ES2252331T3 - Procedimiento para la preparacion de acido l-glutamico. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion de acido l-glutamico.Info
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Abstract
Procedimiento para la preparación de ácido L-glutámico por fermentación, que comprende el cultivo de un microorganismo que tiene la capacidad de producir el ácido L-glutámico en un medio con un pH comprendido entre 3, 0 y 5, 0 y que contiene un ácido orgánico, en el que el contenido total del ácido orgánico que inhibe el desarrollo del microorganismo a dicho pH es aquel al cual no se inhibe el desarrollo del microorganismo.
Description
Procedimiento para la preparación de ácido
L-glutámico.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de ácido
L-glutámico por fermentación. El ácido
L-glutámico se utiliza ampliamente como materia
prima de condimento, etcétera.
El ácido L-glutámico se produce
principalmente por fermentación utilizando la denominada bacteria
corineforme que produce ácido L-glutámico que
pertenece al género Brevibacterium, Corynebacterium o
Microbacterium o las cepas mutantes de las mismas (Amino Acid
Fermentation, Gakkai Shuppan Center, págs. 195-215,
1986). Como procedimientos para la preparación de ácido
L-glutámico por fermentación utilizando otras cepas
bacterianas, se conoce un procedimiento que utiliza un
microorganismo que pertenece al género Bacillus, Streptomyces,
Penicillium o similares (patente U.S. nº 3.220.929),
procedimiento que utiliza un microorganismo que pertenece al género
Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida o similares
(patente U.S. nº 3.563.857), procedimiento que utiliza un
microorganismo que pertenece al género Bacillus, Pseudomonas,
Serratia, Aerobacter aerogenes (actualmente denominado
Enterobacter aerogenes) o similares (publicación de patente
japonesa (Kokoku) nº 32-9393), procedimiento que
utiliza una cepa mutante de Escherichia coli (solicitud de
patente japonesa abierta al público (Kokai) nº
5-244970), etcétera. Además, los inventores de la
presente invención propusieron un procedimiento para la preparación
de ácido L-glutámico utilizando un microorganismo
que pertenece al género Klebsiella, Erwinia o Pantoea
(solicitud de patente japonesa abierta al público nº
2000-106869).
Además, se han dado a conocer varias técnicas
para mejorar la capacidad de producción del ácido
L-glutámico aumentando las actividades de las
enzimas biosintéticas de ácido L-glutámico mediante
la utilización de técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, se
publicó que la introducción de un gen que codifica la citrato
sintetasa derivado de Escherichia coli o Corynebacterium
glutamicum fue eficaz para aumentar la capacidad de producción
del ácido L-glutámico en las bacterias
Corynebacterium o Brevibacterium (publicación de
patente japonesa (Kokoku) nº 7-121228). Además, la
solicitud de patente japonesa abierta al público nº
61-268185 da a conocer una célula que alberga el
ADN recombinante que contiene un gen de glutamato deshidrogenasa
procedente de la bacteria Corynebacterium. Además, la
solicitud de patente japonesa abierta al público nº
63-214189 da a conocer una técnica para aumentar la
capacidad de producción de ácido L-glutámico
ampliando un gen de glutamato deshidrogenasa, un gen de isocitrato
deshidrogenasa, un gen de aconitato hidratasa y un gen de citrato
sintetasa.
Aunque la productividad del ácido
L-glutámico ha aumentado considerablemente por la
reproducción de microorganismos anteriormente mencionada o por la
mejora de los métodos de producción, se necesita desarrollar métodos
para producir de manera más eficaz ácido L-glutámico
a coste inferior para satisfacer el aumento adicional de la demanda
en el futuro.
Se conoce un procedimiento en el que la
fermentación se realiza a medida que el
L-aminoácido acumulado en el cultivo cristaliza
(solicitud de patente japonesa abierta al público nº
62-288). En este procedimiento, la concentración de
L-aminoácido en el cultivo se mantiene por debajo de
un determinado nivel mediante la precipitación del
L-aminoácido acumulado en el cultivo.
Particularmente, L-triptófano,
L-tirosina o L-leucina precipitan
durante la fermentación al ajustar la temperatura y el pH del
cultivo o al añadir un tensioactivo al medio.
Aunque se conoce un procedimiento para realizar
la fermentación acompañada de precipitación de
L-aminoácido como se describió anteriormente, los
aminoácidos adecuados para este procedimiento son aquellos que
presentan una solubilidad en agua relativamente baja y no se conoce
ningún ejemplo de aplicación del método a los aminoácidos muy
solubles en agua tales como el ácido L-glutámico.
Además, el medio debe tener pH bajo para precipitar el ácido
L-glutámico. Sin embargo, las bacterias que producen
el ácido L-glutámico, tales como las mencionadas
anteriormente, no pueden desarrollarse en condiciones ácidas y por
consiguiente la fermentación del ácido L-glutámico
se realiza en condiciones neutras (patentes U.S. nº 3.220.929 y nº
3.032.474; K.C. Chao y J.W. Foster, J. Bacteriol., 77, págs.
715-725 (1959)). Por esta razón, la producción de
ácido L-glutámico por fermentación acompañada de
precipitación no es conocida. Además, es conocido que el desarrollo
de las bacterias más acidófilas es inhibido por ácidos orgánicos
tales como el ácido acético, ácido láctico y ácido succínico (Yasuro
Oshima Ed., "Extreme Environment Microorganism Handbook", pág.
231, Science Forum; R.M. Borichewski, J. Bacteriol., 93, págs.
597-599 (1967) etc.). Por consiguiente, se considera
que muchos microorganismos son sensibles al ácido
L-glutámico, que también es un ácido orgánico, en
condiciones ácidas, y no ha existido ninguna publicación de que se
intentase la investigación de los microorganismos que presentan
capacidad de producción de ácido L-glutámico en
condiciones ácidas.
Un objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar un procedimiento para la preparación de ácido
L-glutámico por fermentación, que permite una
producción eficaz de ácido L-glutámico aún cuando se
utilice como fuente de azúcar un material que contiene un ácido
orgánico que inhibe el desarrollo de un microorganismo a pH
bajo.
Los inventores de la presente invención
descubrieron que, a pH neutro, una bacteria productora de ácido
L-glutámico consumía un ácido orgánico que inhibía
el desarrollo de la bacteria productora de ácido
L-glutámico a pH bajo y que basándose en esta
propiedad, el ácido L-glutámico podía ser producido
de manera eficaz utilizando un material que contenía un ácido
orgánico que inhibía el desarrollo de un microorganismo a pH bajo
como fuente de azúcar. Por esta razón, consiguieron la presente
invención.
La presente invención proporciona los
procedimientos siguientes:
(1) Un procedimiento para la preparación de
ácido L-glutámico por fermentación, que comprende el
cultivo de un microorganismo que tiene capacidad para producir ácido
L-glutámico en un medio con un pH comprendido entre
3,0 y 5,0 y que contiene un ácido orgánico, en el que el contenido
total del ácido orgánico que inhibe el desarrollo del microorganismo
a dicho pH es aquel al cual no se inhibe el desarrollo del
microorganismo.
(2) El procedimiento según el apartado (1), en
el que se produce ácido L-glutámico y se acumula en
el medio acompañada de precipitación del ácido
L-glutámico, durante el cultivo en el medio.
(3) El procedimiento según los apartados (1) o
(2), en el que el contenido total de ácido orgánico es 0,2 g/l o
menos.
(4) El procedimiento según cualquiera de los
apartados (1) a (3), en el que el ácido orgánico es un ácido
orgánico con un número de carbonos comprendido entre 1 y 3.
(5) El procedimiento según cualquiera de los
apartados (1) a (4), en el que el microorganismo pertenece al género
Enterobacter.
(6) El procedimiento según el apartado (5), en
el que el microorganismo es Enterobacter agglomerans.
(7) El procedimiento según cualquiera de los
apartados (1) a (6), en el que el microorganismo puede metabolizar
una fuente de carbono en un medio líquido que contiene ácido
L-glutámico a la concentración de saturación y la
fuente de carbono, a un pH comprendido entre 3,0 y 5,0 y tiene
capacidad para acumular ácido L-glutámico en una
cantidad que sobrepasa la concentración de saturación del ácido
L-glutámico en el medio líquido a dicho pH.
(8) Un procedimiento para la preparación de
ácido L-glutámico por fermentación, que comprende el
cultivo de un microorganismo que tiene capacidad para producir ácido
L-glutámico en un medio que contiene un ácido
orgánico a un primer pH comprendido entre 5,0 y 8,0 en el que el
desarrollo del microorganismo no está inhibido por un ácido orgánico
en el medio y a continuación el cultivo del microorganismo a un
segundo pH comprendido entre 3,0 y 5,0.
(9) El procedimiento según el apartado (8), en
el que el ácido orgánico es un ácido orgánico que tiene un número
de carbonos comprendido entre 1 y 3.
(10) El procedimiento según cualquiera de los
apartados (8) ó (9), en el que el cultivo al primer pH se realiza
mientras se mantiene el pH del medio para que sea el primer pH
añadiendo una sustancia alcalinizante al medio.
(11) El procedimiento según el apartado (10), que
comprende la reducción del pH del medio controlando la adición de
una cantidad de sustancia alcalinizante tras el cultivo al primer
pH.
(12) El procedimiento según cualquiera de los
apartados (8) a (11) en el que el cultivo al primer pH continúa
hasta que se elimina el ácido orgánico del medio.
(13) El procedimiento según cualquiera de los
apartados (8) a (12), en el que el microorganismo pertenece al
género Enterobacter.
(14) El procedimiento según el apartado (13), en
el que el microorganismo es Enterobacter agglomerans.
(15) El procedimiento según cualquiera de los
apartados (8) a (14), en el que el microorganismo puede metabolizar
una fuente de carbono en un medio líquido que contiene ácido
L-glutámico a una concentración de saturación y la
fuente de carbono, a un pH comprendido entre 3,0 y 5,0 y tiene
capacidad para acumular ácido L-glutámico en una
cantidad que sobrepasa la concentración de saturación del ácido
L-glutámico en el medio líquido a dicho pH.
(16) El procedimiento según el apartado (15), en
el que el pH adecuado para la producción de ácido
L-glutámico producido por el microorganismo
precipita en el medio y el ácido L-glutámico es
producido y acumulado acompañado de precipitación de ácido
L-glutámico, durante el cultivo en el medio a este
pH.
Según los procedimientos de la presente
invención, el ácido L-glutámico puede ser preparado
eficazmente aún cuando se utilice un material que contiene un ácido
orgánico que inhibe el desarrollo de un microorganismo tal como las
melazas del vino, como fuente de azúcar.
La Fig. 1 es una cartografía con la enzima de
restricción de un fragmento de ADN procedente de Enterobacter
agglomerans en pTWVEK101.
