ES2238034T3

ES2238034T3 - Compuestos y metodos para la modulacion de receptores estrogenicos.

Info

Publication number: ES2238034T3
Application number: ES00990966T
Authority: ES
Inventors: Shripad S. Bhagwat; Jeffrey A. Mckie; Sak Khammungkhune
Original assignee: Signal Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Signal Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 2000-12-29
Publication date: 2005-08-16
Anticipated expiration: 2020-12-29
Also published as: IL150463A0; WO2001049673A2; CN1437591A; EP1246814A2; DE60018215T2; AU781282B2; AU3077101A; JP2003519219A; HK1058521A1; CA2396059A1; EP1246814B1; KR20020075388A; WO2001049673A3; CN1281598C; ATE289300T1; DK1246814T3; PT1246814E; DE60018215D1

Abstract

Un compuesto que tiene la estructura (I): **(Fórmula)** o un estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; fórmula en la que: n es 0, 1, 2, 3 ó 4; R1 es un arilo C6-12, arilalquilo C7-12, heterociclo C3-12 o heterocicloalquilo C4-16 sustituido o no sustituido; R2 es NRaRb en que Ra y Rb son independientemente hidrógeno, alquilo C1-8, arilo C6-12 o heterociclo y en que Ra y Rb están opcionalmente sustituidos con hasta tres sustituyentes independientemente seleccionados entre alquilo C1-6, halógeno, alcoxilo C1-6, hidroxilo y carboxilo; o R2 es un anillo heterocíclico con la estructura siguiente: **(Fórmula)** en que: m1 y m2 son independientemente 0, 1 ó 2, y m1 y m2 no son 0 los dos; A es CH2, O, S o NH; Z representa 0, 1, 2 ó 3 sustituyentes de anillo heterocíclico seleccionados entre halógeno, alquilo C1-8, arilo C6-12, arilalquilo C7-12, heterociclo C3-12 y heterocicloalquilo C4-16; y en que cualquier átomo de hidrógeno del anillo heterocíclico puede, tomado junto con un átomo de hidrógeno de un átomo adyacente del anillo heterocíclico, formar un doble enlace.

Description

Compuestos y métodos para la modulación de receptores estrogénicos.

Este invento se dirige, en general, a antagonistas y agonistas estrogénicos y a compuestos para inhibir citoquinas, y, más específicamente, a compuestos que modulan selectivamente la actividad del receptor estrogénico beta (ER-\beta; del inglés, estrogen receptor-beta), así como a composiciones farmacéuticas y métodos con ellas relacionados.

Antecedentes del invento

La hormona estrogénica presenta un amplio espectro de efectos sobre tejidos tanto en hembras como en machos. Muchos de estos efectos biológicos son positivos, incluyendo el mantenimiento de la densidad ósea, la protección cardiovascular, la función del sistema nervioso central (CNS; del inglés, central nervous system), y la protección de sistemas orgánicos frente a los efectos del envejecimiento. Sin embargo, además de sus efectos positivos, el estrógeno es también un potente factor de crecimiento en la mama y el endometrio, que aumenta el riesgo de cáncer.

Hasta hace poco, se supuso que el estrógeno se une a un único receptor estrogénico (ER) de células. Como se discute más adelante, este sencillo planteamiento cambió significativamente cuando se clonó un segundo ER (ER-\beta; recibiendo el ER original el nuevo nombre de ER-\alpha) y cuando se descubrieron cofactores que modulan la respuesta del ER. Pueden unirse ligandos a dos diferentes ERs que, en presencia de coactivadores y/o correpresores tisularmente específicos, se unen a un elemento de respuesta a estrógenos de la región reguladora de genes o a otros factores de transcripción. Dada la complejidad de la señalización del ER, junto con la expresión tisularmente específica de
ER-\alpha y ER-\beta y sus cofactores, se reconoce ahora que los ligandos de ER pueden actuar como agonistas y antagonistas estrogénicos que remedan los efectos positivos, o bloquean los efectos negativos, del estrógeno de un modo tisularmente específico. Esto ha dado lugar al descubrimiento de una clase totalmente nueva de fármacos, a los que se hace referencia como Moduladores Selectivos del Receptor Estrogénico o SERMs (del inglés, Selective Estrogen Receptor Modulators). Estos fármacos presentan un significativo potencial para la prevención y/o el tratamiento del cáncer y la osteoporosis, así como de enfermedades cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer. Las enfermedades relativas a la reabsorción ósea, tal como la osteoporosis, son estados debilitantes que afectan a mucha gente y para las que sólo hay un tratamiento limitado. Por ejemplo, en Estados Unidos, la osteoporosis afecta a aproximadamente el 50% de las mujeres y aproximadamente el 10% de los hombres con edad superior a 50 años. En los individuos con osteoporosis, una pérdida aumentada de masa ósea da lugar a huesos frágiles y, como resultado, a un riesgo aumentado de fracturas óseas. Otras enfermedades relativas a la reabsorción ósea, tales como la enfermedad de Paget y el cáncer metastásico de huesos, presentan síntomas similares.

El hueso es un tejido vivo que contiene varios tipos diferentes de células. En individuos sanos, la cantidad de hueso creado por las células osteoblásticas está equilibrada con la cantidad de hueso eliminado o reabsorbido por las células osteoclásticas. En individuos que padecen una enfermedad relativa a la reabsorción ósea, hay un desequilibrio en la función de estos dos tipos de células. Quizás, el ejemplo mejor conocido de dicho desequilibrio es el rápido aumento de reabsorción ósea experimentado por mujeres posmenopáusicas. Dicha pérdida ósea acelerada se atribuye a una deficiencia estrogénica asociada con la menopausia. Sin embargo, el mecanismo de cómo la pérdida de estrógeno da lugar a una reabsorción ósea aumentada ha sido debatido durante mucho tiempo.

Recientemente, ciertos investigadores han sugerido que un aumento de citoquinas relacionadas con la reabsorción ósea, tales como la interleuquina 1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral (TNF; del inglés, tumor necrosis factor), puede ser responsable de la pérdida ósea posmenopáusica (Kimble et al., J. Biol. Chem. 271: 28.890-28.897, 1.996), y que inhibidores de estas citoquinas pueden disminuir parcialmente la pérdida ósea que sigue a una ovariectomía realizada a roedores (Pacifici, J. Bone Miner. Res. 11: 1.043-1.051, 1.996). Además, se ha comunicado que una interrupción de estrógeno conduce a un aumento de la secreción de IL-6 por células murinas de médula ósea y hueso (Girasole et al., J. Clin. Invest. 89: 883-891, 1.992; Jilka et al., Science 257: 88-91, 1.992; Kimble et al., Endocrinology 136: 3.054-3.061, 1.995; Passeri et al., Endocrinology 133: 822-828, 1.993), que anticuerpos contra IL-6 pueden inhibir el aumento de precursores osteoclásticos que tiene lugar en ratones desprovistos de estrógeno (Girasole et al., supra), y que la pérdida ósea que sigue a una ovariectomía no se produce en ratones transgénicos que carecen de IL-6 (Poli et al., EMBO J. 13: 1.189-1.196, 1.994).

Los tratamientos existentes para hacer más lenta la pérdida ósea implican generalmente la administración de compuestos tales como estrógeno, bisfosfonatos, calcitonina y raloxifeno. Sin embargo, estos compuestos se usan generalmente para tratamientos de larga duración y producen efectos secundarios indeseables. Además, dichos tratamientos se dirigen típicamente a la actividad de los osteoclastos maduros en lugar de a reducir su formación. Por ejemplo, el estrógeno provoca la apoptosis de osteoclastos mientras que la calcitonina causa que los osteoclastos se contraigan y separen de la superficie del hueso (Hughes et al., Nat. Med. 2: 1.132-36, 1.996; Jilka et al., Exp. Hematol. 23: 500-506, 1.995). Similarmente, los bisfosfonatos disminuyen la actividad de los osteoclastos, cambian su morfología y aumentan la apoptosis de los osteoclastos (Parfitt et al., J. Bone Miner. 11: 150-159, 1.996; Suzuki et al., Endocrinology 137: 4.685-4.690, 1.996).

Se cree también que las citoquinas desempeñan un papel importante en una diversidad de cánceres. Por ejemplo, en el contexto del cáncer de próstata, ciertos investigadores han mostrado que IL-6 es un factor de crecimiento autocrino/paracrino (Seigall et al., Cancer Res. 50: 7.786, 1.999) y potencia la supervivencia de tumores (Okamoto et al., Cancer Res. 57: 141-146, 1.997), y que anticuerpos anti-IL-6 neutralizantes reducen la proliferación celular (Okamoto et al., Endocrinology 138: 5.071-73, 1.997; Borsellino et al., Proc. Annu. Meet. Am. Assoc. Cancer Res. 37: A2801, 1.996). Se han comunicado resultados similares para IL-6 en cuanto al mieloma múltiple (Martínez-Maza et al., Res. Immunol. 143: 764-769, 1.992; Kawano et al., Blood 73: 517-526, 1.989; Zhang et al., Blood 74: 11-13, 1.989; Garrett et al., Bone 20: 515-520, 1.997; y Klein et al., Blood 78: 1.198-204, 1.991), el carcinoma de células renales (Koo et al., Cancer Immunol. 35: 97-105, 1.992; Tsukamoto et al., J. Urol. 148: 1.778-1.782, 1.992; y Weissglas et al., Endocrinology 138: 1.879-1.885, 1.997) y el carcinoma cervical (Estuce et al., Gynecol. Oncol. 50: 15-19, 1.993; Tartour et al., Cancer Res. 54: 6.243-6.248, 1.994; e Iglesias et al., Am. J. Pathology 146: 944-952, 1.995).

Además, se cree también que IL-6 está implicada en la artritis, particularmente en las artritis provocadas por adyuvantes, colágeno y antígenos (Alonzi et al., J. Exp. Med 187: 146-148, 1.998; Ohshima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8.222-8.226, 1.998; y Leisten et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 56: 108-115, 1.990), y se han presentado anticuerpos anti-IL-6 para el tratamiento de la artritis (Wendling et al., J. Rheumatol. 20: 259-262, 1.993). Además, se ha mostrado que el estrógeno provoca la supresión de la encefalomielitis autoinmune experimental y la artritis provocada por colágeno en ratones (Jansson et al., Neuroimmunol. 53: 203-207, 1.994).

Como se indicó anteriormente, se había supuesto previamente que el estrógeno se une a un único receptor estrogénico (ER) de células, causando cambios conformacionales que dan lugar a la liberación de proteínas de choque térmico y la unión del receptor, en forma de dímero, al llamado elemento de respuesta a estrógenos de la región promotora de una diversidad de genes. Además, los farmacólogos han creído generalmente que ligandos no esteroides de molécula pequeña compiten con el estrógeno por unirse al ER, actuando como antagonistas o agonistas en cada tejido en que se expresa el receptor estrogénico. De este modo, dichos ligandos han sido tradicionalmente clasificados como antagonistas o agonistas puros. Ya no se cree que esto sea correcto.

