ES2262902T3 - Una reaccion en cascada de amplificacion de acido nucleico. - Google Patents

Abstract

Un ensayo para la presencia de una molécula biológica, que comprende detectar dicha molécula biológica por su capacidad para servir como un molde para la circularización y ligado de un oligonucleótido lineal añadido a la misma, en el que el oligonucleótido circular resultante se usa como un molde para un procedimiento de copiado continuo mediante una ácido nucleico polimerasa capaz de desplazar la hebra y sustancialmente sin actividad exonucleasa 5¿-3¿ en presencia de los nucleósidos trifosfato necesarios, caracterizado porque el molde para formar el oligonucleótido circular también proporciona el extremo 3¿ necesario para la formación de polímero por replicación en círculo rodante del oligonucleótido circularizado.

Description

Una reacción en cascada de amplificación de ácido nucleico.

Esta invención se refiere a un procedimiento para producir ADN que consiste en múltiples repeticiones en tándem de una unidad de oligonucleótido y una reacción en cascada de amplificación del ácido nucleico que produce un gran número de copias de ADN o ARN parciales y completas del mismo. La invención también se refiere a la aplicación de estas reacciones en un procedimiento de detección de una molécula o grupo diana en un sitio específico y a un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN particular.

Antecedentes de la invención

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocida es un procedimiento para amplificar cualquier secuencia específica de ácido nucleico contenida en un ácido nucleico o mezcla de ácidos nucleicos. En general, el procedimiento implica una reacción en cadena para producir en cantidades exponenciales respecto al número implicado de etapas de reacción, cualquier secuencia específica de ácido nucleico dado (a) que los extremos de la secuencia se conozcan con suficiente detalle de modo que se pueden sintetizar dos cebadores oligonucleótidos que se hibridarán con los mismos, y (b) que esté disponible una pequeña cantidad de la secuencia para iniciar la reacción en cadena. El procedimiento comprende tratar hebras complementarias separadas del ácido nucleico con un exceso molar de dos cebadores oligonucleótidos, y extender los cebadores en presencia de una ácido nucleico polimerasa y los cuatro nucleósidos trifosfatos necesarios para formar los productos de extensión del cebador complementarios que actúan como moldes para sintetizar la secuencia específica de ácido nucleico. Cuando se separan las hebras complementarias del ácido nucleico, por ejemplo por calentamiento, las hebras están listas para usarse como moldes para la síntesis de hebras complementarias por extensión del cebador, duplicando así el número de copias de la secuencia específica de ácido nucleico. Las etapas de separación de la hebra y síntesis del producto por extensión se pueden repetir tantas veces como sea necesario para producir la cantidad deseada de la secuencia específica de ácido nucleico. Este procedimiento básico se describe y reivindica en la patente de EE.UU. nº 4.683.202, y variantes de la misma se describen y reivindican en las patentes de EE.UU. relacionadas nº 4.683.195 y 4.800.159.

Becton Dickinson ha descrito una variante de la técnica de la PCR en la que los ciclos térmicos se sustituyen por una destrucción enzimática de los cebadores, dejando así libre la secuencia diana que originalmente se une al cebador para hacer que se pueda unir a un nuevo cebador (documentos EP 0497272 A1, EP 0500224 A2, EP 0543612 A2). Después de la unión del segundo cebador a la secuencia diana, el producto generado por elongación de la cadena a partir del primer cebador se separa por desplazamiento de la hebra cuando se produce la elongación del segundo cebador. Al igual que la PCR, esta reacción usa cebadores que se reasocian a ambos extremos de una molécula de ADN biológica con el propósito de amplificar la secuencia biológica intermedia. Esto es distinto de la presente reacción en cascada del ADN que se basa en los cebadores que se reasocian a lo largo de la longitud de una secuencia repetida en tándem construida (denominada "polímero").

El desplazamiento de hebra también está implicado en otras técnicas de ADN tales como las usadas normalmente en el marcado de cebadores aleatorio de sondas de hibridación. Sin embargo, en este enfoque todo el ADN presente puede servir como molde para la reacción. Esto es distinto de la presente reacción en cascada del ADN, que está restringida a un molde específico preseleccionado.

Las reacciones de PRINS también se pueden potenciar por síntesis de ADN por desplazamiento de hebra después de destruir el cebador ya alargado, como ha descrito este autor de la invención y patentado Boehringer Mannheim. Al igual de la reacción de Becton Dickinson, esta produce múltiples copias de una secuencia diana biológica, pero no tiene las características de la presente reacción en cascada del ADN.

J.W. IJdo y col., Nucleic Acids Research, Vol. 19, nº 17, p. 4780 (1991), describen la rápida generación de la secuencia de repetición de telómero humano (TTAGGG)_{n}, con tamaños de fragmentos de hasta 25 kb, usando una técnica relacionada con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción se lleva a cabo en ausencia de molde usando los cebadores (TTAGGG)_{5} y (CCCTAA)_{5}. La reasociación en bisel de los cebadores proporciona un molde de hebra única para la extensión por la polimerasa Taq. Los cebadores sirven como cebadores y como moldes en los ciclos tempranos, mientras que las secuencias recién formadas sirven como cebadoras y moldes en las etapas posteriores de la reacción, dando como resultado una población heterogénea de moléculas que consisten en alineamientos de repeticiones de diferentes longitudes.

El ADN sintetizado se usa sólo como sonda para la hibridación, y por lo tanto, el enfoque sirve como una alternativa a otros procedimientos para el marcaje de sondas de hibridación (de tipo marcaje del extremo o adición de cola de nucleótidos). A diferencia del enfoque descrito aquí, no se añade cebador corto excedente a los polímeros resultados para provocar una reacción en cascada.

Un procedimiento usado normalmente para la amplificación aleatoria de ADN humanos se llama alu-PCR. Este enfoque usa el hecho de que el genoma humano contiene algunos elementos repetidos intercalados llamados repeticiones alu. Estos elementos muy similares como media se encuentran una vez cada 10 kb de ADN genómico humano. Aunque la distancia real entre dos elementos alu vecinos difiere significativamente a lo largo del genoma, la mayoría de estos elementos están situados suficientemente cerca de sus vecinos para permitir la amplificación por la PCR de la secuencia intercalada no alu después de la hibridación de los cebadores hasta la secuencia alu.

El British Technology Group Ltd ha descrito un enfoque similar para detectar el virus de la encefalitis bovina por la PCR (WO 9304198 A1). En este caso, el elemento que se repite intercalado está compuesto de una secuencia repetida en tándem que contiene seis monómeros base, cada uno con una secuencia que presenta una simetría palindrómica. Por consiguiente se pueden amplificar las secuencias intercaladas usando sólo un cebador (que se une a ambas hebras) en lugar de los dos cebadores que se usan normalmente en otros tipos de PCR, tal como la alu-PCR. El hecho de que el elemento que se repite de forma natural, que se detecta por esta técnica, mantenga una entidad de simetría palindrómica da una posible similitud casual con una variante del polímero sintetizado por las reacciones descritas aquí. En dichos casos en los que las secuencias intercaladas son suficientemente cortas, el ADN del virus bovino debería servir como molde para una reacción en cascada del ADN. Sin embargo, dicha posibilidad no se reconoce en la patente del British Technology Group, que se refiere a la PCR sólo como la reacción de amplificación resultante. Las similitudes casuales también implican que tanto el ensayo de virus bovino como algunas variantes de la reacción en cascada del ADN usan cebadores con una simetría palindrómica. Sin embargo, aunque estos cebadores en la reacción en cascada del ADN se usan para construir una molécula y trabajan en la molécula construida, los cebadores en el ensayo de la encefalitis bovina sólo se consideran sondas para el diagnóstico de detección de determinadas moléculas de ADN naturales.

En la solicitud de patente japonesa sin examinar, publicación nº 04-262799, perteneciente a Toyobo Co. Ltd., Toshiya y Yutaka han descrito la formación a partir de una molécula de ADN circular de un polímero como el usado como material de partida para la presente reacción en cascada del ADN. Obtienen el círculo de ADN mediante circularización de una molécula de ADN lineal diseñada en una molécula de ADN biológica, usando la circularización como un ensayo para la presencia de la molécula biológica pertinente. Después de la circularización de la molécula de ensayo, añaden una tercera molécula de ADN que se puede unir a la parte de la molécula de ensayo que no hibridaba con la molécula biológica. Esta tercera molécula sirve pues, como cebador para la replicación en círculo rodante de la molécula de ensayo circularizada, formando así un polímero que se repite en tándem derivado de la misma. En este enfoque no se prevé que el polímero así generado se pueda usar como el material de partida para una reacción en cascada del ADN. Tampoco se sugiere que el procedimiento de circularización se pueda situar en el extremo 3' de la molécula biológica, de modo que este extremo se pueda usar como un cebador para la replicación en círculo rodante, eliminando la necesidad de añadir una tercera molécula de ADN para cebar a la misma, ni que se pueda invertir la reacción, de modo que sea la molécula biológica la que se circularice.