La Fig. 2 presenta la comparación de una
secuencia de aminoácidos deducida a partir de una secuencia de
nucleótidos de un gen sucA procedente de Enterobacter
agglomerans y que procedía de Escherichia coli (parte
superior: Enterobacter agglomerans, columna: Escherichia
coli, lo mismo se aplicará a los apartados siguientes).
La Fig. 3 presenta la comparación de una
secuencia de aminoácidos deducida a partir de una secuencia de
nucleótidos de un gen sucB procedente de Enterobacter
agglomerans y que procedía de Escherichia coli.
La Fig. 4 presenta la comparación de una
secuencia de aminoácidos deducida a partir de una secuencia de
nucleótidos de un gen sucC procedente de Enterobacter
agglomerans y que procedía de Escherichia coli.
La Fig. 5 presenta la comparación de una
secuencia de aminoácidos deducida a partir de una secuencia de
nucleótidos de un gen sdhB procedente de Enterobacter
agglomerans y que procedía de Escherichia coli.
La Fig. 6 presenta la construcción de un plásmido
pMWCPG que contiene un gen gltA, un gen ppc y un gen
gdhA.
La Fig. 7 presenta la construcción de un plásmido
RSF-Tet que contiene un origen de replicación de un
plásmido RSF1010 de amplio espectro en el huésped y un gen con
resistencia a la tetraciclina.
La Fig. 8 presenta la construcción de un plásmido
RSFCPG que contiene un origen de replicación de un plásmido RSF1010
de amplio espectro en el huésped, un gen con resistencia a la
tetraciclina, un gen gltA, un gen ppc y un gen
gdhA.
La Fig. 9 presenta la construcción de un plásmido
pSTVCB que contiene un gen gltA.
La Fig. 10 presenta el efecto de inhibición del
crecimiento de varios ácidos orgánicos a pH ácido (pH 4,5).
La Fig. 11 presenta los resultados de la
investigación utilizando ácido fórmico a un pH al cual se produce la
inhibición del crecimiento.
La Fig. 12 presenta los resultados de la
investigación para la concentración de ácido fórmico que produce la
inhibición del crecimiento a una condición de pH 4,5.
La Fig. 13 presenta el crecimiento celular a lo
largo del tiempo durante el cultivo.
A continuación, se explica con detalle la
presente invención.
El procedimiento de producción según la primera
forma de realización de la presente invención (en lo sucesivo
denominado "primer procedimiento de producción de la presente
invención") es un procedimiento para la preparación de ácido
L-glutámico por fermentación, que comprende el
cultivo de un microorganismo que tiene capacidad de producción de
ácido L-glutámico (denominado también en lo sucesivo
"bacteria productora de ácido L-glutámico") en
un medio con un pH comprendido entre 3,5 y 5,0 y que contiene un
ácido orgánico, en el que el contenido total del ácido orgánico que
inhibe el crecimiento del microorganismo a dicho pH es aquel al cual
no se inhibe el crecimiento del microorganismo.
En el primer procedimiento de producción de la
presente invención, se prefiere que el ácido
L-glutámico sea producido y acumulado por el cultivo
en un medio acompañada de precipitación del ácido
L-glutámico. Esto puede conseguirse ajustando el pH
del medio a un pH al cual precipite el ácido
L-glutámico producido. Dicho pH está comprendido
entre 3,0 y 5,0. En la producción del ácido
L-glutámico por fermentación, se considera que la
reducción de la productividad por el ácido
L-glutámico acumulado en el medio a alta
concentración constituye un obstáculo para mejorar la
productividad. Por ejemplo, una célula microbiana tiene un sistema
de descarga y un sistema de absorción de ácido
L-glutámico y si el ácido
L-glutámico una vez descargado en el medio es
absorbido en el interior de la célula de nuevo, no solo se reduce la
producción eficazmente, sino que también se produce la inhibición de
las reacciones por la biosíntesis de ácido
L-glutámico. Realizando el cultivo a un pH al cual
precipite el ácido L-glutámico producido, puede
evitarse dicha reducción de productividad debida a la acumulación
de ácido L-glutámico a alta concentración.
El medio preferentemente presenta un pH de 4,5 o
menos, más preferentemente de 4,0 o menos.
En la presente forma de realización, el ácido
orgánico que inhibe el crecimiento de un microorganismo al pH del
medio significa un ácido orgánico que presenta un efecto inhibidor
en la inhibición del crecimiento del microorganismo cuando existe
una determinada concentración (normalmente 0,5 g/l o más) en el
medio al pH y es normalmente un ácido orgánico con un número de
carbonos de 1 a 3, es decir, ácido acético, ácido fórmico o ácido
propiónico.
El contenido total del ácido orgánico es 0,2 g/l
o menos.
El procedimiento de producción según la segunda
forma de realización de la presente invención (en lo sucesivo
denominado "segundo procedimiento de producción de la presente
invención") es un procedimiento para la preparación de ácido
L-glutámico por fermentación, que comprende el
cultivo de un microorganismo que tiene capacidad de producción de
ácido L-glutámico en un medio que contiene un ácido
orgánico a un primer pH comprendido entre 5,0 y 8,0, al cual el
crecimiento del microorganismo no está inhibido por un ácido
orgánico en el medio y a continuación el cultivo del microorganismo
a un segundo pH comprendido entre 3,0 y 5,0.
Se descubrió que la bacteria productora de ácido
L-glutámico generalmente adolecía de inhibición de
crecimiento por un ácido orgánico en condiciones ácidas, mientras
que pudo consumir un ácido orgánico en condiciones neutras.
Basándose en esta propiedad, al efectuar el cultivo celular a un pH
neutro y a continuación cambiar el pH a pH ácido para producir ácido
L-glutámico, sería posible obtener mayor
productividad y también sería posible utilizar varios materiales
como fuente de azúcar.
En la presente forma de realización, el ácido
orgánico significa un ácido orgánico que presenta un efecto
inhibidor en el crecimiento del microorganismo cuando existe una
determinada concentración (normalmente 0,5 g/l o más) en un medio al
segundo pH y es normalmente un ácido orgánico con un número de
carbonos de 1 a 3, es decir, ácido acético, ácido fórmico o ácido
propiónico.
El primer pH y el segundo pH se seleccionan a fin
de que reúnan las propiedades de la bacteria productora de ácido
L-glutámico que debe utilizarse. Estos valores de pH
pueden ser medidos fácilmente por los expertos en la materia. Por
ejemplo, el pH al cual no se produce la inhibición del crecimiento
del microorganismo por un ácido orgánico en un medio puede ser
determinado cultivando una bacteria productora de ácido
L-glutámico en un medio que contiene un ácido
orgánico ajustado a varios valores de pH, midiendo las cantidades de
células basándose en la absorbancia o similares y comparando las
cantidades de células con las cantidades de células de las
bacterias productoras de ácido L-glutámico
cultivadas en las mismas condiciones excepto que el medio no
contenga el ácido orgánico. El pH adecuado para la producción de
ácido L-glutámico se refiere al pH al cual se
acumula el ácido L-glutámico en un medio, que puede
determinarse cultivando una bacteria productora de ácido
L-glutámico en un medio de varios valores de pH.
Particularmente, puede determinarse midiendo las cantidades de ácido
L-glutámico acumuladas en el medio de varios valores
de pH y comparándolas.
El primer pH no está limitado particularmente
siempre que el crecimiento del microorganismo no esté inhibido por
el ácido orgánico en el medio, pero está comprendido entre 5,0 y
8,0.
El segundo pH es preferentemente un pH al cual
precipita el ácido L-glutámico producido, y dicho pH
está comprendido entre 3,0 y 5,0. Como se explicó en el primer
procedimiento de producción de la presente invención, la reducción
de productividad por acumulación de ácido
L-glutámico a una concentración elevada puede
evitarse realizando el cultivo a un pH al cual precipite el ácido
L-glutámico producido.
El primer pH y el segundo pH pueden no ser
estrictamente constantes durante el cultivo siempre que puedan
obtenerse las ventajas de la presente invención y pueden
fluctuar.
La bacteria productora de ácido
L-glutámico produce ácido
L-glutámico incluso al primer pH, y por consiguiente
el ácido L-glutámico producido reduce el pH. Por
consiguiente, el cultivo al primer pH se realiza preferentemente
mientras se mantiene el pH del medio al primer pH añadiendo una
sustancia alcalinizante al medio.
Aunque la sustancia alcalinizante no está
particularmente limitada siempre que no afecte desfavorablemente al
crecimiento de la bacteria productora de ácido
L-glutámico o a la producción de ácido
L-glutámico, se prefiere gas amoniaco.
El pH del medio puede ser reducido desde el
primer pH al segundo pH añadiendo una sustancia ácida. Sin embargo,
el pH es reducido por el ácido L-glutámico producido
por la bacteria productora de ácido L-glutámico
durante el cultivo como se describió anteriormente. Por
consiguiente, es preferible reducir el pH del medio desde el primer
pH al segundo pH controlando la cantidad de adición de sustancia
alcalinizante, porque la adición de la sustancia ácida puede
omitirse.
El cultivo al primer pH puede continuarse hasta
que se elimine el ácido orgánico en el medio. La eliminación
significa que la cantidad de ácido orgánico disminuye hasta una
concentración a la cual el crecimiento de la bacteria productora de
ácido L-glutámico no esté inhibido durante el
cultivo al segundo pH. Los expertos en la materia pueden medir
fácilmente dicha concentración de ácido orgánico. Por ejemplo, la
concentración puede determinarse cultivando una bacteria productora
de ácido L-glutámico en el medio que contiene un
ácido orgánico a varias concentraciones al segundo pH, midiendo las
cantidades de células de la bacteria productora de ácido
L-glutámico y comparando las cantidades de células
con las cantidades de células de la bacteria productora de ácido
L-glutámico cultivada en las mismas condiciones
excepto que el medio no contiene el ácido orgánico. Generalmente, a
medida que el segundo pH se hace más bajo, el nivel de ácido
orgánico también se hace más bajo.
La bacteria productora de ácido
L-glutámico utilizada en el primer procedimiento de
producción de la presente invención y en el segundo procedimiento de
producción de la presente invención es un microorganismo que acumula
una cantidad significativa de ácido L-glutámico en
un medio cuando se cultiva en el medio. Ejemplos de éstos comprenden
los microorganismos que pertenecen al género Enterobacter. Se
prefiere Enterobacter agglomerans.
Además, la bacteria productora de ácido
L-glutámico utilizada en el primer y segundo
procedimientos de producción de la presente invención es
preferentemente un microorganismo que puede metabolizar una fuente
de carbono en un medio líquido que contiene ácido
L-glutámico a una concentración de saturación y la
fuente de carbono, a un pH específico, y no tiene capacidad para
acumular ácido L-glutámico en una cantidad que
sobrepasa la concentración de saturación del ácido
L-glutámico en el medio líquido al pH mencionado
anteriormente (denominado también en lo sucesivo "microorganismo
que acumula ácido L-glutámico"). El pH específico
mencionado anteriormente es preferentemente un pH al cual precipita
el ácido L-glutámico en el medio y dicho pH está
comprendido entre 3,0 y 5,0.
