ES2281080T3 - Metodo para preparar polipeptidos heteromultimeros. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION DESCRIBE UN METODO PARA PREPARAR POLIPEPTIDOS HETEROMULTIMERICOS TALES COMO ANTICUERPOS BIESPECIFICOS, INMUNOADHESINAS BIESPECIFICAS, Y QUIMERAS ANTICUERPOINMUNOADHESINA. LA INVENCION TAMBIEN INCLUYE LOS HETEROMULTIMEROS PREPARADOS UTILIZANDO ESTE METODO. EN GENERAL, EL METODO IMPLICA LA INTRODUCCION DE UNA PROTUBERANCIA EN LA INTERFAZ DE UN PRIMER POLIPEPTIDO Y UNA CAVIDAD CORRESPONDIENTE EN LA INTERFAZ DE UN SEGUNDO POLIPEPTIDO, DE MANERA QUE LA PROTUBERANCIA PUEDA POSICIONARSE EN LA CAVIDAD PROMOVIENDO ASI LA FORMACION DE HETEROMULTIMEROS Y DIFICULTANDO LA FORMACION DE HOMOMULTIMEROS. LAS "PROTUBERANCIAS" SE CONSTRUYEN REEMPLAZANDO CADENAS LATERALES PEQUEÑAS DE AMINOACIDOS DE LA INTERFAZ DEL PRIMER POLIPEPTIDO CON CADENAS LATERALES MAYORES (P. EJ. TIROSINA O TRIPTOFANO). LAS "CAVIDADES" COMPENSATORIAS DE TAMAÑO IDENTICO O SIMILAR A LAS PROTUBERANCIAS SE CREAN EN LA INTERFAZ DEL SEGUNDO POLIPEPTIDO REEMPLAZANDO CADENAS LATERALES GRANDES DE AMINOACIDOS CON CADENAS LATERALES MAS PEQUEÑAS (P.E. ALANINA O TREONINA). LAS PROTUBERANCIAS Y CAVIDADES PUEDEN REALIZARSE POR MEDIOS SINTETICOS TALES COMO ALTERAR EL ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA PARA LOS POLIPEPTIDOS O POR SINTESIS DE PEPTIDOS.

Description

Método parta preparar polipéptidos heteromultímeros.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención está relacionada con un procedimiento para preparar polipéptidos heteromultímeros, tales como anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), inmunoadhesinas multiespecíficas (por ejemplo, inmunoadhesinas biespecíficas) al igual que quimeras anticuerpo-inmunoadhesina y los polipéptidos heteromultímeros preparados utilizando el procedimiento.

Descripción de técnica relacionada Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) que presentan especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes presentan un significativo potencial en una amplia gama de aplicaciones clínicas como agentes para diana, para inmunodiagnosis in vitro e in vivo y para terapia, al igual que para inmunoensayos de diagnosis.

En las áreas de diagnosis, los anticuerpos biespecíficos han resultado ser muy útiles para demostrar las propiedades funcionales de las moléculas de superficie celular y para definir la capacidad de los diferentes receptores Fc para mediar la citotoxicidad (Fanger et al., Crit. Rev. Immunol. 12: 101-124 [1992]). Nolan et al., Biochem Biophys. Acta 1040: 1-11 (1990) describen otras aplicaciones para diagnosis para BsAbs. En particular, los BsAbs pueden ser construidos para inmovilizar enzimas para 5 ser utilizados en inmunoensayos de enzima. Para alcanzar esto, un brazo del BsAb puede ser diseñado para su unión a un epítope específico sobre el enzima, a los efectos de que la unión no provoque la inhibición del enzima, el otro brazo del BsAb se une a la matriz inmovilizante, asegurando una elevada densidad de enzima en el punto deseado. Entre los ejemplos de tales BsAbs de diagnosis se incluyen el BsAs anti-IgG/anti-ferritina de conejo, descrito por Hammerling et al, J. Exp. Med. 128: 1461-1473 (1968), el cual fue utilizado para localizar antígenos superficiales. Se han desarrollado también BsAbs que tienen especificidades de unión para peroxidasa de rábano (HRP), al igual que una hormona. Otra potencial aplicación inmunoquímica para BsAbs conlleva su utilización en inmunoensayos de dos puntos. Por ejemplo, se generan dos BsAbs mediante unión a dos epítopes separados sobre la proteína analito -un BsAb une el complejo a una matriz insoluble y el otro se une a un enzima indicador (ver Nolan et al, supra).

Pueden utilizarse también anticuerpos biespecíficos para inmunodiagnosis in vitro o in vivo de diversas enfermedades, tales como cáncer (Songsivilai et al., Clin. Exp. Immuniol. 79: 315 [1990]). Para facilitar este uso en diagnosis del BsAb, un brazo del BsAb puede unirse a un antígeno asociado a tumor y el otro brazo puede unirse a un marcador detectable, tal como un quelador que se une estrechamente a un radionúclido. Utilizando este planteamiento, Le Doussal et al, prepararon un BsAb útil para radioinmunodetección colorrectal y de carcinomas de tiroides, el cual tenía un brazo que se unía a un antígeno carcinoembriónico (CEA) y otro brazo que se unía a ácido dietilentriaminopentaacético (DPTA). Ver Le Doussal et al., Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62 (1992) y Le Doussal et al., J. Nucl. Med. 34: 1662-1671 (1993). Sticney et al., describen similarmente una estrategia para detectar cánceres colorrectales que expresan CEA utilizando radioinmunodetección. Estos investigadores describen un BsAb que se une a CEA, al igual que a hidroxietiltiourea-bencil-EDTA (EOTUBE). Ver Stickney et al., Cancer Res. 51: 6650-6655 (1991).

Los anticuerpos biespecíficos pueden también utilizarse para terapia humana en citotoxicidad redireccionada, mediante la provisión de un brazo que se une a una diana (por ejemplo una célula tumoral o patógena) y otro brazo que se une a una molécula desencadenante de citotoxicidad, tal como el receptor de células T o el receptor Fc\gamma. Por consiguiente, pueden utilizarse anticuerpos biespecíficos para dirigir los mecanismos de inmunodefensa celulares de un paciente específicamente hacia la célula tumoral o al agente infeccioso. Utilizando esta estrategia, se ha demostrado que los anticuerpos biespecíficos que se unen a Fc\gammaRIII (a saber, CD16) pueden mediar la destrucción de células tumorales mediante células destructoras de origen natural (NK)/células (LGL) linfocitos granulares grandes, in vitro, y resultan eficaces en la prevención de crecimiento tumoral in vivo. Segal et al, Chem. Inmmunol. 47:179 (1989) y Segal et al., Biologic Therapy of Cancer 2 (4) DeVita et al., eds. J.B. Lippincott, Philadelphia (1992) p. 1. Similarmente, se ha desarrollado un anticuerpo biespecífico que tiene un brazo que se une a Fc\gammaRIII y otro que se une al receptor HER2, para terapia de tumores de mama y de ovario que sobreexpresan al antígeno HER2. (Hseih-Ma et al., Cancer Research 52: 6832-6839 [1992] y einer et al., Cancer Research 53: 94-100 [1993]). Los anticuerpos biespecíficos pueden también mediar la destrucción mediante células T. Normalmente, los anticuerpos biespecíficos unen el complejo CD3 sobre células T a un antígeno asociado a tumor. Un F(ab')_{2}BsAb completamente humanizado que comprende anti-CD3 unido a anti-p185^{HER2} ha sido utilizado para dirigir células T para destruir células tumorales que sobreexpresan el receptor HER2. Shalaby et al, J. Exp. Ed. 175 (1): 217 (1992). Se han testado anticuerpos biespecíficos en varios ensayos clínicos de fase inicial con resultados prometedores. En un ensayo, 12 pacientes con cáncer de mama, ovario o pulmón fueron tratados con infusiones de linfocitos T activados dirigidos con un anticuerpo biespecífico anti CD3/anti-tumor (MOC31). DeLeij et al., Biespecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Romet-Lemonne, Fanger and Segal Eds., Lienhart (1991) p. 249. Las células dirigidas inducían lisis local de células tumorales, una reacción de inflamación moderada, pero no efectos tóxicos colaterales o respuestas anticuerpo anti-ratón. En un ensayo muy preliminar de un anticuerpo biespecífico anti-CD3/anti-CD19, en un paciente con malignidad de células B, se logró también una reducción significativa en el contaje de células tumorales periféricas. Clark et al, Biespecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Romet Lemonne, Fanger and Segal Eds., Lienhart (1991) p. 243. Ver también Kroesen et al., Cancer Immunol. Immunother. 37: 400-407 (1993), Kroesen et al., Br. J. Cancer 70: 652-661 (1994) y Weiner et al., J. Immunol. 152: 2385 (1994), en relación con aplicaciones terapéuticas para BsAbs.

Los anticuerpos biespecíficos pueden ser también utilizados como agentes fibrinolíticos o adyuvantes de vacuna. Además, estos anticuerpos pueden ser utilizados en el tratamiento de enfermedades infecciosas (por ejemplo, para dirección de células efectoras hacia células infectadas líricamente, tales como HIV o virus de la gripe o protozoos, tales como Toxoplasma gondii), utilizadas para suministrar inmunotoxinas a las células tumorales o dirigir inmunocomplejos hacia los receptores de la superficie celular (ver Fanger et al., supra).

La utilización de BsAbs se ha visto estorbada por la dificultad de obtener BsAbs en cantidad y pureza suficientes. Tradicionalmente, los anticuerpos biespecíficos fueron preparados utilizando la tecnología hibrido-hibridoma (Millstein and Cuello, Nature 305: 537-539 [1983]). Debido al surtido aleatorio de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales tan solo una presenta la estructura biespecífica correcta (ver Figura 1, en el presente documento). La purificación de la molécula correcta, la cual se. efectúa habitualmente mediante pasos de cromatografía por afinidad, resulta bastante engorrosa y los rendimientos de producto son bajos. Por consiguiente, se han desarrollado técnicas para la producción de rendimientos más elevados de BsAb. Estas se dibujan en las Figuras 2A-2E, en el presente documento. Tal y como se muestra en la Figura 2A, los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados utilizando unión química. Para alcanzar el acoplamiento químico de fragmentos de anticuerpo, Brennan et al., Science 229: 81 (1985) describe un procedimiento en el que anticuerpos intactos son rotos proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos son reducidos en presencia de agente complejante ditiol arsenito sódico, para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados son después convertidos en derivados tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB es después reconvertido en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y mezclado con una cantidad eqimolar del otro derivado Fab'-tiol, para formar el BsAb. Los BsAbs producidos pueden ser utilizados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Un progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH procedentes de E. coli, los cuales pueden ser acoplados químicamente para formar anticuerpos biespecíficos (ver la Figura 2B). Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992), describe la purificación de una molécula BsAb F(ab')_{2} completamente humanizada que tiene un brazo que se une a p185^{HER2} y otro brazo que se une a CD3. Cada uno de los fragmentos Fab' fue secretado separadamente a partir de E. coli y sometido a acoplamiento químico directo in vitro, para formar el BsAb. El BsAb obtenido de este modo era capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor HER2 y a células T humanas, así como desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos frente a dianas de tumores de mama humanas. Ver también Rodrigues et al., Inte. J. Cancers (Suppl.) 7: 45-50 (1992).

Se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos BsAb directamente a partir de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido heterodímeros F(Ab')_{2} biespecíficos utilizando zippers de leucina (ver la Fig. 2C). Kostelny et al., J. Immunol 148 (5): 1547-1553 (1992). Los péptidos zipper de leucina procedentes de las proteínas Fos y Jun fueron unidos a las partes Fab' de anticuerpos anti-CD3 \gamma del receptor anti-interleukina-2 (IL-2R), mediante fusión de genes. Los homodímeros anticuerpo fueron reducidos en la región bisagra para formar monómeros y después reoxidados para formar los heterodímeros anticuerpo. Se averiguó que los BsAbs resultaban altamente eficaces para reclutar células T citotóxicas, para someter a lisis a las células HuT-102, in vitro. La llegada de la tecnología "diacuerpo" descrita por parte de Hollinger et al., PNAS (USA) 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para la preparación de fragmentos BsAbs. Los fragmentos comprenden un dominio variable (V_{H}) de cadena pesada conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}), mediante un elemento de unión que resulta demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento son forzados a emparejarse con los dominios V_{L} y V_{H} de otro fragmento, formando como consecuencia dos puntos de unión a antígeno (ver Fig. 2D en el presente documento). Se ha informado acerca de otra estrategia para preparar fragmentos BsAb, mediante la utilización de los dímeros Fv(sFv) de cadena sencilla. Ver Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994). Estos investigadores diseñaron un anticuerpo que comprendía los dominios V_{H} y V_{L} de un anticuerpo dirigido frente al receptor de célula T unido a los dominios V, y V_{L} de un anticuerpo anti-fluoresceína a través de un elemento de un resto de 25 aminoácidos. La molécula redoblada (ver la Fig. 2E en el presente documento) se unía a la fluoresceína y al receptor de células T y redirigía la lisis de las células tumorales humanas que presentaban fluoresceína unida covalentemente a su superficie.

Parece evidente que se ha informado acerca de diversas técnicas para preparar fragmentos de anticuerpo biespecíficos, los cuales pueden ser recuperados directamente a partir de cultivos celulares. No obstante, los BsAbs pueden resultar preferibles a los fragmentos BsAb para muchas aplicaciones clínicas, debido a su, probablemente, mayor duración de semi-vida y a posibles funciones efectoras.

Inmunoadhesinas

Las inmunoadhesinas (Ia's) son moléculas de anticuerpo que combinan el dominio de unión de una proteína, tal como un receptor de superficie celular o un ligando (una "adhesina") con las funciones efectoras de un dominio constante de inmunoglobulina. Las inmunoadhesinas pueden poseer muchas de las valiosas propiedades físicas y químicas de los anticuerpos humanos. Dado que las inmunoadhesinas pueden ser construidas a partir de una secuencia de proteína humana, con una especificidad deseada, unida a una bisagra inmunoglobulina humana adecuada y a una secuencia de dominio constante (Fc), la especificidad de unión de interés puede ser alcanzada utilizado componentes completamente humanos. Las citadas inmunoadhesinas resultan mínimamente inmunógenas para el paciente y son seguras para un uso crónico o repetido.

Entre las inmunoglobulinas reportadas en la literatura se incluyen fusiones del receptor de células T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 2936-2940 [1987]); CD4 (Capon et al., Nature 337: 525-531 [1989]; Traunecker et al., Nature 339: 68-70 [1989]; Zettmeissi et al., ADN Cell Biol. USA 9:347-353 [1990]; y Byrnet et al., Nature 344: 667-670 [1990]); L-selectina o receptor homing (Watson et al., J. Cell Biol. 110: 2221-2229 [1990]; y Watson et al, Nature 349: 164-167 [1991]); CD44 (Aruffo et al., Cell 61: 1303-1313 [1990]); CD28 y B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173: 721-730 [1991]); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174: 561-569 [1991]); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66: 1133-1144 [1991]); receptor TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539 [1991]; Lessiauer et al, Eur J. Immunol. 27: 2883-2886 [1991]; y Peppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 [1991]); receptores NP (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266: 23060-23067 [1991]); receptor de interferón \gamma (Kurschner et al., J. Biol. Chem. 267: 9354-9360 [1992]; 4-1BB (Chalupny et al., PNAS [USA] 89: 10360-10364 [1992] y receptor a de IgE (Ridgway y Gorman, J. Cell Biol. Vol 115, abstract Nº. 1448 [1991]).

Entre los ejemplos de inmunoadhesinas que han sido descritas para uso terapéutico se incluyen la inmunoadhesina CD4-IgG que bloquea la unión de HIV a CD4 de la superficie celular. Los datos obtenidos a partir de ensayos clínicos en fase I, en los cuales la CD4-IgG fue administrada a mujeres embarazadas justo antes del parto, sugieren que esta inmunoadhesina puede resultar de utilidad en la prevención de la transferencia materno-fetal del HIV. Ashkenazi et al., Intern. Rev. Immunol. 10: 219-227 (1983). Se ha desarrollado también una inmunoadhesina que se une al factor de necrosis tumoral (TNF). El TNF es una citoquina pro-inflamatoria, la cual ha demostrado ser un importante mediador en el shock séptico. En base a un modelo de ratón de shock séptico, se ha demostrado que una inmunoadhesina de un receptor TNF promete como candidato para uso clínico en el tratamiento del shock séptico (Ashkenazi et al, supra). Las inmunoadhesinas tienen también usos no terapéuticos. Por ejemplo, la inmunoadhesina del receptor L-selectina se utilizó como reactivo para el teñido histoquímico de vénulas endoteliales elevadas de nódulos linfáticos periféricos (HEV). Este reactivo también se utilizó para aislar y caracterizar el ligando L-selectina (Ashkenazi et al, supra).

