JPH09508001A

JPH09508001A - 増殖分化因子−９

Info

Publication number: JPH09508001A
Application number: JP6516384A
Authority: JP
Inventors: リー，セ−ジン
Original assignee: ジョーンズホプキンスユニバーシティースクールオブメディシン
Priority date: 1993-01-12
Filing date: 1994-01-12
Publication date: 1997-08-19
Anticipated expiration: 2018-12-22
Also published as: JP2004091466A; CA2153653C; CA2153653A1; US20040152143A1; WO1994015966A1; EP0678101A1; US20020127612A1; US6365402B1; JP3482207B2; EP0678101A4

Abstract

(57)【要約】増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）をそのポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列とともに開示する。ＧＤＦ−９ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を使用する診断および治療方法も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】増殖分化因子−９発明の背景１．発明の分野本発明は、一般的には増殖因子に関するものであり、特定的には形質転換増殖因子−β（transforming growth factor−β：ＴＧＦ−β）スーパーファミリーの新メンバーである増殖分化因子−９（growth differentiation factor-3：ＧＤＦ−９）に係わるものである。２．関連技術分野の説明形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、胚発生中の広範な分化過程に影響を及ぼす、構造的に関連したタンパク質の一群を包含する。このファミリーには、正常な雄性発達に必要とされるミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）(Behringerら，Nature，345:167，1990)；背−腹軸の形成および成虫原基の形態形成に必要とされるショウジョウバエのデカペンタプレジック（ＤＰＰ）遺伝子産物(Padgettら，Nature，325:81-84,1987)；卵の植物極に局在するツメガエルＶｇ−１遺伝子産物（Weeksら，Cell，51:861-867，1987）；ツメガエル胚における中胚葉および前方構造の形成を誘導し得る（Thomsenら，Cell，63:485，1 990）アクチビン類(Masonら，Biochem．Biophys．Res．Commun.，135:957-964， 1986)；および新たな軟骨および骨の形成を誘導し得る（Sampathら，J．Biol．Chem.，265:13198，1990）骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ、オステオゲニン、ＯＰ−１）が含まれる。ＴＧＦ−βは、脂質生成、筋発生、軟骨形成、造血および上皮細胞分化を含めて、さまざまな分化過程に影響を与えることができる（再検討のため、Massague，Cell，49:437 ，1987を参照のこと）。ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質は、最初に大きな前駆体タンパク質として合成され、その後前駆体タンパク質はＣ末端側の約１１０〜１４０個のアミノ酸から成る塩基性残基のクラスターで加水分解切断を受ける。これらのタンパク質のＣ末端領域はどれも構造的に関連しており、その相同度に基づいて、それぞれのファミリーメンバーを別個のサブグループに分類することができる。特定のサブグループ内の相同性は７０〜９０％アミノ酸配列同一性の範囲であるが、サブグループ間の相同性は著しく低く、一般的にはせいぜい２０〜５０％の範囲である。いずれの場合も、活性種はＣ末端フラグメントのジスルフィド架橋二量体であると考えられる。これまでに研究された大半のファミリーメンバーでは、ホモ二量体種が生物学的に活性であるとされているが、インヒビン（Lingら，Nature ，321:779，1986）やＴＧＦ−β（Cheifetzら，Cell，48:409，1987）のような他のファミリーメンバーについてはヘテロ二量体も検出されており、これらはそれぞれのホモ二量体とは異なる生物学的性質をもつようである。インヒビン類およびアクチビン類は最初に卵胞液から精製されたもので、下垂体からの卵胞刺激ホルモンの放出に対して反対の作用を有することが分かっている。３種類すべてのインヒビン／アクチビンサブユニット（αａ、βＡおよびβＢ）のｍＲＮＡが卵巣で検出されているが、これらはどれも卵巣特異的ではないようである（Meunierら，Proc．N atl．Acad．Sci．USA，85:247，1988）。ＭＩＳも顆粒膜細胞によって発現されることが判明しており、卵巣発達に及ぼすＭＩＳの効果がＭＩＳを異所的に発現するトランスジェニックマウスによりin vivoで（Behringer,前掲）、さらに器官培養によりin vitroで（Vigierら，Development，100:43，1987）論じられている。発現パターンが組織特異的である新規因子の同定は、その組織の発達および機能のより一層の理解をもたらすだろう。発明の概要本発明は、細胞増殖分化因子ＧＤＦ−９、該因子をコードするポリヌクレオチド配列、および該因子と免疫反応性である抗体を提供する。この因子は種々の細胞増殖性疾患、特に顆粒膜細胞腫のような卵巣の腫瘍を伴う疾患に関係があるようである。従って、１つの実施態様において、本発明は、ＧＤＦ−９と関係がある卵巣起源の細胞増殖性疾患を検出する方法を提供する。他の実施態様において、本発明は、ＧＤＦ−９活性を抑制または増強することにより、ＧＤＦ−９の異常な発現レベルと関係がある細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、成体組織におけるＧＤＦ−９ｍＲＮＡの発現を示す。図２は、マウスＧＤＦ−９のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。共通のＮ−グリコシル化シグナルを無地のボックスで示す。推定上の四塩基プロセシング部位を点刻ボックスで示す。推定上の開始ＡＴＧの上流にある同じ読み枠の終止コドンおよび共通のポリアデニレーションシグナルには下線が引いてある。ポリＡ尾部は示してない。数字は５’末端からのヌクレオチド位置を示す。図３は、ＧＤＦ−９のＣ末端配列とＴＧＦ−βファミリーの他のメンバーとの並列化を示す。保存されたシステイン残基には陰影が付けてある。ダッシュ（− ）は並列化を最大とするために導入されたギャップを表す。図４は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの各メンバー間のアミノ酸相同を示す。数字は最初の保存システインからＣ末端までで計算された各対間のアミノ酸同一性のパーセントを表す。ボックスは特定サブグループ内の密接に関連したメンバー間の相同性を表す。図５は、ＧＤＦ−９タンパク質の免疫組織化学的局在化を示す。成体卵巣の隣接切片をヘマトキシリンとエオシンで染色する（図５ａ）か、あるいは１：５００の希釈率で免疫血清（図５ｂ）または前免疫血清（図５ｃ）とともにインキュベートした。マウスＧＤＦ−９のＣ末端部分（残基３０８−４４１）をバクテリア内で発現させ、分離用ＳＤＳゲルからＧＤＦ−９タンパク質を切り出し、そしてウサギを免疫することにより抗ＧＤＦ−９抗血清を調製した。抗体結合部位は Vectastain ABCキット（Vector Labs)を使って可視化した。図６は、マウスＧＤＦ−９（上のライン）とヒトＧＤＦ−９（下のライン）の推定アミノ酸配列の比較を示す。数字はＮ末端からのアミノ酸位置を表す。垂線は配列同一性を表す。点は並列化を最大とするために導入されたギャップを表す。無地のボックスは推定上のタンパク質分解プロセシング部位を示す。陰影を付けたボックスはこのタンパク質の成熟領域にあるシステイン残基を示す。下部の棒線はＧＤＦ−９のプレ（無地）および成熟（陰影）領域の略図を示し、マウス配列とヒト配列間の配列同一性のパーセントを示してある。図７は、ＧＤＦ−９ＲＮＡプローブを用いた成体卵巣切片に対するin situ ハイブリダイゼーションを示す。４％パラホルムアルデヒドで固定した卵巣のパラフィン包埋した隣接切片に〔³⁵Ｓ〕標識したアンチセンス（図７ａおよび７ｃ）またはセンス（図７ｂおよび７ｄ）ＧＤＦ−９ＲＮＡプローブをハイブリダイズさせた。切片を写真乳剤中に浸し、露光し、現像した後にヘマトキシリンとエオシンで染色した。２つの代表的な視野像を示してある。