"Concentración de saturación" significa una
concentración de ácido L-glutámico disuelto en el
medio líquido cuando el medio líquido está saturado de ácido
L-glutámico.
Cuando se utiliza un microorganismo que acumula
ácido L-glutámico, el pH adecuado para la producción
de ácido L-glutámico es preferentemente un pH al que
precipita el ácido L-glutámico en el medio.
Realizando el cultivo a este pH, se produce ácido
L-glutámico y se acumula en el medio acompañado de
precipitación.
El microorganismo que acumula ácido
L-glutámico puede obtenerse de la forma siguiente.
Se inocula una muestra que contiene microorganismos en un medio
líquido que contiene ácido L-glutámico a una
concentración de saturación y una fuente de carbono, a un pH entre
3,0 y 5,0 y se selecciona una cepa que metaboliza la fuente de
carbono. El pH preferentemente es aproximadamente 4,5 o menos, más
preferentemente aproximadamente 4,3 o menos. Se utiliza el
microorganismo que acumula ácido L-glutámico para la
producción de ácido L-glutámico por fermentación
acompañada de precipitación de ácido L-glutámico. Si
el pH es demasiado alto, sería difícil permitir que el
microorganismo produjera ácido L-glutámico en una
cantidad suficiente para la precipitación. Por consiguiente el pH
está comprendido en el intervalo mencionado anteriormente.
Si el pH de una solución acuosa que contiene
ácido L-glutámico disminuye, la solubilidad del
ácido L-glutámico se reduce de manera significativa
en torno al pKa del grupo \gamma-carboxilo (4,25,
25ºC). La solubilidad llega a ser la menor en el punto isoeléctrico
(pH 3,2) y precipita el ácido L-glutámico que
sobrepasa la cantidad correspondiente a la concentración de
saturación. Mientras dependa de la composición del medio, el ácido
L-glutámico se disuelve en una cantidad comprendida
entre 10 y 20 g/l a pH 3,2, entre 30 y 40 g/l a pH 4,0 y entre 50 y
60 g/l a pH 4,7, a aproximadamente 30ºC.
Además, la expresión de que un microorganismo
"puede metabolizar una fuente de carbono" significa que puede
proliferar o puede consumir una fuente de carbono aún cuando no
pueda proliferar, esto es, indica que cataboliza una fuente de
carbono como por ejemplo azúcares o ácidos orgánicos.
Particularmente, por ejemplo, si un microorganismo prolifera cuando
se cultiva en un medio líquido que contiene ácido
L-glutámico a una concentración de saturación a un
pH comprendido entre 5,0 y 4,0, preferentemente a un pH entre 4,5 y
4,0, más preferentemente a un pH entre 4,3 y 4,0, en particular
preferentemente a un pH 4,0, a una temperatura apropiada, por
ejemplo, 28ºC, 37ºC o 50ºC, durante 2 a 4 días, este microorganismo
puede metabolizar la fuente de carbono en el medio. Además, por
ejemplo, si un microorganismo consume una fuente de carbono aún
cuando el microorganismo no pueda proliferar, cuando se cultiva en
un medio líquido sintético que contiene ácido
L-glutámico a la concentración de saturación a un pH
comprendido entre 5,0 y 4,0, preferentemente a un pH entre 4,5 y
4,0, más preferentemente a un pH entre 4,3 y 4,0, en particular
preferentemente a un pH 4,0, a una temperatura apropiada, por
ejemplo, 28ºC, 37ºC o 50ºC, durante un periodo comprendido entre 2 y
4 días, el microorganismo es un microorganismo que puede metabolizar
la fuente de carbono en el medio.
El microorganismo que puede metabolizar una
fuente de carbono comprende un microorganismo que puede
desarrollarse en el medio líquido mencionado anteriormente.
Además, la expresión de que un microorganismo
"puede desarrollarse" significa que puede proliferar o que
puede producir ácido L-glutámico aún cuando no pueda
proliferar. Particularmente, si un microorganismo prolifera cuando
se cultiva en un medio líquido que contiene ácido
L-glutámico a la concentración de saturación a un pH
comprendido entre 5,0 y 4,0, preferentemente a un pH comprendido
entre 4,5 y 4,0, más preferentemente a un pH comprendido entre 4,3 y
4,0, en particular preferentemente a un pH 4,0, a una temperatura
apropiada, por ejemplo, 28ºC, 37ºC o 50ºC, durante un periodo
comprendido entre 2 y 4 días, este microorganismo puede
desarrollarse en el medio. Además, por ejemplo, si un microorganismo
aumenta la cantidad de ácido glutámico en un medio líquido sintético
aún cuando el microorganismo no prolifere, cuando el microorganismo
se cultiva en un medio líquido sintético que contiene ácido
L-glutámico a la concentración de saturación a un pH
comprendido entre 5,0 y 4,0, preferentemente a un pH comprendido
entre 4,5 y 4,0, más preferentemente a un pH comprendido entre 4,3 y
4,0, en particular preferentemente a un pH 4,0, a una temperatura
apropiada, por ejemplo, 28ºC, 37ºC o 50ºC, durante un periodo
comprendido entre 2 y 4 días, este microorganismo es un
microorganismo que puede desarrollarse en el medio.
La selección descrita anteriormente puede
repetirse dos o más veces en las mismas condiciones o con cambio de
pH o de concentración de ácido L-glutámico. Puede
realizarse una selección para una etapa inicial en un medio que
contiene ácido L-glutámico a una concentración menor
de la concentración de saturación y después puede realizarse una
selección ulterior en un medio que contiene ácido
L-glutámico a la concentración de saturación.
Además, pueden seleccionarse cepas con propiedades favorables como
por ejemplo con velocidad de proliferación superior.
El microorganismo que acumula ácido
L-glutámico es un microorganismo que tiene la
capacidad de acumular ácido L-glutámico en una
cantidad que supera la cantidad correspondiente a la concentración
de saturación de ácido L-glutámico en un medio
líquido, además de las propiedades descritas anteriormente. El pH
del medio líquido mencionado anteriormente es preferentemente el
mismo o próximo al del medio utilizado para identificar un
microorganismo que presenta las propiedades mencionadas
anteriormente. Normalmente, un microorganismo se vuelve sensible al
ácido L-glutámico a concentración alta a medida que
el pH se vuelve más bajo. Por consiguiente, se prefiere que el pH
no sea bajo desde el punto de vista de la resistencia al ácido
L-glutámico, pero se prefiere un pH bajo desde el
punto de vista de la producción de ácido L-glutámico
acompañado de precipitación. Para satisfacer estas condiciones, el
pH puede estar comprendido entre 3 y 5, preferentemente entre 4 y 5,
más preferentemente entre 4 y 4,7, aún más preferentemente entre 4 y
4,5, en particular preferentemente entre 4,0 y 4,3.
Como microorganismo que acumula ácido
L-glutámico de los materiales de reproducción o para
éstos, puede mencionarse, por ejemplo, los microorganismos que
pertenecen al género Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea,
Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Alicyclobacillus, Bacillus,
Saccharomyces o similares. Entre éstos, los microorganismos que
pertenecen al género Enterobacter son los preferidos. En lo
sucesivo, los microorganismos de la presente invención se
explicarán principalmente por los microorganismos que pertenecen al
género Enterobacter. Sin embargo, el microorganismo no está
limitado a los que pertenecen al género Enterobacter, y
pueden utilizarse igualmente los que pertenecen a otros géneros.
Como microorganismos que pertenecen al género
Enterobacter, pueden mencionarse particularmente
Enterobacter agglomerans, preferentemente la cepa AJ13355 de
Enterobacter agglomerans. Esta cepa se aisló del suelo en
Iwata-shi, Shizuoka, Japón como una cepa que puede
proliferar en un medio que contiene ácido
L-glutámico y una fuente de carbono a pH bajo.
A continuación se presentan las propiedades
fisiológicas de AJ13355:
- (1)
- Tinción Gram: negativa
- (2)
- Comportamiento frente al oxígeno: anaerobio facultativo
- (3)
- Catalasa: positiva
- (4)
- Oxidasa: negativa
- (5)
- Capacidad reductora de nitrato: negativa
- (6)
- Prueba de Voges-Proskauer: positiva
- (7)
- Prueba del rojo de metilo: negativa
- (8)
- Ureasa: negativa
- (9)
- Producción de indol: positiva
- (10)
- Movilidad: móvil
- (11)
- Producción de H_{2}S en medio TSI: muy poco activa
- (12)
- \beta-galactosidasa: positiva
- (13)
- Propiedad de asimilar sacáridos:
- Arabinosa: positiva
- Sacarosa: positiva
- Lactosa: positiva
- Xilosa: positiva
- Sorbitol: positiva
- Inositol: positiva
- Trehalosa: positiva
- Maltosa: positiva
- Glucosa: positiva
- Adonitol: negativa
- Rafinosa: positiva
- Salicina: negativa
- Melibiosa: positiva
- (14)
- Propiedad de asimilar glicerosa: positiva
- (15)
- Propiedad de asimilar ácidos orgánicos:
- Ácido cítrico: positiva
- Ácido tartárico: negativa
- Ácido glucónico: positiva
- Ácido acético: positiva
- Ácido malónico: negativa
- (16)
- Arginina deshidratasa: negativa
- (17)
- Ornitina descarboxilasa: negativa
- (18)
- Lisina descarboxilasa: negativa
- (19)
- Fenilalanina desaminasa: negativa
- (20)
- Formación de pigmento: amarillo
- (21)
- Capacidad de licuefacción de la gelatina: positiva
- (22)
- pH de crecimiento: crecimiento posible a pH 4, buen crecimiento a pH comprendido entre 4,5 y 7.
- (23)
- Temperatura de crecimiento: buen crecimiento a 25ºC, buen crecimiento a 30ºC, buen crecimiento a 37ºC, crecimiento posible a 42ºC, crecimiento imposible a 45ºC.
Basándose en estas propiedades bacteriológicas,
se determinó AJ13355 como Enterobacter agglomerans.
La AJ13355 de Enterobacter agglomerans se
depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología humana,
Agencia de Ciencia y Tecnología industrial, Ministerio de Comercio e
Industria internacional (actualmente, depositario del organismo de
patentes internacionales, Instituto nacional de Ciencia y Tecnología
industrial avanzada) el 19 de febrero de 1998 y recibió e número de
registro FERM P-16644. Se transfirió a continuación
a un depósito internacional bajo las estipulaciones del tratado de
Budapest el 11 de enero de 1999 y recibió el número de registro FERM
BP-6614.