Resumen de la invención

Hasta ahora, las técnicas más satisfactorias para la amplificación enzimática del ADN se han diseñado para amplificar secuencias de ácidos nucleicos de origen biológico para permitir su estudio o el estudio con estas secuencias. La presente invención proporciona un ensayo para la presencia de una molécula biológica, que comprende detectar dicha molécula biológica por su capacidad para servir como molde para la circularización y ligado de un oligonucleótido lineal añadido a la misma, en el que el oligonucleótido circular resultante se usa como molde para un procedimiento de copia continua mediante una ácido nucleico polimerasa capaz de desplazar la hebra, y sustancialmente sin actividad exonucleasa 5'-3', en presencia de los nucleósidos trifosfato necesarios, caracterizado porque el molde para la formación del oligonucleótido circular también proporciona el extremo 3' necesario para la formación de polímero por la replicación en círculo rodante del oligonucleótido circularizado.

El ensayo de acuerdo con la invención reivindicada puede comprender además una reacción en cascada del ADN como una etapa de detección añadida.

La presente invención representa una nueva estrategia, denominada "reacción en cascada del ADN", que es amplificar el ADN sintético. Así, el procedimiento de amplificación se puede usar secundariamente como un marcador en análisis biológicos, y para coamplificar secuencias de ácidos nucleicos de origen biológico.

La reacción en cascada del ADN es una técnica para producir múltiples copias parciales o completas de un molde preformado. Este se obtiene después de la construcción inicial ("reacción de multiplicación lineal", fase 1) de un molde adecuado que consiste en múltiples repeticiones en tándem de una unidad de oligonucleótido, cada una de las cuales por sí misma puede servir como punto de partida específico para el procedimiento de copiado (la "reacción de amplificación en cascada", fase 2).

El molde para la reacción en cascada se puede construir a partir de dos oligonucleótidos complementarios con una unidad de repetición interna de una forma similar a la descrita por J.W. IJdo y col., citado antes.

Sin embargo, el molde se produce de forma más conveniente por un nuevo procedimiento de acuerdo con la invención, a partir de un oligonucleótido que comprende al menos una unidad y media y preferiblemente dos unidades de una secuencia de nucleótidos que muestra simetría palindrómica.

Este procedimiento implica sucesos de desnaturalización y reasociación repetidos para permitir que los oligonucleótidos crezcan por pasos por síntesis con cebado catalizada por una ADN polimerasa en presencia de los nucleósidos trifosfato necesarios.

Esta desnaturalización y reasociación repetidas se pueden lograr mediante ciclos térmicos como se ilustra en el ejemplo 1, pero también se podrían lograr por otros medios. Una posibilidad sería incubar el o los oligonucleótidos en el punto de fusión de su forma de dúplex (o ligeramente por encima de esta temperatura). Esto daría como resultado un equilibrio estadístico, en el que una fracción de las moléculas en cualquier momento dado podría dar elongación de la cadena y por lo tanto crecimiento del polímero. En este sistema, la temperatura de los ciclos se sustituiría por un gradiente de temperatura que fuerza a las moléculas a hacerse más y más largas para adaptarse a la temperatura creciente de incubación. La ventaja de este sistema de gradiente es que no requiere la incubación a altas temperaturas, especialmente si las secuencias de ADN elegidas son ricas en adenina y timina. El evitar las altas temperaturas de incubación puede ser ventajoso si la formación de polímero se lleva a cabo mientras los oligonucleótidos están unidos a reactivos de detección específicos tales como la avidina o anticuerpos, puesto que dichas moléculas toleran mal las altas temperaturas.

Por lo tanto, un primer aspecto proporciona un procedimiento para producir ADN que consiste en múltiples repeticiones en tándem de una unidad de oligonucleótido, en el que un oligonucleótido que comprende al menos una unidad y media de una secuencia de nucleótidos que muestra simetría palindrómica se copia por pasos mediante una ADN polimerasa dependiente de molde y de cebador, en presencia de los nucleósidos trifosfato necesarios durante los ciclos repetidos de desanturalización y reasociación, y la elongación de la cadena se produce cada vez que la reasociación da como resultado una hibridación con desplazamiento del marco de lectura, dando lugar dúplex con extremos 3' escondidos.

La secuencia de bases en el oligonucleótido se podría elegir libremente de acuerdo con las necesidades individuales, pero con el fin de que pueda participar en el procedimiento de polimerización, el oligonucleótido debe consistir en al menos una copia y media de la secuencia que se pretende que sea la unidad que se repite del polímero. Además, puede ser conveniente construir el oligonucleótido de modo que consista en repeticiones de una secuencia que muestra simetría palindrómica, puesto que esto hace que la secuencia sea complementaria de sí misma y elimina la necesidad de inclusión de un segundo oligonucleótido (complementario) en el procedimiento de polimerización. Por lo tanto, la unidad que se repite más corta que muestra simetría palindrómica serían dos bases complementarias, por ejemplo la secuencia "AT". Una unidad y media de este secuencia sería "ATA", y el oligonucleótido más corto que puede servir como sustrato para la polimerización por sí mismo sería, por lo tanto, un oligonucleótido de tres bases tal como "ATA". También se puede elegir cualquier unidad con simetría palindrómica que se repite más larga que dos bases y cualquier número de unidades con simetría palindrómica más largas que una y media, siendo la única limitación las limitaciones técnicas del tamaño del oligonucleótido impuestas por el procedimiento usado para producir el oligonucleótido. Preferiblemente, el oligonucleótido de partida comprende al menos dos unidades de la secuencia de nucleótidos que muestran simetría palindrómica.

En una realización particular el procedimiento para producir el molde de la secuencia de nucleótidos que muestra simetría palindrómica comprende la región promotora de una enzima capaz de llevar a cabo la ADN o ARN dependiente de molde sin necesidad de un cebador ni la repetición complementaria de dicha región. La presencia de dicha región promotora en cada unidad de oligonucleótido del molde puede ser ventajosa para llevar a cabo la posterior fase de reacción en cascada como se explica a continuación.

En otra realización particular del procedimiento anterior, cualquier secuencia de nucleótidos que se va a amplificar se inserta entre las copias de la secuencia de nucleótidos que muestra simetría palindrómica en el oligonucleótido de partida. Si dicha secuencia de nucleótidos insertada comprende la región promotora para una enzima capaz de llevar a cabo la síntesis de ADN o ARN dependiente de molde sin necesidad de un cebador, se obtiene el mismo resultado que en la primera realización particular anterior.

También se puede preparar un molde de ácido nucleico que consiste en múltiples repeticiones en tándem de una unidad de oligonucleótido por otro procedimiento nuevo de acuerdo con la invención, que implica la circularización de un oligonucleótido de modo que no tiene extremo y por lo tanto puede actuar como molde para un procedimiento de copiado continuo catalizado por una enzima que desplaza más que digiere el ADN o ARN que ocupan la parte del oligonucleótido circular que se va a copiar produciendo una molécula larga que es un multímero del oligonucleótido.

Por lo tanto, un segundo aspecto proporciona un procedimiento para producir ácido nucleico que consiste en múltiples repeticiones en tándem de una unidad de oligonucleótido, en el que un oligonucleótido circular que comprende al menos una copia de dicha unidad se usa como molde para un procedimiento de copia continuo mediante una ácido nucleico polimerasa, que es capaz de desplazar la hebra y que sustancialmente no tiene actividad exonucleasa 5'-3', en presencia de los nucleósidos trifosfato necesarios, y si es necesario un cebador que se puede unir a alguna porción del oligonucleótido.

El procedimiento de circularización puede ser de dos tipos, ya que la reacción se puede diseñar para circularizar cualquiera de las dos hebras en la otra. Si se usa una secuencia sintética y una secuencia biológica, se puede así elegir circular la secuencia biológica en la sintética o la sintética en la biológica, dependiendo del diseño del experimento. De la misma forma, se podría circularizar la hebra que se va a circularizar en el extremo 3' de la hebra molde, de forma que ésta podría servir también como cebador para la formación de polímero, o se podría hacer la circularización lejos del extremo 3' del molde, de modo que sería necesaria la adición de un cebador separado para la replicación en círculo rodante.

Cuando se usa una polimerasa capaz de llevar a cabo la síntesis de ADN o ARN dependiente de molde y de cebador, el copiado se inicia a partir de un cebador que se une a alguna parte del oligonucleótido circular.

