ES2246904T3 - Formas no anafilacticas del alergeno phi p 6 del polen del cesped y su uso. - Google Patents
Formas no anafilacticas del alergeno phi p 6 del polen del cesped y su uso.Info
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Abstract
Una molécula inmunogénica hipoalergénica obtenida del alógeno del polen del césped de la variedad timothy Phl p 6, donde la molécula Phl p 6 tiene un truncamiento en el extremo N-terminal y/o C-terminal, careciendo dicha molécula de capacidad de unión a IgE.
Description
Formas no anafilácticas del alergeno Phl p 6 del
polen del césped y su uso.
La presente invención se refiere a formas no
anafilácticas, es decir, hipoalergénicas, del alergeno Phl p 6
principal del polen del césped de la variedad timothy y el uso de
las formas para hiposensibilización y diagnóstico. La invención
también se refiere a un método para hiposensibilización de un
individuo mamífero, típicamente un individuo humano, que padece de
alergia tipo I frente al alergeno Phl p 6.
La alergia tipo I es una enfermedad de
hipersensibilidad determinada genéticamente que afecta a más del 20%
de la población en países industrializados (1). Como consecuencia de
este trastorno inmune, los pacientes alérgicos producen anticuerpos
IgE frente a proteínas principalmente transportadas por el aire
inocuas per se, de polen, ácaros, mohos y pelo/ceniza
animal. Los síntomas de alergia Tipo I (rinitis alérgica,
conjuntivitis, asma alérgica y choque anafiláctico) son el
resultado del entrecruzamiento inducido por alergeno de los
anticuerpos IgE unidos a la célula efectora (mastocito, basófilo) y
la liberación posterior de mediadores inflamatorios (2). Como
aproximadamente el 40% de los individuos alérgicos padecen síntomas
después de contacto con polen del césped, la investigación se ha
concentrado en la caracterización de alergenos del polen del césped
pertinentes por métodos proteicos e inmunoquímicos (3). Aunque se
han identificado los grupos de los principales alergenos como restos
con reactividad cruzada que existen en la mayoría de las especies de
césped (4), no se sabía nada con respecto a su naturaleza
\hbox{o funciones biológicas.}
La reciente aplicación de las técnicas de
biología molecular a la caracterización de alergenos ha revelado las
estructuras primarias de los alergenos y ha facilitado la producción
de alergenos recombinantes para propósitos de diagnóstico y
terapéuticos (5). Los componentes del citoesqueleto vegetal (por
ejemplo, profilina) (6) así como las proteínas de polen que unen
calcio (7) se han identificado como alergenos pertinentes. El hecho
de que los pacientes alérgicos muestren reacciones de tipo inmediato
después del contacto con diversas fuentes de alergenos no
relacionadas puede, por tanto, explicarse por reactividad cruzada de
sus anticuerpos IgE con alergenos ubicuos. La evidencia de que los
alergenos del grupo 1 del polen del césped pertenecen a una familia
de proteínas que disgregan la pared celular (expansinas) (8) y que
los alergenos del grupo 5 del césped pueden tener actividad ARNasa
(9), ha re-estimulado ideas de que la función
biológica de una proteína dada puede estar relacionada con su
alergenicidad. Los recientes descubrimientos de que los principales
alergenos del polen del césped pueden llegar a unirse a partículas
de pequeño tamaño (por ejemplo, los alergenos del grupo 1 a gases de
gasoil (10)) o pueden llegar a transmitirse por el aire en forma de
subcompartimientos del polen (por ejemplo, los alergenos del grupo 5
en amiloplastos (11)) proporcionarían un posible mecanismo de cómo
ciertos alergenos pueden ser capaces de alcanzar las vías
respiratorias profundas de los pacientes y provocar asma
alérgica.
La terapia de enfermedades alérgicas Tipo I
actualmente se realiza por tratamiento farmacológico y por
inmunoterapia específica. La inmunoterapia específica se ha
establecido muy temprano ya en este siglo (Noon, Lancet 1 (1911)
1572-1573) e implica la aplicación sistémica de
dosis en aumento de alergenos durante periodos prolongados. Aunque
la inmunoterapia específica se reconoce como tratamiento eficaz, la
existencia de efectos secundarios anafilácticos representa una de
las principales desventajas de esta terapia. Para reducir las
reacciones anafilácticas, se ha propuesto recientemente el uso de
epítopos de células T para inmunoterapia específica de alergeno
(Briner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993)
7608-7612, y Norman, Curr. Opin. Immunol. 5 (1993)
986-973). Los alergenos albergan una gran diversidad
de diferentes epítopos de células T (Ebner et al., J. Immunol
150 (1993) 1047-1054;
Joost-van-Neerven et al, J.
Immunol. 151 (1993) 2326-2335; y Schenk et
al., J. Allergy Clin. Immunol. 96 (1995)
986-996) que pueden solapar con epítopos de IgE
continuos. Para evitar el entrecruzamiento de IgE unidas a células
efectoras (mastocito, basófilo) y la liberación de mediadores, es
necesario analizar minuciosamente los
\hbox{epítopos de las
células T y las IgE.}
Vrtala et al., J. Clin. Invest.
99(7) 1673-1681 (1997) y el documento WO
99/16467 describen una nueva estrategia para reducir la actividad
anafiláctica del alergeno principal Bet v 1 del abedul alterando la
estructura tridimensional expresando dos partes del ADNc de Bet v 1
que representan los aminoácidos 1-74 y
75-160 en Escherichia coli. En contraste con
el Bet v 1 recombinante completo, los fragmentos recombinantes casi
no mostraron alergenicidad. Ambos fragmentos no anafilácticos
indujeron la proliferación de clones humanos de células T
específicos de Bet v 1, que indica que albergaban todos los epítopos
dominantes de células T y por lo tanto podrían usarse para
inmunoterapia de células T segura y específica. Se cree que el éxito
de esta estrategia se debe al hecho de que el alergeno Bet v 1
tiene epítopos de IgE discontinuos (es decir, conformacionales) en
lugar de epítopos de IgE continuos como es el caso para muchos otros
alergenos.
En contraste con el alergeno principal Bet v 1 de
abedul, el alergeno principal Phl p 6 del polen del césped de la
variedad timothy contiene epítopos de IgE continuos (secuenciales) y
por lo tanto no sería susceptible de la anterior estrategia de
fragmentación para reducir la actividad anafiláctica como se ha
descrito anteriormente.