En lugar de ello, se sabe ahora que el estrógeno modula la farmacología celular a través de la expresión génica y que el efecto del estrógeno es mediado por receptores estrogénicos. Como se indicó anteriormente, actualmente hay dos receptores estrogénicos, ER-\alpha y ER-\beta. El efector del receptor estrogénico sobre la regulación génica puede ser mediado por una unión directa del ER al elemento de respuesta a estrógenos (ERE) - "ruta clásica" (Jeltsch et al., Nucleic Acids Res. 15: 1.401-14, 1.987; Bodine et al., Endocrinology 139: 2.048-2.057, 1.998), la unión del ER a otros factores de transcripción tales como NF-6B, C/EBP-\beta o AP-1 - ``ruta no clásica'' (Stein et al., Mol. Cell Biol. 15: 4.971-79, 1.995; Paech et al., Science 277: 1.508-10, 1.997; Duan et al., Endocrinology 139: 1.981-1.990, 1.998) y a través de efectos no genómicos que requieren receptores de canal iónico (Watters et al., Endocrinology 138: 4.030-4.033, 1.997; Improta-Brears et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4.686-4.691, 1.999; Gu et al., Endocrinology 140: 660-666, 1.999; Beyer et al., Eur. J. Neurosci. 10: 255-262, 1.998).

El progreso a lo largo de los últimos años ha mostrado que el ER se asocia con coactivadores (por ejemplo, SRC-1, CBP y SRA) y correpresores (por ejemplo, SMRT y N-CoR), que también modulan la actividad transcripcional del ER de un modo específico de tejidos y específico de ligandos. Además, cierta evidencia sugiere ahora que la mayoría de los genes regulados por estrógeno no tienen un clásico elemento de respuesta al estrógeno. En tales casos, el ER interacciona con los factores de transcripción críticos para la regulación de estos genes. Los factores de transcripción de los que se sabe que tienen su actividad modulada por el ER incluyen, por ejemplo, AP-1, NF-6B, C/EBP y Sp-1.

Dada la complejidad de la señalización del ER, así como los diversos tipos de tejido que expresan ER y sus cofactores, se cree ahora que los ligandos de ER ya no pueden ser clasificados simplemente como antagonistas o agonistas puros. Por lo tanto, se ha acuñado la expresión "modulador selectivo del receptor estrogénico" (SERM). Los SERMs se unen al ER, pero pueden actuar como agonistas o antagonistas de estrógeno en diferentes tejidos y sobre diferentes genes. Por ejemplo, dos de los fármacos mejor conocidos que actúan como SERMs son el tamoxifeno y el raloxifeno. Estudios con estos dos compuestos, así como con otros SERMs ahora en desarrollo, han demostrado que, en muchos casos, la afinidad de un SERM por su receptor no se correlaciona con su actividad biológica. Por lo tanto, los ensayos de unión de ligandos tradicionalmente usados en la exploración de nuevos moduladores del ER no han permitido distinguir entre selectividad tisular y actividad agonista/antagonista.

Más recientemente, se ha identificado y clonado un segundo receptor estrogénico, ER-\beta (Katzenellenbogen y Korach, Endocrinology 138: 861-2, 1.997; Kuiper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5.925-5.930, 1.996; Mosselman et al., FEBS Lett. 392: 49-53, 1.996). El ER-\beta y el ER clásico, de nuevo nombre ER-\alpha, tienen secuencias de aminoácidos significativamente diferentes en el dominio de unión a ligandos y los dominios de transactivación carboxi-terminales (\sim 56% de identidad de aminoácidos), y sólo una homología de 20% en su dominio de transactivación amino-terminal. Esto sugiere que algunos ligandos pueden tener mayor afinidad por un receptor que por otro. Además, los cambios conformacionales, dependientes de ligandos, de los dos receptores y la interacción con cofactores darán lugar a acciones biológicas muy diferentes por parte de un solo ligando. En otras palabras, un ligando que actúe como un antagonista sobre ER-\alpha puede muy bien actuar como un antagonista sobre ER-\beta. Un ejemplo de tal actividad ha sido descrito por Paech et al. (Science 277: 1.508-1.510, 1.997). En ese artículo, se comunica que el estrógeno activa un sitio AP-1 en presencia de ER-\alpha pero inhibe el mismo sitio en presencia de ER-\beta. Por contraste, el raloxifeno (Eli Lilly & Co.) y el tamoxifeno y el ICI-182,780 (Zeneca Pharmaceuticals) estimulan el sitio AP-1 a través de ER-\beta pero inhiben ese sitio en presencia de ER-\alpha. Otro ejemplo ha sido descrito por Sun et al. (Endocrinology 140: 800-4, 1.999). En este artículo, se comunica que el enantiómero R,R de un tetrahidrocriseno es un agonista sobre ER-\alpha pero un antagonista completo sobre ER-\beta, mientras que el enantiómero S,S es un agonista sobre ambos receptores.

Además, ER-\alpha y ER-\beta presentan distribuciones tisulares tanto solapantes como diferentes, según se analiza predominantemente mediante transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR; del inglés, reverse transcription-polymerase chain reaction) o hibridación in-situ a causa de la falta de buenos anticuerpos anti-ER-\beta. Sin embargo, algunos de estos resultados son controvertibles, lo que puede ser atribuible al método usado para medir ER, la especie analizada (rata, ratón, ser humano) y/o el estado de diferenciación de las células primarias aisladas. Muy a menudo, los tejidos expresan tanto ER-\alpha como ER-\beta, pero los receptores están situados en diferentes tipos celulares. Además, algunos tejidos (tal como el riñón) contienen exclusivamente ER-\alpha mientras que otros tejidos (tales como el útero, la hipófisis y el epidídimo) muestran una gran predominancia de ER-\alpha (Couse et al., Endocrinology 138: 4.613-4.621, 1.997; Kuiper et al., Endocrinology 138: 863-870, 1.997). Por contraste, los tejidos que expresan niveles elevados de ER-\beta incluyen la próstata, el testículo, los ovarios y ciertas zonas del cerebro (Brandenberger et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 83: 1.025-8, 1.998; Enmark et al., J. Clinic. Endocrinol. Metabol. 82: 4.258-65, 1.997; Laflamme et al., J. Neurobiol. 36: 357-78, 1.998; Sar y Welsch, Endocrinology 140: 963-71, 1.999; Shughrue et al., Endocrinology 138: 5.649-52, 1.997a; Shughrue et al., J. Comp. Neurol. 388: 507-25, 1.997b).

El desarrollo de ratones deficientes ("knockout") en cuanto a ER-\alpha (Korach, Science 266: 1.524-1.527, 1.994) y ER-\beta (Krege et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 15.677-82, 1.998) demuestra además que ER-\beta ejerce diferentes funciones en diferentes tejidos. Por ejemplo, los ratones (machos y hembras) deficientes en cuanto a ER-\alpha son estériles, las hembras no muestran receptividad sexual y los machos no presentan el típico comportamiento agresivo de los machos (Cooke et al., Biol. Reprod. 59: 470-5, 1.998; Das et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12.786-791, 1.997; Korach, 1.994; Ogawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1.476-81, 1.997, Rissman et al., Endocrinology 138: 507-10, 1.997a; Rissman et al., Horm. Behav. 31: 232-243, 1.997b). Además, los cerebros de estos animales aún responden al estrógeno según un patrón que es similar al de los animales de tipo silvestre (Shughrue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11.008-12, 1.997c), y el estrógeno aún inhibe la lesión vascular causada por un daño mecánico (Iafrati et al., Nature Med. 3; 545-8, 1.997). Por contraste, los ratones que carecen de ER-\beta se desarrollan normalmente, son fértiles y presentan un comportamiento sexual normal, aunque tienen menos y más pequeñas crías que los ratones de tipo silvestre (Krege et al., 1.998), tienen un desarrollo mamario normal y secretan leche normalmente. Se cree que la reducción de la fertilidad es el resultado de una eficacia ovárica reducida, y ER-\beta es la forma predominante de ER en el ovario, localizándose en las células granulosas de los folículos en maduración.

En resumen, los compuestos que actúan como antagonistas o agonistas del estrógeno han sido reconocidos durante mucho tiempo por su significativa utilidad farmacéutica en el tratamiento de una gran variedad de estados relacionados con el estrógeno, incluyendo estados relacionados con el cerebro, el hueso, el sistema cardiovascular, la piel, los folículos pilosos, el sistema inmune, la vejiga y la próstata (Barkhem et al., Mol. Pharmacol. 54: 105-12, 1.998; Farhat et al., FASEB J. 10: 615-624, 1.996; Gustafsson, Chem. Biol. 2; 508-11, 1.998; Sun et al., 1.999; Tremblay et al., Endocrinology 139: 111-118, 1.998; Turner et al., Endocrinology 139: 3.712-20, 1.998). Además, se ha descrito una diversidad de células de cáncer mamario y no mamario que expresan ER y sirven como tejido diana para antagonistas estrogénicos específicos (Brandenberger et al., 1.998; Clinton y Hua, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 25: 1-9. 1.997; Hata et al., Oncology 55 Suppl 1: 35-44, 1.998; Rohlff et al., Prostate 37: 51-9, 1.998; Simpson et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 64: 137-45, 1.998; Yamashita et al., Oncology 55 Suppl 1: 17-22, 1.998).

Con la reciente identificación del ER-\beta y el reconocimiento de que ER-\alpha y ER-\beta tienen diferentes funciones biológicas, los moduladores selectivos de ER poseerían similarmente una significativa utilidad clínica. Puesto que
ER-\beta se expresa intensamente en diversos tejidos, que incluyen la próstata, la vejiga, el ovario, el testículo, el pulmón, el intestino delgado, el endotelio vascular y diversas partes del cerebro, los compuestos que modulan selectivamente ER-\beta tendrían importancia clínica en el tratamiento de una diversidad de enfermedades o estados, tales como cáncer de próstata, cáncer testicular, enfermedades cardiovasculares, trastornos neurodegenerativos, incontinencia urinaria, estados del CNS y del tracto gastrointestinal (GI), y cáncer de huesos y otros cánceres. Dichos compuestos ejercerían un efecto mínimo sobre tejidos que contienen ER-\alpha y, de este modo, presentarían diferentes perfiles de efectos secundarios. Por ejemplo, aunque la terapia de reposición de estrógeno está asociada con una diversidad de efectos beneficiosos (tales como protección ósea, efecto cardiovascular, prevención de sofocos, demencia, metabolismo óseo, etc. ), dicha terapia también tiene efectos negativos (tales como cánceres de mama y endometrio, trombosis, etc.). Se cree que algunos de estos efectos negativos son mediados por mecanismos específicos de ER-\alpha o ER-\beta. De este modo, los antagonistas o agonistas de ER-\beta presentarán perfiles terapéuticos diferentes en comparación con los antagonistas o agonistas de ER-\alpha, y serían preferentemente beneficiosos en tejidos que expresan niveles elevados de ER-\beta (véanse, por ejemplo, Nilsson et al., TEM 9: 387-395, 1.998; Chang y Prins, The Prostate 40: 115-124, 1.999). Además, diversos investigadores han mostrado que productos químicos ambientales y fitoestrógenos interaccionan preferentemente con ER-\beta, desencadenando respuestas biológicas similares a las del estrógeno (véase, por ejemplo, Kuiper et al., Endocrinology 139, 4.252-4.263, 1.998). De esta manera, los compuestos que ejercen antagonismo sobre ER-\beta también serían importantes en cuanto a regular las interacciones con productos químicos, que afectan a la salud, la capacidad reproductora, etc.

En los últimos años se han desarrollado diversos compuestos, tanto esteroides como no esteroides, que interaccionan con el ER. Por ejemplo, el tamoxifeno fue originalmente desarrollado como un anti-estrógeno y fue usado para el tratamiento del cáncer de mama pero, más recientemente, se ha hallado que actúa como un agonista estrogénico parcial en el útero, el hueso y el sistema cardiovascular. El raloxifeno es otro compuesto que ha sido propuesto como un SERM, y ha sido aprobado para el tratamiento de la osteoporosis.