El microorganismo que acumula ácido
L-glutámico puede ser un microorganismo que
originalmente tiene capacidad para producir ácido
L-glutámico o el que tiene capacidad comunicada o
aumentada para producir ácido L-glutámico mediante
reproducción a través de la utilización de un tratamiento de
mutagénesis, técnicas de ADN recombinante o similares.
La capacidad para producir ácido
L-glutámico puede comunicarse o aumentarse, por
ejemplo, aumentando la actividad de una enzima que cataliza una
reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico.
La capacidad para producir ácido L-glutámico puede
también aumentarse disminuyendo o eliminando la actividad de una
enzima que cataliza una reacción que sale de la serie de reacciones
biosintéticas del ácido L-glutámico y genera otro
compuesto aparte del ácido L-glutámico.
Como ejemplos de enzimas que catalizan la
reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico,
pueden mencionarse glutamato deshidrogenasa (en lo sucesivo,
denominada también "GDH"), glutamina sintetasa, glutamato
sintetasa, isocitrato deshidrogenasa, aconitato hidratasa, citrato
sintetasa (en lo sucesivo, denominada también "CS"),
fosfoenolpiruvato carboxilasa (en lo sucesivo, denominada también
"PEPC"), piruvato deshidrogenasa, piruvato cinasa, enolasa,
fosforogliceromutasa, fosfoglicerato cinasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, triosafosfato isomerasa, bifosfato de fructosa
aldolasa, fosfofructocinasa, fosfato de glucosa isomerasa, etcétera.
Entre estas enzimas, se prefieren una, dos o tres de CS, PEPC y GDH.
Además, se prefiere que las actividades de las tres enzimas, CS,
PEPC y GDH, estén aumentadas en el microorganismo que acumula ácido
L-glutámico. En particular, se prefiere CS de
Brevibacterium lactofermentum, porque no adolece de la
inhibición por el ácido \alpha-cetoglutárico, el
ácido L-glutámico y NADH.
A fin de aumentar la actividad de CS, PEPC o GDH,
por ejemplo, un gen que codifica CS, PEPC o GDH puede clonarse en un
plásmido apropiado y puede transformarse un microorganismo anfitrión
con el plásmido obtenido. El número de copias del gen que codifica
CS, PEPC o GDH (en lo sucesivo, abreviado como "gen
gltA", "gen ppc" y "gen gdhA",
respectivamente) aumenta en la célula de la cepa transformada,
produciendo el aumento de la actividad de CS, PEPC o GDH.
Los genes gltA, ppc y gdhA
clonados se introducen en la cepa precursora de partida mencionada
anteriormente sola o en combinación de dos o tres tipos arbitrarios
de ellos. Cuando se introducen dos o tres tipos de los genes, pueden
clonarse dos o tres tipos de genes en un tipo de plásmido e
introducirse en el anfitrión, o clonarse aparte en dos o tres tipos
de plásmido que pueden coexistir e introducirse en el anfitrión.
Dos o más tipos de genes que codifican una enzima
del mismo tipo, pero procedente de diferentes microorganismos, puede
introducirse en el mismo anfitrión.
Los plásmidos descritos anteriormente no están
limitados particularmente a condición de que sean replicables de
forma autónoma en una célula de un microorganismo que pertenece, por
ejemplo, al género Enterobacter o similares. Sin embargo,
pueden mencionarse, por ejemplo, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299,
pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218,
pACYC177, pACYC184, etcétera. Aparte de éstos, pueden utilizarse
también los vectores del ADN del fago.
La transformación puede realizarse, por ejemplo,
por el método de D.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326
(1979)), método en el que aumenta la permeabilidad al ADN de las
bacterias receptores mediante el tratamiento de las células con
cloruro de calcio (Mandel M. e Higa A., J. Mol. Biol.,
53, 159 (1970)), electroporación (Miller J.H., "A Short Course in
Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.,
1992) o similares.
La actividad de CS, PEPC o GDH también puede
aumentarse permitiendo copias múltiples del gen gltA, del gen
ppc o del gen gdhA en el ADN cromosómico de la cepa
precursora de partida mencionada anteriormente que debe ser un
anfitrión. A fin de introducir copias múltiples del gen gltA,
el gen ppc o el gen gdhA en el ADN cromosómico de un
microorganismo que pertenece al género Enterobacter o
similar, puede utilizarse una secuencia de la cual múltiples copias
están presentes en el ADN cromosómico, tal como el ADN repetitivo y
se presentan repeticiones invertidas en el terminal de un elemento
transponible. Como alternativa, pueden introducirse múltiples
copias de los genes en el ADN cromosómico utilizando la
transferencia de un transposón que contiene el gen gltA,el
gen ppc o el gen gdhA. Como resultado, aumenta el
número de copias del gen gltA, del gen ppc o del gen
gdhA en una célula de la cepa transformada y por lo tanto
aumenta la actividad de CS, PEPC o GDH.
Como organismos utilizados como fuente del gen
gltA, del gen ppc o del gen gdhA de los cuales
debe aumentar el número de copias, se puede utilizar cualquier
organismo siempre que presente actividad de CS, PEPC o GDH. Entre
otras, se prefieren las bacterias, que son procariotas, por ejemplo
las que pertenecen al género Enterobacter, Klebsiella,
Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium,
Brevibacterium o Bacillus. Como ejemplos específicos, se
pueden mencionar Escherichia coli, Brevibacterium
lactofermentum, etcétera. El gen gltA, el gen ppc
y el gen gdhA pueden obtenerse del ADN cromosómico de los
microorganismos descritos anteriormente.
El gen gltA, el gen ppc y el gen
gdhA pueden obtenerse utilizando una cepa mutante que carece
de actividad de CS, PEPC o GDH para aislar un fragmento de ADN que
complementa su auxotrofía del ADN cromosómico del microorganismo
mencionado anteriormente. Además, como las secuencias de nucleótidos
de estos genes de las bacterias Escherichia y
Corynebacterium se han aclarado ya (Biochemistry, 22,
págs. 5243-5249, (1983); J. Biochem., 95,
págs. 909-916, (1984); Gene, 27, págs.
193-199, (1984); Microbiology, 140, págs.
1817-1828, (1994); Mol. Gen. Genet., 218,
págs. 330-339, (1989); Molecular
Microbiology, 6, págs. 317-326, (1992)), pueden
obtenerse también por PCR utilizando cebadores sintetizados
basándose en cada secuencia de nucleótidos y en el ADN cromosómico
como plantilla.
La actividad de CS, PEPC o GDH puede aumentarse
también incrementando la expresión del gen gltA, del gen
ppc o del gen gdhA, además de la ampliación de los
genes mencionada anteriormente. Por ejemplo, puede aumentarse la
expresión sustituyendo un activador para el gen gltA, el gen
ppc o el gen gdhA por otro activador más potente. Por
ejemplo, el activador lac, el activador trp, el
activador trc, el activador tac, el activador P_{R}
y el activador P_{L} del fago lambda, etcétera, son conocidos
como potentes activadores. El gen gltA, el gen ppc y
el gen gdhA cuyo activador se sustituye se clonan en un
plásmido y se introducen en el microorganismo anfitrión o se
introducen en el ADN cromosómico del microorganismo anfitrión
utilizando ADN repetitivo, repetición invertida, transposones o
similares.
La actividad de CS, PEPC o GDH también puede
aumentarse sustituyendo el activador del gen gltA, del gen
ppc o del gen gdhA en el cromosoma por otro activador
más potente (véase el documento WO 87/03006 y la solicitud de
patente japonesa abierta al público nº 61-268183) o
insertando un activador potente corriente arriba de la secuencia de
codificación de cada gen (véase Gene, 29, págs.
231-241 (1984)). Particularmente, puede realizarse
la recombinación homóloga entre el gen gltA, el gen
ppc o el gen gdhA cuyo activador está sustituido por
uno más potente o un ADN que contiene una parte de éste y el
correspondiente gen en el cromosoma.
Ejemplos de enzimas que cataliza la reacción que
sale de la serie de reacciones biosintéticas del ácido
L-glutámico y genera otro compuesto aparte del ácido
L-glutámico comprenden
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa (en lo
sucesivo denominada "\alphaKGDH"), isocitrato liasa, fosfato
acetiltransferasa, acetato cinasa, ácido acetohidroxi sintetasa,
acetolactado sintetasa, formato acetiltransferasa, lactato
deshidrogenasa, glutamato decarboxilasa,
1-pirrolina-deshidrogenasa,
etcétera. Entre estas enzimas, se prefiere \alphaKGDH.
A fin de reducir o eliminar las actividades de
las enzimas mencionadas anteriormente en un microorganismo que
pertenece al género Enterobacter o similar, pueden
introducirse mutaciones para disminuir o eliminar la actividad
intracelular de las enzimas en los genes de las enzimas mencionadas
anteriormente mediante un método de tratamiento de mutagénesis
habitual o un método de ingeniería genética.
Ejemplos de método de tratamiento de mutagénesis
comprenden, por ejemplo, los métodos que utilizan irradiación con
rayos-X o rayos ultravioleta, los métodos que
utilizan el tratamiento con un agente de mutagénesis tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
etcétera. Esta zona del gen en la que se introduce la mutación puede
estar en una zona de codificación codificando una proteína
enzimática o en una zona para la regulación de la expresión, tal
como un activador.
Ejemplos de métodos de ingeniería genética
comprenden, por ejemplo, los métodos que utilizan recombinación
génica, transducción, fusión celular, etcétera. Por ejemplo, un gen
con resistencia a fármacos se inserta en un gen diana clonado para
preparar un gen que ha perdido su función (gen defectuoso).
Posteriormente, este gen defectuoso se introduce en una célula de un
microorganismo anfitrión y el gen diana en el cromosoma se sustituye
por el gen defectuoso mencionado anteriormente utilizando
recombinación homóloga (destrucción del gen).
La disminución o insuficiencia de la actividad
intracelular en la enzima diana y el grado de disminución de la
actividad pueden confirmarse midiendo la actividad de la enzima de
un extracto celular o de una fracción purificada de la misma
obtenida a partir de una cepa experimental y comparándola con la de
una cepa natural. Por ejemplo, la actividad de \alphaKGDH puede
medirse por el método de Reed et al., (Reed L.J. y Mukherjee
B.B., Methods in Enzymology, 13, págs. 55-61
(1969)).
Dependiendo de la enzima diana, puede
seleccionarse una cepa mutante diana basándose en el fenotipo de la
cepa mutante. Por ejemplo, una cepa mutante en la que la actividad
de \alphaKGDH se elimine o disminuya no puede proliferar o
presenta una tasa de proliferación reducida en un medio mínimo que
contiene glucosa o en un medio mínimo que contiene ácido acético o
ácido L-glutámico como fuente de carbón exclusiva en
condiciones de cultivo anaeróbicas. Sin embargo, la proliferación
normal es incapaz incluso en las mismas condiciones de añadir ácido
succínico o lisina, metionina y ácido diaminopimélico en un medio
mínimo que contiene glucosa. Utilizando estos fenómenos como
indicadores, puede seleccionarse una cepa mutante con actividad
disminuida o con insuficiente actividad de
\alphaKGDH.
