DCM (10 ml) se añadió gota a gota anhídrido tríflico. Se agitó la mezcla de reacción a 0ºC durante 1,5 h. En un embudo de goteo se puso el compuesto II (1,75 g, 7,51 mmol) en 10 ml de DCM y se añadió la solución a la mezcla de reacción de triflato de nitronio a -78ºC. Se mantuvo la mezcla de reacción a -78ºC durante 30 min y se calentó gradualmente a temperatura ambiente. Se agitó durante 15 h. Se sofocó la reacción con NaHCO_{3} al 5% (50 ml) y se agitó la mezcla durante 30 min. Se extrajo la capa acuosa con DCM (3 X 20 ml). Se secaron las capas de DCM reunidas sobre Na_{2}SO_{4}. Se purificó el producto crudo por HPLC, dando el compuesto III (250 mg, 11%) como un sólido blanco. ^{1}H NMR \delta (300Hz, CDCl_{3}) 3,03 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,90 (s, 3H), 6,32 (d, 1H, J=3Hz), 6,88 (d, 1H, J=3Hz), 8,31 (s, 1H). APCI-MS m/z 275 (M-H)^{-}.
Compuesto IV. A una solución del compuesto III (106 mg, 0,38 mmol) en EtOH (2 ml) se añadieron 20 mg de Pd/C y NH_{2}NH_{2} (1 ml). Se mantuvo la mezcla de reacción a reflujo durante 9 h. Se pasó la mezcla de reacción a través de un lecho de celita. Se llevó la solución a sequedad para obtener el compuesto IV como un sólido pardo (90 mg, 95%). Este compuesto se usó directamente en la siguiente etapa.
Compuesto 228 (RC)
A una solución del compuesto IV (39 mg, 0,16 mmol), cloruro de 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil]-2-furoilo (60 mg, 0,174 mmol) en DCM (1 ml) se añadió TEA (44 \mul, 0,31 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. Por cromatografía rápida (acetato de etilo al 30%/hexano) se obtuvo el compuesto 228 (65 mg, 74%) como un sólido blanco. ^{1}H NMR (300Hz, CDCl_{3}) 1,04 (m, 12H), 1,45 (m, 4H), 2,09 (s, 3H), 2,71 (s, 3H), 3,60 (s, 3H), 3,63 (s, 3H), 3,78 (s, 2H), 5,89 (d, 1H, J=3Hz), 6,17 (d, 1H, J=3Hz), 6,58 (d, 1H, J=3Hz), 6,85 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 6,96 (d, 1H, J=3Hz), 7,90 (s, 1H), 8,24 (s, 1H). APCI-MS m/z 556
(M+H)^{+}.
A continuación se muestran ejemplos adicionales (NMR) de algunos compuestos
Compuesto 20
^{1}H NMR \delta (300Hz, CDCl_{3}) 1,26 (m, 12H), 1,66 (m, 4H), 2,28 (s, 3H), 3,82 (s, 6H), 3,96 (s, 2H), 6,04 (d, 1H, J=6Hz), 6,60 (s, 1H), 6,62 (s, 1H), 7,05 (m, 3H), 7,23 (t, 1H, J=6Hz), 7,44 (s, 1H). APCI-MS m/z 462 (M+H)^{+}.
Compuesto 126 (RC)
^{1}H NMR \delta (300Hz, DMSO) 2,20 (s, 3H), 2,27 (s, 6H), 3,71 (s, 6H), 3,98 (s, 2H), 5,93 (d, 1H, J=3Hz), 6,68 (s, 1H), 6,69 (s, 1H), 6,86 (d, 2H, J=3Hz), 7,10 (d, 1H, J=3Hz), 7,23 (t, 1H, J=7Hz), 9,04 (s, 1H). APCI-MS m/z 379 (M+H)^{+}.
Compuesto 140 (RC)
^{1}H NMR \delta (300Hz, DMSO) 2,28 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 3,72 (s, 6H), 4,10 (s, 2H), 6,00 (d, 1H, J=3Hz), 6,60 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 6,71 (s, 1H), 7,10 (m, 2H), 7,24 (t, 1H, J=6Hz), 9,04 (s, 1H). APCI-MS m/z 458 (M+H)^{+}.
