ES2251721T3 - Factor-11 de diferenciacion del crecimiento. - Google Patents
Factor-11 de diferenciacion del crecimiento.Info
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Abstract
SE DESCRIBE EL FACTOR 11 DE DIFERENCIACION DEL CRECIMIENTO (GDF-11), JUNTO CON SU SECUENCIA POLINUCLEOTIDICA Y AMINOACIDA. ASIMISMO, SE DESCRIBEN METODOS TERAPEUTICOS Y DE DIAGNOSTICO QUE UTILIZAN LA SECUENCIA POLINUCLEOTIDICA Y POLIPEPTIDICA DEL GDF11.
Description
Factor-11 de diferenciación del
crecimiento.
La invención se refiere en general a factores de
crecimiento y específicamente a un nuevo miembro de la superfamilia
de factores de crecimiento de transformación beta
(TGF-\beta), que se denomina
factor-11 de diferenciación del crecimiento
(GDF-11).
La superfamilia de factores de crecimiento de
transformación \beta (TGF-\beta) incluye un
grupo de proteínas relacionadas estructuralmente que afectan a una
amplia serie de procesos de diferenciación durante el desarrollo
embrionario. La familia incluye la substancia inhibidora mülleriana
(MIS), que se requiere para el desarrollo sexual masculino normal
(Behringer, et al., Nature 345:167, 1990), el
producto génico decapentaplégico de Drosophila (DPP), que se
requiere para la formación del eje dorsal-ventral y
la morfogénesis de los discos imaginales (Padgett, et al.,
Nature, 325:81-84, 1987), el producto
génico Vg-1 de Xenopus, que se localiza en el polo
vegetativo de los huevos ((Weeks, et al., Cell,
51:861-867, 1987), las activinas (Mason et
al., Biochem, Biophys. Res. Commun.,
135:957-964, 1986), que pueden inducir la
formación del mesodermo y de estructuras anteriores en embriones de
Xenopus (Thomsen, et al., Cell, 63:485, 1990) y las
proteínas morfogenéticas del hueso (BMP, osteogenina,
OP-1), que pueden inducir la formación de novo de
cartílago y de hueso (Sampath, et al., J. Biol. Chem.,
265:13198, 1990). Los TGF-\beta pueden
influir sobre una diversidad de procesos de diferenciación,
incluyendo la adipogénesis, miogénesis, condrogénesis, hematopoyesis
y diferenciación de células epiteliales (como revisión, véase
Massague, Cell 49:437, 1987).
Las proteínas de la familia de
TGF-\beta inicialmente se sintetizan como una
proteína precursora grande que posteriormente experimenta una
escisión proteolítica en un agrupamiento de restos básicos a una
distancia de aproximadamente 110-140 aminoácidos del
extremo C. Todas las regiones C-terminales, o
regiones maduras, de las proteínas están relacionadas
estructuralmente y los diferentes miembros de la familia pueden
clasificarse en distintos subgrupos basándose en el grado de
homología. Aunque las homologías dentro de subgrupos particulares
varían desde una identidad de secuencias de aminoácidos del 70% al
90%, las homologías entre subgrupos son significativamente
inferiores, variando sólo generalmente de un 20 a un 50%. En
cualquier caso, la especie activa parece ser un dímero unido por
enlaces disulfuro de fragmentos C-terminales.
Ciertos estudios han demostrado que cuando la región pro de un
miembro de la familia de TGF-\beta se coexpresa
con una región madura de otro miembro de la familia de
TGF-\beta, se produce una dimerización
intracelular y la secreción de homodímeros biológicamente activos
(Gray, A., y Maston, A., Science, 247:1328, 1990). Otros
estudios de Hammonds, et al., (Molec. Endocrin. 5:
149, 1991) demostraron que el uso de la región pro de
BMP-2 combinada con la región madura de
BMP-4 conducía a una expresión espectacularmente
mejorada de la BMP-4 madura. Para la mayoría de los
miembros de la familia que se han estudiado, se ha descubierto que
las especies homodiméricas son biológicamente activas, pero para
otros miembros de la familia, como las inhibinas (Ling, et
al., Nature, 321:779, 1986) y los
TGF-\beta (Cheifetz, et al., Cell, 48:409,
1987), también se han detectado heterodímeros, y éstos parecen tener
diferentes propiedades biológicas que los homodímeros
respectivos.
Otros miembros de la superfamilia de
TGF-\beta han sido dados a conocer en WO 94/26892l
la cual describe una proteína designada como BMP-II,
en WO 92/00382, la cual describe una proteína designada como
GDF-1, en WO 94/21681, la cual describe una proteína
designada como GDF-8 y en McPherron and Lee, 1993,
Journal of Biochemistry, 268(5):3444-3449 en
donde se describen proteínas designadas como GDF-3 y
GDF-9. Los documentos WO 94/26892 y WO 94/21681
fueron publicados entre las fechas de prioridad y presentación de la
presente
solicitud.
solicitud.
La identificación de nuevos factores que
presenten especificidad de tejido en su modelo de expresión
proporcionará una mayor compresión del desarrollo y función de ese
tejido.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado o recombinante que codifica un
polipéptido del factor-11 de diferenciación del
crecimiento celular (GDF-11), en donde el
polinucleótido comprende:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1, en donde T puede ser también U;
- (b)
- los nucleótidos 1 a 135 de SEQ ID NO:1, en donde T puede ser también U; o
- (c)
- una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un vector de expresión que incluye el polinucleótido de los aspectos
primero o segundo.
En un tercer aspecto, la invención proporciona
una célula hospedadora transformada de forma estable con el vector
del tercer aspecto.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona un
método para la producción del polipéptido de GDF-11
que comprende cultivar la célula hospedadora del cuarto aspecto bajo
condiciones adecuadas y recuperar el polipéptido expresado.
En un quinto aspecto, la invención proporciona un
polipéptido de GDF-11 codificado por un
polinucleótido de los aspectos primero o segundo o producido por el
método del quinto aspecto.
En un sexto aspecto, la invención proporciona
anticuerpos que se unen selectivamente al polipéptido del sexto
aspecto o sus fragmentos que se unen a antígenos.
En un séptimo aspecto, la invención proporciona
una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido de los
aspectos primero o segundo, un vector del tercer aspecto, un
polipéptido del sexto aspecto y/o un anticuerpo del séptimo aspecto,
y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En un octavo aspecto, la invención proporciona
una composición de diagnóstico que comprende un polinucleótido de
los aspectos primero o segundo, un vector del tercer aspecto, un
polipéptido del sexto aspecto y/o un anticuerpo del séptimo aspecto,
y opcionalmente un medio adecuado para la detección.
En un noveno aspecto, la invención proporciona un
método in vitro para detectar un trastorno proliferativo de
células musculares asociado con la expresión de
GDF-11, que comprende poner en contacto un
anticuerpo del séptimo aspecto con una muestra de un sujeto del que
se sospecha que tiene un trastorno asociado con
GDF-11, y detectar la unión del anticuerpo.
En un décimo aspecto, la invención proporciona el
uso de un anticuerpo del séptimo aspecto en la preparación de una
composición de diagnóstico para detectar un trastorno proliferativo
de células musculares asociado con la expresión de
GDF-11.
En un undécimo aspecto, la invención proporciona
el uso de un anticuerpo del séptimo aspecto o un polinucleótido de
los aspectos primero o segundo que suprime la actividad de
GDF-11 en la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de un trastorno proliferativo de
células musculares asociado con la expresión de
GDF-11.
GDF-11.
La figura 1 muestra las secuencias de nucleótidos
y secuencias pronosticadas de aminoácidos de GDF-11
murínico (figura 1a) y humano (figura 1b). Los sitios putativos de
procesado proteolítico vienen mostrados por las cajas sombreadas. En
la secuencia humana, la señal de glicosilación potencial
N-enlazada viene mostrada por la caja en blanco y la
señal de poliadenilación de consenso está subrayada; no se muestra
la cola de poli A.
La figura 2 muestra transferencias de tipo
Northem de ARN preparadas a partir de tejidos de adultos (figura 2a)
o fetales y neonatales (figura 2b) sondados con una sonda murínica
de GDF-11.
La figura 3 muestra homologías de aminoácidos
entre diferentes miembros de la superfamilia de
TGF-\beta. Los números representan el porcentaje
de identidades de aminoácidos entre cada par calculado desde la
primera cisteína conservada hasta el terminal C. Las cajas
representan homologías entre miembros altamente relacionados dentro
de subgrupos particulares.
La figura 4 muestra una alineación de las
secuencias pronosticadas de aminoácidos de GDF-11
humano (líneas superiores) con GDF-8 humano (líneas
inferiores). Las líneas verticales indican identidades. Los puntos
representan espacios de separación introducidos con el fin de
maximizar la alineación. Los números representan posiciones de
aminoácidos con respecto al terminal N. Los sitios putativos de
procesado proteolítico vienen ilustrados por la caja en blanco. Los
residuos de cisteína conservados en la región
C-terminal vienen mostrados por las cajas
som-
breadas.
breadas.
La figura 5 muestra la expresión de
GDF-11 en células de mamíferos. El medio
acondicionado preparado a partir de células de ovario de hámster
chino transfectadas con un gen híbrido de
GDF-8/GDF-11 (véase el texto)
clonado en el vector de expresión MSXND en la orientación
antisentido (carril 1) o de sentido (carril 2) fue dializado,
liofilizado y sometido a análisis de tipo Western empleado
anticuerpos dirigidos contra la porción C-terminal
de la proteína de GDF-8. Las flechas a la derecha
indican las proteínas putativas de GDF-11 sin
procesar
(pro-GDF-8/GDF-11)
o procesadas. Los números a la izquierda indican las movilidades de
las referencias de peso molecular.