\alphaKGDH.
En el documento WO 95/34672 se da a conocer con
detalle un método para la preparación de una cepa con insuficiencia
del gen \alphaKGDH de Brevibacterium lactofermentum
utilizando recombinación homóloga. Pueden aplicarse métodos
similares a otros microorganismos.
Además, técnicas tales como la clonación de los
genes y la digestión y ligadura del ADN, la transformación,
etcétera, se describen con detalle en Molecular Cloning, 2ª edición,
Cold Spring Harbor Press (1989), etcétera.
Como ejemplo específico de cepa mutante que
carece de actividad de \alphaKGDH o con actividad de \alphaKGDH
disminuida tal como se describió anteriormente, puede mencionarse
AJ13356 de Enterobacter agglomerans.
La AJ13355 de Enterobacter agglomerans se
depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología humana,
Agencia de Ciencia y Tecnología industrial, Ministerio de Comercio e
Industria internacional (actualmente, depositario del organismo de
patentes internacionales, Instituto nacional de Ciencia y Tecnología
industrial avanzada) el 19 de febrero de 1998 y recibió e número de
registro FERM P-16645. Se transfirió a continuación
a un depósito internacional bajo las estipulaciones del tratado de
Budapest el 11 de enero de 1999 y recibió el número de registro FERM
BP-6615. La AJ13356 de Enterobacter
agglomerans carece de actividad de \alphaKGDH como resultado
de la destrucción del gen de la subunidad
\alphaKGDH-E1 (sucA).
Cuando Enterobacter agglomerans, que es un
ejemplo de microorganismo utilizado en la presente invención, se
cultiva en un medio que contiene un sacárido, se segrega
extracelularmente mucosidad, produciendo ocasionalmente una baja
eficacia en la operación. Por consiguiente, cuando se utiliza
Enterobacter agglomerans,que presenta dicha propiedad de
segregar mucosidad, es preferible utilizar una cepa mutante que
segregue menos mucosidad en comparación con una cepa natural.
Ejemplos de métodos de tratamiento de mutagénesis comprenden, por
ejemplo, los métodos que utilizan irradiación con
rayos-X o rayos ultravioleta, los métodos que
utilizan el tratamiento con un agente de mutagénesis tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina,
etcétera. Puede seleccionarse una cepa mutante con menor secreción
de mucosidad inoculando células bacterianas mutagenizadas en un
medio que contiene un sacárido, por ejemplo, una placa con medio LB
que contiene 5 g/l de glucosa, cultivándola con una inclinación de
la placa de 45 aproximadamente grados y seleccionando una colonia
que no presente flujo de mucosidad.
\newpage
En la presente invención, la transmisión o
aumento de la capacidad productora de ácido
L-glutámico y la transmisión de otras propiedades
favorables tales como la mutación para una menor secreción de
mucosidad descritas anteriormente pueden realizarse en orden
arbitrario.
Cultivando el microorganismo que acumula ácido
L-glutámico en un medio líquido que se ajuste a la
condición de pH que permite la precipitación del ácido
L-glutámico, puede producirse y acumularse ácido
L-glutámico acompañada de su precipitación en el
medio.
La "condición que permite la precipitación del
ácido L-glutámico producido por el
microorganismo" citada en la presente memoria significa una
condición que permite la precipitación del ácido
L-glutámico cuando el microorganismo que acumula
ácido L-glutámico produce y acumula ácido
L-glutámico. Aunque el pH de esta condición puede
variar dependiendo de la capacidad de producción de ácido láctico
del microorganismo, normalmente está comprendido entre 3 y 5 cuando
el microorganismo es una bacteria Enterobacter.
Como medio utilizado para el cultivo en el primer
método de producción de la presente invención, en el cultivo al
primer pH y en el cultivo al segundo pH en el segundo método de
producción de la presente invención, puede utilizarse un medio
nutriente habitual que contiene una fuente de carbono, una fuente de
nitrógeno, sales minerales y vestigios de nutrientes orgánicos tales
como aminoácidos y vitaminas según se requiera siempre que el pH se
ajuste a fin de satisfacer la condición predeterminada. Puede
utilizarse ya sea un medio sintético o un medio natural. La fuente
de carbono y la fuente de nitrógeno utilizadas en el medio pueden
ser cualesquiera siempre que puedan ser utilizadas por la cepa que
se debe cultivar.
Como fuente de carbono, se utilizan sacáridos
tales como glucosa, glicerol, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa,
galactosa, hidrolizado de almidón y melazas. Además, pueden
utilizarse ácidos orgánicos tales como el ácido acético y el ácido
cítrico solos o en combinación con otra fuente de carbono.
Como fuente de nitrógeno, se utiliza amoniaco,
sales de amonio tales como sulfato de amonio, carbonato de amonio,
cloruro de amonio, fosfato de amonio y acetato de amonio, nitratos y
etcétera.
Como vestigios de nutrientes orgánicos, se
utilizan aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos, ácidos nucleicos,
aquellos que contienen sustancias tales como peptona, casaminoácido,
extracto de levadura y productos de descomposición de la proteína de
la soja. Cuando se utiliza una cepa mutante auxótrofa que requiere
un aminoácido, etcétera, para la metabolización o el crecimiento, el
nutriente requerido debe ser enriquecido.
Como sales minerales, se utilizan fosfatos, sales
de magnesio, sales de calcio, sales de hierro, sales de manganeso,
etcétera.
Como método de cultivo, normalmente se realiza el
cultivo por aireación entre 20 y 42ºC siempre que el pH se controle
para que resulte un valor predeterminado.
Una vez terminado el cultivo, el ácido
L-glutámico precipitado en el cultivo puede
recogerse por centrifugación, filtración o similares. El ácido
L-glutámico disuelto en el medio puede recogerse
también por métodos conocidos. Por ejemplo, el ácido
L-glutámico puede aislarse concentrando el caldo de
cultivo para cristalizarlo o aislarse por cromatografía de
intercambio iónico o similares. También es posible cristalizar el
ácido L-glutámico disuelto en el medio y a
continuación recoger el precipitado de ácido
L-glutámico en el caldo de cultivo junto con el
ácido L-glutámico cristalizado.
En una forma de realización en la que precipita
el ácido L-glutámico que sobrepasa la concentración
de saturación, la concentración de ácido L-glutámico
disuelto en el medio se mantiene a una concentración constante. Por
consiguiente, puede reducirse la influencia del ácido
L-glutámico a concentración elevada en los
microorganismos. Así pues, también sería posible reproducir un
microorganismo que presenta una capacidad mejorada adicional para
producir ácido L-glutámico. Además, como el ácido
L-glutámico precipita en forma de cristales, se
suprime la acidificación del caldo de cultivo por acumulación de
ácido L-glutámico y por consiguiente puede reducirse
significativamente la cantidad de álcali utilizado para mantener el
pH del cultivo.
A continuación, la presente invención se explica
de manera más específica con referencia a los siguientes ejemplos.
En los ejemplos, los aminoácidos son L-aminoácidos a
menos que se indique de otro modo.
Ejemplo de Referencia
1
La identificación de un microorganismo con
resistencia al ácido L-glutámico en medio ácido se
realizó de la manera siguiente. Un (1) g de cada una de las
aproximadamente 500 muestras obtenidas de la naturaleza incluyendo
suelo, frutas, organismos vegetales, agua de río, etcétera, se puso
en suspensión en 5 ml de agua esterilizada y 200 \mul de la misma
se colocó sobre 20 ml de medio sólido ajustado a un pH de 4,0 con
HCl. La composición del medio fue la siguiente: 3 g/l de glucosa, 1
g/l de sulfato de amonio, 0,2 g/l de sulfato de magnesio
heptahidratado, 0,5 g/l de fosfato dibásico de potasio, 0,2 g/l de
cloruro de sodio, 0,1 g/l de cloruro de calcio dihidratado, 0,01 g/l
de sulfato ferroso heptahidratado, 0,01 g/l de sulfato de manganeso
tetrahidratado, 0,72 mg/l de sulfato de cinc dihidratado, 0,64 mg/l
de sulfato de cobre pentahidratado, 0,72 mg/l de cloruro de cobalto
hexahidratado, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de molibdato de
sodio dihidratado, 50 \mug/l de biotina, 50 \mug/l de
pantotenato de calcio, 50 \mug/l de ácido fólico, 50 \mug/l de
inositol, 50 \mug/l de niacina, 50 \mug/l de ácido
p-aminobenzoico, 50 \mug/l de hidrocloruro de
piridoxina, 50 \mug/l de riboflavina, 50 \mug/l de
hidrocloruro de tiamina, 50 mg/l de cicloheximida y 20 g/l de
agar-agar.
Los medios colocados en placas con las muestras
anteriores se incubaron a 28ºC, 37ºC o 50ºC durante 2 a 4 días y se
obtuvieron 378 cepas formando colonias.
Posteriormente, cada una de las cepas obtenidas
tal como se describió anteriormente se inoculó en un tubo de ensayo
de 16,5 cm de longitud y 14 mm de diámetro que contenía 3 ml de
medio líquido (ajustado a pH 4,0 con HCl) que contenía una
concentración de saturación de ácido L-glutámico y
se cultivaron a 28ºC, 37ºC o 50ºC durante 24 horas a 3 días con
agitación. A continuación, se seleccionaron las cepas cultivadas. La
composición del medio mencionado anteriormente fue la siguiente: 40
g/l de glucosa, 20 g/l de sulfato de amonio, 0,5 g/l de sulfato de
magnesio heptahidratado, 2 g/l de fosfato dibásico de potasio, 0,5
g/l de cloruro de sodio, 0,25 g/l de cloruro de calcio dihidratado,
0,02 g/l de sulfato ferroso heptahidratado, 0,02 g/l de sulfato de
manganeso tetrahidratado, 0,72 mg/l de sulfato de cinc dihidratado,
0,64 mg/l de sulfato de cobre pentahidratado, 0,72 mg/l de cloruro
de cobalto hexahidratado, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de
molibdato de sodio dihidratado y 2 g/l de extracto de
levadura.
levadura.
De este modo, se obtuvieron con éxito 78 cepas de
microorganismos que presentan resistencia al ácido
L-glutámico en medio ácido.