Compuesto 211 (RC)
^{1}H NMR \delta (300Hz, CDCl_{3}) 3,76-3,83 (m, 15H), 4,07 (s, 2H), 5,95 (d, 1H, J=3Hz), 6,60 (s, 1H), 6,57-6,62 (m, 3H), 6,78 (d, 1H, J=9Hz), 7,03 (d, 1H, J=3Hz), 7,19 (t, 1H, J=6Hz), 7,46 (s, 1H). APCI-MS m/z 428 (M+H)^{+}.
Compuesto 220 (RC)
^{1}H NMR \delta (300Hz, CDCl_{3}) 3,72-3,77 (m, 15H), 3,90 (s, 2H), 5,78 (d, 1H, J=3Hz), 6,08 (s, 2H), 6,52-6,55 (m, 2H), 6,94 (d, 1H, J=9Hz), 7,12 (t, 1H, J=9Hz), 7,39 (s, 1H). 4PCI-MS m/z 428 (M+H)^{-}.
Compuesto 226 (RC)
^{1}H NMR \delta (300Hz, CD_{3}OD) 2,33-2,48 (m, 12H), 3,84 (s, 6H), 4,19 (s, 2H), 5,81 (d, 1H, J=3Hz), 6,73 (d, 2H, J=9Hz), 7,06 (d, 1H, J=3Hz), 7,29 (t, 1H, J=9Hz). APCI-MS m/z 472 (M+H)^{+}.
Compuesto 231 (RC)
^{1}H NMR \delta (300Hz, CDCl_{3}) 0,67 (t, 3H, J=6Hz), 1,27 (m, 6H), 1,70 (m, 2H), 3,62 (s, 3H), 3,80-3,83 (m, 6H), 4,02 (s, 2H), 6,02 (d, 1H, J=3Hz), 6,60 (d, 2H, J=9Hz), 6,83 (d, 1H, J=3Hz), 7,07-7,19 (m, 4H), 7,43 (s, 1H). APCI-MS m/z 438 (M+H)^{+}.
Compuesto 232 (RC)
^{1}H NMR \delta (300Hz, CDCl_{3}) 0,66 (t, 3H, J=6Hz), 1,23 (m, 6H), 1,54-1,62 (m, 2H), 3,80-3,81 (m, 12H), 4,01 (s, 2H), 6,00 (d, 1H, J=3Hz), 6,81 (d, 2H, J=9Hz), 6,82 (d, 1H, J=3Hz), 7,06-7,28 (m, 4H). APCI-MS m/z 468 (M+H)^{+}.
Ejemplos de referencia de otros compuestos que contienen aromáticos 
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57
Síntesis de 5-(5-ciclohexil-2-metilbencil)-N-(2,4,6-trimetoxifenil)-2-furamida (RC)
A una mezcla del compuesto 1 (5,0 g, 20,3 mmol) y el furoato de metilo (3,5 g, 20,3 mmol) en 100 ml de nitrometano se añadió una solución de AlCl_{3} (5,4 g, 40,6 mmol) en CH_{3}NO_{2} (50 ml) a temperatura ambiente. Se calentó la solución a 70 \sim 75ºC durante la noche. La mezcla de color marrón oscuro se enfrió a temperatura ambiente y se vertió lentamente sobre 300 ml de hielo-agua. Se extrajo la mezcla con acetato de etilo. La capa orgánica concentrada se purificó por cromatografía en gel de sílice y se eluyó con hexano/acetato de etilo (15:1 a 9:1 v/v) para dar 920 mg del compuesto 2, que después se hidrolizó y se acopló con la trimetoxianilina según el procedimiento general para dar el compuesto con un buen rendimiento. ^{1}H NMR (CDCl_{3}) \delta 1,23-1,48 (m, 5H), 1,73-1,86 (m, 5H), 2,31 (s, 3H), 2,51 (m, 1H), 3,83 (s, 1H), 4,02 (s, 2H), 6,03 (s, 1H), 7,44 (s, 1H) MS (APCI): 464,2 (M+1)
58
Síntesis de 5-(5-acetil-2,4-dimetilbencil)-N-(2,4,6-trimetoxifenil)-2-furamida (RC)
Una mezcla del compuesto 3 (14 g, 94,4 mmol), furoato de metilo (16,4 g, 94,4 mmol) y AlCl_{3} (25 g, 189 mmol) en 200 ml de nitrometano se agitó y se calentó a 80ºC durante la noche. Se recogió la mezcla y se purificó en columna de gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo (9:1 v/v) para dar una mezcla de los compuestos 4 y 5 (3:1, total 16,2 g). La mezcla de 4 y 5 (2,0 g) se hidrolizó en NaOH 2 N /MeOH (1:1 v/v) a temperatura ambiente para dar una mezcla de los compuestos 6 y 7, que se recristalizó en acetona y heptano para obtener el compuesto 6 (460 mg).