Si los dos brazos de la estructura de inmunoadhesina presentan diferentes especificidades, la inmunoadhesina se denomina una "inmunoadhesina biespecífica", por analogía con los anticuerpos biespecíficos. Dietsch et al., J. Immunol. Methods 162: 123 (1993) describen la citada inmunoadhesina biespecífica combinando los dominios extracelulares de las moléculas de adherencia, E-selectina y P-selectina. Estudios de unión indicaron que la proteína de fusión inmunoglobulina biespecífica obtenida de esta manera presentaba una capacidad reforzada para unirse a una línea celular mieloide, en comparación con las inmunoadhesinas monoespecíficas, a partir de las cuales procede.

Quimeras anticuerpo-inmunoadhesina

En la literatura se han descrito quimeras anticuerpo-inmunoadhesina (Ab/Ia). Estas moléculas combinan la región de unión de una inmunoadhesina con el dominio de unión de un anticuerpo.

Berg et al., PNAS (USA) 88: 4723-4727 (1991) prepararon una quimera anticuerpo-inmunoadhesina biespecífica, la cual procedía de CD4-IgG murino. Estas personas construyeron una molécula tetrámera con dos brazos. Un brazo estaba compuesto de CD4 fusionado con un dominio constante de cadena pesada de anticuerpo, junto con una fusión CD4, con un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo. El otro brazo estaba compuesto de una cadena pesada completa de un anticuerpo anti-CD3, junto con una cadena ligera completa del mismo anticuerpo. En virtud del brazo CD4-IgG, esta molécula biespecífica se une a CD3 sobre la superficie de células T citotóxicas. La yuxtaposición de las células citotóxicas y las células infectadas con HIV daba como resultado la destrucción específica de estas últimas células.

Si bien Berg et al., describen una molécula biespecífica con una estructura tetrámera, resulta posible producir una molécula híbrida trímera que contiene tan solo una fusión CD4-IgG. Ver Chamow et al. J. Immunol. 153: 4268 (1994). El primer brazo de esta construcción está formado por una cadena ligera anti-CD3 \kappa humanizada y una cadena pesada anti-CD3 \gamma humanizada. El segundo brazo es una inmunoadhesina CD4-IgG que combina parte del dominio extracelular del CD4 responsable de la unión gp120 con el dominio Fc de IgG. La quimera Ab/Ia resultante mediaba la destrucción de células infectadas con HIV utilizando, o bien preparaciones de células T citotóxicas puras o fracciones de linfocitos de sangre completa periférica (PBL), las cuales incluyen, adicionalmente, células efectoras de linfocito granular grandes que soportan receptor Fc.

En la fabricación de los heteromultímeros mencionados anteriormente, resulta deseable incrementar los rendimientos del heteromultímero deseado en relación con el(los) homomultímero(s). La invención descrita en el presente documento proporciona un medio para lograr este objetivo.

Resumen de la invención

La solicitud describe una estrategia de "protuberancia-en-cavidad", que se utiliza para elaborar una interfase entre un primer y un segundo polipéptido para hetero-oligomerización. Ver la Fig. 4 para una ilustración esquemática de la estrategia utilizada. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio C_{H}3 de un dominio constante de anticuerpo. Las "protuberancias" se construyen mediante la sustitución de pequeñas cadenas laterales de aminoácidos, procedentes de la interfase del primer polipéptido, por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). "Cavidades" compensatorias de idéntico o similar tamaño al de las protuberancias son creadas opcionalmente sobre la interfase del segundo polipéptido, mediante la sustitución de grandes cadenas laterales de aminoácido por cadenas más pequeñas (por ejemplo, alanita o treonina). Cuando en la interfase de o bien el primero y segundo polipéptido existe una protuberancia o cavidad adecuadamente posicionada y dimensionada, resulta tan solo necesario gestionar una cavidad o protuberancia correspondiente, respectivamente, en la interfase adyacente.

Por consiguiente, puede afirmarse que la invención está relacionada con un procedimiento según la reivindicación 1.

Normalmente, los ácidos nucleicos que codifican tanto para el primer polipéptido como para el segundo polipéptido son alterados para codificar para la protuberancia y la cavidad, respectivamente. El primer y el segundo polipéptido comprenden, cada uno de ellos, un dominio constante de anticuerpo, tal como el dominio C_{H}3 de una IgG humana.

La invención proporciona también un heteromultímero (tal como un anticuerpo biespecífico, inmunoadhesina biespecífica o una quimera anticuerpo/inmunoadhesina), obtenible a través del procedimiento de la reivindicación 1. El heteromultímero puede ser proporcionado en forma de una composición que comprende además un soporte farmacéuticamente aceptable.

La invención está también relacionada con una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica para el heteromultímero del párrafo precedente, en la que el ácido nucleico que codifica para el primer polipéptido y para el segundo polipéptido se encuentra presente en un vector sencillo o en vectores separados. La célula huésped puede ser utilizada en un procedimiento de preparación de un heteromultímero, el cual conlleva el cultivo de la célula huésped, a los efectos de que el ácido nucleico sea expresado y la recuperación del heteromultímero a partir del cultivo celular.

La invención proporciona un mecanismo para incrementar los rendimientos de heteromultímero en relación con los de otros productos finales, tales como homomultímeros. Preferiblemente, los rendimientos de heteromultímero recuperado a partir de cultivo celular recombinante son al menos superiores al 80% y, preferiblemente, superiores al 90%, en comparación con el(los) sub-producto(s) homomultímero(s).

Breve descripción de los gráficos

La Fig. 1 muestra las diversas moléculas de anticuerpo que pueden ser generadas cuando la técnica hibrido-hibridoma tradicional de Millstein y Cuello, supra, es utilizada para preparar BsAbs de longitud completa.

Las Figs. 2A-2E ilustran las diversas técnicas de los conocimientos anteriores para fabricar fragmentos BsAb, revisados en la anterior sección de antecedentes.

Las Figuras 3A-3C muestran una estrategia ejemplarizada para la preparación de un dímero inmunoadhesina (Fig. 3C), que comprende el dominio de unión de un receptor (Fig. 3A) y el dominio constante de una inmunoglobulina IgG_{1} (Fig. 3B).

La Fig. 4 ilustra esquemáticamente la estrategia de protuberancia-en-cavidad de la presente solicitud para generar heteromultímeros.

La Fig. 5 muestra los restos de interfase del dominio C_{H}3 de las inmunoglobulinas IgG (SEQ ID Nos: 1-3), IgA (SEQ ID NO:4), IgG (SEQ ID NO:5), IgE (SEQ ID NO:6) e IgM (SEQ ID NO:7). El dominio C_{H}3 de cada una de estas inmunoglobulinas está compuesto por un "sándwich \beta", que consta de dos "laminas \beta" separadas y paralelas. Una de las láminas \beta proporciona los restos interfase, la otra es la "lamina exterior \beta". La lámina \beta que forma la interfase está formada por cuatro "hebras \beta". Los restos de cada una de las siete hebras \beta del dominio C_{H}3 de las diversas inmunoglobulinas son identificados mediante subrayado. Los restos en las hebras \beta del centro y en el extremo de la interfase son identificados, al igual que los de la lámina \beta exterior. El numerado de los restos se efectúa según la estructura cristalina Fc (Deisenhofer, Biochem 20: 2361 [1981]). Los restos enterrados en el interior del dominio C_{H}3 son identificados con una "B", aquellos que están parcialmente enterrados en el interior del dominio C_{H}3 son identificados con una "b", aquellos restos de "contacto" que están parcialmente enterrados en la interfase (a saber, expuestos entre el 26% y 10%) son identificados con una "i" y aquellos que están enterrados en la interfase (a saber, expuestos < 6%) son identificados con una "I". Los restos en negrita son restos candidatos óptimos originales para sustitución por restos importados.

La Fig. 6 identifica los restos de interfase de subtipos IgG humana (h) (SEQ ID Nos: 8-11 y 16) o murina (m) (SEQ ID Nos: 12-15) (B=ASX y Z=GLX). Los restos en las hebras \beta en el extremo y en el centro de la interfase se muestran entre paréntesis y los restos de "contacto" se indican con flechas. Las secuencias son obtenidas a partir de Millar et al., J. Mol. Biol. 216: 965 (1990) y Rabat et al., Sequences of Proteins of Inmmunological Interest, Nacional Institutes of Health, Bethesda, MD, ed. 5 (1991). Aparentemente, los restos de contacto están altamente
conservados.

La Fig. 7 muestra restos de interfase del dominio C_{H}3 de IgG_{1} humana. Los datos son obtenidos de Millar et al., J. Mol. Biol. 216: 965 (1990). Se muestran restos "contacto" y aquellos restos mutados en los ejemplos descritos en el presente documento se encuentran dentro de las cajas.

La Fig.8 muestra el ensayo de co-transfección para examinar la heterodimerización de Fc descrita en los ejemplos.

La Fig. 9 muestra un dímero C_{H}3, basado en una estructura de 2,9 \ring{A} de IgG_{1} humana (Deisenhofer, Biochem 20: 2361 [1981]), destacando las mutaciones T366Y e Y407T sobre lados opuestos de la interfase, conjuntamente con restos Phe^{405} y Thr^{394} ("numeración Kabat"-Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Nacional Institutes of Health, Bethesda, MD, ed. 5, [1991]).

Las Figs. 10A-10E muestran un análisis densitométrico con escaneado de SDS-PAGE de productos procedentes de co-transfección de cadenas pesadas (H) y ligeras (L) de anticuerpo (Ab) con inmunoadhesina (Ia). La Fig. 10A muestra el tipo natural, la Figura 10B muestra el mutante Ab Y407T, la T366Y; la Fig. 10C muestra el mutante Ab T366Y, la Y407T; la Fig 10C muestra el mutante Ab T366Y, la Y407T; la Fig. 10D muestra el mutante Ab F405A, la T394W; y la Fig. 10E muestra el mutante Ab T366Y: F405A, la T394W: Y407T. Los datos presentados son la media de al menos 2 experimentos independientes. Se averiguó que la respuesta señal densitométrica era lineal (R= 0,9993) a lo largo de la banda experimental utilizada (0,02-10 \mug), tal y como se dedujo a partir del control experimental, utilizando un anticuerpo humanizado estrechamente relacionado, huMAb4D5-8 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 89: 4285 [1992]).

I. Definiciones

En general, las siguientes frases o palabras tienen las definiciones indicadas cunado son utilizadas en la descripción, ejemplos y reivindicaciones.

Un "heteromultímero" o "polipéptido heteromultímero" es una molécula que comprende al menos un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido en al menos un resto aminoácido. Preferiblemente, el heteromultímero tiene especificidad de unión para al menos dos ligandos diferentes o puntos de unión. El heteromultímero puede comprender un "heterodímero", formado por el primer y el segundo polipéptido o puede formar estructuras terciarias de orden superior donde se encuentran presentes polipéptidos, además del primer y segundo polipéptido. Entre las estructuras ejemplarizadas para el heteromultímero se incluyen heterodímeros (por ejemplo, la inmunoadhesina biespecífica descrita por Dietsch et al., supra), heterotrímeros (por ejemplo, la quimera Ab/Ia descrita por Chamow et al., supra), heterotetrámeros (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico) y nuevas estructuras oligómeras.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "polipéptido" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos. Preferiblemente, se utilizan polipéptidos de mamífero (polipéptidos que fueron originalmente obtenidos de un organismo mamífero), más preferiblemente, aquellos que son directamente secretados en el medio. Entre los ejemplos de polipéptidos bacterianos se incluyen, por ejemplo, fosfatasa alcalina y \beta-lactamasa. Entre los ejemplos de polipéptidos de mamífero se incluyen moléculas tales como renina, una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana; hormona de crecimiento bovina; factor de liberación de hormona de crecimiento; hormona paratiroide; hormona estimuladora de la tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena de insulina A; cadena de insulina B; proinsulina; hormona estimuladora del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de coagulación, tales como el factor VIIIC, el factor IX, el factor tisular y el factor von Willebrands, factores anti-coagulación tales como la Proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor decrecimiento hemopoyético; factor alfa y beta de necrosis tumoral; enkefalinasa; RANTES (regulada durante activación normalmente expresada en células T y secretada); proteína inflamatoria de macrófago humana (MIP-1-alfa); una sueroalbúmina, tal como la sueroalbúmina humana; sustancia inhibidora Muellerian; cadena de relaxina A; cadena de relaxina B, prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; proteína microbiana, tal como beta lactamasa; ADNsa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A ó D; factores reumatoides; un factor neurotrópico, tal como factor neurotrópico derivado de hueso (BDBF), neurotrofina-3, -4, -5, -6 (NT-3, NT-4, NT-5 ó NT-6) o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-\beta; factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF); factor de crecimiento de fibroblasto, tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformador (TGF), tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-\beta1, TGF-\beta2, TGF-\beta3, TGF-\beta4 o TGF-\beta5; factor I y II de crecimiento de tipo insulina (IGF-I e IGF-II); des (1-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro); proteínas de unión a factor de crecimiento de tipo insulina; proteínas CD, tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas, proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón alfa, -beta, -gamma; factores estimuladores de colonia (CSFs), por ejemplo M-CSF, GM-CSF y -CSF; antígeno vírico de interleukinas (ILs), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de membrana superficial; factor acelerador del decaimiento; antígeno vírico, tal como, por ejemplo, una parte del sobre AIDS; proteínas de transporte; receptores homing; adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos listados anteriormente.

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El "primer polipéptido" es cualquier polipéptido que tiene que ser asociado con un segundo polipéptido. El primer y el segundo polipéptido se encuentran en una "interfase" (definida más adelante). Además de la interface, el primer polipéptido puede comprender uno o más dominios adicionales, tales como "dominios de unión" (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo, un dominio de unión a receptor, un dominio de unión a ligando o un dominio enzimático) o dominios constantes de anticuerpo (o partes de los mismos), incluyendo dominios C_{H}2, C_{H}1 y C_{L}. Normalmente, el primer polipéptido comprenderá al menos un dominio que procede de un anticuerpo. Este dominio convenientemente es un dominio constante, tal como el dominio C_{H}3 de un anticuerpo y puede formar la interface del primer polipéptido. Entre los primeros polipéptidos ejemplarizados se incluyen polipéptidos de cadena pesada, quimeras que combinan un dominio constante de anticuerpo con un dominio de unión de un polipéptido heterólogo (a saber, una inmunoadhesina, ver definición más adelante), polipéptidos receptores (especialmente aquellos que forman dímeros con otro polipéptido receptor, por ejemplo, el receptor de interleukina-8 [IL-8R] y heterodímeros de integrina [por ejemplo, LFA-1 ó GPIIIb/IIIa]), polipéptidos ligando (por ejemplo, factor de crecimiento nervioso [NGF], neurotrofina-3 [NT-3] y factor neurotrófico derivado del cerebro [BDNF]-ver Arakawa et al., J. Biol. Chem. 269 (45): 27833-27839 [1994] y Radziejewski et al., Biochem 32 (48): 1350 [1993])y polipéptidos de dominio variable de anticuerpo (por ejemplo, diacuerpos). El primer polipéptido preferido es seleccionado de entre un anticuerpo de cadena pesada y una inmunoadhesina.