De acuerdo con la presente invención, sin
embargo, se ha descubierto sorprendente y más inesperadamente que
pueden construirse variantes de deleción de Phl p 6 por
fragmentación genética (recombinante) o sintética, pudiendo usarse
dichos fragmentos para inmunoterapia específica de alergia al polen
del césped con efectos secundarios anafilácticos reducidos. Dichos
fragmentos con capacidad anafiláctica fuertemente reducida se
mencionarán a continuación como no anafilácticos o
hipoalergénicos.
En un primer aspecto de la presente invención, se
proporciona una molécula inmunogénica hipoalergénica obtenida del
alergeno Phl p 6 del polen del césped de la variedad timothy donde
la molécula Phl p 6 tiene una deleción N-terminal
y/o C-terminal que hace que la molécula carezca de
capacidad de unión a IgE.
La deleción N-terminal o
C-terminal puede ser un truncamiento terminal del
alergeno. La deleción también puede ser interna en la parte
N-terminal o C-terminal del
alergeno, respectivamente.
Los fragmentos de la molécula de alergeno pueden
producirse por técnicas de ADN recombinante o química sintética de
péptidos como se conoce per se por los especialistas en la
técnica.
En un segundo aspecto, la presente invención
proporciona una combinación inmunogénica hipoalergénica de moléculas
obtenidas del alergeno Phl p 6, que comprende (i) una molécula Phl p
6 que tiene una deleción N-terminal que hace que la
molécula carezca al menos sustancialmente de la capacidad de unión a
IgE, y (ii) una molécula Phl p 6 que tiene una deleción
C-terminal que hace que la molécula carezca al menos
sustancialmente de la capacidad de unión a IgE, abarcando las dos
moléculas juntas la secuencia de aminoácidos completa del alergeno
Phl p 6.
Para abarcar juntas la secuencia de aminoácidos
completa de Phl p 6, las secuencias respectivas de las dos moléculas
Phl p 6 pueden solapar o ser contiguas.
Los tamaños de las deleciones
N-terminal y C-terminal del alergeno
Phl p 6 necesarias para que los fragmentos sean útiles para los
propósitos de la invención, es decir, que los fragmentos sean (i)
inmunogénicos y (ii) no reactivos con IgE, pueden determinarse
fácilmente por los especialistas en la técnica. Por tanto, la
carencia o presencia de capacidad de unión a IgE de una molécula con
deleción N-terminal o C-terminal
puede determinarse fácilmente, indicando la carencia de reactividad
con IgE que la molécula puede aplicarse sin o con bajo riesgo de
inducir efectos secundarios anafilácticos. La actividad inmunogénica
de las moléculas puede determinarse por su capacidad de reconocerse
por un antisuero policlonal frente al alergeno Phl p 6 completo. De
este modo, pueden seleccionarse fragmentos y combinaciones de
fragmentos, respectivamente, que tengan muy alta probabilidad de ser
capaces de provocar respuestas inmunes que protejan frente al
alergeno completo.
Un tercer aspecto de la invención es una terapia
de hiposensibilización específica. Dicha terapia puede realizarse
como se conoce en la técnica para alergenos proteicos e incluye
administrar de manera repetida al mamífero, típicamente un individuo
humano, que padece de alergia tipo I frente al alergeno, un
inmunógeno que es capaz de provocar una respuesta inmune IgG frente
al alergeno. El inmunógeno puede mezclarse con adyuvantes apropiados
tales como óxido de aluminio. La administración puede hacerse
sistémicamente, por ejemplo, por inyección, infusión, etc., pero
también se ha sugerido la vía oral para exponer la parte intestinal
del sistema inmune. Véase también Norman PS, "Current status of
immunotherapy for allergies and anaphylactic reactions" Adv.
Internal. Medicine 41 (1996) 681-713.
Aquí, el inmunógeno a administrar puede se una
molécula inmunogénica de acuerdo con el primer aspecto de la
invención, o una mezcla de dichas moléculas, preferiblemente, la
combinación inmunogénica hipoalergénica de moléculas mencionada
anteriormente obtenida del alergeno Phl p 6 de acuerdo con el
segundo aspecto de la invención, es decir, (i) una molécula Phl p 6
que tiene una deleción N-terminal que hace que la
molécula carezca al menos sustancialmente de la capacidad de unión a
IgE, y (ii) una molécula Phl p 6 que tiene una deleción
C-terminal que hace que la molécula carezca al menos
sustancialmente de la capacidad de unión a IgE, abarcando las dos
moléculas juntas la secuencia completa de aminoácidos de Phl p
6.
Más específicamente, los inmunógenos pueden
usarse para inducir respuestas de anticuerpo en un paciente, y/o
provocar la respuesta de células T, y/o modular la respuesta de
anticuerpo y células T para inducir tolerancia.
Un cuarto aspecto de la presente invención
proporciona el uso del inmunógeno de acuerdo con el primer aspecto,
o la combinación de inmunógenos de acuerdo con el segundo aspecto,
como antígeno en un inmunoensayo para detectar anticuerpos
específicos de la clase IgA, IgD, IgE, IgG o IgM dirigida frente al
alergeno Phl p 6 del que deriva el inmunógeno o inmunógenos. Las
variantes de ensayo apropiadas implican la formación de un complejo
inmune terciario entre el inmunógeno, el anticuerpo de muestra y un
anticuerpo dirigido frente a la clase de Ig de interés. La muestra
puede ser cualquier fluido biológico que contenga Ig, por ejemplo,
una muestra obtenida de la sangre (suero, plasma, sangre completa),
CSF, etc. Especialmente, los fragmentos hipoalergénicos pueden
usarse para controlar el diagnóstico (por ejemplo, medidas de IgG,
medida de respuestas de células T) durante la terapia cuando se
induce una nueva respuesta inmune frente a los fragmentos.
La invención ahora se ilustrará por el siguiente
Ejemplo no limitante.