La figura 6 muestra el mapa cromosómico de
GDF-11 humano. Muestras de ADN preparadas a partir
de líneas de células somáticas de ser humano/roedor fueron sometidas
a PCR, electroforadas sobre geles de agarosa, transferidas y
sondadas. El cromosoma humano contenido en cada una de las líneas
celulares híbridas viene identificado en la parte superior de cada
uno de los primeros 24 carriles (1-22, X e Y). En
los carriles designados por CHO, M y H, el molde de ADN de partida
consistía en ADN genómico total de hámster, ratón y ser humano,
respectivamente. En el carril marcado con B1, no se utilizó ADN de
molde. Los números a la izquierda indican las movilidades de las
referencias de ADN.
La figura 7 muestra la localización FISH de
GDF-11. Los cromosomas metafásicos derivados de
linfocitos de sangre periférica fueron hibridados con sonda de
GDF-11 humano marcado con digoxigenina (a) o una
mezcla de sondas genómicas de GDF-11 humano y de
centrómeros específicos al cromosoma 12 (b) y analizados en la forma
descrita en el texto. En el panel (c) se muestra un esquema que
ilustra la localización de GDF-11 en la posición
12q13.
La figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos y
la secuencia deducida de aminoácidos de GDF-8
murínico.
La presente invención proporciona un factor de
crecimiento y diferenciación, GDF-11, y una
secuencia polinucleotídica que codifica GDF-11.
GDF-11 se expresa a niveles máximos en músculo,
cerebro, útero, bazo y timo y a niveles inferiores en otros tejidos.
Puede ser detectado un trastorno proliferativo celular o
inmunológico de origen muscular que está asociado con la expresión o
función de GDF-11. Un trastorno proliferativo
celular o inmunológico puede ser tratado por medio del uso de un
agente que reprime o potencia la actividad de
GDF-11.
La superfamilia de TGF-\beta
consta de polipéptidos multifuncionales que controlan la
proliferación, diferenciación y otras funciones en muchos tipos
celulares. Muchos de los péptidos tienen efectos reguladores, tanto
positivos como negativos, sobre otros factores de crecimiento
peptídicos. La homología estructural entre la proteína
GDF-11 de esta invención y los miembros de la
familia de TGF-\beta indica que
GDF-11 es un nuevo miembro de la familia de factores
de crecimiento y diferenciación. Basándose en las actividades
conocidas de muchos de los otros miembros, puede esperarse que el
GDF-11 también posea actividades biológicas que lo
hagan útil como reactivo de diagnóstico y terapéutico.
Ciertos miembros de esta superfamilia tienen
modelos de expresión o poseen actividades que están relacionadas con
la función del sistema nervioso. Por ejemplo, se ha demostrado que
un miembro de la familia, concretamente GDNF, es un potente factor
neurotrófico que puede promover la supervivencia de neuronas
dopaminérgicas (Lin, et al., Scienc, 260:1130). Otro
miembro de la familia, concretamente dorsalin-1, es
capaz de promover la diferenciación de células de la cresta neural
(Basler, et al., Cell, 73:687, 1993). Se ha demostrado
que las inhibinas y las activinas se expresan en el cerebro
(Meunier, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos,
85:247, 1988; Sawchenko, et al., Nature,
334:615, 1988) y se ha demostrado que la activina es capaz de
funcionar como una molécula de supervivencia de células nerviosas
(Schubert, et al., Nature, 344:868, 1990). Otro
miembro de la familia, particularmente el GDF-1, es
específico para el sistema nervioso en su modelo de expresión (Lee,
S.J., Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos, 88:4250, 1991),
y también se sabe que ciertos miembros distintos de la familia,
tales como Vgr-1 (Lyons, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., Estados Unidos, 86, 4554, 1989; Jones, et
al., Development, 111:531, 1991), OP-1
(Ozkaynak, et al., J. Biol. Chem., 267:25220, 1992) y
BMP-4 (Jones, et al., Development, 111:531,
1991) se expresan en el sistema nervioso. La expresión de
GDF-11 en cerebro y músculo sugiere que
GDF-11 puede poseer también actividades relacionadas
con la función del sistema nervioso. En particular, se sabe, por
ejemplo, que el músculo esquelético produce un factor o factores que
promueven la supervivencia de neuronas motoras (Brown, Trenes
Neurosci., 7:10, 1984). Las actividades neurotróficas conocidas de
otros miembros de esta familia y la expresión de
GDF-11 en músculo sugieren que una de las
actividades de GDF-11 puede ser como un factor
trófico para neuronas motoras; en realidad, GDF-11
está altamente relacionado con GDF-8, el cual es
virtualmente específico al músculo en su modelo de expresión.
Alternativamente, GDF-11 puede tener actividades
neurotróficas para otras poblaciones neuronales. A este respecto, el
GDF-11 puede tener aplicaciones en el tratamiento de
enfermedades neurodegenerativas, tales como la esclerosis lateral
amiotrófica, o en el mantenimiento de células o tejidos en cultivo
antes del transplante.
El GDF-11 también puede tener
aplicaciones en el tratamiento de procesos de enfermedad en los que
está implicado el músculo, tales como enfermedades
musculodegenerativas o en la reparación de tejidos dañados debido a
traumatismos. A este respecto, muchos otros miembros de la familia
de TGF-\beta también son mediadores importantes de
la reparación de tejidos. Se ha demostrado que el
TGF-\beta tiene efectos notables sobre la
formación de colágeno y que produce una respuesta angiogénica
sorprendente en el ratón recién nacido (Roberts, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos 83:4167, 1986).
También se ha demostrado que el TGF-\beta inhibe
la diferenciación de mioblastos en cultivo (Massague, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos 83:8206, 1986).
Además, como los mioblastos pueden usarse como vehículo para
suministrar genes al músculo para una terapia génica, las
propiedades del GDF-11 podrían explotarse para
mantener las células antes de un trasplante o para potenciar la
eficacia del proceso de fusión.
El GDF-11 puede tener también
aplicaciones en el tratamiento de trastornos inmunológicos. En
particular, se ha demostrado que TGF-\beta tiene
una amplia variedad de actividades inmunoreguladoras, incluyendo
potentes efectos supresitos sobre la proliferación y función de
células B y T (en relación con esto, véase Palladito, et al.,
Ann. N. Y. Acad. Sci., 593:181, 1990). La expresión de
GDF-11 en bazo y timo sugiere que
GDF-11 puede poseer actividades similares y, por
tanto, se puede emplear como un agente antiinflamatorio o como un
tratamiento para trastornos relacionados con la proliferación o
función anormal de linfocitos.
La expresión "substancialmente puro", como
se usa en este documento, se refiere al GDF-11 que
está substancialmente exento de otras proteínas, lípidos,
carbohidratos y otros materiales con los que está asociado de forma
natural. Un especialista en la técnica puede purificar el
GDF-11 usando técnicas convencionales para la
purificación de proteínas. El polipéptido substancialmente puro
producirá una sola banda principal en un gel de poliacrilamida no
reductor. La pureza del polipéptido GDF-11 también
puede determinarse por medio del análisis de la secuencia de
aminoácidos amino-terminal. El polipéptido
GDF-11 incluye fragmentos funcionales del
polipéptido, siempre que se conserve la actividad del
GDF-11. En la invención se incluye péptidos más
pequeños que contienen la actividad biológica del
GDF-11.
La invención proporciona polinucleótidos que
codifican la proteína GDF-11. Estos polinucleótidos
incluyen secuencias de ADN, ADNc y ARN que codifican
GDF-11. Se entiende que en este documento, se
incluyen todos los polinucleótidos que codifican todo el
GDF-11, siempre que codifiquen un polipéptido con la
actividad de GDF-11. Tales polinucleótidos incluyen
polinucleótidos naturales, sintéticos y manipulados
intencionadamente. Por ejemplo, el polinucleótido
GDF-11 puede someterse a una mutagénesis de
localización dirigida. La secuencia de polinucleótidos para
GDF-11 también incluye secuencias antisentido. Los
polinucleótidos de la invención incluyen secuencias que están
degeneradas como resultado del código genético. Hay 20 aminoácidos
naturales, la mayoría de los cuales se especifican por más de un
codón. Por lo tanto, en la invención se incluyen todas las
secuencias de nucleótidos degeneradas siempre que la secuencia de
aminoácidos del polipéptido GDF-11 codificado por la
secuencia de nucleótidos permanezca funcionalmente inalterada.
En concreto, se describe aquí una secuencia de
ADN que contiene el gen de GDF-11 humano. La
secuencia contiene un marco de lectura abierto que codifica un
polipéptido con una longitud de 407 aminoácidos. La secuencia
contiene un sitio putativo de escisión proteolítica RXXR en los
aminoácidos 295-298. La escisión del precursor en
este sitio generará un fragmento C-terminal activo
de 109 aminoácidos de longitud con un peso molecular pronosticado de
aproximadamente 12.500 kD. Con preferencia, la secuencia de
nucleótidos de GDF-11 es la SEQ ID NO:1. También se
describe aquí una secuencia genómica murínica parcial (véase SEQ ID
NO:3).