El "segundo polipéptido" es cualquier polipéptido que tiene que ser asociado con el primer polipéptido a través de una "interfase". Además de la interfase, el segundo polipéptido puede comprender dominios adicionales, tales como un "dominio de unión" (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo, un dominio de unión a receptor, un dominio de unión a ligando o un dominio enzimático) o dominios constantes de anticuerpo (o partes de los mismos), incluyendo dominios C_{H}2, C_{H}1 y C_{L}. Normalmente, el segundo polipéptido comprenderá al menos un dominio que procede de un anticuerpo. Este dominio convenientemente es una región constante, tal como el dominio C_{H}3 de un anticuerpo, y puede formar la interface del segundo polipéptido. Entre los segundos polipéptidos ejemplarizados se incluyen polipéptidos de cadena pesada de anticuerpo, quimeras que combinan un dominio constante de anticuerpo con un dominio de unión de un polipéptido heterólogo (a saber, una inmunoadhesina, ver definición más adelante), polipéptidos receptores (especialmente aquellos que forman dímeros con otro polipéptido receptor, por ejemplo, receptor de interleukina-8 [IL-8] y heterodímeros de integrina [por ejemplo, LFA-1 o GPIIIb/IIIa]), polipéptidos ligando (por ejemplo, factor de crecimiento nervioso [NGF], neurotrofina-3 [NT-3] y factor neurotrófico derivado del cerebro [BDNF]-ver Arakawa et al., J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 [1994] y Radziejewski et al., Biochem 32(48): 1350 [1993] y polipéptidos de dominio variable de anticuerpo por ejemplo, diacuerpos). El segundo polipéptido preferido es seleccionado a partir de una cadena pesada de anticuerpo y de una inmunoadhesina.

Un "dominio de unión" comprende cualquier región de un polipéptido que sea responsable de la unión selectiva a una molécula de interés (por ejemplo, a un antígeno, a un ligando, a un receptor, a un sustrato o a un inhibidor). Entre los dominios de unión ejemplarizados se incluyen un dominio variable de anticuerpo, un dominio de unión a receptor, un dominio de unión a ligando, y un dominio enzimático.

El término "anticuerpo" significará un polipéptido que contiene uno o más dominios capaces de unirse a un epítope o a un antígeno de interés, en el que el(los) citados dominio(s) procede(n) de o son homólogos a la región variable de un anticuerpo. Entre los ejemplos de anticuerpos se incluyen anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo, moléculas de cadena sencilla, moléculas biespecíficas o bifuncionales, diacuerpos y anticuerpos quiméricos (por ejemplo, humanizados y anticuerpos Primatized^{TM}). Entre los "fragmentos de anticuerpo" se incluyen fragmentos Fv, Fv', Fab y F(ab')_{2}.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo roedores o primates) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas que contienen la secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En la mayoría de los casos, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor), en las cuales restos procedentes de una región determinante complementaria (CDR) del receptor son sustituidos por restos procedentes de un CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate, que tienen la deseada especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, restos de la región marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana son sustituidos por los correspondientes restos no humanos. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender restos que no son encontrados ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias marco. Estas modificaciones se llevan a cabo con vistas a refinar y optimizar adicionalmente el comportamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los cuales la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones CDR corresponden a las de la inmonuglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las regiones FR corresponden a las de la secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente comprenderá también al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la correspondiente a una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo Primatized^{TM}, en el que la región de unión a antígeno procede de un anticuerpo producido mediante la inmunización de monos macacos con el antígeno de interés.

Una "molécula multiespecífica" es una molécula que tiene especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. Si bien las citadas moléculas se unirán normalmente a dos antígenos (a saber, anticuerpos biespecíficos, BsAbs), anticuerpos con especificidades tales como anticuerpos triespecíficos quedan englobados por esta expresión cuando se utiliza en el presente documento. Entre los ejemplos de BaAbs se incluyen aquellos con un brazo dirigido frente a un antígeno de 1célula tumoral y el otro dirigido frente a una molécula desencadenante de la citotoxicidad, tal como anti-Fc\gammaRI/anti-CD15, anti-p185^{HER2}/Fc\gammaRIII (CD16), anti-CD3/anti-célula B maligna (1D10), anti-CD3/anti-p185^{HER2}, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-carcinoma de célula renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti-carcinoma de colon), anti-CD3/anti-análogo de hormona estimuladora de melanocito, anti-receptor EFG/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-molécula de adherencia a célula neural (NCAM)/anti-CD3, anti-proteína de unión a folato (FBP)/anti-CD3, anti-antígeno asociado a carcinoma de pan (AMOC-31)/anti-CD3; BsAbs con un brazo que se une específicamente a un antígeno tumoral y un brazo que se une a una toxina tal como anti-saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-cadena de ricina A, anti-interferón-\alpha(IFN-\alpha)/anti-hibridoma idiotipo, anti-CEA/anti-vinca alcaloide; BsAbs para convertir profármacos activados por enzima, tales como anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina (que cataliza la conversión del profármaco fosfato de mitomicina en mitomicina alcohol); BsAbs que pueden ser utilizados como agentes fibrinolíticos, tales como anti-fibrina/anti-activador plasminógeno tisular (tPA), anti-fibrina/anti-activador plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA); BsAbs para dirigir complejos inmunes hacia receptores de superficie celular, tales como anti-lipoproteina de baja densidad (LDL)/anti-receptor Fc (por ejemplo, Fc\gammaRI, Fc\gammaRII, o Fc\gammaRIII); BsAbs para ser utilizados en terapia de enfermedades infecciosas, tales como anti-CD3/anti herpes virus simplex (HSV), Complejo anti-receptor de células T:complejo CD3/anti-gripe, anti-Fc\gammaR/anti-HIV; BsAbs para detección de tumores in vitro o in vivo, tales como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-p185^{HER2}/anti-hapteno; BsAbs como adyuvantes de vacuna (ver Fanger et al., supra); y BsAbs como herramientas de diagnosis, tales como anti-conejo IgG/anti-ferritina, anti-peroxidasa de rábano (HRP)/anti-hormona, anti-somatostatina/anti-sustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-R-galactosidasa (ver Nolan et al., supra). Entre los ejemplos de anticuerpos triespecíficos se incluyen anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-Cd3/anti-CD8/anti-CD37.

Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa moléculas de tipo anticuerpo que combinan el "dominio de unión" de una proteína heteróloga (una "adhesina", por ejemplo un receptor, ligando o enzima) con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácido de adhesina con la especificidad de unión deseada, la cual es distinta a la de reconocimiento de antígeno y punto de unión (punto de combinación con antígeno) de un anticuerpo (a saber, es "heteróloga") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede ser obtenida a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}; IgA; IgE; IgD o IgM.

El termino "dominio de unión a ligando" tal y como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquier receptor de superficie celular de origen natural o a cualquier región o derivado de los mismos que retiene al menos una capacidad de unión a ligando cualitativa y, preferiblemente, la actividad biológica de un receptor de origen natural correspondiente. En una realización específica, el receptor procede de un polipéptido de superficie celular que tiene un dominio extracelular que es homólogo a un componente de la supergenfamilia de inmunoglobulina. Otros receptores típicos no son componentes de la supergenfamilia de inmunoglobulina pero están, sin embargo, cubiertos por esta definición, son receptores para citoquinas y, en particular, receptores con actividad tirosina-quinasa (receptores tirosina-quinasas), componentes de la hematopoyetina y superfamilias de receptores de factor de crecimiento nervioso y moléculas de adherencia celular, por-ejemplo, selectinas (E, -L y -P).

El término "dominio de unión a receptor" se utiliza para designar cualquier ligando de origen natural para receptor, incluyendo moléculas de adherencia a células, o cualquier región o derivado del citado ligando de origen natural que retenga al menos una capacidad de unión a receptor cualitativa y, preferiblemente, la actividad biológica de un ligando de origen natural correspondiente. Esta definición, entre otras, incluye específicamente las secuencias de unión procedentes de ligandos para los receptores mencionados anteriormente.

Tal y como se utiliza en el presente documento, la frase "inmunoadhesina multiespecífica" designa inmunoadhesinas (tal y como se han definido anteriormente) que tienen al menos dos especificidades de unión (a saber, combinando dos o más dominios de unión a adhesina). Las inmunoadhesinas multiespecíficas pueden ser ensambladas como heterodímeros, heterotrímeros o heterotetrámeros, esencialmente tal como se describe en WO 89/02922 (publicada el 6 de abril de 1989), en EP 314.317 (publicada el 3 de mayo de 1989) y en la patente US 5.116.964, concedida el 2 de mayo de 1992. Las inmunoadhesinas multiespecíficas preferidas son biespecíficas. Entre los ejemplos de inmunoadhesinas multiespecíficas se incluyen CD4-IgG/TNF receptor-IgG y CD4-IgG/selectina L-IgG. La molécula mencionada en último lugar combina la función de unión del nódulo linfático del receptor homing de linfocito (LHR, selectina-L) y la función de unión a HIV de CD4, y encuentra una potencial aplicabilidad en la prevención o tratamiento de la infección por HIV, dolencias relacionadas o como diagnosis.

Una "quimera anticuerpo-inmunoadhesina (quimera Ab/Ia)" comprende una molécula que combina al menos un dominio de unión de un anticuerpo (tal y como se define en el presente documento) con al menos una inmunoadhesina (tal y como se ha definido en esta solicitud). Constituyen ejemplos de quimeras Ab/Ia las quimeras CD4-IgG biespecíficas descritas por parte de Berg et al., supra y Chamow et al., supra.

La "interface" comprende aquellos restos de aminoácido "contacto" (u otros grupos no aminoácido, tales como grupos carbohidrato, NADH, biotina, FAD o grupo haem) en el primer polipéptido que interaccionan con uno o más restos aminoácido "contacto" (u otros grupos no aminoácido) en la interfase del segundo polipéptido. La interfase es un dominio constante de anticuerpo. La interfase preferida comprende el dominio C_{H}3 de una inmunoglobulina que procede, preferiblemente, de un anticuerpo IgGy, muy preferiblemente, de un anticuerpo IgG_{1} humano.

Una "protuberancia" se refiere a al menos una cadena lateral de aminoácido que se proyecta desde la interfase del primer polipéptido y resulta por tanto posicionable en una cavidad compensatoria en la interfase adyacente (a saber, la interfase del segundo polipéptido), con vistas a estabilizar el heteromultímero y favorecer con ello, por ejemplo, la formación de heteromultímero sobre la formación de homomultímero. La protuberancia puede existir en la interfase original o puede ser introducida de forma sintética (por ejemplo, mediante alteración del ácido nucleico que codifica para la interfase). Normalmente, el ácido nucleico que codifica para la interfase del primer polipéptido es alterado para que codifique para la protuberancia. Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica para al menos un resto aminoácido "original" en la interfase del primer polipéptido es sustituido por ácido nucleico que codifica para al menos un resto aminoácido de "importación", el cual tiene un mayor volumen de cadena lateral que el resto aminoácido original. Se apreciará el hecho de que puede existir más de un original y correspondiente resto de importación. El límite superior para el número de restos originales que son sustituidos es el número total de restos en la interfase del primer polipéptido. Los volúmenes de cadena lateral de los diversos restos aminoácido se muestran en la siguiente tabla.

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TABLA 1

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2

Los restos de importación preferidos para la formación de una protuberancia son generalmente restos de aminoácido de origen natural y son preferiblemente seleccionados de entre arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W). Los más preferidos son el triptófano y la tirosina. En la realización preferida, el resto original para la formación de la protuberancia presenta un volumen de cadena lateral pequeño, tal como alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina o valina.

Una "cavidad" hace referencia a al menos una cadena lateral de aminoácido que presenta un hundimiento desde la interfase del segundo polipéptido y, por tanto, acomoda una protuberancia correspondiente sobre la interfase adyacente del primer polipéptido. La cavidad puede existir en la interfase original o puede ser introducida de modo sintético (por ejemplo, alterando el ácido nucleico que codifica para la interfase). Normalmente, el ácido nucleico que codifica para la interfase del segundo polipéptido es alterado para codificar para la cavidad. Para lograr esto, el ácido nucleico que codifica para al menos un resto aminoácido "original" en la interfase del segundo oligopéptido es sustituido por ADN que codifica para al menos un resto aminoácido de "importación", el cual presenta un volumen de cadena lateral más pequeño. que el del resto de aminoácido original. Se apreciará el hecho de que puede existir más de un resto original y correspondiente resto de importación. El límite superior para el número de restos originales que son sustituidos es el número total de restos en la interfase del segundo polipéptido. Los volúmenes de cadena lateral de los diversos restos aminoácido se muestran en la anterior Tabla 1. Los restos de importación preferidos para la formación de una cavidad son habitualmente restos aminoácido de origen natural y son preferiblemente seleccionados de entre alanita (A), serina (S), treonina (T) y valina (V). Los más preferidos son serina, alanina o treonina. En la realización preferida, el resto original para la formación de la protuberancia presenta un gran volumen de cadena lateral, tal como tirosina, arginina, fenilalanina o triptófano.

Un resto aminoácido "original" es uno que es sustituido por un resto de "importación" que puede tener un volumen de cadena lateral más pequeño o más grande que el del resto original. El resto aminoácido de importación puede ser un resto aminoácido de origen natural o de origen no natural, pero preferiblemente es de origen natural. Restos aminoácido de "origen natural" son aquellos restos codificados por el código genético y listados en la Tabla 1 mencionada anteriormente. Por resto aminoácido de "origen no natural" se quiere dar a entender un resto que no es codificado por el código genético, pero que es capaz de unirse de forma covalente a un resto(s) aminoácido(s) adyacente(s) en la cadena de polipéptido. Como ejemplos de restos de aminoácido de origen no natural se pueden mencionar norleucina, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de restos de aminoácido tales como los discutidos, por ejemplo, en Ellman et al., Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991). Para generar los citados restos de aminoácido de origen no natural se pueden utilizar los procedimientos de Noren et al, Science 244: 182 (1989) y Ellman, supra. Brevemente, esto conlleva la activación química de un supresor tRNA con un resto aminoácido de origen no natural, seguida de transcripción y traducción in vitro del RNA. El procedimiento de la presente invención conlleva la sustitución de al menos un resto aminoácido original, pero más de un resto original puede ser sustituido. Normalmente, no más del total de restos en la interfase del primer y segundo polipéptidos comprenderán restos de aminoácido originales que son sustituidos. Los restos originales preferidos para sustitución son "enterrados". Por "enterrados" se quiere dar a entender que el resto resulta esencialmente inaccesible para el disolvente. El resto de importación preferido no es cisterna, para evitar con ello una posible oxidación o enparejamiento incorrecto de los enlaces disulfuro.

La protuberancia es "posicionable" en la cavidad, lo cual significa que la localización espacial de la misma y de la cavidad en la interfase del primer y segundo polipéptido y los tamaños de la protuberancia y de la cavidad son tales que la protuberancia puede estar localizada en la cavidad sin perturbar de forma significativa la asociación normal del primer y segundo polipéptidos en la interfase. Dado que protuberancias tales como Tyr, Phe y Trp no se extienden habitualmente perpendicularmente desde el eje de la interfase y presentan conformaciones preferidas, la alineación de una protuberancia con una cavidad correspondiente se basa en el modelado del par protuberancia/cavidad, basado en una estructura tridimensional tal como la obtenida mediante cristalografía de rayos X o resonancia magnética nuclear (NMR). Esto puede ser logrado utilizando técnicas ampliamente conocidas por los expertos.

Por "ácido nucleico original" se quiere dar a entender el ácido nucleico que codifica para un polipéptido de interés, el cual puede ser "modificado" (a saber, mutado mediante ingeniería genética) para que codifique para una protuberancia o cavidad. El ácido nucleico original o de partida puede ser un ácido nucleico de origen natural o puede comprender un ácido nucleico que ha sido sometido a una modificación anterior (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo humanizado). Por "alterar" el ácido nucleico se quiera dar a entender que el ácido nucleico original es mutado mediante la inserción, supresión o sustitución de al menos un codón que codifica para un resto aminoácido de interés. Normalmente, un codón que codifica para un resto original es sustituido por un codón que codifica para un resto de importación. En Mutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed. (IRL Press, Oxford, UK. (1991) se han revisado las técnicas para modificar genéticamente un ADN de esta forma y en las citadas técnicas se incluyen, por ejemplo, mutagénesis dirigida un punto, mutagénesis en casette y mutagénesis mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR).

La protuberancia o cavidad puede ser "introducida" en la interfase del primer o segundo polipéptido por medios sintéticos, por ejemplo, a través de técnicas recombinantes, síntesis de péptido in vitro, aquellas técnicas que permiten la introducción de restos aminoácido de origen no natural descritas anteriormente, mediante acoplamiento enzimático o químico de péptidos o de alguna combinación de estas técnicas. Por consiguiente, la protuberancia o cavidad que es "introducida" es de "origen no natural" o "no natural", lo que significa que la misma no existe en la naturaleza o en el polipéptido original (a saber, un anticuerpo monoclonal humanizado).