El polen del césped de la variedad timothy
(Phleum pratense), césped inglés (Lolium perenne),
centeno (Secale cereale), pasto azul de Kentucky (Poa
pratensis), trigo (Triticum sativum), avena cultivada
(Avena sativa) y carrizo (Phragmites communis) fueron
de Allergon AB, (Välinge, Suecia). Las semillas de césped de la
variedad timothy se adquirieron de Austrosaat, (Viena, Austria) y
se hicieron crecer durante 4 semanas para obtener hojas y raíces
recientes. Se caracterizaron pacientes alérgicos al polen del césped
como se ha descrito (4). El antisuero de conejo
anti-profilina de apio (RP1) se describe (12). Se
provocó antisuero de conejo anti-rPhl p 6 frente a
Phl p 6 recombinante purificado usando adyuvantes de Freund
(Charles River, Kissleg, Alemania). Se purificaron los alergenos del
polen del césped de la variedad timothy recombinante rPhl p 1, rPhl
p 2 y rPhl p 5 como se ha descrito (13). Se purificó la profilina
del polen del césped de la variedad timothy recombinante por
cromatografía de afinidad con poli (L-prolina)
(6).
Se aislaron trescientos cincuenta clones
reactivos a IgE de una biblioteca de ADNc de expresión construida a
partir de polen del césped de la variedad timothy maduro en el fago
\lambdagt 11 (14). Seis ADNc (c121, c142, c146, c171, c223, c233)
con homología de secuencia con un ADNc que codifica Phl p 6 (15) se
subclonaron en el plásmido pUC18 y se secuenciaron (16, 17). Las
secuencias se analizaron usando el programa McVector (Kodak,
Rochester, NY). La búsqueda de secuencias proteicas homólogas a Phl
p 6 se hizo con el programa FastA (paquete GCG) (18) en la base de
datos SwissProt. Las secuencias de los alergenos Hol l 5 y Hor v 5
se recuperaron de la base de datos EMBL. Se produjo un alineamiento
de secuencia múltiple con ClustalW (19) y se editó a mano. El editor
de secuencias GDE (S. Smith, Harvard University, Cambridge, MA) y
COLORMASK (J. Thompson, EMBL, Heidelberg, Alemania) se usaron para
colorear restos conservados con propiedades relacionadas (19). La
estructura secundaria de la proteína y las predicciones de
accesibilidad a la superficie se hicieron con el programa PHD en el
\hbox{servidor EMBL PredictProtein (20).}
La capacidad de unión a IgE de clones fágicos que
expresan isoformas y fragmentos de Phl p 6 se investigó por ensayo
de aparición de placas (21). El ADN que codifica el alergeno Phl p 6
maduro se amplificó por PCR a partir del ADN del clon 142,
subclonado en el sitio NdeI/Eco RI de pET-17b. El
Phl p 6 recombinante se expresó en E. coli BL 21 (DE 3) en
cultivo líquido. Las células se suspendieron en Imidazol 25 mM, pH
7,4, Triton X-100 al 0,1% y se lisaron por la
adición de lisozima (20 \mug/g de células) durante 30 minutos a
temperatura ambiente así como por ciclos de
congelación-descongelación. El ADN se digirió con
ADNasa I (0,1 mg/g de sedimento celular) durante 20 minutos a
temperatura ambiente. El extracto proteico se centrifugó durante 20
minutos a 10.000 x g (Sorvall RC5C; rotor SS34) para retirar los
materiales insolubles. Se enriqueció rPhl p 6 en un precipitado
obtenido por adición de sulfato amónico (40-60%
p/v). El precipitado se disolvió en Tris 10 mM pH 6, se dializó
frente a este tampón y después de centrifugación (20 minutos, 10.000
g, Sorvall RC5C; rotor SS34) se aplicó a una columna de
dietilaminoetil celulosa-Sepharose (Pharmacia). Las
proteínas no unidas se eluyeron con Tris 10 mM, pH 6, isopropanol al
4% v/v. Las fracciones que contenían Phl p 6 a más del 80% de pureza
se ajustaron a pH 8 con NaOH y se sometieron a una segunda etapa de
cromatografía en una columna de dietilaminoetil
celulosa-Sepharose. La elución de las proteínas
unidas con un gradiente 0-0,5 M de NaCl a pH 8
produjo fracciones que contenían rPhl p 6 puro que
\hbox{se
dializaron frente a H _{2} O _{dd} .}
Los espectros de masas mediante desorción por
láser se consiguieron de un modo lineal con un instrumento Compact
MALDI II de tiempo de vuelo (Kratos, Manchester, UK) (piCHEM, Graz,
Austria). Los espectros de CD se registraron en un
espectropolarímetro Jasco J-710 ajustado con un
sistema de control de temperatura tipo peltier Jasco
PTC-348WI y conectado con un baño de agua Fisons
HAAKE GH. Los espectros de CD ultravioleta lejano se registraron a
20ºC en una cubeta de cuarzo de 2 mm de longitud de paso (Hellma,
Mullheim, Baden, Alemania) a una concentración de proteínas de 7
\muM. La desnaturalización térmica de Phl p 6 se controló
registrando la elipticidad durante el aumento de temperatura
(50ºC/h) a 220 nm. La reversibilidad del proceso de desplegamiento
se controló midiendo la restauración de la señal de CD después del
enfriamiento (50ºC/h) hasta la temperatura de partida (20ºC). La
fracción de proteína plegada se calculó como F=1-U,
donde U=(\Theta220-
\ThetaN)/(\ThetaU-\ThetaN). \ThetaN es la
elipticidad de la proteína en estado nativo y \ThetaU la de la
proteína desnaturalizada. Para rPhl p 6, \ThetaU se supuso que
era igual a \Theta220 a 85ºC y \ThetaN para \Theta220 a
20ºC.
El predominio de reactividad
anti-rPhl p 6 de IgE se determinó en sueros de 171
pacientes alérgicos al polen del césped y, para propósitos de
control, en sueros de personas no atópicas por ELISA (13). La
presencia de epítopos de IgE con reactividad cruzada en Phl p 6
natural y recombinante se investigó por experimentos de inhibición
por inmunotransferencia de IgE (4). Una posible relación
inmunológica entre rPhl p 6 y alergenos del polen del césped de la
variedad timothy recombinante (rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5) (13) se
estudió por ELISA de competición como se ha descrito (4).
Se aislaron granulocitos de muestras de sangre
heparinizadas de individuos alérgicos al polen del césped que
contenían anticuerpos IgE reactivos a rPhl p 6 por sedimentación con
dextrano (22). Las células se incubaron con concentraciones en
aumento de rPhl p 5, rPhl p 6 purificados, y con un anticuerpo
anti-IgE humana (E124.2.8 D\varepsilon2,
Immunotech, Marsella, Francia). La histamina liberada en los
sobrenadantes se midió por radioinmunoensayo (Immunotech, Marsella,
Francia).