Varios microorganismos con resistencia al ácido
L-glutámico en medio ácido obtenidos como se
describió anteriormente se inoculan en un tubo de ensayo de 16,5 cm
de longitud y 14 mm de diámetro que contiene 3 ml de medio (ajustado
a pH 4,0 con HCl) obtenido añadiendo 20 g/l de ácido
L-glutámico y 2 g/l de glucosa al medio M9
(Sambrook, J., Fritsh, E.F. y Maniatis, T., "Molecular
Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989) y se
midió la turbidez del medio a lo largo del tiempo para seleccionar
las cepas que presentaban una tasa de crecimiento favorable. Como
resultado, como cepa que presenta crecimiento favorable, se obtuvo
la cepa AJ13355 del suelo de Iwata-Shi, Shizuoka,
Japón. Esta cepa se determinó como de Enterobacter
agglomerans basándose en sus propiedades bacteriológicas
descritas anteriormente.
Como la cepa AJ13355 de Enterobacter
agglomerans segrega extracelularmente mucosidad cuando se
cultiva en un medio que contiene un sacárido, la eficacia de la
operación no es favorable. Por consiguiente, se obtuvo una cepa con
menos secreción de mucosidad por el método de irradiación
ultravioleta (Miller, J.H. et al., "A Short Course in
Bacterial Genetics; Laboratory Manual", pág. 150, 1992, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.).
La cepa AJ13355 de Enterobacter
agglomerans se irradió con rayos ultravioleta durante 2 minutos
a 60 cm de una lámpara ultravioleta de 60 W y se cultivó en un medio
LB toda la noche para fijar la mutación. La cepa mutagenizada se
diluyó y se inoculó en medio LB que contenía 5 g/l de glucosa y 20
g/l de agar-agar a fin de que afloraran
aproximadamente 100 colonias por placa y se cultivaran a 30ºC toda
la noche con una inclinación de la placa de aproximadamente 45
grados y a continuación se seleccionaron 20 colonias que no
presentaban escurrido de mucosidad.
Como cepa que satisface las condiciones de no
volver a aflorar aún después de 5 veces de subcultivo en medio LB
que contiene 5 g/l de glucosa y 20 g/l de agar-agar
y en la que debería observarse un crecimiento equivalente a la cepa
precursora en medio LB, en medio LB que contiene 5 g/l de glucosa y
en medio M9 (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, 2ª
edición, Cold Spring Harbor Press, U.S.A., 1989) enriquecido con 20
g/l de ácido L-glutámico y 2 g/l de glucosa y
ajustado a pH 4,5 con HCl, se seleccionó la cepa SC17 de entre las
cepas seleccionadas anteriormente.
Se preparó una cepa que carecía de \alphaKGDH y
presentaba un sistema biosintético aumentado de ácido
L-glutámico a partir de la cepa SC17 de
Enterobacter agglomerans.
\newpage
Se clonó el gen sucAB de la cepa AJ13355
de Enterobacter agglomerans seleccionando un fragmento de ADN
que complementa la propiedad de desasimilación del ácido acético de
la cepa que carece del gen de la subunidad
\alphaKGDH-E1 (en lo sucesivo denominado
"sucA") de Escherichia coli procedente del ADN
cromosómico de la cepa AJ13355 de Enterobacter
agglomerans.
Se aisló el ADN cromosómico de la cepa AJ13355 de
Enterobacter agglomerans por un procedimiento empleado
normalmente para extraer el ADN cromosómico de Escherichia
coli (Text fórmula Bioengineering Experiments, editado por
Society for Bioscience and Bioengineering, Japón, págs.
97-98, Baifukan, 1992). Se utilizó el pTWV228
(resistente a la ampicilina) como vector era un producto comercial
de Takara Shuzo Co., Ltd.
El ADN cromosómico de la cepa AJ13355 digerida
con EcoT221 y el pTWV228 digerido con PstI se ligaron
utilizando T4 ligasa y se utilizaron para transformar la cepa JRG465
de Escherichia coli que carece de sucA (Herbert, J.
et al., Mol. Gen. Genetics, 105, 182 (1969)). Se seleccionó
una cepa que se desarrolla en un medio mínimo de acetato de entre
las cepas transformantes obtenidas anteriormente, se extrajo un
plásmido de ella y se denominó pTWVEK101. La cepa JRG465 de
Escherichia coli que alberga el pTWVEK101 recuperó la
auxotrofía para el ácido succínico o la L-lisina y
L-metionina además de la característica de la
propiedad de desamilación del ácido acético. Esto sugiere que
pTWVEK101 contenía el gen sucA de Enterobacter
agglomerans.
La Fig. 1 presenta una cartografía con la enzima
de restricción de un fragmento de ADN procedente de Enterobacter
agglomerans en pTWVEK101. En la secuencia de nucleótidos de la
parte rayada en la Fig. 1, se descubrió que las secuencias de
nucleótidos consideradas dos longitudes completas de las ORF y las
dos secuencias de nucleótidos consideradas secuencias parciales de
las ORF. Como resultado de la investigación de la homología de
éstas, se dio a conocer que las partes cuyas secuencias de
nucleótidos se determinaron contenían una secuencia parcial con
terminal 3' del gen (sdhB) de la proteína succinato
deshidrogenasa hierro-azufre, sucA completo
y el gen de la subunidad \alphaKGDH-E2 (gen
sucB) y una secuencia parcial con terminal 5' del gen de la
subunidad \beta succinil CoA sintetasa (gen sucC). Los
resultados de la comparación de las secuencias de aminoácidos
deducidas de estas secuencias de nucleótidos con las procedentes de
Escherichia coli (Eur. J. Biochem., 141, págs.
351-359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, págs.
361-374 (1984); Biochemistry, 24, págs.
6245-6252 (1985)) se presentan en las Figs. 2 a 5.
Por esta razón, las secuencias de aminoácidos presentaban una
homología muy grande entre sí. Además, se descubrió que un grupo de
sdhB-sucA-sucB-sucC
estaba constituido en el cromosoma de Enterobacter
agglomerans como en Escherichia coli(Eur. J.
Biochem., 141, págs. 351-359 (1984); Eur. J.
Biochem., 141, págs. 361-374 (1984);
Biochemistry, 24, págs. 6245-6252
(1985)).
Se realizó la recombinación homóloga utilizando
el gen sucAB de Enterobacter agglomerans obtenido tal
como se describió anteriormente para obtener una cepa carente de
\alphaKGDH de Enterobacter agglomerans.
Una vez se digirió pTWVEK101 con SphI para
escindir un fragmento que contenía sucA, el fragmento se
truncó con el fragmento de Klenow (Takara Shuzo Co., Ltd.) y se ligó
con pBR322 digerido con EcoRI y se truncó con el fragmento de
Klenow, utilizando T4 ADN ligasa (Takara Shuzo, Co., Ltd.). El
plásmido obtenido se digirió en el punto de reconocimiento
BgIII de la enzima de restricción situado aproximadamente en
el centro de sucA utilizando la enzima, se truncó con el
fragmento de Klenow y a continuación se ligó otra vez utilizando T4
ADN ligasa. Se consideró que el gen sucA se volvía
inoperativo debido a que se introdujo una mutación que desplaza el
marco de lectura en sucA del plásmido recién construido en el
procedimiento anterior.
El plásmido construido como se describió
anteriormente se digirió con una enzima de restricción ApaLI
y se sometió a electroforesis en gel de agarosa para recuperar un
fragmento de ADN que contenía sucA en el cual se introdujo la
mutación de desplazamiento del marco de lectura y un gen con
resistencia a la tetraciclina procedente del pBR322. El fragmento de
ADN recuperado se ligó otra vez utilizando T4 ADN ligasa para
construir un plásmido destinado a destruir el gen \alphaKGDH.
El plásmido para destruir el gen \alphaKGDH
obtenido como se describió anteriormente se utilizó para transformar
la cepa SC17 de Enterobacter agglomerans por electroporación
(Miller, J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics;
Handbook", pág. 279, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.,
1992) y se obtuvo una cepa en la que se sustituyó sucA en el
cromosoma por un mutante tipo uno del plásmido por recombinación
homóloga utilizando la resistencia a la tetraciclina como marcador.
La cepa obtenida se denominó cepa SC17sucA.
A fin de confirmar que la cepa SC17sucA
presentaba actividad carente de \alphaKGDH, se midió la actividad
enzimática por el método de Reed et al. (Reed, L.J. y
Mukherjee, B.B., Methods in Enzymology, 13, págs.
55-61, (1969)) utilizando células de la cepa
cultivada en medio LB en fase de crecimiento logarítmico. Como
resultado, se detectó una actividad de \alphaKGDH de 0,073
(\DeltaABS/min/mg de proteína) en la cepa SC17, mientras que no se
detectó ninguna actividad de \alphaKGDH en la cepa SC17sucA y de
este modo se confirmó que el sucA fue eliminado como se
pretendía.
Después, el gen de citrato sintetasa, el gen de
fosfoenolpiruvato carboxilasa y el gen de glutamato deshidrogenasa
procedentes de Escherichia coli se introdujeron en la cepa
SC17sucA.
Los procedimientos de preparación de un plásmido
con el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA se
explicarán con referencia a las Figs. 6 y 7.
Un plásmido con el gen gdhA procedente de
Escherichia coli, pBRGDH (Solicitud de patente japonesa
abierta al público nº 7-203980), se digirió con
HindIII y SphI, se truncaron ambos extremos mediante
el tratamiento con T4 ADN polimerasa y a continuación el fragmento
de ADN con el gen gdhA se purificó y se recuperó.
Independientemente, un plásmido con el gen gltA y el gen
ppc procedente de Escherichia coli, pMWCP (documento
WO 97/08294), se digirió con XbaI y a continuación se
truncaron ambos extremos utilizando la T4 ADN polimerasa. Éste se
mezcló con el fragmento de ADN purificado anterior que tiene el gen
gdhA y se ligó utilizando T4 ligasa para obtener un plásmido
pMWCPG, que corresponde a pMWCP que contiene además el gen
gdhA (Fig. 6).
Al mismo tiempo, el plásmido pVIC40 (solicitud de
patente japonesa abierta al público nº 8-047397) que
tiene el origen de la replicación del plásmido RSF1010 de amplio
espectro en el anfitrión se digirió con NotI, se trató con T4
ADN polimerasa y se digirió con PstI. Se digirió pBR322 con
EcoT14I, se trató con T4 ADN polimerasa y se digirió con
PstI. Se mezclaron ambos productos y se ligaron utilizando T4
ligasa para obtener un plásmido RSF-Tet que tiene el
origen de la replicación de RSF1010 y el gen con resistencia a la
tetraciclina (Fig. 7).
Después, se digirió pMWCPG con EcoRI y
PstI y se purificó y se recuperó un fragmento de ADN con el
gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA. Se digirió
igualmente RSF-Tet con EcoRI y PstI y
se purificó y recuperó un fragmento de ADN que posee el origen de la
replicación de RSF1010. Ambos productos se mezclaron y se ligaron
utilizando T4 ligasa para obtener un plásmido RSFCPG que corresponde
a RSF-Tet que contiene el gen gltA, el gen
ppc y el gen gdhA (Fig. 8). Se cofirmó que el plásmido
RSFCPG obtenido expresaba al gen gltA, al gen ppc y
al gen gdhA basándose en la complementación de la auxotrofía
de la cepa carente del gen gltA, en el gen ppc o en el
gen gdhA procedente de Escherichia coli y la medición
de cada actividad enzimática.