Preferiblemente, el resto aminoácido de importación para la formación de la protuberancia tiene un relativamente pequeño número de "rotámeros", por ejemplo, entre aproximadamente 3 y 6). Un "rotámero" es una conformación energéticamente favorable de una cadena lateral de aminoácido. El número de rotámeros de los diversos restos aminoácido es revisado en Ponders and Richards, J. Mol. Biol. 193: 775-791 (1987).

Un heteromultímero "aislado" significa un heteromultímero que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno de cultivo celular natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con usos en diagnosis o terapéuticos para el heteromultímero y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el heteromultímero será purificado (1) hasta más del 95% en peso de proteína, tal y como se determina por el procedimiento Lowry y, muy preferiblemente, más del 99% en peso (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de secuencia de aminoácidos interna o N-terminal, mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria o (3) hasta homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras, utilizando azul de Comassie o, preferiblemente, teñido con plata.

Los heteromultímeros de la presente invención son generalmente purificados hasta homogeneidad sustancial. Las frases "sustancialmente homogéneo", "forma sustancialmente homogénea" y "homogeneidad sustancial" se utilizan para indicar que el producto está sustancialmente i desprovisto de sub-productos originados a partir de combinaciones de polipéptido no deseadas (por ejemplo, homomultímeros). Expresado en términos de pureza, homogeneidad sustancial significa que la cantidad de sub-productos no excede el 10%, y preferiblemente está por debajo del 5%, más preferiblemente del 1%, muy preferiblemente por debajo del 0,5%, donde los porcentajes son en peso.

La expresión "secuencias control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia se codificación unida operativamente, en un organismo huésped particular. Las secuencias control que resultan adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un favorecedor, opcionalmente una secuencia operadora, un punto de unión a ribosoma y, posiblemente, otras secuencias todavía escasamente entendidas. Las células eucariotas son conocidas por utilizar favorecedores, señales de poliadenilación y reforzadores.

El ácido nucleico está "operativamente unido" cuando está ubicado en una relación funcional con otras secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está unido operativamente a ADN para un polipéptido si el mismo es expresado en forma de pre-proteína que precipita en la secreción del polipéptido; un favorecedor o reforzador está unido operativamente a una secuencia de codificación si el mismo afecta a la traducción de la secuencia; o un punto de unión a ribosoma está operativamente unido a una secuencia de codificación si el mismo está posicionado para facilitar la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. No obstante, los reforzadores no tienen que estar contiguos. La conexión se consigue mediante la unión en adecuados puntos de restricción. Si los citados puntos no existen, los adaptadores oligonucleótidos sintéticos o los elementos de unión se utilizan según la práctica convencional.

II. Preparación del heteromultímero 1. Preparación de los materiales de partida

Como primer paso, se seleccionan el primer y el segundo polipéptidos (y cualquier polipéptido adicional que forme el heteromultímero). Normalmente, el ácido nucleico que codifica para estos polipéptidos tiene que ser aislado, a los efectos de que pueda ser alterado para codificar para la protuberancia o cavidad o para ambas, tal y como se ha definido anteriormente. No obstante, las mutaciones pueden ser introducidas utilizando medios sintéticos, por ejemplo, utilizando un sintetizador péptido. Asimismo, en el caso en el que el resto de importación sea un resto de origen no natural, el procedimiento de Noren et al., supra, resulta disponible para la preparación de polipéptidos que tienen tales sustituciones. Adicionalmente, parte del heteromultímero es adecuadamente convertida recombinantemente, en cultivo celular, y otra(s) parte(s) de la molécula se preparan mediante las técnicas mencionadas anteriormente.

Siguen a continuación unas técnicas para aislar anticuerpos y preparar inmunoadhesinas. No obstante, se apreciará el hecho de que el heteromultímero puede incorporar otros polipéptidos, utilizando técnicas que son conocidas por parte de los expertos en la materia. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica para un poripéptido de interés (por ejemplo, un ligando, receptor o un enzima) puede ser aislado a partir de una librería de cADN preparada a partir de tejido acerca del cual se considera posee el polipéptido mRNA y lo expresa a un nivel detectable. Las librerías son cribadas con sondas (tales como anticuerpos u oligonucleótidos de entre aproximadamente 20-80 bases) diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. El cribado del cADN o de la librería genómica con la sonda seleccionada puede ser llevado a cabo utilizando procedimientos estándares, tales como los descritos en los capítulos 10-12 de Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

(i) Preparación de anticuerpo

Se han descrito diversas técnicas para la producción de anticuerpos, entre las cuales se incluyen el tradicional procedimiento mediante hibridoma para la preparación de anticuerpos monoclonales, técnicas recombinantes para la preparación de anticuerpos (incluyendo anticuerpos quiméricos, por ejemplo, anticuerpos humanizados), producción de anticuerpos en animales transgénicos y la tecnología descrita recientemente de despliegue de fagos, para la preparación de anticuerpos "completamente humanos". Estas técnicas se describirán brevemente más adelante.

Los anticuerpos policlonales para el antígeno de interés pueden ser producidos generalmente en animales, a través de múltiples inyecciones subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del antígeno y del adyuvante. Puede resultar de utilidad la conjugación del antígeno (o de un fragmento que contiene la secuencia de aminoácido diana) con una proteína que sea inmunógena en la especie que tiene que ser inmunizada por ejemplo, hemocianina de lapa, sueroalbúmina, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de haba de soja, utilizando un agente derivatizante o bifuncional, por ejemplo éster maleimidobenzoilo de sulfosuccinimida (conjugación a través de restos lisina), N-hidroxisuccinimida (a través de restos lisina), glutaraldehido, anhídrido succínico, SOCl_{2}, o R^{1}N=C=NR, en la que R y R^{1} son grupos alquilo diferentes. Los animales son inmunizados frente a los conjugados o derivados inmunógenos, mediante la combinación de 1 mg ó 1 \mug de conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freud's e inyectando la solución intradérmicamente en múltiples puntos. Un mes más tarde, los animales son reforzados con entre 1/5 y 1/10 de la cantidad original de colgado en medio adyuvante de Freud's completo, mediante inyección subcutánea en múltiples puntos. Entre 7 y 14 días más tarde, los animales son reforzados con el conjugado del mismo origen pecó conjugado a una proteína distinta y/o a través de distinto reactivo de reticulación. Los conjugados pueden también ser preparados en cultivos celulares recombinantes, como en previas fusiones. Asimismo, para reforzar la respuesta inmune se utilizan agentes agregantes, tales como alum.

Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos utilizando el procedimiento hibridoma descrito primeramente por Kohler & Milstein, Nature 256: 495 (1975) o pueden ser obtenidos mediante procedimientos de ADN recombinante (Cabilly et al., patente US Nº. 4.816.567). En el procedimiento hibridoma, un ratón u otro animal huésped adecuado, tal como un hámster, es inmunizado tal y como se ha descrito anteriormente, para obtener los linfocitos que producen o son capaces de producir, anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Los linfocitos pueden ser fusionados con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp. 59-103 [Academic Press, 1986]). Las células hibridoma preparadas de este modo son sembradas y cultivadas en el medio de cultivo adecuado, el cual contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parental carecen del enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá habitualmente hipoxantina, aminopepterina y timidina (medio HAT), sustancias que evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan de forma eficaz, soportan de forma estable niveles elevados de expresión de anticuerpo por parte de las células productoras de anticuerpo seleccionadas y resultan sensibles a un medio, tal como el medio HAT. Entre las mismas, las líneas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, tales como las que proceden de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11, disponibles a partir del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA y las células SP-2, disponibles en el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Las líneas celulares de mieloma humano y las líneas celulares de heteromieloma ratón-humano se han escrito también para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 [1984]; y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc, New York, 1987). Ver también, Boerner et al., J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991) y WO 91/17769, publicada el 28 de noviembre de 1991, para técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos frente al antígeno de interés. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos mediante células de hibridoma es determinada mediante inmunoprecipitación o a través de ensayo de unión in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorvente unido a enzima (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, ser determinada a través de análisis Scatchard de Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107-220 (1980). Una vez se han identificado las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseadas, los clones pueden ser subclonados mediante procedimientos de dilución limitativos y cultivados mediante procedimientos estándar. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-104 (Academis Press, 1986). Entre los medios de cultivo adecuados para este propósito se incluyen, por ejemplo, el medio Eagle modificado por Dulbecco o el medio RPMI-1640. Además, las células hibridoma pueden ser cultivadas in vivo en forma de tumores ascitos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones resultan adecuadamente separados del medio de cultivo, fluido ascito o suero, mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía por afinidad.

Alternativamente, resulta ahora posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones), que son capaces, después de inmunización, de producir un amplio repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigota del gen (J_{H}) de la región de unión de cadena pesada de anticuerpo en ratones mutantes de línea germinal y quiméricos, da lugar a la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia de la matriz genética de inmunoglobulina de línea germinal humana en los citados ratones mutantes en línea germinal da lugar a la producción de anticuerpos humanos tras desafío con antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 2551-255 (1993) y Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993).

En una nueva realización, pueden aislarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpo a partir de librerías de fago generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990), utilizando el antígeno de interés para seleccionar un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo adecuado. Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991) y Marks et al, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando librerías de fagos. Las subsiguientes purificaciones describen la producción de anticuerpos humanos de elevada afinidad (rango nM) mediante arrastre en cadena (Mark et al., Bio/Technol. 10: 779-783 [1992], al igual que infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para la construcción de librerías de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21: 2265-2266 [1993]). Así pues, estas técnicas constituyen alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal tradicionales, para el aislamiento de anticuerpos "monoclonales" (especialmente anticuerpos humanos), las cuales están englobadas por la presente invención.

El ADN que codifica para los anticuerpos de la invención es rápidamente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos murinos). Las células hibridoma de la invención sirven como fuente preferida para el citado ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, los cuales son después transfectados en células huésped, tales como las células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), o células de mieloma que no producen, por otra parte, proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN puede ser también modificado, por ejemplo, mediante sustitución de la secuencia de codificación de los dominios constantes de cadena ligera y pesada humanos en lugar de las secuencias murinas homólogas, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851 (1984). De este modo, se preparan anticuerpos "quiméricos" que presentan la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-antígeno en los mismos.

En el estado de la técnica se tiene conocimiento de la existencia de procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos aminoácido introducidos en el mismo a partir de una fuente que es no humana. Estos restos de aminoácido no humanos se identifican a menudo como restos de "importación", los cuales proceden habitualmente de un dominio variable de "importación". La humanización puede ser esencialmente llevada a cabo siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Dones et al., Nature 321: 522-525 [1986]; Riechmann et al., Nature 332: 323-327 [1988]; Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 [1986]), mediante la sustitución de las secuencias de anticuerpo humano por secuencias CDR o CDRs de roedor. Por consiguiente, los citados anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Cabilly, supra), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la correspondiente secuencia procedente de especies no humanas. En la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente anticuerpos humanos en los cuales algunos restos CDR, y posiblemente algunos restos FR, so sustituidos por restos procedentes de anticuerpos de roedor procedentes de puntos análogos. Es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de elevada afinidad para el antígeno y de otras propiedades biológicas favorables. Para alcanzar este objetivo, según un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan a través de un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales, utilizando modelos tridimensionales de las secuencias humanizadas y parentales. A los expertos en la materia les resultarán familiares modelos tridimensionales de inmunoglobulina. Se dispone de programas de ordenador que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de las secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas exposiciones permite analizar el probable rol de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, a saber, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidato para unirse a su antígeno. De este modo, pueden seleccionarse restos FR y combinados a partir del consenso y secuencias de importación, a los efectos de alcanzar las características deseadas del anticuerpo, tales como una afinidad incrementada para el(los) antígeno(s) diana. Para detalles adicionales ver el documento WO 92/22653, publicado el 23 de diciembre
de 1992.

(ii) Preparación de inmunoadhesina

Las inmunoglobulinas (Ig) y determinadas variantes de las mismas son conocidas y muchas han sido preparadas en cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, ver la patente US nº. 4.745.055; EP 256.654; Faulkner et al., Nature 298: 286 (1982); EP 120.694; EP 125.023; Morrison, J. Immun. 123: 793 (1979); Köeler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41: 2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 239 (1984); Morrison, Science 229: 1202 (1985); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851 (1984); EP 255.694; EP 266.663; y WO 88/03559. Se conocen también cadenas de inmunoglobulina resurtidas. Ver por ejemplo, los documentos patente US Nº. 4.444.878; WO 88/03565 y EP 68.763 y referencias a las mismas citadas en el presente documento.

Las quimeras construidas a partir de una secuencia de dominio de unión a adhesina, unida a una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina adecuada (inmunoadhesinas) son conocidas en el estado de la técnica. Entre las inmuniadhesinas reportadas en la literatura se incluyen fusiones del receptor de células T Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2936-2940 [1987]); CD4 (Capon et al., Nature 337: 525-531 [1989]; Traunecker et al., Nature 339: 68-70 [1989]; Zettmeissi et al., ADN Cell Biol. USA 9: 347-353 [1990]; y Byrn et al., Nature 344: 667-670 [1990]); L-selectina (receptor homing) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110: 2221-2229 [1990]; y Watson et al., Nature 349: 164-167 [1991]); CD4 (Aruffo et al., Cell 61: 1303-1313 [1990]); CD28 y B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173: 721-730 [1991]); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med 174: 561-569 [1991]); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144[1991]; receptor TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539 [1991]; Lesslauer et al., Eur. J. Immnunol. 27: 2883-2886 [1991] y Peppel et al., J. Exp. Med. 174: 1483-1489 [1991]); y receptor \alpha de IgE (Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. Vol 115, Abstact M1. 1448 [1991]).

El diseño de inmunoadhesina más simple y más directo combina el(los) dominio(s) de unión de la adhesina (por ejemplo, el dominio extracelular [ECD] de un receptor) con las regiones bisagra y Fc de la cadena pesada de inmunoglobulina (ver la Fig. 3). Ordinariamente, cuando se preparan las inmunoadhesinas de la presente invención, el ácido nucleico que codifica para el dominio de unión de la adhesina estará fusionado en C-terminal con el ácido nucleico que codifica para el N-terminal de una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina, no obstante las fusiones N-terminales resultan también posibles.

Habitualmente, en las citadas fusiones, el polipéptido quimérico codificado retendrá al menos la bisagra funcionalmente activa, los dominios C_{H}2 y C_{H}3 de la región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Se efectúan también fusiones con el C Terminal de la porción Fc de un dominio constante o inmediatamente N-terminal al C_{H}1 de la cadena pesada o de la correspondiente región de la cadena ligera. El punto preciso en el cual se lleva a cabo la fusión no resulta crítico; los puntos particulares son bien conocidos y pueden ser seleccionados con vistas a optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de unión de la Ia.

En una realización preferida, la secuencia de adhesina es fusionada con en N Terminal del dominio Fc de inmunoglobulina G_{1} (IgG_{1}). Resulta posible fusionar la región constante de cadena pesada completa con la secuencia de adhesina. No obstante, más preferiblemente, una secuencia que empieza en la región bisagra, justo aguas arriba del punto de rotura con papaína que define químicamente IgG Fc (a saber, el resto 216, considerando que el primer resto de región constante de cadena pesada es 114) o puntos análogos de otras inmunoglobulinas, son utilizados en la fusión. En una realización particularmente preferida, la secuencia de aminoácido de adhesina es fusionada con (a) la región bisagra y C_{H}2 y C_{H}3 o (b) los dominios C_{H}1, bisagra, C_{H}2 y C_{H}3 de una cadena pesada de IgG_{1}, IgG_{2} o IgG_{3}. El punto preciso en el cual se lleva a cabo la fusión no resulta crítico, y el punto experimental puede ser determinado mediante rutina experimental.

Para inmunoadhesinas biespecíficas, las inmunoadhesinas son ensambladas como multímeros y, particularmente, como heterodímeros o heterotetrámeros. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas tendrán estructuras unitarias conocidas. Una unidad estructural de cuatro cadenas básica es la forma en la que existen IgG, IgD y IgE. Una unidad de cuatro cadenas se repite en las inmunoglobulinas de peso molecular más elevado; la IgM existe generalmente como pentámero de cuatro unidades básicas, conjuntamente con enlaces disulfuro. La globulina IgA y, ocasionalmente, la globulina IgG pueden también existir en forma multímera en suero. En el caso de multímero, cada una de las cuatro unidades puede ser igual o distinta.