El polinucleótido que codifica
GDF-11 incluye la SEQ ID NO:1, así como secuencias
de ácidos nucleicos complementarias a SEQ ID NO:1. Una secuencia
complementaria puede incluir un nucleótido antisentido. Cuando la
secuencia es ARN, los deoxinucleótidos A, G, C y T de SEQ ID NO:1
están reemplazados por los ribonucleótidos A, G, C y U,
respectivamente. Los fragmentos de las secuencias de ácidos
nucleicos anteriormente descritas que tienen una longitud de al
menos 15 bases, son suficientes para permitir que el fragmento se
hibridice selectivamente a ADN que codifica la proteína de SEQ ID
NO:2 bajo condiciones fisiológicas.
La región C-terminal de
GDF-11 después del supuesto sitio de procesamiento
proteolítico muestra una homología significativa con los miembros
conocidos de la superfamilia de TGF-\beta. La
secuencia de GDF-11 contiene la mayoría de los
restos que están muy conservados en otros miembros de la familia
(véase la figura 1). Al igual que los
TGF-\beta y las inhibinas b, GDF-11 contiene un par extra de restos de cisteína además de las 7 cisteínas encontradas en prácticamente todos los demás miembros de la familia. Entre los miembros de la familia conocidos, GDF-11 es el más homologo a GDF-8 (identidad de secuencia del 92%) (véase la figura 3).
TGF-\beta y las inhibinas b, GDF-11 contiene un par extra de restos de cisteína además de las 7 cisteínas encontradas en prácticamente todos los demás miembros de la familia. Entre los miembros de la familia conocidos, GDF-11 es el más homologo a GDF-8 (identidad de secuencia del 92%) (véase la figura 3).
Ciertas modificaciones minoritarias de la
secuencia de aminoácidos primaria de GDF-11
recombinante pueden producir proteínas con una actividad
substancialmente equivalente en comparación con el polipéptido
GDF-11 descrito en este documento. Tales
modificaciones pueden ser deliberadas, tal como por mutagénesis de
localización dirigida, o pueden ser espontáneas. Todos los
polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en este
documento siempre que aún exista la actividad biológica de
GDF-11. Además, la deleción de uno o más aminoácidos
también puede ocasionar una modificación de la estructura de la
molécula resultante sin alterar significativamente su actividad
biológica. Esto puede conducir al desarrollo de una molécula activa
más pequeña que tendría una mayor utilidad. Por ejemplo, se pueden
retirar los aminoácidos amino o carboxi terminales que no se
requieren para la actividad biológica del
GDF-11.
La secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido GDF-11 de la invención incluye la
secuencia descrita y variaciones conservativas de la misma. La
expresión "variación conservativa", como se usa en este
documento, denota el reemplazo de un resto aminoacídico por otro
resto biológicamente similar. Los ejemplos de variaciones
conservativas incluyen la substitución de un resto hidrófobo tal
como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la
substitución de un resto polar por otro, tal como la substitución de
lisina por arginina, ácido aspártico por glutámico o asparagina por
glutamina, y similares. La expresión "variación conservativa"
también incluye el uso de un aminoácido substituido en lugar de un
aminoácido parenteral no substituido siempre que los anticuerpos
inducidos contra el polipéptido substituido también presenten una
reacción inmunológica con el polipéptido no substituido.
Las secuencias de ADN de la invención pueden
obtenerse por varios métodos. Por ejemplo, el ADN puede aislarse
usando técnicas de hibridación que son bien conocidas en la técnica.
Éstas incluyen, pero sin limitación: 1) hibridación de bibliotecas
de ADN genómico o ADNc con sondas para detectar secuencias de
nucleótidos homólogas, 2) reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
sobre el ADN genómico o el ADNc usando cebadores capaces de hibridar
con la secuencia de ADN de interés, y 3) selección con anticuerpos
de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN
clonados con características estructurales compartidas.
Preferiblemente, el polinucleótido
GDF-11 de la invención procede de un organismo de
mamífero y, aún más preferiblemente, de un ratón, rata o ser humano.
Los procedimientos de selección que se basan en la hibridación de
ácidos nucleicos hacen posible aislar cualquier secuencia génica de
cualquier organismo, siempre que esté disponible la sonda apropiada.
Pueden sintetizarse químicamente sondas oligonucleotídicas que
correspondan a una parte de la secuencia que codifica la proteína
en cuestión. Esto requiere que se conozcan tramos oligopeptídicos
cortos de la secuencia de aminoácidos. La secuencia de ADN que
codifica la proteína puede deducirse a partir del código genético,
sin embargo, debe tenerse encuentra la degeneración del código. Es
posible realizar una reacción de adición mixta cuando la secuencia
es degenerada. Esto incluye una mezcla heterogénea de ADN de doble
cadena desnaturalizado. Para tal selección, la hibridación
preferiblemente se realiza en ADN monocatenario o ADN bicatenario
desnaturalizado. La hibridación es particularmente útil en la
detección de clones de ADNc derivados de fuentes donde está presente
una cantidad extremadamente baja de secuencias de ARNm en relación
con el polipéptido de interés. En otras palabras, por medio del uso
de condiciones de hibridación rigurosas dirigidas a evitar la unión
no específica, es posible, por ejemplo, permitir la visualización
autorradiográfica de un clon de ADNc específico por medio de la
hibridación del ADN diana con esa única sonda en la mezcla que es su
complemento completo (Wallace, et al., Nucl. Acid. Res.,
9:879, 1981); Maniatis, et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989).
El desarrollo de secuencias de ADN específicas
que codifican GDF-11 también pueden obtenerse por:
1) aislamiento de secuencias de ADN bicatenarias a partir del ADN
genómico; 2) fabricación química de una secuencia de ADN para
proporcionar los codones necesarios para el polipéptido de interés;
y 3) síntesis in vitro de una secuencia de ADN de doble
cadena por transcripción inversa del ARNm aislado a partir de una
célula donadora eucariota. En el último caso, finalmente se forma un
complemento de ADN bicatenario de ARNm que generalmente se denomina
ADNc.
De los tres métodos indicados anteriormente para
desarrollar secuencias de ADN específicas para uso en procedimientos
recombinantes, el menos común es el aislamiento de aislados de ADN
genómico. Esto es así especialmente cuando es deseable obtener la
expresión microbiana de polipéptidos de mamífero debido a la
presencia de intrones.
La síntesis de secuencias de ADN frecuentemente
es el método elegido cuando se conoce la secuencia entera de restos
aminoacídicos del producto polipeptídico deseado. Cuando no se
conoce la secuencia entera de restos aminoacídicos del polipéptido
deseado, no es posible la síntesis directa de secuencias de ADN y el
método elegido es la síntesis de secuencias de ADNc. Entre los
procedimientos convencionales para aislar secuencias de ADNc de
interés, se encuentra la formación de bibliotecas de ADNc que llevan
plásmidos o fagos que proceden de la transcripción inversa del ARNm
que es abundante en células donadoras que tienen un alto nivel de
expresión genética. Cuando se usa en combinación con la tecnología
de reacción en cadena de la polimerasa, pueden clonarse incluso
productos de expresión raros. En los casos en los que se conocen
porciones significativas de la secuencia de aminoácidos del
polipéptido, puede emplearse la producción de secuencias de sonda de
ADN o ARN monocatenarias o bicatenarias marcadas que duplican una
secuencia supuestamente presente en el ADNc diana en procedimientos
de hibridación de ADN/ADN que se realizan en copias clonadas del
ADNc que se han desnaturalizado en una forma monocatenaria (Jay,
et al., Nucl. Acid. Res., 11:2325, 1983).
En una biblioteca de expresión de ADNc, tal como
lambda gt11, pueden seleccionarse indirectamente péptidos
GDF-11 con al menos un epítopo, usando anticuerpos
específicos para GDF-11. Tales anticuerpos pueden
obtenerse policlonal o monoclonalmente y usarse para detectar el
producto de expresión indicativo de la presencia del ADNc de
GDF-11.
Pueden expresarse secuencias de ADN que codifican
GDF-11 in vitro por transferencia de ADN al
interior de una célula hospedadora adecuada. Las "células
hospedadoras" son células en las que puede propagarse un vector y
en las que puede expresarse su ADN. La expresión también incluye
cualquier progenie de la célula hospedadora en cuestión. Se entiende
que toda la progenie puede no ser idéntica a la célula parental, ya
que puede haber mutaciones que se producen durante la replicación.
Sin embargo, cuando se usa la expresión "célula hospedadora" se
incluye tal progenie. En la técnica se conocen métodos de
transferencia estable, lo que significa que el ADN extraño se
mantiene de forma continuada en el hospedador.
En la presente invención, las secuencias
polinucleotídicas de GDF-11 pueden insertarse en un
vector de expresión recombinante. La expresión "vector de
expresión recombinante" se refiere a un plásmido, virus u otro
vehículo conocido en la técnica que se haya manipulado por inserción
o incorporación de las secuencias genéticas de
GDF-11. Tales vectores de expresión contienen una
secuencia promotora que facilita la transcripción eficaz de la
secuencia genética insertada del hospedador. El vector de expresión
típicamente contiene un origen de replicación, un promotor, así como
genes específicos que permiten la selección fenotípica de las
células transformadas. Los vectores adecuados para uso en la
presente invención incluyen, pero sin limitación, el vector de
expresión basado en T7 para la expresión en bacterias (Rosenberg,
et al., Gene, 56:125, 1987), el vector de expresión
pMSXND para la expresión en células de mamífero (Lee y Nathans, J.