Con vistas a una posterior reacción en cascada la polimerasa preferiblemente es una ADN polimerasa dependiente de molde y de cebador, y puede ser ventajoso que el oligonucleótido circular comprenda una secuencia de ADN que muestre simetría palindrómica, y el cebador tenga la misma secuencia de ADN.

Cuando se usa una ARN polimerasa dependiente de molde que no necesita un cebador, el copiado se inicia a partir de una región promotora incorporada en el oligonucleótido circular y que es reconocida por la polimerasa.

En este caso, si se desea llevar a cabo una reacción en cascada posterior es necesario producir un multímero de ADN a partir del multímero de ARN resultante mediante una transcriptasa inversa y un cebador de ADN.

Con el propósito de hacer el seguimiento de la reacción de multiplicación lineal y detectar el producto multímero puede ser útil que los nucleósidos trifosfato presentes estén marcados. Dicho marcaje puede ser, por ejemplo, una enzima, un isótopo radiactivo, un compuesto fluorescente, un compuesto quimiluminiscente, un compuesto bioluminiscente, un quelato metálico o un hapteno detectable mediante una reacción secundaria específica.

La reacción de amplificación en cascada comprende una copia del molde en un procedimiento catalizado por enzima que empieza con múltiples unidades que se repiten en el molde, permitiendo de esta forma producir múltiples copias de cualquier segmento del molde. Para obtener esto es necesario usar enzimas que desplacen en lugar de digerir el ADN o ARN que ocupa la parte del molde que se va a copiar. Puesto que las secuencias de las copias producidas son tanto idénticas como complementarias, se pueden agregar formando complejos largos con una menor movilidad respecto a las moléculas individuales.

Por consiguiente, en un segundo aspecto la presente invención proporciona una reacción de amplificación de ácidos nucleicos en cascada, en la que se produce un gran número de copias de ADN o ARN parciales y completas de un molde de ADN que consiste en múltiples repeticiones en tándem de una unidad de oligonucleótido, mediante una ácido nucleico polimerasa, que puede desplazar una hebra y que sustancialmente no tiene actividad de exonucleasa 5'-3', poniendo en contacto el molde con dicha ácido nucleico polimerasa en presencia de los nucleósidos trifosfato necesarios, y si es necesario, un cebador capaz de unirse a la unidad de oligonucleótido, sintetizando así la polimerasa ADN o ARN que en el mejor de los casos empiezan en cada unidad de oligonucleótido que se repite en el molde.

Si cualquier parte de la unidad de oligonucleótido que se repite corresponde al promotor de una enzima que puede llevar a cabo la síntesis de ADN o ARN dependiente de molde sin necesidad de un cebador como punto de partida para el procedimiento, como la ARN polimerasa T3, T7 o SP6, la fase de reacción en cascada se puede inducir por la simple adición de esta enzima y los nucleósidos trifosfato necesarios para el molde de hebra única o de hebra doble, preferiblemente el molde de hebra doble.

Si este no es el caso, es necesario un cebador que se pueda unir a la unidad de oligonucleótido que se repite junto con una enzima adecuada que pueda sintetizar ADN o ARN a partir de los nucleósidos trifosfato adecuados en una reacción dependiente de molde y cebador y tenga la capacidad mencionada de inducir el desplazamiento de hebra. En este caso, primero deben separarse las hebras del molde de modo que el cebador pueda hibridar con cada hebra. Las ADN polimerasas adecuadas de este tipo son, por ejemplo, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, preparaciones de polimerasa Taq sin actividad de exonucleasa o la ADN polimerasa T4.

Si el molde de ADN se produce a partir de un oligonucleótido circular mediante una ADN polimerasa que empieza a partir de un cebador que se une a alguna parte del oligonucleótido circular, la reacción en cascada se puede llevar a cabo simultáneamente con la formación del molde por adición de un cebador que se una al menos a una parte de las unidades de oligonucleótidos complementarias que comprenden el molde.

En el caso de que, como se ha mencionado previamente, sea ventajoso que el oligonucleótido circular de partida comprenda una secuencia de ADN que muestre simetría palindrómica, y que el cebador tenga la misma secuencia de ADN, entonces, tanto la formación del molde como la reacción en cascada a partir del mismo se producirán usando el mismo cebador individual.

Cuando la ácido nucleico polimerasa es una ADN polimerasa, las hebras sintetizadas desplazadas del molde también son ADN, y la reacción en cascada se desarrolla además más allá de las unidades de oligonucleótido repetidas de las hebras de ADN recién sintetizadas.

En una realización particular de dicha reacción en cascada, el tiempo en que se lleva a cabo la reacción en cascada se ajusta al número de unidades repetidas en el molde, y si es posible a la concentración del cebador, de modo que el copiado del molde y las hebras de ADN recién sintetizadas no avanzan hasta sus extremos, de modo que las hebras desplazadas permanecen unidas al molde, formando una red larga de hebras interconectadas.

Cuando la ácido nucleico polimerasa es una ARN polimerasa, las hebras sintetizadas desplazadas del molde son ARN, y la reacción en cascada produce un gran número de moléculas de ARN de hebra única que hibridan entre sí formando un retículo largo inmóvil.

Las moléculas de ARN sintetizadas no serán copiadas más por la ARN polimerasa, pero si se desean más copias se puede proceder como sigue: El retículo producido de moléculas de ARN hibridadas se desnaturaliza, se reasocia con los oligonucleótidos complementarios adecuados como cebadores para la síntesis del ADNc y se copian en hebras de ADNc mediante la transcriptasa inversa, después de lo cual la reacción en cascada avanza más allá de las unidades de oligonucleótidos repetidas de las hebras de ADNc.

En la reacción en cascada también puede ser útil con el propósito de seguir la reacción o detectar el producto o los productos, que los nucleósidos trifosfato presentes estén marcados. Otra vez, dicho marcaje puede ser por ejemplo una enzima, un isótopo radiactivo, un compuesto fluorescente, un compuesto quimiluminiscente, un compuesto bioluminiscente, un quelato metálico o un hapteno detectable por una reacción secundaria específica.

Un aspecto de la solicitud proporciona un procedimiento para detectar una molécula o grupo diana en un sitio específico, en el que

a) una molécula detectora que se une específicamente a la diana se une a un oligonucleótido que puede tomar parte en una reacción para formar un molde de ADN que consiste en múltiples repeticiones en tándem de dicho oligonucleótido,

b) el oligonucleótido con la molécula detectora unida se pone en contacto con el sitio diana, y el oligonucleótido con la molécula detectora unida, no unida a la diana se separa,

c) se lleva a cabo una reacción para formar un molde de ADN que consiste en múltiples repeticiones en tándem del oligonucleótido unido a la molécula detectora, y

d) la diana se detecta por detección del ácido nucleico amplificado unido.

En este procedimiento a menudo será conveniente que además se lleve a cabo una reacción en cascada como se ha descrito previamente antes de detectar la diana.

En otra realización de este procedimiento

a) una molécula detectora que se une específicamente a la diana se une a un molde de ADN que consiste en múltiples repeticiones en tándem de una unidad de oligonucleótido,

b) el molde con la molécula detectora unida se pone en contacto con el sitio diana, y se separa el molde con la molécula detectora unida, no unida a la diana,

c) se lleva a cabo una reacción en cascada como se ha descrito previamente, y

d) la diana se detecta por detección del ácido nucleico unido amplificado.

Cuando el procedimiento comprende una reacción en cascada, la presencia de una red grande de hebras de ácido nucleico puede ser visible o detectable por sí misma, pero normalmente los nucleósidos trifosfato usados en el procedimiento para producir el molde de ADN, y posiblemente, en la reacción en cascada están marcados, y la diana se detecta por detección del marcador.

El marcador en los nucleósidos trifosfato marcados puede ser por ejemplo, una enzima, un isótopo radiactivo, un compuesto fluorescente, un compuesto quimiluminiscente, un compuesto bioluminiscente, un quelato metálico o un hapteno tal como biotina detectable por una reacción secundaria específica.

Si el producto de la reacción de detección va a aparecer en un determinado sitio, las moléculas o grupos diana que se van a detectar deben unirse a un sitio específico ya sea antes o después de que se produzcan las reacciones de acuerdo con la invención. Por ejemplo, se pueden fijar a una superficie sólida, o se pueden confinar dentro de un espacio estrecho, tal como una célula orgánica.