Después de obtener el consentimiento con total
conocimiento de causa, se realizaron ensayos de pinchazo cutáneo en
los antebrazos de los individuos como se ha descrito (23). Los
individuos se pincharon con alícuotas de 20 \mul que contenían
diferentes concentraciones (1 \mug/ml, 10 \mug/ml, 100
\mug/ml) de rPhl p 6, rPhl p 5 purificados y con extracto de
polen del césped de la variedad timothy, histamina y cloruro sódico
(ALK, Horsholm, Dinamarca).
Los extractos proteicos de pólenes, hojas y
raíces se obtuvieron homogeneizando los tejidos en
SDS-tampón de muestra (24). Los materiales
insolubles se retiraron centrifugando los extractos (10.000 x g, 20
minutos; Sorvall RC5C, rotor SS34). Los extractos proteicos se
separaron por SDS al 14%-PAGE (25) y se transfirieron a
nitrocelulosa (26). Las tiras de nitrocelulosa se sondearon con
antisuero de conejo anti-profilina de apio, RP1,
(12), el antisuero de conejo anti-rPhl p 6 y el
último suero preinmune de conejo. Los anticuerpos de conejo unidos
se detectaron con un antisuero de burro anti Ig de conejo marcado
con ^{125}I diluido 1:1000 (Amersham).
Los granos del polen del césped de la variedad
timothy se fijaron en condiciones no acuosas como se ha descrito
(27). Se incubaron secciones ultradelgadas con concentraciones
iguales de Ig de conejo anti-rPhl p 6 (Ig: fracción
de inmunoglobulina purificada con proteína G) o Ig preinmune. Los
anticuerpos de conejo unidos se detectaron con anticuerpos de cabra
anti-IgG de conejo acoplados a partículas de oro
coloidales de 10 nm (Plano, Wetzlar, Alemania) (27).
Se generaron variantes de deleción
N-terminales y C-terminales de Phl p
6 para representar los aminoácidos 1-57 y
aminoácidos 31-110. Los ADNc que codifican los
aminoácidos 1-57 de Phl p 6 y los aminoácidos
31-110 de Phl p 6 se obtuvieron por amplificación
por PCR del ADNc de Phl p 6 (clon Nº 142) usando los siguientes
cebadores oligonucleotídicos:
Para los aminoácidos 1-57 de Phl
p 6:
5': GGG AAT TC C ATA TGG GGA AGG CCA
CGA CC 3'
5': CGG GGT ACC CTA GTG GTG GTG
GTG GTG GTG GGG CGC CTT TGA AAC 3'
Para los aminoácidos 31-110 de
Phl p 6:
5': GGG AAT TC C ATA TGG CAG ACA AGT
ATA AG 3'
5': CCG GAA TTC CTA GTG GTG GTG
GTG GTG GTG CGC GCC GGG CTT GAC 3'
Los sitios Eco RI y Kpn I se han escrito en
cursiva, los sitios Nde I y una marca de His, que se ha introducido
en el extremo C-terminal, están subrayados.
Los productos de PCR se cortaron con Nde I/Kpn I
(aminoácidos 1-57) y con Nde I/Eco RI (aminoácidos
31-110), se purificaron por electroforesis en gel de
agarosa preparativa, se subclonaron en el plásmido
pET-17b (Novagen) y se transformaron en E.
coli BL 21 (DE3) (Novagen). Las colonias que expresaban las
variantes de deleción correctas se identificaron por
inmunoexploración usando antisuero de conejo
anti-Phl p 6. El ADN de los clones positivos se
aisló usando puntas Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemania) y se secuenció
(MWG-Biotech, Hilden, Alemania).
Los aminoácidos 1-57 de Phl p 6 y
los aminoácidos 31-110 de Phl p 6 recombinantes se
expresaron en E. coli Bl 21 (DE 3) por inducción con
isopropil-\beta-tiogalactopiranósido
0,5 mM a una OD_{600} de 0,8 en cultivo líquido durante 5 h a
37ºC. Se separaron cantidades iguales de rPhl p 6, aminoácidos
1-57 de rPhl p 6 y aminoácidos
31-110 de rPhl p 6 por SDS-PAGE y se
transfirieron a nitrocelulosa.
Las tiras de nitrocelulosa se incubaron con suero
IgE de individuos alérgicos, personas de control no alérgicas, con
un antisuero de conejo anti-Phl p 6 y un suero
preinmune de conejo. Los anticuerpos IgE unidos se detectaron con
anticuerpos anti-IgE humana marcados con ^{125}I y
los anticuerpos de conejo unidos con anticuerpos de burro
anti-conejo marcados con ^{125}I.
Seis clones de ADNc (c142, c223, c171, c121,
c233, c146), que codifican isoformas/fragmentos de Phl p 6 se
aislaron de una biblioteca \lambdagt11 de polen del césped de la
variedad timothy con suero IgE de un paciente alérgico al polen del
césped. Las secuencias de los clones descritos se han depositado en
la base de datos GenBank (números de Acceso:
Y16955-Y16960). La secuencia de aminoácidos deducida
de Phl p 6 (clon 142) contenía un péptido líder hidrófobo de 28
aminoácidos. Se calcularon una masa molecular de 11,8 kDa y un pI de
5,5 para la proteína Phl p 6 madura (clon 142) que comienza con un
resto de glicina y muestra un alto contenido en restos de alanina
(20,9%). El análisis de estructura secundaria ayudado por ordenador
de Phl p 6 indica un contenido de hélices predominante y el cálculo
de la accesibilidad de disolvente predice que muchos de los
aminoácidos N-terminales están expuestos al
disolvente mientras que la mayoría de los aminoácidos
C-terminales parecen internados. Una búsqueda de
motivos de secuencia reveló la presencia de un sitio de
glicosilación unido a N potencial (NAS: aminoácidos
15-17), un sitio de miristoilación
N-terminal (GKAT: aminoácidos 1-4),
dos sitios de fosforilación por proteína quinasa dependiente de
AMPc (KATT: aminoácidos 2-5; KYKT: aminoácidos
33-36) y dos secuencias de dirección peroxisomal
(GKA: aminoácidos 1-3; SKA: aminoácidos
54-56). La secuencia de aminoácidos de Phl p 6
deducida presentó identidad con una secuencia de Phl p 6 (15)
recientemente presentada y similitudes con las porciones
N-terminales de los alergenos del grupo 5 del polen
del césped. Sin embargo, IgE específico de Phl p 6 muestra poca o
ninguna reactividad cruzada con los alergenos del grupo 5. Una
comparación con los alergenos del grupo 5 del polen del césped se da
en Vrtala, S., et al., J. Immunol. 1999, 163(10):
5489-5496 (37) (la descripción del cual se incorpora
como referencia en este documento). La Figura 1A del mismo muestra
un alineamiento de secuencia múltiple, la estructura secundaria y la
predicción de accesibilidad de disolvente de variantes de Phl p 6 y
alergenos del
grupo 5.
grupo 5.