Se trató el compuesto 6 (150 mg, 55 mmol) con cloruro de tionilo y se acopló con trimetoxi-anilina para dar AXC07485 (124 mg). ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 2,31 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,54 (s, 3H), 3,80 (s, 9H), 4,02 (s, 2H), 6,00 (d, 1H), 6,16 (s, 2H), 7,08 (s, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), MS (APCI): 438,7 (M+1)
Síntesis de 5-(5-isopropenil-2,4-dimetilbencil)-N-(2,4,6-trimetoxifenil)-2-furamida
59
A una solución del compuesto 6 (250 mg, 0.92 mmol) en 5 ml de THF seco a 0ºC bajo N_{2} se añadió metil-litio (1,4 M en hexano, 3 equivalentes). Se agitó la solución a 0ºC durante 3 horas, se sofocó con agua y se extrajo con acetato de etilo. Se secó la capa orgánica sobre sulfato de magnesio y se concentró a presión reducida. El compuesto crudo se trató con SOCl_{2} y se acopló con trimetoxi-anilina para dar AXC 07499 (36 mg). ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 1,80 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 3,59 (s, 9H), 3,75 (s, 2H), 4,60 (d, 1H), 4,95 (d, 1H), 5,81 (d, 1H), 5,95 (s, 2H), 6,71 (s, 1H), 6,79 (s, 1H), 6,89 (d, 1H), 7,18 (s, 1H). MS (APCI): 436,2 (M+1).
Síntesis de 5-[(4,6-dimetil[1,1'-bifenil]-3-il)metil]-N-(2,4,6-trimetoxifenil)-2-furamida (RC)
60
Se realizó la reacción de Friedel-Crafts del compuesto 9 (10 g, 57,3 mmol), furoato de metilo (12,7 g, 68,7 mmol) y AlCl_{3} (9,1 g, 68,7 mmol) en nitrometano a 80ºC durante 2 horas. Se vertió la solución en 200 ml de hielo-agua y se extrajo con acetato de etilo. Se concentró la capa orgánica y se purificó en columna de gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo (9:1 v/v) para dar una mezcla de los regioisómeros 10 y 11 (15,5 g) con una relación de 2:1.
Se hidrolizó la mezcla en NaOH 2 N/MeOH (1:1 v/v) para dar la mezcla de análogos ácidos.
La mezcla ácida (2,3 g, 7,4 mmol), ácido benceno-borónico (1,1 g, 8,9 mmol), [P(Ph)_{3}]_{4}Pd, y carbonato de potasio (2 N, 11 ml) en DMF (20 ml) se calentó a 80ºC durante la noche. Después de tratamiento acuoso, el residuo se pasó a través de una columna de gel de sílice y se eluyó con una mezcla de disolventes hexano/acetato de etilo/ácido acético (7:3:1 v/v/v) para dar una mezcla de 2 regioisómeros que se recristalizó en hexano y acetato de etilo para dar el compuesto 12 (610 mg). El compuesto 12 se acopló con trimetoxianilina mediante el procedimiento estándar para dar AXC07468 con buen rendimiento. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 2,24 (d, 3H), 2,33 (d, 3H), 3,82 (s, 6H), 3,84 (s, 3H), 4,02 (s, 2H), 6,03 (d, 1H), 6,18 (s, 2H), 7,06 (s, 2H), 7,12 (s, 1H), 7,29-7,40 (m, 5H). MS (APCI): 472,1 (M+1).