Biol. Chem., 263:3521, 1988) y vectores derivados de
baculovirus para la expresión en células de insectos. El segmento de
ADN puede estar presente en el vector unido operativamente a
elementos reguladores, por ejemplo, un promotor, (por ejemplo, los
promotores de T7, metalotioneína I o polihedrina).
Las secuencias polinucleotídicas que codifican
GDF-11 pueden expresarse en procariotas o
eucariotas. Los hospedadores pueden incluir organismos microbianos,
levaduras, insectos y mamíferos. En la técnica son bien conocidos
los métodos de expresión de secuencias de ADN que tienen secuencias
eucariotas o virales en procariotas. En la técnica se conocen
vectores de ADN plasmídico y viral biológicamente funcionales
capaces de expresarse y replicarse en un hospedador. Tales vectores
se usan para incorporar secuencias de ADN de la invención.
Preferiblemente, la región C-terminal madura de
GDF-11 se expresa a partir de un clon de ADNc que
contiene la secuencia codificante entera de GDF-11.
Como alternativa, la porción C-terminal de
GDF-11 puede expresarse como una proteína de fusión
con la región pro de otro miembro de la familia de
TGF-\beta o co-expresarse con otra
región pro (véase, por ejemplo, Hammonds, et al., Molec.
Endocrin. 5: 149, 1991; Gray, A., y Mason, A., Science,
247:1328, 1990).
La transformación de una célula hospedadora con
ADN recombinante puede realizarse por técnicas convencionales que
son bien conocidas para los especialistas en la técnica. Cuando el
hospedador es procariota, tal como E. coli, pueden prepararse
células competentes capaces de absorber ADN a partir de células
recogidas después de una fase de crecimiento exponencial y
posteriormente pueden tratarse por el método de CaCl_{2} usando
procedimientos bien conocidos en la técnica. Como alternativa,
pueden usarse MgCl_{2} o RbCl. Si se desea, la transformación
también puede realizarse después de formar un protoplasto de la
célula hospedadora.
Cuando el hospedador es un eucariota, pueden
usarse métodos de transfección de ADN tales como
co-precipitados de fosfato cálcico, procedimientos
mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación,
inserción de un plásmido encerrado en liposomas, o vectores virales.
Las células eucariotas también pueden cotransformarse con secuencias
de ADN que codifiquen el GDF-11 de la invención, y
una segunda molécula de ADN extraña que codifique un fenotipo
selectivo, tal como el gen de la timidina quinasa del herpes simple.
Otro método es el uso de un vector eucariota viral, tal como el
virus simiano 40 (SV40) o el virus del papiloma bovino, para
infectar o transformar transitoriamente células eucariotas y
expresar la proteína. (Véase, por ejemplo, Eukaryotic Viral Vectors,
Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982).
El aislamiento y la purificación del polipéptido
microbiano expresado o de fragmentos del mismo proporcionados por la
invención, pueden realizarse por medios convencionales que incluyen
cromatografía preparativa y separaciones inmunológicas que implican
anticuerpos monoclonales o policlonales.
Los polipéptidos de GDF-11 de la
invención se pueden emplear también para producir anticuerpos que
son inmunoreactivos o se unen a epitopos de los polipéptidos de
GDF-11. Se proporcionan un anticuerpo que consiste
esencialmente en anticuerpos monoclonales reunidos con distintas
especificidades epitópicas, así como preparados de distintos
anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se producen a
partir de fragmentos de la proteína que contiene antígeno por
métodos bien conocidos en la técnica (Kohler, et al.,
Nature, 256:495, 1975; Current Protocols in Molecular
Biology, Ausubel, et al., ed., 1989).
El término "anticuerpo" tal y como se emplea
en esta invención incluye moléculas intactas así como fragmentos de
las mismas, tales como Fab, F(ab')_{2} y Fv que son capaces
de unir el determinante epitópico. Estos fragmentos de anticuerpo
conservan cierta capacidad para unirse selectivamente con su
antígeno o receptor y se definen como sigue:
- (1)
- Fab, el fragmento que contiene un fragmento monovalente de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo se producir por digestión del anticuerpo entero con la enzima papaína para obtener una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada;
- (2)
- Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo se puede obtener tratando el anticuerpo entero con pepsina, seguido por reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo;
- (3)
- (Fab')_{2}, el fragmento del anticuerpo que puede obtenerse tratando el anticuerpo entero con la enzima pepsina sin posterior reducción; F(ab')_{2} es un dímero de dos fragmentos Fab' mantenidos juntos por dos enlaces disulfuro;
- (4)
- Fv, definido como un fragmento construido genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresadas como dos cadenas; y
- (5)
- Anticuerpo de una sola cadena ("SCA"), definido como una molécula construida genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera, la región variable de la cadena pesada, ligadas por un polipéptido ligador adecuado como una molécula de una sola cadena genéticamente fusionada.
Los métodos de preparación de estos fragmentos
son conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Harlow and Lane,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New
York (1988), incorporado aquí solo con fines de referencia).
Tal como se emplea en esta invención, el término
"epitopo" significa cualquier determinante antigénico o un
antígeno al cual se une el paratopo de un anticuerpo. Los
determinantes epitópicos consisten normalmente en agrupaciones
superficiales de moléculas químicamente activas, tales como
aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y generalmente presentan
características estructurales tridimensionales específicas, así como
características de carga también específicas.
Los anticuerpos que se unen al polipéptido de
GDF-11 de la invención se pueden preparar empleando
un polipéptido intacto o fragmentos que contienen pequeños péptidos
de interés como el antígeno inmunizante. El polipéptido o un péptido
utilizado para inmunizar un animal se puede obtener a partir de ADNc
traducido o por medio de síntesis química que se puede conjugar a
una proteína de soporte, si se desea. Tales soportes comúnmente
utilizados y que son acoplados químicamente al péptido, incluyen
hemocianina de lapa (KLH), tiroglobulina, albúmina de suero bovino
(BSA) y toxoide de tétano. El péptido acoplado se emplea entonces
para inmunizar el animal (por ejemplo, un ratón, una rata o un
conejo).
Si se desea, los anticuerpos policlonales o
monoclonales pueden ser purificados adicionalmente, por ejemplo, por
unión a y elución a partir de una matriz a la que se une el
polipéptido o péptido para el cual se promovieron los anticuerpos.
Los expertos en la materia conocerán diversas técnicas comunes en el
campo de la inmunología para la purificación y/o concentración de
anticuerpos policlonales, así como anticuerpos monoclonales (véase,
por ejemplo, Coligan, et al., Unit 9, Current Protocols in
Immunology, Wiley Interscience, 1991, incorporado aquí solo con
fines de referencia.
También es posible utilizar la tecnología del
anti-idiotipo para producir anticuerpos monoclonales
que imitan a un epitopo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal
anti-idiotípico preparado a un primer anticuerpo
monoclonal tendrá un dominio de unión en la región hipervariable que
es la "imagen" del epitopo unido por el primer anticuerpo
monoclonal.
La expresión "trastorno de la proliferación de
células" se refiere a poblaciones de células malignas así como no
malignas que a menudo parecen diferenciarse del tejido circundante
tanto morfológica como genotípicamente. Las células malignas (es
decir, el cáncer) se desarrollan como resultado de un proceso de
múltiples etapas. El polinucleótido GDF-11 que es
una molécula antisentido es útil en el tratamiento de malignidades
de diversos sistemas de órganos, particularmente, por ejemplo, de
células del músculo o del tejido adiposo. Esencialmente, cualquier
trastorno que esté etiológicamente asociado a una expresión alterada
de GDF-11 podría considerarse susceptible de
tratamiento con un reactivo supresor de GDF-11. Uno
de tales trastornos es, por ejemplo, un trastorno proliferativo de
células
malignas.
malignas.
La invención proporciona un método in
vitro para detectar un trastorno de la proliferación de células
del tejido muscular o adiposo que comprende poner en contacto un
anticuerpo anti-GDF-11 con una
célula que se sospecha que tiene un trastorno asociado con
GDF-11 y detectar la unión al anticuerpo. El
anticuerpo reactivo con GDF-11 se marca con un
compuesto que permite la detección de la unión a
GDF-11. Para los fines de la invención, puede usarse
un anticuerpo específico para el polipéptido GDF-11
para detectar el nivel de GDF-11 en fluidos
biológicos y tejidos. Puede usarse cualquier muestra que contenga
una cantidad detectable de antígeno. Una muestra preferida de esta
invención es el tejido muscular. El nivel de GDF-11
en las células sospechosas puede compararse con el nivel en una
célula normal para determinar si el sujeto tiene un trastorno de la
proliferación celular asociado con GDF-11.
Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.
Los anticuerpos de la invención pueden usarse en
cualquier sujeto en el que sea deseable administrar inmunodiagnosis
o inmunoterapia in vitro o in vivo. Los anticuerpos de
la invención son adecuados para uso, por ejemplo, en inmunoensayos
en los que pueden utilizarse en fase líquida o unidos a un soporte
en fase sólida. Además, en estos inmunoensayos los anticuerpos
pueden marcarse de forma detectable de diversas formas. Los ejemplos
de tipos de inmunoensayos que pueden utilizar anticuerpos de la
invención son inmunoensayos competitivos y no competitivos en un
formato directo o indirecto. Son ejemplos de tales inmunoensayos el
radioinmunoensayo (RIA) y el ensayo de sándwich (inmunométrico). La
detección de los antígenos usando los anticuerpos de la invención
puede realizarse utilizando inmunoensayos que se realizan en modos
de avance, inverso o simultáneo, incluyendo ensayos
inmunohistoquímicos en muestras fisiológicas. Los especialistas en
la técnica conocerán, o pueden averiguar fácilmente, otros formatos
de inmunoensayo sin una experimentación indebida.