図８は、アンチセンスＧＤＦ−９ＲＮＡプローブを用いた生後４日目の卵巣切片に対するin situハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に記載したように調製した。オートラジオグラフィーおよび染色後に、明視野（図８ａ）または暗視野（図８ｂ）照明の下で切片の写真を撮った。図９は、アンチセンス（図９ａ）またはセンス（図９ｂ）ＧＤＦ−９ＲＮＡプローブを用いた生後８日目の卵巣切片に対するin situハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に記載したように調製した。図10は、アンチセンス（図10ａ）またはセンス（図10ｂ）ＧＤＦ−９ＲＮＡプローブを用いた成体輸卵管切片に対するin situハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に記載したように調製した。図11は、アンチセンスＧＤＦ−９ＲＮＡプローブを用いた成体輸卵管（受精後０．５日）切片に対するin situハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に記載したように調製した。オートラジオグラフィーおよび染色後に、明視野（図11ａ）または暗視野（図11ｂ）照明の下で切片の写真を撮った。発明の詳細な説明本発明は、増殖分化因子ＧＤＦ−９ならびにＧＤＦ−９をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーと違って、ＧＤＦ−９の発現は非常に組織特異的で、主に卵巣組織の細胞において発現される。１つの実施態様において、本発明は、ＧＤＦ−９発現と関係がある卵巣の細胞増殖性疾患を検出する方法を提供する。他の実施態様において、本発明は、ＧＤＦ−９活性を抑制または増強する薬剤を使用することにより、ＧＤＦ−９の異常な発現と関係がある細胞増殖性疾患を治療する方法を提供する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーは多くの細胞型の増殖、分化、その他の機能を制御する多機能性ポリペプチドから成っている。かかるペプチドの多くは他のペプチド増殖因子に対してポジティブおよびネガティブの両方の調節作用を有する。本発明のＧＤＦ−９タンパク質とＴＧＦ−βファミリーのメンバー間の構造的相同性は、ＧＤＦ−９が増殖および分化因子のファミリーの新メンバーであることを示す。他の多くのメンバーのすでに知られた活性に基づくと、ＧＤＦ−９もまた診断薬や治療薬として有用であるような生物学的活性を有することが期待できる。例えば、ＴＧＦ−βとの構造的相同を有することが見いだされた別の調節タンパク質はインヒビンであるが、これはＦＳＨの下垂体分泌の特異的かつ強力なポリペプチド阻害物質である。インヒビンは卵巣の卵胞液から単離されている。ＦＳＨを抑制するために、インヒビンは雌雄両性の避妊薬としての使用可能性を有する。ＧＤＦ−９は、卵巣特異的ペプチドであるから、同様の生物学的活性をもつかもしれない。また、インヒビンはある種の卵巣腫瘍のマーカーとして有用であることが分かっている(Lappohnら，N．Engl．J．Med.，321:790，1989)。ＧＤＦ−９も卵巣起源の原発性および転移性新生物を確認するマーカーとして有用でありうる。同様に、ＧＤＦ−９は出生前スクリーニング法における発生異常の指示物質として役立つかもしれない。ＴＧＦ−βファミリーの他のペプチドには精巣で産生されるＭＩＳがあり、これは雄性胚においてミュラー管の退行現象に関与している。ＭＩＳはヌードマウスにおいてヒト卵巣癌の増殖を抑制することが分かった(Donahoeら，Ann．Surg. ，194:472，1981)。ＧＤＦ−９も同様に機能する可能性があり、それゆえ、抗癌剤として例えば卵巣癌の治療に有効であるかもしれない。ＧＤＦ−９はまた増殖促進因子としても機能することができ、それゆえにin v itroでの種々の細胞集団の生存に有用である可能性がある。特に、ＧＤＦ−９が卵成熟において何らかの役割を果たすのであれば、ＧＤＦ−９は試験管内受精法で、例えば成功率を上げるのに有用であるかもしれない。また、ＴＧＦ−βファミリーの他の多くのメンバーは組織修復の重要な媒介物質ともなる。ＴＧＦ−βはコラーゲンの形成に対して著しい影響を及ぼすことが知られており、新生マウスでは顕著な脈管形成応答を生じさせる(Robertsら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83:4167，1986)。ＧＤＦ−９も同様の活性を示して、例えば外傷や火傷による組織傷害の修復に有用であるかもしれない。本明細書中で用いる「実質的に純粋な」という用語は、他のタンパク質、脂質、炭水化物または自然界でＧＤＦ−９と結合している他の物質を実質的に含まないＧＤＦ−９を指す。当業者はタンパク質精製の標準的な技法を用いてＧＤＦ− ９を純化することが可能である。実質的に純粋なポリペプチドは非還元ポリアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドをもたらすだろう。ＧＤＦ−９ポリペプチドの純度はまた、アミノ末端のアミノ酸配列解析によって決定することができる。ＧＤＦ−９ポリペプチドは、ＧＤＦ−９の活性が残っているという条件で、該ポリペプチドの機能性フラグメントを含むものである。ＧＤＦ−９の生物学的活性を有する比較的小さいペプチドも本発明に含まれる。本発明はＧＤＦ−９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドとして、ＧＤＦ−９をコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列が含まれる。ＧＤＦ−９の全部または一部をコードするポリヌクレオチドはすべて、それらがＧＤＦ−９活性を有するポリペプチドをコードするのであれば、本発明に含まれることが理解されよう。こうしたポリヌクレオチドとして、天然に存在するもの、合成されたもの、そして故意に操作されたものが挙げられる。例えば、ＧＤＦ−９ポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発にかけることができる。ＧＤＦ−９のポリヌクレオチド配列はアンチセンス配列も含むものである。本発明のポリヌクレオチドは遺伝暗号の結果としての縮重配列を含む。２０種類の天然アミノ酸が存在し、その大部分は１種類より多いコドンによって規定されている。かくして、すべての縮重ヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列によってコードされるＧＤＦ−９ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化しない限り、本発明に含まれるものである。特に、本明細書中では、鎖長が１７１２塩基対で、ヌクレオチド２９のメチオニンコドンから始まるオープンリーディングフレームを含むＧＤＦ−９のｃＤＮＡ配列が開示される。コードされるポリペプチドは４４１個のアミノ酸から成り、ヌクレオチド配列解析で測定して約４９．６ｋＤの分子量を有する。ＧＤＦ− ９配列は、Ｎ末端の近傍に、分泌のためのシグナル配列を暗示する疎水性アミノ酸のコアを含んでいる。ＧＤＦ−９はアスパラギン残基１６３、２２９、２５８および３２５に可能なＮ−グリコシル化部位と、アミノ酸３０３−３０６に推定上の四塩基タンパク質分解プロセシング部位（ＲＲＲＲ）を含む。ＧＤＦ−９の成熟Ｃ末端フラグメントは１３５個のアミノ酸から成り、ヌクレオチド配列解析で測定して非グリコシル化分子量が約１５．６ｋＤであると想定される。当業者は標準的な技法を使ってグリコシル基を修飾したり、ＧＤＦ−９タンパク質からグリコシル基を部分的にまたは完全に除いたりできるだろう。それゆえ、本発明の機能性タンパク質またはそのフラグメントとして、ＧＤＦ−９のグリコシル化種、部分的グリコシル化種および非グリコシル化種が含まれる。ＧＤＦ−９と既知のＴＧＦ−βファミリーメンバーとの配列同一性の程度は、ミュラー管阻害物質（ＭＩＳ）の場合の最低２１％から骨形態形成タンパク質− ４（ＢＭＰ−４）の場合の最高３４％までの範囲である。本明細書に詳しく開示するＧＤＦ−９はＣ末端領域のシステイン残基のパターンが既知のファミリーメンバーと相違している。ＧＤＦ−９は他のファミリーメンバーに存在している７個のシステインのうち４番目のシステインを欠いている。すなわち、この位置のシステインの代わりに、ＧＤＦ−９配列はセリン残基を含んでいる。ＧＤＦ−９はＣ末端領域のどこにも７番目のシステイン残基を含んでいない。組換えＧＤＦ−９の一次アミノ酸配列のマイナーな修飾は、本明細書に記載のＧＤＦ−９ポリペプチドと比べて実質的に同等の活性を有するタンパク質をもたらすかもしれない。かかる修飾は部位特異的突然変異誘発によるもののように故意であっても、自然に起こるものであってもよい。これらの修飾によって得られるポリペプチドのすべては、ＧＤＦ−９の生物学的活性が依然として存在するのであれば、本発明に包含される。さらに、１個以上のアミノ酸を欠失させることも、その生物学的活性を著しく変えることなく分子構造の修飾を可能とする。