Síntesis de 5-[5-(2,2-dimetilpropanoil)-2,4-dimetoxibencil]-N-(2,4,6-trimetoxifenil)-2-furamida (RC)
61
El compuesto 15 se preparó en dos etapas de la reacción de Friedel Crafts (véase procedimiento general) a partir del compuesto 13 con moderado rendimiento con buena regio-selectividad. El compuesto 15 se hidrolizó y se acopló con trimetoxianilina para dar el compuesto. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 1,18(s, 9H), 3,79 (s, 3H), 3,81 (s, 6H), 3,85 (s, 6H), 3,93 (s, 2H), 6,03 (d, 1H), 6,15 (s, 2H), 6,45 (s, 1H), 6,86 (s, 1H), 7,11 (s, 1H), 7,40 (s, 1H). Ms (APCI) 512,1 (M+1).
Síntesis de 5-[(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)carbonil]-N-(2,4,6-trimetoxifenil)-2-furamida y 5-[hidroxi(3,5,5,8,8-pentametil-5,6,7,8-tetrahidro-2-naftalenil)metil]-N-(2,4,6-trimetoxifenil)-2-furamida (RC) 
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62
6200 
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Una mezcla del compuesto 19 (9,0 g, 27,5 mmol) y MnO_{4} (8,2 g, 82,7 mmol) en una mezcla de los disolventes cloroformo y dicloroetano se calentó a 70ºC durante la noche. Después de tratamiento acuoso, se pasó el compuesto 20 a través de una columna de gel de sílice y se eluyó con hexano/acetato de etilo/ácido acético (90:10:1 v/v/v). Se obtuvo AXC07042 por el procedimiento general durante la formación del enlace amida. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 1,26-1,31 (2s, 12H), 1,70 (s, 4H), 3,81 (s, 6H), 3,83 (s, 3H), 6,18 (s, 2H), 7,05 (d, 1H), 7,22 (s, 1H), 7,29 (d, 1H), 7,52 (s, 1H), 7,68 (s, 1H). MS (APCI): 506,2 (M+1).
El compuesto (50 mg) se trató con NaBH_{4} (1,5 equivalentes) en etanol (2 ml) y éter dietílico (0,5 ml). Se agitó la solución a temperatura ambiente durante 1,5 horas, se sofocó con agua, y se extrajo con acetato de etilo. Se concentró la capa orgánica para dar el compuesto como un sólido blanco. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 1,24,1,28,1,29 (3s, 12H), 1,66, 1,67 (2s, 4H), 2,29 (s, 3H), 2,55 (d, 1H), 3,80 (s, 6H), 3,82 (s, 3H), 5,98 (d, 1H), 6,17 (s,2H), 7,08, 7,10 (2s, 2H), 7,38 (s, 1H), 7,41 (s, 1H). MS (APCI): 508,2 (M+1).
Síntesis de 5-(5-{1-[(etilamino)carbonil]ciclopropil}-2-metilbencil]-N-(2,4,6-trimetoxifenil)-2-furamida (RC) 
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63
Se calentó a reflujo durante 3 minutos una solución del compuesto 22 (2,0 g, 11,3 mmol) en cloruro de tionilo (8 ml). El cloruro de tionilo sin reaccionar se separó mediante un evaporador rotatorio. El residuo concentrado se disolvió en CH_{2}Cl_{2}. Se añadió a esta solución etilamina (exceso) para dar el compuesto 23 (1,3 g). El compuesto se convirtió en AXC07555 mediante 3 etapas (reacción de Friedel Crafts, hidrólisis, y formación del enlace amida) como se describe en los procedimientos generales. ^{1}H NMR (CDCl_{3}): \delta 0,94-1,02 (m, 5H), 1,59 (m, 2H), 2,34 (s, 3H), 3,17 (q, 2h), 3,80, 3,81 (2s, 9H), 4,01 (s, 2H), 5,39 (brd, 1H), 6,01 (d, 1H), 6,17 9s, 2H), 7,11 (d, 1H), 7,21 (m, 2H), 7,31 9s, 1H). MS (APCI): 493,2 (M+1).