Se construyó un plásmido con el gen gltA
procedente de Brevibacterium lactofermentum de la forma
siguiente. Se realizó la PCR utilizando los ADN del cebador que se
prepararon basándose en la secuencia de nucleótidos del gen
gltA de Corynebacterium
glutamicum(Microbiology, 140, págs.
1817-1828 (1994)) y el ADN cromosómico de
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 como plantilla para
obtener un fragmento del gen gltA de aproximadamente 3 kb.
Este fragmento se insertó en un plásmido pHSG399 (adquirido en
Takara Shuzo Co., Ltd.) se digirió con SmaI para obtener un
plásmido pHSGCB (Fig. 9). Posteriormente, se digirió pHSGDB con
HindIII y el fragmento del gen gltA escindido de
aproximadamente 3 kb se insertó en un plásmido pSTV29 (adquirido en
Takara Shuzo Co., Ltd.) digerido con HindIII para obtener un
plásmido pSTVCB (Fig. 9). Se confirmó que el plásmido pSTVCB
obtenido expresaba el gen gltA midiendo la actividad
enzimática en la cepa AJ13355 de Enterobacter
agglomerans.
La cepa SC17sucA de Enterobacter
agglomerans se transformó con RSFCPG por electroporación para
obtener una cepa SC17sucA/RSFCPG transformante que presenta
resistencia a la tetraciclina. Además, la cepa
SC17sucA/
RSFCPG se transformó con pSTVCB por electroporación para obtener una cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB transformante que presenta resistencia al cloranfenicol.
RSFCPG se transformó con pSTVCB por electroporación para obtener una cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB transformante que presenta resistencia al cloranfenicol.
Una cepa con resistencia mejorada al ácido
L-glutámico a concentración elevada en un medio de
pH bajo (en lo sucesivo, denominada también "cepa con resistencia
a alta concentración de Glu a pH bajo") se aisló de la cepa
SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB de Enterobacter agglomerans.
Se cultivó la cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB durante
la noche a 30ºC en medio LBG (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto
de levadura, 10 g/l de NaCl, 5 g/l de glucosa) y las células lavadas
con solución salina se diluyeron apropiadamente y se colocaron en
placas en un medio M9-E (4 g/l de glucosa, 17 g/l de
Na_{2}HPO_{4}\cdot12 H_{2}O, 3 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5
g/l de NaCl, 1 g/l de NH_{4}Cl, 10 mM de MgSO_{4}, 10 \muM de
CaCl_{2}, 50 mg/l de L-lisina, 50 mg/l de
L-metionina, 50 mg/l de ácido
DL-diaminopimélico, 25 mg/l de tetraciclina, 25 mg/l
de cloranfenicol, 30 g/l de ácido L-glutámico,
ajustado a pH 4,5 con amoniaco acuoso). Se obtuvo como cepa con
resistencia a alta concentración de Glu a pH bajo, una colonia
aflorada tras el cultivo a 32ºC durante 2 días.
Para la cepa obtenida, se midió el nivel de
crecimiento en medio líquido M9-E y se determinó la
capacidad de producción del ácido L-glutámico en un
tubo de ensayo grande de 50 ml de volumen que contenía 5 ml de medio
de ensayo de producción de ácido L-glutámico (40 g/l
de glucosa, 20 g/l de sulfato de amonio, 0,5 g/l de sulfato de
magnesio heptahidratado, 2 g/l de fosfato dibásico de potasio, 0,5
g/l de cloruro de sodio, 0,25 g/l de cloruro de calcio dihidratado,
0,02 g/l de sulfato ferroso heptahidratado, 0,02 g/l de sulfato de
manganeso tetrahidratado, 0,72 mg/l de sulfato de cinc dihidratado,
0,64 mg/l de sulfato de cobre pentahidratado, 0,72 mg/l de cloruro
de cobalto hexahidratado, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l de
molibdato de sodio dihidratado, 2 g/l de extracto de levadura, 200
mg/l de hidrocloruro de L-lisina, 200 mg/l de
L-metionina, 200 mg/l de DL-ácido
\alpha,\varepsilon-diaminopimélico, 25 mg/l de
hidrocloruro de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol). Una cepa
que presentaba el mejor nivel de crecimiento y la misma capacidad de
producción de ácido L-glutámico que la de su cepa
precursora, la cepa SC17/RSFCPG+pSTVCB, se denominó AJ13601 de
Enterobacter agglomerans. La AJ13601 de Enterobacter
agglomerans se depositó en el Instituto Nacional de Biociencia y
Tecnología humana, Agencia de Ciencia y Tecnología industrial,
Ministerio de Comercio e Industria internacional (actualmente,
depositario del organismo de patentes internacionales, Instituto
nacional de Ciencia y Tecnología industrial avanzada; Central 6,
Higashi 1-1-1,
Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566,
Japón) el 18 de agosto de 1999 y recibió el número de registro FERM
P-17516. Se transfirió a continuación a un depósito
internacional bajo las estipulaciones del tratado de Budapest el 6
de julio de 2000 y recibió el número de registro FERM
BP-7207.
Aunque la cepa AJ13601 de Enterobacter
agglomerans puede desarrollarse en un intervalo amplio de pH
desde pH neutro a pH ácido, la inhibición del crecimiento por un
ácido orgánico es particularmente notable a pH ácido. Por
consiguiente, se realizó a pH ácido un experimento referente a la
inhibición del crecimiento por un ácido orgánico.
Se cultivó la cepa AJ13601 de Enterobacter
agglomerans en medio LBG con agar-agar (10 g/l
de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl y 15 g/l
de agar-agar) que contenía 25 mg/l de hidrocloruro
de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol a 30ºC durante 14 horas y
se extrajo una asa de extensión de platino de las células y se
inoculó en 300 ml de medio de cultivo sembrado con la siguiente
composición en un vaso fermentador de 1 l de volumen para realizar
el cultivo de la siembra a 34ºC a pH 6,0.
50 g/l de sacarosa, 0,4 g/l de sulfato de
magnesio heptahidratado, 4,0 g/l de sulfato de amonio, 2,0 g/l de
fosfato dibásico de potasio, 4,0 g/l de extracto de levadura, 0,01
g/l de sulfato ferroso heptahidratado, 0,01 g/l de sulfato de
manganeso pentahidratado, 0,4 g/l de hidrocloruro de
L-lisina, 0,4 g/l de DL-metionina,
0,4 g/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diamino-pimélico,
25 mg/l de hidrocloruro de tetraciclina y 25 mg/l de
cloranfenicol.
Se controló el pH añadiendo gas amoniaco durante
el cultivo. El cultivo sembrado se terminó observando la eliminación
del sacárido en el medio de cultivo sembrado como marcador y el
caldo de cultivo sembrado se inoculó en 300 ml de un medio de
cultivo principal contenido en vasos fermentadores de 1 l de volumen
en una cantidad del 20% del volumen del medio de cultivo principal
para realizar el cultivo principal. La composición del medio de
cultivo principal se muestra a continuación. Cuando se realiza un
experimento para la inhibición del crecimiento por un ácido
orgánico, el experimento se realiza añadiendo el ácido orgánico a
una concentración predeterminada.
20 g/l de glucosa, 0,4 g/l de sulfato de magnesio
heptahidratado, 5,0 g/l de sulfato de amonio, 6,0 g/l de fosfato
dibásico monopotásico, 1,5 g/l de cloruro de sodio, 0,01 g/l de
sulfato ferroso heptahidratado, 0,01 g/l de sulfato de manganeso
pentahidratado, 0,8 g/l de hidrocloruro de L-lisina,
0,6 g/l de DL-metionina, 0,6 g/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diamino-pimélico,
25 mg/l de hidrocloruro de tetraciclina, 25 mg/l de cloranfenicol,
6,0 g/l de extracto de levadura y 0,75 g/l de cloruro de calcio
dihidratado.
La temperatura del cultivo se ajustó a 34ºC y el
pH se controló a un pH predeterminado añadiendo gas amoniaco.
Los experimentos para el efecto de inhibición del
crecimiento a pH ácido (pH 4,5) se realizaron en primer lugar con
varios ácidos orgánicos. Los experimentos se realizaron añadiendo
ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico, ácido propiónico, ácido
valérico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido
oxalacético y ácido cítrico a una concentración de 0,5 g/l al medio
de cultivo principal. Una parte de los resultados de estos
experimentos se presentan en la Fig. 10.
Como se aprecia por estos resultados, el ácido
fórmico, ácido acético y ácido propiónico presentaban una inhibición
del crecimiento evidente. Por otra parte, el ácido láctico presentó
una tasa de crecimiento comparable a la obtenida con el medio de
referencia no enriquecido con un ácido orgánico (además de esto, el
ácido succínico, el ácido fumárico y el ácido maleico no presentaron
inhibición del crecimiento). Existe también un informe en el que la
inhibición del crecimiento microbiano por un ácido orgánico a pH
ácido se produce porque el ácido orgánico que pierde la carga en
condiciones de pH ácido pasa a través de una membrana citoplasmática
y se disocia otra vez en condiciones de pH neutro en una célula y
esta idea se explica utilizando una constante de disociación pKa de
un ácido orgánico.
| Ácido orgánico | pKa | Inhibición del crecimiento |
| Ácido fórmico | 3,75 | Observada |
| Ácido láctico | 3,86 | No observada |
| Ácido succínico | 4,21 | No observada |
| Ácido acético | 4,76 | Observada |
| Ácido propiónico | 4,87 | Observada |
Sin embargo, los resultados de los experimentos
anteriores no pueden explicarse basándose en la pKa, y la inhibición
del crecimiento de la cepa AJ13601 de Enterobacter
agglomerans por el ácido fórmico, acetato y ácido propiónico se
considera que se produce por otro mecanismo de inhibición, que no
puede explicarse mediante la idea del informe anterior.
A continuación, se investigó el pH que produce la
inhibición del crecimiento utilizando ácido fórmico (concentración:
0,5 g/l). Los resultados se presentan en la Fig. 11. Se pone de
manifiesto que la inhibición del crecimiento por el ácido fórmico no
se observó en una zona de pH de 5,5 o más, pero se observó a un pH
menor que éste. En particular, a pH 4,5, apenas se observó el
crecimiento de las células.
Además, también se investigó la concentración de
ácido fórmico que produce la inhibición del crecimiento en
condiciones de pH 4,5. Los resultados se presentan en la Fig. 12. A
partir de estos resultados, se pone de manifiesto que la inhibición
del crecimiento no se observaba cuando la concentración de ácido
fórmico en el medio era 0,20 g/l o menor, pero la inhibición del
crecimiento se observó a una concentración mayor de un determinado
nivel comprendido entre 0,2 y 0,5 g/l.