Diversos ejemplos de inmunoadhesinas ensambladas dentro del campo de cobertura del presente documento son mostradas esquemáticamente en forma de diagrama seguidamente:

(a)

AC_{L}-AC_{L};

(b)

AC_{H}-[AC_{H}, AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H} o V_{L}C_{L}-AC_{H}];

(c)

AC_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, V_{L}C_{L}-AC_{H} o V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}];

(d)

AC_{L}-V_{H}C_{H}-[AC_{H}, o AC_{L}-V_{H}C_{H} o V_{L}C_{L}-AC_{H}];

(e)

V_{L}C_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-V_{H}C_{H} o V_{L}C_{L}-AC_{H}]; y

(f)

[A-Y]_{n}-[V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}]_{2}.

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En donde cada A representa secuencias de aminoácido de adhesina idénticas o diferentes;

V_{L} es un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina;

V_{H} es un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina;

C_{L} es un dominio constante de cadena ligera de inmunoglobulina;

C_{H} es un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina;

n es un número entero superior a 1;

Y designa el resto de un agente reticulante covalente.

En interés de la brevedad, las estructuras precedentes tan solo muestran características clave; las mismas no indican unión (J) u otros dominios de las inmunoglobulinas, ni se muestran los enlaces disulfuro. No obstante, cuando los citados dominios resultan necesarios para la actividad de unión, los mismos serán construidos para estar presentes en las localizaciones ordinarias que ocupan en las moléculas de inmunoglobulina.

Alternativamente, las secuencias de adhesina pueden ser insertadas entre secuencias de cadena ligera y de cadena pesada de inmunoglobulina, de forma que se obtenga una inmunoglobulina que comprenda una cadena pesada quimérica. En esta realización, las secuencias de adhesina se fusionan con el extremo 3' de una cadena pesada de inmunoglobulina, en cada uno de los brazos de una inmunoglobulina, ya sea entre la bisagra y el dominio C_{H}2 o entre los dominios C_{H}2 y C_{H}3. Se ha informado acerca de construcciones similares por parte de Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28: 1027-1037 (1991).

Si bien la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina no resulta necesaria en las inmunoadhesinas de la presente invención, una cadena ligera de inmunoglobulina puede estar presente, ya sea asociada covalentemente a un polipéptido de fusión de cadena pesada adhesina-inmunoglobulina, o directamente fusionado con la adhesina. En el primer caso, el ADN. que codifica para una cadena ligera de inmunoglobulina es habitualmente co-expresado con el ADN que codifica para la proteína de fusión de cadena pesada adhesina-inmunoglobulina. Tras la secreción, la cadena pesada híbrida y la cadena ligera se asociarán covalentemente para proporcionar una estructura de tipo inmunoglobulina que comprende dos pares de cadenas ligera-cadena pesada de inmonuglobulina, unidas por disulfuro. Procedimientos adecuados para la preparación de tales estructuras se describen, por ejemplo, en las patente US Nº. 4.816.567, concedida el 28 de marzo de 1989.

En una realización preferida, las secuencias de inmunoglobulina utilizadas en la construcción de las inmunoadhesinas de la presente invención proceden de dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina IgG. Para inmunoadhesinas humanas, resulta preferida la utilización de secuencias de inmunoglobulina IgG_{1} e IgG_{3} humana. Una importante ventaja derivada de la utilización de IgG_{1} reside en el hecho de que las inmunoadhesinas IgG_{1} pueden ser purificadas eficazmente sobre proteína inmovilizada. Por el contrario, la purificación de IgG_{3} requiere proteína G, un medio significativamente menos versátil. No obstante, otras propiedades estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas deberías ser consideradas cundo se elige el partner de fusión Ig para una particular construcción de inmunoadhesina. Por ejemplo, la bisagra IgG_{3} es más larga y más flexible, por lo que la misma puede ubicar dominios de "adhesina" más grandes que no pueden doblarse o funcionar adecuadamente cuando se fusionan con IgG_{1}. Otra consideración puede ser la valencia, las inmunoadhesinas IgG son homodímeros bivalentes, mientras que los subtipos fg, como IgA e IgM pueden dar lugar a estructuras dímeras o pentámeras, respectivamente, o la unidad homodímera Ig básica. Para inmunoadhesinas diseñadas para aplicación in vivo, las propiedades farmacocinéticas y las funciones efectoras especificadas por la región Fc son importantes también. A pesar de que la IgG_{1}, IgG_{2} y la IgG tienen semividas in vivo de 21 días, sus potencias relativas a la hora de activar el sistema complementario son diferentes. La IgG_{4} no activa el complemento, y la IgG_{2} es significativamente más débil en la activación complementaria que la IgG_{1}. Además, a diferencia de la IgG_{1}, la IgG_{2} no se une a los receptores Fc sobre células mononucleares o neutrófilos. Si bien la IgG_{3} resulta óptima para activación complementaria, su semivida in vivo es aproximadamente una tercera parte de la de otros isotipos IgG. Otra importante consideración para las inmunoadhesinas diseñadas para ser utilizadas en terapéutica humana es el número de variantes alotípicas del isótopo particular. En general, resultan preferidos los isotipos IgG con menos alotipos definidos serológicamente resultan preferidos. Por ejemplo, la IgG_{1} presenta tan solo cuatro puntos alotípicos serológicamente definidos, dos de los cuales (Glm y 2) están localizados en la región Fc; y uno de estos puntos, G1m1 es no inmunógeno. Por el contrario, hay 12 alotipos serológicamente definidos en IgG_{3}, la totalidad de los cuales se encuentra en la región Fc, tan solo tres de estos puntos (G3m5, 11 y 21) presenta un alotipo que es no inmunógeno. Así pues, la potencial inmunogenecidad de una inmunoadhesina \gamma3 es superior a la de una inmunoadhesina \gamma1.

Las inmunoadhesinas son muy convenientemente construidas fusionando la secuencia de cADN que codifica para la parte de adhesina en marco, con una secuencia de Ig cADN. No obstante, puede también utilizarse la fusión con fragmentos de Ig gnómica (ver, por ejemplo, Gascoine et al., supra; Aruffo et al., Cell 61: 1303-1313 [1990]; y Stamenkovic et al., Cell 66: 1133-1144 [1991]). El último tipo de fusión requiere la presencia de secuencias reguladoras de Ig para expresión. Los cADNs que codifican para regiones constantes de cadena pesada de IgG pueden ser aislados en base a secuencias publicadas a partir de librerías de cADN derivadas de linfocitos de bazo o de sangre periférica, mediante técnicas de hibridación o de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los cADNs que codifican para la
"adhesina" y las partes Ig de la inmunoadhesina son insertados en tandem en un vector plásmido que dirige la expresión eficaz en las células huésped elegidas.

2. Generando una protuberancia y/o una cavidad

Como primer paso para seleccionar restos originales para la formación de la protuberancia y/o la cavidad, se obtiene la estructura tridimensional del heteromultímero, utilizando técnicas que resultan bien conocidas por parte de los expertos en la materia, tales como la cristalografía por rayos X o la NMR. En base a la estructura tridimensional, los expertos en la materia serán capaces de identificar los restos en la interfase.

La interfase preferida es el dominio C_{H}3 de un dominio constante de inmunoglobulina. Los restos interfase de los dominios C_{H}3 de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM son identificados en la Fig. 5, incluyendo aquellos que resultan óptimos para ser sustituidos por restos de importación. Los retos de la interfase de diversos subtipos de IgG son ilustrados en la Fig. 6. Se identifican también restos "enterrados". La base para la ingeniería de la interfase C_{H}3 es que la cristalografía por rayos X ha demostrado que la asociación intermolecular entre cadenas pesadas de IgG_{1} humana en la región Fc incluye una extensiva interacción proteína/proteína entre los dominios C_{H}3, mientras que los dominios C_{H}2 glicosilados interaccionan a través de sus carbohidratos (Deisehhofer, Biochem. 20: 2361 [1981]). Además, existen dos enlaces disulfuro inter-cadena pesada, los cuales son eficazmente formados durante la expresión de anticuerpo en células de mamífero, salvo que la cadena pesada resulte truncada para eliminar dominios C_{H}2 y C_{H}3 (King et al., Biochem. J. 281: 317 [1992]). Así pues, el ensamblaje de cadena pesada parece favorecer la hipótesis de que la asociación de cadena pesada de anticuerpo es dirigida por los dominios C_{H}3. Se especuló adicionalmente con que la interfase entre dominios C_{H}3 podría ser adaptada por ingeniería para favorecer la formación de heteromultímeros de diferentes cadenas pesadas y dificultar el ensamblado de los correspondientes monomultímeros. Los experimentos descritos en el presente documento demostraron que resultaba posible favorecer la formación de heteromultímeros sobre homomultímeros, utilizando este planteamiento. Por lo tanto, resulta posible generar una fusión de polipéptido que comprende un polipéptido de interés y el dominio C_{H}3 de un anticuerpo para formar un primer o segundo anticuerpo. El dominio C_{H}3 preferido deriva de un anticuerpo IgG, tal como IgG, humana. Los restos interfase de IgG, humanos se muestran en la Fig. 7.

Los restos de interfase que pueden constituir potencialmente candidatos para la formación de protuberancias o cavidades son identificados. Resulta preferible seleccionar restos "enterrados" para que sean sustituidos. Para determinar si un resto es enterrado, el programa de accesibilidad en superficie de Lee et al., J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971) puede ser utilizado para calcular la accesibilidad de disolvente (SA) de los restos en la interfase. Seguidamente, la SA para los restos de cada uno de los primeros y segundos polipéptidos puede ser calculada de forma separada después de la eliminación de otro polipéptido. La diferencia en SA de cada uno de. los restos entre las formas monómeras y dímeras de la interfase puede ser entonces calculada mediante: SA (dímero)-SA (monómero). Esto proporciona una lista de restos que pierden SA durante la formación del dímero. La SA de cada uno de los restos en el dímero es comparada con la SA teórica del mismo aminoácido en el tripéptido Gly-X-Gly, en donde X= el aminoácido de interés (Rose et al, Science 229: 834-838 [1985]). Los restos que (a) pierden SA en el dímero en comparación con el monómero y (b) 5 tenían una SA inferior al 26% de la de su correspondiente tripéptido son considerados como restos interfase. Dos categorías pueden ser delimitadas: aquellas que tienen una SA < 10% comparadas con su correspondiente tripéptido (a saber, "enterrado") y las que tienen 25% > SA> 10%, en comparación con su correspondiente tripéptido (a saber, "parcialmente enterrado").

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TABLA 2

3

El efecto de sustituir restos sobre la estructura de cadena de polipéptido puede ser estudiado utilizando un programa de modelado de gráficos moleculares, tal como el programa Insight^{TM} (Biosym Technologies). Utilizando el programa, los restos enterrados en la interfase del primer polipéptido que tiene un volumen de cadena lateral pequeño pueden ser cambiados por restos que tienen un volumen de cadena lateral más grande (a saber, una protuberancia), por ejemplo. Seguidamente, los restos en la interfase del segundo polipéptido que se encuentran en las proximidades de la protuberancia son examinados para localizar un resto adecuado para la formación de la cavidad. Normalmente, este resto tendrá un gran volumen de cadena lateral y es sustituido por un resto que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño. En determinadas realizaciones, el examen de la estructura tridimensional de la interfase revelará una protuberancia dimensionada y adecuadamente posicionada sobre la interfase del primer polipéptido o una cavidad sobre la interfase del segundo polipéptido. En estos casos, tan solo resulta necesario modelar un mutante sencillo, a saber, con una protuberancia o cavidad introducida sintéticamente.

En lo que hace referencia a la selección de restos originales potenciales para sustitución, cuando el primer y segundo polipéptidos comprenden cada uno de ellos un dominio C_{H}3, la interfase C_{H}3/C_{H}3 de la IgG_{1} humana conlleva dieciséis restos sobre cada uno de los dominios localizados sobre cuatro hebras anti-paralelas p, las cuales entierran 1090 \ring{A} a partir de cada una de las superficies (Deisenhofer, supra) y Millar, J. Mol. Biol. 216: 965 [1990]). Ver la Fig. 7 en el presente documento. Las mutaciones son preferiblemente dirigidas hacia restos localizados sobre las dos hebras anti-paralelas R centrales. La intención es la de minimizar el riesgo de que las protuberancias que se crean puedan ser acomodadas mediante salientes rodeados de disolvente, más que a través de cavidades compensadoras en el dominio C_{H}3 asociado.

Una vez identificados los restos originales/importación preferidos por medio de modelado molecular, las sustituciones aminoácido son introducidas en el polipéptido utilizando técnicas que son bien conocidas por los expertos en la materia. Normalmente, el ADN que codifica para el polipéptido es sometido a ingeniería genética utilizando las técnicas descritas en Mutagenesis: a Practical Approach, supra.

La mutagénesis mediada por oligonucleótido constituye un procedimiento preferido para la preparación de variantes de sustitución del ADN que codifica para el primer y el segundo polipéptido. Esta técnica es bien conocida por parte de los expertos en la materia, tal y como se describe en Adelman et al., ADN 2: 183 (1983). Brevemente, el primer o el segundo ADN polipéptido son alterados mediante la hibridación de un oligonucleótido que codifica para la mutación deseada con una plantilla de ADN, en donde la plantilla es la hebra sencilla formada por un plásmido o bacteriófago que contiene la secuencia de ADN de origen natural o no modificada del heteromultímero. Después de la hibridación, se utiliza, una ADN polimerasa para sintetizar una segunda hebra complementaría completa, la cual incorporará el cebador oligonucleótido y codificará para la modificación seleccionada en el ADN hetero-
multímero.

La mutagénesis en casette puede ser llevada a cabo tal y como se describe por Wells et al., Gene 34: 315 (1985), mediante la sustitución de una región del ADN de interés por un fragmento mutante sintético generado mediante anillamiento de oligonucleótidos complementarios. La mutagénesis PCR resulta también adecuada para la preparación de variantes del primer y segundo ADN polipéptido. Si bien la siguiente discusión hace referencia a ADN, se da por entendido que la técnica encuentra también aplicación con RNA. La técnica PCR hace referencia generalmente al siguiente procedimiento (ver Erlich, Science 252: 1643-1650 [1991], el capítulo correspondiente a R. Higuchi,
p 61-70).

Esta invención abarca también, además de las mutaciones de protuberancia o cavidad, variantes de secuencia de aminoácido del heteromultímero, las cuales pueden ser preparadas mediante la introducción de cambios de nucleótido adecuados en el ADN heteromultímero o mediante síntesis del polipéptido heteromultímero deseado. Entre las citadas variantes se incluyen, por ejemplo, supresiones de, o inserciones o sustituciones de, restos dentro de las secuencias de aminoácidos de los primeros y segundos polipéptidos que forman el heteromultímero. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se efectúa para llegar a la construcción final, siempre y cuando la construcción final posea las características de unión a antígeno deseadas. Los cambios de aminoácidos pueden también modificar los procedimientos post-traduccionales del heteromultímero, tales como cambios en el número o en la posición de puntos de glicosilación.

Un procedimiento útil para la identificación de determinados restos o regiones de polipéptidos heteromultímeros que constituyen localizaciones preferidas para mutagénesis es el denominado "mutagénesis mediante escaneado con alanina", tal y como se describe por parte de Cunningham y Wells, Science 244: 1081-1085 (1989). Aquí, un resto o grupo de restos diana son identificados (por ejemplo, restos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y sustituidos por un aminoácido neutro o cargado negativamente (muy preferiblemente alanina o polialanina), para afectar la interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso envolvente, en el interior o exterior de la célula. Aquellos dominios que demuestran sensibilidad funcional para las sustituciones son después refinados mediante la introducción de nuevas u otras variantes en o para los puntos de sustitución. Así pues, si bien el punto para la introducción de una variación de secuencia de aminoácido está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no precisa ser
determinada.

Normalmente, las mutaciones conllevarán sustituciones de aminoácido conservadoras en regiones no funcionales del heteromultímero. En la siguiente tabla se muestran ejemplos de sustituciones.