Un uso práctico de este aspecto, es aquel en el que la diana es un antígeno específico, y la molécula detectora es un anticuerpo para dicho antígeno. Otro es aquel en el que la diana es una molécula o grupo de hidrato de carbono específico, y la molécula detectora es una lecitina unida a la misma. Todavía otro, es aquel en el que la diana es una secuencia de ácido nucleico específica, y la molécula detectora es una sonda de ADN o ARN que hibrida específicamente con la secuencia diana.

Un aspecto adicional de la solicitud proporciona un procedimiento para amplificar un fragmento de ADN particular, en el que se añade un primer oligonucleótido a ambos extremos de una copia de dicha secuencia de ADN y se añade un segundo oligonucleótido complementario del primero a ambos extremos de otra copia de dicha secuencia de ADN, y las secuencias de ADN resultantes se copian de forma continua mediante una ADN polimerasa dependiente de molde y de cebador en presencia de los nucleósidos trifosfato necesarios durante los ciclos repetidos de desnaturalización y reasociación, produciéndose la elongación de la cadena cada vez que la reasociación da como resultado una hibridación con desplazamiento del marco de lectura dando lugar a dúplex con extremos 3' ocultos.

En otra realización de este procedimiento de amplificación, se añade un primero oligonucleótido al extremo 5' y se añade un segundo oligonucleótido complementario del primero al extremo 3' de una copia de dicha secuencia de ADN y viceversa con otra copia de dicha secuencia de ADN, y las secuencias de ADN resultantes se copian de forma continua mediante una ADN polimerasa dependiente de molde y de cebador en presencia de los nucleósidos trifosfato necesarios durante los ciclos repetidos de desnaturalización y reasociación, produciéndose la elongación de la cadena cada vez que la reasociación da como resultado una hibridación con desplazamiento del marco de lectura dando lugar a dúplex con extremos 3' ocultos.

Todavía en otra realización de este procedimiento de amplificación, se añade al menos una unidad de un oligonucleótido que muestra simetría palindrómica a ambos extremos de dicha secuencia de ADN, y la secuencia de ADN resultante se copia de forma continua mediante una ADN polimerasa dependiente de molde y de cebador en presencia de los nucleósidos trifosfato necesarios durante los ciclos repetidos de desnaturalización y reasociación, produciéndose la elongación de la cadena cada vez que la reasociación da como resultado una hibridación con desplazamiento del marco de lectura dando lugar a dúplex con extremos 3' ocultos.

En cada una de las tres realizaciones anteriores puede ser conveniente que las unidades de oligonucleótidos añadidas a los extremos de la secuencia de ADN particular se diseñen para que contengan sitios de reconocimiento de enzimas de restricción contiguos a dicha secuencia de ADN.

Todavía en otra realización del procedimiento de amplificación, la secuencia de ADN particular que se va a amplificar se circulariza o se inserta en un oligonucleótido circular y el ADN circular resultante se usa como molde para un procedimiento de copiado continuo mediante una ácido nucleico polimerasa capaz de desplazar la hebra y que sustancialmente no tiene actividad exonucleasa 5'-3' en presencia de los nucleósidos trifosfato necesarios, y si es necesario, un cebador capaz de unirse a alguna parte del oligonucleótido.

En esta realización puede ser conveniente que la secuencia de ADN particular se inserte en un sitio del oligonucleótido circular produciendo sitios de reconocimiento de enzimas de restricción contiguos a dicha secuencia de ADN.

Cada una de las realizaciones antes descritas del procedimiento de amplificación producirá con mucho la amplificación más grande, cuando el procedimiento además comprende una reacción en cascada como se ha descrito previamente.

Además, en este aspecto de amplificación de la invención, con propósitos de seguimiento o de detección puede ser útil que los nucleósidos trifosfato usados en el procedimiento estén marcados.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el emparejamiento perfecto de dos copias de un oligonucleótido que comprende dos unidades de simetría palindrómica así como la reasociación con marco de lectura desplazado de las hebras y síntesis de ADN después de la primera desnaturalización de la hebra doble.

De la misma forma, la Figura 2 ilustra el emparejamiento perfecto de un oligonucleótido con repeticiones internas y su oligonucleótido complementario así como la reasociación con marco de lectura desplazado de las dos hebras y síntesis de ADN después de la primera desnaturalización de la hebra doble.

La Figura 3 ilustra la coamplificación de una secuencia de ADN de doce bases "irrelevantes" entre dos unidades de una secuencia de simetría palindrómica.

La Figura 4 es un diagrama que ilustra un copiado continuo de un oligonucleótido circular. (1) Es un oligonucleótido lineal; (2) es el oligonucleótido circularizado; (3) ilustra el copiado del oligonucleótido circular partiendo de un cebador o un promotor en el extremo 5'; y (4) ilustra el desplazamiento de la hebra y el copiado continuo después de una vuelta del oligonucleótido.

La Figura 5 ilustra una reacción de amplificación en cascada a partir de un molde de ADN que consiste en múltiples repeticiones en tándem de una unidad de oligonucleótido de simetría palindrómica, usando la unidad de simetría palindrómica como cebador. El cebador hibridará con numerosas secuencias complementarias en la hebra molde, y puesto que la ADN polimerasa usada puede desplazar la hebra y no tiene actividad exonucleasa 5'-3' significativa, el desplazamiento de la hebra se producirá cuando la síntesis de ADN alcance un sitio ya ocupado por una hebra sintetizada. Así la síntesis de ADN continúa a lo largo de la hebra molde, mientras que más secuencias de cebador se unen a las hebras desplazadas dando lugar a la síntesis de las nuevas hebras que se desplazan entre sí.

La Figura 6 ilustra la unión de un oligonucleótido que comprende unidades repetidas de una secuencia de nucleótidos de simetría palindrómica a un anticuerpo que se une a un antígeno específico fijado a una superficie sólida con una vista a una posterior multiplicación y, opcionalmente reacción en cascada para detectar el anticuerpo.

Descripción detallada de la invención

La realización más productiva en teoría de esta invención es la siguiente:

i) El molde se produce por polimerización a partir de una simetría palindrómica de una unidad de oligonucleótido corta que se repite para hacer que contenga tantas secuencias de simetría palindrómica como sea posible.

ii) La fase de reacción en cascada produce múltiples copias de ADN del molde. Debido a la naturaleza de la simetría palindrómica de la secuencia, cada una de las múltiples copias tendrá una composición de secuencia idéntica a la del molde y así podrá servir como molde para la síntesis de múltiples copias nuevas que cada una puede servir como un molde para la síntesis de múltiples copias nuevas (y así sucesivamente). (Si el ácido nucleico producido en el procedimiento es ARN, será necesario convertirlo con las enzimas disponibles actualmente en ADN con una segunda enzima (una transcriptasa inversa) para hacer un molde adecuado para nuevas series de copiado).

Esta realización se describe con más detalle a continuación.

La reacción en cascada del ADN es una reacción en dos fases para producir grandes cantidades de ADN con una secuencia de bases específica. En la fase 1 se generan multímeros de una secuencia oligonucleótida elegida. En la fase 2 esta estructura de multímero (el molde) se amplifica a una cantidad de varios órdenes de magnitud mayor que la cantidad de material de partida. La conexión de las dos fases da como resultado un efecto mucho más allá del que se lograría con cada una de las dos reacciones de forma individual. El ADN sintetizado en la fase 2 podría servir como material de partida para una segunda fase 1 o una segunda fase 2. Por lo tanto, las diferentes etapas se pueden repetir y combinar de acuerdo con las necesidades específicas. En ambas fases se pueden imaginar diferentes variantes. A continuación se dará cuenta del principio de cada etapa, junto con una mención corta de las variantes principales y una presentación de las posibles aplicaciones.

Formación de multímeros

La formación del molde de multímero por crecimiento secuencial a partir de un oligonucleótido de simetría palindrómica se puede ilustrar con el oligonucleótido

GAAATTTCGAAATTTC

\hskip1cm

(o (GAAATTTC)_{2}),

que es una repetición directa de la simetría palindrómica GAAATTTC. Se pueden hibridar dos moléculas de este oligonucleótido con un emparejamiento perfecto o en una posición con marco de lectura desplazado donde sólo una mitad de cada molécula tiene pares de bases (Figura 1). En esta última situación los dúplex tendrán extremos 3' ocultos o libres, que representa un desplazamiento del marco de lectura a la derecha o a la izquierda. Si están presentes una ADN polimerasa y nucleósidos trifosfato, los extremos 3' ocultos se extenderán dando como resultado el crecimiento de esta hebra de ADN en la mitad del tamaño del oligonucleótido usado. Por lo tanto, como media el 25% de los oligonucleótidos aumentarán su longitud en 50%. Si se llevan a cabo series sucesivas de desnaturalización y reasociación/elongación de la cadena, las moléculas seguirán aumentando de tamaño con una velocidad creciente regular (Hay dos razones por las que la velocidad de crecimiento aumentará. Una es que se genera una población heterogénea de moléculas, que aumenta la frecuencia de desplazamiento del marco de lectura. La otra es que cuando las moléculas se hacen más largas, también lo hacen los posibles desplazamiento del marco de lectura y por lo tanto el crecimiento resultante), hasta que se alcanza un nivel en el que la reacción disminuye en eficacia debido al hecho de que la ADN polimerasa sólo puede sintetizar algunos kilobases de ADN in vitro. En ese momento, el multímero de 16 miembros original ha crecido a un tamaño de varios kilobases.