Se expusieron rPhl p 6 completo (c223, c142),
rPhl p 6 truncado en el extremo N-terminal (c171,
c121, c233, c146) fusionados a \beta-gal unidos a
nitrocelulosa y, para propósitos de control,
\beta-gal solo a suero IgE de 9 individuos
alérgicos al polen del césped y una persona no alérgica (Figura 1).
Los resultados obtenidos mostraron que las dos isoformas de Phl p 6
completo y un fragmento de Phl p 6 que carece sólo de 4 de los
aminoácidos N-terminales se unieron fuertemente a
IgE de todos los pacientes alérgicos al polen del césped ensayados y
que la capacidad de unión a IgE de los clones parciales de Phl p 6
disminuyó dependiendo de la cantidad de aminoácidos que estaban
ausentes en el extremo N-terminal de la proteína. Un
clon parcial (clon 121) que carece de 30 aminoácidos
N-terminales tenía casi completamente perdida su
capacidad de unión a IgE (Figura 1).
rPhl p 6 se sobreexpresó en E. coli BL21
(DE3). Una combinación de varias etapas de purificación produjo rPhl
p 6 puro y soluble (aproximadamente 5 mg de proteína/litro de
cultivo de E. coli) que por SDS-PAGE se
identificó como uno de los alergenos del polen del césped de la
variedad timothy de bajo peso molecular (Figura 2A). El análisis
MALDI-TOF de Phl p 6 recombinante purificado dio
como resultado dos picos de masa/carga de 11790 y 5896 que
corresponden a las especies MH+ y M2H2+ de la muestra que estaban de
acuerdo con la masa molecular de Phl p 6 deducida (11789 Da).
En 128 sueros de 171 pacientes alérgicos al polen
del césped pero no en suero de 10 individuos no alérgicos se
detectaron anticuerpos IgE específicos de rPhl p 6. La preabsorción
de sueros de pacientes alérgicos al polen del césped con rPhl p 6
condujo a una gran reducción de la unión de IgE a un resto de
10-14 kDa en extracto de polen del césped de la
variedad timothy transferido a nitrocelulosa que indica que rPhl p 6
y Phl p 6 natural comparten epítopos de IgE. Experimentos de ELISA
de competición demostraron que sólo un pequeño porcentaje (<20%)
de IgE específica de Phl p 6 podría preabsorberse con rPhl p 6. La
unión de IgE a rPhl p 1, rPhl p 2 y profilina de césped de la
variedad timothy recombinante no se redujo después de preincubación
de los sueros con rPhl p 6. Estos resultados identifican Phl p 6
como un alergeno principal que es distinto de otros alergenos del
polen del césped.
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El espectro de CD ultravioleta lejano de rPhl p 6
purificado (Figura 2B) indica que la proteína contiene una cantidad
considerable de estructura secundaria en hélice alfa. El espectro se
caracteriza por dos anchos mínimos a 208 nm y 220 nm y un máximo a
191 nm. La predicción de estructura secundaria (37) está en buen
acuerdo con las medidas de CD como indica el contenido de estructura
secundaria en hélice alfa predominante. La transición de
desplegamiento de rPhl p 6 es monofásica y altamente cooperativa con
un punto de fusión de 61ºC. A 85ºC, rPhl p 6 adopta una conformación
helicoidal aleatoria, con un mínimo típico a 200 nm. rPhl p 6
muestra un alto grado de reversibilidad de plegamiento, evidente a
partir del perfil de curva de enfriamiento (Figura 2C) y el
espectro UV lejano registrado a 20ºC después de enfriamiento desde
85ºC (Figura 2B).
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rPhl p 6 purificado indujo liberación de
histamina específica y dependiente de dosis por los basófilos de un
paciente alérgico al polen del césped (Figura 3A). rPhl p 5 que
representa un alergeno del polen del césped altamente activo (14,
Valenta y Flicker, datos no publicados) indujo una liberación máxima
ya a una concentración inferior en comparación con rPhl p 6. En
cuatro pacientes alérgicos al polen del césped pero no en los
individuos no alérgicos, rPhl p 6, rPhl p 5 y extracto de polen del
césped de la variedad timothy indujeron reacciones cutáneas de tipo
inmediato (Tabla 1; Figura 3B). Aunque no se observaron reacciones a
cloruro sódico, la histamina indujo reacciones de ronchas en todos
los individuos ensayados (Tabla 1; Figura 3B).
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Aunque los principales grupos de alergenos del
polen del césped existen en pólenes de la mayoría de especies de
césped (4), se informó de que los alergenos del grupo 6 existen
exclusivamente en el polen del césped de la variedad timothy
(Phleum pratense) (15). Un antisuero de conejo
anti-rPhl p 6 reaccionó de manera cruzada con los
alergenos del grupo 5 en extractos de polen transferidos a
nitrocelulosa de diversas monocotiledóneas (Phleum pratense,
Lolium perenne, Secale cereale, Triticum sativum, Avena sativa,
Phragmites communis) entre 25-28 kDa (Figura 4A,
carriles 2). Phl p 6 o alergenos relacionados con Phl p 6 a 11 kDa
se detectaron exclusivamente en pólenes de Phleum pratense y
Poa pratensis. Aunque se encontró un supuesto sitio de
N-glicosilación en la secuencia de aminoácidos
deducida de la secuencia de ADNc de Phl p 6, se observaron pesos
moleculares comparables para Phl p 6 natural y recombinante
excluyendo la fuerte glicosilación de Phl p 6 natural (Figuras 4A,
2A). Los anticuerpos de conejo anti-rPhl p 6
reaccionaron fuertemente con Phl p 6 a 11 kDa en polen del césped de
la variedad timothy transferido a nitrocelulosa pero no con
extractos de hoja o raíz (Figura 4B, carriles 2). Se detectó
profilina en los tres tejidos a aproximadamente 14 kDa (Figura 4B,
carriles 1).