これはより広い有用性を有するより小さな活性分子の開発へと導く。例えば、ＧＤＦ−９の生物学的活性にとっては必要でないアミノまたはカルボキシ末端のアミノ酸の除去が可能である。本発明のＧＤＦ−９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、開示した配列およびその保存的変更を含むものである。ここで用いる「保存的変更」という用語は、アミノ酸残基を他の生物学的に類似した残基で置き換えることを意味する。保存的変更の例として、ある疎水性アミノ酸（イソロイシン、バリン、ロイシン、メチオニンなど）を別の疎水性アミノ酸と置き換えること、または、ある極性アミノ酸を別の極性アミノ酸と置き換えることが含まれ、例えば、リシンとアルギニンとの置換、アスパラギン酸とグルタミン酸との置換、アスパラギンとグルタミンとの置換などを挙げることができる。また、「保存的変更」という用語は、置換ポリペプチドに対して誘起された抗体が非置換ポリペプチドと免疫反応性であるという条件で、非置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも包含する。本発明のＤＮＡ配列はいくつかの方法によって得ることができる。例えば、ＤＮＡは当技術分野で公知のハイブリダイゼーション技法を使って単離し得る。これらには、１）相同ヌクレオチド配列を検出するためのプローブとゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーション、および２）構造的特徴を共有するクローン化ＤＮＡフラグメントを検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニングが含まれるが、これらに限らない。好ましくは、本発明のＧＤＦ−９ポリヌクレオチドは哺乳動物に由来するものであり、マウス、ラットまたはヒト由来のものが最も好ましい。核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法は、適当なプローブが利用可能であれば、どの動物からでも任意の遺伝子配列を単離することを可能にする。対象のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴヌクレオチドプローブは化学的に合成可能である。そのためには、短いオリゴペプチドの範囲のアミノ酸配列が既知でなければならない。タンパク質をコードするＤＮＡ配列はアミノ酸配列から推定することができるが、遺伝暗号の縮重を考慮に入れる必要がある。配列が縮重をもつときは混合付加反応を行うことが可能である。これは変性二本鎖ＤＮＡの不均質混合物を含む。こうしたスクリーニングでは、一本鎖ＤＮＡかまたは変性二本鎖ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを実施することが好ましい。ハイブリダイゼーションは、対象のポリペプチドに関係するｍＲＮＡ配列が極めて少ない量で存在する供給源から誘導されたｃＤＮＡクローンの検出に特に有用である。言い換えれば、非特異的結合を回避するようなストリンジェントハイブリダイゼーション条件を用いることにより、例えば、標的ＤＮＡとその完全な相補体である混合物中の単一プローブとのハイブリダイゼーションにより、特定のｃＤＮＡクローンのオートラジオグラフ可視化を可能にすることができる（Wallace ら，Nucl．Acid Res.，9:879，1981）。また、ＧＤＦ−９をコードする特定のＤＮＡ配列は、１）ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離、２）対象のポリペプチドに必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列の化学的製造、および３）真核供与細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による二本鎖ＤＮＡ配列のin vitro合成、により得ることができる。後者の場合は、一般にｃＤＮＡと呼ばれるｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補体が最終的に形成される。組換え法で用いる特定のＤＮＡ配列を得るための上記の３方法のうち、ゲノムＤＮＡ単離物の単離が最も一般的でない方法である。イントロンの存在ゆえに哺乳動物ポリペプチドの微生物発現を得ることが望ましい場合は特にそうである。目的とするポリペプチド産物のアミノ酸残基の全配列が既知であるときは、ＤＮＡ配列の合成がしばしば好適な方法となる。目的とするポリペプチドのアミノ酸残基の全配列が不明であるときは、ＤＮＡ配列の直接合成が不可能で、ｃＤＮＡ配列の合成が好適な方法となる。対象のｃＤＮＡ配列を得るための標準的な方法として、高レベルの遺伝子発現を有する供与細胞中に豊富にあるｍＲＮＡの逆転写により誘導されるプラスミド- またはファージ- 担持ｃＤＮＡライブラリーの作製がある。ポリメラーゼ連鎖反応の技法とともに用いると、稀な発現産物でさえもクローニングすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列のかなりの部分が知られている場合には、標的ｃＤＮＡ中に存在すると想定される配列を複写した一本鎖または二本鎖の標識ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを作製し、該プローブを、一本鎖形態に変性させたクローン化コピー数のｃＤＮＡに対して実施されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法において用いることができる（Ja yら，Nucl．Acid Res.，11:2325，1983）。ラムダｇｔ１１のようなｃＤＮＡ発現ライブラリーは、ＧＤＦ−９に特異的な抗体を用いて、少なくとも１つのエピトープを有するＧＤＦ−９ペプチドについて間接的にスクリーニングし得る。こうした抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、ＧＤＦ−９ｃＤＮＡの存在を示す発現産物の検出に用いられる。ＧＤＦ−９をコードするＤＮＡ配列は適当な宿主細胞へのＤＮＡ導入によりin vitroで発現させることができる。「宿主細胞」とは、ベクターを増幅しかつそのＤＮＡを発現し得る細胞のことである。また、この用語は被験宿主細胞のあらゆる子孫をも含むものである。すべての子孫は、複製中に突然変異を起こすことがあるから、その親細胞と同一でなくてもよいことが理解されよう。しかし、「宿主細胞」という用語を用いるときは、こうした子孫も含むものとする。安定したＤＮＡ導入（外来ＤＮＡが宿主内に連続的に維持されることを意味する）の手法は当技術分野で公知である。本発明では、ＧＤＦ−９ポリヌクレオチド配列が組換え発現ベクターに挿入される。「組換え発現ベクター」という用語は、ＧＤＦ−９遺伝子配列の挿入または組込みによって操作された、当技術分野で公知のプラスミド、ウイルスまたは他の運搬体を指す。かかる発現ベクターは宿主内に挿入した遺伝子配列の効率のよい転写を促進するプロモーター配列を含む。発現ベクターは複製起点、プロモーター、さらに形質転換細胞の表現型選択を可能にする特殊な遺伝子を含むのが常である。本発明で使用するのに適したベクターとしては、バクテリア発現用のＴ７をベースとした発現ベクター（Rosenbergら，Gene，56:125，1987）、哺乳動物細胞発現用のｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（LeeおよびNathans，J．Biol．Che m.，263:3521，1988）、および昆虫細胞発現用のバキュロウイルス由来のベクターを挙げることができるが、これらに限らない。ＤＮＡセグメントはプロモーター（例：Ｔ７、メタロチオネインＩ、ポリヘドリンプロモーター）のような調節要素に機能的に連結された状態でベクター中に存在する。ＧＤＦ−９をコードするポリヌクレオチド配列は原核生物または真核生物のいずれで発現させてもよい。宿主としては、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物が含まれる。原核生物内で真核生物配列またはウイルス配列を有するＤＮＡ配列を発現させる方法は当技術分野で公知である。宿主内で発現・複製しうる生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは当技術分野で知られている。本発明のＤＮＡ配列を組み込む際には、こうしたベクターが用いられる。組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者によく知られているような慣用の技法を使って行われる。宿主が大腸菌のような原核生物である場合は、指数増殖期の後に回収した細胞からＤＮＡ取込み能を有するコンピテント細胞を調製し、その後当技術分野で公知の手法を用いてＣａＣｌ₂法で処理する。また、ＭｇＣｌ₂やＲｂＣｌを用いてもよい。