1

Se han presentado también compuestos análogos al raloxifeno (Grese et al., J. Med. Chem. 40: 146-167, 1.997).

En cuanto a compuestos basados en cumarina, se han propuesto diversas estructuras que incluyen las siguientes: Roa et al., Synthesis 887-888, 1.981; Buu-Hoi et al:, J. Org. Chem. 19: 1.548-1.552, 1.954; Gupta et al., Indian J. Exp. Biol. 23: 638-640, 1.985; Solicitud PCT Publicada nº WO 96/31206; Verma et al., Indian J. Chem. 32B: 239-243, 1.993; Lednicer et al., J. Med. Chem. 8: 725-726, 1.965; Micheli et al., Steroids 5: 321-335, 1.962; Brandt et al., Int. J. Quantum Chemistry: Quantum Biol. Symposia 13: 155-165, 1.986; Wani et al., J. Med. Chem. 18: 982-985, 1.975; Pollard et al., Steroids 11: 897-907, 1.968.

Ray et al. (Contraception, 35(3), 283-287, 1.987) hallaron que la adición de una cadena lateral de 3-n-butilamino-2-hidroxipropiloxilo a estrógenos no esteroides basados en cumarina y cromeno potenciaba su actividad antifertilidad.

En consecuencia, en la técnica existe la necesidad de antagonistas y agonistas de estrógeno en general y, más específicamente, de compuestos que inhiban citoquinas, particularmente IL-6, incluyendo composiciones farmacéuticas que contengan dichos compuestos así como métodos relativos al uso de las mismas. También existe la necesidad de compuestos que modulen selectivamente ER-\beta. El presente invento satisface estas necesidades y proporciona otras ventajas relacionadas.

Sumario del invento

En resumen, el presente invento se dirige, en general, a antagonistas y/o agonistas del estrógeno, incluyendo composiciones farmacéuticas que contienen los mismos, así como a métodos para tratar estados relacionados con el estrógeno. Dichos estados son discutidos más específicamente más adelante y, en general, incluyen (pero no se limitan a) obesidad, cáncer de mama, osteoporosis, endometriosis, enfermedad cardiovascular, cáncer de próstata, síndromes menopáusicos, pérdida de pelo (alopecia), diabetes de tipo II, enfermedad de Alzheimer, incontinencia urinaria, estados del tracto GI, espermatogénesis, protección vascular tras una lesión, aprendizaje y memoria, efectos sobre el CNS, niveles lipídicos en plasma, acné, cataratas, hirsutismo, otros cánceres sólidos (tales como los de colon, pulmón, ovario, melanoma, CNS y renal), mieloma múltiple y linfoma.

En una realización más específica, este invento se dirige a compuestos para inhibir citoquinas, tal como la interleuquina 6 (IL-6), y a métodos relativos al tratamiento de estados asociados con ellas, así como a composiciones farmacéuticas que contienen uno o más de los compuestos de este invento. En este contexto, las condiciones de tratamiento asociadas con niveles aumentados de citoquinas incluyen (pero no se limitan a) métodos para tratar el cáncer, la artritis y enfermedades relativas a la reabsorción ósea, particularmente para reducir la formación de osteoclastos y/o bloquear la producción de citoquinas en el contexto de la osteoporosis.

Los compuestos de este invento tienen la estructura general (I) siguiente:

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o estereoisómeros o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos; fórmula en la que:

n es 0, 1, 2, 3 ó 4;

R_{1} es un arilo C_{6-12}, arilalquilo C_{7-12}, heterociclo C_{3-12} o heterocicloalquilo C_{4-16} sustituido o no sustituido;

R_{2} es NR_{a}R_{b} en que R_{a} y R_{b} son independientemente hidrógeno, alquilo C_{1-8}, arilo C_{6-12} o heterociclo y en que R_{a} y R_{b} están opcionalmente sustituidos con hasta tres sustituyentes independientemente seleccionados entre alquilo C_{1-6}, halógeno, alcoxilo C_{1-6}, hidroxilo y carboxilo; o R_{2} es un anillo heterocíclico con la estructura siguiente:

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en que:

m_{1} y m_{2} son independientemente 0, 1 ó 2, y m_{1} y m_{2} no son 0 los dos;

A es CH_{2}, O, S o NH;

Z representa 0, 1, 2 ó 3 sustituyentes de anillo heterocíclico seleccionados entre halógeno, alquilo C_{1-8}, arilo C_{6-12}, arilalquilo C_{7-12}, heterociclo C_{3-12} y heterocicloalquilo C_{4-16};

y en que cualquier átomo de hidrógeno del anillo heterocíclico puede, tomado junto con un átomo de hidrógeno de un átomo adyacente del anillo heterocíclico, formar un doble enlace.

Como se indicó anteriormente, los compuestos de este invento son útiles en una gran variedad de aplicaciones terapéuticas y profilácticas y pueden ser usados para tratar una diversidad de enfermedades asociadas con la reabsorción ósea, así como para el tratamiento del cáncer y la artritis. Tales métodos implican la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de este invento, preferiblemente en forma de una composición farmacéutica, a un animal que lo necesita (incluyendo un ser humano).

En otra realización, se describen métodos para modular células y/o tejidos que expresan ER-\beta, poniendo la célula y/o el tejido en contacto con una cantidad eficaz de un compuesto de estructura (I). En una realización, la célula y/o el tejido expresa preferentemente ER-\beta con respecto a ER-\alpha, tal como una célula y/o tejido de hueso, vejiga, útero, ovario, próstata, testículo, epidídimo, tracto gastrointestinal (GI), riñón, mama, corazón, pared vascular, sistema inmune, pulmón, hipófisis, hipocampo e hipotálamo.

En aún una realización más, el presente invento describe métodos para tratar un estado relacionado con estrógeno mediante la administración, a un animal de sangre caliente que lo necesita, de una cantidad eficaz de un compuesto de estructura (I) formulado en forma de una composición farmacéutica adecuada para administración al animal. En realizaciones representativas, el estado relacionado con estrógeno es cáncer de mama, osteoporosis, endometriosis, enfermedad cardiovascular, hipercolesterolemia, hipertrofia prostática, obesidad, cáncer de próstata, síndromes menopáusicos, diabetes de tipo II, enfermedad de Alzheimer, incontinencia urinaria, estados del tracto GI, espermatogénesis, protección vascular tras una lesión, aprendizaje y memoria, efectos sobre el CNS, niveles lipídicos en plasma, acné, hirsutismo, otros cánceres sólidos (tales como los de colon, pulmón, ovario, testículo, melanoma, CNS y renal), mieloma múltiple, linfoma, carcinomas prostáticos, obesidad, sofocos, efectos cutáneos, cambios bruscos de humor, pérdida de memoria, y/o efectos reproductores negativos asociados con la exposición a productos químicos ambientales. En otras realizaciones, se describen métodos para inhibir una citoquina, tal como IL-6 o GM-CSF, en un animal que lo necesita, así como métodos para tratar el cáncer asociado con ella.

Estos y otros aspectos de este invento resultarán evidentes por referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos adjuntos. Con este fin, se exponen aquí varias referencias que describen con mayor detalle ciertos aspectos de este invento y que se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B ilustran la actividad de un compuesto no de este invento, en cuanto a inhibir la producción de IL-6 y GM-CSF, respectivamente.

La Figura 2 ilustra la actividad de un compuesto no de este invento, en cuanto a inhibir la producción de IL-6 en sinoviocitos de enfermos con artritis reumatoide.

La Figura 3 ilustra la actividad de un compuesto no de este invento, en cuanto a inhibir la proliferación de un cáncer de mama.

La Figura 4 ilustra la actividad de un compuesto no de este invento, en cuanto a inhibir una línea celular de cáncer de próstata.

Descripción detallada del invento

Como se mencionó anteriormente, el presente invento se dirige a compuestos que tienen actividad como antagonistas y/o agonistas estrogénicos, así como a composiciones farmacéuticas que contienen uno o más de dichos compuestos y a métodos relacionados con las mismas. Como antagonistas y/o agonistas estrogénicos, los compuestos de este invento son útiles en el tratamiento de una gran variedad de estados relacionados con el estrógeno. En este contexto, el término "tratamiento" incluye tanto tratamiento como prevención de un estado relacionado con el estrógeno. De esta manera, los compuestos de este invento pueden ser administrados como un agente terapéutico y/o profiláctico. Un "agonista" estrogénico es un compuesto que se une al ER y remeda la acción del estrógeno en uno o más tejidos, mientras que un "antagonista" se une al ER y bloquea la acción del estrógeno en uno o más tejidos. Además, la expresión "estado relacionado con el estrógeno" abarca todo estado asociado con niveles elevados o reducidos de estrógeno, moduladores selectivos del receptor estrogénico (SERM), ER-\alpha o ER-\beta.

En consecuencia, los compuestos del presente invento pueden ser también usados en un método para tratar estados relacionados con el estrógeno, que incluyen (pero no se limitan a) cáncer de mama, osteoporosis, endometriosis, enfermedad cardiovascular, hipercolesterolemia, hipertrofia prostática, carcinomas prostáticos, obesidad, sofocos, efectos cutáneos, cambios bruscos de humor, pérdida de memoria, síndromes menopáusicos, pérdida de pelo (alopecia), diabetes de tipo II, enfermedad de Alzheimer, incontinencia urinaria, estados del tracto GI, espermatogénesis, protección vascular tras una lesión, aprendizaje y memoria, efectos sobre el CNS, niveles lipídicos en plasma, acné, hirsutismo, otros cánceres sólidos (tales como los de colon, pulmón, ovario, testículo, melanoma, CNS y renal), mieloma múltiple, cataratas, linfoma, y efectos reproductores negativos asociados con la exposición a productos químicos ambientales.

En un aspecto de este invento, se ha hallado que los compuestos de este invento son moduladores selectivos del receptor estrogénico y, más específicamente, son selectivos para ER-\beta. En consecuencia, en este aspecto del invento, los compuestos son útiles como agentes para el tratamiento de la osteoporosis, el cáncer hormonalmente regulado, el tratamiento de combinación del cáncer (tal como con taxol-cisplatina o quimioterapia), problemas sanitarios ginecológicos de las mujeres y estados sanitarios que resultan de la exposición a productos químicos ambientales.

Los compuestos de este invento tienen la estructura general siguiente:

4

n es 0, 1, 2, 3 ó 4;

5

en que:

A es CH_{2}, O, S o NH;

Como se usa aquí, un "arilo C_{6-12}" es un resto aromático que contiene de 6 a 12 átomos de carbono. En una realización, el arilo C_{6-12} es seleccionado entre (pero no está limitado a) fenilo, tetralinilo y naftalenilo.

Un "aralquilo C_{7-12}" es un areno que contiene de 7 a 12 átomos de carbono y tiene tanto unidades alifáticas como aromáticas. En una realización, el aralquilo C_{7-12} es seleccionado entre (pero no se limita a) bencilo, etilbencilo [es decir, -(CH_{2})_{2}-fenilo], propilbencilo e isobutilbencilo.

Un "heterociclo C_{3-12}" es un compuesto que contiene un anillo formado por más de una clase de átomo y que contiene de 3 a 12 átomos de carbono, e incluye (pero no se limita a) pirrolilo, furanilo, tienilo, imidazolilo, oxazolilo, tiazolilo, pirazolilo, pirrolidinilo, piridinilo, pirimidinilo y purinilo.

Un "heterocicloalquilo C_{4-16}" es un compuesto que contiene un ``heterociclo C_{3-12}'' enlazado a un alquilo C_{1-8}.