Usando microscopía electrónica por inmunomarcaje
con oro después de incrustarlo, se unieron anticuerpos de conejo
anti-rPhl p 6 a las numerosas partículas
polisacáridas (P) que llenan gran parte del interior del grano de
polen maduro del césped de la variedad timothy (Figura 4C). La mayor
acumulación de partículas de oro se observó en superficies
seccionadas de las partículas P que indica que Phl p 6 está presente
sobre en lugar de dentro de la partículas P. Se observó poca
(citosol, exina) o ninguna (mitocondria, intina) inmunorreactividad
anti-Phl p 6 en otras partes del grano de polen.
Asimismo, casi no se detectaron partículas de oro en los
amiloplastos. Este patrón de localización, junto con el
descubrimiento de que un antisuero de conejo
anti-rPhl p 5 no logró marcar las partículas P
(datos no mostrados) excluye la posibilidad de que el inmunomarcaje
de las partículas P sea el resultado de la presencia de alergenos
del grupo 5 con reactividad cruzada. Los experimentos de control
realizados con Ig preinmune produjeron sólo unas pocas partículas de
oro adsorbidas no específicamente (Figura 4D).
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rPhl p 6 completo (Figura 5A), la variante de los
aminoácidos 1-57 de rPhl p 6 (Figura 5B) y la
variante de los aminoácidos 31-110 de rPhl p 6
(Figura 5C) transferidos a nitrocelulosa se expusieron a 13 sueros
de pacientes alérgicos al polen del césped, a un suero de una
persona no atópica y a un antisuero de conejo
anti-rPhl p 6. Mientras que los 13 pacientes
alérgicos al polen del césped presentaron reactividad de IgE a Phl
p 6 recombinante completo (Figura 5A), la variante de los
aminoácidos 1-57 se reconoció por el suero 11 y
ligeramente por el suero 13 (Figura 5B). La variante de los
aminoácidos 31-110 de Phl p 6 reaccionó sólo
ligeramente con el suero 7 y 11 (Figura 5C). El suero del individuo
no atópico no logró reaccionar con rPhl p 6 completo y las variantes
de deleción. El antisuero de conejo anti-rPhl p 6
mostró reactividad de intensidad comparable a rPhl p 6 completo y
las dos variantes de deleción (Figuras 5A-C:
carriles 15) mientras que el suero preinmune de conejo no mostró
reactividad en el intervalo de peso molecular de las moléculas
(Figuras 5A-C: carriles 16).
IgG1 de ratón provocadas frente a rPhl p 6
completo y los aminoácidos 31-110 de rPhl p 6
reaccionan con rPhl p 6 (Tabla II).
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Los granulocitos de un paciente alérgico al polen
del césped se incubaron con diversas concentraciones de rPhl p 6
purificado, aminoácidos 1-57 de rPhl p 6,
aminoácidos 31-110 de rPhl p 6, aminoácidos
1-33 de rPhl p 6 o un mAb anti-IgE
(E124.2.8 D\varepsilon2, Immunotech, Marsella, Francia). La
histamina liberada en el sobrenadante se midió por RIA (Immunotech)
(Figura 6). rPhl p 6 purificado indujo una liberación de histamina
específica y dependiente de dosis por los basófilos de un paciente
alérgico al polen del césped, mientras que los derivados de los
aminoácidos 1-57 y aminoácidos
31-110 de rPhl p 6 no indujeron ninguna liberación
de histamina hasta a una concentración de 1 \mug/ml. Los
aminoácidos 1-33 de Phl p 6 indujeron una liberación
del 50% de histamina a una concentración de 1 \mug/ml, que
representa una reducción de 1000 veces la liberación de histamina en
comparación con rPhl p 6 completo.
Aproximadamente el 40% de los pacientes alérgicos
presentan síntomas de tipo inmediato después del contacto con polen
del césped (3). Se han aislado ADNc que codifican isoformas y
fragmentos de un alergeno principal del polen del césped de la
variedad timothy, denominado Phl p 6. Phl p 6 representa un alergeno
proteico de 11,8 kDa que se reconoce por anticuerpos IgE del 75% de
los pacientes alérgicos al polen del césped. El predominio de
reconocimiento por IgE de rPhl p 6 está, por tanto, de acuerdo con
lo que se ha informado anteriormente para Phl p 6 e indica que los
restos de carbohidrato no presentan un papel determinante en el
reconocimiento por IgE de Phl p 6 (28, 29). En acuerdo con los datos
de secuencia peptídica obtenidos para Phl p 6 natural se descubrió
que la secuencia de aminoácidos deducida de rPhl p 6 muestra un alto
grado de homología de secuencia con las porciones
N-terminales de los alergenos del grupo 5 del polen
del césped, una familia de alergenos principal del polen del césped
de 25-35 kDa (29, 14). Debido a la presencia de un
péptido líder hidrófobo N-terminal, Phl p 6
representa un alergeno independiente, en lugar de un fragmento de
alergeno del grupo 5. En acuerdo con la propuesta de otros autores
que analizaron un clon de ADNc que codifica Phl p 6 (15) se sugiere
que los alergenos del grupo 5 y el grupo 6 pueden provenir de genes
ancestrales similares comunes como se ha descrito para los alergenos
del polen de césped del grupo 1 y el grupo 2/3 (30). La suposición
de que Phl p 6 pertenece a un grupo independiente de alergenos del
polen del césped también se sostiene por el descubrimiento de que
Phl p 6 comparte pocos epítopos de IgE con reactividad cruzada con
el grupo 5 y ninguno con otros alergenos del polen del césped. La
predicción de accesibilidad de disolvente indicó que muchos de los
aminoácidos N-terminales de Phl p 6 están expuestos
al disolvente, mientras que la mayoría de los restos de aminoácidos
C-terminales parecen estar internados. Aunque no hay
pruebas, este descubrimiento esta en acuerdo con los datos obtenidos
de los experimentos de mapeo de epítopos de IgE que indican que el
extremo N-terminal de la proteína está críticamente
implicado en el reconocimiento de IgE. Sin embargo, es igualmente
posible que el extremo N-terminal en sí mismo
represente un epítopo de IgE dominante o que la deleción del extremo
N-terminal afecte a los epítopos conformacionales de
IgE para Phl p 6.