Ejemplos de referencia adicionales 
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64
Un intermedio útil se puede preparar como sigue:
Preparación de 5-(clorometil)-2-furoato de metilo 
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65
Materiales requeridos
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Procedimiento detallado para un lote a escala de 2,88 mol de 5-(cloro-metil)-2-furoato de metilo (2)
- Un matraz de fondo redondo (r.b.) de 12 litros, de 3 bocas, se equipa con un embudo de adición; un agitador eléctrico elevado; un par termoelétrico; y un baño de hielo. (Se recomienda una atmósfera de nitrógeno, pero puede no ser necesariamente requerida)
- Se cargan 2,2 litros de DCM al r.b. seguido por 2,2 litros de HCl conc. (No se observa ninguna reacción exotérmica significativa; se forman dos capas)
- Se empieza la agitación. (Asegúrese la mezcla adecuada de ambas fases)
- Se cargan 1,1 litros de H_{2}SO_{4} al embudo de adición como el espacio lo permita. Se enfría el reactor a 0-10ºC. Se empieza la adición de ácido sulfúrico gota a gota inicialmente hasta que se calma la reacción exotérmica (aproximadamente 1/2 adición), y después se aumenta la velocidad de adición hasta un ligero chorro. (Manténgase la temperatura por debajo de 20ºC para seguridad)
- Se cambia el baño de enfriamiento a agua a temperatura ambiente. (Esta actuará como un sumidero de calor durante las subsiguientes adiciones sin reducir la velocidad de la reacción significativamente)
- Se cargan 0,371 kg de 2-furoato de metilo al r.b. en una porción. (No se observa reacción exotérmica, solución marrón verdosa)
- Se cargan 0,520 kg de ZnCl_{2} en muchas porciones. (Algunas burbujas - probablemente HCl gas; la reacción exotérmica se controla por el baño de agua)
- Se cargan 0,371 litros de formaldehído para lavar el embudo de adición. Se añade al reactor a lo largo de 2,5 - 3,5 horas. (La temperatura se mantiene a temperatura ambiente por el baño de agua; la adición lenta da como resultado menos reacciones de polimerización entre el formaldehído "libre")
- Se agita durante la noche a temperatura ambiente.
- Cuando la reacción es completa según la TLC (véase más adelante) se separa la capa acuosa. Se filtra la capa orgánica a través de un tapón de 0,550 kg de sílice (empaquetado seco, aprox. 10 cm de espesor). Se eluye con aproximadamente 4 litros de DCM hasta que por TLC no se detecta que sale más producto. (Asegúrese que esta etapa se realiza con ventilación apropiada, ya que algunos vapores de ácido están todavía presentes, incluso en el filtrado)
- Se concentra para dar un aceite que varía en color de amarillo a marrón (aproximadamente 0,5 litros)
- Se carga una cantidad igual de DCM, aproximadamente 0,5 litros. Se lava con 2 x 0,2 litros de agua destilada. Después se lava la capa orgánica con 0,05 litros de NaHCO_{3} saturado en 0,15 litros de agua destilada. (Asegúrese un pH 7-10, no hay una pérdida significativa de producto en la capa acuosa)
- Se separa la capa acuosa, y se seca la capa orgánica con Na_{2}SO_{4}. Se filtra a través de 0,05 kg de sílice (aproximadamente 5 cm de espesor). Se eluye con DCM hasta que no sale más producto.
- Se concentra por rotavapor usando una campana de vacío. Después se pone el aceite en una bomba de alto vacío durante la noche. (Aceite de color amarillo a marrón claro)
Intervalo de rendimiento: 95-100%
Intervalo de pureza: 95-98% (HPLC A%)
Comentarios adicionales
Visual: La reacción es seguida por TLC (254 nm) usando EtOAc al 30% en Hexano (rf del material de partida - 0,52, rf del producto - 0,40).
HPLC: método TFA (método y espectro adjuntos). Tiempo de retención del material de partida = 12,67 min, tiempo de retención del producto = 17,37 min.
NMR: ^{1}H (CDCl_{3}) (espectro adjunto) 3,93 (s, 3H), 4,63 (s, 2H), 6,52 (d, 1H), 7,18 (d, 1H).