Un "alquilo C_{1-8}" es una cadena carbonada lineal o ramificada que contiene de 1 a 8 átomos de carbono, e incluye (pero no se limita a) metilo, etilo y n-propilo. Similarmente, un "alquilo C_{1-x}" tiene el mismo significado pero, en él, "x" representa un número de átomos de carbono inferior a ocho, tal como alquilo C_{1-6}.

Un resto alquilo C_{1-x}, arilo C_{6-12}, aralquilo C_{7-12}, heterociclo C_{3-12} o heterocicloalquilo C_{4-16} "sustituido" es un resto alquilo C_{1-x}, arilo C_{6-12}, aralquilo C_{7-12}, heterociclo C_{3-12} o heterocicloalquilo C_{4-16} que tiene al menos un átomo de hidrógeno sustituido por un sustituyente.

Un "sustituyente" es un resto seleccionado entre halógeno, -OH, -R', -OR', -COOH, -COOR', -COR', -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR', -NR'R', -SH, -SR', -SOOR', -SOOH y -SOR', en los que cada presencia de R' es independientemente seleccionada entre un alquilo C_{1-8}, arilo C_{6-12}, aralquilo C_{7-12}, heterociclo C_{3-12} y heterocicloalquilo C_{4-16} sustituido o no sustituido.

Un "halógeno" es fluoro, cloro, bromo o yodo.

En una realización de este invento, el A del anillo heterocíclico R_{2} es CH_{2}, m_{1} es 1, y m_{2} es 0 ó 1, según se representa respectivamente mediante las siguientes estructuras (i) y (ii):

6

En las anteriores estructuras (i) y (ii), ha de advertirse que no se representan los átomos de hidrógeno con objeto de aclarar que el(los) sustituyente(s) Z opcional(es) puede(n) estar sobre cualquier átomo del anillo heterocíclico y que el punto de unión a la estructura (I) puede ser a través de un átomo de carbono o nitrógeno.

De este modo, en realizaciones más específicas de las estructuras (i) y (ii), R_{2} incluye las siguientes estructuras (iii) a (vi):

7

en las que Z es, por ejemplo, metilo.

En otra realización, el A del anillo heterocíclico R_{2} es O o NH, m_{1} es 1, y m_{2} es 0 ó 1, según se representa, por ejemplo, mediante las siguientes estructuras (vii) y (viii):

8

Como con las anteriores estructuras (i) y (ii), en las estructuras (vii) y (viii) no se representan los átomos de hidrógeno con objeto de aclarar que el(los) sustituyente(s) Z opcional(es) puede(n) estar sobre cualquier átomo del anillo heterocíclico y que el punto de unión a la estructura (I) puede ser a través de un átomo de carbono o nitrógeno.

Además de las anteriores estructuras representadas, cualquier átomo de hidrógeno del anillo heterocíclico puede ser tomado junto con un átomo de hidrógeno unido a un átomo adyacente del anillo heterocíclico para formar un doble enlace. Por ejemplo, con respecto a la anterior estructura (vii), los correspondientes compuestos análogos insaturados incluyen las siguientes estructuras (ix), (x) y (xi):

9

En una realización de este invento, R_{1} es un fenilo no sustituido o sustituido, y los compuestos de este invento tienen la siguiente estructura (II):

10

en la que X representa uno o más sustituyentes opcionales como los anteriormente definidos y R_{2} y n son como se definieron anteriormente.

En una realización más específica de la estructura (II), los compuestos representativos de este invento tienen la siguiente estructura (IV):

11

en la que A, X, Z, m_{1}, m_{2} y n son como se definieron anteriormente.

En una realización de la estructura (I), R_{1} es un fenilo no sustituido o sustituido, y los compuestos de este invento tienen la siguiente estructura (VIII):

12

En otra realización, los compuestos de este invento están representados por la estructura (IX):

13

en la que R_{1}, R_{2} y n son como se definieron anteriormente.

En una realización más específica de las estructuras (VIII) y (IX), los compuestos representativos de este invento tienen la siguiente estructura (X):

\vskip1.000000\baselineskip

14

en la que A, X, Z, m_{1}, m_{2} y n son como se definieron anteriormente.

En otra realización de la estructura (X), m_{1} y m_{2} son 1, A es CH_{2}, el sustituyente Z opcional no está presente y n es 2, y los compuestos de este invento tienen la siguiente estructura (XI):

15

en la que X representa uno o más sustituyentes opcionales como los anteriormente definidos.

En una realización más específica, X (a) no está presente o (b) representa un único sustituyente, tal como un único sustituyente en la posición para. En consecuencia, los compuestos representativos de este invento incluyen (pero no se limitan a) compuestos que tienen las siguientes estructuras (XIa) y (XIb):

16

en que, en la estructura (XIb), X representa un halógeno, tal como flúor o cloro.

En la realización en que el grupo fenilo de la posición 4 del anillo de cumarina está para-sustituido, se ha hallado que los compuestos de este invento presentan selectividad hacia ER-\beta con respecto a ER-\alpha.

Los compuestos de este invento pueden ser preparados por un experto en síntesis orgánica mediante técnicas conocidas, así como mediante las rutas sintéticas aquí descritas. Por ejemplo, pueden sintetizarse compuestos representativos de este invento mediante el siguiente Esquema 1 de Reacción general, en el que p = 0:

\newpage

Esquema 1 de Reacción

\vskip1.000000\baselineskip

17

Mediante el Esquema 1 de Reacción se obtienen compuestos en que R_{2} es un anillo heterocíclico como el definido en la estructura (I). Similarmente, pueden prepararse compuestos de estructura (I) en que R_{2} es NR_{a}R_{b} empleando el correspondiente cloruro de amina, R_{a}R_{b}N(CH_{2})_{n}Cl, en lugar del anillo heterocíclico en las operaciones segunda a última del Esquema 1 de Reacción.

Más específicamente, pueden prepararse compuestos representativos de este invento (cuando R_{2} es piperid-1-ilo) mediante el siguiente Esquema 2 de Reacción, en que p = 0:

\newpage

Esquema 2 de Reacción

18

Con respecto a los estereoisómeros, los compuestos de estructura (I) pueden tener centros quirales y pueden encontrarse en forma de racematos, mezclas racémicas, y de enantiómeros o diastereoisómeros individuales. Todas las citadas formas isómeras están incluidas en el presente invento, incluyendo mezclas de las mismas. Además, algunas de las formas cristalinas de los compuestos de estructura (I) pueden existir como compuestos polimórficos, los cuales están incluidos en el presente invento. Además, algunos de los compuestos de estructura (I) pueden formar también solvatos con agua u otros disolventes orgánicos. Tales solvatos están similarmente incluidos dentro del alcance de este invento.

Aunque sin pretender limitación alguna por la teoría siguiente, en el contexto de las enfermedades relativas a la reabsorción ósea se cree que los compuestos de este invento actúan bloqueando la producción de citoquinas y/o inhibiendo la formación de osteoclastos. Se ha mostrado previamente que la citoquina IL-6 es un factor importante en cuanto a provocar la formación de osteoclastos [Girasole et al., supra; Jilka et al. (1.992), supra; Jilka et al. (1.995), supra; Kimble et al. (1.995), supra; Pacifici et al., supra; y Passeri et al., supra]. Otros investigadores han mostrado que la administración del anticuerpo neutralizante, los oligonucleótidos antisentido, o el antagonista Sant 5 contra IL-6 reduce el número de osteoclastos en el hueso trabecular de ratones sometidos a ovariectomía [Devlin et al., J. Bone Miner. 13: 393-399, 1.998; Girasole et al., supra; Jilka et al. (1.992), supra; y Schiller et al., Endocrinology 138: 4.567-4.571, 1.997], la capacidad de células gigantes humanas para reabsorber dentina (Ohsaki et al., Endocrinology 131: 2.229-2.234, 1.993; y Reddy et al., J. Bone Min. Res. 9: 753-57, 1.994), y la formación de osteoclastos en cultivo de médula ósea humana normal. Se ha hallado también que el estrógeno infrarregula la actividad del promotor de IL-6 por interacciones entre el receptor estrogénico y los factores de transcripción NF-6B y C/EBP\beta (Stein et al., Mol. Cell Biol. 15: 4.971-4.979, 1.995).

Se ha sugerido que el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF; del inglés, granulocy-
te-macrophage colony-stimulating factor) desempeña un papel en la proliferación de células precursoras osteoclásticas. En cultivos de larga duración de células de médula ósea o células de sangre periférica de ser humano o ratón, el GM-CSF activa la formación de células osteoclásticas (Kurihara et al., Blood 74: 1.295-1.302, 1.989; Lorenzo et al., J. Clin. Invest. 80: 160-164, 1.987; MacDonald et al., J. Bone Miner. 1: 227-233, 1.986; y Shinar et al., Endocrinology 126: 1.728-1.735, 1.990). Células de médula ósea aisladas de mujeres posmenopáusicas o mujeres que habían interrumpido la terapia con estrógeno expresaban mayores niveles de GM-CSF que las células de mujeres premenopáusicas (Bismar et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 80: 3.351-3.355, 1.995). Se ha mostrado también que la expresión de GM-CSF está asociada con la distribución tisular de osteoclastos de reabsorción ósea en pacientes con erosión de implantaciones ortopédicas (Al-Saffar et al., Anatomic Pathology 105: 628-693, 1.996).

Además, se ha hallado que el bloqueo de la acción de IL-6 con un anticuerpo anti-IL-6 reduce la formación de células similares a osteoclastos en el sistema de cultivo conjunto de células óseas humanas del Ejemplo 8. Este sistema incluye osteoblastos humanos inmortalizados y la línea celular premonocítica U937, que se cultivan conjuntamente en el mismo pocillo para cultivo tisular. Bajo condiciones de cultivo apropiadas, los osteoblastos secretan IL-6 que actúa sobre las células premonocíticas causando su diferenciación en células similares a osteoclastos. De esta manera, el sistema de cultivo conjunto refleja más fielmente el ambiente fisiológico del hueso y proporciona una lectura funcional de la eficacia de los compuestos de los que se sabe que bloquean la producción de IL-6 y conducen a activación y formación de osteoclastos. Por ejemplo, se halló que el estrógeno suprime la producción de IL-6 en el sistema de cultivo conjunto del Ejemplo 8.

Además, se halló que un anticuerpo anti-GM-CSF reduce la formación de células similares a osteoclastos, y el estrógeno redujo la producción de GM-CSF en el sistema de cultivo conjunto del Ejemplo 8. Esto demuestra que el estrógeno puede ejercer su efecto inhibidor sobre la formación y función de los osteoclastos por medio del bloqueo de la producción de IL-6 y GM-CSF. Por lo tanto, los compuestos de este invento que bloquean la producción de
IL-6 y/o GM-CSF o inhiben la formación y la función de los osteoclastos, o ambas cosas, son útiles en el tratamiento de enfermedades relativas a la reabsorción ósea.

Como se mencionó anteriormente, se cree también que las citoquinas desempeñan un papel importante en una diversidad de cánceres. En el contexto del cáncer de próstata, ciertos investigadores han mostrado que IL-6 es un factor de crecimiento autocrino/paracrino (Seigall et al., supra) y potencia la supervivencia de tumores [Okamoto et al. (Cancer Res. 1.997), supra], y que anticuerpos anti-IL-6 neutralizantes reducen la proliferación celular [Okamoto et al. (Endocrinology 1.997), supra; Borsellino et al., supra]. Se han comunicado también que IL-6 desempeña un papel en cuanto al mieloma múltiple (Martínez-Maza et al., supra; Kawano et al., supra; Zhang et al., supra; Garrett et al., supra; y Klein et al., supra), el carcinoma de células renales (Koo et al., supra; Tsukamoto et al., supra; y Weissglas et al., supra) y el carcinoma cervical (Estuce et al., supra; Tartour et al., supra; e Iglesias et al., supra).