Se podría obtener una reacción similar con dos oligonucleótidos que tengan la secuencia (GAAA)_{n} y (TTTC)_{n} (Figura 2). Dicha reacción de polimerización a partir de dos oligonucleótidos ha sido descrita previamente por J.W. IJdo y col., citado antes, y mostró que podía generar moléculas de 25 kilobases a partir de oligonucleótidos cortos.

El principio como tal no debería verse afectado por la colocación de una secuencia "irrelevante" entre las copias iniciales del oligonucleótido en crecimiento. (Por "irrelevante" en este contexto se entiende que la secuencia por sí misma no podría meterse en las reacciones de acuerdo con esta invención). Así pues, el oligonucleótido

GAAATTTC[secuencia "irrelevante"]GAAATTTC

debería crecer para generar la secuencia

(GAAATTTC[secuencia "irrelevante"])_{n} GAAATTTC

(Figura 3).

La ventaja de añadir la secuencia "irrelevante" sería tenerla coamplificada junto con el oligonucleótido que se amplifica. Así, el oligonucleótido serviría como vehículo para la amplificación de otra cosa. Por supuesto, el coste sería que a medida que el tamaño de la unidad de amplificación aumentara, el número de copias en cada polímero disminuiría puesto que el tamaño total del polímero es fijo. Cuanto menor es el número de unidades por polímero, menos ADN se podrá generar en la siguiente fase en la que el grado máximo de amplificación está determinado principalmente por el número de unidades que se repiten en cada polímero.

En el caso de la formación de molde de multímero a partir de un oligonucleótido circular, el multímero se puede generar sin desnaturalización y reasociación repetidos (Figura 4). Esto requiere usar una polimerasa que pueda desplazar la hebra y sustancialmente sin actividad de exonucleasa 5'-3' como se describe a continuación para la fase de la reacción en cascada y con cinéticas idénticas a las descritas aquí. Además, el oligonucleótido de partida debería ser mayor que el que es necesario para la formación del molde de multímero a partir de una molécula lineal de simetría palindrómica. Sin embargo, el tamaño mínimo no se puede establecer, ya que dependerá de la secuencia del oligonucleótido y del tamaño de la enzima usada para copiar el ADN circular. La rigidez del ADN depende de la secuencia de bases, y cuanto más rígido es, más largo debe ser el oligonucleótido con el fin de que se doble en un círculo. Además, este círculo debe ser suficientemente grande para permitir que la ADN polimerasa trabaje en él. Si el oligonucleótido original no es suficientemente grande para cumplir estos requisitos, se puede elongar como se ha descrito en el párrafo anterior, hasta que haya alcanzado un tamaño suficiente. A parte de los requisitos de tamaño, la variante de la circularización sólo requiere que la molécula que se va a circularizar tenga un grupo 5'-fosfato y un grupo 3'-hidroxi, así como la adición de una ADN o ARN ligasa en condiciones de reacción adecuadas, incluyendo la presencia de una molécula rica en energía de tipo ATP para donar la energía necesaria para la unión covalente de los extremos. Si el oligonucleótido circular debe fijarse en un sitio determinado, entonces debe conectarse a una molécula detectora, contener una molécula detectora o contener un resto que pueda unirse a una molécula detectora.

La posibilidad de formar un polímero a partir de un molde circular se puede usar para identificar moléculas que pueden formar círculos cuando se complementan con un molde adecuado, o pueden servir como moldes para la circularización del ADN complementario. Así, se puede detectar la existencia de una determinada molécula biológica por su capacidad para inducir la circularización de una molécula de ADN lineal añadida a la misma, y detectar la circularización por la capacidad de una tercera molécula de ADN a unirse al círculo iniciando la replicación en círculo rodante como se describe en la patente de Toyobo, citada antes.

Sin embargo, la circularización se puede realizar de forma más conveniente hacia el extremo 3' del molde, de modo que este extremo pueda servir como un cebador para la replicación en círculo rodante. Este enfoque no sólo elimina la necesidad de añadir un cebador extra, si no que también impide que los círculos formados de manera errónea en sitios de reacción cruzada sean copiados, salvo que por casualidad coincidan con un extremo 3'. Este sistema también tiene la ventaja adicional de que el polímero se uniría de forma covalente al extremo 3' que se detecta. Así, si el círculo se forma en un sitio dentro de un cromosoma, el polímero será una continuación del ADN cromosómico en ese sitio, y si el círculo se forma en ADN capturado en un pocillo de microvaloración, en perlas magnéticas o de otra forma, el polímero será una continuación del ADN capturado. Como resultado de esto, el polímero no sólo se sintetiza específicamente en el sitio pertinente, si no que también es retenido en el mismo de forma muy eficaz.

La formación del polímero se puede detectar directamente si se sintetiza a partir de nucleótidos marcados, pero se obtendrá mayor especificidad y sensibilidad por adición de una etapa de detección separada, que podría ser una reacción en cascada del ADN en el polímero, o posiblemente procedimientos de tipo PRINS o FISH. Un prerrequisito para este tipo de reacción es que al ADN estudiado tenga un extremo 3' situado de forma adecuada. Si dicho extremo no está disponible de forma natural, se puede generar de forma artificial, por ejemplo, por digestión con una enzima de restricción adecuada.

Un aspecto adicional de este ensayo es que no sólo es sensible a la secuencia del molde de ADN, si no también a la forma del mismo (roto (con un extremo 3') o continua (sin extremo 3')). Así sería posible determinar no sólo si está presente una determinada secuencia y donde, si no también si está rota o no. Dichas roturas pueden ser resultado de una variedad de acciones enzimáticas (p. ej., topoisomerasas) y de procesos patológicos (p. ej., roturas de cromosoma en el cáncer).

El invertir el sistema del ensayo de modo que sea el ADN en la muestra el que se circulariza sobre el ADN añadido, tiene la consecuencia de que es el ADN en la muestra el que se copia en la replicación en círculo rodante. Por consiguiente, la composición de la secuencia de ADN en el polímero reflejará la de la muestra y se puede provocar una posterior reacción en cascada en el polímero con cebadores dentro de los segmentos usados para la circularización, de modo que no quedaría sin detectar ningún círculo "erróneo" formado, ya que no podría unirse a los cebadores de la reacción en cascada. Además, el ADN sintetizado en la reacción en cascada también correspondería al de la muestra, y se podría usar por sí mismo para propósitos analíticos (usado como sonda, secuenciado, etc.).

Un oligonucleótido circular como se ha descrito antes también se puede usar directamente como molde para la siguiente fase de reacción en cascada, si se desea la misma.

La fase de reacción en cascada

Si se añade el oligonucleótido original a los polímeros, se unirán a numerosas posiciones a lo largo del ADN elongado, puesto que lo que se tiene es un polímero largo que contienen hasta varios miles de copias en tándem del oligonucleótido original. Si la reasociación se produce en presencia de nucleótidos marcados y una ADN polimerasa sustancialmente sin actividad de exonucleasa 5'-3', estas hibridaciones darán como resultado un número similar de sucesos de cebado generando cada uno una copia parcial marcada del polímero. Puesto que la ADN polimerasa no tiene actividad de exonucleasa significativa, el desplazamiento de hebra se producirá cuando la síntesis de ADN alcance un sitio que ya está ocupado por un oligonucleótido, permitiendo así producir múltiples copias del mismo segmento del polímero (Figura 5).

Como se ve en la Figura 5, el ADN de hebra única que se produce por desplazamiento de la hebra también tiene la posibilidad de unir nuevos oligonucleótidos (que darán lugar a nuevas hebras que se desplazan entre sí). En principio este proceso podría durar para siempre (y a una velocidad creciente y regular, puesto que el número de hebras sencillas nuevas generadas supera el número de hebras usadas para generarlas), generando un máximo de m^{n} moléculas mediante n series de desplazamiento de hebra de un polímero que contiene m copias del oligonucleótido que se amplifica. En la práctica es probable que la reacción se ralentice después de algún tiempo, puesto que las nuevas hebras serán cada vez más cortas con cada generación. Sin embargo, a partir de una molécula de polímero que contiene mil copias del oligonucleótido original (m = 1000), es probable que se produzcan 10^{16} moléculas nuevas, si la reacción se lleva hasta completarse (n alcanza el valor máximo).