所望により、宿主細胞のプロトプラストを形成させた後で形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合は、リン酸カルシウム共沈、マイクロインジェクションのような慣用の機械的方法、エレクトロポレーション、リポソーム内に保持されたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターといったＤＮＡトランスフェクション法が用いられる。真核細胞はまた、本発明のＧＤＦ−９をコードするＤＮＡ配列および選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）を用いて同時形質転換することもできる。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）やウシパピローマウイルスのような真核生物ウイルスベクターを使って真核細胞を一時的に感染させるか形質転換することにより、タンパク質を発現させる方法である（例えば、Eukaryotic Viral Vectors，Co ld Spring Harbor Laboratory，Gluzman編集，1982を参照のこと）。本発明により提供される、微生物内で発現させたポリペプチドまたはそのフラグメントの単離・精製は、分離用クロマトグラフィーおよびモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いる免疫学的分離を含めて、慣用の手段により行うことができる。本発明は、ＧＤＦ−９ポリペプチドと免疫反応性の抗体またはその機能性フラグメントを含むものである。様々なエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体のプールから本質的に成る抗体、ならびに明確に異なるモノクローナル抗体調製物が提供される。モノクローナル抗体は当業者によく知られた方法を用いてタンパク質の抗原含有フラグメントから作られる(Kohlerら，Nature，256:495，19 75)。本発明で用いる「抗体」という用語は、完全な抗体分子のほかに、ＧＤＦ −９上のエピトープ決定基と結合し得るＦabおよびＦ(ab')₂のような抗体フラグメントを包含する。「細胞増殖性疾患」という用語は、しばしば周囲の組織と形態学的にも遺伝子型的にも相違するように見える悪性ならびに非悪性の細胞集団を表す。アンチセンス分子からなるＧＤＦ−９ポリヌクレオチドは、さまざまな器官系の悪性疾患、特に、例えば卵巣の悪性疾患を治療するのに有用である。本質的に、ＧＤＦ− ９発現の変化が病因的に関係している疾患はどれも、ＧＤＦ−９抑制剤による治療に感受性であると考えられる。本発明は、卵巣の細胞増殖性障害を検出する方法であって、抗ＧＤＦ−９抗体をＧＤＦ−９関連障害を有する疑いがある細胞と接触させ、その抗体への結合を検出することを含む方法を提供する。ＧＤＦ−９と反応性のこの抗体は、ＧＤＦ −９への結合を検出できるようにする化合物で標識される。本発明の目的のために、ＧＤＦ−９ポリペプチドに特異的な抗体を用いて生物学的流体及び組織中のＧＤＦ−９のレベルを検出することができる。検出可能な量の抗原を含有するあらゆる検体を用いることができる。この発明の好ましいサンプルは、卵巣起源の組織、特に顆粒膜細胞又は卵胞液を含有する組織である。疑いのある細胞中のＧＤＦ−９のレベルを正常細胞中のレベルと比較して、被験体がＧＤＦ−９関連細胞増殖性障害を有するかどうかを確認することができる。好ましくは、被験体はヒトである。本発明の抗体は、in vitro又はin vivo免疫診断又は免疫療法を施すのが望ましいあらゆる被験体に用いることができる。本発明の抗体は、例えば、イムノアッセイに用いるのに適しており、その際それらを液相で用いても固相キャリヤーに結合させてもよい。加えて、これらイムノアッセイにおける抗体を検出できるように種々の方法で標識することができる。本発明の抗体を用いることができるタイプのイムノアッセイの例は、直接又は間接フォーマットのいずれかの競合及び非競合イムノアッセイである。かかるイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及びサンドイッチ（免疫測定）アッセイである。本発明の抗体を用いる抗原の検出は、生理学的サンプルでの免疫組織化学的アッセイを含む、フォワード、リバース、又は同時モードのいずれで行われるイムノアッセイを用いても行うことができる。当業者は、過度な実験を重ねることなく他のイムノアッセイフォーマットを認知するか、又は容易に認識できるであろう。本発明の抗体は、多くの異なるキャリヤーに結合できるので、本発明のポリペプチドを含む抗原の存在を検出するのに用いることができる。周知のキャリヤーの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄鉱が含まれる。このキャリヤーの性質は、本発明の目的のためには可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者は、抗体を結合させるのに適する他のキャリヤーを認知するか、又は日常的な実験を用いてそうしたものを探知できるであろう。当業者にとって既知の多くの異なる標識及び標識方法がある。本発明に用いることができるタイプの標識の例には、酵素、放射性同位元素、蛍光性化合物、コロイド状金属、化学発光性化合物、リン光性化合物、及び生物発光化合物が含まれる。当業者は、抗体に結合するのに適する他の標識を認知するか、又は日常的な実験を用いてそうしたものを探知できるであろう。より大きな感度をもたらすこともできるもう１つの技術は、これら抗体を低分子量ハプテンにカップリングさせることからなる。次いで、第２反応によってこれらハプテンを特異的に検出することができる。例えば、特異的抗ハプテン抗体と反応するビオチン（アビジンと反応する）、ジニトロフェニル、ピリドキサール、及びフルオレセインのようなハプテンを用いるのが普通である。抗原のin vivo検出に本発明のモノクローナル抗体を用いるに際して、検出できるように標識された抗体を診断に有効な用量で投与する。「診断に有効」という用語は、検出できるように標識されたモノクローナル抗体の量が、本発明のポリペプチド（このポリペプチドに対してモノクローナル抗体は特異的である）を含む抗原を有する部位の検出が可能になるのに十分な量で投与されることを意味している。検出できるように標識されたモノクローナル抗体の投与濃度は、該ポリペプチドを有する細胞への結合がバックグラウンドに比較して検出可能になるのに十分な濃度であるべきである。更に、最良の標的対バックグラウンド信号比を得るために、検出できるように標識されたモノクローナル抗体が循環系から急速に浄化されることが望ましい。一般に、検出できるように標識されたモノクローナル抗体のin vivo診断のための用量は、個体の年齢、性別、及び疾患の程度の如き要因に依存して変動するであろう。かかる用量は、例えば、注射が多数回行われるかどうか、抗原負担、及び当業者に知られている他の要因に依存して変動してもよい。 in vivo診断的画像化については、利用可能な検出装置のタイプが、所定の放射性同位元素を選択するにあたっての主因となる。選ばれる放射性同位元素は、所与のタイプの装置で検出可能なタイプの崩壊を起こさなければならない。in v ivo診断用の放射性同位元素を選択するに際して重要なもう１つ要因は、宿主に対する有害な放射線を最小限に抑えることである。理想的には、in vivo画像化に用いられる放射性同位元素は粒子放射を欠くが、慣用的なガンマカメラにより簡単に検出できる１４０〜２５０ｋｅＶの範囲の多数の光量子を生成するであろう。 in vivo診断については、介在官能基を用いることにより放射性同位元素を直接又は間接にイムノグロブリンに結合させてもよい。金属イオンとして存在する放射性同位元素をイムノグロブリンに結合させるのにしばしば用いられる介在官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び類似の分子の如き二官能性キレート剤である。本発明のモノクローナル抗体に結合できる金属イオンの典型的な例は、¹¹¹Ｉｎ、⁹⁷Ｒｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒ、及び²⁰¹Ｔｌである。本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）又は電子スピン共鳴（ＥＳＲ）におけるように、in vivo診断の目的のために常磁性同位元素で標識することもできる。一般に、診断画像を可視化するあらゆる慣用方法を用いることができる。通常、ガンマ及び陽電子放射性ラジオアイソトープが、ＭＲＩ用のカメラ画像化及び常磁性同位元素として用いられる。かかる技術に特に有用である元素には、¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｃｒ、及び⁵⁶Ｆｅが含まれる。本発明のモノクローナル抗体は、in vitro及びin vivoで用いて被験体のＧＤＦ−９関連疾患の改善の経過を追跡することができる。かくして、例えば、本発明のポリペプチドを含む抗原を発現する細胞の数の増加若しくは減少、又は種々の体液中に存在するかかる抗原の濃度の変化を測定することにより、ＧＤＦ−９関連疾患の改善を狙った特定の療法が効果的であるかどうかを確認することが可能になろう。