Basándose en los resultados experimentales
anteriores, se concluye que, para permitir el cultivo de la cepa
AJ13601 de Enterobacter agglomerans a un pH ácido utilizando
una fuente de carbono (sacárido) que contiene un ácido orgánico tal
como melazas de remolacha y melazas de caña de azúcar y una fuente
de nitrógeno tal como maíz empapado en licor (CSL), solución de la
hidrólisis de la proteína de la soja, solución de la hidrólisis de
proteínas animales (extracto de carne) e hidrolizado de caseína, si
es necesario a una concentración más baja de un ácido orgánico que
presente la inhibición, tal como ácido fórmico y ácido acético en un
medio, o para producir ácido L-glutámico a pH ácido,
se necesita un método de cultivo que comprende células de cultivo
en un intervalo de pH en el que no se observa la inhibición del
crecimiento para que el ácido orgánico que presenta la inhibición se
consuma y a continuación cultivar las células a un pH ácido
desplazado, como en el Ejemplo 2 mencionado a continuación.
El crecimiento celular de la cepa AJ13601 de
Enterobacter agglomerans se inhibe mediante un ácido orgánico
de bajo peso molecular tal como el ácido fórmico a un pH ácido como
se demostró en el Ejemplo 1. Por consiguiente, debido a muchas de
dichas materias primas naturales, incluyendo las melazas de
remolacha y las melazas de caña de azúcar, que contienen cantidades
considerables de dichos ácidos orgánicos, la cepa AJ13601 de
Enterobacter agglomerans no puede cultivarse a pH ácido
utilizando las materias primas naturales. Sin embargo, debido a que
la inhibición del crecimiento por los ácidos orgánicos se observaba
únicamente a pH ácido, pero no se observaba a pH neutro, se intentó
producir ácido glutámico realizando el cultivo a pH neutro durante
una etapa preliminar del cultivo para consumir los ácidos orgánicos
que producen la inhibición del cultivo y a continuación desplazando
el pH a un pH ácido para producir ácido glutámico.
Se cultivó la cepa AJ13601 de Enterobacter
agglomerans en medio LBG con agar-agar (10 g/l
de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl y 15 g/l
de agar-agar) que contenía 25 mg/l de hidrocloruro
de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol a 30ºC durante 14 horas y
se extrajo una asa de extensión de platino de las células y se
inoculó en 300 ml de medio de cultivo sembrado con la siguiente
composición en un vaso fermentador de 1 l de volumen para realizar
el cultivo de la siembra a 34ºC a pH 6,0.
50 g/l de sacarosa, 0,4 g/l de sulfato de
magnesio heptahidratado, 4,0 g/l de sulfato de amonio, 2,0 g/l de
fosfato dibásico de potasio, 4,0 g/l de extracto de levadura, 0,01
g/l de sulfato ferroso heptahidratado, 0,01 g/l de sulfato de
manganeso pentahidratado, 0,4 g/l de hidrocloruro de
L-lisina, 0,4 g/l de DL-metionina,
0,4 g/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico,
25 mg/l de hidrocloruro de tetraciclina y 25 mg/l de
cloranfenicol.
Se controló el pH añadiendo gas amoniaco durante
el cultivo. El cultivo sembrado se terminó observando la eliminación
del sacárido en el medio de cultivo sembrado como marcador y el
caldo de cultivo sembrado se inoculó en 300 ml de un medio de
cultivo principal contenido en vasos fermentadores de 1 l de volumen
en una cantidad del 20% del volumen del medio de cultivo principal
para realizar el cultivo principal. La composición del medio de
cultivo principal se muestra a continuación.
20 g/l de melazas de remolacha (o melazas de caña
de azúcar), 0,4 g/l de sulfato de magnesio heptahidratado, 5,0 g/l
de sulfato de amonio, 6,0 g/l de fosfato dibásico monopotásico, 1,5
g/l de cloruro de sodio, 0,01 g/l de sulfato ferroso heptahidratado,
0,01 g/l de sulfato de manganeso pentahidratado, 0,8 g/l de
hidrocloruro de L-lisina, 0,6 g/l de
DL-metionina, 0,6 g/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diamino-pimélico,
25 mg/l de hidrocloruro de tetraciclina, 25 mg/l de cloranfenicol,
6,0 g/l de extracto de levadura y 0,75 g/l de cloruro de calcio
dihidratado.
La temperatura del cultivo se ajustó a 34ºC y el
pH se controló a un pH determinado añadiendo gas amoniaco. Se inició
el cultivo a pH 6,0 y se realizó hasta que se consumieron el
sacárido y el ácido orgánico en el medio de cultivo principal. Una
vez eliminado el sacárido, se añadieron en continuo 700 g/l (5 ml/h)
de una solución acuosa de glucosa. Mientras se añadía en continuo
la glucosa, se controló la cantidad de adición de gas amoniaco y la
reducción del pH en relación con la producción de ácido glutámico se
utilizó a un pH menor hasta un nivel de 4,5 durante aproximadamente
2 horas y a continuación se continuó el cultivo a pH 4,5. Cuando la
concentración de ácido glutámico en el caldo de cultivo alcanzó 45
g/l, se añadió 1,0 g de cristales de ácido glutámico al medio de
cultivo principal y se sembraron los cristales para favorecer la
precipitación de los cristales en el caldo de cultivo.
Como resultado del cultivo durante 50 horas, una
cantidad notable de cristales de ácido glutámico precipitaron en el
vaso fermentador. A continuación, se añadió amoniaco a fin de
aumentar el pH hasta 6,0 para disolver los cristales totales de
ácido glutámico en el vaso fermentador y a continuación se midió la
cantidad de ácido glutámico producido. Además, se realizó el cultivo
de la misma forma que anteriormente excepto que el pH se mantuvo
para que fuera 4,5 desde una etapa preliminar del cultivo y se midió
la cantidad de ácido glutámico producida. En este caso, debido a que
disminuyeron las células, el cultivo terminó en 28 horas. Los
resultados se presentan en la Tabla 2.
| Método de cultivo | D.O. (\times101) | Cantidad de ácido glutámico |
| producido (g) | ||
| Con cambio de pH | 0,753 | 50,4 |
| A pH constante (4,5) | 0,078 | 2,6 |
Además, se midió el crecimiento de las células a
lo largo del tiempo basándose en la densidad óptica (D.O.) a una
longitud de onda de 620 nm. Los resultados se presentan en la Fig.
13.
Como resultado, se observó que, en el experimento
en el que se realizó el cultivo a un pH ácido en una etapa
preliminar del cultivo, se inhibió el crecimiento celular y por esta
razón apenas se observó la producción de ácido
L-glutámico, mientras que, en el experimento en el
que se realizó el cultivo utilizando un cambio de pH, los cristales
de ácido glutámicos precipitaron en el caldo de cultivo y por esta
razón se demostró que las materias primas naturales que mantienen un
ácido orgánico podrían utilizarse en el método.
A partir de los resultados mencionados
anteriormente, se confirmó que el cultivo que utiliza cambio de pH
permitió el cultivo con precipitación de cristales de ácido
glutámico a un pH ácido utilizando incluso materias primas naturales
que contenían ácidos orgánicos.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE
ÁCIDO L-GLUTÁMICO
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EPA-53850
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> JP 2001-44135
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-02-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 935
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterobacter agglomerans
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 407
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<212> PRT
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<213> Enterobater agglomerans
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 41
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<212> PRT
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<213> Enterobacter agglomerans
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 39
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<212> PRT
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<213> Enterobacter agglomerans
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 933
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<212> PRT
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<213> Escherichia coli
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 405
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<212> PRT
<213 Escherichia coli
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<400> 6
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<210> 7
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<213> Escherichia coli
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<400> 8
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Claims (16)
1. Procedimiento para la preparación de ácido
L-glutámico por fermentación, que comprende el
cultivo de un microorganismo que tiene la capacidad de producir el
ácido L-glutámico en un medio con un pH comprendido
entre 3,0 y 5,0 y que contiene un ácido orgánico, en el que el
contenido total del ácido orgánico que inhibe el desarrollo del
microorganismo a dicho pH es aquel al cual no se inhibe el
desarrollo del microorganismo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el ácido L-glutámico se prepara y se acumula en
el medio acompañado de precipitación del ácido
L-glutámico, durante el cultivo en el medio.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que el contenido total de ácido orgánico es 0,2 g/l o
menos.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el ácido orgánico es un ácido
orgánico con un número de carbonos comprendido entre 1 y 3.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que el microorganismo pertenece al
género Enterobacter.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el
que el microorganismo es Enterobacter agglomerans.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el microorganismo puede
metabolizar una fuente de carbono en un medio líquido que contiene
ácido L-glutámico en una concentración de saturación
y la fuente de carbono, a un pH comprendido entre 3,0 y 5,0 y tiene
la capacidad de acumular ácido L-glutámico en una
cantidad que sobrepasa la concentración de saturación del ácido
L-glutámico en el medio líquido a dicho pH.
8. Procedimiento para la preparación de ácido
L-glutámico por fermentación, que comprende el
cultivo de un microorganismo que tiene la capacidad de producir
ácido L-glutámico en un medio que contiene un ácido
orgánico a un primer pH comprendido entre 5,0 y 8,0 en el que el
desarrollo del microorganismo no está inhibido por un ácido orgánico
en el medio y a continuación el cultivo del microorganismo a un
segundo pH comprendido entre 3,0 y 5,0.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el
que el ácido orgánico es un ácido orgánico que presenta un número de
carbonos comprendido entre 1 y 3.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8 ó 9, en el que el cultivo al primer pH se realiza
mientras se mantiene el pH del medio para que sea el primer pH
añadiendo una sustancia alcalinizante al medio.
11. Procedimiento según la reivindicación 10,
que comprende la reducción del pH del medio controlando la adición
de una cantidad de la sustancia alcalinizante tras el cultivo al
primer pH.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, en el que el cultivo al primer pH continúa
hasta que se elimina el ácido orgánico en el medio.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, en el que el microorganismo pertenece al
género Enterobacter.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el microorganismo es Enterobacter agglomerans.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 14, en el que el microorganismo puede
metabolizar una fuente de carbono en un medio líquido que contiene
ácido L-glutámico a la concentración de saturación y
la fuente de carbono, a un pH comprendido entre 3,0 y 5,0 y tiene la
capacidad de acumular ácido L-glutámico en una
cantidad que sobrepasa la concentración de saturación del ácido
L-glutámico en el medio líquido a dicho pH.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que el pH adecuado para la preparación de ácido
L-glutámico es un pH al cual el ácido
L-glutámico producido por el microorganismo
precipita en el medio y el ácido L-glutámico se
produce y se acumula acompañado de precipitación de ácido
L-glutámico, durante el cultivo en el medio a dicho
pH.
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