TABLA 3

4

Modificaciones covalentes del heteromultímero pueden ser introducidas en la molécula haciendo reaccionar restos de aminoácido dirigidos del heteromultímero o fragmentos de los mismos con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas de los restos N- ó C- terminales. Otro tipo de modificación covalente del polipéptido heteromultímero comprende la alteración del patrón de glicosilación de origen natural del polipéptido. Por alqueración se quiere dar a entender uno o más restos carbohidrato encontrados en el heteromultímero original, y/o la adición de uno o más puntos de glicosilación que no se encuentran presentes en el heteromultímero original. La adición de puntos de glicosilación al polipéptido hetermultímero es lograda, de forma adecuada, mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos, de tal manera que la misma contenga uno o más puntos de glicosilación unidos a N. La alteración puede también ser efectuada mediante la adición de o la sustitución por, uno o más restos serina o treonina en la secuencia de heteromultímero original (para puntos de glicosilación unidos a O). Para facilidad, la secuencia de aminoácido de heteromultímero es preferiblemente alterada a través de cambios a nivel de ADN, particularmente mediante la mutación del ADN que codifica para el polipéptido heteromultímero en bases preseleccionadas, de tal forma que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados. Otro medio para incrementar el número de restos carbohidrato sobre el polipéptido heteromultímero es a través de acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Estos procedimientos se describen en WO 87/05330, publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem, pp. 259-306 (1981). La eliminación de los restos carbohidrato presentes en el heteromultímero puede ser lograda química o enzimáticamente.

Otro tipo de modificación covalente de heteromultímero comprende la unión del polipéptido heteromultímero a uno de entre una diversidad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la forma expuesta en las patentes US Nºs. 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ó 4.179.337.

Dado que resulta a menudo difícil predecir con anticipación las características de un heteromultímero variante, se valorará el hecho de que algún cribado de la variante recuperada resultará necesario para seleccionar la variante óptima.

3. Expresión del heteromultímero

Después de la mutación del ADN, tal y como se ha discutido en la sección precedente, el ADN que codifica para la molécula es expresado utilizando técnicas recombinantes, las cuales están ampliamente disponibles en el estado de la técnica. A menudo, el sistema de expresión de elección conllevará un vector de expresión en célula de mamífero y un huésped, a los efectos de que el heteromultímero resulte apropiadamente glicosilado (por ejemplo, en el caso de heteromultímeros que comprenden dominios de anticuerpo que son glicosilados). No obstante, las moléculas pueden ser también producidas en los sistemas de expresión procariotas mencionados más adelante. Normalmente, la célula huésped será transformada con ADN que codifica tanto para el primer polipéptido como para el segundo polipéptido y otro(s) polipéptido(s), requeridos para formar el heteromultímero, sobre un vector sencillo o vectores independientes. No obstante, resulta posible expresar el primer polipéptido y el segundo polipéptido en sistemas de expresión independientes y acoplar los polipéptidos expresados in vitro.

El ácido nucleico (por ejemplo, cADN o ADN genómico) que codifica para el heteromultímero es insertado en un vector replicable, para proceder a un nuevo clonado (amplificación del ADN) o para expresión. Muchos vectores se encuentran disponibles. Los componentes del vector incluyen generalmente, sin que ello represente ninguna limitación, una o más de lo siguiente: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento reforzador, un favorecedor y una secuencia de terminación de transcripción.

Los polipéptidos del heteromultímero pueden ser producidos como polipéptidos de fusión con una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un punto de rotura específico en el N-terminal de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia señal pude ser un componente del vector o puede ser una parte del ADN que es insertada en el vector. La secuencia de señal heteróloga seleccionada es preferiblemente una que es reconocida y procesada (a saber, rota por una señal peptidasa) por parte de la célula huésped. Para células huésped procariotas, la secuencia señal puede ser sustituida por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o líderes enterotoxina II estable al calor. Para la secreción de levadura, la secuencia señal de origen natural pude ser sustituida por, por ejemplo, el líder levadura invertasa, el líder factor alfa (incluyendo líderes Saccharomyces y Kluyveromycs factor \alpha, éste último descrito en la patente US Nº. 5.010.182, concedida el 23 de abril de 1991), o el líder fosfatasa ácida, el líder C. albicans glucomylasa (EOP 362.179, publicada el 4 de abril de 1990) o la señal descrita en WO 90/13646, publicada el 15 de noviembre de 1990. En expresión en célula de mamífero, las secuencia señal de origen natural (por ejemplo, el anticuerpo o la presecuencia de adhesina que normalmente dirige la secreción de estas moléculas desde las células humanas, in vivo) es satisfactoria, si bien otras secuencias señal de mamífero pueden resultar adecuadas, al igual que líderes secretores víricos, por ejemplo, la señal gD de herpes simplex. El ADN para la citada región precursora está ligado en marco de lectura al ADN que codifica para los polipéptidos que forman el heteromultímero.

Tanto los vectores de expresión como los vectores de clonado contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en vectores de clonado esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Las citadas secuencias son bien conocidas para una diversidad de bacterias, levaduras o virus. El origen de replicación a partir del plásmido pBR322 resulta adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido de 2 \mu resulta adecuado para levadura y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) resultan de utilidad para vectores de clonado en células de mamífero. Generalmente, el origen de componente de replicación no resulta necesario para vectores de expresión en mamíferos (el origen SV40 puede ser habitualmente utilizado, tan solo debido a que el mismo contiene el favorecedor temprano).

Los vectores de expresión y de clonado deben contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica para D-alanina racemasa para Bacilli. Un ejemplo de esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son transformadas con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármaco y sobrevive por tanto al régimen de selección. Los ejemplos de la citada selección dominante utilizan los fármacos neomicina (Southern et al., J. Molc. Appl. Gent. 1: 327 [1982]), ácido micofenólico (Mulligan et al., Science 209: 1422 [1980]) o higromicina (Sugden et al., Mol. Cell Biol. 5 410-413 [1985]). Los tres ejemplos proporcionados anteriormente utilizan genes bacterianos bajo control eucariota para transmitir la resistencia hacia el fármaco adecuado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) o higromicina, respectivamente.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero, son aquellos que permiten la identificación de células competentes para recoger al ácido nucleico heteromultímero, tales como DHFR o timidina quinasa. Los transformadores de células de mamífero son ubicados bajo presión de selección de tal forma que tan solo los transformadores están adaptados para sobrevivir, en virtud de haber recogido el marcador. La presión de selección es impuesta mediante el cultivo de los transformadores en condiciones en las cuales la concentración del agente de selección en el medio es modificada sucesivamente, conduciendo con ello a la amplificación de tanto el gen de selección como del ADN que codifica para el heteromultímero. Cantidades crecientes de heteromultímero son sintetizadas a partir del ADN amplificado. Entre otros ejemplos de genes amplificables se incluyen metalotioneina-I y II, preferiblemente genes de metalotioneina de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, células transformadas con el gen de selección DHFR son primeramente identificadas mediante cultivo de todos los transformadores en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped adecuada, cuando se utiliza DHFR de tipo natural, es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal y como se describe en Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980). Las células transformadas son después expuestas a niveles crecientes de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de copias múltiples del gen DHFR y, de manera concomitante, a copias múltiples de otro ADN que comprende los vectores de expresión, tales como el ADN que codifica para los componentes del heteromultímero. Esta técnica de amplificación puede ser utilizada con cualquier huésped que resulte adecuado, por ejemplo, ATCC Nº. CCL61 CHO-K1, a pesar de la presencia de DHFR endógeno si, por ejemplo, se utiliza un gen DHFR mutante que es altamente resistente a Mtx (EP 117.060).

Alternativamente, células huésped (particularmente huéspedes de tipo natural que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican para el heteromultímero, proteína DHFR de origen natural, y otros marcadores seleccionables, tales como aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH) pueden ser seleccionados mediante crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo kanamicina, neomicina, o G418. Ver la patente US Nº. 4.965.199.

Un agente de selección adecuado para su utilización en levaduras es el gen trpl, presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282: 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7: 141 [1979]; o Tschemper et al., Gene 10: 157 [1980]). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC Nº. 44076 p PEP4-2 (Jones, Genetics 85: 12 [1977]). La presencia de la lesión trpl en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. Similarmente, las cepas de levadura deficitarias en Leu2 (ATCC 20.622 ó 38.626) son complementadas mediante plásmidos conocidos que soportan el gen Lu2.

Además, los vectores que proceden del plásmido circular pKD1 de 1,6 \mum pueden ser utilizados para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Bianchi et al., Curr. Genet. 12: 185 (1987). Más recientemente, se ha informado, por parte de K. Lactis, acerca de un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternera recombinante. Van den Berg, Bio/Technology 8: 135 (1990). Se han descrito también vectores de expresión multicopia estables para la secreción de sueroalbúmina humana recombinante madura mediante cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology 9: 968-975 (1991).

Los vectores de clonado y expresión contienen habitualmente un favorecedor que es reconocido por el organismo huésped y está unido operativamente al ácido nucleico heteromultímero. Un gran número de favorecedores reconocidos por una diversidad de células huésped potenciales resultan bien conocidos. Estos favorecedores están unidos operativamente a ADN que codifica para heteromultímero, mediante la eliminación del favorecedor desde la fuente de ADN por medio de digestión con enzima de restricción e inserción de la secuencia de favorecedor aislada en el vector.

Entre los favorecedores adecuados para ser utilizados con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas de favorecedor lactosa y \beta-lactamasa (Chang et al., Nature 275: 615 [1978]; y Goeddel et al., Nature 281: 544 [1979]), fosfatasa alcalina, un sistema favorecedor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acid Res. 8: 4057 [1980] y EP 36.775) y favorecedores híbridos tales como el favorecedor tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]). No obstante, resultan adecuados otros favorecedores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótido han sido publicadas, permitiendo con ello que un experto en la materia las una de forma operativa a ADN que codifica para el heteromultímero (Siebenlist et al., Cell 20: 269 [1980]), utilizando elementos de unión o adaptadores para suministrar cualquier punto de restricción necesario. Los favorecedores que se utilizan en los sistemas bacterianos contendrán también y una secuencia Shine-Dalgarro (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica para el heteromultímero.

Las secuencias de favorecedor son conocidas para eucariotas. Virtualmente todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente entre 25 y 30 bases aguas arriba del punto en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada entre 70 y 80 bases aguas arriba del punto en el que se inició la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT, en la que X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas se encuentra la secuencia AATAAA que puede ser una señal para la adición de una cola poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación. La totalidad de estas secuencias son adecuadamente insertadas en vectores de expresión eucariotas.

Entre los ejemplos de secuencias favorecedoras adecuadas para ser utilizadas con huéspedes de levadura se incluyen los favorecedores de la 3-fosfoglicerato-quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073 [1980] u otros enzimas glicolíticos (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg 7: 149 [1968]; y Holland, Biochemistry 17: 4900 [1978]), tales como enolasa, gliceraldehido-3-fasfatodeshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfatoisomerasa, 3-fosfogliceratomutasa, piruvato quinasa, triosafosfatoisomerasa, fosfoglucosaisomerasa y glucoquinasa.

Otros favorecedores de levadura, los cuales son favorecedores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada a través de condiciones de crecimiento, son las regiones de favorecedor para el alcohol deshidrogenada 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativos asociados con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehido-3-fosfatodeshidrogenada y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y favorecedores adecuados para ser utilizados en la expresión de levadura son descritos adicionalmente en Hitzeman et al., EP 73.657A. Los reforzadores de levadura pueden ser también ventajosamente utilizados con favorecedores de levadura.

La transcripción heteromultímera a partir de vectores en células huésped de mamífero es controlada, por ejemplo, a través de favorecedores obtenidos a partir de genomas de virus, tales como virus polioma, virus de la viruela aviar (UK 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tales como Adenovirus 2), virus papelona bovino, virus sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y, muy preferiblemente, Virus Simian 40 (SV40), a partir de favorecedores mamíferos heterólogos, por ejemplo, el favorecedor actina o un favorecedor inmunoglobulina, o a partir de favorecedores de choque de calor.

Los favorecedores tempranos y tardíos del virus SV40 son obtenidos convenientemente, como en el fragmento de restricción SV40 que contiene también el origen vírico SV40 de replicación. Fiers et al., Nature 273: 113 (1978); Mulligan y Berg, Science 209: 1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7398-7402 (1981). El favorecedor temprano inmediato del citomegalovirus humano es obtenido convenientemente como un fragmento de restricción Hindi E. Greenaway et al., Gene 18: 355-360 (1982). Un sistema para la expresión de ADN en huéspedes mamíferos utilizando el papilomavius bovino como vector se describe en la patente US Nº. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente US Nº. 4.601.978. Ver también Gray et al., Nature 295: 503-508 (1982), sobre la expresión de cADN que codifica para interferón inmune en células de mono; Reyes et al, Nature 297: 598-601 (1982) sobre expresión de cADN interferón-\beta humano en células de ratón, bajo control de un favorecedor timidinaquinasa procedente de virus herpes simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen interferón \beta1 humano en células de conejo y de ratón cultivadas; y Goman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777-6781 (1982), sobre expresión de secuencias CAT bacterianas en células de riñón de mono, fibroblastos de embrión de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa y células NIH-3T3 de ratón, utilizando como favorecedor la repetición terminal larga del virus de sarcoma de Rous.

La transcripción del ADN que codifica para el heteromultímero a través de eucariotas más elevados resulta a menudo incrementada mediante la inserción de una secuencia reforzadora en el vector. Los reforzadores son relativamente independientes de la orientación y de la posición, habiendo sido encontrados en 5' (Laimins et al., Proc. Natl Acad. Sci USA 78: [1981]) y 3' (Lusky et al., Mol. Cell Biol. 3: 1108 [1983]) en la unidad de transcripción, dentro de un intrón Banerji et al., Cell 33: 729 [1983]), al igual que dentro de la propia secuencia de codificación (Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 [1984]). Se tiene conocimiento de mucgas secuencias reforzadoras a partir de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). No obstante, habitualmente, uno utilizaría un reforzador procedente de un virus de célula eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el reforzador SV40 sobre el lado tardío del origen de replicación (bp 100-270), el reforzador del favorecedor temprano de citomegalovirus, el reforzador polioma sobre el lado tardío del origen de replicación y reforzadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos reforzadores para activación de favorecedores eucariotas. El reforzador puede ser empalmado en el vector en une posición 5' ó 3' de la secuencia que codifica para el heteromultímero, pero está preferiblemente localizado en un punto 5' del favorecedor.

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas (levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanas o células nucleadas procedentes de otros organismos multicelulares) contendrán también secuencias necesarias para la terminación de la trascripción y para estabilizar el mRNA. Las citadas secuencias se encuentran habitualmente disponibles a partir del extremo 5' y, ocasionalmente, del extremo 3', regiones no traducidas de ADNs o cADNs eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del mRNA que codifica para el heteromultímero.

La construcción de los vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes listados anteriormente utiliza técnicas de unión estándares. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN son rotos, hechos a medida y vueltos a unir en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para que los análisis confirmen las secuencias correctas en plásmidos construidos, las mezclas de unión son utilizadas para transformar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC 31, 446) y transformadores exitosos seleccionados a través de resistencia a ampicilina o tetraciclina, cuando resulte apropiado. Se preparan plásmidos a partir de los transformadores, se analizan por medio de digestión con endonucleasa de restricción y/o se secuencian a través del procedimiento de Messing et al., Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981) o a través el procedimiento de Maxam et al., Methods in Enzymology 65: 499 (1980).

Particularmente útil en la práctica de esta invención son los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de mamífero de ADN que codifica para heteromultímero. En general. La expresión transitoria conlleva la utilización de un vector de expresión que es capaz de replicación eficaz en una célula huésped, de tal forma que la célula huésped acumula muchas copias de la expresión y, a su vez, sintetiza elevados niveles de un polipéptido deseado, codificado por el vector de expresión. Sambrook et al., supra, pp. 16.17-16.22. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión adecuado, permiten convenientemente la identificación positiva de polipéptidos codificados por ADNs clonados, al igual que el rápido cribado de heteromultímeros que tienen las especificidades/afinidades de unión deseadas.

Otros procedimientos, vectores y células huésped adecuadas para adaptación a la síntesis de heteromultímero en cultivo celular recombinante se describen en Gething et al., Nature 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281: 40-46 (1979): Levinson et al., EP 117.060 y EP 117.058. Un plásmido particularmente útil para expresión de cultivo celular en mamífero del heteromultímero es pRK5 (EP 307.247) p pSV16B (pub. PCT nº. WO 91/08291, publicada el 13 de junio de 1991).