Si se aumenta el tamaño del oligonucleótido original por inclusión de una secuencia "irrelevante" como se ha mencionado antes, ésta por supuesto también se producirá en grandes cantidades, aunque la amplificación total disminuirá, y con adiciones muy largas sólo se pueden generar unos cientos de moléculas a partir de cada polímero.

En este caso, las reacciones se podrían repetir, o bien sólo la fase 2 usando todas las hebras nuevas como moldes para una segunda reacción en cascada, o bien la reacción completa dejando que las hebras nuevas se alarguen ellas mismas antes de una nueva etapa de reacción en cascada. La repetición de la reacción completa p veces dará como máximo una amplificación de (m^{n})^{p} veces.

Otras formas de potenciar la reacción en cascada sería haciendo reaccionar previamente el polímero con el o los oligonucleótidos que provocan la reacción en cascada durante un momento antes de añadir la ADN polimerasa, asegurándose así de que se usarán todos los potenciales sitios de unión en la primera serie de síntesis de ADN, y usando un cebador degradable como se describe en las patentes de Becton Dickinson y de Boehringer Mannheim (citados antes), para obtener una multitud de sucesos de cebado de cada sitio, o una combinación de estos
sistemas.

Alternativamente, se podría incluir el sitio de reconocimiento de una ARN polimerasa tal como la ARN polimerasa T7 en la unidad de amplificación y añadir la enzima al extremo de la reacción como amplificador de la reacción en cascada (la ARN polimerasa T7 tras la unión generará hasta 40 copias de ARN de la secuencia de ADN al lado de la secuencia de reconocimiento, de modo que si la unidad original se amplifica 10 veces durante la fase de polimerización y otras 100 veces durante la fase de reacción en cascada, entonces la amplificación total sería 10x100x40 = 4.000 veces).

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Las secuencias promotoras se pueden polimerizar como se ilustra aquí con el promotor para la ARN polimerasa T7.

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La fase de reacción en cascada se puede provocar no sólo con una polimerasa dependiente de cebador, si no también con una polimerasa dependiente de promotor; y el ácido nucleico producido puede ser ARN más que ADN como se ilustra aquí para la enzima que produce ARN dependiente de promotor, la ARN polimerasa T7. La secuencia del promotor T7 es CCCTATAGTGAGTCGTATTA. La simetría palindrómica más corta construida a partir de esta secuencia es:

CCCTATAGTGAGTCGTATT:AATACGACTCACTATAGGG

(":" indica el eje de simetría). Los oligonucleótidos que contienen al menos una unidad y media de esta simetría palindrómica se podrán polimerizar en un polinucleótido de hebra doble, teniendo cada hebra la secuencia

(CCCTATAGTGAGTCGTATTAATACGACTCACTATAGGG)_{n}.

Si por ejemplo "n" es 100, esto significa que cada hebra contiene 100 sitios de unión potenciales para la ARN polimerasa T7. Para obtener la unión de la polimerasa no es necesario que las hebras de ADN se separen (desnaturalicen) por calor u otra forma. Es suficiente añadir la polimerasa y los precursores de ARN (nucleósidos trifosfato) al polímero de acuerdo con uno de los muchos protocolos que describen la síntesis de ARN a partir de un promotor T7. Después, la polimerasa se unirá a múltiples sitios a lo largo de la hebra de ADN, proporcionando la síntesis de ARN multifocal de alta velocidad.

Este tipo de reacción puede ser especialmente adecuada para aplicaciones en las que sea particularmente importante que los ácidos nucleicos producidos en la reacción sean retenidos de forma muy precisa en el sitio de síntesis (p. ej., localización de genes o cromosomas en metafase). El motivo de esto es que las moléculas de ARN de hebra única producidas son autocomplementarias, como las hebras de ADN a partir de las cuales se han copiado. Junto con la alta concentración y la baja complejidad de estas moléculas, esto hará que las hebras hibriden entre sí casi de forma inmediata, formando un retículo con un tamaño y densidad que harían poco probable que se difundieran fuera del sitio de síntesis. En teoría, el retículo podría alcanzar tal tamaño y densidad que precipita, lo cual haría que fuera totalmente incapaz de moverse salvo que se sometiera a alguna fuerza mecánica (tal como la agitación vigorosa).

El retículo formado puede no unirse a la ARN polimerasa T7 para producir más hebras de ARN puesto que esta enzima se une sólo a ADN. Si se desea que suceda esto, es necesario copiar las moléculas de ARN en moléculas de ADNc. Esto se puede hacer a partir de nucleósidos trifosfato con una transcriptasa inversa y es necesario la desnaturalización del retículo (calentando o de otra forma) y la reasociación con oligonucleótidos complementarios que puedan servir como puntos de partida (cebadores) para la síntesis de ADN.

Posibles aplicaciones Amplificación sin ADN "irrelevante" añadido

En esta situación el o los oligonucleótidos sólo se amplifican a sí mismos. Puesto que lo que se genera son sólo grandes cantidades del oligonucleótido corto elegido y no ninguna molécula "biológica", la reacción es particularmente adecuada para propósitos de detección.

Un requisito previo para este tipo de uso es que las moléculas se puedan llevar a un sitio pertinente. Inicialmente, esto se puede obtener mediante la fijación del molde polímero para la reacción en cascada a una molécula detectora que se pueda unir específicamente al sitio pertinente. Esta fijación se puede obtener por una reacción química entre grupos reactivos en las dos moléculas o mediante una reacción de afinidad en la que el molde contiene un resto que se unirá específicamente a la molécula detectora. Así pues, si la molécula detectora es avidina o estreptavidina el molde se puede unir específicamente a la misma si contiene un resto de biotina. De la misma forma, si la molécula detectora es un anticuerpo, el molde se puede unir específicamente al mismo si contiene un antígeno reconocido por ese anticuerpo. Esta unión del molde se puede producir antes, simultáneamente o después de la unión de la molécula detectora a la diana pertinente. Si se prefiere, se puede unir un oligonucleótido que pueda formar parte en la formación del molde polímero en lugar del molde, y después se puede formar el molde en la molécula
detectora.

Si la formación de polímero empieza a partir de un oligonucleótido circularizado, el círculo se puede usar para producir la unión covalente del polímero a la diana detectada, o sirve como un punto de anclaje para el polímero, terminando el polímero en el círculo y rodeando el círculo la diana.

Una vez que el molde se ha unido al sitio pertinente, se puede llevar a cabo la reacción en cascada. Como puede deducirse de la Figura 5, el desplazamiento de hebra que se produce en esta fase generará moléculas de hebra única que están unidas directa o indirectamente al molde polímero o están unidas a otras moléculas similares en un retículo grande que no se puede mover alrededor debido a su tamaño. Por lo tanto, los ácidos nucleicos sintetizados durante la fase de reacción en cascada permanecerán con el polímero que se unió al sitio pertinente. Dependiendo del sistema experimental esta retención del producto puede ser potenciada por las características del sitio pertinente. Así pues, por ejemplo, si la reacción se produce dentro de una célula, el esqueleto y la membrana de la célula servirán para aumentar la retención del producto.

Si el sustrato para la síntesis de ácidos nucleicos son nucleótidos marcados, los ácidos nucleicos sintetizados estarán marcados. Así, las 10^{16} moléculas generadas a partir de una molécula precursora en el ejemplo anterior, podrían estas marcadas. Este número de moléculas marcadas supera en mucho el límite de detección en la mayoría de las reacciones de laboratorio. Por lo tanto, si los oligonucleótidos iniciadores están fijos en una molécula detectora específica (como un anticuerpo a un antígeno de interés) la presencia (unión) de esta molécula detectora podrá ser visible aún cuando sólo haya una molécula unida a la diana (Figura 6).

Así se podría tener un sistema de detección con la mayor sensibilidad posible, puesto que podría detectar la existencia de entidades individuales. Para la mayoría de las aplicaciones este nivel de sensibilidad carecería de sentido, puesto que sería difícil distinguir la unión de moléculas detectoras individuales de la unión no específica inevitable de estas moléculas. Sin embargo, el nivel alto de sensibilidad aseguraría que la sensibilidad fuera siempre suficiente.