「改善」という用語は、治療を受けている被験体のＧＤＦ−９関連疾患の好ましくない作用が少なくなることを表す。本発明は、正常細胞における発現に比較して変異した方法で発現され得るヌクレオチド配列を同定するものであり、従ってこの配列に向けられる適切な治療又は診断法を設計するのが可能となる。かくして、細胞増殖性障害がＧＤＦ−９の発現と関連している場合には、翻訳レベルでＧＤＦ−９発現を妨害する核酸配列を用いることができる。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸及びリボザイムを用いて特定のＧＤＦ−９ｍＲＮＡの翻訳を遮断するものであって、それはアンチセンス核酸でそのｍＲＮＡをマスクするか又はリボザイムでそれを開裂させるかのいずれかによりなされる。アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であるＤＮＡ又はＲＮＡ分子である（Weintraub，Scientific American，262:40，1990）。細胞内でアンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないであろうから、アンチセンス核酸はこのｍＲＮＡの翻訳を妨害することになる。約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。というのは、それらは、より大きな分子よりも簡単に合成できかつ標的ＧＤＦ−９産生細胞内に導入したときにあまり問題を起こしそうにないからである。遺伝子のin vitro翻訳を阻害するためにアンチセンス法を用いることは、当該技術分野で周知である（Marcus-Sakura，Anal．B iochem.，172:289，1988）。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似のやり方で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に開裂する能力を有するＲＮＡ分子である。これらＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾により、ＲＮＡ分子内の特定のヌクレオチド配列を認識してそれを開裂する分子を工学的に作ることが可能である(C hen，J．Amer．Med．Assn.，260:3030，1988)。このアプローチの主要な利点は、それらが配列特異性であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡだけを不活性にする点である。２つの基本的なタイプのリボザイム、即ち、テトラヒメナ型（Hasselhoff，Na ture，334:585，1988）及び“ハンマーヘッド”型がある。テトラヒメナ型リボザイムは長さが４塩基の配列を認識し、“ハンマーヘッド”型リボザイムは長さが１１〜１８塩基の塩基配列を認識する。認識配列が長ければ長いほど、その配列が標的ｍＲＮＡ種内に独占的に存在する可能性が大きくなる。従って、特定のｍＲＮＡ種を不活性化するには、ハンマーヘッド型リボザイムがテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、しかも１８塩基の認識配列がそれより短い認識配列よりも好ましい。本発明は、ＧＤＦ−９タンパク質により媒介される細胞増殖性障害を治療するための遺伝子治療も提供する。かかる療法は、ＧＤＦ−９アンチセンスポリヌクレオチドをこの増殖性障害を有する細胞内に導入することによりその治療効果を奏することになる。アンチセンスＧＤＦ−９ポリヌクレオチドの運搬（デリバリー）は、キメラウイルスの如き組換え発現ベクター又はコロイド分散系を用いて行うことができる。アンチセンス配列の治療的デリバリーに特に好ましいのは、標的設定（ターゲティング）されたリポソームを用いることである。ここに教示した遺伝子治療に用いることができる種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア又は、好ましくは、レトロウイルスの如きＲＮＡウイルスが含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウス又は鳥類のレトロウイルスの誘導体である。単一の異種遺伝子を挿入することができるレトロウイルスの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイ（Harvey）マウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含まれるが、これらに限定されない。多くの更なるレトロウイルスベクターが複数の遺伝子を組み込むことができる。導入細胞が同定されて世代形成できるように、これら全てのベクターは、選択マーカー用の遺伝子を移入するか又は取り込むことができる。興味の対象であるＧＤＦ−９配列を、例えば、特定の標的細胞上のレセプターのリガンドをコードする別の遺伝子と一緒にウイルスベクターに挿入することにより、そのベクターはその時点で標的特異性となる。レトロウイルスベクターを、例えば、糖、糖脂質又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって標的特異性にしてもよい。好ましい標的設定（ターゲティング）は、抗体を用いることにより行われる。当業者は、過度な実験を重ねることなく、ＧＤＦ−９アンチセンスポリヌクレオチドを含有するレトロウイルスベクターの標的特異性デリバリーを可能にするためにレトロウイルスゲノム内に挿入できる特定のポリヌクレオチド配列を認知するか、又は容易に探知できるであろう。組換えレトロウイルスは欠損ウイルスであるので、感染性ベクター粒子を生成させるためにはそれらは助けを必要とする。この助けは、例えば、レトロウイルスの全ての構造遺伝子をそのＬＴＲ内の調節配列の制御下でコードするプラスミドを含有するヘルパー細胞系を用いることにより提供することができる。これらプラスミドには、そのパッケージング機構がキャプシデーション（包膜）のためにＲＮＡ転写産物を認識するのを可能にするヌクレオチド配列が存在しない。このパッケージングシグナルの欠失を有するヘルパー細胞系には、例えば、Ψ２、ＰＡ３１７及びＰＡ１２が含まれるが、これらに限定されない。これら細胞系は、ゲノムがパッケージされていないので、空のビリオンを産生する。パッケージングシグナルは完全であるが構造遺伝子が興味の対象である他の遺伝子により置換されている細胞内にレトロウイルスベクターを導入した場合には、そのベクターはパッケージされてベクタービリオンを産生することができる。また、ＮＩＨ３Ｔ３又は他の組織培養細胞は、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖをコードするプラスミドで慣用的なリン酸カルシウムトランスフェクションにより直接トランスフェクトすることができる。次いで、これら細胞を対象の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトする。得られる細胞は、培地中にそのレトロウイルスベクターを放出する。ＧＤＦ−９アンチセンスポリヌクレオチドのもう１つの標的デリバリーシステムは、コロイド分散系である。コロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、及び、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。この発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、in vitro及びin vivoでの運搬体として有用である人工膜小胞である。サイズが０．２〜４．０μｍの大きな単ラメラ小胞（large unilamellar vesicle，ＬＵＶ）が巨大分子を含有する相当なパーセンテージの水性緩衝液を封入できることが分かった。ＲＮＡ、ＤＮＡ及び無傷ビリオンをその水性内部に封入して、生物活性形態で細胞へ運搬することができる（Fraleyら，Trends Bio chem．Sci.，6:77，1981）。哺乳動物細胞に加えて、リポソームは、植物、酵母、及び細菌細胞へのポリヌクレオチドの運搬に用いられてきた。リポソームが効率のよい遺伝子導入運搬体であるためには、次の特徴が示されるべきである：（１）対象となる遺伝子を高い効率で封入するがそれらの生物活性を弱めないこと；（２）非標的細胞に比較して標的細胞に優先的かつ強固に結合すること；（３）標的細胞の細胞質へ該小胞の水性内容物を高い効率で運搬すること；及び（４）遺伝子情報を正確かつ効率的に発現すること（Manninoら，Biotechniques，6: 682，1988）。リポソームの組成は、通常、リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質とステロイド、特にコレステロールとを組み合わせたものである。他のリン脂質又は他の脂質を用いることもできる。