Se cree también que IL-6 está implicada en la artritis, particularmente en las artritis provocadas por adyuvantes, colágeno y antígenos (Alonzi et al., supra; Ohshima et al., supra; y Leisten et al., supra), y se han presentado anticuerpos anti-IL-6 para el tratamiento de la artritis (Wendling et al., supra). Además, se ha mostrado que el estrógeno provoca la supresión de la encefalomielitis autoinmune experimental y la artritis provocada por colágeno en ratones (Jansson et al., supra).

En consecuencia, otras realizaciones del presente invento incluyen métodos para tratar enfermedades relativas a la reabsorción ósea en general, incluyendo (pero sin limitarse a) osteoporosis, cáncer óseo metastásico e hipercalcemia, lesiones osteolíticas con implantaciones ortopédicas, enfermedad de Paget, y pérdida ósea asociada con hiperparatiroidismo. Otros estados asociados con IL-6 incluyen diversos cánceres y artritis. El cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer endometrial, mieloma múltiple, carcinoma de células renales y carcinoma cervical son cánceres representativos. Los estados artríticos incluyen las artritis provocadas por adyuvantes, colágeno, bacterias y antígenos, particularmente la artritis reumatoide.

Además, los compuestos del presente invento también actúan como antagonistas y/o agonistas estrogénicos y son útiles en el tratamiento de una gran variedad de estados relacionados con el estrógeno. En este contexto, el tratamiento incluye tanto el tratamiento como la prevención de un estado relacionado con el estrógeno. De esta forma, los compuestos de este invento pueden ser administrados como un agente terapéutico y/o profiláctico. Un "agonista" estrogénico es un compuesto que se une al ER y remeda la acción del estrógeno en uno o más tejidos, mientras que un "antagonista" se une al ER y bloquea la acción del estrógeno en uno o más tejidos. Además, la expresión "estado relacionado con el estrógeno" abarca todo estado asociado con niveles elevados o reducidos de estrógeno, moduladores selectivos del receptor estrogénico (SERM) o ER. En este contexto, ER incluye tanto ER-\alpha como ER-\beta, así como cualesquier isoformas, mutaciones y proteínas con una homogía significativa en relación con ER.

En consecuencia, los compuestos del presente invento pueden ser también usados en un método para tratar estados relacionados con el estrógeno, que incluyen (pero no se limitan a) cáncer de mama, osteoporosis, endometriosis, enfermedad cardiovascular, hipercolesterolemia, hipertrofia prostática, carcinomas prostáticos, obesidad, sofocos, efectos cutáneos, cambios bruscos de humor, pérdida de memoria, cáncer de próstata, síndromes menopáusicos, pérdida de pelo (alopecia), diabetes de tipo II, enfermedad de Alzheimer, incontinencia urinaria, estados del tracto GI, espermatogénesis, protección vascular tras una lesión, aprendizaje y memoria, efectos sobre el CNS, niveles lipídicos en plasma, acné, cataratas, hirsutismo, otros cánceres sólidos (tales como los de colon, pulmón, ovario, melanoma, CNS y renal), mieloma múltiple, linfoma, y efectos reproductores negativos asociados con la exposición a productos químicos ambientales o desequilibrios hormonales naturales.

Los compuestos del presente invento que son agonistas del estrógeno son útiles para la contracepción oral; el alivio de los síntomas de la menopausia; la prevención de la amenaza de aborto o el aborto habitual; el alivio de la dismenorrea; el alivio de la hemorragia uterina disfuncional; el alivio de la endometriosis; la ayuda al desarrollo ovárico; el tratamiento del acné; la disminución del excesivo crecimiento de pelo corporal en las mujeres (hirsutismo); la prevención y el tratamiento de la enfermedad cardiovascular; la prevención y el tratamiento de la aterosclerosis; la prevención y el tratamiento de la osteoporosis; el tratamiento de la hiperplasia prostática benigna y el carcinoma prostático; la obesidad; y la supresión de la secreción láctea posparto. Estos agentes también ejercen un efecto beneficioso sobre los niveles lipídicos en plasma y, como tales, son útiles en el tratamiento y la prevención de la hipercolesterolemia. Aquellos que son antagonistas del estrógeno son útiles como antiestrógenos en, por ejemplo, los tejidos mamario y ovárico y, por lo tanto, son útiles en el tratamiento y la prevención de los cánceres de mama y ovario.

Los métodos de este invento implican administrar un compuesto de estructura (I) o una composición farmacéutica que contenga uno o más de los mismos, a un animal que lo necesita, en una cantidad suficiente para tratar la enfermedad o el estado de interés. Con este fin, el término "tratar" (o el término relacionado "tratamiento") significa la administración de un compuesto, típicamente en combinación con un apropiado vehículo o agente de distribución, a un animal que no muestra síntomas de una enfermedad o estado (por ejemplo, administración profiláctica o preventiva) o que muestra síntomas de una enfermedad o estado (por ejemplo, administración curativa o de tratamiento). Además, la frase "cantidad eficaz" significa una dosis de compuesto que, después de un tiempo dado, da lugar al efecto deseado. Por ejemplo, en el contexto de una enfermedad relativa a la reabsorción ósea, una cantidad eficaz da lugar a una masa ósea que es estadísticamente diferente de la de animales tratados con placebo. Similarmente, para el cáncer y la artritis, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para producir el efecto deseado sobre el tejido canceroso o artrítico.

Los métodos de este invento incluyen la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de estructura (I), o una sal del mismo, como ingrediente activo. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de estructura (I) son típicamente sales de tipo atóxico comúnmente utilizadas, tales como sales con ácidos orgánicos (por ejemplo, los ácidos fórmico, acético, trifluoroacético, cítrico, maleico, tartárico, metanosulfónico, bencenosulfónico y toluenosulfónico), ácidos inorgánicos (por ejemplo, los ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico y fosfórico) y aminoácidos (por ejemplo, los ácidos aspártico y glutámico). Estas sales pueden ser preparadas mediante los métodos conocidos por químicos de experiencia normal.

Los compuestos de este invento pueden ser administrados oral o parenteralmente a animales (incluyendo seres humanos) en la forma convencional de las preparaciones, tales como cápsulas, microcápsulas, tabletas, gránulos, polvo, pastillas, píldoras, supositorios, inyecciones, suspensiones y jarabes. Pueden prepararse formulaciones adecuadas mediante métodos comúnmente empleados en que se usan aditivos orgánicos o inorgánicos convencionales, tales como un excipiente (por ejemplo, sacarosa, almidón, manitol, sorbitol, lactosa, glucosa, celulosa, talco, fosfato cálcico o carbonato cálcico), un agente aglutinante (por ejemplo, celulosa, metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, polipropilpirrolidona, polivinilpirrolidona, gelatina, goma arábiga, polietilenglicol, sacarosa o almidón), un agente disgregante (por ejemplo, almidón, carboximetilcelulosa, hidroxipropilalmidón, hidroxipropilcelulosa de baja sustitución, bicarbonato sódico, fosfato cálcico o citrato cálcico), un lubricante (por ejemplo, estearato magnésico, ácido silícico anhidro ligero, talco o laurilsulfato sódico), un agente saboreador (por ejemplo, ácido cítrico, mentol, glicocola o polvo de naranja), un conservante (por ejemplo, benzoato sódico, bisulfito sódico, metilparabeno o propilparabeno), un agente estabilizador (por ejemplo, ácido cítrico, citrato sódico o ácido acético), un agente suspendedor (por ejemplo, metilcelulosa, polivinilpirrolidona o estearato de aluminio), un agente dispersivo (por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa), un agente diluyente (por ejemplo, agua) y una cera básica (por ejemplo, manteca de cacao, vaselina blanca o polietilenglicol). La cantidad del ingrediente activo en la composición médica puede estar en un nivel que produzca el deseado efecto terapéutico, tal como, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg a 100 mg en una dosificación unitaria tanto para administración oral como parenteral.

El ingrediente activo puede ser normalmente administrado a pacientes humanos de una a cuatro veces al día con una dosificación unitaria de 0,1 mg a 100 mg, pero la dosificación anterior puede ser apropiadamente variada dependiendo de la edad, el peso corporal y el estado médico del paciente y el tipo de administración. Una dosis preferida es de 0,25 mg a 25 mg para pacientes humanos. Se prefiere una dosis por día.

Los químicos farmacéuticos reconocerán que los compuestos fisiológicamente activos con uno o más grupos hidroxilo accesibles se administran frecuentemente en forma de ésteres farmacéuticamente aceptables. La bibliografía relativa a tales compuestos, tal como el estradiol, proporciona diversos ejemplos de dichos ésteres. Se cree que dichos ésteres son metabólicamente escindidos en el organismo y que el fármaco real es el propio compuesto hidroxílico. En las técnicas farmacéuticas se sabe cómo ajustar la velocidad o duración de acción de un compuesto mediante apropiadas elecciones de grupos éster.

Con este fin, en el contexto de este invento también se incluyen profármacos. Los profármacos son vehículos covalentemente enlazados que liberan in vivo un compuesto de estructura (I) cuando tal profármaco es administrado a un paciente. Los profármacos son generalmente preparados modificando grupos funcionales de tal modo que la modificación sea escindida, por manipulación rutinaria o in vivo, para dar lugar al compuesto original. Los profármacos incluyen, por ejemplo, compuestos de este invento en que el grupo hidroxilo está enlazado a cualquier grupo que, cuando aquellos se administran a un paciente, se escinde para formar el grupo hidroxilo.

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de este invento por adición de ácido pueden estar formadas por el propio compuesto o por cualquiera de sus ésteres e incluyen las sales farmacéuticamente aceptables que se utilizan a menudo en química farmacéutica. Por ejemplo, pueden formarse sales con ácidos inorgánicos u orgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácidos sulfónicos que incluyen agentes tales como los ácidos naftalenosulfónico, metanosulfónico y toluenosulfónico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido pirosulfúrico, ácido metafosfórico, ácido succínico, ácido fórmico, ácido ftálico, ácido láctico y similares, muy preferiblemente con ácido clorhídrico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido acético y ácido propiónico. Normalmente, se prefiere administrar un compuesto de este invento en forma de una sal por adición de ácido, como es habitual en la administración de productos farmacéuticos que contienen un grupo básico.

Como se discutió anteriormente, los compuestos de este invento se administran muy a menudo en forma de sales por adición de ácido. Las sales son convenientemente formadas, como es normal en química orgánica, al hacer reaccionar el compuesto de este invento con un ácido adecuado, tal como uno de los que se han descrito anteriormente. Las sales se forman rápidamente con elevados rendimientos a temperaturas moderadas y, a menudo, se preparan al aislar simplemente el compuesto de un lavado ácido adecuado en la operación final de la síntesis. El ácido que forma la sal es disuelto en un apropiado disolvente orgánico, o un disolvente orgánico acuoso, tal como un alcanol, una cetona o un éster. Por otra parte, si se desea el compuesto de este invento en forma de base libre, es aislado de una operación de lavado final básico de acuerdo con la práctica corriente. Una técnica típica para preparar hidrocloruros es disolver la base libre en un disolvente adecuado y secar la disolución a fondo, tal como sobre tamices moleculares, antes de burbujear cloruro de hidrógeno gaseoso a través de ella.