Hay que indicar que la etapa de polimerización no es una reacción específica en el sentido de que cualquier oligonucleótido que tenga la capacidad de participar en dicha reacción podría hacerlo en las condiciones adecuadas. Por lo tanto, se podría polimerizar una serie de oligonucleótidos diferentes en una sola reacción. A diferencia de esto, la etapa de reacción en cascada es una etapa específica que depende de la adición de un oligonucleótido específico (o enzima) para provocar la reacción en cascada. Esto se puede usar para el teñido diferencial de múltiples dianas. Si se uniera una serie de oligonucleótidos diferentes a una serie de anticuerpos correspondientes, y estos se unieran a sus correspondientes antígenos, se podrían polimerizar todos los oligonucleótidos en una sola reacción. Posteriormente se podría usar cada polímero como molde para una reacción en cascada específica provocada por el oligonucleótido pertinente. Por lo tanto, si la primera reacción en cascada se provocara con un marcador rojo, la segunda reacción en cascada con un marcador verde y la tercera reacción en cascada con un marcador azul, la primera diana aparecería en rojo, la segunda en verde y la tercera en azul.

Coamplificación de ADN "irrelevante"

Como se ha descrito previamente se podría poner alguna otra secuencia de ADN en el alineamiento del ADN que se reasocia. Este ADN "irrelevante" en principio podría ser de cualquier tipo, siempre que el tamaño no fuera excesivo haciendo imposible la polimerización en la fase 1. Por lo tanto, la multiplicación del ADN y probablemente la reacción en cascada se podrían usar para generar grandes cantidades de alguna secuencia de ADN de interés, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y clonación. El ADN generado después se podría usar para cualquiera de los propósitos para los que se usa el ADN. Por ejemplo, se podría marcar durante la síntesis y usar como una sonda de hibridación, o se podría caracterizar por secuenciación o de otra forma.

Para llevar a cabo la amplificación de este ADN por supuesto es necesario añadir las secuencias de reasociación a los extremos del ADN de interés. Esto se podría hacer en cualquiera de una serie de formas. Las secuencias se podrían ligar directamente a los extremos del ADN mediante procedimientos de ligado convencionales, o podría estar contenido en un vector usado para la clonación del ADN, por ejemplo, flanqueando el policonector encontrado en la mayoría de los vectores modernos. Cualquiera que sea el procedimiento elegido, el resultado final sería una secuencia de ADN capaz de la autoamplificación mediante una multiplicación del ADN y reacción en cascada. Si es necesario liberar el ADN "irrelevante" amplificado de las secuencias que se amplifican después de la amplificación, el ADN que se reasocia se puede diseñar para que contenga sitios de reconocimiento para enzimas de restricción.

Si se usa la multiplicación mediante dos secuencias de oligonucleótidos complementarias, se puede hacer de dos formas diferentes. O bien se puede añadir un primer oligonucleótido, por ejemplo, ATCG, a ambos extremos de un lote de ADN "irrelevante" que se va a amplificar, y añadir un segundo oligonucleótido complementario al primero, en este caso CGAT, a ambos extremos de otro lote de ADN "irrelevante", hibridando y polimerizando las secuencias de ADN resultantes como sigue:

5' ATCG[irrelevante]ATCG 3' \rightarrow

\leftarrow 3' TAGC[irrelevante]TAGC 5'

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O bien se puede añadir el primer oligonucleótido al extremo 5' y el segundo oligonucleótido al extremo 3' del primero lote de ADN "irrelevante", mientras que el primer oligonucleótido se añade al extremo 3' y el segundo oligonucleótido al extremo 5' del segundo lote de ADN "irrelevante", hibridando y polimerizando las secuencias de ADN resultantes como sigue:

5' ATCG[irrelevante]CGAT 3' \rightarrow

\leftarrow 3' GCTA[irrelevante]TAGC 5'

\vskip1.000000\baselineskip

Si se usa la multiplicación mediante un oligonucléotido que muestra simetría palindrómica, este oligonucleótido de simetría palindrómica, por ejemplo, GAAATTTC, se añade a ambos extremos del ADN "irrelevante", hibridando y polimerizando las secuencias de ADN resultantes como sigue:

5' GAAATTTC [irrelevante] GAAATTTC 3' \rightarrow

\leftarrow 3' CTTTAAAG[irrelevante]CTTTAAAG 5'

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En estas realizaciones de la reacción de multiplicación, la primera etapa de la hibridación y polimerización producirá copias complementarias del ADN "irrelevante"; la segunda etapa producirá copias reales del ADN "irrelevante" y así sucesivamente. El resultado será un molde que comprende el desplazamiento de las copias reales y complementarias del ADN deseado. Una reacción en cascada posterior que copia tanto el molde resultante como las copias del molde producirá así una multitud de copias tanto reales como complementarias del ADN deseado.

Por otra parte, si la reacción de multiplicación se lleva a cabo mediante copiado continuo de un ADN circular que incorpora el ADN "irrelevante", el molde resultante comprenderá múltiples copias de ADN o ARN complementario del ADN deseado. Si el molde es ADN, una reacción en cascada posterior en primer lugar producirá copias reales del ADN deseado, y en segundo lugar copias complementarias del mismo y así sucesivamente. Si el molde es ARN, este por transcripción inversa se puede copiar en ADNc que comprende copias reales del ADN deseado, y una reacción en cascada posterior producirá en primer lugar copias complementarias del ADN deseado y en segundo lugar copias reales del mismo y así sucesivamente. En todos los casos el resultado final será una multitud de copias tanto reales como complementarias del ADN deseado.

Por supuesto también se podrían usar reacciones de coamplificación para propósitos de detección mediante marcado como se ha descrito previamente. La cantidad de ADN generado en la etapa de reacción en cascada sería mucho menor, pero esto puede ser razonable. Además, el tamaño más grande de la unidad de amplificación puede aumentar la retención en el sitio de síntesis compensado el rendimiento global más bajo.

Además, con la coamplificación de algún otro ADN sería posible provocar la reacción en cascada con un cebador oligonucleótido que hibrida con alguna secuencia dentro de este ADN más que con la secuencia de oligonucleótido usada para la polimerización. Esto probablemente aumentaría la especificidad de la reacción posterior.

De la misma forma, la molécula detectora podría estar presente en forma de una secuencia "irrelevante" que dirige la construcción que se amplifica a un sitio capaz de hibridar con la secuencia "irrelevante", uniéndose así a la reacción en cascada en ese sitio.

Ejemplos Ejemplo 1 Formación de un polímero a partir de una repetición en tándem de una secuencia con simetría palindrómica

La secuencia 5'-ACAAATTTGT-3' tiene una simetría palindrómica. El oligonucleótido 5'-ACAAATTTGTACAAATTTGT-3' contiene dos repeticiones de esta simetría palindrómica y se puede elongar a un tamaño aparente de 20 kb (calculado por electroforesis en gel de agarosa neutro) por la reacción descrita aquí. En este ejemplo el polímero resultante está marcado con digoxigenina, cuando se añade dUTP marcado con digoxigenina a la reacción. El dUTP-digoxigenina por supuesto se puede omitir o sustituir por dTTP.

Se logra una elongación similar si el oligonucleótido se sintetiza con una molécula de biotina unida al extremo 5', permitiendo que el oligonucléotido o su polímero se fijen a la avidina, si se desea.

Los 10 \mul cogidos cada diez ciclos se pueden usar para seguir el avance de la formación de polímero. Parece que la mayor parte de la elongación se produce en la última incubación, como se predecía por consideraciones teóricas. También parece que los polímeros varían más de tamaño cuando se hacen más largos, lo cual también es como se esperaba.

Procedimiento

Se mezcla lo siguiente en un volumen final de 20 \mul:

1-10 ng (aproximadamente 1 pmol) de oligonucleótido

2 \mul de glicerol

2 \mul de tampón 10xTaq (suministrado por el suministrador de la polimerasa Taq)

2 nmol de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP

500 pmol de dig-11-dUTP (Boehringer Mannheim)

2 U de polimerasa Taq (Boehringer Mannheim)

Agua hasta 20 \mul

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Se incuba en un termociclador durante 10 ciclos a:

30ºC durante 2 minutos

50ºC durante 1 minuto

70ºC durante 1 minuto

\vskip1.000000\baselineskip

Después se transfieren 10 \mul de la mezcla a una nueva reacción y se añade la siguiente mezcla:

1 \mul de glicerol

1 \mul de tampón 10xTaq

2 nmol de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP

500 pmol de dig-11-dUTP

2 U de polimerasa Taq

Agua hasta 10 \mul.

\vskip1.000000\baselineskip

Se incuba en un termociclador durante 10 ciclos a:

40ºC durante 2 minutos

65ºC durante 2 minutos

90ºC durante 1 minuto.