La elección de la línea celular huésped para la expresión de heteromultímero depende principalmente del vector de expresión. Otra consideración es la cantidad de proteína que resulta necesaria. Cantidades a nivel de miligramos pueden a menudo ser producidas a través de transfecciones transitorias. Por ejemplo, el adenovirus 293 transformado por EIA de línea celular de riñón embriónico humano puede ser transfectado transitoriamente con vectores basados en pRK5, mediante una modificación del procedimiento del fosfato cálcico, con vistas a permitir la expresión eficaz del heteromultímero. Los vectores basados en CDMB pueden ser utilizados para transfectar células COS por medio del procedimiento DEAE-dextrano (Aruffo et al., Cell 61: 1303-1313 [1990]; y Zettmeissi et al., ADN Cell Biol. (US) 9: 347-353 [1990]). Si se desean cantidades más grandes de proteína, la inmunoadhesina puede ser expresada después de transfección estable de la línea celular huésped. Por ejemplo, el vector basado en pRK5 puede ser introducido en células de ovario de hámster chino (CHO) en presencia de un plásmido adicional que codifica para la dihidrofolato reductasa (DHFR) y confiriendo resistencia a G418. Los clones resistentes a G418 pueden ser seleccionados en cultivo. Estos clones son cultivados en presencia de niveles crecientes de metotrexato inhibidor de DHFR y se seleccionan clones en los cuales el número de copias de genes que codifican para DHFR y las secuencias de heteromultímero es co-amplificado. Si la inmunoadhesina contiene una secuencia líder hidrófoba en si N Terminal, es probable que sea procesada y secretada por las células transfectadas. La expresión de inmunoadhesinas con estructuras más complejas puede requerir únicamente células huésped adecuadas. Por ejemplo, componentes tales como cadena ligera o cadena J pueden ser proporcionados por determinados mielomas o células huésped hibridoma (Gascoigne et al., supra; y Martin et al, J. Virol. 67: 3561-3568 [1993]).

Otras células huésped adecuadas para clonado o expresión de los vectores del presente documento son las células procariotas, de levadura o las células eucariotas superiores descritas anteriormente. Entre las procariotas adecuadas para este propósito se incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriáceas tales como Eschericchia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, al igual que Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, el licheniformis 41P descrito en DD 266.710, publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Un huésped de clonado de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), si bien resultan adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31, 537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitativos. La cepa W3110 es un huésped o un huésped padre particularmente preferido, dado que la misma constituye una cepa huésped común para fermentaciones de producto ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por ejemplo, la cepa W3110 puede ser modificada para efectuar una mutación genética en los genes que codifican para proteínas, con ejemplos de tales huéspedes incluyendo la cepa 27C7 de E. coli W3110. El genotipo completo de 27C7 es tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15\Delta(argf-lac)169 ompT\Delta degP41karf. La cepa 27C7 fue depositada el 30 de octubre de 1991 en la American Type Culture Collection como ATCC Nº. 55.244. Alternativamente, puede utilizarse la cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en la patente US Nº. 4.946.783, concedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, resultan adecuados procedimientos. de clonado, por ejemplo, reacciones de PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido
nucleico.

Además de procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras resultan huéspedes de expresión o clonado adecuados para vectores que codifican para heteromultímeros. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panadero, es el más comúnmente utilizado de entre los microorganismos huéspedes eucariotas. No obstante, un determinado número de otros géneros, especies y cepas se encuentra comúnmente disponible y resulta de utilidad en el presente documento, tales como Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature 290: 140 [1981]; EP 139.383, publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes Kluyveromyces (patente US Nº. 4.943.529; Fleer et al., supra), tales como, por ejemplo, K. lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacterial. 737 (1983)], K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickermamili (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., supra), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia [EP 402.226]; Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrisha et al., J. Basic Microbiol. 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma recia [EP244.234]; Neurospora crassa (case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentales (EP 394.538, publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, publicada el 10 de enero de 1991), y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem Biophys. Res. Común. 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474 [1984]) y A. Níger (Nelly y Hynes, EMBO J. 4: 475-479 [1985]).

Las células huésped adecuadas para la expresión de heteromultímero glicosilado proceden de organismos multicelulares. Las citadas células huésped son capaces de procesar complejos y llevar a cabo actividades de glicosilación. En principio, cualquier cultivo celular eucariótico superior resulta manipulable, ya sea procedente de cultivo vertebrado o invertebrado. Entre los ejemplos de células invertebradas se incluyen células de plantas y de insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovíricas y variantes y las correspondientes células huésped permisivas a partir de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (frutales) y Bómbix mori. Ver, por ejemplo, Luckow et al., Bio/Technology 6: 47-55 (1988); Millar et al., en Genetic Engineering, Setlow et al., eds. Vol 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda et al., Nature 315: 592-594 (1985). Una variedad de cepas víricas para transfección se encuentra públicamente disponible, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bómbix ori NPV, y los citados virus pueden ser utilizados como los virus en el presente documento según la invención, particularmente para la transfección de células Spodoptera frugiperda.

Cultivos de células de planteas de algodón, maíz, patatas, haba de soja, petunia, tomate y tabaco pueden ser utilizados como huéspedes. Habitualmente, las células de las plantas son transfectadas mediante incubación con determinadas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, las cuales han sido manipuladas previamente para contener el ADN heteromultímero. Durante la incubación del cultivo de células de planta con A. tumefaciens, el ADN que codifica para el heteromultímero es transferido al huésped de la célula de la planta, de forma que el mismo sea transfectado y pueda expresar, bajo las condiciones adecuadas, el ADN heteromultímero. Además, secuencias señal y reguladoras, compatibles con células de plantas disponibles, tales como el favorecedor nopalina sintasa y secuencias señal de poliadenilación, se encuentran disponibles. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 561 (1982). Además, segmentos de ADN aislados a partir de la región aguas arriba del gen T-ADN 780 son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de los genes expresables en plantas, en tejido de planta que contiene ADN recombinante. EP 321.196, publicada el 21 de junio de 1989.

Los huéspedes preferidos son células de vertebrado y la propagación de las células de vertebrado en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento rutinario en los últimos años (Tissue Culture, Academia Press, Kruse and Patterson, editors [1973]). Entre los ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero se encuentra la línea CV1 de riñón de mono, transformada por SV40(COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embriónico humano (células 293 o células 293 subclonadas en cultivo en suspensión, Gram. et al., J. Gen Virol. 36: 59 [1977]); células de riñón de cría de hámster (BHK, QTCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77: 4216 [1980]); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 [1980]); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 [1982]); células MRC 5; células FS4; y una línea de hematoma humano
(Hep G2).

Las células huésped son transfectadas con los vectores de clonado o expresión de esta invención descritos anteriormente y cultivadas en medios nutrientes convencionales, según resulte adecuado para inducir favorecedores, seleccionar transformadores o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. En función de la célula huésped utilizada, la transfección se efectúa utilizando técnicas estándar, apropiadas para las citadas células. El tratamiento con calcio, utilizando cloruro cálcico, tal y como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al, supra, o la electroporación, es generalmente utilizado para la transformación de determinadas células de planta, tal y como se describe por parte de Shaw et al., Gene: 315 (1983) y WO 89/05859, publicada el 29 de junio de 1989. Además, las plantas pueden ser transfectadas utilizando tratamiento con ultrasónidos, tal y como se describe en WO 91/00358, publicada el 10 de enero de 1991.

Para células de mamífero sin las citadas paredes celulares, el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico de Gramham y van der Eb, Virology 52: 456-457 (1978) resulta preferido. Aspectos generales del sistema huésped de célula de mamífero han sido descritos por Axel en la patente US Nº. 4.399.216, concedida el 16 de agosto de 1983. Las transformaciones en levadura son habitualmente llevadas a cabo según el procedimiento de Van Solingen et al., J. Bat. 130: 946 (1977) de Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 76: 3829 (1979). No obstante, para la introducción del ADN en las células pueden también utilizarse otros procedimientos, tales como la microinyección nuclear, la electroporación, la fusión de protoplasto bacteriano con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina, etc. Para las diversas técnicas de transformación de las células de mamífero, ver Keown et al., Methods. in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymoogy 185: 527-537 (1990) y Mansour et al., Nature 336: 348-352 (1988).

Las células procariotas utilizadas para producir el polipéptido heteromultímero de esta invención son cultivadas en medios adecuados, tal y como se describe de forma general en Sambrook et al, supra.

Las células huésped de mamífero utilizadas para producir el heteromultímero de esta invención pueden ser cultivadas en una diversidad de medios. Medios comercialmente disponibles como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Médium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio Eagle modificado por Dulbecco ([DMEM], Sigma) resultan adecuados para cultivar las células huésped. Además, los medios descritos en Ham y Wallace, Meth Enz. 58: 44 (1979), Bames y Sato, Anal. Biochem. 102: 255 (1980), patentes US Nos. 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762 o 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195; patente US Re. 30.985 o patente US Nº. 5.122.469, pueden ser utilizadas como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede ser suplementado, según resulte necesario, con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, cálcico, magnésico y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamycin^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes en concentraciones finales en la banda micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario puede ser también incluido en concentraciones adecuadas, las cuales resultarían conocidas por parte de los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH o similar, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para expresión y resultarán evidentes para los expertos en la materia.

En general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos de célula de mamífero pueden ser encontrados en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed., IRL Press, 1991.

Las células huésped a las que se hace referencia en esta descripción abarcan células en cultivo, al igual que células que se encuentran dentro de un animal huésped.

4. Recuperación del heteromultímero

El heteromultímero es preferiblemente recuperado a partir del medio de cultivo en forma de polipéptido secretado, si bien el mismo puede ser también recuperado a partir de lisato de células huésped cuando se produce directamente sin una señal secretora. Si el heteromultímero esta unido a membrana, el mismo puede ser liberado de la membrana utilizando una elución detergente adecuada (por ejemplo, Triton X 100).

Cuando el heteromultímero es producido en una célula recombinante distinta de la de origen humano, el mismo se encuentra totalmente exento de proteínas o polipéptidos de origen humano. No obstante, resulta necesario purificar el heteromultímero de proteínas celulares recombinantes o de polipéptidos para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas, en lo que hace referencia al heteromultímero. Como primer paso, el medio de cultivo o lisato es normalmente centrifugado para eliminar restos celulares en forma de partícula.

Los heterodímeros que tienen dominios constantes de anticuerpo pueden ser adecuadamente purificados mediante cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía por afinidad, siendo la cromatografía por afinidad la técnica de purificación preferida. Cuando el heteromultímero comprende un dominio C_{H}3, la resina Bakerbond ABX^{TM} (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) resulta adecuada para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como la fraccionación sobre una columna de intercambio iónico, la precipitación con etanol, la HPLC en fase inversa, la cromatografía sobre sílice, la cromatografía sobre heparina Sepharose, la cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), la cromatografía focalizada, SDS-PAGE, y la precipitación con sulfato amónico se encuentran también disponibles, en función del polipéptido que tenga que ser recuperado. La adecuabilidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo del dominio Fc de inmunoglobulina que tenga que ser utilizado en la quimera. La proteína A puede ser utilizada para purificar inmunoadhesinas que están basadas en cadenas pesadas \gamma1, \gamma2 ó \gamma4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983]). La proteína G es recomendada para la totalidad de isotipos de ratón y para \gamma3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 [1986]). La matriz a la que se une el ligando de afinidad es, muy habitualmente, agarosa, pro se dispone de otras matrices. Las marices mecánicamente estables, tales como las de cristal de poro controlado o de poli(estireno-divinil)benceno permiten alcanzar velocidades de flujo más elevadas y períodos de procesado más cortos de los que pueden alcanzarse con agarosa. Las condiciones para la unión de una inmunoadhesina a la columna de afinidad de proteína A o G son impuestas completamente por las características del dominio Fc, es decir, sus especies e isotipos. Generalmente, cuando se elige el ligando propio, se genera una unión eficaz directamente desde el fluido de cultivo no condicionado. Una característica distintiva de las inmunoadhesinas es la de que, para moléculas \gamma1 humana, la capacidad de unión para la proteína A queda algo reducida en relación con un anticuerpo del mismo tipo Fc. La inmunoadhesina unida puede ser eficazmente eluida ya sea en condiciones de pH ácido (a o por encima de 3,0) o en un tampón a pH neutro que contiene una sal moderadamente caotrópica. Este paso de cromatografía por afinidad puede dar lugar a una preparación de heterodímero que tenga una pureza > 95%.

5. Usos para el heteromultímero

Se contemplan muchas aplicaciones terapéuticas para el heteromultímero. Por ejemplo, el heteromultímero puede ser utilizado para citotoxicidad redirigida (por ejemplo, para destruir células tumorales), como adyuvante de vacuna, para el suministro de agentes trombolíticos a coágulos, para el suministro de inmunotoxinas a células tumorales, para convertir profármacos activados por enzimas en un punto diana (por ejemplo, un tumor), para el tratamiento de enfermedades infecciosas o para dirigir complejos inmunes hacia receptores de la superficie celular.

Las formulaciones terapéuticas del heteromultímero son preparadas para almacenamiento mediante el mezclado del heteromultímero que tiene el grado deseado de pureza con soportes fisiológicamente aceptables opcionales, excipientes, o estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A., Ed. [1980]), en forma de pastel liofilizado o de soluciones acuosas. Los soportes, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (por debajo de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como sueroalbúmina, gelatina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de tipo azúcar, tales como manitol o sorbitol; contrapones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensioactivos no fónicos, tales como Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG).

El heteromultímero puede estar también atrapado en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o polimerización de interfase (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina o microcápsulas de poli- [metilmetacrilato], respectivamente), en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en microemulsiones. Las citadas técnicas de describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

El heteromultímero que tiene que ser utilizado para administración in vivo tiene que ser estéril. Esto se consigue rápidamente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, con anterioridad a o después de liofilización y reconstitución. El heteromultímero será habitualmente almacenado en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones de heteromultímeros terapéuticas se colocan generalmente en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa con solución intravenosa o un vial que tiene un tope agujereable mediante una aguja de inyección hipodérmica.

La ruta de administración de heteromultímero está en consonancia con procedimientos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, o intralesional o mediante sistema de liberación sostenida, tal y como se indica más adelante. El heteromultímero es administrado de forma continua a través de infusión o inyección bolus.

Entre los ejemplos de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la proteína, matrices que están en forma de artículos puntiagudos, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles [a saber, poli(2-hidroxietil-metacrilato), tal y como se describe por parte de Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982) o poli(vinilalcohol)], poliáctidas (patente US Nº. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 [1983]), copolímeros etileno-acetato de vinilo no degradables (Langer et al., supra), copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como Lupron Depot^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímero ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988).

Si bien polímeros tales como etileno-acetato de etilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando proteínas encapsuladas permanecen en el organismo durante un largo período de tiempo, las mismas se desnaturalizan o acumulan como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, dando lugar a la pérdida de actividad biológica y a posibles cambios en la inmunogenicidad. Pueden diseñarse estrategias racionales para la estabilización de proteínas, en función del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de acumulación es la formación de enlace S-S intermolecular a través de intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede ser lograda mediante la modificación de los restos sulfidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados, y desarrollando composiciones matriciales poliméricas específicas.

Las composiciones de heteromultímero de liberación sostenida incluyen también heteromultímero atrapado liposomalmente. Los liposomas que contienen heteromultímero son preparadas a través de procedimientos conocidos per se: DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patente US Nºs. 4.485.045 y 4.544.545; y EP 102.324. Ordinariamente, los liposomas son de tipo unilamelar pequeño (aproximadamente entre 200 y 800 \ring{A}), en los cuales el contenido en lípido es superior a aproximadamente 30% en moles de colesterol, siendo la proporción seleccionada ajustada para la terapia de heteromultímero óptima.

La cantidad eficaz de heteromultímero que tiene que ser terapéuticamente utilizada dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, de la ruta de administración y de la dolencia del paciente. Por consiguiente, resultará necesario para el terapeuta valorar la dosis y modificar la ruta de administración, según convenga, con vistas a obtener el óptimo efecto terapéutico. Una dosis diaria típica podría oscilar entre aproximadamente 1 \mug/kg hasta un máximo de 10 mg/kg o más, en función de los factores mencionados anteriormente. Habitualmente, el clínico administrará el heteromultímero hasta que se alcance una dosis que logre el efecto deseado. El avance de esta terapia es fácilmente monitorizado a través de ensayos convencionales.