Los anticuerpos de la invención puede unirse a
muchos soportes diferentes y usarse para detectar la presencia de un
antígeno que comprende el polipéptido de la invención. Los ejemplos
de soportes bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno,
polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas
naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La
naturaleza del soporte puede ser soluble o insoluble para los fines
de la invención. Los especialistas en la técnica conocerán otros
soportes adecuados para unir anticuerpos, o podrán determinarlos
usando una experimentación rutinaria.
Hay muchos marcadores diferentes y métodos de
marcaje conocidos para los especialistas habituales en la técnica.
Los ejemplos de los tipos de marcadores que pueden usarse en la
presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos
fluorescentes, metales coloidales, compuestos quimioluminiscentes,
compuestos fosforescentes y compuestos bioluminiscentes. Los
especialistas habituales en la técnica conocerán otros marcadores
adecuados para la unión al anticuerpo, o podrán determinarlos usando
una experimentación rutinaria.
Otra técnica que también puede producir una mayor
sensibilidad consta del acoplamiento de los anticuerpos haptenos de
bajo peso molecular. Estos haptenos después pueden detectarse
específicamente por medio de una segunda reacción. Por ejemplo, es
común usar haptenos tales como biotina, que reacciona con avidina, o
dinitrofenilo, puridoxal y fluoresceína, que puede reaccionar con
anticuerpos anti-hapteno específicos.
En el uso de los anticuerpos monoclonales de la
invención para la detección in vivo del antígeno, el
anticuerpo marcado de forma detectable recibe una dosis que es
eficaz desde el punto de vista diagnóstico. La expresión "eficaz
desde el punto de vista diagnóstico" significa que la cantidad de
anticuerpo monoclonal marcado de forma detectable se administra en
una cantidad suficiente como para permitir la detección del sitio
que tiene el antígeno que comprende un polipéptido de la invención
para el que son específicos los anticuerpos monoclonales.
La concentración de anticuerpo monoclonal marcado
de forma detectable que se administra debe ser suficiente de tal
forma que la unión a las células que tienen el polipéptido sea
detectable en comparación con el nivel de fondo. Además, es deseable
que el anticuerpo monoclonal marcado de forma detectable se retire
rápidamente del sistema circulatorio para proporcionar la mejor
relación entre la señal diana y la señal de fondo.
En general, la dosificación del anticuerpo
monoclonal marcado de forma detectable para la diagnosis in
vivo variará dependiendo de factores tales como la edad, el sexo
y el grado de enfermedad del individuo. Tales dosificaciones pueden
variar, por ejemplo, dependiendo de si se administran múltiples
inyecciones, de la carga antigénica y de otros factores conocidos
por los especialistas en la técnica.
Para la formación de imágenes de diagnóstico
in vivo, el tipo de instrumento de detección disponible es un
factor importante en la selección de un radioisótopo dado. El
radioisótopo elegido debe tener un tipo de desintegración que sea
detectable para un tipo de instrumento dado. Otro factor importante
en la selección de un radioisótopo para la diagnosis in vivo
es que se minimice la radiación perjudicial con respecto al
hospedador. Idealmente, un radioisótopo usado para la formación de
imágenes in vivo carecerá de emisión de partículas, pero
producirá un gran número de fotones en el intervalo de
140-250 keV, que puede detectarse fácilmente por
cámaras gamma convencionales.
En el caso de los radioisótopos de diagnosis
in vivo, pueden unirse a inmunoglobulinas directa o
indirectamente por medio del uso de un grupo funcional intermedio.
Los grupos funcionales intermedios que a menudo se usan para unir
radioisótopos que existen como iones metálicos a inmunoglobulinas
son agentes quelantes bifuncionales tales como el ácido
dietilentriaminopentaacético (DTPA) y el ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA), y moléculas similares. Son
ejemplos típicos de iones metálicos que pueden unirse a los
anticuerpos monoclonales de la invención ^{111}In, ^{97}Ru,
^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{72}As, ^{89}Zr y ^{201}Tl.
Los anticuerpos monoclonales de la invención
también pueden marcarse con un isótopo paramagnético para fines de
diagnosis in vivo, como en la formación de imágenes de
resonancia magnética (MRI) o resonancia del espín electrónico (ESR).
En general, puede utilizarse cualquier método convencional para
visualizar imágenes de diagnóstico. Normalmente se usan
radioisótopos de emisión gamma y de positrones para la formación de
imágenes con una cámara e isótopos paramagnéticos para MRI. Los
elementos que son particularmente útiles en tales técnicas incluyen
^{157}Gd, ^{55}Mn, ^{162}Dy, ^{52}Cr y ^{56}Fe.
Los anticuerpos monoclonales de la invención
pueden usarse in vitro e in vivo para controlar el
curso de la mejora de una enfermedad asociada con
GDF-11 en un sujeto. De esta manera, por ejemplo,
midiendo el aumento o la reducción en el número de células que
expresan el antígeno que comprende un polipéptido de la invención o
los cambios de la concentración de tal antígeno presente en diversos
fluidos corporales, sería posible determinar si un régimen
terapéutico particular destinado a mejorar la enfermedad asociada
con GDF-11 es eficaz. La expresión "mejorar"
se refiere a una reducción del efecto perjudicial de la enfermedad
asociada con GDF-11 en el sujeto que recibe
la
terapia.
terapia.
La presente invención identifica una secuencia de
nucleótidos que puede expresarse de una manera alterada en
comparación con la expresión en una célula normal, por lo tanto, es
posible diseñar técnicas terapéuticas o de diagnóstico apropiadas
dirigidas a esta secuencia. De esta manera, cuando un trastorno de
la proliferación celular está asociado con la expresión de
GDF-11, pueden usarse secuencias de ácido nucleico
que interfieren con la expresión de
GDF-11 a nivel de la traducción. Esta estrategia utiliza, por ejemplo, un ácido nucleico antisentido y ribozimas para bloquear la traducción de un ARNm de GDF-11 específico, enmascarando ese ARNm con un ácido nucleico antisentido o escindiéndolo con una ribozima. Tales trastornos incluyen, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas.
GDF-11 a nivel de la traducción. Esta estrategia utiliza, por ejemplo, un ácido nucleico antisentido y ribozimas para bloquear la traducción de un ARNm de GDF-11 específico, enmascarando ese ARNm con un ácido nucleico antisentido o escindiéndolo con una ribozima. Tales trastornos incluyen, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas.
Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas de
ADN o ARN que son complementarias a al menos una porción de una
molécula de ARNm específica (Weintraub, Scientific American,
262:40, 1990). En la célula, los ácidos nucleicos antisentido
hibridan con el ARNm correspondiente, formando una molécula
bicatenaria. Los ácidos nucleicos antisentido interfieren con la
traducción del ARNm, ya que la célula no traducirá un ARNm que sea
bicatenario. Se prefieren los oligómeros antisentido de
aproximadamente 15 nucleótidos, ya que se sintetizan fácilmente y es
menos probable que produzcan problemas que las moléculas mayores
cuando se introducen en la célula productora de
GDF-11 diana. El uso de métodos antisentido para inhibir la traducción in vitro de genes es bien conocido en la técnica (Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988).
GDF-11 diana. El uso de métodos antisentido para inhibir la traducción in vitro de genes es bien conocido en la técnica (Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988).
Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la
capacidad de escindir específicamente otro ARN monocatenario de una
manera análoga a las endonucleasas de restricción de ADN. Por medio
de la modificación de secuencias de nucleótidos que codifican estos
ARN, es posible obtener por ingeniería genética moléculas que
reconozcan secuencias de nucleótidos específicas en una molécula de
ARN y que la escindan (Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030,
1988). Una ventaja principal de esta estrategia es que, como son
específicos de secuencia, sólo se inactivan los ARNm con secuencias
particulares.
Hay dos tipos básicos de ribozimas,
particularmente de tipo Tetrahymena (Hasselhoff, Nature,
334:585, 1988) y de tipo de "cabeza de martillo". Las
ribozimas de tipo Tetrahymena reconocen secuencias que tienen una
longitud de cuatro bases, mientras que las ribozimas de tipo de
"cabeza de martillo" reconocen secuencias de
11-18 bases de longitud. Cuanto mayor sea la
secuencia de reconocimiento, mayor probabilidad habrá de que la
secuencia aparezca exclusivamente en las especies de ARNm diana. Por
consiguiente, las ribozimas de tipo de cabeza de martillo son
preferibles a las ribozimas de tipo Tetrahymena para inactivar una
especie de ARNm específica y las secuencias de reconocimiento de 18
bases son preferibles a las secuencias de reconocimiento más
cortas.
El polinucleótido antisentido de
GDF-11 se puede introducir en células que tienen un
trastorno de la proliferación celular muscular mediado por la
proteína GDF-11. El suministro del polinucleótido
GDF-11 antisentido puede conseguirse usando un
vector de expresión recombinante tal como un virus quimérico o un
sistema de dispersión coloidal. Es especialmente preferido para el
suministro terapéutico de secuencias antisentido el uso de liposomas
dirigidos.