\vskip1.000000\baselineskip

Después se transfieren 10 \mul de la mezcla a una nueva reacción y se añade la siguiente mezcla:

1 \mul de glicerol

1 \mul de tampón 10xTaq

2 nmol de cada uno de dCTP, dGTP, dTTP

4 nmol de dATP

500 pmol de dig-11-dUTP

4 U de polimerasa Taq

Agua hasta 10 \mul.

\vskip1.000000\baselineskip

Se incuba en un termociclador durante 10 ciclos a:

50ºC durante 2 minutos

70ºC durante 10 minutos

90ºC durante 1 minuto.

Después de esto el polímero ha alcanzado un tamaño de aproximadamente 20 kb en los experimentos citados aquí. La repetición de la última incubación dos veces no da como resultado ningún aumento aparente del tamaño del polímero.

Ejemplo 2 El gen mutado en la fibrosis quística se puede teñir en preparaciones de cromosomas en metafase y núcleos en interfase

En este protocolo una sonda de oligonucleótido se circulariza y se liga a la variante normal del gen de la fibrosis quística en una preparación de células fijadas de un donante humano sano. Después del ligado se añade un segundo cebador. Este cebador hibrida con la parte del círculo que no hibrida con el ADN genómico e inicia la formación de polímero por la replicación en círculo rodante del círculo. Después de esto, se vuelve a añadir el mismo cebador, pero esta vez junto con un cebador no complementario capaz de hibridar con el polímero. Estos dos cebadores juntos generan una reacción en cascada del polímero. Al incluir el d-UTP marcado con digoxigenina en la mezcla de reacción, está reacción en cascada posteriormente se puede hacer visible por incubación con un anticuerpo antidigoxigenina marcado con fluorocromo.

En los sitios en los que todas las reacciones funcionan de forma óptima, el teñido de los cromosomas en metafase aparece como una pequeña colina situada en el medio del brazo largo del cromosoma 7. Sin embargo, ninguna de las etapas funciona al 100% en todas las células, por lo que el aspecto variará de una célula a otra. Si el primer oligonucleótido no hibrida con la secuencia diana y si no es ligado después de la hibridación, no se puede general teñido. Lo mismo ocurre si falla la hibridación del oligonucleótido que genera polímero o la replicación en círculo rodante. Cuando todas estas reacciones han funcionado, se puede provocar la reacción en cascada. Se espera que la cantidad de ADN (marcado) que se produce en estas reacciones varíe dependiendo de cuanto aumentan los polímeros individuales en la etapa precedente (cuanto más largo es el polímero, más producto en cascada) y dependiendo de las condiciones espaciales del sitio individual (cuanto ADN se puede acomodar). Por consiguiente, el aspecto del cromosoma 7 individual después de la reacción varía desde que no hay señal a una señal de tipo punto a una señal de tipo colina; y de los dos cromosomas 7 en una metafase individual, puede no teñirse ninguno, teñirse uno o
ambos.

\newpage

La mayoría de los núcleos en interfase también contienen sitios teñidos. Sin embargo, puesto que los núcleos, a diferencia de los cromosomas, no presentan características morfológicas que ayuden a determinar si la tinción está situada en el sitio correcto, este resultado es más difícil de interpretar.

Procedimiento

Se hace una extensión reciente de células fijadas en metanol y ácido acético (3:1) en un portaobjetos de microscopio. Para facilitar el acceso a los sitios de hibridación, es importante que lo cromosomas se extiendan bien y no estén metidos en el citoplasma denso.

Se prepara la siguiente mezcla para la hibridación y ligado de la sonda de fibrosis quística:

2,5 pmol de sonda (5'-p-AAGATGATA(T)_{4}CTTTAATG(T)_{10}ATAATGTTAAGTGACCGGCAGC(A)_{4}TG(T)_{16}CAT
CATAGGAAACACCA-3')

5 \mul de tampón de ligasa 10xTth (1xtampón: Tris.HCl 20 mM pH 9,0, KCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM y "Triton® X-100" 0,1%)

10 \mul de NAD 10 mM

5 \mug de ADN de esperma de salmón sonicado y desnturalizado

5 \mug de BSA

5 \mul de glicerol

12,5 U de ADN ligasa Tth

agua hasta 50 \mul.

Se añade la mezcla al portaobjetos y se extiende con un cubreobjetos. Se incuba a 92,5ºC durante 2,5 minutos (para desnaturalizar el ADN genómico) y después a 55ºC durante 30 minutos (para hibridar y ligar la sonda).

Después se lava en formamida al 30%, 2xSSC a pH 7,0 (1xSSC: NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM) a 42ºC durante 10 minutos y en 2xSSC a 55ºC durante 10 minutos para separar tanto la sonda libre como la no ligada.

Se deshidrata el portaobjetos en una serie de etanol (70-90-99%) y se seca al aire.

Ahora el portaobjetos está listo para la formación de polímero.

Para llevar a cabo esto, se mezcla lo siguiente:

1 pmol de cebador (5'-TGCTGCCGGTCACTTAACAT-3')

5 nmol de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP

5 \mug de BSA

5 \mul de tampón 10x\Phi-29 (tampón 1x\Phi-@29: Tris.HCl 50 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM, DTT 1 mM)

340 ng de ADN polimerasa \Phi-29

agua hasta 50 \mul

Se añade la mezcla al portaobjetos, se extiende con un cubreobjetos y se incuba a 30ºC durante 1 hora.

Se transfiere el portaobjetos a tampón de lavado (4xSSC, Tween®-20 al 0,05%) y se lava durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Se deshidrata el portaobjetos en una serie de etanol (70-90-99%) y se seca al aire.

Ahora el portaobjetos está listo para la reacción en cascada.

Para llevar a cabo la reacción en cascada, se mezclan los siguientes reactivos:

4 pmol del cebador usado para generar el polímero

4 pmol de un cebador complementario al polímero (en este caso: (5'-AAGATGATATTTTCTTTAATG-3')

5 nmol de cada uno de dATP, dCTP y, dGTP

4 nmol de dTTP

1 nmol de dUTP con digoxigenina

5 \mug de glicerol

5 \mul de tampón 10x\Phi-29

340 ng de ADN polimerasa \Phi-29

agua hasta 50 \mul.

Se añade la mezcla al portaobjetos, se extiende con el cubreobjetos y se incuba a 37ºC durante 1 hora. Se transfiere el portaobjetos a tampón de lavado y se equilibra en este tampón durante 5 minutos.

Después se añaden 100 \mul de anticuerpo anti-digoxigenina marcada con fluoresceína para visualizar el ADN marcado con digoxigenina sintetizado in situ (se extiende con un cubreobjetos). El anticuerpo debe estar en tampón de lavado complementado con leche en polvo desnatada al 5%. Se incuba durante 30 minutos de temperatura ambiente a 37ºC y fuera de la luz. Se lava el portaobjetos 3x5 minutos en tampón de lavado a temperatura ambiente.

El portaobjetos ahora está listo para ser analizado.

Claims (8)

1. Un ensayo para la presencia de una molécula biológica, que comprende detectar dicha molécula biológica por su capacidad para servir como un molde para la circularización y ligado de un oligonucleótido lineal añadido a la misma, en el que el oligonucleótido circular resultante se usa como un molde para un procedimiento de copiado continuo mediante una ácido nucleico polimerasa capaz de desplazar la hebra y sustancialmente sin actividad exonucleasa 5'-3' en presencia de los nucleósidos trifosfato necesarios, caracterizado porque el molde para formar el oligonucleótido circular también proporciona el extremo 3' necesario para la formación de polímero por replicación en círculo rodante del oligonucleótido circularizado.

2. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el extremo 3' cebado necesario para la formación del polímero por replicación en círculo rodante del oligonucleótido circularizado se genera de forma artificial por digestión de la molécula biológica con una enzima de restricción.

3. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el molde para el ligado se fija en un sitio determinado, seleccionado del grupo consistente en un locus cromosómico, un pocillo de microvaloración, una perla magnética o un peine de secuenciación, tal que el polímero también se fijará en este sitio.

4. Un ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la polimerasa es una ARN polimerasa, y el procedimiento además comprende la producción de un multímero de ADN a partir del multímero de ARN resultante, mediante una transcriptasa inversa y un cebador de ADN.

5. Un ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que los nucleósidos trifosfato usados están marcados.

6. Un ensayo de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el marcador se selecciona del grupo constituido por una enzima, un isótopo radiactivo, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto bioluminiscente, un quelato metálico, y un hapteno detectable por una reacción secundaria específica.

7. Un ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que además comprende una reacción en cascada del ADN como una etapa de detección añadida.

8. Un ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el molde se rompe (con un extremo 3') permitiendo la detección de la secuencia diana o roturas de cromosomas.