La expresión de Phl p 6 en E. coli produjo
grandes cantidades de proteína recombinante soluble y plegada que
contenía casi exclusivamente estructura secundaria en hélice alfa.
El pliegue en hélice alfa de Phl p 6 es una confirmación adicional
de que no hay características estructurales comunes que predispongan
a una cierta proteína a comportarse como un alergeno. Aunque Phl p 6
muy probablemente es un proteína toda en hélice alfa, Bet v 1, el
alergeno principal del polen del abedul (31) y Bet v 2, profilina de
abedul (32) tienen un plegamiento mixto alfa-beta.
Como se revela por los análisis espectroscópicos de CD, rPhl p 6
comparte con otros alergenos de polen inmunológicamente no
relacionados (por ejemplo, Bet v 1 (33), Bet v 2 (6, 32)) la
tendencia intrínseca remarcable de volver a plegarse en una
conformación estable después de desnaturalización. Otra
característica que comparten Phl p 6 y otros alergenos de plantas
importantes es su alta expresión en tejido de polen. El hecho de que
la mayoría de los alergenos vegetales caracterizados hasta ahora se
expresen predominantemente en polen maduro puede, por lo tanto,
interpretarse como una huella de sensibilización mediante el tracto
respiratorio (34).
Por microscopía electrónica por inmunomarcaje con
oro, Phl p 6 se localizó principalmente en las partículas P de polen
maduro. Las partículas P son pequeños cuerpos que contienen
polisacárido que representan hasta un 30% de los contenidos del
grano de polen inactivo y, durante la germinación del polen
transfieren el material a la pared del tubo de polen en crecimiento
(35, 36). La existencia de Phl p 6 en las partículas P puede ser de
relevancia clínica ya que las partículas P podrían funcionar como
vehículos de alergeno de pequeño tamaño (<2,5 micrómetros) y por
lo tanto respirables que llevan Phl p 6 en contacto inmediato con la
mucosa bronquial. Una intrusión de Phl p 6 unida a una partícula P
en el tracto respiratorio más profundo explicaría, por tanto, el
alto predominio (75%) de sensibilización frente a este alergeno
aunque sólo unas pocas especies de césped (Phleum pratense, Poa
pratensis) contengan restos reactivos con
anti-rPhl p 6 de conejo en el intervalo de peso
molecular bajo (10-12 kDa).
El alergeno Phl p 6 recombinante purificado
expresado en Escherichia coli reaccionó con anticuerpos IgE
de la mayoría de los pacientes alérgicos al polen del césped e
indujo liberación de histamina por basófilos así como reacciones
cutáneas de tipo inmediato. Por lo tanto puede usarse para el
diagnóstico in vitro así como in vivo (ensayo
cutáneo) de alergia al polen del césped. El descubrimiento de que la
deleción de la porción N-terminal de Phl p 6 redujo
drásticamente la capacidad de unión a IgE de los alergenos dio lugar
a la idea de que puede ser posible construir variantes de deleción
de Phl p 6 que puedan usarse para inmunoterapia específica de
alergia al polen del césped con efectos secundarios anafilácticos
reducidos. Una estrategia similar se aplicó recientemente para
alterar los epítopos conformacionales de IgE del alergeno principal
Bet v 1 del polen del abedul (23) pero no podría predecirse para Phl
p 6 porque la última molécula contenía epítopos continuos de IgE. Se
produjeron versiones truncadas en el extremo
N-terminal y C-terminal de Phl p 6,
de las cuales la variante de los aminoácidos 1-57 y
aminoácidos 31-110 mostraron una capacidad de unión
a IgE casi completamente eliminada. Se propone el uso de esta dos
variantes de Phl p 6 hipoalergénicas producidas como moléculas
recombinantes o por química de péptidos como vacunas candidatas
frente a alergia al polen del césped.
Tabla 1. Reactividad cutánea de tipo inmediato a
rPhl p 6. Cuatro pacientes alérgicos al polen del césped (HP, SF,
CS, LW) y dos individuos no alérgicos (SV, SS) se sometieron a
ensayo cutáneo con rPhl p 6 purificado, rPhl p 5, con extracto de
polen del césped de la variedad timothy natural, histamina y cloruro
sódico isotónico. Los resultados se presentan como los diámetros
medios (mm) de la reacción de ronchas.
Tabla II. Reactividad de IgG1 de antisueros de
ratón anti-Phl p 6 o anti- aminoácidos
31-110 de Phl p 6 frente a rPhl p 6.
Figura 1. Reactividad con IgE de isoformas y
fragmentos de rPhl p 6. Filtros de nitrocelulosa que contienen
proteínas del fago \lambdagt11 recombinante que expresa dos
isoformas de Phl p 6 (c142, c223), fragmentos de Phl p 6 (c121,
c146, c171, c233) y para propósitos de control, se sondeó el fago
\lambdagt11 de tipo silvestre (0) con suero IgE de 9 pacientes
alérgicos al polen del césped (1-9) y de un
individuo no alérgico (10).
Figura 2. A, Pureza de alergenos del polen
del césped de la variedad timothy recombinante.
SDS-PAGE teñido con azul brillante de Coomassie que
contiene alergenos del polen del césped de la variedad timothy
recombinante purificados (Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6,
profilina de polen del césped de la variedad timothy) y extracto de
polen del césped de la variedad timothy natural (Timothy). (M)
Marcador de peso molecular.
B, C, Análisis de dicroísmo circular.
B, Los espectros de dicroísmo circular UV lejano de rPhl p
6, expresados como elipticidad residual media ([\Theta]) (eje y),
se registraron en el intervalo de longitud de onda presentado en el
eje x a 20ºC (línea continua), 85ºC (línea de puntos) y a 20ºC
después de enfriamiento desde 85ºC (línea discontinua). C,
Desnaturalización térmica y enfriamiento de rPhl p 6 purificado
registrado a 220 nm (eje x: temperatura en ºC; eje y: fracción
aparente de proteína plegada).
Figura 3. A, rPhl p 6 induce la liberación
de histamina en basófilos. Se incubaron los granulocitos de un
paciente alérgico al polen del césped con diversas concentraciones
(eje x) de Phl p 6 recombinante purificado (triángulos), Phl p 5
(puntos) o un anticuerpo monoclonal anti-IgE
(cuadrados). El porcentaje de histamina liberada en el sobrenadante
se presenta en el eje y. Los resultados representan las medias (+/-
SD) de determinaciones tripli-
cadas.
cadas.