La dosis de un compuesto de este invento que se va a administrar a un ser humano es bastante variable y está sujeta al juicio del médico que le trata. Ha de advertirse que puede que sea necesario ajustar la dosis de un compuesto cuando éste se administra en forma de una sal, tal como un laureato, cuyo resto formador de sal tiene un peso molecular considerable. El intervalo general de las relaciones de administración eficaces de los compuestos es de aproximadamente 0,05 mg/día a aproximadamente 100 mg/día. Un intervalo de relaciones preferido es de aproximadamente 0,25 mg/día a 25 mg/día. Por supuesto, a menudo es práctico administrar la dosis diaria del compuesto en porciones, a diversas horas del día. Sin embargo, en cualquier caso dado, la cantidad de compuesto administrada dependerá de factores tales como la solubilidad del componente activo, la formulación usada y la vía de administración.

La vía de administración de los compuestos de este invento no es crítica. Se sabe que los compuestos son absorbidos del tracto alimentario, y, por ello, se prefiere normalmente administrar oralmente un compuesto por razones de conveniencia. Sin embargo, si se desea en un caso dado, los compuestos pueden ser administrados percutáneamente, o como supositorios para absorción por el recto, de un modo igualmente eficaz.

Los compuestos de este invento son normalmente administrados como composiciones farmacéuticas que son importantes y nuevas realizaciones del invento a causa de la presencia de los compuestos. Pueden usarse todos los tipos habituales de composiciones, incluyendo tabletas, tabletas masticables, cápsulas, disoluciones, disoluciones parenterales, pastillas, supositorios y suspensiones. Las composiciones se formulan para que contengan una dosis diaria, o una fracción conveniente de la dosis diaria, en una unidad de dosificación, la cual puede ser una sola tableta o cápsula o un volumen conveniente de un líquido.

Cualquiera de los compuestos puede ser fácilmente formulado en forma de tabletas, cápsulas y similares. Es preferible preparar disoluciones de sales solubles en agua, tal como la sal hidrocloruro. En general, todas las composiciones se preparan de acuerdo con métodos conocidos en química farmacéutica. Las cápsulas se preparan mezclando el compuesto con un agente diluyente adecuado y cargando la cantidad apropiada de la mezcla en cápsulas. Los agentes diluyentes habituales incluyen sustancias inertes pulverulentas tales como almidón de muchas clases diferentes, celulosa pulverulenta, especialmente celulosa cristalina y microcristalina, azúcares tales como fructosa, manitol y sacarosa, harinas de cereales y polvos comestibles similares.

Las tabletas se preparan por compresión directa, por granulación en estado húmedo o por granulación en estado seco. Sus formulaciones llevan normalmente incorporados agentes diluyentes, agentes aglutinantes, lubricantes y agentes disgregantes además del compuesto. Los agentes diluyentes típicos incluyen, por ejemplo, diversos tipos de almidón, lactosa, manitol, caolín, fosfato o sulfato cálcico, sales inorgánicas tales como el cloruro sódico, y azúcar pulverulento. Son también útiles los derivados de celulosa pulverulentos. Los agentes aglutinantes típicos para tabletas son sustancias tales como almidón, gelatina y azúcares tales como lactosa, fructosa, glucosa y similares. Son también convenientes gomas naturales y sintéticas, incluyendo goma arábiga, alginatos, metilcelulosa, polivinilpirrolidina y similares. El polietilenglicol, la etilcelulosa y ceras pueden servir también como agentes aglutinantes.

Un lubricante es típicamente necesario en una formulación de tabletas para prevenir que la tableta y los punzones se peguen en la matriz. El lubricante es elegido entre sólidos resbaladizos tales como el talco, los estearatos magnésico y cálcico, el ácido esteárico y aceites vegetales hidrogenados. Los agentes disgregantes para tabletas son sustancias que se hinchan cuando se mojan con objeto de que se deshaga la tableta y se libere el compuesto; incluyen almidones, arcillas, celulosas, alginas y gomas. Más particularmente, pueden usarse, por ejemplo, almidones de maíz y patata, metilcelulosa, agar, bentonita, celulosa de madera, esponja natural en polvo, resinas de intercambio catiónico, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos y carboximetilcelulosa, así como laurilsulfato sódico. Las tabletas son a menudo revestidas con azúcar como agente saboreador y sellador, o con agentes protectores formadores de películas para modificar las propiedades de disolución de la tableta. Los compuestos pueden ser también formulados como tabletas masticables usando en la formulación grandes cantidades de sustancias de sabor agradable, tal como manitol, como está ahora bien establecido en la técnica.

Cuando se desea administrar un compuesto en forma de supositorio, pueden usarse las bases típicas. La manteca de cacao es una base tradicional para supositorios que puede ser modificada mediante la adición de ceras para elevar ligeramente su punto de fusión. Las bases miscibles con agua para supositorios, que comprenden particularmente polietilenglicoles de diversos pesos moleculares, son de gran utilidad.

El efecto de los compuestos puede ser retardado o prolongado mediante una formulación apropiada. Por ejemplo, puede prepararse un glóbulo lentamente soluble del compuesto e incorporarse a una tableta o cápsula, o en forma de dispositivo implantable de liberación lenta. La técnica puede ser mejorada al preparar glóbulos de varias velocidades de disolución diferentes y cargar las cápsulas con una mezcla de los glóbulos. Las tabletas o cápsulas pueden ser revestidas con una película que resista la disolución durante un periodo de tiempo predecible. Incluso las preparaciones parenterales pueden hacerse de acción prolongada al disolver o suspender el compuesto en vehículos oleosos o emulsionados que permiten que aquél se disperse sólo lentamente en el suero.

Los ejemplos siguientes se presentan a modo de ilustración, no de limitación.

Ejemplos

En resumen, los Ejemplos 1-11 se dirigen a la síntesis de compuestos representativos de este invento y compuestos similares a los mismos. En el Ejemplo 12 se describe un sistema de cultivo conjunto de células óseas humanas para analizar compuestos en cuanto a su capacidad para bloquear la producción de IL-6. En el Ejemplo 13 se describe la actividad de un compuesto similar a los compuestos de este invento, según se analiza en el sistema de cultivo conjunto de células óseas humanas del Ejemplo 12. En los Ejemplos 14-21 se presentan más datos experimentales que evidencian la actividad de compuestos de este invento.

Ejemplo 1 2-(4-hidroxibencilacetona)-5-metoxifenol

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19

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Se añadió POCl_{3} (100 ml, 1,6 moles) a una mezcla de 3-metoxifenol (50 g, 0,40 moles), ácido 4-hidroxifenilacético (71 g, 0,46 moles) y ZnCl_{2} (174 g, 1,28 moles). La mezcla fue agitada a 65ºC durante 2 horas, vertida sobre hielo-agua (2 l) y agitada hasta que se fundió el hielo. El sobrenadante claro fue separado por decantación, y el residuo fue enjuagado con agua (1 l) y fue sometido a reparto entre EtOAc y agua. La capa orgánica fue lavada con salmuera, secada (MgSO_{4}), filtrada y concentrada. El aceite resultante fue purificado por cromatografía (SiO_{2}, EtOAc al 20%/n-hexano) para obtener 2-(4-hidroxibencilacetona)-5-metoxifenol (34,1 g, 33% de rendimiento) en forma de sólido blanco; punto de fusión: 137-140ºC.

Ejemplo 2 2-(4-triisopropilsililoxibencilacetona)-5-metoxifenol

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20

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Se añadió cloruro de triisopropilsililo (9 ml, 0,042 moles) a una mezcla de 2-(4-hidroxibencilacetona)-5-metoxifenol (10 g, 0,038 moles) y NEt_{3} (6 ml, 0,042 moles) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml). La mezcla fue agitada durante 22 horas y fue concentrada y el residuo fue sometido a reparto entre EtOAc y H_{2}O. La capa orgánica fue lavada con NaOH (1 N), HCl (1 N) y salmuera. La capa orgánica fue secada (MgSO_{4}), filtrada y concentrada. El residuo fue tratado con n-hexano para obtener 2-(4-triisopropilsililoxibencilacetona)-5-metoxifenol (6,2 g, 38% de rendimiento) en forma de sólido blanco; punto de fusión: 66-68ºC.

Ejemplo 3 3-fenil-4-(4-hidroxibencil)-7-metoxicumarina

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21

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Se añadió cloruro de fenilacetilo (2,3 ml, 14 milimoles) a una mezcla de 2-(4-triisopropilsililoxibencilacetona)-5-metoxifenol (4 g, 9,6 milimoles) y K_{2}CO_{3} (4 g, 29 milimoles) en CH_{3}CN (50 ml). La mezcla fue agitada a reflujo durante 22 horas, vertida sobre H_{2}O (0ºC, 500 ml) y sometida a extracción con EtOAc (2x). La capa orgánica fue secada (MgSO_{4}), filtrada y concentrada. El residuo fue agitado con Et_{2}O, y el sólido resultante fue separado por filtración y fue recristalizado (EtOH) para obtener 3-fenil-4-(4-hidroxibencil)-7-metoxicumarina (0,88 g, 15% de rendimiento) en forma de sólido blanco; punto de fusión: 235-236ºC.

Ejemplo 4 3-fenil-4-{4-[2-(piperidin-1-il)]etoxi}-bencil-7-metoxicumarina

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22

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Una mezcla de 3-fenil-4-(4-hidroxibencil)-7-metoxicumarina (0,50 g, 1,39 milimoles), K_{2}CO_{3} (0,58 g, 4,18 milimoles), hidrocloruro de 2-cloroetilpiperidina (0,41 g, 2,22 milimoles) y acetona (50 ml) fue calentada a reflujo durante 6 horas. La disolución fue concentrada hasta un sólido que fue sometido a reparto entre EtOAc y H_{2}O. La capa orgánica fue lavada con NaOH (1 N) y salmuera, secada (MgSO_{4}), filtrada y concentrada. El residuo fue agitado con HCl (al 20% en EtOAc), y el sólido fue separado por filtración para obtener 3-fenil-4-{4-[2-(piperidin-1-il)]etoxi}-bencil-7-metoxicumarina (0,57 g, 87% de rendimiento); punto de fusión de 171-172ºC.

Ejemplo 5 3-fenil-4-{4-[2-(piperidin-1-il)]etoxi}-bencil-7-hidroxicumarina

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23

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Una mezcla de 3-fenil-4-{4-[2-(piperidin-1-il)]etoxi}-bencil-7-metoxicumarina (0,10 g, 0,20 milimoles), HOAc (glacial, 15 ml) y HBr (al 48%, 15 ml) fue dejada refluir durante 48 horas. La mezcla fue sometida a reparto entre EtOAc (120 ml) y NAOH (1 N, 120 ml), y la capa acuosa fue lavada con EtOAc. La capa acuosa fue luego acidificada (HCl concentrado, pH de 1-2) y filtrada para obtener 3-fenil-4-{4-[2-(pi-peridin-1-il)]etoxi}-bencil-7-hidroxicumarina (0,88 g, 99% de rendimiento); punto de fusión: 160-161ºC.