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。リポソーム生成に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド及びガングリオシドの如きホスファチジル化合物が含まれる。特に有用なのは、脂質部分が１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を含有し飽和であるジアシルホスファチジルグリセロールである。実例となるリン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。リポソームの標的設定（ターゲティング）は、解剖学的及び機械学的要因に基づいて分類される。解剖学的分類は、選択性、例えば、器官特異性、細胞特異性及びオルガネラ特異性のレベルに基づく。機械学的標的設定は、それが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的標的設定は、洞様毛細血管を含む器官内の細網内皮系（reticulo-endothelial system，ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの自然的傾向を利用するものである。一方、能動的標的設定は、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質又はタンパク質の如き特異的リガンドにカップリングさせることにより又はリポソームの組成若しくはサイズを変えることによりリポソームを改変して、天然に存在する局在部位以外の器官及び細胞型に標的設定することを包含する。標的デリバリーシステムの表面をいろいろな方法で修飾することができる。リポソーム標的デリバリーシステムの場合には、脂質基をリポソームの脂質二重層内に取り込ませて、標的指向性リガンドをリポソーム二重層との安定な結合状態で維持するようにできる。脂質鎖を標的指向性リガンドに結合するために種々の連結基を用いることができる。生殖路内でのＧＤＦ−９の発現のために、避妊、受精能及び妊娠に関連する本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド及び抗体を用いる種々の応用がある。ＧＤＦ−９は月経周期の調節にある役割を果たすであろうから、種々の避妊法に有用であろう。以下の実施例は、本発明を説明するものであって限定を意図するものではない。それらは用いられるかも知れない実例を代表しているが、当業者にとって既知の他の手法を代わりに用いてもよい。実施例１新規なTGF-βファミリーメンバーの同定と単離 TGF-βスーパーファミリーの新しいメンバーを同定するため、既知のファミリーメンバーにおける２つの保存領域に対応する縮重オリゴヌクレオチドを設計した。１つの領域は２つのトリプトファン残基の間にわたり、MISを除いて全てのファミリーメンバーに保存されているものであり、もう１つの領域はC-末端に近い不変システイン残基の間にわたるものである。これらのプライマーをマウスゲノムDNA上でのポリメラーゼ連鎖反応に使用し、その後プライマーの5'末端に配置された制限部位を利用してPCR生成物をサブクローン化し、これらのサブクローン化された挿入物を含む大腸菌の個々のコロニーを採集し、そしてランダムな配列決定とハイブリダイゼーション分析を組み合わせて使用して、前記スーパーファミリーの公知のメンバーを除外した。 GDF-9は、プライマーにより得たPCR生成物の混合物から同定した。これらのプライマーを使用したPCR は、２μgマウスゲノムDNAを使用して94℃で１分間、50℃で２分間、72℃で２分間、40サイクル行った。約280bpのPCR生成物をゲル精製し、EcoRIにより消化し、再度ゲル精製し、Blu escriptベクター（Stratagene，San Diego，C A）中にサブクローン化した。個々のサブクローンを含む細菌コロニーを96ウェルマイクロタイタープレートに採集し、ニトロセルロース上に細胞をプレーティングすることにより複数のレプリカを調製した。複写したフィルターを、ファミリーの公知のメンバーを示すプローブとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしないコロニーから配列分析のためのDNAを調製した。 SJL160及びSJL153のプライマーの組合せは、分析した145のサブクローンから３種の公知の配列(インヒビンβB、BMP-2及びBMP-4)及び１種の新規な配列（GDF -9と指称する）を与えた。 RNA単離とノーザン分析は以前に記載されているように行ったる(Lee，S.J.，M ol．Endocrinol.，4:1034，1990)。Stratageneにより与えられた指示書に従い、卵巣からポリA選択したRNA2.5-3μgから、オリゴdTプライマーを用いてcDNAライブラリーをλZAP IIベクター中に調製した。卵巣ライブラリーはスクリーニングの前に増幅しなかった。フィルターを前記したようにハイブリダイズさせた(Lee ，S.J.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA.，88:4250-4254，1991)。ジデオキシチェーンターミネーション法(Sangerら，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA，74:5463-54 67，1977)及びS1ヌクレアーゼ／エキソヌクレアーゼIIIの組合せによる方法(Hen ikoff，S.，Gene，28:351-359，1984)及び合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、両鎖のDNA配列決定を行った。実施例２ GDF-9の発現パターン及び配列 GDF-9の発現パターンを調べるため、種々の成体組織から調製したRNA試料をノーザン分析によりスクリーニングした。各組織から調製した、２回ポリＡ選択したRNAの５μgをホルムアルデヒドゲル上で電気泳動にかけ、ブロットし、GDF-9により釣り上げた。図１に示すように、GDF-9プローブは、卵巣のみで発現された1.7kbのmRNAを検出した。 1.5×10⁶組換えファージのマウス卵巣cDNAライブラリーをλZAP II中に構築し、GDF-9 PCR生成物から得たプローブを使用してスクリーニングした。19のハイブリダイズする最も長いクローンのヌクレオチド配列を図２に示す。共通のN-グリコシレーションシグナルを無地のボックスにより示す。推定上の４塩基プロセシング部位を点描ボックスにより示す。推定上の開始ATGの上流の読み枠内終結コドン及び共通のポリアデニレーションシグナルに下線を付した。ポリA尾部は示していない。数字は5'末端からみたヌクレオチドの位置を示す。この1712bp配列は、ヌクレオチド29のメチオニンコドンから始まり、49.6kDの分子量を有する 441アミノ酸長のタンパク質をコードし得る長いオープンリーディングフレームを含んでいる。他のTGF-βファミリーメンバーと同様に、GDF-9配列はN-末端に近い疎水性アミノ酸のコアを含み、これは分泌のためのシグナル配列を示唆するものである。GDF-9はまたアスパラギン残基163、229、258及び325における４つの可能性のあるN-グリコシレーション部位並びにアミノ酸303-306における推定の４塩基タンパク質分解プロセシング部位(RRRR)を含む。GDF-9の成熟C-末端フラグメントは、135アミノ酸長で非グリコシル化分子量が15.6kDと予測される。 GDF-9のC-末端領域は他のファミリーメンバーに対して明らかに相同性を示すが、GDF-9の配列は他のファミリーメンバーのものから有意に異なっている（図３及び４）。図３は、GDF-9のC-末端配列と、ヒトGDF-1（Lee，P roc．Natl．Acad．Sci．USA，88:4250-4254，1991）、ツメガエルVg-1（Weeksら，Cell，51:861-867，1987）、ヒトVgr-1(Celesteら，Proc．Natl．Acad．Sci． USA，87:9843-9847，1990)、ヒトOP-1（Ozkaynakら，EMBO J.，9:2085-2093，19 90）、ヒトBMP-5（Celesteら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:9843-9847，19 90）、ショウジョウバエ60A（Whartonら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:921 4-9218，1991）、ヒトBMP-2及び4(Wozneyら，Science，242: 1528-1534，1988) 、ショウジョウバエDPP(Padgettら，Nature，325:81-84，1987)、ヒトBMP-3（Wo zneyら，Science，242:1528-1534，1988）、ヒトMIS(Cateら，Cell，45:685-698 ，1986),ヒトインヒビンα、βA、及びβB(Masonら，Biochem，Biophys．Res．