B, Inducción de reacciones cutáneas de
tipo inmediato con rPhl p 6 en pacientes alérgicos sensibilizados.
Dos pacientes alérgicos al polen del césped (a) LW,
(b) HP y un individuo no alérgico (c) SV se pincharon
en sus antebrazos con concentraciones en aumento de rPhl p 6 y rPhl
p 5 así como con histamina (Hist) y NaCl como se indica en
(d). El área del ronchón se rodeo con un bolígrafo de punta
redonda.
Figura 4. Expresión específica de tejido de Phl p
6. A, Se sondearon extractos de polen de césped envasado en
nitrocelulosa de diversas monocotiledóneas con Ig preinmune de
conejo (carriles 1) o Ig de conejo anti-rPhl 6
(carriles 2). B, Se incubaron cantidades comparables de
extractos proteicos envasados en nitrocelulosa de polen, hojas y
raíces del césped de la variedad timothy con Ig de conejo
anti-profilina (carriles 1), Ig de conejo
anti-Phl p 6 (carriles 2) o Ig preinmune de conejo
(carriles 3).
C, D, Localización ultraestructural de Phl
p 6. Se tiñeron secciones ultradelgadas de polen del césped de la
variedad timothy con Ig de conejo anti-Phl p 6
(C) y con Ig preinmune de conejo (D). Los anticuerpos
de conejo unidos se detectaron con antisuero de cabra
anti-Ig de conejo conjugado con oro (partículas de
oro = manchas negras). Las flechas indican inmunorreactividad de Phl
p 6 en las partículas P. Abreviaturas: E: exina; I: intina; P:
partícula P. Las barras representan 0,250 \mum.
Figura 5. Capacidad para unirse a IgE reducida de
variantes de deleción de Phl p 6. Se ensayaron cantidades iguales de
Phl p 6 (A), aminoácidos 1-57 de Phl p 6
(B) y aminoácidos 31-110 de Phl p 6
(C) para la reactividad con IgE con sueros de pacientes
alérgicos al polen del césped de la variedad timothy (carril
1-13) y suero de un individuo de control no
alérgico (carril 14). El carril 15 y el carril 16 muestran la
reactividad con un antisuero de conejo anti-Phl p 6
y un suero preinmune de conejo. Los anticuerpos IgE unidos se
detectaron con anticuerpos anti-IgE humanos marcados
con ^{125}I, los anticuerpos de conejo unidos se detectaron con
anticuerpos de burro anti-conejo marcados con
^{125}I y se visualizaron por autorradiografía.
Figura 6. Se incubaron los granulocitos de un
paciente alérgico al polen del césped con diversas concentraciones
(1, 10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-5}, y 10^{-7}
\mug/ml) de rPhl p 6 purificado (puntos), aminoácidos
1-57 de rPhl p 6 (triángulos hacia arriba)
aminoácidos 31-110 de rPhl p 6 (triángulos hacia
abajo), aminoácidos 1-33 de rPhl p 6 (rombos) o un
mAb anti-IgE (cuadrados). La histamina liberada en
el sobrenadante se midió por RIA y se presenta en el eje x. Los
resultados representan las medias de determinaciones
triplicadas.
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| Ratón anti-rPhl p 6 | Suero preinmune | I. Suero inmune | II. Suero inmune |
| 1 | 0,060 | 0,445 | >2,5 |
| 2 | 0,061 | 1,528 | >2,5 |
| 3 | 0,065 | 0,253 | >2,5 |
| 4 | 0,061 | 0,508 | >2,5 |
| 5 | 0,062 | 0,864 | >2,5 |
| Ratón anti-aa 31-110 de rPhl p 6 | |||
| 1 | 0,063 | 1,218 | >2,5 |
| 2 | 0,056 | >2,5 | >2,5 |
| 3 | 0,057 | 0,347 | >2,5 |
| 4 | 0,054 | >2,5 | >2,5 |
| 5 | 0,056 | 0,406 | >2,5 |
Claims (10)
1. Una molécula inmunogénica hipoalergénica
obtenida del alógeno del polen del césped de la variedad timothy Phl
p 6, donde la molécula Phl p 6 tiene un truncamiento en el extremo
N-terminal y/o C-terminal,
careciendo dicha molécula de capacidad de unión a IgE.
2. La molécula inmunogénica de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la molécula Phl p 6 está truncada en el
extremo N-terminal.
3. La molécula inmunogénica de acuerdo con la
reivindicación 1, donde la molécula Phl p 6 está truncada en el
extremo C-terminal.
4. La molécula inmunogénica de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que se produce por técnicas
recombinantes.
5. La molécula inmunogénica de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que se produce por química
sintética de péptidos.
6. Una combinación inmunogénica hipoalergénica de
moléculas obtenidas del alergeno Phl p 6, que comprende (i) una
molécula Phl p 6 que tiene una deleción N-terminal
que hace que la molécula carezca al menos sustancialmente de la
capacidad de unión a IgE, y (ii) una molécula Phl p 6 que tiene una
deleción C- terminal que hace que la molécula carezca al menos
sustancialmente de la capacidad de unión a IgE, abarcado las dos
moléculas juntas la secuencia completa de Phl p 6.
7. Uso de una cantidad eficaz de una molécula
inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 5 o de una combinación de moléculas inmunogénicas de acuerdo con
la reivindicación 6 en la preparación de un medicamento para
hiposensibilización de un mamífero que padece de alergia mediada por
IgE frente al alergeno del polen del césped de la variedad timothy
Phl p 6.
8. Uso de una molécula inmunogénica de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una combinación de
moléculas inmunogénicas de acuerdo con la reivindicación 6 en la
preparación de un medicamento para inmunoterapia específica para el
tratamiento de alergia al polen del césped medida por IgE.
9. El uso del inmunógeno de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o la combinación de
moléculas inmunogénicas de acuerdo con la reivindicación 6, para el
diagnóstico in vitro de alergia tipo I en un individuo
mamífero.
10. El uso de un inmunógeno de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o la combinación de
moléculas inmunogénicas de acuerdo con la reivindicación 6, para la
preparación de un medicamento para su uso en hiposensibilización de
un individuo mamífero que padece de una alergia tipo I, o para la
preparación de un reactivo para su uso en el diagnóstico in
vivo de alergia tipo I.
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