Los diversos vectores virales que pueden
utilizarse para la terapia génica como se enseña en este documento
incluyen adenovirus, virus del herpes, vaccinia o, preferiblemente,
un virus de ARN tal como un retrovirus. Preferiblemente, el vector
retroviral es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Los
ejemplos de vectores retrovirales en los que puede insertarse un
solo gen extraño incluyen, pero sin limitación: el virus de la
leucemia murina de Moloney (MoMuLV), el virus del sarcoma murino de
Harvey (HaMuSV), el virus del tumor mamario murino (MuMTV), y el
Virus del Sarcoma de Rous (RSV). Otros vectores retrovirales
adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores
pueden transferir o incorporar un gen para un marcador selectivo de
forma que puedan identificarse y generarse células transducidas. Por
medio de la inserción de una secuencia de GDF-11 de
interés en el vector viral, junto con otro gen que codifica el
ligando para un receptor en una célula diana específica, por
ejemplo, el vector adquiere especificidad de diana. Los vectores
retrovirales pueden adquirir especificidad de diana por medio de la
unión, por ejemplo, de un azúcar, un glicolípido o una proteína. La
dirección preferida se consigue usando un anticuerpo para dirigir el
vector retroviral. Los especialistas en la técnica conocerán o
podrán averiguar fácilmente sin experimentación indebida secuencias
polinucleotídicas específicas que pueden insertarse en el genoma
retroviral o unirse a una envuelta viral para permitir el
suministro con especificidad de diana del vector retroviral que
contiene el polinucleótido
GDF-11 antisentido.
GDF-11 antisentido.
Como los retrovirus recombinantes son
defectuosos, requieren ayuda para producir partículas de vector
infecciosas. Esta ayuda puede proporcionarse, por ejemplo, por medio
del uso de líneas de células adyuvantes que contienen plásmidos que
codifican todos los genes estructurales del retrovirus bajo el
control de secuencias reguladoras dentro del LTR. Estos plásmidos
carecen de una secuencia de nucleótidos que permite que el mecanismo
de empaquetamiento reconozca un transcrito de ARN para la
encapsidación. Las líneas de células adyuvantes que tienen
deleciones de la señal de empaquetamiento incluyen, por ejemplo,
pero sin limitación, \psi2, PA317 y PA12. Estas líneas celulares
producen viriones vacíos, ya que no se empaqueta ningún genoma. Si
se introduce un vector retroviral en células en las que la señal de
empaquetamiento está intacta pero los genes estructurales se han
reemplazado por otros genes de interés, el vector puede empaquetarse
y puede producirse el virión del vector.
Como alternativa, pueden transferirse
directamente células NIH 3T3 u otras células de cultivo de tejidos
con plásmidos que codifican los genes estructurales retrovirales
gag, pol y en, por transfección convencional con fosfato cálcico.
Estas células después se transfectan con el plásmido del vector que
contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el
vector retroviral en el medio de cultivo.
Otro sistema de liberación dirigido para
polinucleótidos GDF-11 antisentido es un sistema de
dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidales incluyen
complejos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, perlas y
sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en
agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal
preferido de esta invención es un liposoma. Los liposomas son
vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de
liberación in vitro e in vivo. Se ha demostrado que
las vesículas unilamelares grandes (LUV), que varían en tamaño de
0,2 a 4,0 \mum, pueden encapsular un porcentaje substancial de un
tampón acuoso que contiene macromoléculas grandes. El ARN, el ADN y
los viriones intactos pueden encapsularse en el interior acuoso y
suministrarse a las células en una forma biológicamente activa
(Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981).
Además de las células de mamífero, se han usado liposomas para
suministrar polinucleótidos a células vegetales, a levaduras y a
células bacterianas. Para que un liposoma sea un vehículo de
transferencia génica eficaz, deben estar presentes las siguientes
características: (1) la encapsulación de los genes de interés a alta
eficacia aunque sin comprometer su actividad biológica; (2) la unión
preferente y substancial a una célula diana en comparación con
células no diana; (3) el suministro del contenido acuoso de la
vesícula al citoplasma de la célula diana a una alta eficacia; y (4)
la expresión correcta y eficaz de la información genética (Mannino,
et al., Biotechniques, 6:682, 1988).
La composición del liposoma normalmente es una
combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos con una
alta temperatura de transición de fase, normalmente en combinación
con esteroides, especialmente colesterol. También pueden usarse
otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de
los liposomas dependen del pH, de la intensidad iónica y de la
presencia de cationes divalentes.
Los ejemplos de lípidos útiles en la producción
de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como
fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina,
fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos.
Son particularmente útiles los diacilfosfatidilgliceroles, donde el
resto lipídico contiene de 14 a 18 átomos de carbono,
particularmente de 16 a 18 átomos de carbono, y está saturado. Los
fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo,
dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina.
La dirección de los liposomas puede clasificarse
basándose en factores anatómicos y mecánicos. La clasificación
anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, con
especificidad de órganos, con especificidad de células y con
especificidad de orgánulos. La dirección mecánica puede distinguirse
basándose en si es pasiva o activa. La dirección pasiva utiliza la
tendencia natural de los liposomas a distribuirse en células del
sistema reticuloendotelial (RES) en órganos que contienen capilares
sinusoidales. Por otra parte, la dirección activa implica la
alteración del liposoma por acoplamiento del liposoma a un ligando
específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido o
proteína, o cambiando la composición o el tamaño del liposoma para
conseguir la dirección a órganos y tipos celulares distintos de los
sitios de localización naturales.
La superficie del sistema de liberación dirigido
puede modificarse de una diversidad de formas. En el caso de un
sistema de liberación dirigido por liposomas, pueden incorporarse
grupos lipídicos en la bicapa lipídica del liposoma para mantener el
ligando de dirección en asociación estable con la bicapa liposomal.
Pueden usarse diversos grupos de unión para unir las cadenas
lipídicas al ligando de dirección.
Debido a la expresión de GDF-11
en tejido muscular, bazo, útero, timo y neural, hay una diversidad
de aplicaciones usando el polipéptido, polinucleótido y anticuerpos
de la invención, relacionadas con estos tejidos. Tales aplicaciones
incluyen el tratamiento de trastornos de la proliferación celular
que implican estos y otros tejidos, tales como el tejido neural.
Además, el GDF-11 puede ser útil en diversos
procedimientos de terapia génica.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero
no limitar la invención. Aunque son típicos de los que podrían
usarse, como alternativa pueden usarse otros procedimientos
conocidos por los especialistas en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para identificar nuevos miembros de la
superfamilia de TGF-\beta, se examinó una
biblioteca genómica murínica con una estringencia reducida empleando
una sonda de GDF-8 murínico (figura 8; nucleótidos
865-1234) que abarca la región codificadora de la
porción C-terminal de la proteína precursora de
GDF-8. La hibridación se realizó a 65º C (Lee, Mol.
Endocrinol., 4:1034, 1990) y el lavado final se realizó a la
misma temperatura en un tampón que contiene 0,5 M NaCl. Entre los
fagos de hibridación se encontraba uno que podía distinguirse del
fago que contiene GDF-8 en base a su menor
intensidad de hibridación a la sonda de GDF-8. El
análisis de la secuencia parcial de nucleótidos del inserto genómico
presente en este fago de débil hibridación demostró que este clon
contenía una secuencia altamente relacionada con
GDF-8 murínico pero distinta de la de este
último.
En la figura 1a se muestra una secuencia parcial
de nucleótidos del inserto genómico presente en este fago. La
secuencia contenía un marco de lectura abierta que se extiende desde
los nucleótidos 198 a 575 que muestra una homología importante a los
miembros conocidos de la superfamilia de TGF-\beta
(véase más adelante). Precediendo a esta secuencia se encontraba una
secuencia de consenso de empalme 3' precisamente en la misma
posición que el gen de GDF-8. Este nuevo miembro de
la familia de TGF-\beta recibió la designación de
GDF-11 (factor-11 de diferenciación
del crecimiento).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Para determinar el modelo de expresión de
GDF-11, se seleccionaron muestras de ARN preparadas
a partir de un diversidad de tejidos adultos por análisis de
Northern. El aislamiento de ARN y el análisis de Northern se
realizaron como se ha descrito previamente (Lee, S.J., Mol.
Endocrinol., 4:1034, 1990) con la excepción de que la
hibridación se realizó en 5X SSPE, sulfato de dextrano al 10%,
formamida al 50%, SDS al 1%, 200 \mug/ml de ADN de salmón y 0,1%
de cada uno de los siguientes: albúmina de suero bovino, ficoll y
polivinilpirrolidona. Se sometieron a electroforesis cinco
microgramos de ARN seleccionado con respecto a poli A dos veces
preparado a partir de cada tejido (excepto para cerebro neonatal de
2 días, para lo cual se emplearon solo 3,3 \mug de ARN) en geles
de formaldehído, se sometieron a inmunotransferencia y se sondaron
con GDF-11. Como se muestra en la figura 2, la sonda
de GDF-11 detectó dos especies de ARN, con una
longitud de aproximadamente 4,2 y 3,2 kb, en timo, cerebro, bazo,
útero y músculo, adultos, así como en embriones enteros aislados en
el día 12.5 o 18.5 y en muestras de cerebro tomadas en diversas
fases de desarrollo. Tras exposiciones más prolongadas de estas
transferencias, pudieron detectarse también niveles más bajos de ARN
de GDF-11 en un número de otros tejidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Con el fin de aislar clones de ADNc que codifican
GDF-11, se preparó una biblioteca de ADNc en el
vector lambda ZAP II (Stratagene) empleando ARN preparado a partir
de bazo de humano adulto. A partir de 5 mg de ARN dos veces poli A
seleccionado, preparado a partir de bazo humano, se construyó una
biblioteca de ADNc consistente en 21 millones de fagos recombinantes
de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por Stratagene. La
biblioteca fue examinada sin amplificación. El examen de la
biblioteca y la caracterización de insertos de ADNc se realizaron
en la forma anteriormente descrita (Lee, Mol. Endocrinol.,
4:1034, 1990). A partir de esta biblioteca, se obtuvieron 23
fagos hibridantes.