Si la reacción no se ha completado, se puede añadir cada 4 horas el 10% del volumen original de formaldehído. Los efectos de la temperatura no han sido estudiados muy extensamente, pero ha sido conveniente mantener las temperaturas de los reactores en los intervalos especificados para cada etapa. Los vapores ácidos presentes en la capa orgánica incluso después de la filtración hacen que sea problemático el manejo fuera de la campana de humos, por ello se debe tener cuidado cuando se transfiere el material fuera de la campana hasta que se neutralice el pH. Si la velocidad de adición del formaldehído se aumenta, la formación de polímeros evitará que la reacción se complete debido al consumo de formaldehído. Se deben tomar acuerdos con el departamento de seguridad antes del comienzo de este procedimiento de tal modo que se puedan tomar medidas para acomodar los grandes volúmenes de ácido que se van a descargar en la capa acuosa. La neutralización de la capa ácida acuosa requiere grandes volúmenes de base, produce un considerable exotermo, y requiere un periodo de adición prolongado, y por tanto no se recomienda. El producto final se debe mantener frío, ya que no se dispone de datos de estabilidad de este producto. El mantenimiento del producto en un contenedor de Nalgene a -20ºC hace que el producto cristalice, oscureciéndose ligeramente el material, pero parece que no tiene ningún efecto sobre las reacciones posteriores que usan este material.
Los compuestos de la presente invención deben ser útiles para tratar:
1. cánceres/tumores dependientes de hormonas
2. cánceres/tumores dependientes de hormonas mediante interacciones directas
3. para uso en otros mecanismos de acción.
Se cree que esta invención incluye muchas otras realizaciones que no están aquí específicamente descritas, por consiguiente esta descripción no debe ser leída como limitada a los anteriores ejemplos o realizaciones preferidas.
Los siguientes compuestos han sido preparados como se ha discutido antes. Ciertas propiedades de algunos de los compuestos han sido medidas también usando técnicas discutidas anteriormente. S%R es el sustrato restante. Cuanto más próximo está a cero S%R, más próxima al 100% está la inhibición.
Esta Tabla muestra la biodisponibilidad de los compuestos según la invención. Las propiedades fueron determinadas usando los métodos descritos previamente.
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Los siguientes compuestos y compuestos de referencia han sido preparados y analizados usando los procedimientos discutidos previamente. Los datos se presentan en dos partes y muestran la unión de un compuesto a su receptor.
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Claims (7)

1. Un compuesto que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en
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y
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o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
2. Un compuesto que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en
365
y
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o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
\newpage
3. Un compuesto que tiene la fórmula:
367
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
4, Un compuesto que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:
368
y
369
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
5. Un compuesto que tiene la fórmula:
370
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
6. Un compuesto que tiene una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:
371
y
372
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
7. Una composición farmacéutica que comprende: una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o sal farmacéuticamente aceptable como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1-6; y un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
8. El uso de un compuesto o sal farmacéuticamente aceptable como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para la fabricación de un medicamento para regular la secreción de gonadotropinas en los mamíferos.
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Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10199033I2 (de) * 1992-04-22 2003-01-09 Ligand Parmaceuticals Inc Retinoid-x Rezeptor selektive Verbindungen
BR0010655A (pt) * 1999-03-24 2002-02-13 Anormed Inc Compostos heterocìclicos para ligação ao receptor de quimiocina
CO5370679A1 (es) * 1999-06-01 2004-02-27 Smithkline Beecham Corp Inhibidores fab 1
TWI243164B (en) 2001-02-13 2005-11-11 Aventis Pharma Gmbh Acylated indanyl amines and their use as pharmaceuticals
JP2005501006A (ja) * 2001-06-06 2005-01-13 アグロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 非ペプチドＧｎＲＨ薬、医薬組成物、その利用法、これら物質とその中間体の調製方法
CN101624391A (zh) 2001-06-11 2010-01-13 病毒化学医药公司 用作黄病毒感染抗病毒剂的噻吩衍生物
ES2367422T3 (es) 2001-10-09 2011-11-03 Amgen Inc. Derivados de imidazol como agentes antiinflamatorios.