C ommun.，135:957-964，1986)、ヒトTGF-β1(Derynckら，Nature，316:701-705， 1985)、ヒトTGF-β2（deMartinら，EMBOJ.，6:3673-3677，1987）、ヒトTGF-β3 （ten Dijkeら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85:4715-4719，1988）、ニワトリTGF-β4(Jakowlewら，Mol．Endocrinol.，2:1186-1195，1988)、並びにツメガエルTGF-β5(Kondaiahら，J．Biol．Chem.，265:1089-1093，1990)の対応する領域との並列化を示す。保存システイン残基には影を付した。ダッシュは並列化を最大限とするために入れたギャップである。図４は、TGF-βスーパーファミリー中の異なるメンバーの間のアミノ酸の相同性を示す。数字は、第１の保存システインからC- 末端まで計算した各対の間のアミノ酸の同一性のパーセントを表す。ボックスは、特定のサブグループ内の高度に関連したメンバーにおける相同性を示す。公知のファミリーメンバーとの配列同一性の程度は、最小のMISとの21%から最大のBMP-4との34%までの範囲である。従って、GDF-9はこのスーパーファミリーの他のメンバーからの配列相違の程度においてMISに匹敵する。さらにGDF-9は分子のプロ領域において他のファミリーメンバーに対して有意な配列相同性を示さない。GDF-9はまた、C-末端領域におけるシステイン残基のパターンにおいても公知のファミリーメンバーと異なっている。GDF-9は他の全てのファミリーメンバーに存在する７つのシステインの４番目のシステインを欠いており、この位置のシステインの代わりにGDF-9配列はセリン残基を含んでいる。さらに、GDF-9は C-末端領域の他のどこにも７番目のシステインを含んでいない。実施例３透明帯におけるGDF-9の免疫化学的位置決定 GDF-9 mRNAが翻訳されたかどうかを調べるために、成体卵巣の切片を組換えGD F-9タンパク質に対する抗体とインキュベートした。GDF-9に対する抗体を生成するためには、アミノ酸30〜295（前領域）またはアミノ酸308〜441（成熟領域）にわたるGDF-9 cDNAの部分を、T7をベースとするpET3発現ベクター(F.W．Studie r，Brookhaven National Laboratoryにより提供された)中にクローン化し、得られたプラスミドをBL21(DE3)細菌株中に形質転換した。イソプロピルB-D-チオガラクトシド誘発細胞からの全細胞抽出物を、SDS/ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、GDF-9タンパク質フラグメントを切り出し、フロイントアジュバントと混合し、当業者に公知の標準的方法によりウサギを免疫するのに使用した。全ての免疫化はSpring Valle y Lab(Sykesville，MD)により行われた。これらのウサギの血清中のGDF-9-反応性抗体の存在は、細菌により発現されたタンパク質フラグメントのウェスタン分析により調べた。得られた血清は、ウェスタン分析により細菌により発現されたタンパク質と反応することが示された。免疫組織化学的研究のため、成体マウスから卵巣を摘出し、4%パラホルムアルデヒド中に固定し、パラフィン中に埋包し、切片とした。Vectastain ABCキットを使用してVector Laboratoriesにより与えられた指示書に従い抗体結合の部位を検出した。図５は、GDF-9タンパク質の免疫組織化学的位置決定を示す。成体卵巣の隣接する切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色するか（図5a）、希釈率1:500の免疫血清（図5b）または前免疫血清（図5c）とともにインキュベートした。図5bに示されるように、抗血清は卵母細胞においてのみタンパク質を検出した。前免疫血清を使用すると染色は見られなかった（図5c）。従って、GDF-9 は卵母細胞によりin vivoにおいて翻訳されるものと思われる。実施例４ヒトGDF-9の単離ヒトGDF-9をコードするcDNAクローンを単離するために、成人ヒト卵巣から調製した、ポリAで選択したRNAを使用してλZAP II中にcDNAライブラリーを構築した。実施例１のように標準的なスクリーニング法を使用し、そしてマウスGDF-9クローンをプローブとして使用して、このライブラリーから完全なヒトGDF-9コード配列を含むcDNAクローンを同定した。マウスの予測されたアミノ酸配列（最上段）及びヒト（下段）GDF-9配列の比較を図６に示す。数字はN-末端に対するアミノ酸位置を示す。垂直な線は配列の同一性を示す。ドットは並列を最大限とするために導入したギャップを示す。何も付していないボックスは予測タンパク質分解プロセシング部位を示す。影を付したボックスはタンパク質の成熟領域中のシステイン残基を示す。下部の線は、GDF-9 の前領域（なにも付していない）及び成熟領域（影を付した）の概略を示し、下にマウス及びヒト配列の間の配列同一性パーセントを示す。マウスGDF-9と同様に、ヒトGDF-9は疎水性リーダー配列、推定RXXRタンパク質分解切断部位、及び他のTGF-βファミリーのメンバーの前記の顕著な特徴を含む C-末端を含む。マウス及びヒトGDF-9は分子のプロ領域において64％同一であり、予測される分子の成熟領域において90%同一である。この２つの配列の相同性の高い程度は、ヒトGDF-9が胎児発生及び／または成人卵巣において重要な役割を果たしていることを示唆するものである。実施例５卵母細胞におけるGDF-9の発現の核酸検出卵巣におけるGDF-9の発現の位置を決定するために、アンチセンスGDF-9 RNAプローブを使用してマウス卵巣切片に対するin s ituハイブリダイゼーションを行った。図７は、GDF-9 RNAプローブを使用した、成体卵巣切片に対するin situハイブリダイゼーションを示す。[³⁵S]-標識アンチセンスGDF-9 RNAプローブ（図7a及び7c）またはセンスGDF-9 RNAプローブ（図 7b及び7d）を、4%パラホルムアルデヒド中に固定した卵巣の隣接するパラフィン埋包切片にハイブリダイズさせた。切片を写真乳剤に浸し、露出し、現像し、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色した。２種の代表的な領域を示す。図7a及び7cに示すように、GDF-9 mRNAは主として成体卵巣の卵母細胞中に検出された。調べた全ての卵母細胞は（卵胞発生の段階にかかわらず）GDF-9発現を示し、その他の細胞種では発現は検出されなかった。対照のGDF-9センスRNAプローブを使用した場合、ハイブリダイゼーションは見られなかった（図7b及び7d）。従って、GDF-9発現は、成体卵巣中の卵母細胞に特異的なもののようである。卵巣発生の間のGDF-9 mRNAの発現のパターンを調べるために、新生児卵巣の切片をGDF-9 RNAプローブで釣り上げた。図８は、アンチセンスGDF-9 RNAプローブを使用した、出生後第４日の卵巣切片に対するin situハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に示したように調製した。オートラジオグラフィーと染色の後、明視野（図8a）及び暗視野（図8b）照明下において切片の写真をとった。図９は、アンチセンスGDF-9 RNAプローブ（図9a）またはセンスGDF-9 RNAプローブ（図9b）を使用した、出生後第８日の卵巣切片に対するin situハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に示したように調製した。 GDF-9 mRNA発現は最初、卵胞発生の開始において検出された。これは出生第４日において最も明確に明らかとなり、この場合卵胞に存在する卵母細胞のみがGD F-9発現を示し（図８）、顆粒膜細胞に囲まれていない卵母細胞においては発現は見られなかった。出生後第８日までに、全ての卵母細胞は卵胞発生を経たようであり、全ての卵母細胞はGDF-9発現を示した（図９）。排卵の後にもGDF-9が発現されたかどうかを調べるために、マウス輸卵管をin situハイブリダイゼーションにより調べた。図10は、アンチセンスGDF-9 RNAプローブ(図10a)またはセンスGDF-9 RNAプローブ(図10b)を使用した、成体輸卵管切片に対するin situハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に示したように調製した。図11は、アンチセンスGDF-9 RNAプローブを使用した、成体輸卵管（受精後0.5 日）切片に対するin situハイブリダイゼーションを示す。切片は図７に示したように調製した。オートラジオグラフィーと染色の後、明視野(図11a)及び暗視野(図11b)照明下において切片の写真をとった。図10に示されるように、GDF-9は輸卵管に放出された卵母細胞により発現された。