Se determinó la secuencia entera de nucleótidos
del clon que se extiende más lejos hacia el extremo 5' del gen. La
secuencia de 1.258 pares de bases contenía un marco de lectura
abierta único y prolongado que comienza desde el extremo 5' del clon
y se extiende hasta un codón de parada TAA. Debido a que el marco de
lectura abierta y la homología con GDF-8 (véase más
adelante) se extendían al mismo extremo 5' del clon, parecía
probable que este clon estaba ausente de la secuencia codificadora
correspondiente a la porción N-terminal de la
proteína precursora de GDF-11. Con el fin de
obtener la porción restante de la secuencia de
GDF-11, se aislaron varios clones genómicos mediante
examen de una biblioteca genómica humana con la sonda de ADNc de
GDF-11 humano. El análisis de la secuencia parcial
de uno de estos clones genómicos demostró que este clon contenía el
gen de GDF-11. A partir de este clon, se obtuvo el
resto de la secuencia codificadora de GDF-11. La
figura 1b muestra la secuencia pronosticada de
GDF-11 ensamblada a partir de las secuencias
genómicas y de ADNc. Los nucleótidos 136 a 1393 representan la
extensión de la secuencia obtenida a partir de un clon de ADNc. Los
nucleótidos 1 a 135 se obtuvieron a partir de un clon genómico. La
secuencia ha sido numerada arbitrariamente comenzando con un sitio
Sac II presente en el clon genómico, pero se desconoce la posición
del sitio de inicio de ARNm. La secuencia contiene una metionina
iniciadora putativa en el nucleótido 54. Se desconoce si la
secuencia aguas arriba de este codón de metionina está o no del todo
presente en el ARNm. Comenzando con este codón de metionina, el
marco de lectura abierta se extiende para los 407 aminoácidos. La
secuencia con tiene un sitio de glicosilación potencial
N-ligado en asparagina 94. La secuencia contiene un
sitio de escisión proteolítica RXXR pronosticado en los aminoácidos
295 a 298, y la escisión del precursor en este sitio generaría un
fragmento activo C-terminal de 109 aminoácidos de
longitud con un peso molecular pronosticado de
aproximadamente
12.500 kD. En esta región, las secuencias de aminoácidos de GDF-11 murínico y humano, pronosticadas, son 100% idénticas. El alto grado de conservación de la secuencia a través de la especie sugiere que el GDF-11 juega un importante papel in vivo.
12.500 kD. En esta región, las secuencias de aminoácidos de GDF-11 murínico y humano, pronosticadas, son 100% idénticas. El alto grado de conservación de la secuencia a través de la especie sugiere que el GDF-11 juega un importante papel in vivo.
La región C-terminal que sigue al
sitio de escisión pronosticado contiene todos los contrastes
presentes en otros miembros de la familia de
TGF-\beta. El GDF-11 contiene la
mayoría de los residuos que se encuentran altamente conservados en
otros miembros de la familia, incluyendo los siete residuos de
cisteína con su separación característica. Al igual que los
TGF-\beta's, las inhibina \beta's y el
GDF-8, el GDF-11 también contiene
dos residuos de cisteína adicionales. En el caso de
TGF-\beta2, se sabe que estos residuos de cisteína
adicionales forman un enlace disulfuro intramolecular (Daopin, et
al., Science, 257: 369, 1992; Schlunegger and Grutter,
Nature, 358:430, 1992). En la figura 3 se muestra una
tabla de las homologías de secuencias de aminoácidos entre
GDF-11 y los otros miembros de la familia de
TGF-\beta. Los números representan el porcentaje de identidades de aminoácidos entre cada par calculado desde la primera cisteína conservada hasta el terminal C. Las cajas representan homologías entre miembros altamente relacionados dentro de subgrupos particulares. En esta región, el GDF-11 está relacionado en un grado sumamente elevado con
GDF-8 (92% de identidad de secuencias.
TGF-\beta. Los números representan el porcentaje de identidades de aminoácidos entre cada par calculado desde la primera cisteína conservada hasta el terminal C. Las cajas representan homologías entre miembros altamente relacionados dentro de subgrupos particulares. En esta región, el GDF-11 está relacionado en un grado sumamente elevado con
GDF-8 (92% de identidad de secuencias.
En la figura 4 se muestra una alineación de
secuencias de aminoácidos de GDF-8 (SEQ ID NO:5) y
GDF-11 (SEQ ID NO:6). Las dos secuencias contienen
señales potenciales de glicosilación N-ligadas (NIS)
y sitios putativos de procesado proteolítico (RSRR) en posiciones
análogas. Las dos secuencias están relacionadas no solo en la
región
C-terminal que sigue al sitio putativo de escisión (90% de identidad de secuencias de aminoácidos), sino también en la pro-región de las moléculas (45% de identidad de secuencias de aminoácidos).
C-terminal que sigue al sitio putativo de escisión (90% de identidad de secuencias de aminoácidos), sino también en la pro-región de las moléculas (45% de identidad de secuencias de aminoácidos).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Con el fin de expresar proteína de
GDF-11, se construyó un gen híbrido en donde la
región N-terminal de
GDF-11 fue reemplazada por la región análoga de GDF-8. Dichos constructos híbridos han sido utilizados para producir BMP-4 biológicamente activa (Hammonds, et al., Mol. Endocrinol., 5:149, 1991) y Vg-1 (Thomsen and Melton, Cell, 74:433, 1993). Con el fin de asegurar que la proteína de GDF-11 producida a partir del constructor híbrido representaría GDF-11 auténtico, el gen híbrido se construyó de tal manera que la fusión de los dos fragmentos génicos ocurriera precisamente en los sitios de escisión pronosticados. En particular, está presente un sitio de restricción AvaII en ambas secuencias en la posición correspondiente al sitio de escisión proteolítica pronosticado. La pro-región
N-terminal de GDF-8 hasta este sitio AvaII se obtuvo por digestión parcial del clon con AvaII y se fusionó a la región C-terminal de GDF-11 comenzando en este sitio AvaII. El constructo híbrido resultante fue insertado entonces en el vector de expresión de mamífero pMSXND (Lee and Nathans, J. Biol. Chem., 263:3521) y transfectado en células de ovario de hámster chino. Como se muestra en la figura 5, en análisis Western de medio acondicionado a partir de células G418-resistentes empleando anticuerpos promovidos contra la porción C-terminal de GDF-8, demostró que estas células secretaban proteína de GDF-11 en el medio y que al menos parte de la proteína híbrida fue procesada proteolíticamente. Además, estos estudios demuestran que los anticuerpos dirigidos contra la porción C-terminal de GDF-8 reaccionaron también con la proteína de GDF-11.
GDF-11 fue reemplazada por la región análoga de GDF-8. Dichos constructos híbridos han sido utilizados para producir BMP-4 biológicamente activa (Hammonds, et al., Mol. Endocrinol., 5:149, 1991) y Vg-1 (Thomsen and Melton, Cell, 74:433, 1993). Con el fin de asegurar que la proteína de GDF-11 producida a partir del constructor híbrido representaría GDF-11 auténtico, el gen híbrido se construyó de tal manera que la fusión de los dos fragmentos génicos ocurriera precisamente en los sitios de escisión pronosticados. En particular, está presente un sitio de restricción AvaII en ambas secuencias en la posición correspondiente al sitio de escisión proteolítica pronosticado. La pro-región
N-terminal de GDF-8 hasta este sitio AvaII se obtuvo por digestión parcial del clon con AvaII y se fusionó a la región C-terminal de GDF-11 comenzando en este sitio AvaII. El constructo híbrido resultante fue insertado entonces en el vector de expresión de mamífero pMSXND (Lee and Nathans, J. Biol. Chem., 263:3521) y transfectado en células de ovario de hámster chino. Como se muestra en la figura 5, en análisis Western de medio acondicionado a partir de células G418-resistentes empleando anticuerpos promovidos contra la porción C-terminal de GDF-8, demostró que estas células secretaban proteína de GDF-11 en el medio y que al menos parte de la proteína híbrida fue procesada proteolíticamente. Además, estos estudios demuestran que los anticuerpos dirigidos contra la porción C-terminal de GDF-8 reaccionaron también con la proteína de GDF-11.
\newpage
Ejemplo
5
Para establecer la localización cromosómica del
GDF-11, se analizaron muestras de ADN de híbridos
de células somáticas de humano/roedor (Drwinga, et al.,
Genomics, 16:311-413, 1993; Dubois y Naylor,
Genomics, 16:315-319, 1993) por reacción en
cadena de la polimerasa seguido de transferencia de Southern. La
reacción en cadena de la polimerasa se realizó usando el cebador nº
101, 5'-GAGTCCCGCTGCTGCCGATATCC-3'
(SEC ID Nº 7) y el cebador nº 102,
5'-TAGAGCATGTTGATTGGGGACAT-3' (SEC
ID Nº 8) durante 35 ciclos a 94ºC durante 2 minutos, a 58ºC durante
1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto. Estos cebadores corresponden a
los nucleótidos 981 a 1003 y al componente inverso de los
nucleótidos 1182 a 1204, respectivamente, en la secuencia del
GDF-11 humano. Los productos de PCR se sometieron a
electroforesis en geles de agarosa, se sometieron a
inmunotransferencia y se sondearon con el oligonucleótido nº 104,
5'-AAATATCCGCATACCCATTT-3' (SEC ID
Nº 9), que corresponde a una secuencia interna a la región
flanqueada por el cebador nº 101 y nº 102. Los filtros se hibridaron
en 6 X SSC, 1 X solución de Denhardt, 100 mg/ml de ARN de
transferencia de levadura y pirofosfato sódico al 0,05% a 50ºC.