GB0126292D0 (en) * 2001-11-01 2002-01-02 Smithkline Beecham Plc Compounds
JP2005170790A (ja) * 2002-01-09 2005-06-30 Ajinomoto Co Inc Ｎ−アルキルスルフォニル置換アミド誘導体
US6521395B1 (en) * 2002-01-30 2003-02-18 Eastman Kodak Company Infrared couplers for incorporating and recovering metadata
WO2003068769A1 (en) * 2002-02-12 2003-08-21 Pfizer Inc. Non-peptide compounds affecting the action of gonadotropin-releasing hormone (gnrh)
TW200304820A (en) * 2002-03-25 2003-10-16 Avanir Pharmaceuticals Use of benzimidazole analogs in the treatment of cell proliferation
BR0312123A (pt) 2002-06-13 2005-03-29 Pfizer Agentes de gnrh não peptìdicos, composições farmacêuticas e métodos para o seu uso
ES2270129T3 (es) * 2002-11-20 2007-04-01 Paradigm Therapeutics Ltd. Compuestos heterociclicos del silicio y su utilizacion en el tratamiento de enfermedades o condiciones asociadas a gnrh (hormona liberadora de gonadotropina).
CN100451004C (zh) * 2003-03-31 2009-01-14 大正制药株式会社 嘧啶衍生物
US20050197350A1 (en) * 2003-03-31 2005-09-08 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Novel quinoline, tetrahydroquinazoline, and pyrimidine derivatives and methods of treatment related to the use thereof
US7429603B2 (en) * 2003-04-25 2008-09-30 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. C-fms kinase inhibitors
US7427683B2 (en) * 2003-04-25 2008-09-23 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. c-fms kinase inhibitors
JP2006526660A (ja) * 2003-06-05 2006-11-24 バーテックス　ファーマシューティカルズ　インコーポレイテッド Ｖｒ１レセプターのモジュレーター
RU2303594C2 (ru) * 2003-07-09 2007-07-27 Пэредайм Терапьютикс Лтд. Кремнийорганические соединения и их применение
US20070111967A1 (en) * 2003-07-09 2007-05-17 Miller David J Organosilicon compounds and their use
KR20060033904A (ko) * 2003-07-10 2006-04-20 패러다임 테라퓨틱스 리미티드 규소 화합물과 그 용도
US20050182061A1 (en) * 2003-10-02 2005-08-18 Jeremy Green Phthalimide compounds useful as protein kinase inhibitors
US20090291915A1 (en) * 2004-12-17 2009-11-26 Graham Andrew Showell Silicon Compounds and Their Use
BRPI0610283A2 (pt) 2005-05-13 2010-10-19 Virochem Pharma Inc composto, uso do mesmo na preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma infecção por vìrus de hepatite c, composição farmacêutica e combinação farmacêutica
US8193206B2 (en) 2005-06-14 2012-06-05 Taigen Biotechnology Co., Ltd. Pyrimidine compounds
JP5118029B2 (ja) 2005-06-14 2013-01-16 タイゲン バイオテクノロジー カンパニー，リミテッド ピリミジン化合物
WO2007000582A1 (en) * 2005-06-28 2007-01-04 Takeda Cambridge Limited Heterocyclic non-peptide gnrh antagonists
EP1910385B1 (en) * 2005-08-04 2013-07-24 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Benzothiazoles and thiazolopyridines as sirtuin modulators
JP5255559B2 (ja) 2006-03-31 2013-08-07 アボット・ラボラトリーズ インダゾール化合物
US20080070987A1 (en) * 2006-05-12 2008-03-20 Francesc Yraola Font Meta-xylylenediamine vanadate salts
TW200916472A (en) 2007-06-20 2009-04-16 Sirtris Pharmaceuticals Inc Sirtuin modulating compounds
CN101883760A (zh) * 2007-10-11 2010-11-10 沃泰克斯药物股份有限公司 用作电压-门控钠通道抑制剂的杂芳基酰胺类
JPWO2009057199A1 (ja) * 2007-10-31 2011-03-10 財団法人乙卯研究所 レチノイドプロドラッグ化合物
AU2008355098B2 (en) 2008-04-21 2012-11-15 Gpcr Therapeutics, Inc Heterocyclic compounds
UY31984A (es) * 2008-07-16 2010-02-26 Boehringer Ingelheim Int DERIVADOS DE 1-(3,4-difluorobencil)-6-oxo-1,6-dihidropirimidin-5-carboxamidas N-sustituidas y de 2-(3,4-difluorobencil)-3-oxo-2,3-dihidro-1H-pirazol-4-carboxamidas N-sustituidas.