Ejemplo 6 3-(4-fluorofenil)-4-[4-(1-metilpiperidil-3-oxi)]-bencil-7-hidroxicumarina

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Una disolución de 3-(4-fluorofenil)-4-[(4-hidroxifenil)metil]-7-metoxi-2H-cromen-2-ona (0,27 g, 0,72 milimoles) en 3 ml de CH_{2}Cl_{2} fue tratada con 3-hidroxi-1-metilpiperidina (0,42 g, 3,6 milimoles), trifenilfosfina (0,94 g, 3,6 milimoles y azodicarboxilato de dietilo (0,65 g, 3,6 milimoles). La mezcla de reacción fue agitada durante 8 horas a 25ºC y fue luego concentrada bajo presión reducida. El producto crudo fue disuelto en 4 ml de una disolución 1:1 de HBr (al 48%, acuoso) y ácido acético glacial. La disolución resultante fue calentada a 90ºC durante 12 horas. La mezcla de reacción fue concentrada y el residuo resultante fue neutralizado con 10 ml de una disolución acuosa saturada de NaHCO_{3}. La mezcla acuosa fue sometida a extracción con CH_{2}Cl_{2} (3 x 15 ml) y las capas orgánicas combinadas fueron secadas (MgSO_{4}) y luego concentradas bajo presión reducida. El producto (106 mg, 32%) fue aislado después de una purificación por cromatografía de resolución rápida (SiO_{2}, CH_{2}Cl_{2}/MeOH, 10:1).

Alternativamente, se hace reaccionar 3-(4-fluorofenil)-4-[(4-hidroxifenil)-metil]-7-metoxi-2H-cromen-2-ona con uno de los siguientes enantiómeros (a) y (b) en presencia de PPh_{3} y azodicarboxilato de dietilo (DEAD; del inglés, diethyl azodicarboxylate), seguidos de HBr/HOAc, para obtener el correspondiente producto enantiómero.

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25

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Ejemplo 7 2-hidroxi-4-metoxifenil-4-hidroxifenil-cetona

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Una disolución de 3-metoxifenol (2,5 g, 20,14 milimoles), ácido 4-hidroxibenzoico (3,2 g, 23,16 milimoles) y ZnCl_{2} (8,78 g, 64,44 milimoles) en 15 ml de POCl_{3} fue calentada a 65ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción resultante fue vertida sobre hielo-agua (100 ml). La capa acuosa fue sometida a extracción con CH_{2}Cl_{2} y las capas orgánicas combinadas fueron secadas (MgSO_{4}) y luego concentradas bajo presión reducida. El producto crudo fue purificado por cromatografía de resolución rápida para obtener el compuesto del título (3,93 g, 80%) en forma de sólido blancuzco [cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS; del inglés, liquid chromatography/mass spectrometry) = 244 (M+H^{+})].

Ejemplo 8 3-(4-clorofenil)-4-(4-hidroxifenil)-7-metoxi-2H-cromen-2-ona

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Una suspensión de 2-hidroxi-4-metoxifenil-4-hidroxifenil-cetona (2,6 g, 10,65 milimoles), ácido 4-clorofenilacético (4,0 g, 23,43 milimoles), K_{2}CO_{3} (4,4 g, 31,95 milimoles), carbonildiimidazol (3,8 g, 23,43 milimoles) y 4-dimetilaminopiridina (0,1 g) en 20 ml de DMF fue calentada a 90ºC durante 5 horas. La mezcla de reacción fue vertida sobre 150 ml de H_{2}O y fue agitada durante 30 minutos. El producto precipitado fue recogido por filtración, y el producto deseado purificado fue aislado después de una cromatografía de resolución rápida [2,1 g, 52%, LC/MS = 379 (M+H^{+})].

Ejemplo 9 3-(4-clorofenil)-7-metoxi-4-[4-(2-piperidiletoxi)fenil]-2H-cromen-2-ona

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28

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El compuesto del título fue preparado a partir de 3-(4-clorofenil)-4-(4-hi-droxifenil)-7-metoxi-2H-cromen-2-ona de la manera descrita en el Ejemplo 4 [LC/MS = 492 (M+H^{+})].

Ejemplo 10 3-(4-clorofenil)-7-hidroxi-4-[4-(2-piperidiletoxi)fenil]-2H-cromen-2-ona

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El compuesto del título fue preparado a partir de 3-(4-clorofenil)-7-me-toxi-4-[4-(2-piperidiletoxi)fenil]-2H-cromen-2-ona de la manera descrita en el Ejemplo 5 [LC/MS = 476 (M+H^{+})].

Ejemplo 11 Compuestos adicionales

Mediante los procedimientos aquí expuestos, pueden prepararse los compuestos de la Tabla 1.

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TABLA 1 Compuestos

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30

31

32

Ejemplo 12 Sistema de cultivo conjunto de células óseas humanas

La generación de células osteoblásticas de hueso trabecular femoral adulto normal de pacientes sin evidencia de enfermedad ósea metabólica fue llevada a cabo del modo previamente descrito (Kung Sutherland et al., Osteoporosis International 5: 335-343, 1.995; Wong et al., J. Bone Miner. 5: 803-813, 1.990). Se quitó el tejido adherente y la sangre de fragmentos óseos y se cultivaron éstos durante 4 semanas en medio que contenía F12 de Ham complementado con HEPES 28 mM, pH de 7,4, suero de ternera fetal (FCS; del inglés, fetal calf serum) al 10%, CaCl_{2} 1,1 mM, glutamina 2 mM y agente antibiótico-antimicótico al 1%. Tras la confluencia, las células fueron recogidas y fueron inmortalizadas utilizando un vector retrovírico (pLXSN) que contiene el gen de resistencia a la neomicina y los oncogenes E6 y E7 de papilomavirus humano (HPV18) (International Journal of Oncology 6: 167-174, 1.995). Las células osteoblásticas inmortalizadas fueron seleccionadas en medio que contenía G418 (600 \mug/ml).

Se mantuvo la línea celular monocítica U937 humana (clonada por dilución sucesiva de las células comercialmente asequibles) en medio RPMI 1640 que contenía FCS al 10% y agente antibiótico-antimicótico al 1%.

El sistema de cultivo conjunto fue establecido del modo siguiente. Se sembraron células osteoblásticas humanas en placas de 96 pocillos con una densidad de 5 x 10^{3} células/pocillo. Se dispuso una capa de células U937 en medio RPMI (5 x 10^{4} células/pocillo) sobre los osteoblastos. Se provocó la formación de células similares a osteoclastos con PMA 100 nM. Para determinar los efectos de los compuestos o los anticuerpos neutralizantes hacia IL-6 (Sigma) y GM-CSF (Pharmingen) sobre la formación de células similares a osteoclastos, se añadieron los compuestos o los anticuerpos 30 minutos antes de la adición de PMA. Los cultivos fueron interrumpidos después de 96 horas y fueron procesados para análisis histoquímicos o inmunohistoquímicos.

Ejemplo 13 Actividad del compuesto 1 en el cultivo conjunto de células óseas humanas

Se probó el compuesto del Ejemplo 5 (es decir, el compuesto nº 1 de la Tabla 1) en el sistema de cultivo conjunto de células óseas humanas del Ejemplo 12 y se halló que tenía una concentración inhibitoria del 50% (IC_{50}; del inglés, inhibitory concentration 50%) con respecto a IL-6 y GM-CSF de 10 nM y 38 nM, respectivamente.

Ejemplo 14 Actividad del compuesto 1 sobre la producción de IL-6 y GM-CSF en células HOB

Se sembraron osteoblastos humanos (HOB; del inglés, human osteoblasts) en placas de 96 pocillos con una densidad de 7 x 10^{3} células/pocillo, en medio regular para HOB (F12 de Ham complementado con HEPES 28 mM, pH de 7,4, FCS al 10%, CaCl_{2} 1,1 mM, glutamina 2 mM y agente antibiótico-antimicótico al 1%). El día siguiente, las células fueron tratadas con el Compuesto 1 o el vehículo (DMSO al 0,2%) durante 30 minutos antes de la adición de la combinación de IL-1\beta (1 ng/ml) y TNF-\alpha (10 ng/ml). Se continuaron los cultivos durante un periodo de 18 a 24 horas. Los niveles de IL-6 y GM-CSF en el medio de cultivo fueron medidos usando sistemas comercialmente asequibles para ensayos de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA; del inglés, enzyme-linked immunosorption assay) (Endogen, Cambridge, Massachusetts, EE.UU.). Los resultados de este experimento se exponen en la Figura 1A para la inhibición de IL-6, y la Figura 1B para la inhibición de GM-CSF. En esas figuras también se presentan los datos comparativos para el dietil-estilbestrol (DES) y el raloxifeno.

Ejemplo 15 Actividad del compuesto 1 sobre la producción de IL-6 en células RA

Se sembraron sinoviocitos primarios de pacientes con artritis reumatoide (RA; del inglés, rheumatoid arthritis) en placas de 96 pocillos con una densidad de 8 x 10^{3} células/pocillo, en medio DMEM exento de rojo fenol y complementado con glutamina 2 mM, agente antibiótico-antimicótico al 1% y FCS al 10% descargado de impurezas con carbón vegetal. El día siguiente, las células se trataron con el Compuesto nº 1 o el vehículo (DMSO al 0,2%) durante 30 minutos antes de la adición de la combinación de IL-1\beta (2 ng/ml) y TNF-\alpha (2 ng/ml). Se continuaron los cultivos durante un periodo de 18 a 24 horas. Los niveles de IL-6 en el medio de cultivo fueron medidos usando ELISAs Endogen comercialmente asequibles, como se describió anteriormente. Los resultados de este experimento, así como la actividad comparativa del DES y el raloxifeno, se presentan en la Figura 2.

Ejemplo 16 Actividad del compuesto 1 sobre la proliferación de células de cáncer de mama

Se sembraron células de carcinoma de mama MCF-7 en placas de 24 pocillos con una densidad de 5 x 10^{3} células/pocillo, en medio DMEM exento de rojo fenol:F-12 (1:1) que contenía antibióticos al 1%, \beta-mercaptoetanol al 0,05%, etanolamina al 0,01%, 0,42 ng/ml de selenito sódico y FCS al 5% descargado de impurezas con carbón vegetal. Se añadieron el Compuesto nº 1 y el vehículo (DMSO al 0,2%) el día siguiente y se realizó una renovación con cambio de medios cada 48 horas. Se interrumpieron los cultivos 9 días más tarde y se analizó la proliferación usando el sistema Cyquant (Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.). Los resultados de este experimento se presentan en la Figura 3, que incluye datos comparativos para el tamoxifeno y el raloxifeno así como para la combinación de los mismos con estradiol.

Ejemplo 17 Actividad del compuesto 1 sobre la proliferación de células de carcinoma de próstata

Se sembraron células de carcinoma de próstata DU-145 en placas de 96 pocillos con una densidad de 2 x 10^{3} células/pocillo, en medio MEM Eagles exento de rojo fenol que contenía sales equilibradas de Earles, agente antibiótico-antimicótico al 1%, glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato sódico 1 mM, y FCS al 10% descargado de impurezas con carbón vegetal. Se añadieron el Compuesto nº 1 y el vehículo (DMSO al 0,2%) el día siguiente y se realizó una renovación con cambio de medio cada 48 horas. Se interrumpieron los cultivos 5 días más tarde y se analizó la proliferación usando el sistema Cyquant, como se describió anteriormente. Los resultados de este experimento, con datos comparativos para el DES, se presentan en la Figura 4.

Ejemplo 18 Ensayo de unión al ER en fase sólida

Se evaluó la unión al receptor estrogénico humano (ER-\alpha y ER-\beta) en un ensayo de competición con ^{3}H-estradiol en fase sólida, según la adaptación de McGuire, Cancer Res. 38: 4.289-4.291, 1.978. En resumen, se inmovilizó
ER-\alpha (15 nM) o ER-\beta (50 nM) recombinantes humanos en pocillos de placas para microtitulación de 96 pocillos. La unión del compuesto de ensayo al ER fue evaluada en competición con ^{3}H-estradiol 30 nM a temperatura ambiental durante 1 hora. Los resultados de este experimento, como se presentan en la Tabla 2, representan la media de al menos 3 experimentos diferentes. Se ensayaron simultáneamente compuestos de referencia como una parte integral de cada ensayo para asegurar la validez de los resultados obtenidos.