Los heteromultímeros descritos en el presente documento pueden ser también utilizados en inmunoensayos de enzimas. Para lograr esto, un brazo del heteromultímero puede ser diseñado para unirse a un epítope específico sobre el enzima, a los efectos de que la unión no provoque inhibición de enzima, el otro brazo del heteromultímero puede ser diseñado para su unión a la matriz inmovilizadora, lo que asegura una elevada densidad de enzima en un punto de interés. Entre los ejemplos de heteromultímeros para diagnosis se incluyen aquellos que presentan especificidad para IgG, al igual que la ferritina y aquellos que presentan especificidades de unión para peroxidasa de rábano (HRP), al igual que, por ejemplo, una hormona.

Los heteromultímeros pueden ser diseñados para ser utilizados en dos inmunoensayos puntuales. Por ejemplo, se producen dos heteromultímeros biespecíficos uniendo dos epítopes separados sobre la proteína analito -un heteromultímero une el complejo a una matriz insoluble, el otro se une a un enzima indicador.

Los heteromultímeros pueden ser también utilizados para inmunodiagnosis in vitro o in vivo de diversas enfermedades, tales como cáncer. Para facilitar este uso en diagnosis, un brazo del heteromultímero puede ser diseñado para unirse a un antígeno asociado a tumor y el otro brazo puede unirse a un marcador detectable (por ejemplo, un quemador que se une a un radionúclido). Por ejemplo, un heteromultímero que tiene especificidades para el antígeno CEA asociado al tumor, al igual que un hapteno bivalente puede ser utilizado para obtener imágenes de carcinomas de tiroides y colorrectal. Otros usos no terapéuticos, de diagnosis, para el heteromultímero resultarán evidentes para los expertos en la materia.

Para aplicaciones en diagnosis, al menos un brazo del heteromultímero estará marcado directa o indirectamente con un resto detectable. El resto detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S, o ^{125}I; un compuesto fluorescente o uno quimioluminiscente, tal como fluoresceína isotiocianato, rodamina, o luciferina; o un enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano (HRP).

Puede ser utilizado cualquier procedimiento conocido en el estado de la técnica que permita la conjugación separada del heteromultímero con el resto detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981); y Nygren, J. Histochem and Cytochem 30: 407 (1982).

Los heteromultímeros de la presente invención pueden ser utilizados en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitivos, ensayos tipo sándwich directos o indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1887).

Los ensayos de unión competitivos se basan en la capacidad que tiene un estándar marcado de competir con el analito de la muestra de prueba, para competir con una cantidad limitada de heteromultímero. La cantidad de analito en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de estándar que se une al heteromultímero. Para facilitar la determinación de la cantidad de estándar que queda unida, los heteromultímeros son generalmente insolubilizados antes o después de la competición, a los efectos de que el estándar y el analito unidos a los heteromultímeros puedan ser separados adecuadamente del estándar y analito que permanecen no unidos.

Los heteromultímeros son particularmente útiles para ensayos sándwich, los cuales conllevan la utilización de dos moléculas, cada una de ellas capaz de unirse a una parte, o epítope, inmununógena diferente de la muestra que tiene que ser detectada. En un ensayo sándwich, el analito de la muestra de prueba está unido a un primer brazo del heteromultímero que es inmovilizado sobre un soporte sólido y, seguidamente, un segundo brazo del heteromultímero se une al analito, formando de este modo un complejo de tres partes insoluble. Ver, por ejemplo, la patente US Nº. 4.376.110. El segundo brazo del heteromultímero puede ser marcado con un resto detectable (ensayos sándwich directos) o puede ser medido utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que esté marcado con un resto detectable (ensayo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo sándwich es el ensayo ELISA, en cuyo caso el resto detectable es un enzima.

Más adelante se proporcionan ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos son ofrecidos tan solo a efectos ilustrativos y no pretenden, en modo alguno, limitar la cobertura de la presente invención.

Ejemplos

La interfase C_{H}3 entre la quimera anti-CD3/CD4-IgG, descrita previamente por parte de Chamow et al., J. Immunol. 153: 4268 (1994) fue diseñada para maximizar el porcentaje de heteromultímeros que podían ser recuperados. La protuberancia en el interior de la cavidad y las variantes C_{H}3 de tipo natural fueron comparadas en lo referente a su capacidad para dirigir la formación de una quimera anticuerpo-inmunoadhesina humanizada (Ab/Ia) anti-CD3/CD4-IgG.

Así pues, se construyeron mutaciones en el dominio C_{H}3 de la cadena pesada de anticuerpo anti-CD3 humanizado y en CD4-IgG, mediante mutagénesis dirigida a un punto, utilizando oligonucleótidos mal emparejados (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367 [1987] y P. Carter, en Mutagenesis: a Practical Approach, M.J. McPherson, Ed. IRL Press., Oxford, UK, pp. 1-25 [1991]), verificándose mediante secuenciado de didesoxinucleótido (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 [1977]). Ver la Tabla 4 mostrada seguidamente y la Fig. 7 del presente documento.

TABLA 4

6

El resto T366 se encuentra dentro de la distancia de unión a hidrógeno del resto Y407, sobre el dominio C_{H}3 asociado. Ciertamente, el principal contacto intermolecular con el resto T366 es con el resto Y407 y viceversa. Se creó un par de protuberancia-en-cavidad mediante la inversión de estos restos con las mutaciones recíprocas de T366Y en un dominio C_{H}3 e Y407T en el dominio asociado, manteniendo de este modo el volumen de las cadenas laterales en la interfase (Fig. 9). Las mutaciones son identificadas por el resto de tipo natural seguido de la posición, utilizando el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Nacional Institute of Health, Bethesda, MD, ed. 5 [1991]) y después el resto de sustitución en forma de código de letra única. Las mutaciones múltiples son señalizadas listando las mutaciones de componente único separadas por un guión.

Fagémidos que codifican para variantes de cadena pesada (H) y ligera (L) de anti-CD3 (Shalaby et al, J. Exp. Med. 175: 217 [1992] y Rodrigues et al., Int. J. Cancer (Suppl), 7: 45 [1992]) fueron co-transfectados en células de riñón embriónico humanas, 293S, conjuntamente con una variante CD4-IgG que codifica para el fagémido (Byrn et al., Nature 344: 667 [1990]), tal como se había descrito con anterioridad (Chamow et al., J. Immunol. 153: 4268 [1994]). El procedimiento es ilustrado en la Fig. 8 del presente documento. La cantidad total de ADNs de fagémido transfectada era fija, mientras que la relación de diferentes ADNs variaba para maximizar el rendimiento de la quimera Ab/Ia. La relación de ADNs input (en masa) de Ia: cadena H: cadena L (15 \mug total) fue modificada de acuerdo con lo siguiente: 8:1:3; 7:1:3; 6:1:3; 5:1:3; 4:1:3; 3:1:3; 1:0:0; 0:1:3.

Los productos fueron purificados por afinidad, utilizando la proteína A Staphylococcal (ProSepA, BioProcessing Ltd. UK) con anterioridad al análisis mediante SDS-PAGE, seguido de escaneado mediante densitometría LASER (Figs. 10A-10E). El exceso ADN de cadena L sobre cadena H se utilizó para evitar que la cadena L resultase limitativa. La identidad de los productos fue verificada mediante electrotransferencia por adsorción sobre la membrana PVDF (Matsudaira, J. Biol. Chem 262: 10035 [1987]), seguido de secuenciado aminoterminal.

La co-transfección de fagémidos para cadena L conjuntamente con los de la cadena H y la incorporación de C_{H}3 de origen natural dió lugar a una mezcla de productos homodímeros de quimera Ab/Ia, IgG e Ia, según lo esperado (Chamow et al., J. Immunol. 153: 4268 [1994]). Ver la Fig. 10A. Cuanto mayor es la fracción de ADN input que codifica para el anticuerpo H más las cadenas L o Ia, más elevada será la fracción de los correspondientes homodímeros recuperada. Una relación de ADN input de 6:1:3 de Ia:H:L proporcionó un rendimiento del 54,5% de quimera Ab/Ia, con fracciones similares de homodímero la (22,5%)y de IgG (23,0%). Estas relaciones concuerdan perfectamente con las esperadas a partir de la expresión equimolar de cada una de las cadenas, seguido de clasificación aleatoria de cadenas H, sin influencia introducida por el procedimiento de análisis: 50% de quimera Ab/Ia, 25% homodímero Ia y 25% IgG.

En contraste con las cadenas que contienen C_{H}3 de origen natural, la quimera Ab/Ia fue recuperada con rendimientos de hasta el 92% a partir de co-transfecciones en las cuales la cadena anti-CD3 H y CD4-IgG Ia contenía, respectivamente, las mutaciones de la cavidad Y407T y la protuberancia T366Y (Fig. 10B). Similares rendimientos de la quimera Ab/Ia se obtuvieron si estas mutaciones recíprocas se instalaban con la protuberancia sobre la cadena H y la cavidad en la Ia (Fig. 10C). En ambos casos, se observó el monómero para la cadena que contenía la protuberancia pero no la cavidad. Sin querer estar vinculados por ninguna teoría, se considera que la protuberancia T366Y es más perjudicial para la formación del homodímero que la cavidad Y407T. La fracción de híbrido Ab/Ia no resultó significativamente modificada mediante el incremento del tamaño de tanto la protuberancia como la cavidad (Ab T366W, Ia Y407A). Un segundo par de protuberancia y cavidad (Ab F405A, Ia T394W) proporcionó hasta un 71% de quimera Ab/Ia, utilizando una pequeña fracción de ADN input Ia para compensar la no anticipada proclividad de la variante de protuberancia T349W para homodimerizar (Fig. 10D). La combinación de los dos pares mutantes independientes protuberancia-en-cavidad (Ab T366Y:F405A, Ia T394W:Y407T) no mejoraba el rendimiento de hibrido Ab/Ia sobre el par Ab T366Y, Ia Y407T (comparar la Fig. 10C y la 10E).

La fracción de quimera Ab/Ia obtenida con T366Y y el par mutante Y407T era virtualmente independiente de la relación de ADNs input a lo largo del rango comprobado. Además, las especies contaminantes eran eliminadas rápidamente de la quimera Ab/Ia a través de cromatografía de intercambio iónico (NaCl 0-300 mM en Tris-HCL 20 mM, pH 8,0) sobre una mono columna S HR 5/5 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Esto ofrece buenas perspectivas para la preparación de cantidades más elevadas de quimeras Ab/Ia utilizando líneas celulares estables en las que los niveles de expresión relativos de Ab e la son manipulados menos rápidamente que en el sistema de expresión transitorio.

Se puede anticipar que las mutaciones protuberancia-en-cavidad incrementan las potenciales aplicaciones de BsAb que contiene Fc, mediante la reducción de la complejidad de la mezcla de productos obtenida a partir diez posibles especies importantes (Suresh et al., Methods Enzymol. 121: 210 [1990]) hasta cuatro o menos. Se espera que el par mutante T366Y e Y407T resultará de utilidad a la hora de generar heteromultímeros u otros isótopos IgG humanos, dado que T366 e Y407 se encuentran completamente conservados y otros restos en la interfase del dominio C_{H}3 de IgG_{1} resultan altamente conservados (ver la Fig. 6 en el presente documento).

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: Genentech, Inc

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR POLIPÉPTIDOS HETEROMULTÍMEROS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS:16

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Genentech, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 460 Point St. Bruno Blvd.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: San Francisco sur

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS:USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: 3,5 pulgadas, disco flexible 720 kb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible IMB

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WinPatin (Genentech)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 05-Feb.1996

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD PRIORITARIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/399106

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD: 01-MAR-1995

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Lee, Wendy M.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 00.000

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/ARCHIVO: p0927PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 415/225-1994

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFÁX: 415/952-9881

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TÉLEX: 910/371-7168

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 110 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 106 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERISTÍCAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

220

Claims (27)

1. Procedimiento para preparar un heteromultímero que comprende un primer polípéptido y un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido y el segundo polipéptido comprenden, cada uno de ellos, un dominio constante de anticuerpo, encontrándose los dominios constantes de anticuerpo en una interfase que comprende una interfase original entre los dominios constantes de anticuerpo, que es alterada para favorecer la formación del heteromultímero, comprendiendo el procedimiento:

(a) alterar un primer ácido nucleico que codifica para el dominio constante de anticuerpo del primer polipéptido, a los efectos de que, dentro de la interfase original del dominio constante de anticuerpo del primer polipéptido que se encuentra con la interfase original del dominio constante de anticuerpo del segundo polipéptido dentro del heteromultímero, un resto aminoácido sea sustituido por un resto aminoácido con un volumen de cadena lateral más grande, generando con ello una protuberancia dentro de la interfase sobre el dominio constante de anticuerpo del primer polipéptido, que es posicionable en una cavidad dentro de la interfase del dominio constante de anticuerpo del segundo polipéptido;

y/o

(b) alterar un segundo ácido nucleico que codifica para el dominio constante de anticuerpo del segundo polipéptido, a los efectos de que, dentro de la interfase original del dominio constate de anticuerpo del segundo polipéptido que se encuentra con la interfase original del dominio constante de anticuerpo del primer polipéptido dentro del heteromultímero, un resto aminoácido sea sustituido por un resto aminoácido que tenga un volumen de cadena lateral más pequeño, generando con ello una cavidad dentro de la interfase del dominio constate de anticuerpo del segundo polipéptido, dentro de la cual sea posicionable una protuberancia dentro de la interfase del dominio constante de anticuerpo del segundo polipéptido;

(c) introducir el primer y el segundo ácido nucleico en una célula huésped y cultivar la célula a los efectos de que se produzca la expresión del primer y del segundo ácido nucleico;

(d) recuperar el heteromultímero formado a partir el cultivo celular.

2. Procedimiento de la reivindicación 1, que comprende alterar, según lo manifestado, el ácido nucleico que codifica para el dominio constante de anticuerpo del primer polipéptido y el ácido nucleico que codifica para el dominio constante de anticuerpo del segundo polipéptido.

3. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el citado resto de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más grande es arginina (R).

4. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el citado resto de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más grande es fenilalanina (F).

5. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el citado resto de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más grande es tirosina (Y).

6. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el citado resto de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más grande es triptófano (W).

7. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el citado resto de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño es cisteína (C).

8. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el citado resto de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño es alanina (A).

9. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el citado resto de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño es serina (S).

10. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el citado resto de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño es treonina (T).

11. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el citado resto de aminoácido que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño es valina (V).

12. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dominio constante de anticuerpo en un dominio C_{H}3.

13. Procedimiento de la reivindicación 12, en el que el dominio constante de anticuerpo es el de una IgG.

14. Procedimiento de la reivindicación 13, en el que la IgG es IgG_{1} humana.

15. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el heteromultímero es un anticuerpo biespecífico.

16. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el heteromultímero es una inmunoadhesina biespecífica.

17. Procedimiento de la reivindicación 1, en el que el heteromultímero es una quimera anticuerpo-inmunoadhesina.

18. Heteromultímero obtenible a través del procedimiento de la reivindicación 1.

19. Heteromultímero de la reivindicación 18, en el que la protuberancia y la cavidad han sido introducidas, respectivamente, en la interfase del dominio constante de anticuerpo del primer y del segundo polipéptidos.

20. Heteromultímero de la reivindicación 19, en el que la protuberancia y la cavidad comprenden, cada una de ellas, un resto aminoácido de origen natural.

21. Composición que comprende el heteromultímero de la reivindicación 18 y un soporte farmacéuticamente aceptable.

22. Célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica para el heteromultímero de la reivindicación 18.

23. Célula huésped de la reivindicación 22 en la que el ácido nucleico que codifica para el primer polipéptido y el ácido nucleico que codifica para el segundo polipéptido están presentes en un vector único.

24. Célula huésped de la reivindicación 22, en la que el ácido nucleico que codifica para el primer polipéptido y el ácido nucleico que codifica para el segundo polipéptido están presentes en vectores separados.

25. Procedimiento para preparar un heteromultímero que 1comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 22, a los efectos de que el ácido nucleico sea expresado y la recuperación del heteromultímero a partir del cultivo celular.

26. Procedimiento de la reivindicación 25, en el que la célula huésped es una célula de mamífero.

27. Procedimiento de la reivindicación 25, en el que el heteromultímero es recuperado del medio de cultivo celular.