WO2010056847A2 (en) 2008-11-13 2010-05-20 Taigen Biotechnology Co., Ltd. Lyophilization formulation
CN103168032A (zh) 2010-08-05 2013-06-19 安美基公司 抑制间变性淋巴瘤激酶的苯并咪唑和氮杂苯并咪唑化合物
CN102050823A (zh) * 2010-10-27 2011-05-11 华东理工大学 新型光稳定剂-鸟嘌呤类似物的合成及表征
WO2012112567A1 (en) * 2011-02-15 2012-08-23 Georgetown University Small molecule inhibitors of agbl2
US9493451B2 (en) 2011-05-16 2016-11-15 Bionomics Limited Amine derivatives as potassium channel blockers
JP6021910B2 (ja) 2011-07-26 2016-11-09 サノフイ ３−ヘテロアロイルアミノ−プロピオン酸誘導体及び医薬としてのそれらの使用
EP2776411B1 (en) * 2011-11-07 2019-06-26 The University of Queensland Modulators of c3a receptors
ES2858511T3 (es) * 2012-10-17 2021-09-30 Exonate Ltd Compuestos útiles para tratar neovascularización ocular
GB201300304D0 (en) * 2013-01-08 2013-02-20 Kalvista Pharmaceuticals Ltd Benzylamine derivatives
WO2017070235A1 (en) * 2015-10-19 2017-04-27 Attenua, Inc. Antitussive compositions and methods
CN118206529A (zh) 2017-09-04 2024-06-18 C4医药公司 二氢苯并咪唑酮
WO2020181232A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 C4 Therapeutics, Inc. Heterocyclic compounds for medical treatment

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3499002A (en) * 1968-06-20 1970-03-03 Robins Co Inc A H 1-carbamoyl-3-aroylpyrrolidines
NL6913261A (es) * 1968-09-09 1970-03-11
US3932444A (en) * 1972-04-28 1976-01-13 E. I. Du Pont De Nemours & Co. 4-Imidazolylsulfonylimidazoles
US4013647A (en) * 1976-03-23 1977-03-22 American Home Products Corporation Morpholine containing tetrazole-5-carboxamide derivatives
GB1491776A (en) * 1976-09-08 1977-11-16 Pfizer Ltd Thiadiazoles
US4096153A (en) * 1977-01-21 1978-06-20 American Home Products Corporation Arylene-bis-tetrazole-5-carboxamides
US5236928A (en) * 1991-03-19 1993-08-17 Merck & Co., Inc. Imidazole derivatives bearing acidic functional groups at the 5-position, their compositions and methods of use as angiotensin II antagonists
WO1993003058A2 (en) 1991-07-01 1993-02-18 University Technologies International Inc. NON-DESENSITIZING ANALOGS OF GnRH AND OTHER BIOLOGICALLY ACTIVE LIGANDS
EP0619814A1 (en) * 1991-12-31 1994-10-19 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Oxadiazole derivatives having acetylcholinesterase-inhibitory and muscarinic agonist activity
DE69628705T2 (de) * 1995-08-24 2004-05-13 Basf Ag Isoxazole- und Isothiazole-5-carboxamid Derivate, deren Herstellung und deren Verwendung als Herbizide
SK77498A3 (en) * 1995-12-14 1999-01-11 Merck & Co Inc Nonpeptide derivatives, pharmaceutical composition containing them and their use
US6150352A (en) * 1996-05-20 2000-11-21 Merck & Co., Inc. Antagonists of gonadotropin releasing hormone
US5878393A (en) * 1996-09-09 1999-03-02 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. High quality concatenative reading system

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