TABLA 2 Unión al ER en fase sólida

	K_{i} (nM)
Receptor	Compuesto nº 1	Citrato de	Raloxifeno\cdotHCl	Estradiol
	(sal HCl)	Tamoxifeno
ER-\alpha	1,4	72	0,4	0,8
ER-\beta	7,3	173	13	2,5

Se halló que los datos de unión para el tamoxifeno, raloxifeno y estradiol correspondían a los valores bibliográficos publicados para esos compuestos. Se comparó la unión del Compuesto nº 1 (en forma de la sal HCl) a ER-\alpha y

\hbox{ER- \beta }

con la unión del 17\beta-estradiol, el citrato de tamoxifeno y el raloxifeno\cdotHCl. El Compuesto nº 1 se une con elevada afinidad (similar a la del estradiol) a ER-\alpha y ER-\beta. Se halló que la afinidad hacia ER-\beta era ligeramente menor que hacia ER-\alpha, como es típico para la mayoría de los ligandos del ER. Ejemplo 19 Riesgo uterino

Como se discutió aquí, son deseables compuestos que actúen como moduladores selectivos del receptor estrogénico o SERMs. En una realización preferida, los SERMs no presentan riesgo uterino según se evaluó en ensayos reconocidos, tales como el bioensayo uterino en ratas inmaduras (Robertson et al., Biol. Reprod. 54: 183-196, 1.996; Medlock et al., Biol. Reprod. 56: 1.239-1.244, 1.997; Martel et al., Endocrinology 139: 2.486-2.492, 1.998; Hyder et al., Cancer Cells 120: 165-171, 1.997) y el bioensayo uterino en ratas sometidas a ovariectomía (Sato et al., FASEB J. 10: 905-912, 1.996; Ruenitz et al., Bone 23: 537-542, 1.998; Luo et al., Endocrinology 139: 2.645-2.656, 1.998; Ke et al., Bone 20: 31-39, 1.997). En ambos ensayos se mide el efecto de un compuesto concreto sobre el peso del útero en estados húmedo y seco, y ambos proporcionan datos histológicos.

Se ensayó el Compuesto nº 1 junto con estrógeno y raloxifeno\cdotHCl en un bioensayo uterino de 3 días en ratas inmaduras en que se usa administración subcutánea (s.c.) (Medlock et al., supra). El estrógeno causó un aumento del peso uterino de 4,5 veces, que es el valor bibliográfico comunicado (Ashby et al., Regul. Toxicol. Pharmacol. 25: 226-231, 1.997; Medlock et al., supra). El raloxifeno\cdotHCl causó un aumento del peso uterino de hasta el 50% con una dosis de 1 mg/kg, lo que también está de acuerdo con los datos publicados (Ashby et al., supra). El Compuesto nº 1 causó un aumento del peso uterino de aproximadamente 30%, lo que no era estadísticamente diferente del valor de los animales tratados con vehículo (PEG-400). Tanto el raloxifeno\cdotHCl como el Compuesto nº 1 mostraron una dosis-respuesta en forma de campana, lo que se halla típicamente con SERMs.

Se ensayó también el Compuesto nº 1 junto con 17\beta-estradiol y raloxifeno\cdotHCl en un bioensayo uterino de 28 días en ratas sometidas a ovariectomía (Ke et al., supra). Los tres compuestos se administraron diariamente por inyección s.c. El estrógeno evitó la pérdida de peso uterino causada por la ovariectomía al aumentar el peso uterino un 550%. Estos resultados están de acuerdo con los datos publicados (Grese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14.105-14.110, 1.997; Ashby et al., supra; Ke et al., supra). El raloxifeno\cdotHCl causó un aumento del peso uterino de aproximadamente 70%, lo que había sido previamente comunicado (Grese et al., supra; Ashby et al., supra). El Compuesto nº 1 causó un aumento del peso uterino de aproximadamente 40%, lo que era estadísticamente menor que el aumento de peso mediado por el raloxifeno\cdotHCl. Estos resultados respaldan los datos del bioensayo uterino en ratas inmaduras sobre que el Compuesto nº 1 no muestra un riesgo uterino significativo. De esta manera, este compuesto presenta un potencial significativo para la prevención y/o el tratamiento del cáncer y la osteoporosis, así como de enfermedades cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas, tal como la enfermedad de Alzheimer.

Ejemplo 20 Ensayo comparativo

Se ensayó el compuesto nº 1 frente a un compuesto de Lednicer et al., J. Med. Chem. 8: 725-726, 1.965. Más específicamente, esta referencia se dirige a compuestos basados en cumarina como supuestos antagonistas estrogénicos. Uno de estos compuestos (es decir, el Compuesto 20 de la Tabla IV, en adelante "L-20") tiene la estructura siguiente [LC/MS (M+H)^{+} = 414]:

34

El compuesto anterior fue ensayado frente al Compuesto nº 38 del presente invento en el ensayo de unión al ER del Ejemplo 18 y el sistema de cultivo conjunto de células óseas humanas del Ejemplo 12 para actividad de IL-6. Los resultados de estos experimentos se presentan en la Tabla 3.

TABLA 3

	Ensayo de unión a ER	Actividad de IL-6
	ER-\alpha (K_{i}, \muM)	ER-\beta (K_{i}, \muM)	IC_{50}, \muM
Compuesto nº 38	0,69	1,56	0,175
"L-20"	>10	>10	>1

Ejemplo 21 Selectividad para ER en células de osteosarcoma U20S

Se transfectaron establemente células de osteosarcoma U20S humano (ATCC) con vectores de expresión para ER-\alpha o ER-\beta humanos de longitud completa, respectivamente, usando técnicas de biología molecular estándares. Se generaron subclones estables que expresaban niveles elevados de mRNA de ER-\alpha o ER-\beta. Se confirmó la expresión de ER-\alpha y ER-\beta usando un análisis de protección de RNasa. Las células U20S originarias no expresaban cantidades mensurables de ER-\alpha ni ER-\beta.

Se sembraron células en placas de 96 pocillos con una densidad de 8.000 células por pocillo en medios exentos de rojo fenol y con suero de ternera fetal descargado de impurezas con carbón vegetal. Veinticuatro horas más tarde, las células fueron tratadas con el vehículo (DMSO al 0,2%) o con el compuesto de ensayo en las concentraciones indicadas (en DMSO al 0,2%). Treinta minutos más tarde, las células fueron estimuladas con 10 ng/ml de IL-\beta y 10 ng/ml de TNF-\alpha. Veinticuatro horas más tarde, el sobrenadante de los medios fue analizado en cuanto a producción de citoquinas (IL-6) utilizando sistemas ELISA comercialmente asequibles siguiendo las instrucciones del fabricante. La producción de citoquinas en presencia del vehículo (DMSO al 0,2%) fue ajustada a 100%.

En la Tabla 4 se exponen los resultados de este ensayo para diversos compuestos representativos de este invento así como para los compuestos de ensayo de la técnica anterior. En esa tabla, la actividad se expresa como IC_{50} calculada por inhibición del 50% con respecto al DMSO testigo (100%).

TABLA 4 Efecto de SERMs representativos sobre citoquinas

	IL-6 de U20S	IL-6 de U20S	IL-6 de U20S
	ER-\alpha	ER-\beta	ER-Negativo
Compuesto	IC_{50} (nM)	IC_{50} (nM)	IC_{50} (nM)
"L-20"	>1.000	>1.000	>1.000
17-\beta-estradiol	0,03	0,016	>1.000
Hidrocloruro de raloxifeno	3	10.000	>1.000
4-hidroxi-tamoxifeno	0,3-3	>1.000	>1.000
Compuesto nº 16	325	51	>1.000
Compuesto nº 38	>1.000	165	>10.000

En relación con la tabla anterior, compuestos representativos de este invento (por ejemplo, los Compuestos números 16 y 38) mostraban especificidad para ER-\beta con respecto a ER-\alpha, mientras que los compuestos de la técnica anterior (con excepción del 17-\beta-estradiol) eran selectivos para ER-\alpha con respecto a ER-\beta.

Se apreciará que, aunque aquí se han descrito realizaciones específicas del invento con fines de ilustración, pueden realizarse diversas modificaciones sin desviarse del espíritu ni el alcance del invento. En consecuencia, el invento no está limitado salvo por las reivindicaciones siguientes.

Claims

1. Un compuesto que tiene la estructura (I):

37

o un estereoisómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; fórmula en la que:

n es 0, 1, 2, 3 ó 4;

38

en que:

A es CH_{2}, O, S o NH;

2. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que R_{1} es un arilo C_{6-12} no sustituido o sustituido, un heteroarilo no sustituido o sustituido, un arilalquilo C_{7-12} no sustituido o sustituido, o un heterociclo C_{3-12} o heterocicloalquilo C_{4-16} no sustituido o sustituido.

3. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 2, en el que R_{1} es un fenilo no sustituido o sustituido, un piridinilo o tiofenilo no sustituido o sustituido, o un bencilo no sustituido o sustituido.

4. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 3, en el que R_{1} es 4-halofenilo, 4-metilfenilo, 4-hidroxifenilo, 4-trifluorometilfenilo, 3-halofenilo, 2-halofenilo, 2,4-dihalofenilo o 3,4-dihalofenilo, en los que halo es fluoro, cloro, bromo o yodo.

5. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que n es 0, 1, 3 ó 4.

6. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que n es 2.

7. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que R_{2} es un anillo heterocíclico con la estructura siguiente:

39

en que:

A es CH_{2}, O, S o NH;

8. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 7, en el que m_{1} y m_{2} son 1, o m_{1} es 1 y m_{2} 0.

9. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 8, en el que A es CH_{2} u O.

10. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 7, en el que R_{2} es piperidin-1-ilo o morfolin-4-ilo.

11. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 7, en el que R_{2} es imidazol-1-ilo o imidazol-2-ilo sustituido con 0 ó 1 sustituyentes Z.

12. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que resto R_{2}-(CH_{2})_{n}-O- está unido a la posición 3 ó 4 del anillo fenílico.

13. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 1, que tiene la estructura:

40

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en la que n es 0, 1, 2, 3 ó 4.

14. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 1, que tiene la estructura:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

en la que X es uno o más sustituyentes fenílicos.

15. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 1, que tiene la estructura:

\vskip1.000000\baselineskip

42

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en la que X es halógeno.

16. Un compuesto de acuerdo con la Reivindicación 1, que tiene la estructura:

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44

45

46

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

17. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-16 en combinación con un vehículo o agente diluyente farmacéuticamente aceptable.

18. Un método in vitro para modular ER-\beta en una célula o tejido que expresa ER-\beta, que comprende poner la célula o el tejido en contacto con una cantidad eficaz de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-16 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 17.

19. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-16 o una composición de acuerdo con la Reivindicación 17 para uso en un método in vivo para modular ER-\beta en una célula o tejido que expresa ER-\beta.

20. Un método de acuerdo con la Reivindicación 18 o un compuesto o composición de acuerdo con la Reivindicación 19, en que la célula o tejido es de hueso, vejiga, útero, ovario, próstata, testículo, epidídimo, tracto gastrointestinal, riñón, mama, ojo, corazón, pared vascular, sistema inmune, pulmón, hipófisis, hipocampo o hipotálamo.