Como se muestra en la figura 6, la sonda con
especificidad humana detectó una banda del tamaño previsto
(aproximadamente 224 pares de bases) en la muestra de control
positivo (ADN genómico humano total) y en una sola muestra de ADN
del panel híbrido de humano/roedor. Esta señal positiva corresponde
al cromosoma 12 humano. El cromosoma humano contenido en cada una de
las líneas de células híbridas se identifica en la parte superior de
cada una de las primeras 24 calles (1-22, X e Y). En
las calles denominadas CHO, M y H, la plantilla de ADN de partida
era ADN genómico total procedente de hámster, ratón y humano,
respectivamente. En la calle marcada como B1, no se usó ninguna
plantilla de ADN. Los números de la izquierda indican las
movilidades de los patrones de ADN. Estos datos demuestran que el
gen GDF-11 humano está localizado en el cromosoma
12.
Con el fin de determinar la posición más precisa
de GDF-11 en el cromosoma 12, el gen de
GDF-11 fue localizado por hibridación por
fluorescencia in situ (FISH). Estos estudios de localización
FISH fueron realizados mediante contrato con BIOS laboratorios (New
Haven, Connecticut). ADN purificado procedente de un clon genómico
de
GDF-11 humano fue marcado con digoxigenina dUTP mediante traducción de muescas. La sonda marcada se combinó con ADN humano cortado e hibridada a cromosomas metafásicos normales derivados de linfocitos de sangre periférica estimulados con PHA en una solución que contiene 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano y 2xSSC. Se detectaron señales de hibridación específicas por incubación de las platinas hibridadas en anticuerpos de oveja anti-digoxigenina conjugados con fluoresceína. Las platinas fueron entonces contra-manchadas con yoduro de propidio y analizadas. Como se muestra en la figura 7a, el experimento se tradujo en el marcado específico del brazo largo proximal de un cromosoma del grupo C, cuyo tamaño y morfología estaban de acuerdo con el cromosoma 12. Con el fin de confirmar la identidad del cromosoma marcado de forma específica, se realizó un segundo experimento en donde una sonda de centrómero específica al cromosoma 12 fue co-hibridada con GDF-11. Como se muestra en la figura 7b, este experimento demostró de forma clara que el GDF-11 está localizado en una posición que se encuentra al 23% de la distancia desde el centrómero al telómero del brazo largo del cromosoma 12, un área que corresponde a la banda 12q13 (figura 7c). Se analizó un total de 85 células metafísicas y 80 exhibieron un marcado específico.
GDF-11 humano fue marcado con digoxigenina dUTP mediante traducción de muescas. La sonda marcada se combinó con ADN humano cortado e hibridada a cromosomas metafásicos normales derivados de linfocitos de sangre periférica estimulados con PHA en una solución que contiene 50% de formamida, 10% de sulfato de dextrano y 2xSSC. Se detectaron señales de hibridación específicas por incubación de las platinas hibridadas en anticuerpos de oveja anti-digoxigenina conjugados con fluoresceína. Las platinas fueron entonces contra-manchadas con yoduro de propidio y analizadas. Como se muestra en la figura 7a, el experimento se tradujo en el marcado específico del brazo largo proximal de un cromosoma del grupo C, cuyo tamaño y morfología estaban de acuerdo con el cromosoma 12. Con el fin de confirmar la identidad del cromosoma marcado de forma específica, se realizó un segundo experimento en donde una sonda de centrómero específica al cromosoma 12 fue co-hibridada con GDF-11. Como se muestra en la figura 7b, este experimento demostró de forma clara que el GDF-11 está localizado en una posición que se encuentra al 23% de la distancia desde el centrómero al telómero del brazo largo del cromosoma 12, un área que corresponde a la banda 12q13 (figura 7c). Se analizó un total de 85 células metafísicas y 80 exhibieron un marcado específico.
(1) INFORMACION GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: The Johns Hopkins University School of Medicine
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCION: FACTOR-11 DE DIFERENCIACION DEL CRECIMIENTO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Fish & Richardson P. C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4225 Executive Square, Suite 1400
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: La Jolla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL: 92037
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release Nº. 1.0, Versión Nº. 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: PCT/US95/
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACION: 7 Julio 1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACION:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACION DEL AGENTE/MANDATARIO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: HAILE, PH.D., LISA A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NUMERO DE REGISTRO: 38.347
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 07265/036WO1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACION DE TELECOMUNICACION:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELEFONO: 619/678-5070
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: 619/678/5099
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1393 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: GDF-11 HUMANO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICION: 54..1274
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 407 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 630 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: GDF-11 DE RATON
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICION: 198...575
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 126 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 375 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: GDF-8
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICION: 1..375
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 407 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: GDF-11
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICION: 1..407
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICION: 1..23
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGTCCCGCT GCTGCCGATA TCC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICION: 1..23
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGAGCATGT TGATTGGGGA CAT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICION: 1..20
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAATATCCGC ATACCCATTT
\hfill20
Claims (27)
1. Un polinucleótido aislado o recombinante que
codifica un polipéptido del factor-11 de
diferenciación del crecimiento celular (GDF-11), en
donde el polinucleótido comprende:
- (a)
- la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1, en donde T puede ser también U;
- (b)
- los nucleótidos 1 a 135 de SEQ ID NO:1, en donde T puede ser también U;
- (c)
- una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEQ ID NO:2; o
- (d)
- una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1, en donde T puede ser también U.
2. La secuencia de polinucleótidos según la
reivindicación 1, en donde el polinucleótido se aisla de una célula
de mamífero.
3. El polinucleótido según la reivindicación 2,
en donde la célula de mamífero se elige del grupo consistente en
células de ratón, rata y seres humanos.
4. Un vector de expresión que incluye el
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. El vector según la reivindicación 4, en donde
el vector es un plásmido o un virus.
6. Una célula hospedadora transformada de forma
estable con el vector según la reivindicación 4 o 5.
7. La célula hospedadora según la reivindicación
6, en donde la célula es procariótica o eucariótica.
8. Un método para la producción de polipéptido
de GDF-11 que comprende cultivar la célula
hospedadora según la reivindicación 6 o 7 bajo condiciones adecuadas
y recuperar el polipéptido expresado.
9. Un polipéptido de GDF-11
codificado por un polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 o producido por el método de la
reivindicación 8.
10. Anticuerpos que se unen selectivamente al
polipéptido según la reivindicación 9 o fragmentos del mismo que se
unen a antígenos.
11. Los anticuerpos según la reivindicación 10,
en donde los anticuerpos son policlonales o monoclonales.
12. Una composición farmacéutica que comprende el
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el
vector según la reivindicación 4 o 5, el polipéptido según la
reivindicación 9 y/o el anticuerpo según la reivindicación 10 u 11,
y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Una composición de diagnóstico que comprende
el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el
vector según la reivindicación 4 o 5, el polipéptido según la
reivindicación 9 y/o el anticuerpo según la reivindicación 10 u 11,
y opcionalmente un medio de detección adecuado.
14. Un método in vitro para detectar un
trastorno proliferativo de células musculares asociado con la
expresión de GDF-11, que comprende poner en contacto
el anticuerpo según la reivindicación 10 u 11 con una muestra de un
sujeto del que se sospecha que tiene un trastorno asociado con
GDF-11; y detectar la unión del anticuerpo.
15. Uso del anticuerpo según la reivindicación 10
u 11 en la preparación de una composición de diagnóstico para
detectar un trastorno proliferativo de células musculares asociado
con la expresión de GDF-11.
16. El método según la reivindicación 14 o el
uso según la reivindicación 15, en donde el anticuerpo es marcado de
forma detectable.
17. El método o el uso según la reivindicación
16, en donde el marcador detectable se elige del grupo consistente
en un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto
bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente y una enzima.
18. Uso de un anticuerpo según la reivindicación
10 u 11 o de un polinucleótido según la reivindicación 1, 2 o 3 que
suprime la actividad de GDF-11 en la preparación de
una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno
proliferativo de células musculares asociado con la expresión de
GDF-11.
19. El uso según la reivindicación 18, en donde
el polinucleótido ha sido introducido en una célula empleando un
vector.
20. El uso según la reivindicación 19, en donde
el vector es un sistema de dispersión coloidal.
21. El uso según la reivindicación 20, en donde
el sistema de dispersión coloidal es un liposoma.
22. El uso según la reivindicación 21, en donde
el liposoma está acoplado a una mitad seleccionada del grupo
consistente en un azúcar, un glicolípido y una proteína.
23. El uso según la reivindicación 19, en donde
el vector es un virus.
24. El uso según la reivindicación 23, en donde
el virus es un virus de ARN.
25. El uso según la reivindicación 24, en donde
el virus de ARN es un retrovirus.
26. El uso según la reivindicación 25, en donde
el retrovirus comprende además un polinucleótido insertado en el
genoma retrovírico o una mitad seleccionada del grupo consistente en
un azúcar, un glicolípido y una proteína.
27. El uso según la reivindicación 22 o 26, en
donde la proteína es un anticuerpo.
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