しかし、GDF-9 mRNAの発現は、卵母細胞の受精の後に受精後0.5日までに急速に消失し、いくつかの胚（例えば図11に示したようなもの）のみがGDF-9 mRNA を発現し、1.5日までに全ての胚はGDF-9発現について陰性であった。本発明を現時点で好ましい態様を引用して説明したが、本発明の概念を逸脱することなく種々の改変を行うことができることが理解されるべきである。従って、本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。配列の要約配列番号１は、GDF-9のプライマー、SJL 160についてのヌクレオチド配列である。配列番号２は、GDF-9のプライマー、SJL 153についてのヌクレオチド配列である。配列番号３は、GDF-9についてのヌクレオチド及び推定アミノ酸配列である（図２）。配列番号４は、GDF-9についての推定アミノ酸配列である（図２）。配列番号５は、GDF-3のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号６は、GDF-9のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号７は、GDF-1のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号８は、Vg-1のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号９は、Vgr-1のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号10は、OP-1のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号11は、BMP-5のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号12は、60AのC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号13は、BMP-2のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号14は、BMP-4のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号15は、DPPのC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号16は、BMP-3のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号17は、MISのC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号18は、インヒビン−αのC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号19は、インヒビン−βAのC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号20は、インヒビン−βBのC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号21は、TGF-β1のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号22は、TGF-β2のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号23は、TGF-β3のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号24は、TGF-β4のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号25は、TGF-β5のC-末端のアミノ酸配列である（図３）。配列番号26は、ヒトGDF-9のアミノ酸配列である（図６）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵ 9051−4ＣＡ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵ 49/00 9454−4Ｃ 49/00 ＡＣ０７Ｈ 21/04 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｋ 14/495 ＺＮＡ 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/495 ＺＮＡ 16/22 9356−4Ｈ 16/22 Ｃ１２Ｎ 1/21 9282−4ＢＣ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/53 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 Ｅ 9284−4ＣＴ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に純粋な増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）およびその機能性フラグメント。２．請求項１のＧＤＦ−９ポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。３．前記のポリヌクレオチドが哺乳動物細胞から単離されるものである、請求項２に記載のポリヌクレオチド配列。４．哺乳動物細胞がマウス、ラットおよびヒト細胞よりなる群から選ばれる、請求項３に記載のポリヌクレオチド配列。５．請求項２のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。６．前記のベクターがプラスミドである、請求項５に記載のベクター。７．前記のベクターがウイルスである、請求項５に記載のベクター。８．請求項５のベクターで安定に形質転換された宿主細胞。９．前記の細胞が原核細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。 10．前記の細胞が真核細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。 11．請求項１のポリペプチドと反応性の抗体またはそのフラグメント。 12．前記の抗体がポリクローナルである、請求項11に記載の抗体。 13．前記の抗体がモノクローナルである、請求項11に記載の抗体。 14．請求項11の抗体を、ＧＤＦ−９関連疾患の疑いがある患者の標本と接触させ、該抗体の結合を検出することからなる、細胞増殖性疾患の検出方法。 15．細胞増殖性疾患が卵巣の腫瘍である、請求項14に記載の方法。 16．検出をin vivoで行う、請求項14に記載の方法。 17．抗体が検出可能なように標識されている、請求項16に記載の方法。 18．検出可能な標識が放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物および化学発光化合物よりなる群から選ばれる、請求項17に記載の方法。 19．検出をin vitroで行う、請求項14に記載の方法。 20．抗体が検出可能なように標識されている、請求項19に記載の方法。 21．標識が放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物および酵素よりなる群から選ばれる、請求項20に記載の方法。 22．ＧＤＦ−９の発現に関連した細胞増殖性疾患の治療方法であって、該細胞とＧＤＦ−９活性を抑制する薬剤とを接触させることからなる方法。 23．前記の薬剤が抗ＧＤＦ−９抗体である、請求項22に記載の方法。 24．前記の薬剤がＧＤＦ−９アンチセンス配列である、請求項22に記載の方法。 25．細胞増殖性疾患が卵巣の腫瘍である、請求項22に記載の方法。 26．ＧＤＦ−９活性を抑制する薬剤が運び屋（ベクター）を使って細胞に導入される、請求項22に記載の方法。 27．前記の運び屋がコロイド分散系である、請求項26に記載の方法。 28．コロイド分散系がリポソームである、請求項27に記載の方法。 29．リポソームが本質的にターゲット特異的である、請求項28に記載の方法。 30．リポソームが解剖学的にターゲティング（標的設定）される、請求項29に記載の方法。 31．リポソームが機械学的にターゲティングされる、請求項29に記載の方法。 32．機械学的ターゲティングが受動的である、請求項31に記載の方法。 33．機械学的ターゲティングが能動的である、請求項31に記載の方法。 34．リポソームが糖、糖脂質およびタンパク質よりなる群から選ばれる成分と結合することにより能動的にターゲティングされる、請求項33に記載の方法。 35．タンパク質成分が抗体である、請求項34に記載の方法。 36．前記の運び屋がウイルスである、請求項35に記載の方法。 37．前記のウイルスがＲＮＡウイルスである、請求項36に記載の方法。 38．ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求項37に記載の方法。 39．レトロウイルスが本質的にターゲット特異的である、請求項38に記載の方法。